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Stand der Technik
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Die Extraktion bzw. Isolation von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus Blut ist ein wichtiger Schritt in der Analyse von Blut zur Diagnose von Tumorzellen. Als CTCs werden Zellen definiert, die Cyto-Keratin-positiv, CD45-negativ, einen Nucleus (DAPI Nachweis) haben und epithelialen Ursprungs sind. Diese Definition ist eine Vorgabe und in der Liquid Biopsy Community weitestgehend akzeptiert. Zellen, welche diese Eigenschaften haben, sollen extrahiert bzw. isoliert werden.
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Keratin (von griechisch κέρας keras „Horn“, Genitiv keratos) ist ein Sammelbegriff für verschiedene wasserunlösliche Faserproteine, die von Tieren gebildet werden und die Hornsubstanz charakterisieren und die in Zellen mechanische Funktionen übernehmen.
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Entsprechend ihrer molekularen Aufbau als α-Helix oder β-Faltblatt unterscheidet man α- und β-Keratine. Keratine sind der Hauptbestandteil von Säugetierhaaren, Finger- und Zehennägeln etc. α-Keratine (oder Cytokeratine) liegen in Form lose organisierter Keratinfilamente vor. Cytokeratine (CKs oder nach neueren Nomenklatur auch einfach Keratine genannt) sind intermediäre Filamente, die Proteine bilden, die mechanische Unterstützung bieten und eine Vielzahl von zusätzlichen Funktionen in Zellen erfüllen. Sie sind Teil des Zytoskeletts und die größte Familie der intermediären Filamentproteine. Es werden zwei Arten von Cytokeratinen unterschieden, die Heterodimere bilden, nämlich sauren Typ I (Cytokeratine 9-23) und basischen Typ II (Cytokeratine 1-8).
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Cyto-Keratine sind typische Marker in der diagnostischen Pathologie, insbesondere für die Erkennung von Tumoren. Primärtumore und Metastasen eines gegebenen Karzinoms teilen das gleiche Muster von Zytokeratinen, das sie von anderen Karzinomtypen unterscheidet, wodurch eine Unterscheidung zwischen den verschiedenen Tumoren ermöglicht wird.
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CD45 ist ein Antigen, welches insbesondere zum Erkennen von Leukozyten (weißen Blutkörperchen) verwendet werden kann.
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Antigene sind Stoffe, an die sich Antikörper und bestimmte Lymphozyten-Rezeptoren spezifisch binden können (wobei Letzteres ebenfalls bewirken kann, dass Antikörper gegen das Antigen produziert werden). Antigene sind meistens Proteine, können aber auch Kohlenhydrate, Lipide oder andere Stoffe sein. Sie können entweder von B-Zell-Rezeptoren, T-Zell-Rezeptoren oder (von B-Zellen produzierten) Antikörpern erkannt bzw. gebunden werden.
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Epithelialen Ursprungs ist eine Zelle, wenn diese aus Epithelgewebe stammt. Epithelgewebe ist eine spezielle Gewebeart, die als Sammelbezeichnung für Deckgewebe und Drüsengewebe verwendet wird. Bei Epithelgewebe handelt es sich um ein- oder mehrlagige Zellschichten, die alle inneren und äußeren Körperoberflächen von vielzelligen Organismen bedecken. Eine Ausnahme bilden hier Gelenkkapseln und Schleimbeutel des Bewegungsapparates. Epithelgewebe ist neben Muskelgewebe, Nervengewebe und Bindegewebe eine der vier Grundgewebearten in vielzelligen Organismen.
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Ein Nucleus (DAPI Nachweis) ist ein Nachweis, dass diese Zellen einen Zellkern haben - also keine zellkernlosen Zellen sind, wie beispielsweise rote Blutkörperchen. Zellkernlose Zellen werden grundsätzlich nicht als CTCs angesehen, auch wenn sie die anderen genannten Kriterien erfüllen.
Der Begriff „Lysieren“ bedeutet, dass die Zellen bzw. die Zellmembranen der Zellen, die in einer Zellsuspension vorhanden sind, zerstört werden, so dass die einzelnen Bestandteile der Zellen der Zellsuspension in einer Lösung frei verfügbar sind. Dies ermöglicht die spätere Analyse.
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Zweck des Zählens von CTCs ist, dass in medizinischen Studien ein klarer Zusammenhang zwischen der Overall Survival (OS) und den post-therapeutisch gemessenen CTC-Zahlen hergestellt werden kann. Das heißt, ein reines Zählen von CTCs kann schon wichtige Informationen über OS oder die Wirksamkeit einer Therapie liefern. Um ein umfangreicheres Bild des Tumorstatus zu erhalten, fokussiert sich die CTC-Forschung aktuell auch auf die Identifikation genetischer Merkmale aus CTCs. Systeme zum automatischen Sortieren, Zählen und Zuordnen von CTCs sind daher ausgesprochen relevant.
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Für eine genetische Analyse von CTCs ist es unabdingbar sicherzustellen, dass tatsächlich auch Zellen in der Probe vorhanden waren. Ansonsten ist bei nicht vorhandenen Signalen (=genetisches Merkmal nicht vorhanden) nicht klar, ob keine CTCs oder generell keine Zellen in der Probe waren, beispielsweise, weil die Probe verunreinigt war und die Nachweisreaktion deshalb keine Signale generiert hat.
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Wünschenswert ist daher ein Verfahren, bei welchem die absolute Zellzahl einer Probe gezählt werden kann.
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Eine Möglichkeit ist das Zählen von Zellen mit Hilfe der Durchführung von Färbeschritten und automatisierter Verarbeitung von Proben. Solche Verfahren sind aber nur schwer in vollautomatisierten Workflows für den klinischen Einsatz realisierbar - einerseits, weil meistens eine Bildverarbeitung notwendig ist, um Proben optisch zu analysieren, wenn bestimmte gefärbte Merkmale erkennbar sind - andererseits, weil Färbeschritte häufig länger dauern. Auch dies erschwert die klinische Anwendung solcher Verfahren
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Offenbarung der Erfindung
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Hier beschrieben werden soll ein Verfahren für den Nachweis (oder sogar das Zählen) isolierter CTCs mittels Identifikation genetischer Merkmale. Das Verfahren ermöglicht unter Umständen auch den Verzicht auf Färbeschritte.
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Das Verfahren dient für den Nachweis bestimmter charakteristischer Zellen in einer Probe und weist folgende Schritte auf:
- a) Bereitstellen einer Probe von Zellsuspension
- b) Durchführen eines ersten Lysiervorgangs mit der Probe, so dass ein erstes Lysat der Probe entsteht, wobei das Lysieren so erfolgt, dass der Zellkern der Zellen der Zellsuspension intakt bleibt;
- c) Extrahieren der in dem ersten Lysat frei verfügbaren Ribonukleinsäuren (RNA);
- d) Zuordnen der extrahierten Ribonukleinsäuren, um die Mengen verschiedener Arten von Ribonukleinsäuren in dem Lysat der Probe zu ermitteln;
- e) Durchführen eines zweiten Lysiervorgangs mit der verbliebenen Probe, so dass ein zweites Lysat der Probe entsteht, wobei das Lysieren so erfolgt, dass Zellkerne von Zellen in der Probe zerstört werden,
- f) Extrahieren der in dem zweiten Lysat frei verfügbaren Desoxyribonukleinsäuren (DNA),
- g) Berechnen einer Gesamtzellzahl an Zellen in der Probe anhand der Menge von Desoxyribonukleinsäuren
- h) Berechnen von Anzahlen mit einzelnen Zellmarkern in der Probe anhand der in Schritt d) ermittelten Mengen verschiedener Arten von Ribonukleinsäuren und der in Schritt g) berechneten Gesamtzellzahl.
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Das Verfahren ist besonders bevorzugt, wenn die Zellmarker in Schritt h) dazu dienen CTCs (zirkulierende Tumorzellen) zu identifizieren.
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Das Verfahren ist weiterhin besonders bevorzugt, wenn die Zellmarker in Schritt h) zumindest einen der nachfolgenden Marker umfassen:
- - epithelialer Marker;
- - EpCAM;
- - CD45; und
- - Cyto-Keratin.
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Mit diesem Verfahren werden isolierte CTCs quantifiziert ohne dass ein Färbeschritt für die Quantifizierung notwendig ist. Mit dem Begriff „Quantifizieren“ ist hier gemeint, dass die Anzahl von CTSs absolut bestimmt werden kann. Der Ansatz erlaubt auch das Normalisieren der Probe, das heißt das Feststellen, wie viele Zellen in der Probe insgesamt sind, um die Probe und die gezählten CTCs mit anderen Proben bzw. in anderen Proben gezählten CTCs vergleichbar zu machen.
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Das Verfahren eignet sich, um in einem Lab-on-Chip-basierten vollautomatisierten Workflow für den Point-of-Care realisiert zu werden.
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Der Schritt a) kann beispielsweise das Bereitstellen von Zellen an ein Lab-on-Chip System umfassen. Die Schritte b) und e) sind übliche Lysiervorgänge, die zum Auflösen von Membranen von Zellen dienen und mit welchen die Bestandteile der Zellen identifizierbar werden. Die Extraktionsschritte c) und f) dienen jeweils zur Vorbereitung der nachfolgenden Analyseschritte d) bzw. g) und h).
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Eine sinnvolle Größe einer Probe für Schritt a) umfasst beispielsweise eine Blutmenge zwischen 10 µl und 10 ml. Eine solche Probe enthält zwischen 5 ×107 und 5 × 1010 Zellen.
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Kern dieser Erfindung sind Verfahren für einen quantitativen Nachweis isolierter CTCs über eine Multiparametermessung genetischer Merkmale. Dies geschieht in Schritt h) wo die Anzahlen einzelner Zelltypen berechnet werden. Hierbei wird ausgenutzt, dass die im Stand der Technik über Anfärbemethoden bestimmten Merkmale (z.B. epithelialer Marker, EpCAM, CD45, Cyto-Kreatin) auch anhand korrespondierender Moleküle nachweisbar sind, nämlich RNA (Ribonukleinsäuren), insbesondere mRNA (Messenger RNA) in den Zellen nachweisbar sind. Diese bewirken, dass die Zellen auf bestimmte Farbstoffe reagieren. Bei der Verwendung von Anfärbemethoden wird also indirekt ohnehin schon auf die Existenz dieser Moleküle zurückgegriffen, um eine Zuordnung von Zellen zu erreichen. Mit dem beschriebenen Verfahren ist es gewissermaßen möglich, direkt auf diese Moleküle rückzuschließen. Daher werden diese Moleküle in Schritt d) ermittelt, bzw. zugeordnet, um Mengen von verschiedenen Arten von RNA zu bestimmen. Beim Zuordnen in Schritt d) wird bevorzugt ein genetischer Nachweis verwendet, um eine Zuordnung von RNA zu einem bestimmten Merkmal (epithelialer Marker, EpCAM, CD45, Cyto-Keratin) zu erreichen.
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Prinzipiell funktioniert ein solcher genetischer Nachweis so, dass beim Nachweis von RNA zunächst eine Reverse-Transkriptase (RT) aus RNA (cDNA) gemacht wird, damit diese cDNA mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt werden kann, wobei gleichzeitig auch eine Quantifizierung stattfindet. Alles zusammen wird dann als RT-PCR bezeichnet. DNA wird einfach nur mittels PCR nachgewiesen (wenn quantitativ, dann qPCR genannt). Verschiedene Arten von Ribonukleinsäuren, die in Schritt d) zugeordneten werden um deren Mengen in der Probe zu bestimmten, sind insbesondere Ribonukleinsäuren, die Marker für bestimmte Krebszellen sind. Bevorzugt werden in Schritt d) mittels PCR-basierter Verfahren zum einen die RNA-Mengen (insbesondere mRNA-Mengen) oben genannter (Oberflächen-)Marker (z.B. epithelialer Marker EpCAM, CD45, Cyto-Keratin) bestimmt. Hierbei gilt EpCAM als ein Marker für Zellen epithelialen Ursprungs, und damit für Zellen die aus einem Gewebeverbund stammen, also CTCs; CD45 ist ein Marker für weiße Blutkörperchen, also für unspezifisch isolierte Zellen; Cytokeratine sind Proteine, die im Zellinneren von Zellen epithelialen Ursprungs vorhanden sind, also wieder ein Marker für CTCs. PCR (insbesondere rtPCR = quantitative real-time PCR, oder auch qPCR) ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren. Diese Vervielfältigungsmethode beruht auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Quantifizierung wird bei der PCR mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus in Echtzeit (engl. real time) erfasst werden.
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Zusätzlich wird die Gesamtmenge an isolierten Zellen über DNA bestimmt. Dies geschieht mit Hilfe der Schritte e), f) und g). Abschließend werden die auf mRNA-Ebene bestimmten Mengen mit der Gesamtmenge an Zellen in Relation gebracht (Schritt h).
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Die verschiedenen Schritte des beschriebenen Verfahrens können in Ihrer Reihenfolge variiert werden. Das gilt insbesondere für Schritte, die nicht unmittelbar aufeinander aufbauen und deren Bearbeitungsreihenfolge daher angepasst werden kann. Beispielsweise muss Schritt d) muss nicht gezwungenermaßen vor e) erfolgen. Man kann das erste Lysat auch zwischenspeichern, z.B. nach dem Schritt der Reversen Transkriptase, und dann zeitgleich mit dem DNA-Nachweis der zweiten Lyse analysieren. Insbesondere die Schritte c) und f) können parallel erfolgen.
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Das Verfahren kann auch als genetisches Zählverfahren bezeichnet werden, wobei sich die Bezeichnung „Zählverfahren“ hier insbesondere auf Schritt d) bezieht.
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Das Verfahren hat gegenüber bekannten Verfahren zum Nachweis charakteristischer Zellen in einer Probe eine Vielzahl von Vorteilen.
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Der Hauptvorteil des Verfahrens ist, dass aufgrund der Messung genetischer Merkmale die Anzahl bzw. Mengenbereiche an in einer isolierten Probe befindlichen Tumorzellen gemessen werden. Es muss also in keinem zusätzlichen Schritt eine Quantifizierung der Probenmenge stattfinden. Eine Quantifizierung der Probe ist notwendig, um die Messung an der Probe mit anderen Daten in ein Verhältnis setzen zu können und der Probe so eine Aussagekraft zu verleihen.
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Das Verfahren ist prinzipiell auch dafür geeignet, Krebs-spezifische Mutationen, Deletionen oder Insertionen - häufig mittels PCR-basierter Verfahren - auf Basis von CTCs nachzuweisen. Das Verfahren bietet nämlich den Vorteil, dass derartige Nachweise und das hier vorgestellte Verfahren von den Prozessschritten her prinzipiell gleich sind, und sich daher für eine co-Integration auf einem Lab-on-Chip besonders gut eignen, denn auch hier stellt die Quantität der vorhandenen Probemenge eine wichtige Basis des Designs dar.
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Anfärbeverfahren haben den grundsätzlichen Nachteil, dass es schwierig ist, eindeutige Schlüsse aus den Bildern zu ziehen, die elektronisch ausgewertet werden. Hierfür ist sehr viel Intelligenz zur Bildauswertung notwendig. Auch bestehen keine einheitlichen Normen für die Bestimmung von CTCs. Es wurde zwar der sogenannte ACCEPT5 vom CANCER-ID Konsortium entwickelt, der für die Bildauswertung eine Art Standard definieren soll. Die Messung über das hier beschriebene Verfahren (verspricht)/liefert aussagekräftigere und eindeutigere Signale. Insbesondere kann eine (klassische) numerische Auswertung in Schritt h) erfolgen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren verspricht auch bei in nur geringen Mengen in einer Probe vorhandenen Zellen gut detektierbare Signale, da bei transkribierten, aktiven Genen in der Mehrheit der Fälle eine Vielzahl an mRNA-Molekülen in einer Zelle vorhanden ist. Dieses Verfahren setzt also auf einen Marker der in punkto vorhandener Mengen vorteilhaft ist, wobei dieser Marker insbesondere vorteilhaft gegenüber Markern ist, die auf Zell-DNA basieren, wovon grundsätzlich sehr viel weniger pro Zelle verfügbar ist.
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Diese mRNA-Marker werden mit Informationen auf DNA-Ebene, als verlässliche Quelle für die Messung der Gesamtzellmenge einer Probe, kombiniert. Dies hat den Vorteil, dass man die auf mRNA-Ebene bestimmten relativen Verhältnisse durch den Bezug auf DNA-Messungen in Absolutwerte umformen/umrechnen kann. Es findet eine eindeutige Normierung des Probenmaterials statt.
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Durch das beschriebene Verfahren kann auch eine Reduktion manueller Schritte bei der Probenanalyse erreicht werden. Je nach Isolationssystem erfordert das Anfärben eine Vielzahl von Prozessschritten. Diese Prozessschritte werden durch das beschriebene Verfahren entbehrlich. Das hier vorgeschlagene Verfahren ermöglicht eine einfache Automatisierung und spart somit Kosten und Zeit.
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Bei den im Stand der Technik angewendeten Anfärbeverfahren wird mit Antikörpern gearbeitet, die auch immer unspezifisch binden. Bei diesen Verfahren ist es also möglich, dass unerwünschte Anfärbungen entstehen, die das Ergebnis einer anschließenden Zählung von gefärbten Zellen verfälschen. Ein genetischer Nachweis liefert hier eine höhere Spezifität. Auch können Antikörper in der Herstellung eine Varianz aufweisen und sind je nach Herstellungs-LOT verschieden sensitiv oder spezifisch.
Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine individuelle Zusammenstellung von Targets, auf die hin eine Probe untersucht werden soll. Dies kann geschehen, indem die Zuordnung in Schritt d) sowie die Berechnung/Auswertung in Schritt h) entsprechend angepasst wird. Dieses universelle Verfahren erlaubt somit eine applikationsspezifische Anwendung. Mit dem Begriff „Target“ sind hier bestimmte Zellmarker gemeint auf deren Existenz die Zelle untersucht werden soll bzw. für die festgestellt werden soll wie oft diese in den Zellen der Probe vorkommen.
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Das Verfahren ist nicht auf die Anwendungen in der Onkologie begrenzt. Generell bietet dieses Verfahren einen vereinfachten Prozessansatz zur Analyse von Expressionsmustern von Zellen für die Diagnostik. Das Verfahren ist insbesondere in vollautomatisierten Point-of-Care Anwendungen vorteilhaft einsetzbar.
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Um die mit Hilfe des Verfahrens durchgeführte Berechnung/Auswertung präziser zu machen wird bevorzugt zumindest in einem der beiden Schritte g) und h) eine Varianz der Zellgrößen der Zellen in der Probe berücksichtigt. Diese Varianz der Zellgrößen kann beispielsweise durch eine optische Analyse (Bildanalyse) der Probe festgestellt werden oder aus statistischen Daten gewonnen werden. In Ausführungsvarianten des Verfahrens ist die Varianz als Parameter für die Berechnung Auswertung in den Schritten g) und h) fest hinterlegt.
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Der Begriff „Berechnen“ in den Schritten g) und h) ist nicht in einem zu verstehen, dass als Ergebnis in Schritt g) zwangsläufig eine exakte Gesamtzellzahl herauskommt, die definitiv bzw. tatsächlich der genauen Anzahl an Zellen in der Probe entspricht. Genausowenig ist hier gemeint, dass in Schritt h) exakt berechnen welche Anzahlen von Zellen mit einzelnen Zellmarkern in der Probe definitiv bzw. tatsächlich enthalten sind. Aufgrund von Unsicherheiten bzw. stochastischen Ungenauigkeiten in den für die Berechnungen beschriebenen Eingangsgrößen (Menge von Desoxyribonukleinsäuren für Schritt g) und Mengen verschiedener Arten von Ribonukleinsäuren für Schritt h)) ist dies eventuell auch gar nicht möglich. Vielmehr ist mit dem Schritt Begriff „Berechnen“ hier gemeint, dass die Ermittlung der Gesamtanzahl von Zellen bzw. die Ermittlung der Anzahlen von Zellen mit einzelnen Zellenmarken auf Basis der zur Verfügung stehenden Eingangsgrößen nach einer mathematischen Vorschrift ermittelt wird und hierfür bevorzugt keine weiteren Schätzwerte oder Annahmen zu Grunde gelegt werden.
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Besonders bevorzugt wird die Varianz der Zellgrößen über ein Haushaltsgen der Zellen bestimmt. Mit Hilfe eines Haushaltsgens sind Abschätzungen der Zellgrößen möglich und so können Größenunterschiede der Zellen normiert und vergleichbar gemacht werden. Haushaltsgene sind typischerweise Gene, die die Strukturmoleküle und Enzyme, die mit dem Grundstoffwechsel von Zellen zusammenhängen, beispielsweise mit dem Glukose-Stoffwechsel, codieren. Anhand solcher Gene ist ein Rückschluss auf eine Zellgröße möglich.
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Besonders vorteilhaft ist das Verfahren außerdem, wenn vor Schritt h) folgender Schritt durchgeführt wird:
- g2) Unterscheiden aktiver Ribonukleinsäuren und inaktiver Ribonukleinsäuren. Hierdurch ergeben sich weiter verbesserte Auswertungsmöglichkeiten für die Verfahrensschritte h) und g).
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Besonders erfolgt die Abschätzung in Schritt g) mit einem Vergleich der in Schritt d) ermittelten Mengen mit einer Datenmatrix, in der für jeden Zellmarker Daten bezüglich vorhandener Ribonukleinsäuren hinterlegt sind. Eine solche Datenmatrix kann nach Art eines Expertensystems aufgebaut sein.
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Besonders vorteilhaft ist das Verfahren, wenn vor Schritt c) folgender Schritt durchgeführt wird:
- b2) Extrahieren von Zytoplasma.
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Dieser zusätzliche Schritt vereinfacht die späteren Verfahrensschritte. Außerdem wird durch diesen Schritt ermöglicht Fehler bei den Schritten d), g) und h) zu vermeiden, die durch das Zytoplasma verursacht sein könnten.
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Außerdem vorteilhaft ist das Verfahren, wenn zur Ermittlung der Mengen in Schritt d) ein Umwandeln der Ribonukleinsäuren in Desoxyribonukleinsäuren erfolgt. Diese Umwandlung bietet vorteilhafte Möglichkeiten für das Zuordnen.
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Darüber hinaus vorteilhaft ist, wenn das Lysieren in Schritt b) durch eine Veränderung eines osmotischen Gleichgewichts in der Probe erfolgt, wodurch ein Platzen der Zellmembranen der Zellen bewirkt wird. In diesem Zusammenhang ist insbesondere vorteilhaft, wenn ein osmotisches Gleichgewicht in Schritt b) so eingestellt wird, dass Zellkerne von Zellen in der Probe intakt bleiben. Durch eine solche Gestaltung der Lysiervorgänge kann sichergestellt werden, dass RNA und DNA sich für die Analyseschritte d), g) und h) nicht durchmischen.
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Im Folgenden wird das Verfahren anhand der Figuren erläutert. Die Figuren zeigen ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel auf welches das Verfahren jedoch nicht reduziert werden kann. Es zeigen:
- 1: ein Ablaufdiagramm des beschriebenen Verfahrens,
- 2: beispielhaft Parameter zur Zuordnung von RNA zu Zellmarkern, und
- 3: ein weiteres Ablaufdiagramm des beschriebenen Verfahrens
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In 1 werden die angewandten Prozessschritte des Verfahrens ganz schematisch dargestellt. Dabei wird eine (meist) vorverarbeitete Zellsuspension 1 lysiert. Die Zellsuspension kann dabei Vollblut, Serum, ein Zellaufreinigungsprodukt oder eine am Durchflusszytometer sortierte Probe sein. Alternative zu einer Zellsuspension können auch an einer Fläche anhaftende Zellen für das Verfahren eingesetzt werden. Insbesondere können Zellen eingesetzt werden, die an einer für das Verfahren funktionalisierten Biopsienadel anhaften.
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Der erste Lysiervorgang 2 (Schritt b)) ist hier durch einen Pfeil dargestellt. Durch den ersten Lysiervorgang 2 wird ein erstes Lysat 4 erzeugt, welches mit den Schritten c) und d) analysiert werden kann.
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Bei einer typischen Menge einer Ausgangsprobe von 1 ml [Milliliter] entsteht durch Schritt b) bevorzugt eine Menge von 2 ml bis 4 ml erstes Lysat.
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Der zweite Lysiervorgang 3 (Schritt e)) ist hier ebenfalls durch einen Pfeil dargestellt. Durch den zweiten Lysiervorgang 3 wird ein zweites Lysat 5 erzeugt, welches mit den Schritten f), g) und h) analysiert werden kann.
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Bei einer typischen Menge einer Ausgangsprobe von 2 ml [Milliliter] bis 4 ml entsteht durch Schritt e) bevorzugt eine Menge von 4 ml bis 8 ml zweites Lysat.
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Der in Schritt b) eingesetzte Lysemodus (erster Lysiervorgang) kann beliebig gewählt sein, muss aber kompatibel zur anschließenden RT-qPCR sein. Insbesondere ist auf eine Aufreinigung des Lysates zu verzichten, da sonst zu quantifizierendes Material verloren gehen kann. Ein geeignetes Lysierverfahren kann über die Immobilisierung des Zellmaterials in einer Kanüle erfolgen. In die Kanüle kann dann ein Lysepuffer eingezogen werden, um Nukleinsäuren wie DNA oder RNA aus dem Zellmaterial zu extrahieren. Dabei wird zuerst eine hypotonische Lösung (der Lysepuffer) eingezogen, wobei der Salzgehalt des Puffers höher als der der Zellen ist. Dabei platzt die Zellmembran auf, nicht aber der Zellkern. Als Folge kann so das Zytoplasma extrahiert werden, in welchem sich die RNA der Zelle befindet. Nach der Extraktion der RNA kann in einem zweiten Schritt die DNA extrahiert werden, in dem ein hypertonsicher Lysepuffer aufgezogen wird. Dabei platzt nun auch der Zellkern und die DNA kann extrahiert werden. Es kann auch nur ein hypertonischer Puffer eingesetzt werden und die DNA sowie die RNA in einem Schritt extrahiert werden.
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Lysepuffer können unterschiedlich zusammen gesetzt sein. Man muss zwischen hypotonischem (Lyse)puffer und hypertonischen (Lyse)puffer unterscheiden.
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Eine beispielhafte Zusammensetzung von hypotonischem Lysepuffer enthält 20 mM [Millimol] Tris finale Konzentration. Das heist in einem Gemisch aus Probe und Tris stellt sich eine finale Konzentration von 20 mM NaCI ein.
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Eine beispielhafte Zusammensetzung von hypertonischem Puffer enthält 3 %iges NatriumChlorid (NaCI). Das heist in einem Gemisch aus Probe und NaCI stellt sich eine finale Konzentration von 3 % NaCI ein.
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Nach der erfolgreichen Lyse wird die RNA mittels einer reversen Transkription in DNA umgewandelt. Dabei entsteht eine Lösung, welche nur aus DNA besteht. Diese kann nun für eine Nachweisreaktion mittels quantitativer Echtzeitpolymerasenkettenreaktion (qPCR) nachgewiesen werden.
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Der eigentliche Kern des beschriebenen Verfahrens liegt im Konstrukt des PCR Systems wie in
1 (Schritte g) und h)) angedeutet und in folgender Tabelle dargestellt:
LEVEL | TRANSKRIPTOME | GENOME |
Target | A | B | C | D |
Zelltyp α | + | + | - | + |
Zelltyp ß | + | - | + | + |
Untersuchtes Material | mRNA | mRNA | mRNA | DNA |
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Die Auswertung der qPCR Kurven ermöglicht die quantitative Ermittlung und Rückschluss auf die Zusammensetzung des Sample auf Zelltypebene.
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Die Tabelle beschreibt die Designstrategie des PCR System für die erfolgreiche Anwendung des beschriebenen Verfahrens. Dabei dient als Grundlage, dass man die Zusammensetzung einer Zellsuspension von einem Zelltyp oder Zellpopulation α und einem anderen Zelltyp oder Zellpopulation β von einem eukaryotischen Individuum nachweist.
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Ein konkretes Beispiel ist dabei ein Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (Typ a) in einem Hintergrund von Blutzellen (Typ β). Die grundlegende Strategie ist dabei, über das Transkriptom (mRNA Information) die Zelltypen das relative Zellmuster zwischen den Zelltypen zu bestimmen. Durch das Messen des Genoms, kann dann die absolute Zahl aller Zellen in der Probe bestimmt werden. Kennt man diese Zahl kann zusammen mit den Verhältnissen können dann die absoluten Zahlen Zellen mit einzelnen Zellmarkern bzw. die Zahlen der einzelnen Subpopulationen (verschiedene Arten von Zellen innerhalb der Probe) abgeschätzt werden.
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Die Menge aller mRNA einer Zelle wird als „Transkriptom“ bezeichnet. Sie ist ein zelltypenspezifischer Parameter. Dieses Transkriptom ist die Gesamtmenge an RNA, die für das Zuordnen in Schritt d) zur Verfügung steht.
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Die Probe bzw. das erste Lysat der Probe mit der Gesamtmenge an RNA (Transkriptom) wird bevorzugt schrittweise auf Targets (also auf Zellmarker oder Zelltypen die mit dem beschriebenen Verfahren erkannt werden sollen) geprüft. Bevorzugt werden die einzelnen Targets in einer bestimmten Reihenfolge abgearbeitet. Beispielsweise sind die zu untersuchenden Targets mit Indizes A, B, C und so weiter bezeichnet. Zunächst wird die Probe bzw. das erste Lysat auf Target A geprüft, dann auf Target B, dann Target C und so weiter. Dies geschieht in Schritt d).Ist in einer Zelle ein bestimmtes Gen aktiv, wird diese entsprechende DNA Sequenz in RNA transkribiert, welche dann vom Zellkern ins Zytosom wandert und dort in ein Protein übersetzt wird.
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Ein Zelltyp ist anhand von aktiven und inaktiven Genen identifizierbar. Jeder Zelltyp hat eine definierte Gruppe von Genen welche besonders aktiv sind oder ausgeschaltet sein müssen. Diese Genaktivität kann man durch Nachweis der entsprechenden mRNA oder Proteine zeigen. RNA-Nachweise durch qPCR sind hierbei besonders sensitiv.
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Anstelle das Transkriptom komplett zu untersuchen und sämtliche RNA im Transkriptom zuzuordnen, können in Schritt d) auch nur für Zelltypen typische Sequenzen mittels qPCR nachgewiesen werden. Die mRNA wird dann wie bereits beschrieben in DNA transkribiert, um anschließend eine genspezifische qPCR durchzuführen. Die Transkriptionsmessungen erlauben es, Aussagen über die Verhältnisse der Transkriptionsmuster der Zelle(n) zu schließen. Dazu wird mindestens ein Target A gewählt, welches in allen Zelltypen gleich exprimiert wird, i.e. in beiden Typen aktiv ist. Dies ist ein sogenanntes Haushaltsgen, welches im Allgemeinen konstant über alle Zelltypen aktiv ist. Typische Beispiele dazu sind GAPDH, Aktin, SDHA, HSP, COX8 oder MYH9. Als zweites Target B wird ein Target eingesetzt, welches für Zelltyp α hochreguliert ist, während in Zelltyp β das Target entsprechend runterreguliert ist. Das dritte Target C hat ein chiasmatisches Transkriptionsprofil zu Target B, i.e. in Zelltyp α runterreguliert und Zelltyp β hochreguliert.
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Die Normierung über das Target A ist notwendig, da Zellenpopulationen sehr heterogen in ihren Messparametern sind. Besonders die Zellgröße weißt üblicherweise eine hohe Varianz auf. Kleine Zellen haben in der Regel weniger absolute Anzahlen an mRNA, ihre Verhältnisse von hoch und runterreguliert, sind allerdings konserviert. Daher wird ein Haushaltsgen eingesetzt, um die Größenunterschiede der Zellen zu normieren und vergleichbar zu machen. Im Beispiel von CTC im Blut könnte so Target B ein epithelialer Marker wie EpCAM, CDK, Catenin sein. Als Target C für Blutzellen (hauptsächlich Leukozyten wie T-Zellen, Neutrophile, Dendriten, Macrophagen) können hämatopoetische Marker wie CD45 eingesetzt werden.
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Die Information, wieviel Probematerial (also welche Anzahl von Zellen) eingesetzt wurde, wird nun über das Genom gemessen. Dabei wird ein Target D eingesetzt, welches über sämtliche Zelltypen des zu messenden Individuums gleich sein sollte. Insbesondere Gene mit hohem SNP Anteilen oder hoher Mutationsraten (e.g. Onkogene) sind dazu nicht geeignet, weil solche Gene gerade in verschiedenen Zellen der Probe in unterschiedlicher Menge vorhanden sind bzw. die Menge von Target-Zellen (Zellmarkern) gerade anhand von solchen Genen mit dem beschriebenen Verfahren ermittelt werden soll. Idealerweise werden hier hochkonservierte, multiple abundante Gene wie eine hLlNE1 oder APEX1 eingesetzt. Diese sind mehrfach vorhanden und einfacher zu quantifizieren, als ein klassisches Gen wie EGFR, welches im Genom genau zweimal auftritt. Insbesondere wenn in einer Probe wenig Zellen verfügbar sind, wie im Fall von üblichen CTC-Untersuchungen, ist dies von Vorteil.
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Das Konzept des hier beschriebenen Verfahrens ist beliebig skalierbar. Es kann im Transkriptom ein Target E ergänzt werden, welches zur feineren Selektierung der Zelltypen dient, zur statistischen Bestimmung der Qualität oder zur Einführung von zusätzlichen Zelltypen.
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In Zusammenhang einer Flüssigbiopsie im Rahmen eines Tumortherapiemonitoring kann das beschriebene Verfahren wie folgt ausgeführt werden. Es kann zum eingesetzten Target B EpCAM, e.g. zusätzlich noch CDK19 oder Vimentin gemessen werden. Also ein zusätzlicher Tumorzellenmarker. Sind die beiden Expressionsmuster zu unterschiedlich, kann auf Reaktionsprobleme zurückgeschlossen werden. Die Prüfung ob die beiden Expressionsmuster gleich sind kann also als Kontrollelement für die Validität und Qualität des Probenmaterial eingesetzt werden. Auch kann das Zusätzliche Target E für die Einführung eines dritten Zelltyps γ genutzt werden. Im Rahmen eines CTC Monitoring bietet sich das zusätzliche Target E als ein Marker von mesynchimalen Tumorzellen, wie zum Beispiel Twist, N-Notch, Vimentin oder Snail1 an. Somit kann die Population von CTCs nochmals in zwei Subtypen unterteilt werden. Somit kann die Methode auch im Rahmen von Untersuchungen im Bereich der Epithelial zu Mesenchymal Transition eingesetzt werden (EMT). Dies ist insbesondere interessant, da somit einen Bias von EpCAM vermieden wird, da im Blut auch ein beträchtlicher Teil von mesynchemalen Zellen vorhanden sind.
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2 zeigt die Analysekette des in oben stehender Tabelle beschriebenen Verfahrens. Dabei werden aus den qPCR Kurven der einzelnen Komponenten A,B,C,D die jeweiligen Thresholdzyklen CT-Wert bestimmt. Für die Transkriptionselemente werden dann die relativen Expressionsmuster bestimmt, über die standardmäßige ΔΔCT Verfahren. Daraus können die Expressionsverhältnisse von den einzelnen Zelltypen ermittelt werden. Aus dem genetischen Material wird die absolute Anzahl Zellen im Reaktionsgemisch bestimmt.
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3 zeigt eine alternative schematische Darstellung der Prozessführung des beschriebenen Verfahrens. Anstelle der Messung der Targets in einem Reaktionsmix, kann in einem ersten Schritt das Transkriptom von der DNA getrennt werden. Dabei werden selektive Lyseverfahren eingesetzt, in welchem zuerst nur das Cytosol, in welchem sich mRNA befindet, mittels hypertonischem Puffer (Lysepuffer) lysiert wird, gefolgt von der Lyse des DNA enthaltenden Zellkerns via hypotonischem Lysepuffers. Die Darstellung in 3 zeigt, dass die Schritte b), c) und d) betreffend das Isolieren und Auswerten der RNA im Prinzip als getrennt von den Schritten e), f) und g) betreffend das Isolieren und Auswerten der DNA betrachtet werden. Der Prozessschritt d) und der Prozessschritt g) stellen jeweils Informationen bereit, die Grundlage für die Durchführung des Prozessschrittes h) sind und dem Prozessschritt h) daher zur Verfügung gestellt werden.