DE102021202830A1 - Rekombinantes Typ II-Kollagen zur therapeutischen Verwendung - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes, insbesondere nicht-denaturiertes Typ II-Kollagen zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen eines menschlichen oder tierischen Patienten.

Description

  • Die folgende Erfindung betrifft rekombinantes Typ 11-Kollagen zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen eines menschlichen oder tierischen Körpers.
  • Kollagen ist ein extrazelluläres Strukturprotein, das in Tieren vorkommt, zum Beispiel in Säugetieren, Vögeln und Fischen. Es findet sich dort in der Regel im Bindegewebe, insbesondere als Bestandteil der extrazellulären Matrix. Besonders reich an Kollagen sind Sehnen, Bänder, Knorpel und Knochen. In Pflanzen und einzelligen Organismen sind Kollagene hingegen natürlicherweise nicht anzutreffen.
  • Kollagene treten in verschiedenen, strukturell und funktionell unterschiedlichen Typen auf und unterscheiden sich unter anderem in Hinblick auf ihre Struktur, Funktion und Herkunft. Die das Kollagen aufbauenden Polypeptidketten werden in der Zelle einzeln an den Ribosomen des endoplasmatischen Retikulums in Form größerer Vorläufermoleküle synthetisiert und weisen umfangreiche repetitive (Gly-X-Y)n-Sequenzen auf, wobei X und Y jede Aminosäure sein können, meist allerdings Prolin und 4-Hydroxylprolin sind.
  • Diese Vorläufer-Polypeptidketten werden im endoplasmatischen Retikulum unter Bildung von Hydroxyprolin- und Hydroxylysinresten posttranslational an Prolin- und Lysinresten der Polypeptidkette hydroxyliert. Die Hydroxylierung dient der Stabilisierung benachbarter Kollagen-Polypeptidketten der sich in der Zelle bildenden rechtsgängigen Tripel-Helix aus jeweils drei der Vorläufer-Polypeptidketten (Prokollagen).
  • Das so gebildete Prokollagen wird intrazellulär glykosyliert, in der glykosylierten Tripel-helicalen Form (Tropokollagen) von der Zelle sezerniert und anschließend durch Peptidasevermittelte Abspaltung der terminalen Reste reifes Kollagen gebildet. Dieses lagert sich im Rahmen eines Fibrillogenese-Prozesses zu Kollagenfibrillen zusammen, die anschließend kovalent quervernetzt werden und Kollagenfasern bilden.
  • Kollagen wird häufig auch in denaturierter und dann manchmal auch als Gelatine bezeichneter Form oder in Form von deren Hydrolysaten genutzt.
  • Unterzieht man Gelatine oder Kollagen zum Erhalt von Kollagenpeptiden hydrolytischen Prozessen, insbesondere einer enzymatischen Hydrolyse, können je nach eingesetztem Kollagentyp und Herkunft sowie enzymatischen Bedingungen Kollagenhydrolysate mit unterschiedlichster Zusammensetzung und Anwendungsprofil hergestellt werden. Diese Kollagenhydrolysate stellen jedoch ein Gemisch von Peptiden dar, deren Molekulargewichte über bestimmte Größenbereiche verteilt sind. Die Verwendung solcher Kollagenhydrolysate zum Beispiel als Nahrungsergänzungsmittel oder als kosmetisches Hilfsmittel ist seit längerem bekannt, unter anderem zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Beschwerden, die im Zusammenhang mit den Knochen, den Gelenken oder dem Bindegewebe stehen.
  • So beschreibt die WO 2012/065782 aus Schweinschwartengelatine gewonnene Kollagenhydrolysate, die zur Stimulation der Biosynthese extrazellulärer Matrixproteine durch Hautzellen dienen und insbesondere für kosmetische Zwecke geeignet sind. Die WO 2012/117012 offenbart enzymatisch hydrolysiertes Kollagen aus Rinderspalt mit einem mittleren Molekulargewicht von 1500 bis 8000 Da, das gemeinsam mit einem Präbiotikum zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Osteoporose eingesetzt werden kann.
  • Obgleich für viele Anwendungen und Konsumentengruppen die Verwendung von aus tierischen Materialien gewonnenen Kollagen oder Kollagenhydrolysaten Vorteile mit sich bringt, kann mit Blick auf bestimmte Konsumentengruppen und Anwendungsprofile die Verwendung solchermaßen gewonnener Kollagenhydrolysate auch weniger wünschenswert sein. So stehen bestimmte Konsumentengruppen aus tierischen Materialien gewonnenen Rohstoffen grundsätzlich kritisch oder ablehnend gegenüber, sei es, dass Kontaminationen mit gesundheitsgefährdenden Mikroorganismen oder Agentien, zum Beispiel Verfahrenshilfsstoffen, oder unerwünschte Immunreaktionen befürchtet werden oder aus religiösen oder ethischen Motiven. Darüber hinaus umfassen die für die Gewinnung von aus tierischen Materialien gewonnenen Kollagenhydrolysaten eingesetzten Herstellverfahren häufig aufwändige und teure Aufschluss-, Reinigungs- und Weiterverarbeitungsschritte.
  • Vor diesem Hintergrund ist es nicht verwunderlich, dass Verfahren entwickelt wurden, Gelatine, Kollagen, Kollagenhydrolysate und einzelne Kollagenpeptide auf biotechnologischem Wege unter Einsatz rekombinanter Gentechnologie herzustellen.
  • So offenbart die WO 2006/052451 A2 die Herstellung von rekombinantem Kollagen Typ III in Pichia pastoris-Stämmen, die auch humane Prolylhydroxylasen exprimieren. Die WO 2005/012356 A2 offenbart die Herstellung von Gelatine aus humanem Kollagen Typ I sowie einzelner 50 kDa, 65 kDa und 100 kDa großer Kollagenpeptidspezies, jeweils in vollständig hydroxylierter, partiell und nicht-hydroxylierter Form. Olsen et al. (Protein Expression and Purification, 2005, 40, pg. 346-357) offenbart die rekombinante Herstellung einer 8,5 kDa großen Kollagenpeptidspezies aus der α1-Kette humanen Kollagens in Pichia pastoris. Die WO 01/34646 A2 offenbart ebenfalls die Herstellung einzelner rekombinanter Gelatinespezies mit sich jeweils aus dem rekombinanten Herstellweg ergebendem definiertem Molekulargewicht von bis 350 kDa, die in nicht-hydroxylierter, partiell oder vollständig hydroxylierter Form vorliegen können.
  • Typ II-Kollagen ist ein speziell in Knorpelgewebe vorkommendes Kollagen und liegt dort in der Regel in Form eines Homotrimers von α1-Ketten vor. Die Herstellung von rekombinanten Typ II-Kollagenpeptiden, deren Hydroxylierung mittels einer Prolyl-4-Hydroxylase und deren Hydrierung und Formierung zu Prokollagen und die damit einhergehende Tripel-Helix Bildung wird zum Beispiel in der US 5,593,859 beschrieben.
  • Aus US 5,399,347 ist die orale Verabreichung wasserlöslichen hochgereinigten Typ II-Kollagens aus natürlichen Quellen zur Behandlung von Arthritis beschrieben. Die Herstellung dieses Kollagens ist jedoch ausgesprochen schwierig, aufwendig und darüber hinaus kontaminationsanfällig, insbesondere auch durch Mikroben.
  • Aus US 5,750,144 , US 5,645,851 , US 5,529,786 und US 5,637,321 ist es bekannt, Tiergewebehaltige Zusammensetzungen bereitzustellen, die Typ II-Kollagen enthalten und diese oral zu applizieren, um rheumatoide Arthritis zu behandeln. Diese Dokumente offenbaren insbesondere den Einsatz von aus natürlichen tierischen Quellen gewonnenem knorpelgewebehaltigem Material, um aus diesem mittels verschiedener chemisch-physikalischer Verfahrensschritte eine Typ II-Kollagen-haltige Zusammensetzung zu erhalten. Die so erhaltenen Typ II-Kollagenhaltigen Zusammensetzungen zeichnen sich durch die Anwesenheit einerseits von nichtdenaturiertem Typ 11-Kollagen sowie andererseits einer Reihe von aus dem Ausgangsmaterial und dem Isolationsverfahren stammenden Nebenkomponenten, insbesondere Proteine, Antigene und Salze aus. Obgleich die Bereitstellung dieser Zusammensetzungen weniger komplizierte Verfahrensschritte erfordert, als die Herstellung hoch aufgereinigter Typ II-Kollagene aus natürlichen Quellen, sind die hergestellten Präparationen aufgrund ihrer Herkunft aus natürlichen Quellen von Ausgangsmaterial zu Ausgangsmaterial unterschiedlich. Darüber hinaus ist während des gesamten Herstell- und Verarbeitungsprozesses sicherzustellen, dass das in der Zusammensetzung enthaltende Typ II-Kollagen nicht-denaturiert wird und Kontaminationen mit Pathogenen vermieden werden.
  • Die US 7,083,820 und EP 1 435 906 offenbaren den Einsatz von Verfahren zur Gewinnung Tiergewebe-haltiger Zusammensetzungen, die nicht-denaturiertes Typ II-Kollagen enthalten, wobei durch spezielle Verfahrensschritte mikrobielle Verunreinigungen eliminiert werden, gleichzeitig aber auch die originale, nicht-denaturierte Form des Typ II-Kollagens erhalten bleiben soll.
  • Auch mit Blick auf die in weiten Teilen der Bevölkerung gestiegenen Ansprüche in Hinblick auf Gesundheit, Mobilität und Fitness, jeweils auch im fortgeschrittenen Alter, besteht nach wie vor ein großer Bedarf an Lebensmitteln, Nahrungsergänzungsmitteln und pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Verbesserung und/oder den Erhalt der Knorpelgesundheit sowie für die Therapie von Knorpelerkrankungen.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde, Typ II-Kollagen bereitzustellen, das die vorgenannten Nachteile überwindet, insbesondere das sich in standardisierter, verlässlicher und genau definierter Form, auch im größerem industriellen und kostengünstigen Maßstab, herstellen lässt und sich aufgrund seiner biologischen Wirksamkeit zur Anwendung in einem Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers und/oder zum Erhalt der Knorpelgesundheit eignet.
  • Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung der Lehren der unabhängigen Patentansprüche, insbesondere auch der Lehren der bevorzugten Ausführungsformen in der Beschreibung und der abhängigen Patentansprüche.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere ein nicht-denaturiertes rekombinantes Typ II-Kollagen, zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen eines menschlichen oder tierischen Patienten.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Lehre zugrunde, dass rekombinant erzeugtes Typ II-Kollagen, insbesondere auch in isolierter Form, in der Lage ist, Knorpelerkrankungen nach oraler Applikation zu therapieren. Obgleich die im Stand der Technik für die Herstellung therapeutisch wirksamer Typ II-Kollagen-Zusammensetzungen notwendigen Materialien und Verfahrensschritte, insbesondere die Nutzung natürlicher tierischer Knorpelgewebe und der Einsatz bestimmter Verfahrensschritte zum Erhalt der Nativität des in diesem Ausgangsgewebe vorhandenen Kollagens nicht eingesetzt beziehungsweise nicht durchgeführt werden und darüber hinaus die in dem Ausgangsmaterial vorhandenen Nebenkomponenten in dem erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinant hergestellten Typ II-Kollagen nicht vorhanden sind, konnte eine biologische Wirksamkeit, insbesondere eine überraschenderweise hohe biologische Wirksamkeit des gemäß der vorliegenden Verfahrensweise rekombinanten hergestellten Typ II-Kollagens gezeigt werden. Überraschenderweise ist das erfindungsgemäß bereitgestellte rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide, in der Lage, eine biologische Wirksamkeit aufzuzeigen, insbesondere eine solche, die mindestens die gleiche ist wie sie aus natürlichen Quellen gewonnenes Kollagen Typ II aufweist, insbesondere wird sogar eine verbesserte biologische Wirksamkeit bereitgestellt. In bevorzugter Ausführungsform ermöglicht es die vorliegende Erfindung, Knorpelerkrankungen in menschlichen oder tierischen Patienten aufgrund der hohen biologischen Wirksamkeit der rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, in sehr geringen Dosierungen, das heißt niedrigen Konzentrationen des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, zu therapieren.
  • Die erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, sind in besonders bevorzugter Ausführungsform befähigt, immunmodulierte Knorpelerkrankungen, insbesondere eine Autoimmunerkrankung, insbesondere Polychondritis oder rheumathoide Arthritis, zu therapieren.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform ist eine immunmodulierte Knorpelerkrankung eine durch Immunintoleranz gekennzeichnete Erkrankung.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide, zur Behandlung von Knorpelerkrankungen, wobei diese entzündliche und/oder degenerative Knorpelerkrankungen sein können, insbesondere rheumatoide Arthritis oder Arthrose.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide zur Induktion von oraler Toleranz, insbesondere zur Induktion oraler Toleranz gegen endogen vorliegendes Kollagen, insbesondere endogen vorliegendes Typ II-Kollagen, insbesondere in Knorpelgewebe vorliegendes endogenes Typ II-Kollagen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide und Zusammensetzungen umfassend rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder therapeutischen Prävention von Immunintoleranz gegenüber Kollagen Typ II, insbesondere durch Induktion von Immuntoleranz gegenüber Typ 11-Kollagen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide, für die Verwendung in einem Verfahren zur Induktion von Immuntoleranz gegenüber Kollagen Typ II, insbesondere eine Zusammensetzung deren Verabreichung zur Induktion von oraler Toleranz gegenüber Typ II-Kollagen führt.
  • Die Lehre der vorliegenden Erfindung stellt daher in vorteilhafter Weise ein reproduzierbar, biotechnologisch herstellbares rekombinantes Typ 11-Kollagen zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen zur Verfügung, das standardisiert herstellbar ist, dessen Herstellung in großtechnischem Maßstab erfolgen kann, und das kontaminationsfrei in hoher Reinheit und Ausbeute ohne die Limitierung durch natürliche Ausgangsmaterialien herstellbar ist und sich insbesondere aufgrund seiner hohen biologischen Wirksamkeit dadurch auszeichnet, dass es in geringer Dosierung einsetzbar ist.
  • Die erfindungsgemäß eingesetzten rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptide, zeichnen sich durch eine sich nach oraler Verabreichung in menschlichen oder tierischen Körpern entfaltende biologische Wirksamkeit aus, insbesondere eine immunmodulierende und/oder entzündungsmodulierende biologische Wirksamkeit. In besonders bevorzugter Ausführungsform stellt sich diese biologische Wirksamkeit insbesondere für in nicht-denaturierter, das heißt nativer, Form vorliegende rekombinante Typ II-Kollagene in Volllänge, in bevorzugter Ausführungsform aber auch für in Form rekombinanter Typ II-Kollagenpeptide vorliegende Kollagenpeptide mit verkürzter Länge dar.
  • Bevorzugt sind die erfindungsgemäß bereitgestellten Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, zur Immunmodulation und/oder Induktion oraler Toleranz befähigt, insbesondere bewirken sie eine Immunantwort und/oder Induktion oraler Toleranz im behandelten menschlichen oder tierischen Körper.
  • Die erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten Typ II-Kollagene entfalten bevorzugt eine die Synthese von Immunglobulinen supprimierende biologische Wirksamkeit und/oder eine entzündungshemmende biologische Wirksamkeit. So konnte erfindungsgemäß die Reduktion pro-inflammatorischer und die Stimulierung anti-inflammatorischer Cytokine festgestellt werden. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, erscheint es so, dass das oral applizierte, erfindungsgemäß vorgesehene rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide, vollständig oder weitgehend unbeschadet die Magen-Darm-Passage übersteht und in immunmodulierenden, insbesondere Immunsupressorzellen, insbesondere Zellen des Peyer'schen Plaque, immunmodulierende und/oder Cytokin-regulierende Reaktionen und/oder Signalkaskaden auslöst, welche unerwünschte Immunreaktionen und entzündliche Prozesse im Bereich von Knorpeln, insbesondere Gelenkknorpeln, reduzieren oder vollständig unterbinden.
  • So ist bekannt, dass endogenes Typ II-Kollagen oder Bruchstücke davon, welches in oder an geschädigten oder degenerierten Knorpelgeweben vorliegt, eine Autoimmunreaktion induzieren kann, welche im Knorpel zu Entzündungen, Immunglobulinbildung und degenerativen und destruktiven Prozessen führt, die zur weiteren Knorpeldestruktion und -degeneration beitragen und letztendlich das Erscheinungsbild von Arthrose, rheumatoider Arthritis und ähnlicher Erkrankungen mit verursachen. Die erfindungsgemäß vorgesehene orale Applikation rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, scheint eine orale Toleranz gegen endogen vorhandenes derartige unerwünschte Reaktionen auslösendes Typ II-Kollagen zu bewirken, sodass eine Therapie von Knorpelerkrankungen ermöglicht wird.
  • Die erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptide sind bevorzugt mit der Fähigkeit ausgestattet, mit Zellen des behandelten menschlichen oder tierischen Patienten zu interagieren, insbesondere mit Zellen des Peyer'sehen Plaque, und insbesondere zur Stimulierung von anti-inflammatorischen und zur Inhibierung von pro-inflammatorischen Cytokinen sowie Inhibierung von Immunglobulinen zu führen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Typ II-Kollagen in nicht-denaturierter, das heißt nativer, Form vor.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Typ II-Kollagen in Tripel-helicaler Form vor.
  • Die vorliegende Erfindung sieht in bevorzugter Ausführungsform ein rekombinantes Typ 11-Kollagen vor, das in Form eines Typ II-Kollagenpeptids, das heißt in einzelsträngiger Form, vorliegen kann oder das in mehrsträngiger, zum Beispiel zwei- oder dreisträngiger Form, hier auch als Tripel-helicale Form bezeichnet, insbesondere in Form eines Typ II-Prokollagens oder reifen Typ II-Kollagens, insbesondere in Form eines Homotrimers aus Typ II-α1-Ketten, vorliegen kann.
  • Sofern das erfindungsgemäße rekombinante Typ II-Kollagen nicht als einzelsträngiges Typ II-Kollagenpeptid vorliegt, sondern in zum Beispiel Tripel-helicaler Form vorliegt, können eins oder alle der einzelnen Kollagenpeptide, die die Tripel-helicale Form des rekombinanten Typ II-Kollagens aufbauen, gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt sein. Insbesondere treffen die in der vorliegenden Lehre offenbarten Ausführungen zu rekombinanten Typ II-Kollagenpeptiden auch auf Typ II-Kollagene zu, die einen, zwei oder drei solcher einzelsträngiger Typ II-Kollagenpeptide aufweisen, insbesondere vollständig aus diesen aufgebaut sind, insbesondere aus den erfindungsgemäßen rekombinanten Typ II-Kollagenpeptiden bestehen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform kann das rekombinante Typ II-Kollagen bovines Typ 11-Kollagen (Typ IIB-Kollagen) sein.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform kann das rekombinante Typ II-Kollagen in Form von Typ II-Prokollagen oder reifem Typ II-Kollagen vorliegen.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform kann das rekombinante Typ II-Kollagen in Tripel-helicaler Form vorliegen, insbesondere in Form eines Homotrimers aus drei Typ II-α1-Ketten.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt das rekombinante Typ II-Kollagen in nicht-denaturierter Form, hier auch als nativer Form bezeichnet, vor, das heißt es weist die natürlicherweise vorkommende Tertiär- und Quartär-Proteinstruktur auf.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform kann das rekombinante Typ 11-Kollagen in Form von vernetzten oder nicht vernetzten Fibrillen vorliegen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform kann das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein Volllängen-Kollagenpeptid sein, das heißt die vollständige Aminosäuresequenz eines natürlicherweise vorkommenden Kollagenpeptides des Typs II aufweisen.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform liegt das rekombinante Typ II-Kollagen in Form eines Typ II-Kollagenpeptids vor.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform kann das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein Kollagenpeptid vom Typ II mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 5 bis 400 kDa sein, insbesondere 10 bis 390 kDa, insbesondere 10 bis 350 kDa, insbesondere 10 bis 300 kDa, insbesondere 10 bis 110 kDa, insbesondere 40 bis 110 kDa, insbesondere 40 bis 100 kDa, insbesondere 11 bis 105 kDa, insbesondere 15 bis 100 kDa, insbesondere 20 bis 99 kDa, insbesondere 25 bis 95 kDa, insbesondere 30 bis 95 kDa, insbesondere 35 bis 95 kDa. Bevorzugt weist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Kollagenpeptid, ein Molekulargewicht in einem Bereich von 40 bis 50 kDa, insbesondere 45 kDa auf.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform kann das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid in Tripel-helicaler Form vorliegen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, der vorliegenden Erfindung vollständig oder partial hydroxyliert, vollständig oder partial glycolysiert oder vollständig oder partial hydroxyliert und glycolysiert.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform handelt es sich bei dem rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere dem rekombinanten Typ II-Kollagenpeptid, gemäß der vorliegenden Erfindung um ein nicht-hydroxyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere dem rekombinanten Typ II-Kollagenpeptid, gemäß der vorliegenden Erfindung um ein hydroxyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II- Kollagenpeptid.
  • Bevorzugt weist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere das rekombinante hergestellte Typ II-Kollagenpeptid, hydroxyliertes Prolin und/oder hydroxyliertes Lysin, auf.
  • Bevorzugt ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, ein nicht-hydroxyliertes, partiell hydroxyliertes oder vollständig hydroxyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, glykosyliert. Bevorzugt ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, an mindestens einem hydroxylierten Lysin glykosyliert. Bevorzugt ist jedes hydroxylierte Lysin des rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere des rekombinanten Typ II-Kollagenpeptids, glykosyliert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, keine Aminosäure-Modifikation auf, insbesondere keine Hydroxylierung auf. Besonders bevorzugt weist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, keine hydroxylierten und/oder glykosylierten Aminosäuren auf.
  • Bevorzugt weist das erfindungsgemäße Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, eine in Typ II-Kollagen aus Wirbeltieren, insbesondere aus Fischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugetieren, insbesondere in Schwein, Schaf, Rind, Nagetier, Känguru, Pferd oder aus Wirbellosen, insbesondere Qualle, vorkommende Aminosäuresequenz auf, insbesondere eine in Typ II-Kollagen aus Rind vorkommende Aminosäuresequenz auf.
  • Besonders bevorzugt umfasst das Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2. Bevorzugt besteht das Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No, 2.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, bevorzugt mindesten 90%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 96%, bevorzugt mindestens 97%, bevorzugt mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No, 2 auf.
  • Bevorzugt ist die Aminosäuresequenz des rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids,die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids. Bevorzugt ist die Aminosäuresequenz des rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, die Aminosäuresequenz eines natürlich nicht-vorkommenden Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids. Bevorzugt ist die Aminosäuresequenz des rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, die Aminosäuresequenz eines gentechnisch veränderten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids.
  • Besonders bevorzugt weist das erfindungsgemäße Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, eine in nicht-humanem Kollagen, insbesondere in nicht-humanem Typ II-Kollagenpeptiden, bevorzugt in der α1-Kette des nicht-humanen Typ II-Kollagens vorkommende Aminosäuresequenz auf, insbesondere eine in bovinem, porcinem, equinem, ovinem, piscinem oder avianem Kollagen vorkommende Aminosäuresequenz, insbesondere in bovinem Kollagen vorkommende Aminosäuresequenz.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, Kollagenase-resistent, insbesondere resistent gegen die Verdauung durch humane Kollagenasen.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, dazu in der Lage, orale Toleranz zu induzieren, insbesondere gegen endogen vorliegendes Kollagen, insbesondere endogen vorliegendes Typ II-Kollagen, insbesondere in Knorpelgewebe vorliegendes endogenes Typ II-Kollagen.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, dazu in der Lage, die Synthese von Immunglobulinen zu supprimieren.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, dazu in der Lage, die Synthese von pro-inflammatorischen Cytokinen zu supprimieren.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, dazu in der Lage, die Synthese von anti-inflammatorischen Cytokinen zu stimulieren.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, dazu in der Lage, die Synthese von Immunglobulinen zu supprimieren, die Synthese von pro-inflammatorischen Cytokinen zu supprimieren und die Synthese von anti-inflammatorischen Cytokinen zu stimulieren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen eines menschlichen oder tierischen Patienten ein Molekulargewicht in einem Bereich von 5 bis 400 kDa, insbesondere 10 bis 390 kDa, insbesondere 10 bis 350 kDa, insbesondere 10 bis 300 kDa, insbesondere 10 bis 110 kDa, insbesondere 40 bis 110 kDa, insbesondere 40 bis 100 kDa, insbesondere 11 bis 105 kDa, insbesondere 15 bis 100 kDa, insbesondere 20 bis 99 kDa, insbesondere 25 bis 95 kDa, insbesondere 30 bis 95 kDa, insbesondere 35 bis 95 kDa auf. Bevorzugt weist das rekombinante Typ II-Kollagen ein Molekulargewicht in einem Bereich von 40 bis 50 kDa, insbesondere 45 kDa auf.
  • In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, allein, das heißt in isolierter Form, also ohne weitere Substanzen, in der erfindungsgemäß vorgesehenen Verwendung eingesetzt.
  • In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das erfindungsgemäße rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, als homogene Präparation vor, insbesondere als homogene Präparation eines einzigen rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids,mit einem einheitlichen Molekulargewicht.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, als die einzige biologische Wirksamkeit aufweisende Substanz in der erfindungsgemäß vorgesehenen Verwendung eingesetzt.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung mindestens ein rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere mindestens ein rekombinantes Typ 11-Kollagenpeptid, aufweisende Zusammensetzungen, die neben dem mindestens einen rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere dem mindestens einen rekombinanten Typ II-Kollagenpeptid, und gegebenenfalls einem pharmazeutisch akzeptablen und/oder lebensmittelverträglichen Träger, keine weiteren Substanzen enthalten.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform liegt die mindestens ein rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere mindestens ein rekombinantes Typ II-Kollagenpeptid, aufweisende Zusammensetzung in einer für eine orale Verabreichung in einem menschlichen oder tierischen Körper geeigneten Darreichungsform vor.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, umfassend mindestens ein rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere mindestens ein rekombinantes Typ II-Kollagenpeptid, gemäß der vorliegenden Erfindung und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen und/oder nahrungsmittelverträglichen Träger und, optional, mindestens einen Zusatz- oder Hilfsstoff zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine Zusammensetzung für die Verwendung in einem Verfahren für die therapeutische Prophylaxe oder das therapeutische Behandeln von Immunintoleranzreaktionen gegenüber Typ 11-Kollagen, insbesondere endogenem Typ II-Kollagen, durch die Induktion von oraler Toleranz gegenüber Typ 11-Kollagen, insbesondere endogenem Typ II-Kollagen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung für die Verwendung in einem Verfahren zur Induktion oraler Toleranz gegenüber Typ II-Kollagen, insbesondere endogenem Typ II-Kollagen, wobei die Zusammensetzung zur Induktion von oraler Toleranz im menschlichen oder tierischen Körper führt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung umfassend rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen oder Nahrungsergänzungsmittel, oder Lebens- oder Genussmittel, zur Verwendung für die Induktion oraler Toleranz gegenüber Typ 11-Kollagen, insbesondere endogenem Typ II-Kollagen.
  • Erfindungsgemäße Zusammensetzungen für eine orale Verabreichung können insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, Nahrungsergänzungsmittel oder Lebens- und Genussmittel sein. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen pharmazeutische Zusammensetzungen. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen Nahrungsergänzungsmittel.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein erfindungsgemäßes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, sowie die pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers. Demnach kann vorgesehen sein, das erfindungsgemäße Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu verabreichen. Besonders vorteilhaft wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung beispielsweise im Formen von Tabletten, Lutschtabletten, Kautabletten, Pulver, Granulat, Hartkapsel, Weichkapsel, Kapsel, Beißkapseln, Dragees, Pastillen, Extrudat, Säften, Suspension, Gels oder Salben verabreicht.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das erfindungsgemäß eingesetzte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, in einer eine retardierte intestinale Freisetzung ermöglichenden Darreichungsform, insbesondere Retard-Kapsel, vor.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform liegt die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einer zur oralen Verabreichung geeigneten Form vor, insbesondere mit einer Dosis von 1 bis 60 mg/Tag, insbesondere 5 bis 50 mg/Tag, rekombinantes Typ II-Kollagen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Nahrungsergänzungsmittel, umfassend ein erfindungsgemäßes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, und mindestens einen Nahrungsmittel-akzeptablen Träger, sowie das Nahrungsergänzungsmittel zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers. Demnach kann vorgesehen sein, das erfindungsgemäße Typ 11-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, in Form eines Nahrungsergänzungsmittels zu verabreichen. Besonders vorteilhaft liegt das erfindungsgemäße Nahrungsergänzungsmittel als Hartkapsel, Weichkapsel, Kapsel, Beißkapsel, Tablette, Dragee, Pastille, Sachet, Extrudat, Lösung, Suspension oder Gel, zum Beispiel in einer Ampulle, als Granulat oder Pulver vor.
  • Gegenstand der Erfindung ist auch ein Lebensmittel oder Genussmittel, umfassend ein erfindungsgemäßes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, sowie das Lebensmittel oder Genussmittel zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Lebensmittel oder Genussmittel um einem Schokoriegel, Proteinriegel, Cerealienriegel, Instantpulver zur Zubereitung von Getränken, Milch, Milchprodukte, zum Beispiel Joghurt, Molke oder Quark und Milchersatz, zum Beispiel Sojamilch, Reismilch, Mandelmilch und Kokosmilch, functional food oder ein Getränk, zum Beispiel Erfrischungs- oder Fitnessgetränk.
  • Sofern das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nicht als einziger biologische Wirksamkeit aufweisender Bestandteil einer Zusammensetzung, insbesondere einer pharmazeutischen Zusammensetzung, eines Nahrungsergänzungsmittels, oder eines Lebensmittels oder Genussmittels, eingesetzt werden soll, kann es mit einer oder mehreren weiteren Zusatz- oder Hilfsstoffen kombiniert werden, insbesondere solchen, die einen positiven Effekt auf die allgemeine Gesundheit aufweisen, insbesondere auf die Knorpelgesundheit und/oder Ausdauerleistungsfähigkeit. Erfindungsgemäß bevorzugte Hilfsstoffe sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vitamin C, Vitaminen der B-, D-, E- und K-Reihe, Omega-3-Fettsäuren, Omega-6-Fettsäuren, konjugierten Linolensäuren, Coffein und dessen Derivaten, Guaranäextrakt, Hagebuttenextrakt, Grünteeextrakt, Epigallocatechingallat, Kreatin, L-Carnitin, α-Liponsäure, N-Acetylcystein, NADH, D-Ribose, Magnesiumaspartat, Antioxidantien wie Anthocyane, Carotinoide, Flavonoide, Resveratrol, Glutathion und Superoxiddismutase, Mineralstoffen wie Eisen, Magnesium, Calcium, Zink, Selen und Phosphor, sowie weiteren Proteinen, Hydrolysaten und Peptiden wie Soja-, Weizen- und Molkenprotein.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung, insbesondere die pharmazeutische Zusammensetzung, das Nahrungsergänzungsmittel oder das Lebensmittel, beziehungsweise Genussmittel, einen Hilfsstoff, zum Beispiel Chondrotin, Chondrotinsulfat, Hyaluronsäure, Aflapin, Univestin 5-Glocsin, Glucosamin, Glucosaminsulfat und/oder Methylsulfonylmethan (MSM) aufweist.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung, insbesondere die pharmazeutische Zusammensetzung, das Nahrungsergänzungsmittel oder ein Lebensmittel, beziehungsweise Genussmittel, einen Zusatzstoff aufweist, wobei der Zusatzstoff ein rekombinant erzeugtes Kollagenhydrolysat, ein aus natürlichen Quellen stammendes Kollagenhydrolysat, ein rekombinant erzeugtes Typ I-Kollagen, ein aus natürlicher Quelle gewonnenes Typ 1-Kollagen oder eine Kombination davon sein kann.
  • In weiterer bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die erfindungsgemäßen Produkte, insbesondere die pharmazeutische Zusammensetzung, das Nahrungsergänzungsmittel, oder das Lebensmittel oder Genussmittel, neben dem erfindungsgemäßen Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, keine weiteren Proteine oder Peptide, insbesondere keine weiteren Kollagenpeptide.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Therapie, insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung von Knorpelerkrankungen, gemäß denen dem menschlichen oder tierischen Körper eine für den therapeutischen Zweck ausreichende Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, gegebenenfalls mit einem Träger und, optional, einem Hilfs- oder Zusatzstoff, oral verabreicht wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Induktion oraler Toleranz gegenüber Typ II-Kollagen, insbesondere endogenes Typ II-Kollagen, in einem menschlichen oder tierischen Körper, umfassend die Verabreichung einer für einen therapeutischen Zweck ausreichenden Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptide, gegebenenfalls mittels eines Trägers und, optional, einem Hilfs- oder Zusatzstoff, wobei die Verabreichung oral erfolgt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder therapeutischen Prophylaxe von Immunintoleranz gegenüber Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, umfassen die orale Verabreichung einer für einen therapeutischen Zweck ausreichenden Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptide, gegebenenfalls mittels eines Trägers und, optional, einem Hilfs- oder Zusatzstoff.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von rekombinantem Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptiden, in nicht-therapeutischen Verfahren zum Erhalt der Knorpelgesundheit eines Menschen oder Tieres, gemäß denen dem menschlichen oder tierischen Körper eine für der Erhalt der Knorpelgesundheit ausreichende Menge mindestens eines der erfindungsgemäßen rekombinanten Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, gegebenenfalls mit einem Träger und, optional, einem Hilfs- oder Zusatzstoff, oral verabreicht wird. In dieser besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Mensch oder das Tier keine Knorpelerkrankung auf. In besonders bevorzugter Ausführungsform kann demgemäß eine orale Administration von rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptiden, an einen Menschen oder ein Tier vorgesehen sein, welcher beziehungsweise welches keine Knorpelerkrankung aufweist und durch die Verabreichung des rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptids,seine Knorpelgesundheit beibehält.
  • Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, umfassend die Verfahrensschritte:
    1. a) Bereitstellen eines Expressionssystems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, codiert,
    2. b) Kultivieren des Expressionssystems unter Bedingungen, die die Expression des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, ermöglichen, und
    3. c) Gewinnen des erfindungsgemäßen Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids.
  • Das erfindungsgemäß bereitgestellte Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass ein genau definiertes, rekombinant hergestelltes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, gewonnen wird, welches sich, insbesondere aufgrund dessen biologischer Wirksamkeit, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers oder zum Erhalt der Knorpelgesundheit eignet.
  • Das erfindungsgemäß bereitgestellte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, weist aufgrund seiner rekombinanten Herstellweise im Vergleich zu hydrolytisch aus natürlichen Quellen gewonnenem Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptiden, eine besonders hohe Reinheit auf. Es lässt sich dabei in den verschiedensten Expressionssystemen auch im industriellen Maßstab ohne unerwünschte Kontaminationen bereitstellen, wobei das erfindungsgemäße Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, gleichzeitig vorteilhafterweise eine biologische Wirksamkeit aufweist.
  • Rekombinantes Typ II-Kollagen und dessen Herstellung wird zum Beispiel in US 5,593,859 beschrieben. Dieses Dokument offenbart die Gewinnung von rekombinantem Typ II-Kollagenpeptiden sowie die Hydroxylierung und Fibrillogenese zur Gewinnung von Prokollagen in rekombinanter Zellkultur und wird hinsichtlich der Herstellung von rekombinantem Typ II-Kollagen sowie rekombinantem Typ II-Kollagenpeptiden, insbesondere auch in hydroxylierter und Tripel-helicaler Form, vollinhaltlich in den vorliegenden Offenbarungsgehalt mit einbezogen.
  • Die erfindungsgemäß gefundene biologische Wirksamkeit des Typ II-Kollagens, insbesondere der Typ II-Kollagenpeptide, und damit verbunden dessen beziehungsweise deren Eignung zur Anwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers kommt in bevorzugter Ausführungsform vorteilhafterweise bereits dem unmittelbar aus dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptiden, zu, ohne dass es weiterer Verarbeitungsschritte bedarf. So weisen sowohl die hydroxylierten als auch die nicht-hydroxylierten Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, gemäß der vorliegenden Erfindung in bevorzugter Ausführungsform eine biologische Wirksamkeit auf, insbesondere zumindest die gleiche biologische Wirksamkeit wie aus natürlichen Quellen gewonnenes Typ II-Kollagen, besonders bevorzugt eine bessere biologische Wirksamkeit als aus natürlichen Quellen gewonnenes Typ II-Kollagen.
  • Besonders vorteilhaft ist hierbei, dass die erfindungsgemäßen Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, überraschenderweise selbst in nicht-hydroxylierter Form eine biologische Wirksamkeit aufweisen, bevorzugt die gleiche biologische Wirksamkeit wie aus natürlichen Quellen gewonnenes Typ II-Kollagen, besonders bevorzugt eine bessere biologische Wirksamkeit als aus natürlichen Quellen gewonnenes Typ II-Kollagen.
  • Bevorzugt zeigen sowohl die hydroxylierten als auch die nicht-hydroxylierten Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, gemäß der vorliegenden Erfindung eine biologische Wirksamkeit, bevorzugt zumindest die gleiche biologische Wirksamkeit wie aus natürlichen Quellen gewonnenes Typ II-Kollagen, besonders bevorzugt eine bessere biologische Wirksamkeit wie aus natürlichen Quellen gewonnenes Typ II-Kollagen.
  • Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, insbesondere eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle.
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem eine Wirtszelle ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzelle, Hefezelle, Pilzzelle, Säugetierzelle, Insektenzelle und Pflanzenzelle.
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle, eine Bakterienzelle, insbesondere der Arten Escherichia coli oder Bacillus subtilis.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle, eine Hefezelle, insbesondere der Arten Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oder Ogataea angusta (Hansenula polymorpha), insbesondere Pichia pastoris.
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle, eine Pilzzelle, insbesondere der Art Aspergillus niger.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Expressionssystem, insbesondere die Wirtzelle, eine Säugetierzelle, insbesondere eine CHO-Zelle, eine HeLa-Zelle oder eine HEK293-Zelle.
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle, eine Insektenzelle, insbesondere eine Sf-9, Sf-21 oder Tn-5 Zelle.
  • Bevorzugt ist das Expressionssystem, insbesondere die Wirtszelle, eine Pflanzenzelle, insbesondere eine Mais- oder Tabakzelle.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist. Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist.
  • Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem, ein Expressionssystem, das Prolylhydroxylase- und/oder Lysylhydroxylase-Aktivität aufweist. Bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die Prolylhydroxylase- und/oder Lysylhydroxylase-Aktivität aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst. Besonders bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst, so dass in Verfahrensschritt c) ein in vivo hydroxyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid gewonnen wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst. Besonders bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst, so dass in Verfahrensschritt c) ein in vivo hydroxyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, gewonnen wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst und mindestens eine Expressionskassette, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst. Besonders bevorzugt ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem eine Wirtszelle, die mindestens eine Expressionskassette aufweist, die eine Prolyl-4-hydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst und mindestens eine Expressionskassette, die eine Lysylhydroxylase-codierende Polynukleotidsequenz umfasst, so dass in Verfahrensschritt c) ein in vivo hydroxyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid gewonnen wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, insbesondere eines in vivo hydroxylierten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ 11-Kollagenpeptids, umfassend die Verfahrensschritte
    1. a) Bereitstellen eines Expressionssystems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, codiert und wobei das Expressionssystem zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids befähigt ist,
    2. b) Kultivieren des Expressionssystems unter Bedingungen, die die Expression und Hydroxylierung des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, ermöglichen,
    3. c) Gewinnen des erfindungsgemäßen Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, insbesondere des in vivo hydroxylierten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ 11-Kollagenpeptids.
  • Mit Hilfe des vorgenannten Verfahrens ist es somit vorteilhafterweise möglich, ein in vivo hydroxyliertes rekombinant hergestelltes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, zu erhalten, welches sich je nach verwendetem zellbasierten Expressionssystem durch ein spezifisches Muster an posttranslationalen Modifikationen, insbesondere Hydroxylierungen und Glykosylierungen auszeichnen. Auf diese Weise ist es vorteilhafterweise insbesondere möglich, direkt, das heißt ohne die Notwendigkeit einer nachträglichen Modifizierung, ein Typ II-Kollagen, insbesondere ein rekombinant hergestelltes Typ II-Kollagenpeptid, mit gewünschter biologischer Wirksamkeit zur Anwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers zu erhalten.
  • In bevorzugter Ausführungsform weist das erfindungsgemäß hergestellte rekombinante in vivo hydroxylierte Kollagenpeptid eine biologische Wirksamkeit auf. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem ein Expressionssystem, das nicht dazu befähig ist, eine Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Kollagenpeptids zu bewirken, insbesondere weist das in Schritt a) bereitgestellte Expressionssystem keine Prolylhydroxylase- und Lysylhydroxylase-Aktivität auf.
  • Somit umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten erfindungsgemäß verwendbaren Kollagenpeptids, insbesondere eines nicht-hydroxylierten Kollagenpeptids, umfassend die Verfahrensschritte
    1. a) Bereitstellen eines Expressionssystems, das mindestens eine Expressionskassette aufweist, wobei die Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz aufweist, die ein Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, codiert und wobei das Expressionssystem nicht zur Hydroxylierung von Prolin-, Lysin- oder Prolin- und Lysinresten des exprimierten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, befähigt ist,
    2. b) Kultivieren des Expressionssystems unter Bedingungen, die die Expression des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, ermöglichen,
    3. c) Gewinnen des erfindungsgemäßen Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, insbesondere des nicht-hydroxylierten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine Nukleotidsequenz der mindestens einen Expressionskassette codon-optimiert, das heißt, dass diejenigen Codons in der Nukleotidsequenz, die vom Translationssystem des bereitgestellten Expressionssystems, insbesondere des bereitgestellten zellbasierten Expressionssystems, insbesondere der bereitgestellten Wirtszelle, nicht oder nicht bevorzugt genutzt werden, durch solche ersetzt werden, die vom Translationssystem des bereitgestellten Expressionssystems, insbesondere des bereitgestellten zellbasierten Expressionssystems, insbesondere der bereitgestellten Wirtszelle, bevorzugt verwendet werden ohne dadurch die Aminosäuresequenz des codierten Peptids oder Proteins zu verändern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, eines Wirbeltiers, insbesondere eines Säugetiers, zum Beispiel des Menschen oder eines nicht-menschlichen Säugetiers, zum Beispiel Pferd, Känguru, Nagetier, Schwein, Schaf oder Rind, eines Vogels, zum Beispiel Huhn, eines Fisches, einer Amphibie, eines Reptils oder eines wirbellosen Tieres, zum Beispiel Qualle.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist umfasst die in Schritt a) bereitgestellte Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1.
  • Besonders bevorzugt umfasst die in Schritt a) bereitgestellte Expressionskassette mindestens eine Nukleotidsequenz mit einer Sequenzidentität von mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 96%, bevorzugt mindestens 97%, bevorzugt mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, zu der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1.
  • Besonders bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2. Bevorzugt besteht das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No, 2.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, bevorzugt mindesten 90%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt mindestens 96%, bevorzugt mindestens 97%, bevorzugt mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No, 2 auf.
  • Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein natürlich vorkommendes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid kein natürlich vorkommendes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid.Bevorzugt ist das durch die Nukleotidsequenz codierte Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein gentechnisch verändertes Kollagenpeptid.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert die mindestens eine Nukleotidsequenz ein Typ 11-Kollagenpeptid mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 5 bis 400 kDa, insbesondere 10 bis 390 kDa, insbesondere 10 bis 350 kDa, insbesondere 10 bis 300 kDa, insbesondere 10 bis 110 kDa, insbesondere 40 bis 110 kDa, insbesondere 40 bis 100 kDa, insbesondere 11 bis 105 kDa, insbesondere 15 bis 100 kDa, insbesondere 20 bis 99 kDa, insbesondere 25 bis 95 kDa, insbesondere 30 bis 95 kDa, insbesondere 35 bis 95 kDa, insbesondere von 40 bis 50 kDa, insbesondere 45 kDa.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Verfahren dadurch ausgezeichnet, dass in Verfahrensschritt b) Bedingungen gewählt werden, die die Formierung eines nicht-denaturierten, also nativen, Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids,ermöglichen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Verfahren dadurch ausgezeichnet, dass in Verfahrensschritt b) Bedingungen gewählt werden, die die Formierung einer Tripel-helicalen Form des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids,ermöglichen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von homogenen und isolierten Präparationen spezifischer Typ II-Kollagenpeptide mit einem einheitlichen Molekulargewicht führen.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform sieht die Erfindung vor, auch Gemische derartig hergestellter isolierter und homogener Präparationen von Typ II-Kollagenpeptidenmit jeweils einheitlichem Molekulargewicht bereitzustellen.
  • Die Erfindung sieht auch vor, aus mittels der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten gegebenenfalls homogen und isoliert vorliegenden Typ II-Kollagenpeptiden mit einem einheitlichen Molekulargewicht durch Lyse, insbesondere Hydrolyse, rekombinante Kollagenpeptidhydrolysate bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung sieht insbesondere vor, sowohl die homogen isolierten Typ II-Kollagenpeptide mit einheitlichem Molekulargewicht, deren Mischungen oder deren Hydrolysate für die erfindungsgemäß vorgesehene orale Therapie von Knorpelerkrankungen eines menschlichen oder tierischen Körpers vorzusehen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die erfindungsgemäßen Verfahren dadurch ausgezeichnet, dass im Anschluss an Verfahrensschritt b) oder c) in einem Verfahrensschritt d) in einem durch Lyse, insbesondere Hydrolyse, des exprimierten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids,ein rekombinantes Typ II-Kollagenpeptidhydrolysat erhalten wird.
  • Das erfindungsgemäß durch Verfahrensschritt d) erhaltene Typ II-Kollagenpeptidhydrolysat kann entweder in Form dieses Typ II-Kollagenhydrolysats oder nach Isolierung eines oder mehrerer, vorzugsweise dann homogen und isoliert vorliegender, Typ II-Kollagenpeptids als erfindungsgemäßes rekombinantes Typ II-Kollagenpeptid eingesetzt werden.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann auch vorgesehen sein, dass homogen und isoliert vorliegende Typ II-Kollagenpeptide miteinander vermischt werden und so ein Gemisch aus rekombinanten Typ II-Kollagenpeptidendarstellen.
  • Die Erfindung betrifft daher in besonders bevorzugter Ausführungsform auch ein rekombinantes Typ II-Kollagenpeptid, welches in isolierter homogener einheitliches Molekulargewicht aufweisender Form vorliegt, oder als ein rekombinantes Typ II-Kollagenpeptid, welches in einem Gemisch mit rekombinanten oder natürlichen, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptiden vorliegt, oder in einem Hydrolysat eines rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptids,vorliegt.
  • Die erfindungsgemäß einsetzbaren das rekombinante Typ II-Kollagenpeptid codierenden Nukleotidsequenzen können in fachüblicher Weise erhalten werden, so wie zum Beispiel in der WO 93/07889 , US 2006/0147501 , US 5,593,859 oder US 2008/0081353 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäß verwendbare, vorzugsweise mit einem der vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte, Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers ein nicht-hydroxyliertes, partial hydroxyliertes oder vollständig hydroxyliertes Typ II-Kollagenpeptid, bevorzugt ein nicht-hydroxyliertes Typ II-Kollagenpeptid, bevorzugt ein partial hydroxyliertes Typ II-Kollagenpeptid, bevorzugt ein vollständig hydroxyliertes Typ II-Kollagenpeptid.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäß verwendbare, vorzugsweise mit einem der vorstehenden Verfahren hergestellte, Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptid, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung von Knorpelerkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers ein glykosyliertes Kollagenpeptid. Bevorzugt ist das Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid in vivo glykosyliert, bevorzugt ex vivo glykosyliert.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäß verwendbare, vorzugsweise mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte, Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein nicht-glykosyliertes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid.
  • Unter dem Begriff „biologische Wirksamkeit“ wird erfindungsgemäß bevorzugt die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, zur Immunmodulation verstanden, insbesondere zur Suppression der Synthese von Immunglobulinen, insbesondere IgE, IgA, IgM und/oder IgG.
  • Unter dem Begriff „biologische Wirksamkeit“ wird erfindungsgemäß bevorzugt auch die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, verstanden, die Bildung und Aktivität von pro-inflammatorischen Cytokinen, insbesondere TNFα, IL-6 und IPNγ, zu supprimieren oder die Synthese und Aktivität anti-inflammatorischer Cytokine, insbesondere IL-4, IL-10 und TGF-β1, zu stimulieren, insbesondere von bei dem.
  • Unter dem Begriff „biologische Wirksamkeit“ wird erfindungsgemäß bevorzugt verstanden, dass die erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, zur Immunmodulation, insbesondere zur Suppression der Synthese von Immunglobulinen, insbesondere IgE, IgA, IgM und/oder IgG, zur Suppression der Bildung von pro-inflammatorischen Cytokinen, insbesondere TNFα, IL-6 und IPNγ, und zur Stimulation der Synthese anti-inflammatorischer Cytokine, insbesondere IL-4, IL-10 und TGF-ß1, befähigt sind.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform wird die biologische Wirksamkeit insbesondere bestimmt mittels des Fachmannes geläufiger Nachweisverfahren für immunmodulierende sowie anti-inflammatorische Cytokine stimulierende und pro-inflammatorische Cytokine supprimierende Aktivitäten von Substanzen. Insbesondere wird die biologische Aktivität im Sinne der vorliegenden Erfindung bestimmt mittels der Verfahrensweise gemäß des Beispiels 2. Unter dem Begriff „biologische Wirksamkeit“ wird erfindungsgemäß bevorzugt auch die Fähigkeit der erfindungsgemäß verwendbaren Typ II-Kollagene, insbesondere Typ II-Kollagenpeptide, zur Induktion oraler Toleranz verstanden. In besonders bevorzugter Ausführungsform wird das Vorliegen oraler Toleranz bestimmt mittels des Fachmanns geläufiger Nachweisverfahren für die Bestimmung der Fähigkeit einer Substanz orale Toleranz zu induzieren, insbesondere mittels der Verfahrensweise gemäß des Beispiels 2.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind pro-inflammatorische Cytokine insbesondere TNFα, IL-6 und IFN-Gamma.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind anti-inflammatorische Cytokine insbesondere IL-4, IL-10 und TGF-β1.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Suppression“ die teilweise oder vollständige Unterdrückung einer Synthese von Proteinen verstanden, die sich insbesondere als Reduktion oder Inhibierung der Proteinsynthese oder als Reduktion oder Inhibierung der die Proteine betreffenden mRNA-Synthese darstellen kann.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Kollagen“ in fachüblicher Weise verstanden, insbesondere so wie beispielsweise in der WO 01/34646 definiert. In weiterer bevorzugter Ausführungsform wird unter dem Begriff „Kollagen“ ein die Sequenz Glycin-Prolin, Glycin-4-Hydroxyprolin oder Glycin-X-4-Hydroxyprolin, bevorzugt das repetitive Motiv (Gly-X-Y)n, aufweisendes Kollagen- Protein oder Peptid verstanden, wobei X und Y jede Aminosäure sein können, vorzugsweise Prolin und 4-Hydroxylprolin sind. Besonders bevorzugt wird unter dem Begriff „Kollagen“ ein das repetitive Motiv (Gly-Pro-Y)n und/oder (Gly-X-Hyp)m aufweisendes Peptid verstanden, wobei X und Y jede Aminosäure sein können.
  • Ein „Typ II-Kollagen“ gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Kollagen, wie fachüblich gemäß vorstehenden Ausführungen verstanden, wobei das Typ II-Kollagen die Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden Typ II-Kollagens aufweist, insbesondere die Aminosäuresequenz eines Typ II-Kollagens eines Wirbeltieres, insbesondere Schwein, Schaf, Rind, Nagetier, Pferd, Vogel, Fisch, Reptil oder Amphibiums oder eines Wirbellosen, insbesondere Qualle.
  • Das Typ 11-Kollagen kann als monomeres Kollagenpeptid, hier auch als einzelsträngiges Kollagenpeptid bezeichnet, oder als mindestens zwei, insbesondere drei Kollagenpeptide aufweisendes Di- oder Trimer, insbesondere Trimer, aus insbesondere den gleichen einzelsträngigen Kollagenpeptiden, vorliegen. Insbesondere kann das Typ II-Kollagen als Tripelhelicales Typ II-Kollagenpeptid, insbesondere natives Typ II-Kollagen, vorliegen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Typ 11-Kollagenpeptid“ ein einzelsträngiges Typ II-Kollagenpeptid verstanden, das eine in Typ II-Kollagen gemäß vorstehender Definition vorkommende Aminosäuresequenz aufweist, wobei es sich bei dem Peptid um ein Oligopeptid oder Polypeptid handelt. Dabei kann das Typ 11-Kollagenpeptid insbesondere in chemisch-modifizierter Form, insbesondere hydroxylierter und/oder glykosylierter Form, vorliegen oder nicht modifiziert sein.
  • Bevorzugt kann das erfindungsgemäß verwendete rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, eine Sequenzabwandlung, insbesondere eine funktionserhaltende Sequenzabwandlung eines natürlich vorkommenden Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, aufweisen.
  • Unter einem „Typ II-Kollagen“ wird demgemäß auch eine funktionserhaltene Sequenzabwandlung eines natürlich vorkommenden Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, verstanden, insbesondere wenn diese auf Aminosäureebene eine Aminosäuresequenz-Identität von mindestens 80% zu der Aminosäuresequenz des aus einem natürlich vorkommenden Typ II-Kollagens aufweisen, insbesondere mindestens 85%, insbesondere mindestens 90%, insbesondere mindestens 95%, insbesondere mindestens 96%, insbesondere mindestens 97%, insbesondere mindestens 98%, insbesondere mindestens 99% Aminosäuresequenz-Identität. Ein Typ 11-Kollagen liegt demgemäß erfindungsgemäß dann vor, wenn das rekombinante Typ II-Kollagen entweder exakt die Aminosäuresequenz aufweist, die in einem natürlich vorkommenden Typ II-Kollagen vorkommt oder wenn eine funktionserhaltene Sequenzabwandlung mit einer Aminosäuresequenz-Identität von mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 91%, mindestens 92%, mindestens 93%, mindestens 94%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98%, mindestens 99% gegenüber einem natürlich vorkommenden Typ II-Kollagen, insbesondere gegenüber natürlich vorkommendem Typ 11-Kollagen aus einem Wirbeltier, insbesondere Schwein, Schaf, Rind, Nagetier, Känguru, Pferd, einem Vogel, einem Reptil, einem Amphibium oder einem Fisch oder einem Wirbellosen, insbesondere Qualle, vorliegt, insbesondere wenn diese Aminosäure-Identität im Vergleich zu einer natürlich vorkommenden Typ II-Kollagen-Aminosäuresequenz aus Rind vorliegt.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird die Aminosäuresequenz-Identität unter Verwendung des Smith-Waterman-Algorithmus (SSE2, Michael Farrar, 2006, 7.2 November 2010) mit den Parametern BL50-Matrix (15:-5), Open/ext: -12/-2, ermittelt.
  • Unter dem Begriff „funktionserhaltende Sequenzabwandlung“ wird erfindungsgemäß die Abwandlung einer gegebenen, insbesondere natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, insbesondere der Austausch, das Hinzufügen und/oder die Deletion einzelner oder mehrerer Aminosäuren, verstanden, die zwar zu einer von der gegebenen Aminosäuresequenz abweichenden Aminosäuresequenz führt, die abgewandelte Aminosäuresequenz jedoch die für die gegebene Aminosäuresequenz charakteristische Funktion, insbesondere deren biologische Wirksamkeit, beibehält.
  • Bevorzugt wird unter einer „funktionserhaltenden Sequenzabwandlung“ eine Abwandlung einer gegebenen, insbesondere natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz verstanden, bei der die für die gegebene Aminosäuresequenz charakteristische Funktion, insbesondere eine biologische Wirksamkeit zu mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95%, bevorzugt 100%, beibehalten wird. Weiter bevorzugt wird erfindungsgemäß unter einer „funktionserhaltenden Sequenzabwandlung“ eine Abwandlung einer gegebenen Aminosäuresequenz verstanden, bei der die abgewandelte Aminosäuresequenz mindestens 50%, bevorzugt mindestens 55%, bevorzugt mindestens 60%, bevorzugt mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70%, bevorzugt mindestens 75%, bevorzugt mindestens 80%, bevorzugt mindestens 85%, bevorzugt mindestens 90%, Sequenzhomologie zu der gegebenen Aminosäuresequenz aufweist.
  • Besonders bevorzugt ist eine Sequenzabwandlung, insbesondere eine „funktionserhaltende Sequenzabwandlung“ im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Abwandlung einer gegebenen, insbesondere natürlicherweise vorkommenden Aminosäuresequenz, bei der eine oder mehrere Aminosäuren mit bestimmten chemisch-physikalischen Eigenschaften durch eine oder mehrere Aminosäuren mit jeweils gleichen oder ähnlichen chemisch-physikalischen Eigenschaften ersetzt wurden, insbesondere beispielsweise eine Aminosäure mit einer unpolaren Seitenkette (beispielsweise Ala, Val, Met, Leu, Ile, Pro, Trp, Phe) durch eine andere Aminosäure mit einer unpolaren Seitenkette (beispielsweise Ala, Val, Met, Leu, Ile, Pro, Trp, Phe), eine Aminosäure mit einer polaren, neuralen Seitenkette (beispielsweise Tyr, Thr, Gln, Gly, Ser, Cys, Asn) durch eine andere Aminosäure mit einer polaren, neuralen Seitenkette (beispielsweise Tyr, Thr, Gln, Gly, Ser, Cys, Asn), eine Aminosäure mit einer sauren Seitenkette (beispielsweise Glu, Asp) durch eine andere Aminosäure mit einer sauren Seitenkette (beispielsweise Glu, Asp) und/oder eine Aminosäure mit einer basischen Seitenkette (beispielsweise Lys, Arg, His) durch eine andere Aminosäure mit einer basischen Seitenkette (beispielsweise Lys, Arg, His), ersetzt wurde. Gemäß dieser Ausführungsform bleiben die chemisch-physikalischen Eigenschaften einer gegebenen Aminosäuresequenz in der „funktionserhaltenden Sequenzabwandlung“ erhalten oder ändern sich nur geringfügig.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die Sequenzabwandlung, insbesondere eine „funktionserhaltende Sequenzabwandlung“ darin besteht, dass mindestens eine Aminosäure einer gegebenen Aminosäuresequenz, insbesondere einer natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, bevorzugt mindestens eine nicht-essentielle Aminosäure, insbesondere Ala, Asn, Asp, Glu, Ser, der gegebenen Aminosäuresequenz, insbesondere der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, durch mindestens eine ganz bestimmte Aminosäure, insbesondere mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, ersetzt wurde, wobei die für die gegebene Aminosäuresequenz, insbesondere die natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, charakteristische Funktion, insbesondere die biologische Wirksamkeit, insbesondere die biologische Wirksamkeit gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere des in Beispiel 2 dargestellten Nachweises, beibehalten wird.
  • Unter einer Sequenzabwandlung, insbesondere eine „funktionserhaltenden Sequenzabwandlung“ wird erfindungsgemäß auch die Abwandlung einer gegebenen Aminosäuresequenz, insbesondere einer natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, verstanden, die darin besteht, dass der gegebenen Aminosäuresequenz, insbesondere der natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, mindestens eine Aminosäure, bevorzugt mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, hinzugefügt wurde, wobei die für die gegebene Aminosäuresequenz, insbesondere die natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz, charakteristische Funktion, insbesondere die biologische Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung, insbesondere die biologische Wirksamkeit gemäß des in Beispiel 2 dargestellten Nachweises, beibehalten wird. Dabei kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, die mindestens eine Aminosäure, bevorzugt die mindestens eine essentielle Aminosäure, insbesondere Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val, His, Cys, Tyr, besonders bevorzugt Trp, N-terminal, C-terminal und/oder innerhalb der Aminosäuresequenz hinzuzufügen.
  • Der Begriff „Aminosäure-Modifikation“ bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine vor, nach oder während der Synthese des rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere Typ 11-Kollagenpeptids, gegebenenfalls erfolgte chemische Veränderung einer oder mehrerer Aminosäuren unter Beibehaltung des ursprünglichen Aminosäuregrundgerüsts, insbesondere einer oder mehrerer proteinogener Aminosäuren, des Typ II-Kollagenpeptids. Somit umfasst der Begriff sowohl den Einsatz von chemisch veränderten Aminosäuren zur Synthese des erfindungsgemäßen Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, als auch die chemische Veränderung der Aminosäuren nach oder während der Synthese des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids. Für Kollagenpeptide typische Aminosäure-Modifikationen sind insbesondere Hydroxylierungen an Prolin- und Lysinresten sowie Glykosylierungen von hydroxylierten Lysinresten. Der Begriff umfasst erfindungsgemäß jedoch auch andere chemische Veränderungen von Aminosäuren, wie Phosphorylierungen, N-Glykosylierungen, Acetylierungen, Methylierungen oder Myristoylierungen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, beziehungsweise unter einem rekombinant hergestellten Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, ein durch biotechnologische rekombinante Herstellung mittels eines Expressionssystems gewonnenes Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, verstanden. Erfindungsgemäß ist dem rekombinanten Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, beziehungsweise dem rekombinant hergestellten Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid gemein, dass diese nicht aus natürlichen Quellen gewonnen werden.
  • In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptid, in Form einer homogenen Präparation dieses Typ II-Kollagens beziehungsweise Typ II-Kollagenpeptids vor, insbesondere umfasst eine derartige Präparation mindestens 90 Gewichts-%, bevorzugt mindestens 95 Gewichts-%, insbesondere mindestens 98 Gewichts-%, insbesondere mindestens 99 Gewichts-%, bevorzugt 100 Gewichts-% des Typ II-Kollagens beziehungsweise des Typ II-Kollagenpeptids. In bevorzugter Ausführungsform liegen in einer homogenen Präparation allein Typ II-Kollagene beziehungsweise Typ II-Kollagenpeptide einer bestimmten spezifischen Größe, das heißt, eines bestimmten Molekulargewichts vor, also einer einzigen Molekülspezies. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Typ 11-Kollagen beziehungsweise das Typ II-Kollagenpeptid in isolierter Form vor. In besonders bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das rekombinante Typ 11-Kollagen beziehungsweise das Typ II-Kollagenpeptid frei von anderen Proteinen oder Peptiden, insbesondere frei von anderen Substanzen, zum Beispiel von Verunreinigungen vor, insbesondere frei von Nicht-Proteinmaterial, frei von Salzen und/oder frei von anderen Proteinen oder Peptiden.
  • Der Begriff „Gelatine“ wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in fachüblicher Weise verstanden, insbesondere so wie beispielsweise in der WO 01/34646 definiert.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „rekombinante DNA“ ein artifiziell hergestelltes oder manipuliertes DNA-Molekül bezeichnet, das in vitro mittels gentechnischer Methoden hergestellt wurde. In bevorzugter Ausführungsform setzt sich die rekombinante DNA aus Bestandteilen unterschiedlicher Herkunftsorganismen zusammen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Expressionskassette“ ein DNA-Segment verstanden, das für die Transkription der in diesem Segment codierten Information in eine RNA, insbesondere in eine mRNA, verantwortlich ist und zumindest einen Promotor und eine proteincodierende Nukleotidsequenz, in der Regel mindestens einen Promotor, mindestens eine proteincodierende Nukleotidsequenz und gegebenenfalls einen Terminator aufweist.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Nukleotidsequenz“ die Abfolge der Nukleotide einer Nukleinsäure, insbesondere eines Nukleinsäurestrangs, insbesondere eines DNA- oder RNA-Strangs, verstanden. Eine „Nukleotidsequenz“ ist daher sowohl als informatorische Einheit als auch als der diese Information physisch manifestierende DNA- oder RNA-Strang zu verstehen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Expressionssystem“ ein System verstanden, in dem eine gezielte und kontrollierte Proteinbiosynthese erfolgen kann. Dabei umfasst der Begriff „Expressionssystem“ erfindungsgemäß sowohl zellfreie Expressionssysteme, bei denen die zur Proteinbiosynthese notwendigen Komponenten nicht innerhalb einer Zelle vorliegen, das heißt die Proteinbiosynthese außerhalb einer Zelle erfolgt, als auch zellbasierte Expressionssysteme, bei denen die Proteinbiosynthese innerhalb einer lebenden Zelle erfolgt. Bei einem zellfreien Expressionssystem handelt es sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt um ein Lysat oder ein Extrakt aus E. coli, Insektenzellen, Weizenkeimen, Tabakzellen oder Säugetierzellen, insbesondere CHO-Zellen oder Retikulocyten aus Kaninchen, welches die zur Proteinbiosynthese notwendigen Komponenten, insbesondere ein Translations- und ein Transkriptionssystem, aufweist. Im Falle der Verwendung eines zellfreien Expressionssystems in einem der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Begriff „Kultivieren“ gleichbedeutend mit „Inkubieren“.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Wirtszelle“ eine lebende Zelle verstanden, die zur Expression von in Fremd-DNA, insbesondere in rekombinanter DNA, codierten Peptiden oder Proteinen, befähigt ist.
  • Unter dem Begriff „Gewinnen des Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids“, gemäß Verfahrensschritt c) wird erfindungsgemäß ein dem Fachmann bekanntes Verfahren zur Isolierung des Typ II-Kollagens oder Typ II-Kollagenpeptids aus einer mehrere Komponenten enthaltenden Zusammensetzung mittels bekannter Isolierungsverfahren, wie beispielsweise Zentrifugationsverfahren, insbesondere differenzielle Zentrifugation und/oder Dichtegradientenzentrifugation, chromatografischer Verfahren, insbesondere Gelfiltrations-, Ionenaustausch-, Affinitäts- und/oder Hochleistungsflüssigkeitschromatografie, Elektrophoreseverfahren, Filtrationsverfahren und/oder Extraktionsverfahren, verstanden, wobei eine Anreicherung und Reinigung der betreffenden Komponente aus der mehrere Komponenten enthaltenden Zusammensetzung bevorzugt durch sequenzielle Anwendung mehrerer Isolationsverfahren erzielt werden kann. Gegebenenfalls kann vor, nach oder während der Gewinnung eine Abspaltung von C- und/oder N-terminalen Prokollagenfragmenten zur Gewinnung von Kollagen erfolgen.
  • Im Rahmen der Bedingungen des Verfahrensschritts b) können bevorzugt auch Fibrillogenese, chemische Modifikationen und Sezernierung des exprimierten Typ II-Kollagenpeptids stattfinden.
  • Unter „Bedingungen, die die Expression des Typ II-Kollagen, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, ermöglichen“ werden erfindungsgemäß Bedingungen, wie insbesondere Temperatur, Druck, Zeit, Licht sowie An- oder Abwesenheit von Induktoren und/oder Repressoren, verstanden, die eine Expression des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, aktivieren oder verstärken. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids,in Rahmen einer Hochzelldichtefermentation, insbesondere unter Hochdruck, bevorzugt Luft-Hochdruck. Die konkreten Bedingungen, die eine Expression des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, ermöglichen, sind dem Fachmann bekannt und hängen von dem verwendeten Expressionssystem und der verwendeten Expressionskassette, insbesondere des darin enthaltenen Promotors, ab. Bei der Expression des Typ II-Kollagens, insbesondere Typ II-Kollagenpeptids, kann es sich je nach Aufbau der Expressionskassette um eine konstitutive oder induzierbare Expression handeln.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von „Knorpelerkrankungen“ ein Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von Knorpelerkrankungen, insbesondere zur Behandlung von Knorpelerkrankungen, verstanden, wobei die Administration des rekombinanten Typ II-Kollagens oral erfolgt.
  • Knorpelerkrankungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere entzündliche, degenerative und/oder durch Autoimmunaktionen, insbesondere durch überschießende Immunreaktionen, hervorgerufene Knorpelerkrankungen, insbesondere Arthrose und/oder rheumatoide Arthritis. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Knorpelerkrankungen insbesondere Gelenkknorpelerkrankungen, insbesondere der Gelenke in Füßen, Knien, Fingern, Handgelenken, Hüfte und Wirbelsäule.
  • Unter einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von „Knorpelerkrankungen“ wird erfindungsgemäß bevorzugt auch ein Verfahren zur Induktion oraler Toleranz gegen endogenes Kollagen, insbesondere endogenes Typ II-Kollagen, insbesondere in oder an Knorpelgewebe vorhandenes endogenes Typ II-Kollagen, verstanden.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen „umfassend“ und „aufweisend“ verstanden, dass zusätzlich zu den von diesen Begriffen explizit erfassten Elementen noch weitere, nicht explizit genannte Elemente hinzutreten können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter diesen Begriffen auch verstanden, dass allein die explizit genannten Elemente erfasst werden und keine weiteren Elemente vorliegen. In dieser besonderen Ausführungsform ist die Bedeutung der Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „bestehend aus“. Darüber hinaus erfassen die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ auch Zusammensetzungen, die neben den explizit genannten Elementen auch weitere nicht genannte Elemente enthalten, die jedoch von funktionell und qualitativ untergeordneter Natur sind. In dieser Ausführungsform sind die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“.
  • Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung die erste und zweite Nachkommastelle oder die zweite Nachkommastelle nicht angegeben sind/ist, sind/ist diese als 0 zu setzen.
  • Unter dem Begriff „und/oder“ wird in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verstanden, dass alle Mitglieder einer Gruppe, welche durch den Begriff „und/oder“ verbunden sind, sowohl alternativ zueinander als auch jeweils untereinander kumulativ in einer beliebigen Kombination offenbart sind. Dies bedeutet für den Ausdruck „A, B und/oder C“, dass folgender Offenbarungsgehalt darunter zu verstehen ist: a) A oder B oder C oder b) (A und B) oder c) (A und C) oder d) (B und C) oder e) (A und B und C).
  • Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
  • Die Erfindung wird nachstehend ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand beispielhafter Sequenzen und Ausführungsbeispielen beschrieben.
  • Dabei bezeichnet:
    • SEQ ID Nr. 1: Die codierende Nukleotidsequenz von bovinem Typ II-Kollagen (col2αl; 3036 Basenpaare).
    • SEQ ID Nr. 2: Die Aminosäuresequenz von bovinem Typ II-Kollagen (1012 Aminosäuren).
  • Beispiel 1: Herstellung von rekombinantem Typ II-Kollagen
  • Rekombinant hergestelltes hydroxyliertes Volllängen-Kollagen vom Typ II mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 wurden durch rekombinante Expression einer die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 aufweisenden Expressionskassette in einem zur Hydroxylierung von Prolinresten befähigten Pichiapastoris-Stamm gewonnen.
  • Beispiel 2: Wirksamkeitsnachweis
  • A) Immun- und Cytokinmodulation durch rekombinantes Typ II-Kollagen
  • Die immunmodulatorische Wirkung des nativen rekombinant hergestellten Typ II-Kollagen (rekombinant hergestelltes Volllängen-Kollagen Typ II) gemäß Beispiel 1 wurde in kommerziellen gesunden murinen Peyer's Patch M-Zellen (SCC142M, Sigma Aldrich, Deutschland) bestimmt.
  • Die M-Zellen wurden in ITES-ERDF-Medium kultiviert, das die Produktion von Immunglobulinen fördert. Das Kulturmedium wurde mit 10 % fetalem Kälberserum, 10 µg/mL Insulin, 20 µg/mL Transferrin, 20 µM Ethanolamin und 25 nM Selenit (ITES) ergänzt. Die Synthese von Immunglobinen im Zellkulturüberstand wurde durch spezifische Enzym-Linked-Immunosorbent-Assays gegen IgE, IgA, IgM und IgG bestimmt.
  • Zudem wurde die Wirkung von Kollagenpeptiden auf die Bildung von pro-inflammatorischen (TNFα, IL-6, IPNγ) und anti-inflammatorischen Cytokinen (IL-4, IL-10, TGF-ß1) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen untersucht. Die RNA-Expression von pro-inflammatorischen und anti-inflammatorischen Cytokinen wurde nach einer Kultivierungsdauer von 1-5 Tagen getestet.
  • B) Immunisierung von DBA/1-Mäusen mit Typ 11-Kollagen und Induktion von rheumatoider Arthritis
  • 10 mg rekombinantes Typ-II-Kollagen wurden in 2,5 mL 0,01 N Essigsäurelösung auf eine Endkonzentration von 4 mg/mL Kollagen verdünnt (Stammlösung). Das Kollagen wurde durch Rotation des Reaktionsgefäßes über Nacht bei 4°C vollständig aufgelöst.
  • Die Kollagen-Stammlösung wurde in 0,01 N Essigsäure im Verhältnis 1:1 (v/v) gelöst, um so eine Arbeitslösung von Typ-II-Kollagen herzustellen. Vollständiges Freund's Adjuvans (CFA) wurde im Verhältnis 1:1 (v/v) der Kollagen-Arbeitslösung zugegeben.
  • 8 Wochen alte männliche DBA/1J-Mäuse wurden bei 20 ± 2 °C unter 12/12h Licht-Dunkel-Zyklus und 55 ± 10 % Luftfeuchtigkeit sowie Standard-Labornager-Diät und Wasser ad libitum gehalten.
  • Orale Toleranz wurde durch die Fütterung von 2 mg/mL nativem rekombinant hergestelltem Typ II-Kollagen (100 µg gelöst in 0,05 N Essigsäure) jeden zweiten Tag im Rahmen einer zweiwöchigen Intervention induziert und mit einer gleichen Menge phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als Placebokontrolle verglichen. Die Mäuse erhielten sechs aufeinanderfolgende Verabreichungen des Kollagens vor der anschließend erfolgenden Induktion der rheumatoiden Arthritis.
  • Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von 100 µL Ketamin-Xylazin-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1:100 v/v; 62,5 mg Ketamin, 0,625 mg Xylazin in 10 mL PBS) anästhesiert. Jede Maus erhielt 100 µL der finalen CFA-Kollagen-Lösung subkutan in den Schwanz, 2 cm vor der Schwanzbasis, ohne Durchdringung von Blutgefäßen, um so rheumatoide Arthritis (RA) zu induzieren.
  • Die Immunisierung der Mäuse gegen das Typ-II-Kollagen wurde durch Wiederholung der Injektion nach dreiwöchiger Haltung geboostet. Die Boost-Injektion wurde näher an der Schwanzbasis verabreicht, um die Entwicklung der rheumatoiden Arthritis zu verstärken.
  • C) Auswertung:
  • 2,5 Wochen nach der primären Immunisierung wurde der Grad der Arthritis dreimal wöchentlich für bis zu 12 Wochen untersucht. Der Schweregrad der Arthritis wurde auf einer Skala von 0 bis 4 bewertet:
    • 0 = keine Ödeme oder Schwellungen; 1 = leichte Ödeme und Erytheme, die auf den Fuß und/oder den Knöchel begrenzt sind; 2 = leichte Ödeme und Erytheme vom Knöchel bis zum Fußwurzelknochen; 3 = mäßige Ödeme und Erytheme vom Knöchel bis zum Fußwurzelknochen; und 4 = Ödeme und Erytheme vom Knöchel bis zum gesamten Bein.
  • Blutproben, die von jeder Maus 3, 5 und 7 Wochen nach Beginn der Immunisierung entnommen wurden, dienten zur Untersuchung der Immunglobulinkonzentrationen mittels ELISA-Quantifizierungskits. Die Bildung von IgG, IgE, IgM und IgA wurde photometrisch durch Messung der optischen Dichte bei 415 nm quantifiziert.
  • Am Ende des Beobachtungszeitraums wurden die Mäuse geopfert, die M-Zellen des Peyer'schen Plaques wurden isoliert und in ITES-ERDF-Medium kultiviert, wie oben beschrieben.
  • Die RNA-Expression von Cytokinen sowie die Synthese von Immunglobulinen in mit Typ II-Kollagen immunisierten murinen M-Zellen und den PBS-Kontrollen wurde wie oben beschrieben bestimmt.
  • Die Zellkulturexperimente und Immuntoleranztests in DBA/1J-Mäusen wurden mit dreifach helicalen Fragmenten von nativem, rekombinantem Typ II-Kollagen und verkürzten nichthelicalen Fragmenten wiederholt, um zu untersuchen, ob eine ursprünglich helicale Kollagenorganisation notwendig ist, um eine Immuntoleranz gegen endogenes Typ II-Kollagen zu induzieren.
  • D) Ergebnisse
  • Die ermittelten Daten zeigten einen vorteilhaften Effekt von rekombinant hergestelltem Typ 11-Kollagen in murinen Peyer'schen Plaque-Zellen.
  • In gesunden M-Zellen zeigte das RNA-Expressionsprofil der Cytokine eine anti-inflammatorische Wirkung von rekombinant produziertem Typ II-Kollagen.In gesunden M-Zellen wurde darüber hinaus die Synthese von Immunglobulinen unterdrückt.
  • Es konnte auch gezeigt werden, dass die Synthese von pro-inflammatorischen Cytokinen supprimiert und die von anti-inflammatorischen Cytokinen auch in immunisierten murinen M-Zellen, also nach Immunisierung gegen rheumatoide Arthritis, stimuliert wurde. Außerdem wurde die Synthese von Immunglobulinen in Peyer's Plaque-Zellen nach Immunisierung gegen rheumatoide Arthritis unterdrückt, wie in Peyer's Plaque, die aus murinen Darmgewebeproben isoliert wurden, gezeigt werden konnte.
  • CFA-induzierte rheumatoide Arthritis wurde in vivo vermindert, wie durch einen geringeren Grad an Arthritis in von RA betroffenen Knöcheln bei Mäusen nach Immunisierung mit rekombinantem Typ II-Kollagen im Vergleich zur Placebo-Kontrolle gezeigt wurde.
  • Eine verringerte Konzentration von Ig's in Blutproben von mit Kollagen immunisierten Mäusen bestätigte diese Befunde.
  • Die ermittelten Daten zu verkürzten Fragmenten des rekombinanten nativen Typ II-Kollagens deuten darauf hin, dass sowohl dreifach-helicale als auch nicht-helicale Fragmente ausreichen, um eine Immuntoleranz gegen rheumatoide Arthritis induzierendes Typ II-Kollagen zu induzieren.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
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Claims (21)

  1. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen eines menschlichen oder tierischen Patienten.
  2. Rekombinantes Typ 11-Kollagen zur Verwendung nach Anspruch 1, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen bovines Typ II-Kollagen ist, bevorzugt bovines Typ 11-Kollagen umfassend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2.
  3. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen in Form von Typ II-Prokollagen oder reifem Typ II-Kollagen vorliegt.
  4. Rekombinantes Typ 11-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen in Tripel-helicaler Form vorliegt, insbesondere in Form eines Homotrimers aus Typ II-α1-Ketten vorliegt.
  5. Rekombinantes Typ 11-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen in Form von vernetzten oder nichtvernetzten Fibrillen vorliegt.
  6. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 oder 2, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen in Form eines Typ II-Kollagenpeptids vorliegt.
  7. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach Anspruch 6, wobei das rekombinante Typ II- Kollagenpeptid ein Molekulargewicht in einem Bereich von 35 bis 95 kDa aufweist.
  8. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen nicht-denaturiert ist.
  9. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen vollständig oder partial hydroxyliert, vollständig oder partial glykosyliert oder vollständig oder partial hydroxyliert und glykosyliert vorliegt.
  10. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das rekombinante Typ II-Kollagen hergestellt wurde durch Expression in einer eukaryotischen Wirtszelle, insbesondere einer Hefezelle, oder prokaryotischen Wirtszelle, insbesondere E. coli, insbesondere in hydroxylierter Form und/oder in Form eines Fusionspeptides.
  11. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das als rekombinantes Typ II-Kollagenpeptid in isolierter, homogener Form mit einheitlichem Molekulargewicht, in einem Gemisch von Typ II-Kollagenpeptidenoder in einem Hydrolysat eines rekombinanten Typ II-Kollagens, insbesondere rekombinanten Typ II-Kollagenpeptids vorliegt.
  12. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Typ II-Kollagen das Typ II-Kollagen eines Wirbeltiers, insbesondere Schwein, Schaf, Rind, Nagetier, Känguru, Pferd, Vogel, Reptil, Amphibium, oder Fisch, oder eines Wirbellosen, insbesondere Qualle, ist.
  13. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knorpelerkrankung eine immunmodulierte Knorpelerkrankung ist, insbesondere eine Autoimmunerkrankung ist, insbesondere Polychondritis oder rheumatoide Arthritis.
  14. Rekombinantes Typ II-Kollagen zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Knorpelerkrankung eine entzündliche oder degenerative Knorpelerkrankung ist, insbesondere Arthrose und/oder rheumatoide Arthritis.
  15. Zusammensetzung umfassend mindestens ein rekombinantes Typ II-Kollagen nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen oder nahrungsmittelverträglichen Träger und, optional, mindestens einen Zusatz- oder Hilfsstoff, zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur oralen Therapie von Knorpelerkrankungen.
  16. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 15, wobei der mindestens eine Hilfsstoff Chondroitin, Chondroitinsulfat, Hyaluronsäure, Aflapin, Univestin, 5-Loxin, Glucosamin, Glucosaminsulfat oder Methylsulfonylmethan (MSM) ist.
  17. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei der mindestens eine Zusatzstoff ein rekombinant erzeugtes Kollagenhydrolysat, ein aus natürlichen Quellen stammendes Kollagenhydrolysat, ein rekombinant erzeugtes Kollagen I, ein aus natürlicher Quelle gewonnenes Kollagen I oder eine Kombination davon ist.
  18. Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Zusammensetzung in Form einer Tablette, Lutschtablette, Kautablette, Pulver, Granulat, Hartkapsel, Weichkapsel, Kapsel, Beißkapsel, Dragee, Pastille, Extrudats, Saft, Suspension oder Gels vorliegt.
  19. Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 15 bis 18, wobei die Zusammensetzung geeignet ist zur oralen Verabreichung in einer Dosis von 1 bis 60 mg/Tag rekombinantes Typ II-Kollagen.
  20. Rekombinantes Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinante Typ II-Kollagenpeptide, zur Verwendung in einem Verfahren zur therapeutischen Behandlung oder therapeutischen Prophylaxe von Immunintoleranz gegenüber Typ II-Kollagen, insbesondere einer immunmodulierten Knorpelerkrankung.
  21. Verwendung von rekombinantem Typ II-Kollagen, insbesondere rekombinantem Typ II-Kollagenpeptid in einer für eine orale Verabreichung geeigneten Darreichungsform zum Erhalt der Knorpelgesundheit eines Menschen oder Tieres.
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