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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Teststreifen für die Analyse von Proben, insbesondere von Blut- oder Serumproben, z.B. erhältlich durch Zentrifugieren von Vollblut, Urin- oder Speichelproben, oder in Wasser verteilten Analyten, der sich durch zumindest zwei, bevorzugt parallele Strömungspfade für Flüssigkeit auszeichnet, die von einem gemeinsamen Aufgabematerial, auf das eine Probe aufgegeben werden kann, zugänglich sind. Die Strömungspfade bestehen aus porösem Material, insbesondere einer Nitrocelluloseschicht, auf einem für wässrige Flüssigkeit undurchlässigen Träger, z.B. Kunststofffolie oder hydrophobiertem Papier. Die Strömungspfade sind voneinander beabstandet, wobei dieser Abstand optional von hydrophobem Material ausgefüllt sein kann. In dem Abstand zwischen den Strömungspfaden ist kein für Flüssigkeit durchlässiges poröses hydrophiles Material vorhanden, bevorzugt keine Nitrocellulose. Bevorzugt ist das poröse Material in dem Abstand zwischen Strömungspfaden entfernt, insbesondere durch Laserbestrahlung entfernt worden. Bevorzugt sind die Oberflächen der Längsseiten der Strömungspfade flüssigkeitsundurchlässig, insbesondere bestehen diese Oberflächen aus einer dünnen kontinuierlichen Schicht, die aus im Laserprozess aufgeschmolzenem und wieder erstarrtem, vormals porösen Material besteht, z.B. durch Laserbestrahlung aufgeschmolzenem und wieder erstarrtem Anteil des ursprünglichen porösen Materials.
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Der Teststreifen zeichnet sich dadurch aus, dass die Strömungspfade eingerichtet sind, gesteuert gleichzeitig nach einer Inkubationsdauer mit dem Aufgabematerial und/oder einem damit verbundenen Reagenzreservoir verbindbar zu sein. Daher kann sich eine auf das Aufgabematerial aufgegebene Probe über das Aufgabematerial und/oder ein damit verbundenes Reagenzreservoir verteilen und erst bei Überwindung einer Barriere in den Strömungspfaden das Einströmen der Probe in die Strömungspfade erfolgen. Die Barriere hat den Vorteil, dass die Probe mit einem für einen Analyten spezifischen Bindemolekül, optional zusätzlich mit aufgestocktem Analyten und/oder einem Kompetitor des Analyten, vor dem Einströmen in die Strömungspfade inkubiert wird und sich ein Gleichgewicht der am Bindemolekül gebundenen Analyten, optional mit aufgestocktem Analyten und/oder einem Kompetitor des Analyten, einstellt. Die Dauer der Inkubation kann mittels der Barriere eingestellt werden, bevorzugt ist die Barriere eingerichtet, schlagartig bzw. innerhalb kurzer Zeit zu öffnen, um das Aufgabematerial mit allen Strömungspfaden gleichzeitig zu verbinden. Die mittels der Barriere vorbestimmte Inkubationsdauer führt zu einer erhöhten Genauigkeit des Nachweises, insbesondere der Quantifizierung des Analyten, der mit der Probe aufgegeben wurde.
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Bevorzugt ist das Aufgabematerial und/oder das damit verbundene Reagenzreservoir mit dem Bindemolekül versehen, mit dem sich die aufgegebene Probe mischen und reagieren kann, optional zusätzlich mit aufgestocktem Analyten und/oder einem Kompetitor des Analyten, bevor die so erhaltene Mischung nach Öffnen bzw. Überwinden der Barriere in die Strömungspfade strömen kann.
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Der Teststreifen und das erfindungsgemäße Analyseverfahren damit eignen sich insbesondere zur Verwendung für quantitative Analysen, da die zumindest zwei Strömungspfade eine Quantifizierung eines Analyten erlauben. Der Teststreifen eignet sich zur Verwendung in der Analyse eines Analyten mittels nur eines Antikörpers, wobei der Analyt bevorzugt genau ein Epitop aufweist, an das ein Antikörper binden kann, oder der Analyt erlaubt nur die Bindung genau eines Antikörpermoleküls und verhindert z.B. aus räumlichen Gründen die Bindung eines weiteren Antikörpermoleküls. Daher haben der Teststreifen und das damit durchführbare Verfahren zur Analyse den Vorteil, auch für die Verwendung zur Analyse eines Analyten geeignet zu sein, der genau ein Epitop aufweist. Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Teststreifens.
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Im Unterschied zur vorliegenden Erfindung benötigen Teststreifen für sogenannte Sandwich-Analysen an einem Analyten zumindest zwei Epitope, damit ein Fängerantikörper an das eine der Epitope binden kann und zusätzlich ein markierter Antikörper an ein weiteres Epitop desselben Analyten binden kann.
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Hecht et al., Microelectronic Engineering 158, 52-58 (2016) beschreibt die Herstellung von parallelen hydrophilen Pfaden aus einer Nitrocelluloseschicht durch Laserabtrag von Nitrocellulose zwischen den gewünschten Pfaden, wobei durch mehrfache Laserbehandlung entlang der abgetragenen Bereiche die angrenzenden Kanten der Pfade aus Nitrocellulose im Wesentlichen durch Verschmelzen geschlossen werden und ein Austreten von Flüssigkeit in den abgetragenen Bereich verhindern. Die Pfade können daher parallele Kanäle mit geschlossenen Oberflächen der Längsseiten bilden, zwischen denen ein Übertritt von Flüssigkeit vermieden wird.
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Die
EP 3 171 169 B1 beschreibt das Herstellen paralleler getrennter Pfade in z.B. einer auf einem Träger angebrachten Nitrocelluloseschicht durch Entfernen von Nitrocellulose vom unterliegenden Träger durch Laserbestrahlung, z.B. eines Nd:YVO
4-Lasers mit 532 nm Wellenlänge, einer Pulsdauer von 12 ps, einer Pulsenergie von 10 mJ und einer Pulsfrequenz von 10 kHz.
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Der Erfindung stellt sich die Aufgabe, einen alternativen Teststreifen und ein damit durchführbares Analyseverfahren bereitzustellen, insbesondere zur Verwendung zum Nachweis von Analyten, die genau ein Epitop aufweisen. Der Teststreifen soll eine gleichzeitige Kontaktierung von zumindest zwei voneinander getrennten Strömungspfaden mit genau einem Aufgabematerial für eine Probe ermöglichen, wobei das Einströmen der Probe in die Strömungspfade nach einer Inkubationsdauer steuerbar sein soll. Bevorzugt sollen der Teststreifen und das Analyseverfahren zum quantitativen Nachweis eines Analyten oder zum parallelen Nachweis verschiedener Analyten geeignet sein.
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Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche und stellt insbesondere einen Teststreifen und dessen Verwendung im Analyseverfahren bereit, der
- - zumindest zwei Strömungspfade aus flüssigkeitsdurchlässigem porösen Material, die auf einem gemeinsamen Träger angebracht sind,
- - wobei die Strömungspfade an ihrem ersten Ende mit einem Aufgabematerial verbunden sind,
- - wobei bevorzugt die Strömungspfade an ihrem dem ersten Ende gegenüberliegenden zweiten Ende mit einem Saugmaterial in Kontakt sind,
- - wobei zwischen dem Aufgabematerial und den Strömungspfaden und in Kontakt mit deren ersten Enden ein Reagenzreservoir angeordnet ist, das an seinem zweiten Ende in Abteilungen unterteilt ist, von denen jede mit genau einem Strömungspfad an dessen erstem Ende verbunden ist, und die Abteilungen an ihrem gegenüberliegenden ersten Ende mittels eines gemeinsamen Abschnitts des Reagenzreservoirs mit dem Aufgabematerial verbunden sind,
- - optional eine Filterschicht zwischen dem Aufgabematerial und dem Reagenzreservoir oder zwischen dem Reagenzreservoir und angrenzend an die Strömungspfade angeordnet ist,
- - wobei jeder der Strömungspfade zwischen seinem ersten Ende und seinem zweiten Ende einen Detektionsbereich aufweist,
- - optional jeder der Strömungspfade zwischen seinem Detektionsbereich und seinem zweiten Ende einen Kontrollbereich aufweist,
- - wobei zwischen dem zweiten Ende des Reagenzreservoirs, insbesondere den Abteilungen, und jedem der Strömungspfade eine Barriere angeordnet ist.
aufweist oder daraus besteht.
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Die zwischen dem zweiten Ende des Reagenzreservoirs, bzw. den zweiten Enden der Abteilungen des Reagenzreservoirs, und den Strömungspfaden angeordnete Barriere dient dazu, die Mischung aus Probe, die durch das Aufgabematerial in das Reagenzreservoir geströmt ist, und Bindemolekül, das im Reagenzreservoir oder im Aufgabematerial enthalten ist, optional zusätzlich Analyt und/oder Kompetitor des Analyten als Aufstockung, zu inkubieren, bevor die Barriere geöffnet wird, und die Mischung nach Öffnen der Barriere, bevorzugt alle gleichzeitig, mit den Strömungspfaden zu verbinden. Dabei sind bevorzugt in den Abteilungen des Reagenzreservoirs unterschiedliche Mengen des als Aufstockung enthaltenen Analyten und/oder des Kompetitors des Analyten enthalten, und/oder unterschiedliche Bindemoleküle, die für jeweils unterschiedliche Analyten spezifisch sind, und/oder unterschiedlichen Mengen des Bindemoleküls.
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Die zumindest zwei Strömungspfade erlauben die parallele Bestimmung des Analyten mit zumindest einer oder zwei Mengen an Analyt, die der Probe zugesetzt ist, um den Analyten aufzustocken. Alternativ oder zusätzlich erlauben die zumindest zwei Strömungspfade die parallele Analyse mit zumindest zwei verschiedenen Bindemolekülen, die für den gleichen Analyten oder für verschiedene Analyten spezifisch sind.
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Das erste Ende des Reagenzreservoirs ist mit dem Aufgabematerial verbunden, so dass auf das Aufgabematerial aufgegebene Probe in das Reagenzreservoir strömt. Das Reagenzreservoir ist in einem an das erste Ende angrenzenden Abschnitt in parallele Abteilungen vorzugsweise mittels Laserablation unterteilt, so dass die Probe in die Abteilungen strömt. Dabei wird in jeder der Abteilungen die Probe mit dem Bindemolekül, optional zusätzlich mit aufgestocktem Analyt und/oder Kompetitor des Analyten, einem unterschiedlichen Bindemolekül und/oder einer unterschiedlichen Menge desselben Bindemoleküls in Kontakt gebracht und bis zum Öffnen der Barriere in einem der Abschnitte inkubiert. Die Abteilungen sind bevorzugt parallele und voneinander beabstandete Streifen, die einstückig mit dem sie verbindenden Abschnitt am ersten Ende ausgebildet sind.
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Bevorzugt liegt das erste Ende des Reagenzreservoirs zwischen dem Aufgabematerial, z.B. dessen zweitem Ende, und dem Träger, während das zweite Ende des Reagenzreservoirs, insbesondere die zweiten Enden von dessen Abteilungen, auf den ersten Enden der Strömungspfade liegen, gegenüber dem Träger, auf dem die Strömungspfade angeordnet sind.
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Die Barriere kann in den Abteilungen des Reagenzreservoirs angeordnet sein, z.B. an deren zweiten Enden, die mit den ersten Enden der Strömungspfade verbunden sind. Bevorzugt ist die Barriere in Abschnitten der Strömungspfade angrenzend an deren erste Enden angeordnet.
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Die Barriere kann z.B. ausgebildet sein als
- - Zucker (z.B. Saccharose), der als wässrige Zuckerlösung aufgebracht und getrocknet wurde, so dass durch Auflösen des Zuckers die Barriere geöffnet wird,
- - Wachs, flüssig aufgedruckt, der durch Zusatz eines Detergenzes, z.B. Tween 20, das im Aufgabematerial und/oder im Reagenzreservoir enthalten ist, überwunden wird,
- - Salz, als wässrige Lösung aufgebracht und getrocknet, so dass durch Auflösen des Salzes die Barriere geöffnet wird
- - PVA (Polyvinylaklkohol), ein wasserlösliches Polymer, das in Kontakt mit der Probe durch Auflösen die Barriere öffnet, z.B. in Lösung auf Nitrocellulosemembran getropft und dann getrocknet, als hydrophobe Barriere,
- - optional zusätzlich eine in eine Ausnehmung eingebrachte Glasfasermatte, die die Fließgeschwindigkeit reduziert,
- - zusätzlicher Abschnitt aus Cellulose, in eine Ausnehmung eingebracht, sodass zumindest ein Teil der Flüssigkeit durch dieses Cellulose hindurchfließt, was zu einer Verzögerung führt,
- - Spiropyran-dotiertes poly(DEAEMA-co-MMA), das hydrophob ist und erst unter UV-Bestrahlung hydrophil wird, zur photoinduzierten Änderung der Polarität,
- - Ausnehmung, die z.B. mittels Laserstrahlung hergestellt ist, die die Strömung verhindert, und durch Anlegen eines elektrischen Felds die durch die Ausnehmung gebildete Lücke überwunden wird (das elektrische Feld verringert den Kontaktwinkel zwischen Probe und hydrophobem Träger, z.B. aus Polyester, und lässt Probe weiterströmen, „electrowetting“),
- - Donor-Acceptor-Stenhouse-Adducts (DASA), die Moleküle sind, deren Polarität über sichtbares Licht verändert werden kann. Dabei werden bevorzugt DASA-Moleküle in einer mit Laser erzeugten Ausnehmung aufgebracht sein, wobei die DASA-Moleküle zunächst durch einen Schutz vor Licht geschützt werden, und nach der Inkubationsdauer der Schutz entfernt und die DASA Moleküle beleuchtet werden, um sie hydrophil zu machen, sodass die Probe weiter strömt.
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In bevorzugter Ausführungsform ist die Barriere durch eine Ausnehmung gebildet, die sich über den vollständigen Querschnitt der Abteilung des Reagenzreservoirs und/oder des Strömungspfads erstreckt, wobei sich die Ausnehmung bevorzugt in den Träger erstreckt, bzw. der Träger im Anschluß an die Ausnehmung der Strömungspfade eine Ausnehmung aufweist. Bevorzugt weist jeder der Strömungspfade zwischen seinem ersten Ende und seinem Detektionsbereich eine Ausnehmung auf, die sich über den vollständigen Querschnitt des Strömungspfads oder einer Abteilung des Reagenzreservoirs erstreckt, wobei sich die Ausnehmung bevorzugt in den Träger erstreckt, bzw. der Träger im Anschluß an die Ausnehmung der Strömungspfade eine Ausnehmung aufweist.
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Die Ausnehmung, die jeder Strömungspfad aufweist, wobei sich die Ausnehmung bevorzugt bis in den angrenzenden Träger erstreckt, bildet eine Barriere gegen Flüssigkeit, die z.B. aus dem Aufgabematerial und/oder dem Reagenzreservoir und/oder einer Filterschicht in das erste Ende der Strömungspfade eindringt. Daher erlaubt die Ausnehmung die Inkubation einer auf das Aufgabematerial aufgegebenen Probe in dem Aufgabematerial und/oder in einem damit in Kontakt stehenden Reagenzreservoir, und das anschließende gesteuerte Überwinden der Ausnehmung, die die Barriere bildet. Die Ausnehmung ist dadurch überwindbar, dass der Träger entlang der Ausnehmung gebogen wird, um die durch die Ausnehmung beabstandeten Abschnitte jeweils eines Strömungspfads miteinander in Kontakt zu bringen. Dabei hat sich gezeigt, dass ein Biegen des Trägers entlang der Ausnehmung bis zur Kontaktierung der durch die Ausnehmung beabstandeten Abschnitte zur Strömung von Flüssigkeit über die Ausnehmung hinweg führt, und dass diese Strömung auch bei Zurückbiegen des Trägers bestehen bleibt, z.B. beim Zurückbiegen des Trägers in Richtung auf eine Ebene. Zumindest bei wässrigen Proben, z.B. Blutserum, Urin, Speichel, Wasserproben oder in Wasser verteilten Analyten reicht die Oberflächenspannung aus, um auch nach dem Zurückbiegen des Trägers in Richtung auf eine Ebene, so dass die Ausnehmung sich über ihren ursprünglichen Querschnitt erstreckt, die Strömung der Flüssigkeit über die Ausnehmung hinweg aufrecht zu erhalten. Diese Ausnehmungen jedes Strömungspfads sind bevorzugt im jeweils gleichen Abstand zum jeweiligen Detektionsbereich angeordnet, z.B. entlang einer Linie, die sich senkrecht zur Längserstreckung der Strömungspfade erstreckt.
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Die Ausnehmung in jedem der Strömungspfade erstreckt sich über den vollständigen Querschnitt des porösen Materials des Strömungspfads. Die Ausnehmung jedes Strömungspfads hat bevorzugt denselben lichten Querschnitt, insbesondere V-förmig von der dem Träger gegenüberliegenden Oberfläche des porösen Materials zum Träger zulaufend oder rechteckig. Bevorzugt sind die Oberflächen jedes Strömungspfads, die die Ausnehmung begrenzen, bei Erstreckung des Trägers in einer Ebene in einem Abstand voneinander positioniert und werden durch Biegen des Trägers entlang der Ausnehmung miteinander in Kontakt gebracht, wobei optional anschließend der Träger wieder in Richtung auf eine Ebene zurückgebogen wird.
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Die Ausnehmung ist so bemessen, dass bei Anordnung bzw. Ausrichtung des Trägers in einer Ebene und bevor der Träger um die Ausnehmung auf das poröse Material zu gebogen ist, keine Flüssigkeit sich über die Ausnehmung hinweg erstrecken kann, und dass bei Biegen des Trägers um die Ausnehmung sich die Oberflächen jedes Strömungspfads, die die Ausnehmung begrenzen, kontaktieren. Die Ausnehmung weist bevorzugt einen Querschnitt auf, der in der Ebene des Trägers einen Abstand zwischen den sich gegenüberliegenden Flächen von zumindest 50 µm, bevorzugter von zumindest 100 oder zumindest 200 µm aufweist. Die Ausnehmung kann sich z.B. zwischen den Oberflächen jedes Strömungspfads, die die Ausnehmung begrenzen, über 20 bis 300 µm, z.B. 20 bis 40 µm in der Ebene des Trägers erstrecken, z.B. bis 150 bis 300 µm, z.B. 200 bis 250 µm in der Ebene der dem Träger gegenüberliegenden Oberfläche des porösen Materials erstrecken. Bevorzugt setzt sich die Ausnehmung bis in den Träger fort, so dass der Träger angrenzend an die Ausnehmung der Strömungspfade dünner ist und dort ein Biegegelenk bildet. Die Ausnehmung kann sich z.B. von 10 bis 80%, bevorzugt 30 bis 70% oder bis 50% der Dicke des Trägers in diesen erstrecken.
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In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung werden die Ausnehmungen, die eine Barriere bilden, durch Entfernen des porösen Materials mittels Laserbestrahlung erzeugt. Für Nitrocellulose kann gepulste Laserstrahlung einer Wellenlänge von 1030 nm bei einer Wiederholungsrate von 600 kHz und einer Pulsdauer von 212 ps, einer Bewegung des Laserstrahls über das poröse Material mit 2400 mm/s, bevorzugt mit 15 bis 20 Wiederholungen entlang des abzutragenden Bereichs, bei einer Pulsenergie von 9,42 bis 11,57 µJ, z.B. mit einer Laserleistung von 5,655 W zum Entfernen entlang des für die Ausnehmung abzutragenden Bereichs verwendet werden. Für Nitrocellulose mit einer Schichthöhe von 160 bis 200 µm auf transparentem Kunststoff als Träger kann damit eine Ausnehmung mit einem Abstand von ca. 70 bis 85 µm zwischen gegenüberliegenden Oberflächen in mittlerer Höhe der Schicht erzeugt werden. Eine solche Ausnehmung hat einen V-förmigen Querschnitt, der in Richtung auf den Träger zuläuft.
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Die Oberflächen jedes Strömungspfads, die die Ausnehmung begrenzen, sind offenporig.
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Das poröse Material kann offenporiges Nylon, Celluloseacetat, Polyethersulfon, vernetztes Polydextran, bevorzugt Nitrocellulose sein. Der Träger kann aus Polyester, Polypropylen, Polyethylen, Acrylpolymer, Polycarbonat oder hydrophobiertem Papier bestehen.
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Im Verfahren zur Herstellung werden die Längsseiten der Strömungspfade bevorzugt dadurch mit geschlossenen Oberflächen erzeugt, dass das poröse Material entlang der Oberflächen der Längsseiten der Strömungspfade mit Laserstrahlung behandelt werden. Zur Erzeugung der geschlossenen Oberflächen entlang der Oberflächen der Längsseiten kann gepulste Laserstrahlung einer Wellenlänge von 1030 nm bei einer Wiederholungsrate von 600 kHz bei einer Bewegung entlang der Oberflächen der Längsseiten mit 2400 mm/s bei einer Pulsenergie von 11 bis 12 µJ bei zumindest 3 Wiederholungen entlang der Oberflächen der Längsseiten eingesetzt werden. Diese Laserstrahlung wird bevorzugt von demselben Laser erzeugt, mit dem auch die Laserstrahlung zum Entfernen des Materials der Ausnehmung erzeugt wird.
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Die Strömungspfade haben bevorzugt dieselbe Schichthöhe auf dem gemeinsamen Träger, z.B. mit einer Schichthöhe von 100 bis 300 µm, bevorzugt 120 bis 270 µm, z.B. 120 bis 160 µm oder 240 bis 270 µm. Das poröse Material ist bevorzugt Nitrocellulose, bevorzugt mit einer nominellen Ausschlußgröße von 0,22 bis 0,45 µm.
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Das Aufgabematerial kann direkt mit den ersten Enden der Strömungspfade in Kontakt sein oder indirekt mit den ersten Enden der Strömungspfade in Kontakt sein, z.B. durch ein zwischen dem Aufgabematerial und den Strömungspfaden angeordnetes Reagenzreservoir und/oder eine Filterschicht. Bevorzugt enthält das Reagenzreservoir ein Bindemolekül, das für den Analyten spezifisch ist, z.B. einen gegen den Analyten gerichteten Antikörper.
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Das Aufgabematerial, das Reagenzreservoir und ein Saugmaterial kann jeweils unabhängig voneinander poröse Cellulose, Glaswolle oder eine Mischung dieser sein.
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Optional ist ein zweites Reagenzreservoir zwischen dem Aufgabematerial und dem Reagenzreservoir oder zwischen dem Reagenzreservoir und angrenzend an die Strömungspfade angeordnet. Bevorzugt wird jeweils ein zweites Reagenzreservoir von den Abschnitten der Strömungspfade gebildet, die sich zwischen dem ersten Ende des Strömungspfads, z.B. zwischen dem an den Strömungspfad angrenzenden Aufgabematerial, Filterschicht oder Reagenzreservoir einerseits, und der Ausnehmung andererseits erstreckt.
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Ein solches zweites Reagenzreservoir kann einen für den Analyten kompetitiven Antagonisten enthalten, bevorzugt enthalten zweite Reagenzreservoire vorbestimmte unterschiedliche Mengen jeweils desselben kompetitiven Antagonisten und/oder unterschiedliche kompetitive Antagonisten und erlaubt so ein Aufstockverfahren. Optional kann ein zweites Reagenzreservoir eines Strömungspfads den Analyten, optional in Mischung mit einem Antagonisten dieses aufweisen, um in dem Teststreifen eine interne Positivkontrolle für den Analyten zu bilden.
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Ein kompetitiver Antagonist des Analyten kann z.B. durch Druckverfahren mittels einer Düse auf einen Abschnitt der Strömungspfade aufgebracht werden. Ein zweites Reagenzreservoir jedes Strömungspfads erstreckt sich bevorzugt zwischen dem ersten Ende des Strömungspfads und der Ausnehmung. Ein Teststreifen mit zumindest zwei Strömungspfaden, deren Abschnitte zwischen ihrem ersten Ende und der Ausnehmung, die eine Barriere bildet, ein zweites Reagenzreservoir bilden, weist bevorzugt in jedem der zweiten Reagenzreservoire unterschiedliche Mengen jeweils desselben kompetitiven Antagonisten und/oder unterschiedliche kompetitive Antagonisten für den Analyten auf. Solche Teststreifen sind für eine quantitative Analyse des Analyten eingerichtet, da das Bindemolekül abhängig von der Menge des kompetitiven Antagonisten von diesem gebunden wird und umgekehrt proportional zur Menge des Antagonisten im Detektionsbereich bindet.
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Der Detektionsbereich weist bevorzugt ein immobilisiertes Molekül auf, das wie der Analyt und bevorzugt wie der optionale kompetitive Antagonist an das Bindemolekül bindet. Daher ist der Detektionsbereich eingerichtet, Bindemoleküle zu binden, die nicht an den Analyten oder an den optionalen kompetitiven Antagonisten gebunden sind. Das immobilisierte Molekül im Detektionsbereich kann z.B. gebundener Analyt sein, z.B. an einem Trägermolekül gebundener Analyt.
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Weiter bevorzugt weist jeder Strömungspfad zwischen dem Detektionsbereich und seinem zweiten Ende einen Kontrollbereich auf, der eingerichtet ist, Bindemoleküle unabhängig von der Anwesenheit eines Analyten oder des optionalen kompetitiven Antagonisten zu binden. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Bindemolekül ein markierter Antikörper und der Kontrollbereich weist einen für die konstante schwere Kette des markierten Antikörpers spezifischen zweiten Antikörper auf. Ein solcher zweiter Antikörper, der bevorzugt im Kontrollbereich immobilisiert ist, dient als Positivkontrolle für die Strömung von Flüssigkeit aus dem Aufgabematerial, durch das Reagenzreservoir, entlang der Strömungspfade über die Ausnehmung und den Detektionsbereich hinweg.
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Das Aufgabematerial kann mehrschichtig sein und optional eine Filterschicht aufweisen, die z.B. eingerichtet ist, Zellen einer Vollblutprobe zurückzuhalten.
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Generell kann das Aufgabematerial mit dem Reagenzreservoir einstückig ausgebildet sein.
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Im Verfahren zur Herstellung wird bevorzugt
- - ein poröses Material, das auf einem Träger angeordnet ist, insbesondere darauf festgelegt ist, durch Laserbestrahlung in zumindest zwei voneinander durch einen Abstand getrennte Strömungspfade unterteilt,
- - wobei bevorzugt deren Oberflächen der Längsseiten von einem ersten Ende zu einem gegenüberliegenden zweiten Ende zu einer flüssigkeitsundurchlässigen Oberfläche verschmolzen werden,
- - zwischen dem ersten Ende und dem zweiten Ende jedes Strömungspfads durch Laserbestrahlung eine Ausnehmung erzeugt, die sich über den vollständigen Querschnitt des Strömungspfads erstreckt und von gegenüberliegenden offenporigen Oberflächen der Strömungspfade begrenzt wird, wobei sich die Ausnehmung bevorzugt bis in den Träger fortsetzt,
- - zwischen der Ausnehmung und dem zweiten Ende jedes Strömungspfads ein Detektionsbereich durch Aufbringen eines immobilisierten Moleküls hergestellt, das wie der Analyt und bevorzugt wie der optionale kompetitive Antagonist an das Bindemolekül bindet,
- - optional zwischen dem Detektionsbereich und dem zweiten Ende jedes Strömungspfads ein Kontrollbereich durch Aufbringen eines immobilisierten zweiten Antikörpers, der gegen das markierte Bindemolekül gerichtet ist, hergestellt,
- - optional zwischen dem ersten Ende und der Ausnehmung zumindest eines der Strömungspfade durch Aufbringen des Analyten und/oder eines kompetitiven Antagonisten des Analyten ein zweites Reagenzreservoir hergestellt wird,
- - ein Reagenzreservoir, das ein markiertes Bindemolekül enthält, in Kontakt mit dem ersten Ende jedes der Strömungspfade angeordnet,
- - in Kontakt mit dem Reagenzreservoir und gegenüber den Strömungspfaden ein Aufgabematerial angeordnet,
- - optional angrenzend an die zweiten Enden der Strömungspfade ein Saugmaterial angeordnet,
- - wobei bevorzugt anschließend an das Herstellen des Detektionsbereichs, des optionalen Kontrollbereichs und optionaler zweiter Reagenzreservoire Bindestellen der Strömungspfade, optional zusätzlich des Aufgabebereichs und/oder des Reagenzreservoirs abgesättigt werden, z.B. durch Kontaktieren mit einem unspezifischen Protein, z.B. Serumalbumin oder Kasein.
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Im Verfahren zur Analyse wird ein erfindungsgemäßer Teststreifen bereitgestellt und eine Probe wird auf das Aufgabematerial aufgebracht, bevorzugt während der Teststreifen in einer Ebene angeordnet ist. Die Probe strömt durch Kapillarkräfte durch das Reagenzreservoir, durch optionale zweite Reagenzreservoire bis angrenzend an die Barriere. Nach einer Inkubationszeit, die z.B. 1 bis 10 min, z.B. 5 min betragen kann, wird die Barriere geöffnet, so dass die Probe in die zumindest zwei Strömungspfade eintreten kann. In der Ausführungsform, in der die Barriere eine Ausnehmung ist, wird die Barriere geöffnet, indem der Teststreifen um die Ausnehmung gebogen wird, bis sich die Oberflächen der Strömungspfade, die die Ausnehmung begrenzen, berühren und in der Folge Flüssigkeit über die Ausnehmung hinweg in Richtung auf das zweite Ende der Strömungspfade strömt. Optional kann der Teststreifen wieder zurück in Richtung auf die ursprüngliche Ebene gebogen werden, da sich ein Flüssigkeitsfilm über die Ausnehmung erstreckt und die Flüssigkeit strömen lässt.
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Bis zum Öffnen der Barriere kann sich ein Gleichgewicht der Probe mit dem Bindemolekül und ggf. mit dem zugesetzten Analyten und/oder einem Kompetitor des Analyten einstellen, so dass die Quantifizierung von Analyten, der in der ursprünglichen Probe enthalten war, genauer ist, weil der Anteil von Bindemolekül, der nicht an Analyten der Probe oder zugesetzten Analyten bzw. dessen Kompetitor gebunden hat und daher im Detektionsbereich bindet, die Gleichgewichtskonzentration bzw. in der Probe, ggf. mit Aufstockung, minimale freie Menge des Bindemoleküls ist. Nach der Inkubationszeit, die durch das Öffnen der Barriere bestimmt ist, enthält die Flüssigkeit zumindest einen Anteil der Probe und das markierte Bindemolekül aus dem Reagenzreservoir, sowie optional zugesetzten Analyten und/oder kompetitiven Antagonist aus einer Abteilung des Reagenzreservoirs und/oder aus einem der optionalen zweiten Reagenzreservoire. Diese Flüssigkeit strömt entlang des Detektionsbereichs, in dem ungebundenes markiertes Bindemolekül vom immobilisierten Molekül gebunden und immobilisiert wird, das wie der Analyt und bevorzugt wie der optionale kompetitive Antagonist an das Bindemolekül bindet. Im Detektionsbereich gebundenes markiertes Bindemolekül wird anhand der Markierung detektiert, z.B. durch optische Messung der Intensität der Färbung im Detektionsbereich. Dabei hat der Teststreifen den Vorteil, dass das Gleichgewicht zwischen Bindemolekül und Analyt, das sich vor der Barriere eingestellt hat, im Detektionsbereich beibehalten bzw. nicht gestört wird. An Analyten oder kompetitiven Antagonisten gebundenes markiertes Bindemolekül wird weiter entlang des Strömungspfads über den Detektionsbereich hinweg bewegt und im optionalen Kontrollbereich von einem immobilisierten zweiten Antikörper gebunden und immobilisiert. Im Kontrollbereich gebundenes Bindemolekül wird z.B. durch optische Messung der Intensität der Färbung im Kontrollbereich bestimmt. Generell weist ein markiertes Bindemolekül eine detektierbare mit dem Bindemolekül verbundene Markierung auf, bevorzugt eine optisch detektierbare Markierung, z.B. einen Nanopartikel aus Metall, insbesondere einen Goldnanopartikel, oder Metalloxid, oder einen Farbstoff.
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Bevorzugt werden Ergebnisse der Messung im Detektionsbereich und optional im Kontrollbereich in Relation zur Menge von aufgestocktem Analyten und/oder kompetitivem Antagonisten im Reagenzreservoir, insbesondere dessen Abteilungen, oder in optionalen zweiten Reagenzreservoiren gesetzt, um eine quantitative Analyse des Analyten zu erhalten.
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Die Erfindung wird nun genauer anhand von Beispielen und mit Bezug die Figuren beschrieben, die in
- - 1 schematisch eine Aufsicht auf eine Ausführungsform des Teststreifens,
- - 2 A bis C schematisch eine Ausführungsform des Teststreifens im Analyseverfahren,
- - 3 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Querschnitts durch einen Teststreifen im Bereich der Oberfläche der Längsseite eines Strömungspfads,
- - 4 eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Oberfläche der Längsseite eines Strömungspfads aus Nitrocellulose auf einem Träger,
- - 5 A-C eine rasterlasermikroskopische Analyse der Ausnehmung eines Strömungspfads
zeigen.
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Die 1 zeigt einen Teststreifen 10, der auf einem Träger 1 festgelegtes poröses Material von fünf parallelen Strömungspfaden 2 aufweist, mit deren ersten Enden 3 ein Aufgabematerial 4 durch Abteilungen 5a eines Reagenzreservoirs 5 in Kontakt stehen. Gegenüber seiner Abteilungen 5a grenzt das Reagenzreservoir 5 an das Aufgabematerial 4 an. Angrenzend an die gegenüberliegenden zweiten Enden 6 der Strömungspfade 2 ist ein gemeinsames Saugmaterial 13 auf dem Träger 1 angebracht. Optional ist eine Filterschicht 8 zwischen dem Aufgabematerial 4 und dem ersten Ende 3 angeordnet, oder eine Filterschicht 8, z.B. eine Plasmatrennschicht, ist auf der zugänglichen Oberfläche des Aufgabematerials 4 angeordnet. Zwischen dem ersten Ende 3 und dem zweiten Ende 6 ist jeder Strömungspfad 2 von einer Barriere 20 unterbrochen, die z.B. als Ausnehmung 7 ausgebildet ist. Zwischen der Barriere 20 und dem zweiten Ende 6 der Strömungspfade 2 ist ein Detektionsbereich 9 angeordnet, zwischen dem Detektionsbereich 9 und dem zweiten Ende 6 ist ein Kontrollbereich 12 angeordnet. Optional ist ein zweites Reagenzreservoir 14 zwischen dem Aufgabematerial 4 und dem Reagenzreservoir 5 oder zwischen dem Reagenzreservoir 5 und angrenzend an die Strömungspfade 2 angeordnet.
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Die 2 zeigt schematisch eine Ausführungsform des Verfahrens, in 2A ohne Probe, in 2B mit auf das Aufgabematerial 4 aufgebrachter Probe P, die keinen Analyten A enthält, und in 2C mit auf das Aufgabematerial 4 aufgebrachter Probe P, die den Analyten A enthält. Der schematisch im Längsschnitt gezeigte Teststreifen 10 hat am ersten Ende 3 des Strömungspfads 2 ein angrenzend angeordnetes Aufgabematerial 4 und ein Reagenzreservoir 5, das das Aufgabematerial 4 mit dem ersten Ende 3 des Strömungspfads 2 verbindet. Das Reagenzreservoir 5 enthält als Bindemolekül B einen markierten Antikörper, z.B. einen für Amitriptylin (AMT) spezifischen anti-AMT-Antikörper, der mit einem Gold-Nanopartikel markiert ist. Zwischen dem ersten Ende 3 und dem Detektionsbereich 9 ist als Barriere 20 eine Ausnehmung 7 angeordnet, die den Strömungspfad 2 vollständig unterbricht. Im Detektionsbereich 9 ist der Analyt AMT immobilisiert, z.B. als Konjugat von AMT mit Rinderserumalbumin (RSA) oder Nortriptylin, das ein Metabolit von Amitritptylin ist, das an den Strömungspfad 2 bindet, insbesondere in der Ausführungsform des Strömungspfads 2 aus Nitrocellulose. Zwischen dem Detektionsbereich 9 und dem zweiten Ende 6 des Strömungspfads 2 ist ein Kontrollbereich 12 angeordnet, der z.B. aus einem auf den Strömungspfad 2 aufgebrachten, bevorzugt immobilisierten zweiten Antikörper besteht, der gegen das Bindemolekül B gerichtet ist, z.B. gegen die schwere Kette eines als Bindemolekül B verwendeten Antikörpers.
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Nach Aufbringen der Probe auf das Aufgabematerial 4 und nach Ablauf einer Inkubationsdauer von z.B. 3 bis 4 min wird der Teststreifen 10, bzw. dessen Träger 1, zum Öffnen der Barriere 20 entlang der Ausnehmung 7 gebogen, bis sich die Oberflächen 11 des Strömungspfads 2, die die Ausnehmung 7 begrenzen, berühren, so dass Flüssigkeit aus dem Aufgabematerial 4 und dem Reagenzreservoir 5 durch den Abschnitt des Strömungspfads 2, der sich zwischen dessen ersten Ende 3 und der Ausnehmung 7 erstreckt, über die Ausnehmung 7 hinweg strömt. Die strömende Flüssigkeit bewegt das Bindemolekül B über den Detektionsbereich 9.
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Eine auf das Aufgabematerial 4 aufgebrachte Probe P, die keinen Analyten A enthält ( 2B), ergibt Bindemoleküle B, die keinen gebundenen Analyten A aufweisen und daher im Detektionsbereich 9 an dort immobilisiertem Analyten gebunden werden. Bindemoleküle B, die nicht im Detektionsbereich 9 gebunden werden, werden mit der Strömung der Flüssigkeit in Richtung auf das zweite Ende 6 des Strömungspfads 2 bewegt und können im Kontrollbereich 12 vom dort immobilisierten zweiten Antikörper gebunden werden.
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Zur Detektion wird die Menge der Markierung, in diesem Beispiel Goldnanopartikel, des Bindemoleküls B im Detektionsbereich 9 und bevorzugt im Kontrollbereich 12 bestimmt, bevorzugt gemessen, z.B. als Färbung.
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Bei Aufbringen einer Probe P, die den Analyten A enthält (2 C), auf das Aufgabematerial 4 wird Bindemolekül B aus dem Reagenzreservoir 5 den Analyten A binden. Nach Biegen des Teststreifens 10 um die Ausnehmung 7 wird die Barriere in dieser Ausführungsform geöffnet und in der Flüssigkeit enthaltenes Bindemolekül B, das den Analyten A gebunden hat, wird beim Strömen durch den Detektionsbereich 9 nicht am dort immobilisierten Analyten A binden, jedoch kann Bindemolekül B im Kontrollbereich 12 gebunden werden.
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Optional kann ein Vergleich der im Detektionsbereich 9 und im Kontrollbereich 12 detektierten Markierung durchgeführt werden und das Verhältnis als ein Teil der quantitativen Analyse verwendet werden.
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Beispiel 1: Herstellung von Strömungspfaden aus Nitrocellulose mit einer Ausnehmung durch die Nitrocellulose
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Als Beispiel für ein poröses Material wurde Nitrocellulose auf einem Kunststoffträger aus 100 µm dickem transparentem Polyester (Typ CN140, erhältlich von Sartorius, Göttingen) verwendet. Die Barriere wurde als Ausnehmung ausgebildet und durch Laserbestrahlen mit einem frequenzgedoppeltem Yb:KGW Festphasenlaser (Light Conversion Pharos, Litauen), Wellenlänge 1030 nm, Wiederholungsrate 600 kHz, Pulsenergie 9,42 µJ, Verfahrgeschwindigkeit über die Nitrocellulose 2400 mm/s, 3 Wiederholungen, Laserleistung 5,655 W, hergestellt.
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Die Strömungspfade wurden durch Abtragen von Nitrocellulose zwischen den herzustellenden Strömungspfaden mit demselben Laser, eingestellt auf eine Wiederholungsrate von 600 kHz, Pulsenergie 11,23 µJ, Verfahrgeschwindigkeit über die Nitrocellulose 2400 mm/s, 3 bis z.B. 20 Wiederholungen, Laserleistung 6,740 W, hergestellt.
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Die 3 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (Maßstabsbalken100 µm) des Trägers 1 mit einem Strömungspfad 2 darauf im Querschnitt im Bereich der Oberfläche der Seitenwand 2s. Die 3 zeigt, dass die Nitrocellulose des Strömungspfads 2 bis in den Träger 1 mittels der Laserstrahlung abgetragen wurde, so dass der angrenzende Bereich des Trägers 1 frei von Nitrocellulose ist und daher einen Abstand zu einem weiteren Strömungspfad herstellt. Die Laserbestrahlung hat überdies einen Einschnitt in dem Träger 1 erzeugt, der parallel zur Seitenwand 2s verläuft. Der Träger beabstandet parallele Strömungspfade in dem Bereich, in dem die Nitrocellulose abgetragen wurde, z.B. um ca. 7 µm.
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Die 4 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme (Maßstabsbalken100 µm) in Aufsicht auf den Trägers 1 mit einem Strömungspfad 2 aus Nitrocellulose darauf. Die Oberfläche der Seitenwand 2s des Strömungspfads 2 ist im Wesentlichen geschlossen. Dies zeigt, dass mittels Laserbestrahlung das poröse Material vom Träger 1 zwischen Strömungspfaden 2 abgetragen werden kann und eine flüssigkeitsundurchlässige Oberfläche der Seitenwand 2a der Strömungspfade erzeugt werden kann.
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Die 5 A-C zeigt rasterlasermikroskopische Analysen einer durch die Laserbestrahlung erzeugten Ausnehmung 7 in einem Strömungspfad aus Nitrocellulose auf einem Träger von 100 µmDicke aus Polyester. Die Analyse zeigt, dass die Ausnehmung innerhalb des Strömungspfads angrenzend an den Träger einen Abstand von ca. 71 µm zwischen den gegenüberliegenden Oberflächen 11 aufweist und sich von der Oberfläche des Strömungspfads, die dem Träger gegenüberliegt, ca. 192 µm bis in den Träger erstreckt.
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Beispiel 2: Analyse einer Probe
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Es wurde ein Teststreifen gemäß 1 verwendet, dessen Strömungspfade 2 aus Nitrocellulose mit flüssigkeitsdichten Oberflächen 2s der Seitenwände 2 bestanden, als Bindemolekül B ein muriner anti-Amitriptylin-Antikörper (5 ng je Strömungspfad) mit einer Markierung aus Goldnanopartikeln (20 nm Durchmesser), der in wässriger Lösung auf das Reagenzreservoir 5 aus Cellulose aufgebracht und anschließend optional getrocknet wurde, mit einem Nortriptylin-RSA-Konjugat als immobilisierten Molekül, das in wässriger Lösung als Detektionsbereich 9 auf die Strömungspfade 2 aufgebracht und optional getrocknet wurde, mit einem anti-Maus-Antikörper (aus Ziege), der in wässriger Lösung als Kontrollbereich 12 auf die Strömungspfade 2 aufgebracht und optional getrocknet wurde, und einem Saugmaterial 13 aus Cellulose. Die Strömungspfade 2 wurden bevorzugt nach dem Auftragen des immobilisierten Moleküls und des zweiten Antikörpers getrocknet, um diese Verbindungen auf der Nitrocellulose zu immobilisieren, und anschließend mit RSA als unspezifischem Protein, optional zusätzlich Saccharose, in wässriger Lösung getränkt, um freie Bindestellen der Nitrocellulose abzusättigen, und anschließend getrocknet. Das Reagenzreservoir wurde nach Auftragen des Bindemoleküls bevorzugt getrocknet, wobei die aufgetragene wässrige Lösung des Bindemoleküls optional ein unspezifisches Protein enthalten kann.
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Als Beispiel für eine Probe wurde wässrige phosphatgepufferte Lösung (PBS, pH 7,4) oder Blutplasma oder Vollblut, jeweils mit zugesetztem Amitriptylin als Analyt, z.B. auf eine Konzentration von 10 ng Amitriptylin /mL eingestellt, zu 200 µL auf das Aufgabematerial getropft. Diese Probe verteilte sich bis in das Reagenzreservoir und strömte bis in die Abschnitte der Strömungspfade zwischen deren ersten Enden und der Ausnehmung.
Nach einer Inkubationszeit von 5 min, gemessen nach dem Auftropfen der Probe, wurde der Teststreifen entlang der Ausnehmung gebogen, um die voneinander durch die Ausnehmung 7 beabstandeten Oberflächen 11 der Strömungspfade 2 in Kontakt miteinander zu bringen. Durch die Elastizität des Trägers 1 bog sich der Teststreifen beim Ablegen auf einen Tisch wieder zurück, so dass er etwa in einer Ebene angeordnet war. Die Flüssigkeit strömte über die Ausnehmung entlang der Detektionsbereiche 9 und der Kontrollbereiche 12 bis in das gemeinsame Saugmaterial 13, wie an der Flüssigkeitsfront Ff in 1 erkennbar ist. Die leichte Färbung, die in 1 in den Detektionsbereichen 9 und den Kontrollbereichen 12 sichtbar ist, zeigt den Nachweis des Analyten durch geringe oder abwesende Färbung bzw. Bindung des Bindemoleküls B, das den Analyten gebunden hat, im Detektionsbereich 9. Die Färbung im Kontrollbereich 12 zeigt das Binden des Anteils des Bindemoleküls an, das nicht im Detektionsbereich gebunden hat, unabhängig von der Bindung des Analyten.
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In einer weiteren Ausführungsform wies der Teststreifen in den Strömungspfaden 2 zwischen deren ersten Enden 3 und der Ausnehmung 7 ein zweites Reagenzreservoir 14 auf. Wenn das zweites Reagenzreservoir 14 durch Auftropfen einer Lösung des Analyten und anschließendes Trocknen hergestellt wurde, wurde dadurch ein Anteil der Bindemoleküle kompetitiv zum Analyten der Probe gebunden.