DE102018212006B3 - Thioethers as modulators of Kv7.2 / Kv7.3 channels - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend eine Thioether-Struktur, ein Verfahren zu deren Herstellung und Verbindungen erhalten oder erhältlich nach diesem Verfahren. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung als Schmerzmittel und/oder zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie. Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Figure DE102018212006B3_0000
The invention relates to a compound of general formula (I) comprising a thioether structure, a process for their preparation and compounds obtained or obtainable by this process. Furthermore, the invention relates to a compound of general formula (I), or a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I) for use as a medicament, in particular for use as Analgesics and / or for use in tinnitus treatment or prevention and / or for use in the treatment or prevention of convulsive conditions and / or for use in the treatment or prevention of a disease selected from the group consisting of incontinence, anxiety, dependence, mania, bipolar disorder, cognitive disorder and dyskinesia. The invention further relates to a pharmaceutical preparation comprising a compound of the general formula (I) or a compound of the general formula (I) obtained or obtainable by the preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I).
Figure DE102018212006B3_0000

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend eine Thioether-Struktur, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie Verbindungen erhalten oder erhältlich nach diesem Verfahren.The invention relates to a compound of general formula (I) comprising a thioether structure, a process for their preparation and compounds obtained or obtainable by this process.

Eine neuronale Übererregbarkeit spielt eine entscheidende Rolle bei chronischen Schmerzen, Epilepsie oder Migräne. In diesem Kontext stellt die Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials bestimmter Neurone durch Öffnung von Kaliumkanälen und die daraus folgende verringerte Generierung von Aktionspotentialen einen therapeutischen Ansatz dar, der bereits durch die Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin klinisch genutzt wird. Beide Arzneistoffe stehen aber in Zusammenhang mit seltenen aber schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen (vide infra) und sicherere Nachfolgersubstanzen dieser Arzneistoffe sind erforderlich, um eine wichtige therapeutische Alternative für zahlreiche Indikationen zu erhalten.Neural hyper excitability plays a crucial role in chronic pain, epilepsy or migraine. In this context, the hyperpolarization of the resting membrane potential of certain neurons by opening potassium channels and the resulting reduced generation of action potentials represents a therapeutic approach that is already being exploited clinically by the drugs flupirtine and retigabine. However, both drugs are associated with rare but serious adverse drug reactions (vide infra) and safer follow-up substances of these drugs are needed to obtain an important therapeutic alternative for many indications.

Ein spannungsabhängiger, langsam aktivierender und nicht inaktivierender Kaliumionenstrom, der im zentralen und peripheren Nervensystem auftritt, ist an der Steuerung des Feuerungsverhaltens und damit an der Regulierung der Erregbarkeit einer Vielzahl neuronaler Zellen beteiligt.[1] Die molekulare Basis des M-Stroms bilden Kv7-Kaliumkanäle. In den meisten Neuronen überwiegen Kv7.2- und Kv7.3-Untereinheiten.[2] Daneben kommen Kv7-Kaliumkanäle auch in den primären Sinneszellen des Innenohrs, in Skelettmuskelzellen und in Zellen der glatten Muskulatur vor.[3-5] Ähnlich wie bei anderen spannungsgesteuerten Kaliumkanälen bilden jeweils vier Untereinheiten einen Kanal. Dabei können sowohl Homo- als auch Heterotetramere gebildet werden.[6,7] Der Effekt der Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin auf Kv7-Kanäle ist abhängig davon aus welchen Untereinheiten sie aufgebaut sind.[8] Flupirtin und Retigabin wirken auf molekularer Ebene insbesondere über eine Stabilisierung der offenen Konformation der heterotetrameren Kv7.2/Kv7.3-Kanäle, die genaue Bindungsstelle konnte bisher nur durch Berechnungen abgeschätzt aber nicht durch Kristallstrukturanalyse bestimmt werden.[7-10]A voltage-dependent, slowly activating and nonactivating potassium ion current that occurs in the central and peripheral nervous systems is involved in the control of the firing behavior and thus in the regulation of the excitability of a large number of neuronal cells. [1] The molecular basis of M current is formed by Kv7 potassium channels. In most neurons, Kv7.2 and Kv7.3 subunits predominate. [2] In addition, Kv7 potassium channels also occur in the primary sensory cells of the inner ear, in skeletal muscle cells, and in smooth muscle cells. [3-5] Similar to other voltage-gated potassium channels, four subunits each form one channel. Both homo- and heterotetramers can be formed. [6,7] The effect of the drugs flupirtine and retigabine on Kv7 channels depends on which subunits they are constructed. [8] In particular, flupirtine and retigabine act at a molecular level to stabilize the open conformation of the heterotetrameric Kv7.2 / Kv7.3 channels, so far the exact binding site could only be estimated by computation but not determined by crystal structure analysis. [7-10]

Flupirtin wurde vom Chemiewerk Hornburg (später ASTA Medica) entwickelt. Es gehört chemisch betrachtet zur Klasse der Triaminopyridine und wird in Europa seit 1984 als Analgetikum mit muskelrelaxierenden Eigenschaften eingesetzt.[7] Es ist durch die EMA zur Schmerzbehandlung zugelassen und als Maleat-Salz in Form von Kapseln, Tabletten oder Injektionslösungen erhältlich. Der Wirkstoff erreicht seinen schmerzlindernden Effekt auf spinalen und supraspinalen Ebenen.[11] Opiodrezeptoren sind dabei genauso wenig an der Wirkung beteiligt wie eine Beeinflussung der Prostaglandinsynthese, alpha1- oder alpha2-Adreno- oder 5-HT-Rezeptoren.[12-14] Flupirtin ist ein positiver Modulator von Kv7-Kaliumkanälen und öffnet Kv7.2/7.3-Kanäle mit einer EC50 von ungefähr 5 µM.[15] Bei niedrigen mikromolaren Plasmakonzentrationen (2-6 µM), welche für einen analgetischen Effekt nötig sind, gilt dies als der hauptsächliche Wirkmechanismus von Flupirtin.[16]Flupirtin was developed by Chemiewerk Hornburg (later ASTA Medica). It belongs chemically to the class of triaminopyridines and has been used in Europe since 1984 as an analgesic with muscle relaxant properties. [7] It is approved by the EMA for the treatment of pain and as a maleate salt in the form of capsules, tablets or injectable solutions. The drug reaches its analgesic effect on spinal and supraspinal levels. [11] Opiod receptors play just as little role as influencing prostaglandin synthesis, alpha 1 or alpha 2 adreno or 5-HT receptors. [12-14] Flupirtine is a positive modulator of Kv7 potassium channels and opens Kv7.2 /7.3 channels with an EC 50 of about 5 μM. [15] At low micromolar plasma concentrations (2-6 μM), which are necessary for an analgesic effect, this is considered to be the main mode of action of flupirtine. [16]

Des Weiteren gibt es Indizien dafür, dass Flupirtin den Effekt von GABA am GABAA-Rezeptor verstärkt.[17] Flupirtin ist zugelassen für die Therapie von akuten und chronischen Schmerzen, beispielsweise bei schmerzhaften Verspannungen, degenerativen Gelenkerkrankungen, Spannungskopfschmerzen, Tumorschmerzen, Regelschmerzen oder postoperativen Schmerzen. Basierend auf dem Wirkungsmechanismus von Flupirtin sind theoretisch weitere Indikationen möglich. Dazu zählen multiple Sklerose, Tinnitusprophylaxe, überaktive Blase, neuropathische Schmerzen, periphere Neuropathien und Fibromyalgien.[13] Weiterhin verfügt Flupirtin über neuroprotektive Eigenschaften, die potentiell therapeutisch nutzbar sind.[18] Studien an Patienten mit postoperativen oder Tumorschmerzen haben gezeigt, dass Flupirtin in etwa die gleiche analgetische Wirkstärke wie schwache Opioide besitzt.[19-20] Flupirtin galt lange Zeit allgemeinhin als gut verträglich. Schlaflosigkeit, Schläfrigkeit, Schwindel, trockener Mund, Erbrechen und Unwohlsein im Magen-Darm-Bereich sind die häufigsten Nebenwirkungen. Im Rahmen der Pharmakavigilanz wurde jedoch ein ernst zu nehmendes Problem ersichtlich. Bis 2013 wurden 800 unerwünschte Arzneimittelwirkungen gemeldet. Mehr als ein Drittel dieser Meldungen beschreiben Leber- oder Gallenerkrankungen. Aus der Gesamtzahl aller Fallberichte endeten 24 tödlich und für 17 von diesen wurden wiederum lebertoxische Reaktionen berichtet. Nach einer erneuten Nutzen-Risiko-Bewertung besteht für Flupirtin-haltige Arzneimittel eine Einschränkung der therapeutischen Zielgruppe und eine Begrenzung der Behandlungsdauer auf zwei Wochen. [12] Mittlerweile hat der Pharmakavigilanz-Ausschuss (PRAC) der Europäischen Arzneimittelagentur EMA empfohlen, die Zulassungen für alle Flupirtin-haltigen Arzneimittel (Katadolon® und andere) zu widerrufen.[22]Furthermore, there is evidence that flupirtine enhances the effect of GABA on the GABA A receptor. [17] Flupirtin is approved for the treatment of acute and chronic pain, such as painful tension, degenerative joint disease, tension headache, cancer pain, menstrual pain or postoperative pain. Based on the mechanism of action of flupirtine, further indications are theoretically possible. These include multiple sclerosis, tinnitus prophylaxis, overactive bladder, neuropathic pain, peripheral neuropathy and fibromyalgia. [13] Furthermore, flupirtine has neuroprotective properties that are potentially therapeutically useful. [18] Studies in patients with postoperative or cancer pain have shown that flupirtine has approximately the same analgesic potency as weak opioids. [19-20] For a long time, flupirtine was generally considered to be well tolerated. Insomnia, drowsiness, dizziness, dry mouth, vomiting and discomfort in the gastrointestinal area are the most common side effects. In the context of pharmacovigilance, however, a serious problem became apparent. By 2013, 800 adverse drug reactions had been reported. More than a third of these reports describe liver or biliary disorders. Of the total number of case reports, 24 were fatal and 17 of these were again reported to have liver toxic reactions. Following a reassessment of benefit-risk, flupirtine-containing drugs are limited in their therapeutic target group and have a two-week treatment limit. [12] Meanwhile, the Pharmacavigilance Committee (PRAC) has recommended that the European Medicines Agency (EMA) withdraw authorizations for all medicinal products containing flupirtine (Katadolon® and others). [22]

In höheren Dosen verfügt Flupirtin auch über antikonvulsive Eigenschaften. Eine strukturelle Optimierung führte zur Entwicklung des deutlich potenteren, hochanalogen Wirkstoffs Retigabin, der in der Folge als Antiepileptikum zugelassen wurde.[23] Flupirtin und Retigabin sind nachfolgend dargestellt:

Figure DE102018212006B3_0001
Flupirtin also has anticonvulsant properties in higher doses. Structural optimization led to the development of the much more potent, highly analogous drug retigabine, which was subsequently approved as an antiepileptic drug. [23] Flupirtine and retigabine are shown below:
Figure DE102018212006B3_0001

Der postulierte Wirkmechanismus von Retigabin ist vergleichbar mit dem von Flupirtin. Damit besitzt Retigabin einen gänzlich anderen Angriffspunkt als alle anderen aktuell verfügbaren Antiepileptika. Retigabin ist in nahezu jedem Epilepsie-Tiermodell aktiv mit einem Gesamtprofil, welches sich von jedem anderen Antiepileptikum unterscheidet.[23] Das macht es zu einem unverzichtbaren Arzneistoff bei Arzneimittel-resistenten Epilepsien.[24, 25]The postulated mechanism of action of retigabine is comparable to that of flupirtine. This retigabine has a completely different point of attack than any other currently available antiepileptic drugs. Retigabine is active in almost every epilepsy animal model with an overall profile that is different from any other antiepileptic drug. [23] This makes it an indispensable drug in drug-resistant epilepsies. [24, 25]

Die häufigsten unerwünschten Arzneimittelwirkungen während einer Behandlung mit Retigabin (Trobalt ®) sind Benommenheit, Müdigkeit, Kopfschmerz, Verwirrtheit und Schwäche. Darüber hinaus wurden bei 12% der Behandelten renale und urologische Störungen beobachtet. Retigabin verursacht eine Harnretention, die über die Aktivierung von Kv7-Kanälen in der glatten Muskulatur der Blase zu erklären ist.[26] Im Gegensatz zu einigen anderen Antiepileptika ist Retigabin jedoch nicht mit kardialer, hämatologischer oder hepatischer Toxizität assoziiert und ist weder teratogen noch reproduktionstoxisch. Des weiteren besitzt Retigabin nur ein geringes Potential für Arzneimittelinteraktionen, da es Leberenzyme weder induziert noch inhibiert.[6] Diese Eigenschaften machen Retigabin im Allgemeinen zu einem gut verträglichen Antiepileptikum. Berichte aus klinischen Langzeitstudien über Pigmentveränderungen (Verfärbung) von Augengeweben einschließlich der Retina und blaugraue Verfärbungen der Haut, Lippen und Nägel führten jedoch zu einer Anwendungsbeschränkung. Retigabin ist inzwischen nur noch als Zusatztherapie für pharmakaresistente fokale Krampfanfälle mit oder ohne sekundärer Generalisierung bei erwachsenen Patienten mit Epilepsie zugelassen, wenn andere geeignete Arzneimittel unzureichend wirkten oder nicht vertragen wurden.[27] Im Juni 2017 erfolgte letztendlich die weltweite Marktrücknahme von Trobalt® durch GlaxoSmithKline. Eine mögliche Erklärung für die beobachtetet Toxizität ist die Bildung toxischer Metabolite.[28] In Greifswald wurde deshalb eine klinische Studie durchgeführt, in der Hinweise auf entstandene Oxidationsprodukte (Chinondiimine) gefunden wurden, die in Folgereaktionen Dimere bzw. Trimere bildeten und sich mit Glutathion zu entsprechenden Konjugaten umsetzen ließen.[29] Diese Glutathionkonjugate werden in Folgereaktionen wahrscheinlich zu Cystein- und Mercaptursäurekonjugaten metabolisiert.[30] Es wurde aus diesen Befunden abgeleitet, dass die Chinondiiminintermediate des Flupirtins für die Hepatotoxizität verantwortlich sind.[31] Dies ist beispielsweise für Paracetamol und Diclofenac bekannt, die ebenfalls Chinoniminintermediate bilden.[32,33]The most common adverse drug reactions during retigabine (Trobalt ®) treatment are drowsiness, fatigue, headache, confusion, and weakness. In addition, renal and urological disorders were observed in 12% of those treated. Retigabine causes urinary retention, which can be explained by the activation of Kv7 channels in the smooth muscle of the bladder. [26] However, unlike some other antiepileptic drugs, retigabine is not associated with cardiac, hematological or hepatic toxicity and is neither teratogenic nor toxic to reproduction. Furthermore, retigabine has little potential for drug interactions because it does not induce or inhibit liver enzymes. [6] These properties generally make retigabine a well tolerated antiepileptic. However, reports from long-term clinical studies on pigmentation (discoloration) of ocular tissues including the retina and blue-gray discoloration of the skin, lips and nails have limited the use. Retigabine is now approved as adjunctive therapy for pharmacoresistant seizures with or without secondary generalization in adult patients with epilepsy if other appropriate drugs are inadequate or intolerable. [27] In June 2017, the worldwide market withdrawal of Trobalt® by GlaxoSmithKline finally took place. One possible explanation for the observed toxicity is the formation of toxic metabolites. [28] In Greifswald, a clinical study was therefore conducted in which evidence for resulting oxidation products (quinonediimines) were found, which formed dimers or trimers in subsequent reactions and could be converted with glutathione into corresponding conjugates. [29] These glutathione conjugates are likely to be metabolized to cysteine and mercapturic acid conjugates in subsequent reactions. [30] It was deduced from these findings that the chinondiimine intermediates of flupirtine are responsible for hepatotoxicity. [31] This is known, for example, for paracetamol and diclofenac, which also form quinoneimine intermediates. [32,33]

In einer weiteren in vitro Reaktion konnte die Carbamatgruppe des Flupirtins durch Schweineleberesterasen gespalten werden. Die so entstandene primäre, aromatische Aminogruppe wurde wiederum von menschlichen N-Acetyltransferasen zum Metaboliten D13223 acetyliert. Dieser zeigte sich im Vergleich zu Flupirtin als weniger reaktiv gegenüber Peroxidasen. Die entsprechenden Chinondiimine konnten in vitro detektiert werden, d.h. sie sind relativ stabil.[29] Dies erklärt eventuell auch, dass der Metabolit D13223 des Flupirtins weniger hepatotoxisch ist als Flupirtin selbst.[31] Der N-acetylierte Metabolit von Flupirtin verfügt darüber hinaus noch über etwa ein Viertel der analgetischen Wirkung der Muttersubstanz.[34] Der Metabolismus von Retigabin unterscheidet sich etwas von dem des Flupirtins. Gemeinsam ist, dass auch Retigabin durch Acetylierung und Glucuronidierung verstoffwechselt wird. Beide Metabolite wurden in menschlichem Urin nach oraler Einmalgabe von 600 mg Retigabin detektiert.[35] Wie beim Metabolismus von Flupirtin konnte keine Beteiligung der Cytochrom P450 Monooxygenasen nachgewiesen werden.[36] Oxidative Prozesse scheinen im Retigabin-Metabolismus eine geringere Rolle zu spielen als beim Flupirtin. Über die in vivo Bildung von Dimeren gibt es keine Berichte. Dousa et al. identifizierten jedoch Retigabindimere als prozessbezogene Verunreinigungen aus der Retigabinsynthese. [37] Duggan et al. synthetisierten fluorierte Retigabinanaloga, um zu Analoga mit besseren Eigenschaften zu gelangen, ohne aber dabei ein spezielles Augenmerk auf die Metabolisierung zu legen.[38] Bei der Firma Grünenthal wurde die Struktur der an sich als sicher und gut verträglich erwiesenen Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin gänzlich verlassen, so dass zwar die damit verbundenen Probleme vermieden werden, aber eben auch nicht mehr auf die ungewöhnlich breiten Anwendungserfahrungen bezüglich der bei den allermeisten Patienten guten Langzeitverträglichkeit der bewährten Strukturen Bezug genommen werden kann.[39]In another in vitro reaction, the carbamate group of flupirtine could be cleaved by porcine liver esterases. The resulting primary aromatic amino group was in turn acetylated by human N-acetyltransferases to the metabolite D13223. This was found to be less reactive to peroxidases compared to flupirtine. The corresponding quinonediimines could be detected in vitro, i. they are relatively stable. [29] This may also explain that the metabolite D13223 of flupirtin is less hepatotoxic than flupirtine itself. [31] In addition, the N-acetylated metabolite of flupirtine still accounts for about one quarter of the analgesic effect of the parent compound. [34] The metabolism of retigabine is somewhat different from that of flupirtine. What is common is that retigabine is also metabolised by acetylation and glucuronidation. Both metabolites were detected in human urine after single oral administration of 600 mg retigabine. [35] As with the metabolism of flupirtine, no involvement of cytochrome P450 monooxygenases could be demonstrated. [36] Oxidative processes seem to play a lesser role in retigabine metabolism than in flupirtine. There are no reports of in vivo formation of dimers. Dousa et al. however, identified retigabine dimers as process-related impurities from retigabine synthesis. [37] Duggan et al. synthesized fluorinated retigabine analogues in order to arrive at analogues with better properties without, however, paying particular attention to metabolism. [38] At Grünenthal, the structure of flupirtine and retigabine, which has been proven to be safe and well-tolerated, has been completely eliminated, so that the problems associated with it are avoided, but no longer due to the unusually broad experience of use in the vast majority of patients Long-term compatibility of the proven structures can be referred. [39]

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung neuer Verbindungen, die eine ähnlich gute Wirksamkeit aufweisen wie beispielsweise Flupirtin bzw. Retigabin und bei denen die strukturbedingte Toxizität aufgehoben ist. The object of the present invention was therefore to provide novel compounds which have a similarly good activity as, for example, flupirtine or retigabine and in which the structural toxicity is abolished.

Die Aufgabe wurde gelöst mit Verbindung der allgemeinen Formel (I)

Figure DE102018212006B3_0002
wobei

R1
ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus, bevorzugt ein Stickstoff- oder Sauerstoffatom, aufweist;
R2
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F), verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
R3
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
R4
ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt Br) und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe;
X
ein Stickstoffatom oder eine -CH- Gruppe ist;
n
Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist;
m
Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und
p
Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist.
The problem has been solved with compound of general formula (I)
Figure DE102018212006B3_0002
 in which
R 1
is selected from branched or unbranched C1 to C5 alkyl group and -NR 1a R 1b group, wherein R 1a and R 1b are independently selected from hydrogen atom and branched or unbranched C1 to C5 alkyl group or with each other and with the nitrogen atom of NR 1a R 1b group form a C3 to C9 heterocycloalkly group, wherein the C3 to C9 heterocycloalkly group each has at least one substituent selected from hydrogen atom and C1 to C3 alkyl group and optionally in addition to the nitrogen atom of the NR 1a R 1b group at least one further heteroatom in the cycle, preferably a nitrogen or oxygen atom;
R 2
is selected from the group consisting of branched or unbranched C1 to C10 alkyl group, C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, wherein at least one heteroatom selected from nitrogen and oxygen atom is included, C6 to C12 aryl group ; and C5 to C11 heteroaryl group, wherein the C1 to C10 alkyl group, C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, C6 to C12 aryl group, or C5 to C11 heteroaryl group each has at least one further substituent R 2a , wherein R 2a is selected from the group consisting of hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably F), branched or unbranched C1 to C3 alkyl group, branched or unbranched (per) halogenated C1 to C3 alkyl group (F, Cl, Br, I, preferably F) and branched or unbranched C1 to C3 alkoxy group, and wherein the C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, C6 to C12 aryl group or C5 to C11 heteroaryl group comprises one or more ring systems which are fused or separated;
R 3
is selected from the group consisting of branched or unbranched C1 to C10 alkoxy group; branched or unbranched C 1 -C 10 -alkyl group and - (CH 2 ) p -C 6 to C 12 -aryl group which has at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably F) and C 1 to C 3 Alkoxy group and wherein the C6 to C12 aryl group comprises one or more ring systems which are condensed or separated;
R 4
is selected from hydrogen, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably Br) and branched or unbranched C1-C5 alkyl group;
X
is a nitrogen atom or a -CH group;
n
Is zero or an integer in the range of 1 to 3;
m
Is zero or an integer in the range of 1 to 5; and
p
Is zero or an integer in the range of 1 to 5.

Es wurde gefunden, dass ein Ersatz des N-Atoms der sekundären Aminogruppe von Flupirtin bzw. Retigabin durch ein Schwefelatom die Eigenschaften der erhaltenen Moleküle so verändert, dass eine Oxidation nicht mehr am dreifach substituierten Ring sondern an der Thioetherbrücke stattfindet. Vorteilhafterweise werden die Thioether durch Oxidationsmittel nicht zu toxischen Chinondiiminen, sondern zu Sulfoxiden oxidiert, die anders als die Chinodiimine des Flurpitins chemisch unreaktiv sind und nicht mit körpereigenen Nukleophilen reagieren können, womit die Grundlage der Toxizität auf molekularer Ebene aufgehoben ist. Die gebildeten Sulfoxide, die auch die wahrscheinlichen Metaboliten in vivo darstellen, sind nicht per se toxisch und es konnte gezeigt werden, dass durch Veränderung des Substitutionsmusters stärker wirksame Thioether erhalten werden können, deren Sulfoxidmetaboliten nicht hepatotoxisch sind.It has been found that replacement of the N atom of the secondary amino group of flupirtine or retigabine by a sulfur atom alters the properties of the molecules obtained in such a way that oxidation no longer takes place at the triply substituted ring but at the thioether bridge. advantageously, The thioethers are oxidized by oxidants not to toxic quinone diimines, but to sulfoxides, which are chemically unreactive unlike the chinodiimines of flurpitins and can not react with endogenous nucleophiles, thus repealing the basis of toxicity at the molecular level. The formed sulfoxides, which are also the likely metabolites in vivo, are not per se toxic and it has been shown that by altering the substitution pattern, more potent thioethers can be obtained, whose sulfoxide metabolites are not hepatotoxic.

Überraschenderweise zeigen die neu dargestellten Thioether in vitro eine mindestens gleichwertige Wirkung auf Kv7 .2/7.3-Kanäle wie Flupirtin und Retigabin, d.h. es handelt sich um potentielle Kv 7.2/3-Öffner; mittels eines Kaliumkanal-Assays wurde die Kaliumkanalaktivität der Substanzen basierend auf EC50 und Emax belegt. Die halbmaximale Effektkonzentration (EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt des eingesetzten Kaliumkanal-Assays zu beobachten ist, wenn die logarithmierte Konzentration einer Substanz gegen die zugehörigen korrigierten ΔF/F-Werte geplottet wird, womit die Wirkungsstärke (Potenz) einer Verbindung charakterisiert wird. Die intrinsische Aktivität einer Test-Verbindung wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich um die maximale Antwort, bezogen auf den eingesetzten Assay, welche durch die entsprechende Test-Substanz möglich ist (Plateaueffekt). Bei der Auswertung des eingesetzten Assays wurde Emax des als Referenz verwendeten Flupirtins, welches als Maleat eingesetzt wurde (Flupirtinmaleat), auf 100 % festgelegt und die maximalen Antworten der jeweiligen Substanz der allgemeinen Formel (I) relativ auf diesen Wert bezogen.Surprisingly, the newly presented thioethers show in vitro an at least equivalent effect on Kv7 .2 / 7.3 channels such as flupirtine and retigabine, ie they are potential K v 7.2 / 3 openers; A potassium channel assay was used to demonstrate the potassium channel activity of the substances based on EC 50 and Emax. The half-maximal effect concentration (EC 50 ) is the concentration of a substance at which the half-maximal effect of the potassium channel assay is observed when the logarithmic concentration of a substance is plotted against the associated corrected ΔF / F values, indicating the potency (potency ) of a compound is characterized. The intrinsic activity of a test compound is described by its E max value. This is the maximum response, based on the assay used, which is possible by the corresponding test substance (plateau effect). When evaluating the assay used, Emax of the flupirtine used as the reference, which was used as maleate (flupirtine maleate), was set to 100% and the maximum responses of the respective substance of the general formula (I) were based on this value.

Je niedriger der EC50-Wert, desto höher ist die Potenz, während je größer der Emax-Wert ist, desto stärker wirksam ist die Verbindung. Viele Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeigten einen niedrigen EC50-Wert von weniger als 0,9 mikromolar (Mikromol pro Liter). Emax lag bei allen aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bei mindestens 60 %, woraus ein zumindest dem Flupirtinmaleat annhähernd vergleichbarer Kaliumefflux zu erwarten ist; viele der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen Emax-Werte von mehr als 100 % auf, was einen stärkeren Kaliumefflux im Vergleich zum Flupirtinmaleat anzeigt.The lower the EC 50 value, the higher the potency, the larger the E max value, the more effective the compound. Many compounds of general formula (I) showed a low EC 50 value of less than 0.9 micromolar (micromoles per liter). Emax was at least 60% for all active compounds of the general formula (I), from which a potassium flux at least approximately comparable to the flupirtine maleate is to be expected; many of the compounds of the general formula (I) have E max values of more than 100%, indicating a greater potassium flux compared to flupirtine maleate.

Zur Beurteilung des hepatotoxischen Potentials einer Substanz wurde der IC50-Wert verwendet. Als IC50 wurde die Konzentration einer Verbindung definiert, bei welcher die Viabilität der Zellen auf 50 % sank. Aus dem Zusammenspiel der Ergebnisse von Kv7.2/3-Öffnungsaktivität und den Hepatotoxizitäts-Ergebnissen in vitro ist ersichtlich, dass insgesamt Verbindungen der allgemeinen Formel (I) die Wirkung der Referenzsubstanz Flupirtinmaleat deutlich übertreffen.To assess the hepatotoxic potential of a substance, the IC 50 value was used. The IC 50 was defined as the concentration of a compound at which the viability of the cells decreased to 50%. From the interaction of the results of Kv7.2 / 3-opening activity and the hepatotoxicity results in vitro, it can be seen that total compounds of the general formula (I) significantly exceed the effect of the reference substance flupirtine maleate.

In einer Ausführungsform der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist n Null. In einer Ausführungsform der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist m 1. In einer Ausführungsform der Verbindung ist X ein Stickstoffatom.In one embodiment of the compound of the general formula (I), n is zero. In one embodiment of the compound of the general formula (I), m is 1. In one embodiment of the compound, X is a nitrogen atom.

Der Rest R1 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C4- bis C6-, bevorzugt C4,-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C4- bis C6-, bevorzugt C4,-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Sauerstoffatom im Cyclus aufweist; wobei R1 weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH2-Gruppe, Methylgruppe, NH(CH3)-Gruppe, Pyrrolidin-Gruppe und Morpholin-Gruppe, weiter bevorzugt Pyrrolidin-Gruppe.The radical R 1 is preferably selected from the group consisting of branched or unbranched C1 to C3 alkyl group, and -NR 1a R 1b group, wherein R 1a and R 1b are independently selected from hydrogen and branched or unbranched C1 to C3 Alkyl group or with each other and with the nitrogen atom of NR 1a R 1b group form a C4 to C6, preferably C4, -Heterocycloalklygruppe, wherein the C4 to C6, preferably C4, heterocycloalkly group each having at least one substituent selected from hydrogen atom and C1 to C3 alkyl group and optionally in addition to the nitrogen atom of the NR 1a R 1b group has at least one further oxygen atom in the cycle; wherein R 1 is more preferably selected from the group consisting of NH 2 group, methyl group, NH (CH 3 ) group, pyrrolidine group and morpholine group, more preferably pyrrolidine group.

Der Rest R2 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mono- oder Difluorphenyl-Gruppe; CF3-Phenyl-Gruppe; F5S-Phenyl-Gruppe; C4- bis C8-Cycloalkylgruppe, bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe oder Cyclopropyl-Gruppe; verzweigter oder unverzweigter C1 - bis C5-Alkylgruppe, bevorzugt 2-Propyl-Gruppe; Biphenyl-Gruppe; Pyridin-Gruppe; Piperidin-Gruppe; Tetrahydropyran-Gruppe; Dioxolan-Gruppe und Phenyl-Gruppe, wobei die Phenyl-Gruppe mindestens einen Substituenten R2a ausgewählt aus Wasserstoffatom und Methoxy-Gruppe aufweist; wobei R2 weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C4- bis C8-Cycloalkylgruppe, bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe oder Cyclopropyl-Gruppe, weiter bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe; und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe, bevorzugt 2-Propyl-Gruppe; wobei R2 weiter bevorzugt eine Cyclohexyl-Gruppe oder 2-Propyl-Gruppe ist.The radical R 2 is preferably selected from the group consisting of mono- or difluorophenyl group; CF 3 phenyl group; F 5 S-phenyl group; C4 to C8 cycloalkyl group, preferably cyclohexyl group, cyclobutyl group or cyclopropyl group; branched or unbranched C 1 - to C 5 -alkyl group, preferably 2-propyl group; Biphenyl group; Pyridine group; Piperidine group; Tetrahydropyran group; Dioxolane group and phenyl group, wherein the phenyl group has at least one substituent R 2a selected from hydrogen atom and methoxy group; wherein R 2 is more preferably selected from the group consisting of C4 to C8 cycloalkyl group, preferably cyclohexyl group, cyclobutyl group or cyclopropyl group, more preferably cyclohexyl group; and branched or unbranched C1 to C5 alkyl group, preferably 2-propyl group; wherein R 2 is more preferably a cyclohexyl group or 2-propyl group.

Der Rest R3 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethoxy-Gruppe, Propyl-Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p Null oder 1 oder 2 ist; wobei R3 weiter bevorzugt eine (CH2)p-Phenylgruppe ist, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p 1 oder 2 ist.The radical R 3 is preferably selected from the group consisting of ethoxy group, propyl group, tert-butyl group, - (CH 2 ) p -phenyl group which has at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br , I, preferably F) and methoxy group and wherein p is zero or 1 or 2; wherein R 3 is more preferably a (CH 2 ) p -phenyl group having at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably F) and methoxy group, and p is 1 or 2.

Der Rest R4 ist bevorzugt ein Wasserstoffatom, ein Bromatom oder eine Methyl-Gruppe, weiter bevorzugt ein Wasserstoffatom.The radical R 4 is preferably a hydrogen atom, a bromine atom or a methyl group, more preferably a hydrogen atom.

In einer Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist n Null; m ist 1; X ist ein Stickstoffatom, R1 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NH2-Gruppe, Methylgruppe, NH(CH3)-Gruppe, Pyrrolidin-Gruppe und Morpholin-Gruppe, bevorzugt Pyrrolidin-Gruppe; R2 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclohexyl-Gruppe und 2-Propyl-Gruppe; R3 ist eine -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist, wobei p 1 oder 2 ist; und R4 ist ein Wasserstoffatom.In one embodiment of the compounds of general formula (I), n is zero; m is 1; X is a nitrogen atom, R 1 is selected from the group consisting of NH 2 group, methyl group, NH (CH 3 ) group, pyrrolidine group and morpholine group, preferably pyrrolidine group; R 2 is selected from the group consisting of cyclohexyl group and 2-propyl group; R 3 is a - (CH 2 ) p -phenyl group which has at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably F) and methoxy group, wherein p is 1 or 2; and R 4 is a hydrogen atom.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ia) auf:

Figure DE102018212006B3_0003
In a preferred embodiment of the compounds of the general formula (I), the compound has the formula (Ia):
Figure DE102018212006B3_0003

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ib) auf:

Figure DE102018212006B3_0004
In a further preferred embodiment of the compounds of the general formula (I), the compound has the formula (Ib):
Figure DE102018212006B3_0004

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ic) auf:

Figure DE102018212006B3_0005
In a further preferred embodiment of the compounds of the general formula (I), the compound has the formula (Ic):
Figure DE102018212006B3_0005

Bei der Verbindung der Formel (Ic), welche die im experimentellen Teil beschriebene potenteste Substanz 11 ist, werden so niedrige Substanzkonzentrationen (0,0014 µmol pro Liter) zur Erreichung des halbmaximalen Effekts auf Kaliumkanäle benötigt, dass toxische Effekte bei der resultierenden Dosierung sehr unwahrscheinlich sind. Die ermittelten Toxizitätsdaten zeigen, dass bei den durch Löslichkeit im Testmedium limitierten Konzentrationen von 63 µmol pro Liter für Verbindung 11 keine toxischen Effekte beobachtet wurden und der IC50 daher als größer als 63 µmol pro Liter angegeben werden kann. Entsprechend ist das Verhältnis von IC50 zu EC50 mindestens 85-mal größer bei Substanz 11 als bei Flupirtinmaleat. Leberschädigungen während der Therapie sollten damit weniger wahrscheinlich sein. Auch der biologische Effekt der Testsubstanz sollte größer sein (z.B. stärkere Analgesie), da Emax bei über 100 % lag und somit ein stärkerer Kaliumefflux zu erwarten ist als mit Flupirtinmaleat. In the compound of formula (Ic), which is the most potent substance described in the experimental section 11 Thus, in order to achieve the half-maximal effect on potassium channels, such low substance concentrations (0.0014 μmol per liter) are required that toxic effects are very unlikely in the resulting dosage. The determined toxicity data show that in the case of the solubility in the test medium limited concentrations of 63 .mu.mol per liter for compound 11 no toxic effects were observed and the IC 50 can therefore be given as greater than 63 μmol per liter. Accordingly, the ratio of IC 50 to EC 50 is at least 85 times greater in substance 11 as with flupirtine maleate. Liver damage during therapy should therefore be less likely. Also, the biological effect of the test substance should be greater (eg stronger analgesia), since Emax was over 100% and thus a stronger Kaliumefflux is expected than with flupirtine maleate.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),

Figure DE102018212006B3_0006
wobei R1, R2, R3, R4, X, n, m und p die gleiche Bedeutung haben wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert, umfassend:

  1. (i) Bereitstellen einer Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II)
    Figure DE102018212006B3_0007
    wobei R1, R2, R4, m und n die gleiche Bedeutung haben wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert;
  2. (ii) Umsetzen der Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß (i) mit einer Verbindung H-R3, wobei R3 die gleiche Bedeutung hat wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert, unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).
The invention further relates to a process for the preparation of a compound of general formula (I),
Figure DE102018212006B3_0006
 wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , X, n, m and p have the same meaning as defined above for the compounds of the general formula (I), comprising:
  1. (i) providing a nitro compound of the general formula (II)
    Figure DE102018212006B3_0007
     wherein R 1 , R 2 , R 4 , m and n have the same meaning as defined above for the compounds of general formula (I);
  2. (ii) reacting the nitro compound of the general formula (II) according to (i) with a compound HR 3 , wherein R 3 has the same meaning as defined above for the compounds of the general formula (I), to obtain a compound of the general Formula (I).

Die Erfindung betrifft weiterhin Verbindung der allgemeinen Formel (I), erhalten oder erhältlich nach einem Verfahren wie voranstehend beschrieben.The invention further relates to compound of general formula (I), obtained or obtainable by a process as described above.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)

Figure DE102018212006B3_0008
wobei

R1
ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus, bevorzugt ein Stickstoff- oder Sauerstoffatom, aufweist;
R2
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F), verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
R3
ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
R4
ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt Br) und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe;
X
ein Stickstoffatom oder eine -CH- Gruppe ist;
n
Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist;
m
Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und
p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Human- oder Veterinär-Arzneimittel, weiter bevorzugt als Human-, Kleintier- oder Heimtier-Arzneimittel.Furthermore, the invention relates to a compound of general formula (I)
Figure DE102018212006B3_0008
 in which
R 1
is selected from branched or unbranched C1 to C5 alkyl group and -NR 1a R 1b group, wherein R 1a and R 1b are independently selected from hydrogen atom and branched or unbranched C1 to C5 alkyl group or with each other and with the nitrogen atom of NR 1a R 1b group form a C3 to C9 heterocycloalkly group, wherein the C3 to C9 heterocycloalkly group each has at least one substituent selected from hydrogen atom and C1 to C3 alkyl group and optionally in addition to the nitrogen atom of the NR 1a R 1b group at least one further heteroatom in the cycle, preferably a nitrogen or oxygen atom;
R 2
is selected from the group consisting of branched or unbranched C1 to C10 alkyl group, C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, wherein at least one heteroatom selected from nitrogen and oxygen atom is included, C6 to C12 aryl group ; and C5 to C11 heteroaryl group, wherein the C1 to C10 alkyl group, C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, C6 to C12 aryl group, or C5 to C11 heteroaryl group each has at least one further substituent R 2a , wherein R 2a is selected from the group consisting of hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably F), branched or unbranched C1 to C3 alkyl group, branched or unbranched (per) halogenated C1 to C3 alkyl group (F, Cl, Br, I, preferably F) and branched or unbranched C1 to C3 alkoxy group, and wherein the C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, C6 to C12 aryl group or C5 to C11 heteroaryl group comprises one or more ring systems which are fused or separated;
R 3
is selected from the group consisting of branched or unbranched C1 to C10 alkoxy group; branched or unbranched C 1 -C 10 -alkyl group and - (CH 2 ) p -C 6 to C 12 -aryl group which has at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably F) and C 1 to C 3 Alkoxy group and wherein the C6 to C12 aryl group comprises one or more ring systems which are condensed or separated;
R 4
is selected from hydrogen, halogen atom (F, Cl, Br, I, preferably Br) and branched or unbranched C1-C5 alkyl group;
X
is a nitrogen atom or a -CH group;
n
Is zero or an integer in the range of 1 to 3;
m
Is zero or an integer in the range of 1 to 5; and
p is zero or an integer in the range of 1 to 5; or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I)
for use as a medicament, preferably as a human or veterinary drug, more preferably as a human, small animal or pet drug.

Bevorzugte Ausführungsformen der Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Human- oder Veterinär-Arzneimittel, weiter bevorzugt als Human-, Kleintier- oder Heimtier-Arzneimittel sind eingangs beschrieben im Hinblick auf die Verbindung der allgemeinen Formel (I) selbst; das gleiche gilt für die entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Salze, d.h. auch für die pharmazeutisch akzeptablen Salze sind die die gleichen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie eingangs beschrieben im Hinblick auf die Verbindung der allgemeinen Formel (I) selbst, bevorzugt; gleiches gilt auch für Verbindungen der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren. Besonders bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (la), oder eine Verbindung der Formel (Ib), oder eine Verbindung der Formel (Ic), eingesetzt, was auch die Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes umfasst; weiter bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (Ic) eingesetzt, wobei dies ebenfalls die Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes umfasst.Preferred embodiments of the compound of the general formula (I) for use as a medicament, preferably as a human or veterinary medicament, more preferably as a human, small animal or pet drug, are described in the introduction with regard to the compound of the general formula (I) even; the same applies to the corresponding pharmaceutically acceptable salts, ie for the pharmaceutically acceptable salts are the same compounds of general formula (I) as described above with respect to the compound of general formula (I) itself, preferably; The same applies to connections of the general formula (I) or obtainable by the production process described above. Particular preference is given to using a compound of the formula (Ia), or a compound of the formula (Ib), or a compound of the formula (Ic), which also comprises the use of a pharmaceutically acceptable salt; more preferably, a compound of formula (Ic) is used, which also includes the use of a pharmaceutically acceptable salt.

Pharmazeutisch verträgliche Salze sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Berge et al. „Pharmaceutical Salts“, J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977) beschrieben. „Pharmazeutisch verträgliches Salz“ bedeutet ein nicht-toxisches, organisches oder anorganisches Säureadditionssalz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei die Verbindung der allgemeinen Formel (I) im Säureadditionssalz in kationischer Form vorliegt. Das pharmazeutisch akzeptable Salz ist insgesamt neutral geladen.Pharmaceutically acceptable salts are known to those skilled in the art and, for example, in Berge et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19 (1977) described. "Pharmaceutically acceptable salt" means a non-toxic, organic or inorganic acid addition salt of a compound of general formula (I) wherein the compound of general formula (I) is in cationic form in the acid addition salt. The pharmaceutically acceptable salt is neutrally charged overall.

Ein pharmazeutisch verträgliches Salz kann aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Das Salz kann in situ während der Isolation und Aufreinigung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) hergestellt werden oder durch separate Reaktion einer aufgereinigten Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und anschließender Isolation des erzeugten Salzes.A pharmaceutically acceptable salt may be prepared from a compound of general formula (I) with an organic or inorganic acid. The salt can be prepared in situ during isolation and purification of the compound of general formula (I) or by separate reaction of a purified compound of general formula (I) with a suitable organic or inorganic acid and subsequent isolation of the salt produced.

Bevorzugt ist das Anion des pharmazeutisch akzeptablen Salzes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, lodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caprat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorobenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Terephthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, β-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalen-1-sulfonat, Naphthalen-2-sulfonat, Mandelat, Adipat, Alginat, Mucat, Aspartat, Benzolsulfonat, Butyrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Hexanoat, 2-Hydroxyethansulfonat, 2-Napthalensulfonat, Nicotinat, Nitrat, Palmitat, Pectinat, Persulfat, Picrat, Pivalat, Salicylat, Thiocyanat, Tosylat, Arginat und Undecanoat.Preferably, the anion of the pharmaceutically acceptable salt is selected from the group consisting of sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate, chloride, bromide, iodide, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, Formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suberate, sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexine-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitrobenzoate, hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, phthalate, terephthalate, sulfonate, xylenesulfonate, phenylacetate, phenylpropionate, phenylbutyrate, citrate, lactate, β-hydroxybutyrate, glycolate, tartrate, methanesulfonate, propanesulfonate, naphthalene-1-sulfonate, naphthalene-2-sulfonate, mandelate, adipate, alginate, Mucate, aspartate, benzenesulfonate, butyrate, camphorate, camphorsulfonate, cyclopentaneproprionate, digluconate, dodecylsulfate, ethanesulfonate, glucoheptanoate, glycerophosphate, hemisulfate, hexanoate, 2-hydroxyethanesulfone at, 2-naphthalenesulfonate, nicotinate, nitrate, palmitate, pectinate, persulfate, picrate, pivalate, salicylate, thiocyanate, tosylate, arginate and undecanoate.

In einer Ausführungsform wird die Verbindung der allgemeinen Formel (I) als Säureadditionssalz in Form des Chlorids, Sulfats, Mesylats, Besylats, Tosylats oder des Mono-, Di- oder Tricarbonsäuresalzes eingesetzt, wobei die Mono-, Di- oder Tricarbonsäure bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fumarsäure, Malonsäure, Apfelsäure, Succinsäure, Milchsäure, Glycolsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Asparginsäure und Mandelsäure.In one embodiment, the compound of the general formula (I) is used as an acid addition salt in the form of the chloride, sulfate, mesylate, besylate, tosylate or the mono-, di- or tricarboxylic acid salt, wherein the mono-, di- or tricarboxylic acid is preferably selected from the group consisting of fumaric acid, malonic acid, malic acid, succinic acid, lactic acid, glycolic acid, maleic acid, citric acid, aspartic acid and mandelic acid.

Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) wird allein oder als Mischung von zwei oder mehr Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt bzw. als pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder als Mischung von zwei oder mehr pharmazeutisch akzeptablen Salzen von Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Gleichfalls können Mischungen aus einer oder mehreren Verbindung(en) der allgemeinen Formel (I) mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Salz(en) von Verbindung(en) der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden.The compound of the general formula (I) is used alone or as a mixture of two or more compounds of the general formula (I) or as a pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I) or as a mixture of two or more pharmaceutically acceptable salts of Compounds of the general formula (I). Likewise, mixtures of one or more compound (s) of general formula (I) with one or more pharmaceutically acceptable salt (s) of compound (s) of general formula (I) may be employed.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Schmerzmittel.In one embodiment, the invention relates to a compound of general formula (I) as described above or to a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I) for use as Painkiller.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention.In one embodiment, the invention relates to a compound of general formula (I) as described above or to a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I) for use in tinnitus treatment or prevention.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen, bevorzugt bei der Behandlung oder Prävention von neonatalen Krampfzuständen. In one embodiment, the invention relates to a compound of general formula (I) as described above or to a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I) for use in the treatment or prevention of convulsions, preferably in the treatment or prevention of neonatal seizures.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.In one embodiment, the invention relates to a compound of general formula (I) as described above or to a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I) for use in the treatment or prevention of a disease selected from the group consisting of incontinence, anxiety, dependence, mania, bipolar disorder, cognitive disorder and dyskinesia.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben.The invention furthermore relates to a pharmaceutical preparation comprising a compound of the general formula (I) as described above or obtained or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I) as described above.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von Schmerzzuständen, zur Prävention oder Behandlung von Tinnitus oder zur Prävention oder Behandlung von Krampfzuständen umfassend die Verabreichung einer präventiv oder therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).The invention further relates to a method for the prevention or treatment of pain conditions, for the prevention or treatment of tinnitus or for the prevention or treatment of convulsive conditions comprising the administration of a preventively or therapeutically effective amount of a compound of general formula (I) as described above or a compound of the general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation method or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I).

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, Bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie, umfassend die Verabreichung einer präventiv oder therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).The invention also relates to a method for the treatment or prevention of a disease selected from the group consisting of incontinence, anxiety, dependence, mania, bipolar disorder, cognitive disorder and dyskinesia comprising administering a preventively or therapeutically effective amount of a compound of the general formula (I ) as described above, or a compound of the general formula (I) or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I).

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung, welche zumindest anteilig mit einer Veränderung von Kv7.2/Kv7.3-K+-Kanälen einhergeht, umfassend die Verabreichung an einen Probanden (human oder Tier), welcher einer solchen Behandlung oder Prävention bedarf, einer therapeutisch oder präventiv aktiven Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).The invention further relates to a method of treating or preventing a disease which is at least partially associated with alteration of Kv7.2 / Kv7.3 K + channels comprising administering to a subject (human or animal) receiving such treatment or prevention, a therapeutically or preventively active amount of a compound of general formula (I) as described above, or a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation method or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula ( I).

Die Erfindung betrifft ebenso eine Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Schmerzzuständen, zur Prävention oder Behandlung von Tinnitus oder zur Prävention oder Behandlung von Krampfzuständen oder zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.The invention also relates to a use of a compound of general formula (I) as described above or a compound of general formula (I) obtained or obtainable by the above-described preparation process or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of general formula (I) for the preparation a medicament, in particular a medicament for the prevention or treatment of pain, for the prevention or treatment of tinnitus or for the prevention or treatment of convulsive conditions or for the treatment or prevention of a disease selected from the group consisting of incontinence, anxiety, dependence, mania, bipolar disorder, cognitive disorder and dyskinesia.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert, ohne sie hierauf zu beschränken.The invention will be further explained by way of examples without, however, being limited thereto.

BeispieleExamples

Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)Preparation of compounds of general formula (I)

Herstellung der Nitro-VorstufenPreparation of nitro precursors

6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine

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10 mmol 6-Amino-5-nitropyridin-2-thiol (1.71 g) wurden in 40 ml DMF gelöst und 4,3 ml 3 M NaOH hinzugefügt. Der dunkelbraunen Lösung wurden 10 mmol 4-Fluorbenzylbromid zugesetzt und für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Produkt durch Zugabe von 100 ml Wasser präzipitiert. Abschließend wurde das Produkt mit 200 ml Wasser und 200 ml n-Hexan gewaschen. Gelber Feststoff (Smp.: 139-141 °C). Ausbeute: 1,98 g (70,0 %). Rf= 0.35 (n-Hexan/Ethylacetat). 1H-NMR [ppm]: δ = 4,46 (s, 2H), 6,61 (d, 1H, J= 8,8 Hz), 7,13 (m, 2H), 7,53 (m, 2H), 8,15 (d, 1H, J= 8,8 Hz), 8,18 (bs, 2H). 13C-NMR [ppm]: δ = 32,2, 110,3, 115,1 (d, 2C, 2JC,F = 22 Hz), 123,5, 131,1 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 134,2 (d, 4JC,F = 3 Hz), 134,5, 153,1, 160,1 und 162,5 (d, 1JC,F = 242 Hz), 166,3. IR [cm-1]: ṽ= 1342, 1558, 3332, 3456. 10 mmol of 6-amino-5-nitropyridine-2-thiol (1.71 g) were dissolved in 40 ml of DMF and 4.3 ml of 3 M NaOH added. To the dark brown solution was added 10 mmol of 4-fluorobenzylbromide and stirred for 3 h at room temperature. Subsequently, the product was precipitated by adding 100 ml of water. Finally, the product was washed with 200 ml of water and 200 ml of n-hexane. Yellow solid (mp. 139-141 ° C). Yield: 1.98 g (70.0%). R f = 0.35 (n-hexane / ethyl acetate). 1 H-NMR [ppm]: δ = 4.46 (s, 2H), 6.61 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.13 (m, 2H), 7.53 (m, 2H), 8.15 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.18 (bs, 2H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 32.2, 110.3, 115.1 (d, 2C, 2 J C, F = 22 Hz), 123.5, 131.1 (d, 2C, 3 J C, F = 8 Hz), 134.2 (d, 4 J C, F = 3 Hz), 134.5, 153.1, 160.1 and 162.5 (d, 1 J C, F = 242 Hz ), 166.3. IR [cm -1 ]: ṽ = 1342, 1558, 3332, 3456.

weitere Nitro-Vorstufenadditional nitro precursors

Weitere Thioether-Vorstufen wurden in analoger Weise gemäß der Synthese aus 1.1.1 synthetisiert. Tabelle 1 zeigt die jeweiligen Edukte und die daraus erhaltene Nitro-Verbindung. Tabelle 1 Übersicht der synthetisierten Thioether-Vorstufen und der zur Synthese eigesetzten Edukte. Edukte Produkt

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 Additional thioether precursors were synthesized analogously according to the synthesis of 1.1.1. Table 1 shows the respective starting materials and the resulting nitro compound. Table 1 Overview of the synthesized thioether precursors and the educts used for the synthesis. reactants product
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Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)Preparation of compounds of general formula (I)

Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamatEthyl {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate

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In einem 3-Hals-Kolben wurden 3,65 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,02 g) mit 18,6 mmol SnCl2•2H2O (5,1 eq, 4,2 g) vorgelegt und in 40 ml Ethanol suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde unter Argon-Atmosphäre für 25 h auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurde auf 40 °C abgekühlt und 37,2 mmol Et3N (10,2 eq, 5,16 ml) sowie 4,6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,26 eq, 0,44 ml) hinzugefügt. Nach 30 min wurde die Temperatur auf 55 °C erhöht und für eine Stunde gehalten. Nach abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Ansatz über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Evaporation der organischen Phase und waschen des Rückstandes mit n-Hexan ergab das saubere Produkt. Farbloser Feststoff (Smp.: 138-140 °C). Ausbeute: 0,75 g (47 %). Rf= 0,83 (Cyclohexan/Ethanol/Et3N 6:2:2). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,29 (s, 2H), 5,94 (s, 2H), 6,43 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,07-7,12 (m, 2 H), 7,40-7,45 (m, 3H), 8,57 (m, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,6, 60,3, 109,3, 115,0 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 131,8, 135,0 (d, 4JC,F = 3 Hz), 150,2, 152,8, 154,4, 159,9 und 162,3 (d, 1JC,F = 243 Hz). IR [cm-1]: ṽ= 1454, 1678, 2984, 3145, 3260, 3403. HRMS: [C15H16N3O2FS + H]+ berechnet: 322,1020, gemessen: 322,1027. In a 3-necked flask, 3.65 mmol of 6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (1.02 g) with 18.6 mmol SnCl 2 • 2H 2 O (5, 1 eq, 4.2 g) and suspended in 40 ml of ethanol. The reaction batch was heated to 70 ° C. under argon atmosphere for 25 h. It was then cooled to 40 ° C and 37.2 mmol of Et 3 N (10.2 eq, 5.16 ml) and 4.6 mmol of ethyl chloroformate (1.26 eq, 0.44 ml) were added. To The temperature was raised to 55 ° C for 30 minutes and held for one hour. After cooling to room temperature, the mixture was filtered through kieselguhr and the residue was washed with ethanol. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator, taken up in DCM and washed with water. Evaporation of the organic phase and washing of the residue with n-hexane gave the clean product. Colorless solid (mp. 138-140 ° C). Yield: 0.75 g (47%). R f = 0.83 (cyclohexane / ethanol / Et 3 N 6: 2: 2). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.22 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.29 (s, 2H) , 5.94 (s, 2H), 6.43 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.07-7.12 (m, 2H), 7.40-7.45 (m, 3H), 8.57 (m, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 14.5, 32.6, 60.3, 109.3, 115.0 (d, 2C, 2 J C, F = 21 Hz), 115.2, 130, 7 (d, 2C, 3 J C, F = 8 Hz), 131.8, 135.0 (d, 4 J C, F = 3 Hz), 150.2, 152.8, 154.4, 159, 9 and 162.3 (d, 1 J C, F = 243 Hz). IR [cm -1]: v = 1454, 1678, 2984, 3145, 3260, 3403. HRMS: [C 15 H 16 N 3 O 2 FS + H] + calculated: 322.1020, Measured: 322.1027.

Ethyl-[2-amino-6-(benzylthio)pyridin-3-yl]carbamatEthyl [2-amino-6- (benzylthio) pyridin-3-yl] carbamate

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2,31 mmol 6-(Benzylthio)-3-nitropyridin-2-amin (0,60 g) wurden in einer Mischung aus 15 ml Wasser und 25 ml Isopropanol suspendiert. 6,93 mmol Eisenpulver (3 eq, 0,39 g) und 10,4 mmol NH4Cl (4,5 eq, 0,56 g) wurden hinzugefügt und die Suspension für 6 h zum Rückfluss erhitzt. Die resultierende dunkelbraune Mischung wurde filtriert und der Rückstand mit 50 ml Isopropanol gewaschen. Anschließend wurden 13,9 mmol Et3N (6,0 eq, 1,91 ml) und 5,54 mmol Chlorameisensäureethylester (2,4 eq, 0,53 ml) hinzugefügt. Zur Vervollständigung der Reaktion wurden nach einer sowie zwei Stunden jeweils 5,54 mmol Chlorameisensäureethylester hinzugefügt. Nach zusätzlichen 5 Stunden wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand in 100 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit 2×100 ml Wasser und 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknung über Na2SO4 wurde das Rohprodukt mittels Flashchromatographie gereinigt (Mobile Phase: n-Hexan/Ethylacetat 7:3) und der resultierende braune Feststoff mit wenig eiskaltem Diethylether gewaschen. Hellblauer Feststoff (Smp.: 100-101 °C). Ausbeute: 0,23 g (33,0 %). Rf= 0.72 (Cyclohexan/Ethanol/Et3N 6:2:2). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,30 (s, 2H), 5,93 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,21 (t, 1H, J= 7,3 Hz), 7,28 (t, 2H, J= 7,3 Hz), 7,39-7,41 (m, 3H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 33,5, 60,3, 109,2, 115,2, 126,8, 128,3 (2C), 128,8 (2C), 131,8, 138,6, 150,5, 152,7, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 1457, 1681, 2975, 3140, 3281, 3405. HRMS: [C15H17N3O2S + H]+ berechnet: 304,1114, gemessen: 304,1099.2.31 mmol of 6- (benzylthio) -3-nitropyridin-2-amine (0.60 g) were suspended in a mixture of 15 ml of water and 25 ml of isopropanol. 6.93 mmol iron powder (3 eq, 0.39 g) and 10.4 mmol NH 4 Cl (4.5 eq, 0.56 g) were added and the suspension heated to reflux for 6 h. The resulting dark brown mixture was filtered and the residue washed with 50 ml of isopropanol. Subsequently, 13.9 mmol Et 3 N (6.0 eq, 1.91 ml) and 5.54 mmol ethyl chloroformate (2.4 eq, 0.53 ml) were added. To complete the reaction, 5.54 mmol of ethyl chloroformate were added after one and two hours, respectively. After an additional 5 hours, the solution was concentrated on a rotary evaporator and the residue was taken up in 100 ml of ethyl acetate. The organic phase was washed with 2 × 100 ml of water and 100 ml of saturated brine. After drying over Na 2 SO 4 , the crude product was purified by flash chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate 7: 3) and the resulting brown solid washed with a little ice-cold diethyl ether. Light blue solid (mp. 100-101 ° C). Yield: 0.23 g (33.0%). R f = 0.72 (cyclohexane / ethanol / Et 3 N 6: 2: 2). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.22 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.30 (s, 2H) , 5.93 (s, 2H), 6.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.21 (t, 1H, J = 7.3 Hz), 7.28 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 7.39-7.41 (m, 3H), 8.57 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 14.5, 33.5, 60.3, 109.2, 115.2, 126.8, 128.3 (2C), 128.8 (2C), 131, 8, 138.6, 150.5, 152.7, 154.4. IR [cm -1]: v = 1457, 1681, 2975, 3140, 3281, 3405. HRMS: [C 15 H 17 N 3 O 2 S + H] + calculated: 304.1114, Measured: 304.1099.

Ethyl-{2-amino-6-[(3,4-difluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamatEthyl {2-amino-6 - [(3,4-difluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate

Figure DE102018212006B3_0066
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5 mmol 6-[(3,4-Difluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,49 g) wurden in einer Mischung aus 30 ml Wasser und 50 ml Isopropanol suspendiert. 15 mmol Eisenpulver (3,0 eq, 0,84 g) und 22,5 mmol NH4Cl (4,5 eq, 1,2 g) wurden hinzugefügt und die Mischung für 3,5 h zum Rückfluss erhitzt. Die resultierende Suspension wurde filtriert und der Rückstand mit 100 ml Isopropanol gewaschen. 15 mmol Et3N (3,0 eq, 2,07 ml) sowie 6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,2 eq, 0,57 ml) wurden zur Lösung gegeben und für 2 h bei 40 °C gerührt. Zur Vervollständigung der Reaktion wurden weitere 5,5 mmol Chlorameisensäureethylester sowie 5 mmol Et3N hinzugefügt. Nach weiteren 5 h wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in 100 ml Ethylacetat aufgenommen und mit 2×100 ml Wasser sowie 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Das Rohprodukt wurde mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: n-Hexan/Ethylacetat 7:3) aufgereinigt. Farbloser Feststoff (Smp.: 137-140 °C).5 mmol of 6 - [(3,4-difluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (1.49 g) was suspended in a mixture of 30 ml of water and 50 ml of isopropanol. 15 mmol iron powder (3.0 eq, 0.84 g) and 22.5 mmol NH 4 Cl (4.5 eq, 1.2 g) were added and the mixture heated to reflux for 3.5 h. The resulting suspension was filtered and the residue washed with 100 ml of isopropanol. 15 mmol Et 3 N (3.0 eq, 2.07 ml) and 6 mmol ethyl chloroformate (1.2 eq, 0.57 ml) were added to the solution and stirred for 2 h at 40 ° C. To complete the reaction, another 5.5 mmol of ethyl chloroformate and 5 mmol of Et 3 N were added. After a further 5 h, the solution was concentrated on a rotary evaporator, the residue taken up in 100 ml of ethyl acetate and washed with 2 × 100 ml of water and 100 ml of saturated brine. The crude product was purified by flash chromatography (mobile phase: n-hexane / ethyl acetate 7: 3). Colorless solid (mp. 137-140 ° C).

Ausbeute: 0,95 g (56,0 %). Rf= 0,39 (n-Hexane/Ethylacetate 7:3). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,29 (s, 2H), 5,99 (s, 2H), 6,42 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,24-7,36 (m, 2H), 7,40 (d, 1H, J= 6,3 Hz), 7,45-7,50 (m, 1H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,2, 60,4, 109,3, 115,3, 117,1 (d, 2JC,F = 17 Hz), 117,8 (d, 2JC,F = 17 Hz), 125,7 (dd, 3JC,F = 6 Hz, 4JC,F = 3 Hz), 132,0, 137,0 (dd, 3JC,F = 6 Hz, 4JC,F = 4 Hz), 147,2 und 149,6 (dd, 1JC,F = 245 Hz, 2JC,F = 13 Hz). 147,8 und 150,2 (dd, 1JC,F = 245 Hz, 2JC,F = 13 Hz), 152,9, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 1203, 1454, 1510, 1674, 2991, 3149, 3272, 3396. HRMS: [C15H15N3O2F2S + H]+ berechnet: 340,0926, gemessen: 340,0919.Yield: 0.95 g (56.0%). R f = 0.39 (n-hexane / ethyl acetate 7: 3). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.22 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.29 (s, 2H) , 5.99 (s, 2H), 6.42 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.24-7.36 (m, 2H), 7.40 (d, 1H, J = 6.3 Hz), 7.45-7.50 (m, 1H), 8.57 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 14.5, 32.2, 60.4, 109.3, 115.3, 117.1 (d, 2 J C, F = 17 Hz), 117.8 ( d, 2 J C, F = 17 Hz), 125.7 (dd, 3 J C, F = 6 Hz, 4 J C, F = 3 Hz), 132.0, 137.0 (dd, 3 J C , F = 6 Hz, 4 J C, F = 4 Hz), 147.2 and 149.6 (dd, 1 J C, F = 245 Hz, 2 J C, F = 13 Hz). 147.8 and 150.2 (dd, 1 J C, F = 245 Hz, 2 J C, F = 13 Hz), 152.9, 154.4. IR [cm -1]: v = 1203, 1454, 1510, 1674, 2991, 3149, 3272, 3396. HRMS: [C 15 H 15 N 3 O 2 F 2 S + H] + calculated: 340.0926 measured, : 340.0919.

Ethyl-(2-amino-6-{[4-(trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamatEthyl (2-amino-6 - {[4- (trifluoromethyl) benzyl] thio} pyridin-3-yl) carbamate

Figure DE102018212006B3_0067
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In einem 3-Hals-Kolben wurden 1.52 mmol 3-Nitro-6-{[4-(trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-2-amin (0,50 g) sowie 7,9 mmol SnCl2•2H2O (5,2 eq, 1,79 g) vorgelegt und in 20 ml Ethanol suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde unter Argon-Atmosphäre für 23 h auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurde der Ansatz auf 40 °C abgekühlt und 15,4 mmol Et3N (10,2 eq, 2,14 ml) sowie 1,9 mmol Chlorameisensäureethylester (1,27 eq, 0,18 ml) hinzugefügt. Nach 30 min wurde die Temperatur auf 55 °C erhöht und für eine weitere Stunde gerührt. Nach anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand in DCM aufgenommen. Nach waschen der organischen Phase mit Wasser und anschließender Trocknung über Na2SO4 wurde das Lösemittel im Teilvakuum entfernt und der Rückstand mit n-Hexan gewaschen. Farbloser Feststoff (Smp.: 166-168 °C). Ausbeute: 0,42 g (74,0 %). Rf= 0,58 (n-Hexan/Ethylacetate 7:3). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,39 (s, 2H), 5,97 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,41 (d, 1H, J= 5,6 Hz), 7,64 (s, 4H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,8, 60,4, 109,3, 115,3, 122,9 and 125,6, 125,1 (q, 2C, 4JC,F = 4 Hz), 127,4 (q, 2JC,F = 32 Hz), 129,6 (2C), 131,8, 144,1, 149,6, 152,7, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 1113, 1460, 1685, 2980, 3174, 3307, 3423. HRMS: [C16H16N3O2F3S + H]+ berechnet: 372,0988, gemessen: 372,0970.In a 3-neck flask, 1.52 mmol 3-nitro-6 - {[4- (trifluoromethyl) benzyl] thio} pyridin-2-amine (0.50 g) and 7.9 mmol SnCl 2 • 2H 2 O ( 5.2 eq, 1.79 g) and suspended in 20 ml of ethanol. The reaction mixture was heated to 70 ° C. under argon atmosphere for 23 h. The reaction was then cooled to 40 ° C and 15.4 mmol Et 3 N (10.2 eq, 2.14 ml) and 1.9 mmol ethyl chloroformate (1.27 eq, 0.18 ml) were added. After 30 minutes, the temperature was raised to 55 ° C and stirred for an additional hour. After subsequent cooling to room temperature, the suspension was filtered through kieselguhr and the residue was washed with ethanol. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator and the residue taken up in DCM. After washing the organic phase with water and then drying over Na 2 SO 4 , the solvent was removed in a partial vacuum and the residue was washed with n-hexane. Colorless solid (mp 166-168 ° C). Yield: 0.42 g (74.0%). R f = 0.58 (n-hexane / ethyl acetate 7: 3). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.22 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.39 (s, 2H) , 5.97 (s, 2H), 6.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.64 (s, 4H) , 8.57 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 14.5, 32.8, 60.4, 109.3, 115.3, 122.9 and 125.6, 125.1 (q, 2C, 4 J C, F = 4 Hz), 127.4 (q, 2 J C, F = 32 Hz), 129.6 (2C), 131.8, 144.1, 149.6, 152.7, 154.4. IR [cm -1]: v = 1113, 1460, 1685, 2980, 3174, 3307, 3423. HRMS: [C 16 H 16 N 3 O 2 F 3 S + H] + calculated: 372.0988; found: 372 , 0970th

Ethyl-(2-amino-6-{[4-(pentafluor-A6-sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamatEthyl (2-amino-6 - {[4- (pentafluoro-A 6 -sulfanyl) benzyl] thio} pyridin-3-yl) carbamate

Figure DE102018212006B3_0068
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2 mmol 3-Nitro-6-((4-(pentafluor-λ6-sulfanyl)benzyl)thio)pyridin-2-amin (0,78 g) wurden in einer Mischung aus 12 ml Wasser und 20 ml Isopropanol suspendiert. Nach Zugabe von 6 mmol Eisenpulver (3,0 eq, 0,34 g) und 9 mmol NH4Cl (4,5 eq, 0,48 g) wurde für 2 h zum Rückfluss erhitzt. Die Suspension wurde anschließend filtriert und der Rückstand mit 100 ml Isopropanol gewaschen. Dem Filtrat wurden 10 mmol Et3N (5 eq, 1.38 ml) und 2,4 mmol Chlorameisensäureethylester (1,2 eq, 0,23 ml) zugegeben und der Ansatz auf 40 °C erhitzt. Nach 1,5 h wurden erneut 2,4 mmol Chlorameisensäureethylester hinzugefügt und für weitere 7 h gerührt. Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in 50 ml Ethylacetat aufgenommen und mit 2x50 ml Wasser sowie 50 ml gesättigte Kochsalzlösung gewaschen. Das Rohprodukt wurde anschließend mittels Flashchromatographie (Mobile Phase n-Hexan/Ethylacetat 7:3). Blauer Feststoff (Smp.: 157-158 °C). Ausbeute: 0,45 g (52,4 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,39 (s, 2H), 5,97 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J= 6,1 Hz), 7,64 (d, 2H, J= 8,5 Hz),7,80 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,2, 60,3, 109,3, 115,4, 125,7 (t, 2C, 3JC,F = 5 Hz), 129,7 (2C), 131,9, 144,2, 149,4, 151,3 (q, 2JC,F = 15 Hz), 152,8, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 827, 1076, 1218, 1461, 1507, 1649, 1693, 2992, 3163, 3325, 3392. HRMS: [C15H16N3O2F5S2 + H]+ berechnet: 430,0677, gemessen: 430,0684.2 mmol of 3-nitro-6 - ((4- (pentafluoro-λ 6 -sulfanyl) benzyl) thio) pyridin-2-amine (0.78 g) were suspended in a mixture of 12 ml of water and 20 ml of isopropanol. After addition of 6 mmol iron powder (3.0 eq, 0.34 g) and 9 mmol NH 4 Cl (4.5 eq, 0.48 g) was heated at reflux for 2 h. The suspension was then filtered and the residue washed with 100 ml of isopropanol. To the filtrate was added 10 mmol Et 3 N (5 eq, 1.38 ml) and 2.4 mmol ethyl chloroformate (1.2 eq, 0.23 ml) and the reaction heated to 40 ° C. After 1.5 h, 2.4 mmol of ethyl chloroformate were again added and stirred for a further 7 h. The solution was then concentrated on a rotary evaporator, the residue taken up in 50 ml of ethyl acetate and washed with 2x50 ml of water and 50 ml of saturated brine. The crude product was then purified by flash chromatography (mobile phase n-hexane / ethyl acetate 7: 3). Blue solid (mp. 157-158 ° C). Yield: 0.45 g (52.4%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.22 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.39 (s, 2H) , 5.97 (s, 2H), 6.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 6.1 Hz), 7.64 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.80 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 8.57 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 14.5, 32.2, 60.3, 109.3, 115.4, 125.7 (t, 2C, 3 J C, F = 5 Hz), 129, 7 (2C), 131.9, 144.2, 149.4, 151.3 (q, 2 J C, F = 15 Hz), 152.8, 154.4. IR [cm -1]: V = 827, 1076, 1218, 1461, 1507, 1649, 1693, 2992, 3163, 3325, 3392nd HRMS: [C 15 H 16 N 3 O 2 F 5 S 2 + H] + calculated: 430.0677, measured: 430.0684.

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid N- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} butyric acid

Figure DE102018212006B3_0069
Figure DE102018212006B3_0069

1 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,28 g) wurden in 15 ml Isopropanol suspendiert und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 5 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol Buttersäurechlorid (1,2 eq, 0,12 ml) in 2 ml Ethylacetat über 10 min topfenweise hinzugefügt. Nach 2 h wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt, in wenig Isopropanol gelöst und mit Wasser präzipitiert. Der Feststoff wurde abfiltriert, aus DCM umkristallisiert und mit wenig n-Hexan gewaschen. Hellgelber Feststoff (Smp.: 163-164 °C). Ausbeute: 0,11 g (34,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,91 (t, 3H, J= 7,4 Hz), 1,60 (se, 2H, J= 7,4 Hz), 2,28 (t, 2H, J= 7,4 Hz), 4,30 (s, 2H), 5,90 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,10 (m, 2H), 7,44 (m, 2H), 7,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 8,98 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 13,6, 18,5, 32,6, 37,7, 109,2, 115,0 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, 3JC.F = 8 Hz), 132,7, 135,0 (d, 4JC,F = 3 Hz), 150,6, 152,9, 159,9 und 162,3 (d, JC,F = 243 Hz), 171,5. IR [cm-1]: ṽ= 753, 1208, 1456, 1504, 1589, 1650, 2960, 3147, 3334. HRMS: [C16H18N3OFS + H]+ berechnet: 320,1227, gemessen: 320,1232.1 mmol of 6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (0.28 g) was suspended in 15 ml of isopropanol and a spatula tip of Raney nickel added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere using a balloon and stirred vigorously for 5 h. To the reaction was added 1.4 mmol Et 3 N (1.4 eq, 0.2 ml) followed by a solution of 1.2 mmol butyric acid chloride (1.2 eq, 0.12 ml) in 2 ml of ethyl acetate over 10 min added in pots. After 2 h, the catalyst was filtered off and the filtrate was concentrated on a rotary evaporator, dissolved in a little isopropanol and precipitated with water. The solid was filtered off, recrystallised from DCM and washed with a little n-hexane. Light yellow solid (mp. 163-164 ° C). Yield: 0.11 g (34.5%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 0.91 (t, 3H, J = 7.4 Hz), 1.60 (se, 2H, J = 7.4 Hz), 2.28 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 4.30 (s, 2H), 5.90 (s, 2H), 6.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.10 (m, 2H) , 7.44 (m, 2H), 7.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.98 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 13.6, 18.5, 32.6, 37.7, 109.2, 115.0 (d, 2C, 2 J C, F = 21 Hz), 115, 2, 130.7 (d, 2C, 3 J CF = 8 Hz), 132.7, 135.0 (d, 4 J C, F = 3 Hz), 150.6, 152.9, 159.9 and 162.3 (d, J C, F = 243 Hz), 171.5. IR [cm -1]: V = 753, 1208, 1456, 1504, 1589, 1650, 2960, 3147, 3334. HRMS: [C 16 H 18 N 3 SFO + H] + calculated: 320.1227; found: 320 , 1232nd

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}pivalinsäureamidN- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} pivalinsäureamid

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1 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 4,5 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,3 mmol Pivalinsäurechlorid (1,3 eq, 0,16 ml) in 2 ml THF über 10 min topfenweise hinzugefügt. Nach 2 h wurde der Katalysator abfiltriert und das Produkt durch Zugabe von Wasser präzipitiert. Der Feststoff wurde abfiltriert und aus Toluen umkristallisiert. Hellgelbe Plättchen (Smp.: 165-166 °C). Ausbeute: 0,17 g (53,3 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,21 (s, 9H), 4,32 (s, 2H), 5,70 (s, 2H), 6,47 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 7,08-7,12 (m, 2H), 7,20 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 7,43-7,47 (m, 2H), 8,68 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 27,3 (3C), 32,5, 109,5, 115,0 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 135,0 (d, 4JC,F = 4 Hz), 151,6, 154,4, 159,6 und 162,3 (d, 1JC,F = 243 Hz), 177,0. IR [cm-1]: ṽ= 753, 1220, 1440, 1504, 1590, 1647, 2960, 3181, 3381. HRMS: [C17H20N3OFS + H]+ berechnet: 334,1384, gemessen: 334,1388.1 mmol of 6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (0.28 g) was dissolved in 10 ml of THF and a spatula tip of Raney nickel was added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere using a balloon and stirred vigorously for 4.5 h. To the reaction was added 1.4 mmol Et 3 N (1.4 eq, 0.2 ml) and then a solution of 1.3 mmol pivaloyl chloride (1.3 eq, 0.16 ml) in 2 ml THF over 10 min added in pots. After 2 hours, the catalyst was filtered off and the product was precipitated by the addition of water. The solid was filtered off and recrystallized from toluene. Pale yellow platelets (mp. 165-166 ° C). Yield: 0.17 g (53.3%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.21 (s, 9H), 4.32 (s, 2H), 5.70 (s, 2H), 6.47 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.08-7.12 (m, 2H), 7.20 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.43-7.47 (m, 2H), 8.68 (s , 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 27.3 (3C), 32.5, 109.5, 115.0 (d, 2C, 2 J C, F = 21 Hz), 115.2, 130.7 (d, 2C, 3 J C, F = 8 Hz), 135.0 (d, 4 J C, F = 4 Hz), 151.6, 154.4, 159.6 and 162.3 (d, 1 J C, F = 243 Hz), 177.0. IR [cm -1 ]: ṽ = 753, 1220, 1440, 1504, 1590, 1647, 2960, 3181, 3381. HRMS: [C 17 H 20 N 3 OFS + H] + calcd: 334.1384, measured: 334 , 1388th

N-{2-Amino-6-[(cyclohexylmethyl)thio]pyridin-3-yl}buttersäureamidN- {2-amino-6 - [(cyclohexylmethyl) thio] pyridin-3-yl} butyric acid

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2 mmol 6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amine (0,53 g) wurden in 20 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Die Suspension wurde auf 0 °C abgekühlt und 1,4 mmol Et3N (2,8 eq, 0,39 ml) zugesetzt. Anschließend wurde eine Lösung von 2,4 mmol Buttersäurechlorid (1,2 eq, 0,25 ml) in 2 ml THF über 10 min tropfenweise hinzugefügt. Nach 3 h wurde der Reaktionsansatz filtriert und dem Filtrat 120 ml Wasser zugesetzt. Das Produkt wurde abfiltriert und zwei Mal aus Toluen umkristallisiert. Hellgelber Feststoff (Smp.: 107-109 °C). Ausbeute: 0,11 g (18,7 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,91 (t, 3H, J= 7,4 Hz), 0,97 (m, 2H), 1,10-1,23 (m, 3H), 1,48 (m, 1H), 1,59 (se, 2H, J= 7,3 Hz), 1,65-1,68 (m, 3H), 1,81 (d, 2H, J= 11,4 Hz), 2,28 (t, 2H, J= 7,4 Hz), 2,94 (d, 2H, J= 6,6 Hz), 5,79 (s, 2H), 6,43 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 9,00 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 13,6, 18,5, 25,5 (2C), 25,9, 32,1 (2C), 36,4, 37,5, 37,7, 109,2, 114,8, 132,7, 151,9, 152,9, 171,4. IR [cm-1]: ṽ= 1227, 1454, 1504, 1588, 1644, 2849, 2925, 3157, 3319, 3395. HRMS: [C16H25N3OS + H]+ berechnet: 308,1791, gemessen: 308,1797.2 mmol of 6 - [(cyclohexylmethyl) thio] -3-nitropyridine-2-amine (0.53 g) was dissolved in 20 ml of THF and a spatula tip of Raney nickel was added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere with the aid of a balloon and stirred vigorously for 1 h. The suspension was cooled to 0 ° C and 1.4 mmol Et 3 N (2.8 eq, 0.39 ml) added. Subsequently, a solution of 2.4 mmol butyric acid chloride (1.2 eq, 0.25 ml) in 2 ml of THF was added dropwise over 10 min. After 3 h, the reaction was filtered and added to the filtrate 120 ml of water. The product was filtered off and recrystallized twice from toluene. Light yellow solid (mp. 107-109 ° C). Yield: 0.11 g (18.7%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 0.91 (t, 3H, J = 7.4 Hz), 0.97 (m, 2H), 1.10-1.23 (m, 3H), 1, 48 (m, 1H), 1.59 (se, 2H, J = 7.3 Hz), 1.65-1.68 (m, 3H), 1.81 (d, 2H, J = 11.4 Hz ), 2.28 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 2.94 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 5.79 (s, 2H), 6.43 (d, 1H , J = 8.0 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 9.00 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 13.6, 18.5, 25.5 (2C), 25.9, 32.1 (2C), 36.4, 37.5, 37.7, 109, 2, 114.8, 132.7, 151.9, 152.9, 171.4. IR [cm -1]: v = 1227, 1454, 1504, 1588, 1644, 2849, 2925, 3157, 3319, 3395. HRMS: [C 16 H 25 N 3 OS + H] + calculated: 308.1791, measured : 308.1797.

2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-N-[6-(isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]acetamid2- (3,5-Dimethoxyphenyl) -N- [6- (isobutylthio) -2- (pyrrolidin-1-yl) pyridin-3-yl] acetamide

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1 mmol 6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 0,5 h gerührt. Anschließend wurde die Suspension auf 0 °C abgekühlt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)acetylchlorid (0,26 g) in 1,5 ml DCM über 15 min zugetropft. Nach 3 h wurden der Mischung 100 ml Wasser zugesetzt und mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 2×100 ml Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen sowie über Na2SO4 getrocknet. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt woraufhin ein grünes Öl zurückblieb. Dieses kristallisierte bei Lagerung im Kühlschrank aus und konnte anschließend aus Methanol umkristallisiert werden. Leicht grünliche Nadeln (Smp.: 137-138 °C). Ausbeute: 0,09 g (19,8 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,97 (d, 6H, J= 6,7 Hz), 1,77 (t, 4H, J= 6,6 Hz), 1,87 (sep, 1H, J= 6,7 Hz), 2,99 (d, 2H, J = 6,7 Hz), 3,37 (t, 4H, J= 6,6 Hz), 3,51 (s, 2H), 3,73 (s, 6H), 6,39 (t, 1H, J= 2,3 Hz), 6,48 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 6,50 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 7,12 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 9,39 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 21,7 (2C), 24,9 (2C), 28,4, 37,5, 42,9, 48,1 (2C), 55,1 (2C), 98,4, 107,2 (2C), 109,4, 114,5, 137,8, 137,9, 152,8, 153,9, 160,3 (2C), 169,5. IR [cm-1]: ṽ= 1054, 1148, 1203, 1439, 1515, 1594, 1649, 2863, 2959, 3256. HRMS: [C23H31N3O3S + H]+ berechnet: 430,2159, gemessen: 430,2171.1 mmol of 6- (isobutylthio) -3-nitro-2- (pyrrolidin-1-yl) pyridine (0.28 g) was dissolved in 10 ml of THF and a spatula tip of Raney nickel added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere using a balloon and stirred vigorously for 0.5 h. Subsequently, the suspension was cooled to 0 ° C. 1.4 mmol Et 3 N (1.4 eq, 0.2 ml) was added to the reaction followed by a solution of 1.2 mmol 2- (3,5-dimethoxyphenyl) acetyl chloride (0.26 g) in 1, 5 ml DCM was added dropwise over 15 min. After 3 h, 100 ml of water were added to the mixture and extracted with 100 ml of diethyl ether. The organic phase was washed with 2 × 100 ml of water and saturated brine, and dried over Na 2 SO 4 . The solution was concentrated on a rotary evaporator whereupon a green oil remained. This crystallized on storage in the refrigerator and could then be recrystallized from methanol. Slightly greenish needles (mp. 137-138 ° C). Yield: 0.09 g (19.8%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 0.97 (d, 6H, J = 6.7 Hz), 1.77 (t, 4H, J = 6.6 Hz), 1.87 (sep, 1H, J = 6.7 Hz), 2.99 (d, 2H, J = 6.7 Hz), 3.37 (t, 4H, J = 6.6 Hz), 3.51 (s, 2H), 3 , 73 (s, 6H), 6.39 (t, 1H, J = 2.3 Hz), 6.48 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.50 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 9.39 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 21.7 (2C), 24.9 (2C), 28.4, 37.5, 42.9, 48.1 (2C), 55.1 (2C), 98.4, 107.2 (2C), 109.4, 114.5, 137.8, 137.9, 152.8, 153.9, 160.3 (2C), 169.5. IR [cm -1]: v = 1054, 1148, 1203, 1439, 1515, 1594, 1649, 2863, 2959, 3256. HRMS: [C 23 H 31 N 3 O 3 S + H] + calculated: 430.2159 , measured: 430.2171.

N-{6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl}-2-(3,5-dimethoxyphenyl)acetamidN- {6 - [(Cyclohexylmethyl) thio] -2- (pyrrolidin-1-yl) pyridin-3-yl} -2- (3,5-dimethoxyphenyl) acetamide

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1 mmol 6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,32 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)acetylchlorid (0,26 g) in 1,5 ml DCM über 15 min zugetropft. Nach 1 h wurde die Suspension filtriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und mit Wasser, gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und nach entfernen des Lösemittels aus Methanol umkristallisiert. Das Produkt wurde anschließend mittels präparativer HPLC aufgereinigt (Gradient: 50-90 % Methanol/Wasser, selbstgepackte C18-Säule). Dabei präzipitierte das Produkt nachdem der Methanol am Rotationsverdampfer entfernt wurde. Farbloser Feststoff (Smp.: 142-144 °C). Ausbeute: 0,04 g (8,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,95-0,98 (m, 2H), 1,09-1,24 (m, 5H), 1,55-1,82 (m, 10H), 2,98 (d, 2H, J= 5,8 Hz), 3,37 (m, 4H), 3,51 (s, 2H), 3,73 (s, 6H), 6,39-6,50 (m, 4H), 7,11 (d, 1H, J= 7,6 Hz), 9,39 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 24,9 (2C), 25,6 (2C), 25,9, 32,1 (2C), 36,0, 37,7, 42,9, 48,1 (2C), 55,1 (2C), 98,4, 107,2 (2C), 109,4, 114,4, 137,8, 137,9, 152,9, 153,9, 160,3 (2C), 169,6. IR [cm-1]: ṽ= 1064, 1142, 1200, 1446, 1517, 1589, 1650, 2848, 2919, 3243. HRMS: [C26H35N3O3S + H]+ berechnet: 470,2472, gemessen: 470,2485.1 mmol of 6 - [(cyclohexylmethyl) thio] -3-nitro-2- (pyrrolidin-1-yl) pyridine (0.32 g) was dissolved in 10 ml of THF and a spatula tip of Raney nickel was added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere with the aid of a balloon and stirred vigorously for 1 h. 1.4 mmol Et 3 N (1.4 eq, 0.2 ml) was added to the reaction followed by a solution of 1.2 mmol 2- (3,5-dimethoxyphenyl) acetyl chloride (0.26 g) in 1, 5 ml DCM was added dropwise over 15 min. After 1 h, the suspension was filtered and the filtrate was concentrated on a rotary evaporator. The residue was taken up in diethyl ether and washed with water, saturated NaHCO 3 solution and saturated brine. The organic phase was dried over Na 2 SO 4 and, after removal of the solvent, recrystallized from methanol. The product was then purified by preparative HPLC (gradient: 50-90% methanol / water, self-packed C18 column). This precipitated the product after the methanol was removed on a rotary evaporator. Colorless solid (mp. 142-144 ° C). Yield: 0.04 g (8.5%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 0.95-0.98 (m, 2H), 1.09-1.24 (m, 5H), 1.55-1.82 (m, 10H), 2 , 98 (d, 2H, J = 5.8 Hz), 3.37 (m, 4H), 3.51 (s, 2H), 3.73 (s, 6H), 6.39-6.50 ( m, 4H), 7.11 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 9.39 (s, 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 24.9 (2C), 25.6 (2C), 25.9, 32.1 (2C), 36.0, 37.7, 42.9, 48.1 (2C), 55.1 (2C), 98.4, 107.2 (2C), 109.4, 114.4, 137.8, 137.9, 152.9, 153.9, 160.3 ( 2C), 169.6. IR [cm -1]: v = 1064, 1142, 1200, 1446, 1517, 1589, 1650, 2848, 2919, 3243. HRMS: [26 H 35 N 3 O 3 S + H C] + calculated: 470.2472 , measured: 470.2485.

3-(3,5-Difluorphenyl)-N-[6-(isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propionsäureamid 3- (3,5-difluorophenyl) -N- [6- (isobutylthio) -2- (pyrrolidin-1-yl) pyridin-3-yl] propionamide

Figure DE102018212006B3_0074
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1 mmol 6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1 mmol 3-(3,5-difluorphenyl)propanoylchlorid (1,0 eq, 0,20 g) in 1,1 ml DCM über 10 min hinzugefügt. Nach 30 min wurde der Katalysator abfiltriert, dem Reaktionsansatz 100 ml Wasser zugesetzt und das Produkt mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 100 ml Wasser, 100 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach trocknen der Etherphase über Na2SO4 und Evaporation des Lösemittels resultierte ein grüngefärbter Feststoff welcher aus einer Ethanol/Wasser-Mischung (9:1) umkristallisiert wurde. Farbloser Feststoff (Smp.: 138-140 °C). Ausbeute: 0,17 g (40,6 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,97 (d, 6H, J= 6,7 Hz), 1,77 (t, 4H, J= 6,6 Hz), 1,87 (sep, 6,7 Hz), 2,62 (t, 2H, J= 7,3 Hz), 2,92 (t, 2H, J= 7,3 Hz), 2,99 (d, 2H, J= 6,6 Hz), 3,32 (t, 4H, J= 6,6 Hz, 6,48 (d, 1H, J= 7,8 Hz), 6,97-7,08 (m, 3H), 7,06 (d, 1H, J= 7,8 Hz), 9,26 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 21,7 (2C), 25,0 (2C), 28,4, 30,2, 36,2, 38,9, 48,1 (2C), 101,4 (t, 2JC,F = 26 Hz), 109,4, 111,6 (dd, 2C, 2JC,F = 18 Hz, 3JC,F = 6 Hz), 114,4, 137,8, 146,0 (t, 3JC,F = 9 Hz), 152,7, 154,0, 160,0 und 163,5 (dd, 2C 1JC,F = 246 Hz, 3JC,F = 14 Hz), 170,7. IR [cm-1]: ṽ= 849, 1110, 1232, 1449, 1515, 1592, 1643, 2845, 2961, 3267. HRMS: [C22H27N3OF2S + H]+ berechnet:420,1916, gemessen: 420,1904.1 mmol of 6- (isobutylthio) -3-nitro-2- (pyrrolidin-1-yl) pyridine (0.28 g) was dissolved in 10 ml of THF and a spatula tip of Raney nickel added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere with the aid of a balloon and stirred vigorously for 1 h. To the reaction was added 1.4 mmol of Et 3 N (1.4 eq, 0.2 ml), followed by a solution of 1 mmol of 3- (3,5-difluorophenyl) propanoyl chloride (1.0 eq, 0.20 g). in 1.1 ml of DCM over 10 min. After 30 minutes, the catalyst was filtered off, the reaction mixture was added to 100 ml of water and the product was extracted with 100 ml of diethyl ether. The organic phase was washed with 100 ml of water, 100 ml of saturated NaHCO 3 solution and 100 ml of saturated brine. After drying the ether phase over Na 2 SO 4 and evaporation of the solvent resulted in a green-colored solid which was recrystallized from an ethanol / water mixture (9: 1). Colorless solid (mp. 138-140 ° C). Yield: 0.17 g (40.6%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 0.97 (d, 6H, J = 6.7 Hz), 1.77 (t, 4H, J = 6.6 Hz), 1.87 (sep, 6, 7 Hz), 2.62 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.92 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.99 (d, 2H, J = 6.6 Hz ), 3.32 (t, 4H, J = 6.6 Hz, 6.48 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 6.97-7.08 (m, 3H), 7.06 ( d, 1H, J = 7.8 Hz), 9.26 (s, 1H) 13 C-NMR [ppm]: δ = 21.7 (2C), 25.0 (2C), 28.4, 30 , 2, 36.2, 38.9, 48.1 (2C), 101.4 (t, 2 J C, F = 26 Hz), 109.4, 111.6 (dd, 2C, 2 J C, F = 18 Hz, 3 J C, F = 6 Hz), 114.4, 137.8, 146.0 (t, 3 J C, F = 9 Hz), 152.7, 154.0, 160.0 and 163.5 (dd, 2C 1 J C, F = 246 Hz, 3 J C, F = 14 Hz), 170.7 IR [cm -1 ]: ṽ = 849, 1110, 1232, 1449, 1515, 1592, 1643, 2845, 2961, 3267th HRMS: [C 22 H 27 N 3 OF 2 S + H] + calculated: 420.1916, measured: 420.1904.

N-{2-Amino-6-[(cyclopropylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-3-(3,5-difluorphenyl)propionsäureamidpropionamide -3- (3,5-difluorophenyl) - N- {[(cyclopropylmethyl) thio] pyridin-3-yl 2-amino-6}

Figure DE102018212006B3_0075
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2 mmol 6-[(Cyclopropylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,45 g) wurden in 20 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 3 h gerührt. Dem Ansatz wurden 2,8 mmol Et3N (1,4 eq, 0,39 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 2 mmol 3-(3,5-difluorphenyl)propanoylchlorid (1,0 eq, 0,40 g) in 2,2 ml DCM über 10 min hinzugefügt. Nach 1 h wurde der Katalysator abfiltriert und die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt. Der resultierende grüne Feststoff wurde zwei Mal aus einer Ethanol/Wasser-Mischung (8:2) umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 122-125 °C). Ausbeute: 0,24 g (33,1 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,24-0,28 (m, 2H), 0,49-0,54 (m, 2H), 1,02-1,11 (m, 1H), 2,66 (t, 2H, J= 15,3), 2,94 (t, 2H J= 15,2 Hz), 2,99 (d, 2H, J= 7,0 Hz), 5,81 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,00-7,07 (m, 3H), 7,37 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 9,03. 13C-NMR [ppm]: δ = 5,5 (2C), 10,8, 30,4, 34,9, 36,4, 101,4 (t, 2JC,F = 26 Hz), 109,1, 111,4 (dd, 2C, 2JC,F = 18 Hz, 3JC,F = 6 Hz), 114,5, 132,8, 145,9 (t, 3JC,F = 9 Hz), 152,2, 153,1, 161,1 und 163,5 (dd, 2C, 1JC,F = 246 Hz, 3JC,F = 14 Hz), 170,4. IR [cm-1]: ṽ= 771, 832, 968, 1114, 1463, 1523, 1592, 1639, 3091, 3154, 3283, 3465. HRMS: [C18H19N3OF2S + H]+ berechnet: 364,1290, gemessen: 364,1282.2 mmol of 6 - [(cyclopropylmethyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (0.45 g) was dissolved in 20 ml of THF and a spatula tip of Raney nickel was added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere using a balloon and stirred vigorously for 3 h. To the reaction was added 2.8 mmol Et 3 N (1.4 eq, 0.39 ml) followed by a solution of 2 mmol 3- (3,5-difluorophenyl) propanoyl chloride (1.0 eq, 0.40 g). in 2.2 ml of DCM over 10 min. After 1 h, the catalyst was filtered off and the solution was concentrated on a rotary evaporator. The resulting green solid was recrystallized twice from an ethanol / water (8: 2) mixture. Colorless solid (mp 122-125 ° C). Yield: 0.24 g (33.1%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 0.24-0.28 (m, 2H), 0.49-0.54 (m, 2H), 1.02-1.11 (m, 1H), 2 , 66 (t, 2H, J = 15.3), 2.94 (t, 2H J = 15.2 Hz), 2.99 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 5.81 (s , 2H), 6.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.00-7.07 (m, 3H), 7.37 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 9 , 03. 13 C-NMR [ppm]: δ = 5.5 (2C), 10.8, 30.4, 34.9, 36.4, 101.4 (t, 2 J C, F = 26 Hz), 109 , 1, 111.4 (dd, 2C, 2 J C, F = 18 Hz, 3 J C, F = 6 Hz), 114.5, 132.8, 145.9 (t, 3 J C, F = 9 Hz), 152.2, 153.1, 161.1 and 163.5 (dd, 2C, 1 J C, F = 246 Hz, 3 J C, F = 14 Hz), 170.4. IR [cm -1]: V = 771, 832, 968, 1114, 1463, 1523, 1592, 1639, 3091, 3154, 3283, 3465. HRMS: [C 18 H 19 N 3 OF 2 S + H] + calculated : 364.1290, measured: 364.1282.

Ethyl-{2-amino-5-brom-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat Ethyl {2-amino-5-bromo-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate

Figure DE102018212006B3_0076
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0,5 mmol Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat (0,17 g) wurden in einer Mischung aus 5 ml THF und 5 ml ACN gelöst, 0,05 mmol Ammoniumacetat (0,1 eq, 0,004 mg) zugesetzt und der Reaktionsansatz auf 0 °C abgekühlt. Portionsweise wurden anschließend 0,5 mmol N-Bromsuccinimid (1 eq, 0,09 g) hinzugefügt. Nach 2h wurde die Suspension am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohprodukt mittels MPLC (Gradient: 0-100 % Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das resultierende Produkt wurde anschließend aus DCM umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 171-173 °C). Ausbeute: 0,06 g (28,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,23 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,11 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,33 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 7,07-7,11 (m, 2H), 7,47-7,50 (m, 2H), 7,71 (s, 1H), 8,73 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,4, 32,9, 60,6, 101,2, 114,9 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 116,2, 131,0 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 133,5, 135,1 (d, 4JC,F = 3 Hz), 151,4, 154,3, 159,9 und 162,3 (d, 1JC,F = 243 Hz). IR [cm-1]: ṽ= 755, 837, 1054, 1217, 1265, 1434, 1505, 1608, 1664, 2985, 3244, 3362, 3470. HRMS: [C15H15N3O2FSBr+ H]+ berechnet: 400,0125, gemessen: 400,0113.0.5 mmol of ethyl {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate (0.17 g) was dissolved in a mixture of 5 ml of THF and 5 ml of ACN, O, Add 0.05 mmol of ammonium acetate (0.1 eq, 0.004 mg) and cool the reaction to 0 ° C. Portions of 0.5 mmol of N-bromosuccinimide (1 eq, 0.09 g) were then added. After 2 h, the suspension was concentrated on a rotary evaporator and the crude product was purified by MPLC (gradient: 0-100% ethyl acetate / n-hexane). The resulting product was then recrystallized from DCM. Colorless solid (mp 171-173 ° C). Yield: 0.06 g (28.5%). 1 H-NMR [ppm]: δ = 1.23 (t, 3H, J = 7.1 Hz), 4.11 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 4.33 (s, 2H) , 6.24 (s, 2H), 7.07-7.11 (m, 2H), 7.47-7.50 (m, 2H), 7.71 (s, 1H), 8.73 (s , 1H). 13 C-NMR [ppm]: δ = 14.4, 32.9, 60.6, 101.2, 114.9 (d, 2C, 2 J C, F = 21 Hz), 116.2, 131, 0 (d, 2C, 3 J C, F = 8 Hz), 133.5, 135.1 (d, 4 J C, F = 3 Hz), 151.4, 154.3, 159.9 and 162, 3 (d, 1 J C, F = 243 Hz). IR [cm -1]: V = 755, 837, 1054, 1217, 1265, 1434, 1505, 1608, 1664, 2985, 3244, 3362, 3470. HRMS: [C 15 H 15 N 3 O 2 FSBR + H] + calculated: 400.0125, measured: 400.0113.

Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]-5-methylphenyl}carbamatEthyl {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -5-methylphenyl} carbamate

Figure DE102018212006B3_0077
Figure DE102018212006B3_0077

1,75 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl(thio]-5-methyl-3-nitropyridin-2-amin (0,51 g) wurden zusammen mit 17,5 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,95 g) und 17,5 mmol NH4Cl (0,94 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 4 h zum Rückfluss erhitzt und anschließend über Kieselgur filtriert. Der Rückstand wurde mit 50 ml Ethylacetat gewaschen und dem Filtrat 50 ml Wasser zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit 2x50 ml Ethylacetat extrahiert. Den vereinten organischen Phasen wurden 17,5 mmol Et3N (10 eq, 2,4 ml) sowie 2,21 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,21 ml) zugesetzt und die Lösung bei 40 °C über Nacht gerührt. Die resultierende Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan/0,1 % Et3N). Farbloser Feststoff (Smp: 114-115 °C). Ausbeute: 0.08 g (22,14%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,56 (s, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,10 (m, 2H), 5,70 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,04 Hz, 2H), 1,98 (s, 3H), 1,25 (t, J= 6,96 Hz, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 162,2 (d, J= 243 Hz, 1C), 154,5, 135,6 (d, J= 3 Hz, 1C), 131,0 (d, J= 8 Hz, 2C), 117,0, 115,0 (d, J= 21 Hz, 2C), 60,3, 31,8, 16,6, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3446, 3355, 3287, 1679, 1509, 1442, 1259, 1219, 1083. HRMS: [C16H18N3O2FS + H]+ berechnet: 3336,1177, gemesssen: 336,1171.1.75 mmol of 6 - [(4-fluorobenzyl (thio] -5-methyl-3-nitropyridin-2-amine (0.51 g) was added along with 17.5 mmol iron powder (10 eq, 0.95 g) and 17.5 mmol of NH 4 Cl (0.94 g) were suspended in a mixture of 12 ml of ethanol and 3 ml of water The reaction mixture was refluxed for 4 h and then filtered through kieselguhr The residue was washed with 50 ml of ethyl acetate and 50 ml of water were added to the filtrate, the phases were separated and the aqueous phase was extracted with 2 × 50 ml of ethyl acetate 17.5 mmol of Et 3 N (10 eq, 2.4 ml) and 2.21 mmol of ethyl chloroformate (1 , 3 eq, 0.21 ml) was added and the solution was stirred overnight at 40 ° C. The resulting solution was concentrated on a rotary evaporator and purified by flash chromatography (mobile phase: ethyl acetate / n-hexane / 0.1% Et 3 N). Colorless solid (mp: 114-115 ° C) Yield: 0.08 g (22.14%); 1 H NMR [ppm]: δ = 8.56 (s, 1H), 7.45 (m, 2H), 7.31 (s, 1H), 7.10 (m, 2H), 5.70 (s , 2H), 4.36 (s, 2H), 4.12 (q, J = 7.04 Hz, 2H), 1.98 (s, 3H), 1.25 (t, J = 6.96 Hz , 2H); 13 C NMR [ppm]: δ = 162.2 (d, J = 243 Hz, 1C), 154.5, 135.6 (d, J = 3 Hz, 1C), 131.0 (d, J = 8 Hz, 2C), 117.0, 115.0 (d, J = 21 Hz, 2C), 60.3, 31.8, 16.6, 14.5; IR [cm -1]: v = 3446, 3355, 3287, 1679, 1509, 1442, 1259, 1219, 1083. HRMS: [C 16 H 18 N 3 O 2 FS + H] + calculated: 3336.1177 precisely measured, : 336.1171.

Ethyl-{6-[(4-fluorbenzyl)thio]-2-methylpyridin-3-yl}carbamatEthyl {6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -2-methyl-pyridin-3-yl} carbamate

Figure DE102018212006B3_0078
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1,8 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-2-methyl-3-nitropyridin (0,50 g) und 9 mmol SnCl2•2H2O (5 eq, 2,03 g) wurden in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C über Nacht gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C abgesenkt und 18,36 mmol Et3N (10,2 eq, 2,56 ml) sowie 2,34 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,22 ml) zugesetzt. Nach 3 h wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 30 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und das Produkt durch Wasserzugabe präzipitiert. Beiger Feststoff (Smp.: 102-103 °C); Ausbeute: 0.6 g (84%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,99 (s, 1H), 7,60 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,13 (m, 3H), 4,36 (s, 2H), 4,13 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 2,40 (s, 3H), 1,25 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 162,3 (d, J= 243 Hz, 1C), 154,4, 152,0, 134,7 (d, J= 3 Hz, 1C), 132,8, 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 129,5, 119,5, 115,1 (d, J=21 Hz, 2C), 60,43, 32,8, 20,8, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3284, 2980, 1689, 1509, 1442, 1250, 1061; HRMS: [C16H17N2O2FS + H]+ berechnet: 321.1068, gemessen: 321.1060.1.8 mmol 6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -2-methyl-3-nitropyridine (0.50 g) and 9 mmol SnCl 2 • 2H 2 O (5 eq, 2.03 g) were dissolved in 20 ml Ethanol and stirred under argon atmosphere at 70 ° C overnight. The temperature was then lowered to 40 ° C and 18.36 mmol Et 3 N (10.2 eq, 2.56 ml) and 2.34 mmol of ethyl chloroformate (1.3 eq, 0.22 ml) were added. After 3 h, the suspension was filtered through kieselguhr and the residue was washed with 30 ml of ethanol. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator and the product was precipitated by addition of water. Beige solid (mp. 102-103 ° C); Yield: 0.6 g (84%); 1 H NMR [ppm]: δ = 8.99 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.46 (m, 2H), 7.13 (m, 3H ), 4.36 (s, 2H), 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H ); 13 C NMR [ppm]: δ = 162.3 (d, J = 243 Hz, 1C), 154.4, 152.0, 134.7 (d, J = 3 Hz, 1C), 132.8, 130 , 8 (d, J = 8Hz, 2C), 129.5, 119.5, 115.1 (d, J = 21Hz, 2C), 60.43, 32.8, 20.8, 14.5 ; IR [cm -1 ]: ṽ = 3284, 2980, 1689, 1509, 1442, 1250, 1061; HRMS: [C 16 H 17 N 2 O 2 FS + H] + calculated: 321.1068, Measured: 321.1060.

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}-3,4-difluorbenzamidN- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} -3,4-difluorobenzamide

Figure DE102018212006B3_0079
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5 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,40 g) wurden zusammen mit 50 mmol Eisenpulver (10 eq, 2,80 g) und 50 mmol NH4Cl (10 eq, 2,68 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt und anschließend über Kieselgur filtriert. Dem Filtrat wurden 50 ml Wasser zugesetzt und mit 2x50 ml Ethylacetat extrahiert. Der organischen Phase wurden 7,5 mmol Et3N (1,5 eq, 1,05 ml) zugesetzt und die Lösung auf 0 °C abgekühlt. 5 mmol 3,4-Difluorbenzoylchlorid (1 eq, 0,63 ml) wurden tropfenweise über 30 min zugegeben und die Mischung anschließend für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Durch Aufkonzentration der Lösung am Rotationsverdampfer und Lagerung im Kühlschrank präzipitierte das Produkt und konnte abschließend aus DCM umkristalllisiert werden. Farbloser Feststoff (Smp.: 150-151 °C). Ausbeute: 0.68 g (35%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,64 (s, 1H), 8,08 (m, 1H), 7,86 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,34 (d, 1H), 7,13 (m, 2H), 6,49 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 6,09 (s, 2H), 4,34 (s, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 167,3, 162,3 (d, J= 241 Hz, 1C), 154,6, 152,5, 150,3, 147,8, 135,2, 135,0 (d, J= 3 Hz, 1C), 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 125,4, 117,5 (d, J= 9 Hz, 1C), 117,3 (d, J= 9 Hz, 1C), 115,1 (d, J= 21 Hz, 2C), 114,1, 109,0 , 32,5; IR [cm-1]: ṽ= 3396, 3298, 3150, 1629, 1504, 1462, 1226, 750; HRMS: [C19H14N3OF3S + H]+ berechnet: 388.0737, gemessen: 388.0747.5 mmol of 6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (1.40 g) was added along with 50 mmol iron powder (10 eq, 2.80 g) and 50 mmol NH 4 Cl (10 eq , 2.68 g) in a mixture of 12 ml of ethanol and 3 ml of water. The reaction mixture was heated to reflux for one hour and then filtered through kieselguhr. To the filtrate was added 50 ml of water and extracted with 2x50 ml of ethyl acetate. To the organic phase was added 7.5 mmol Et 3 N (1.5 eq, 1.05 mL) and the solution cooled to 0 ° C. 5 mmol of 3,4-difluorobenzoyl chloride (1 eq, 0.63 ml) was added dropwise over 30 minutes and then the mixture was stirred for 1 h at room temperature. Concentration of the solution on a rotary evaporator and storage in the refrigerator precipitated the product and was finally recrystallized from DCM. Colorless solid (mp. 150-151 ° C). Yield: 0.68 g (35%); 1 H NMR [ppm]: δ = 9.64 (s, 1H), 8.08 (m, 1H), 7.86 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.63 (m, 1H ), 7.56 (m, 2H), 7.34 (d, 1H), 7.13 (m, 2H), 6.49 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.09 (s , 2H), 4.34 (s, 2H); 13 C NMR [ppm]: δ = 167.3, 162.3 (d, J = 241 Hz, 1C), 154.6, 152.5, 150.3, 147.8, 135.2, 135.0 (d, J = 3Hz, 1C), 130.8 (d, J = 8Hz, 2C), 125.4, 117.5 (d, J = 9Hz, 1C), 117.3 (d, J = 9 Hz, 1C), 115.1 (d, J = 21 Hz, 2C), 114.1, 109.0, 32.5; IR [cm -1 ]: ṽ = 3396, 3298, 3150, 1629, 1504, 1462, 1226, 750; HRMS: [C 19 H 14 N 3 OF 3 S + H] + calculated: 388.0737, Measured: 388.0747.

Ethyl-(6-{[(1,1'-biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-2-aminopyridin-3-yl)carbamatEthyl (6 - {[(1,1'-biphenyl) -4-ylmethyl] thio} -2-aminopyridine-3-yl) carbamate

Figure DE102018212006B3_0080
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2 mmol 6-{[(1,1'-Biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-3-nitropyridin-2-amin (0,68 g) wurden zusammen mit 10 mmol SnCl2•2H2O (2,26 g) in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 24 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C reduziert und 20,4 mmol Et3N (10,2 eq, 2,85 ml) sowie 2,6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,25 ml) zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht gerührt und die Suspension anschließend über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und das Produkt durch Wasserzugabe gefällt. Abschließend wurde aus DCM umkristallisiert. Beiger Feststoff (Smp.: 165-167 °C); Ausbeute: 0.3 g (38 %); 1H NMR [ppm]: δ= 8,58 (s, 1H), 7,65 (m, 2H), 7,60 (m, 2H), 7,50 (m, 5H), 7,56 (m, 1H), 6,48 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,96 (s, 2H), 4,35 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 154,9, 154,2, 152,0, 139,6, 139,5, 130,8 (2C), 129,9, 128,9 (2C), 127,5, 126,5 (2C), 126,4 (2C), 120,1, 108,6, 60,6, 58,7, 14,4; IR [cm-1]: ṽ= 3484, 3290, 3161, 1703, 1622, 1460, 1219, 1065, 747; HRMS: [C21H21N3O2S - H]- berechnet: 378,1282, gemessen: 378,1272.2 mmol of 6 - {[(1,1'-biphenyl) -4-ylmethyl] thio} -3-nitropyridin-2-amine (0.68 g) was added along with 10 mmol SnCl 2 • 2H 2 O (2.26 g) suspended in 20 ml of ethanol and stirred under argon atmosphere at 70 ° C for 24 h. The temperature was then reduced to 40 ° C and 20.4 mmol Et 3 N (10.2 eq, 2.85 ml) and 2.6 mmol of ethyl chloroformate (1.3 eq, 0.25 ml) were added. The reaction mixture was stirred overnight and the suspension was then filtered through kieselguhr. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator and the product was precipitated by addition of water. Finally, it was recrystallized from DCM. Beige solid (mp 165-167 ° C); Yield: 0.3 g (38%); 1 H NMR [ppm]: δ = 8.58 (s, 1H), 7.65 (m, 2H), 7.60 (m, 2H), 7.50 (m, 5H), 7.56 (m , 1H), 6.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.96 (s, 2H), 4.35 (s, 2H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz , 2H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 3H); 13 C NMR [ppm]: δ = 154.9, 154.2, 152.0, 139.6, 139.5, 130.8 (2C), 129.9, 128.9 (2C), 127.5 , 126.5 (2C), 126.4 (2C), 120.1, 108.6, 60.6, 58.7, 14.4; IR [cm -1 ]: ṽ = 3484, 3290, 3161, 1703, 1622, 1460, 1219, 1065, 747; HRMS: [C 21 H 21 N 3 O 2 S - H] - Calculated: 378.1282; found: 378.1272.

Ethyl-{2-amino-6-[(3,5-dimethoxybenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat Ethyl {2-amino-6 - [(3,5-dimethoxybenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate

Figure DE102018212006B3_0081
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2,5 mmol 6-[(3,5-Dimethoxybenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,80 g) wurden zusammen mit 12,5 mmol SnCl2•2H2O (5 eq, 2,82 g) in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C über Nacht gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C gesenkt und der Suspension 25,5 mmol Et3N (10,2 eq, 3,5 ml) sowie 3,25 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,31 ml) zugesetzt. Nach 4 h wurde der Reaktionsansatz über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 60 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das Produkt wurde abschließend in wenig Ethanol gelöst und durch Wasserzugabe präzipitiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 84-85 °C); Ausbeute = 0.46 g (52%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,57 (bs, 1H), 7,41 (d, J= 5,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J= 2,1 Hz, 2H), 6,44 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,34 (t, 1H), 5,94 (s, 2H), 4,22 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,70 (s, 6H), 1,24 (t, J= 7,0 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 160,2 (2C), 154,4, 152,8, 150,4, 140,9, 131,8, 115,2, 109,4, 106,7 (2C), 98,7, 60,3, 55,1 (2C), 33,7, 14,5; IR: ṽ= 3475, 3285, 3163, 2935, 1685, 1598, 1520, 1460, 1202, 1148, 1057 cm-1; HRMS: [C17H21N3O4S + H]+ berechnet: 364.1326, gemessen: 364.1317.2.5 mmol 6 - [(3,5-dimethoxybenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (0.80 g) was added along with 12.5 mmol SnCl 2 • 2H 2 O (5 eq, 2.82 g g) suspended in 20 ml of ethanol and stirred under argon atmosphere at 70 ° C overnight. The temperature was then lowered to 40 ° C and 25.5 mmol of Et 3 N (10.2 eq, 3.5 ml) and 3.25 mmol of ethyl chloroformate (1.3 eq, 0.31 ml) were added to the suspension. After 4 h, the reaction mixture was filtered through kieselguhr and the residue was washed with 60 ml of ethanol. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator and the residue was purified by flash chromatography (mobile phase: ethyl acetate / n-hexane). The product was finally dissolved in a little ethanol and precipitated by addition of water. Colorless solid (mp. 84-85 ° C); Yield = 0.46 g (52%); 1 H NMR [ppm]: δ = 8.57 (bs, 1H), 7.41 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 6.44 (d, J = 8.0Hz, 1H), 6.34 (t, 1H), 5.94 (s, 2H), 4.22 (s, 2H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.70 (s, 6H), 1.24 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13 C NMR [ppm]: δ = 160.2 (2C), 154.4, 152.8, 150.4, 140.9, 131.8, 115.2, 109.4, 106.7 (2C) , 98.7, 60.3, 55.1 (2C), 33.7, 14.5; IR: ṽ = 3475, 3285, 3163, 2935, 1685, 1598, 1520, 1460, 1202, 1148, 1057 cm -1 ; HRMS: [C 17 H 21 N 3 O 4 S + H] + calculated: 364.1326, Measured: 364.1317.

Ethyl-{2-amino-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-3-yl}carbamatEthyl {2-amino-6 - [(pyridin-2-ylmethyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate

Figure DE102018212006B3_0082
Figure DE102018212006B3_0082

1 mmol 3-Nitro-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-2-amin (0,26 g) wurden zusammen mit 4,6 mmol SnCl2•2H2O (4,6 eq, 1,04 g) in 10 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 22 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C abgesenkt und 10,2 mmol Et3N (10,2 eq, 1,4 ml) sowie 1,3 mmol Chlorameisensäureethylester (0,12 ml) zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht gerührt und anschließend über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit Wasser versetzt und mit DCM extrahiert. Die organische Phase wurde evaporiert und der Rückstand mittels Flashchromatographie aufgereinigt. Brauner Feststoff (Smp.: 129-131 °C); Ausbeute: 0.09 g (30%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,57 (s, 1H), 8,49 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,50 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,41 (d, J= 6,0 Hz, 1H), 7,25 (m, 1H), 6,49 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,94 (s, 2H), 4,39 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 158,2, 154,5, 152,8, 150,3, 149,0, 136,7, 131,9, 130,1, 123,1, 122,1, 115,2, 109,2, 60,4, 45,6, 35,7, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3361, 3227, 2979, 2929, 1721, 1524, 1456, 1245, 1221, 1071; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 305.1067, gemessen: 305.1061.1 mmol of 3-nitro-6 - [(pyridin-2-ylmethyl) thio] pyridin-2-amine (0.26 g) was added together with 4.6 mmol SnCl 2 • 2H 2 O (4.6 eq, 1, 04 g) in 10 ml of ethanol and stirred under argon atmosphere at 70 ° C for 22 h. Subsequently, the temperature was lowered to 40 ° C and 10.2 mmol Et 3 N (10.2 eq, 1.4 ml) and 1.3 mmol of ethyl chloroformate (0.12 ml) was added. The reaction mixture was stirred overnight and then filtered through kieselguhr. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator, the residue was treated with water and extracted with DCM. The organic phase was evaporated and the residue was purified by flash chromatography. Brown solid (mp. 129-131 ° C); Yield: 0.09 g (30%); 1 H NMR [ppm]: δ = 8.57 (s, 1H), 8.49 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.50 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.25 (m, 1H), 6.49 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.94 (s, 2H), 4.39 (s, 2H), 4.12 (q, J = 7.1Hz, 2H), 1.24 (t, J = 7.1Hz, 3H); 13 C NMR [ppm]: δ = 158.2, 154.5, 152.8, 150.3, 149.0, 136.7, 131.9, 130.1, 123.1, 122.1, 115 , 2, 109, 2, 60, 4, 45, 6, 35, 7, 14, 5; IR [cm -1 ]: ṽ = 3361, 3227, 2979, 2929, 1721, 1524, 1456, 1245, 1221, 1071; HRMS: [C 14 H 16 N 4 O 2 S + H] + calculated: 305.1067, Measured: 305.1061.

Ethyl-(2-amino-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-3-yl)carbamatEthyl (2-amino-6 - {[2- (piperidin-1-yl) ethyl] thio} pyridin-3-yl) carbamate

Figure DE102018212006B3_0083
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1 mmol 3-Nitro-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-2-amin (0,28 g) wurden zusammen mit 4,6 mmol SnCl2•2H2O (4,6 eq, 1,02 g) in 10 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 25 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C gesenkt und 10,2 mmol Et3N (10,2 eq, 1,4 ml) sowie 2,6 mmol Chlorameisensäureethylester (2,6 eq, 0,24 ml) zugesetzt. Die Suspension wurde für weitere 3 h gerührt, anschließend über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 60 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt und mit DCM extrahiert. Die organische Phase wurde abschließend evaporiert. Brauner Feststoff (Smp.: 136-137 °C); Ausbeute: 0.1 g (32%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,55 (s, 1H), 7,40 (d, J= 6.1 Hz, 1H), 6,44 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,82 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,14 (q, J= 8,8 Hz, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,38 (m, 4H), 1,51 (m, 4H), 1,39 (m, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 154,5, 152,8, 151,1, 131,9, 114,9, 109,3, 60,3, 58,2, 53,8 (2C), 26,9, 25,5 (2C), 24,0, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3341, 3212, 2934, 1713, 1530, 1452, 1214, 1065; HRMS-ESI m/z [C15H24N4O2S +H]+ berechnet: 325.1693, gemessen: 325.1698.1 mmol of 3-nitro-6 - {[2- (piperidin-1-yl) ethyl] thio} pyridin-2-amine (0.28 g) was added together with 4.6 mmol of SnCl 2 • 2H 2 O (4, 6 eq, 1.02 g) in 10 ml of ethanol and stirred under argon atmosphere at 70 ° C for 25 h. The temperature was then lowered to 40 ° C and 10.2 mmol Et 3 N (10.2 eq, 1.4 ml) and 2.6 mmol of ethyl chloroformate (2.6 eq, 0.24 ml) was added. The suspension was stirred for a further 3 h, then filtered through kieselguhr and the residue was washed with 60 ml of ethanol. The filtrate was concentrated on a rotary evaporator, the residue was combined with 50 ml of water and extracted with DCM. The organic phase was finally evaporated. Brown solid (mp. 136-137 ° C); Yield: 0.1 g (32%); 1 H NMR [ppm]: δ = 8.55 (s, 1H), 7.40 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5, 82 (s, 2H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.14 (q, J = 8.8 Hz, 2H), 2.50 (m, 2H), 2, 38 (m, 4H), 1.51 (m, 4H), 1.39 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.1 Hz, 3H); 13 C NMR [ppm]: δ = 154.5, 152.8, 151.1, 131.9, 114.9, 109.3, 60.3, 58.2, 53.8 (2C), 26, 9, 25.5 (2C), 24.0, 14.5; IR [cm -1 ]: ṽ = 3341, 3212, 2934, 1713, 1530, 1452, 1214, 1065; HRMS ESI m / z [C 15 H 24 N 4 O 2 S + H] + calculated: 325.1693, Measured: 325.1698.

N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorpheny)acetamidN- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} -2- (3,5-difluorpheny) acetamide

Figure DE102018212006B3_0084
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1,5 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,42 g) wurden zusammen mit 15 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,84 g) und 15 mmol NH4Cl (10 eq, 0,81 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt, anschließend über ein Papierfilter filtriert und der Rückstand mit 75 ml Ethylacetat gewaschen. Dem Filtrat wurden 1,5 mmol Et3N (1 eq, 0,21 ml) sowie 2 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid zugesetzt und für 1 h bei 40 °C gerührt. Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Abschließend wurde aus Ethanol umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp: 166-167 °C). Ausbeute: 0.08 g (21,4%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,29 (s, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,40 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 7,12 (m, 5H), 6,44 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 6,00 (s, 2H), 4,31 (s, 2H), 3,71 (s, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,5, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 240 Hz, 2C), 162,3, 159,9, 153,3, 151,4, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 135,0 (d, J= 3 Hz, 1C), 133,2, 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 115,1 (d, J= 21 Hz, 2C), 114,6, 112,7 (dd, J= 7 Hz, J= 18 Hz, 2C), 109,1, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,8, 32,5; IR [cm-1]: ṽ= 3404, 3179, 1644, 1505, 1454, 1223, 1119, 839; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 404,1039, gemessen: 404,1038.1.5 mmol of 6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (0.42 g) was added along with 15 mmol iron powder (10 eq, 0.84 g) and 15 mmol NH 4 Cl ( 10 eq, 0.81 g) in a mixture of 12 ml of ethanol and 3 ml of water. The reaction mixture was heated to reflux for one hour, then filtered through a paper filter and the residue washed with 75 ml of ethyl acetate. 1.5 mmol of Et 3 N (1 eq, 0.21 ml) and 2 mmol of 2- (3,5-difluorophenyl) acetyl chloride were added to the filtrate and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 h. The solution was then concentrated on a rotary evaporator and the residue was purified by flash chromatography (mobile phase: ethyl acetate / n-hexane). Finally, it was recrystallized from ethanol. Colorless solid (mp: 166-167 ° C). Yield: 0.08 g (21.4%); 1 H NMR [ppm]: δ = 9.29 (s, 1H), 7.46 (m, 2H), 7.40 (d, J = 7.96 Hz, 1H), 7.12 (m, 5H ), 6.44 (d, J = 7.96 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 4.31 (s, 2H), 3.71 (s, 2H); 13 C NMR [ppm]: δ = 168.5, 163.4 (dd, J = 13 Hz, J = 240 Hz, 2C), 162.3, 159.9, 153.3, 151.4, 140, 4 (t, J = 10Hz, 1C), 135.0 (d, J = 3Hz, 1C), 133.2, 130.8 (d, J = 8Hz, 2C), 115.1 (d, J = 21 Hz, 2C), 114.6, 112.7 (dd, J = 7 Hz, J = 18 Hz, 2C), 109.1, 102.2 (t, J = 26 Hz, 1C), 41 , 8, 32.5; IR [cm -1 ]: ṽ = 3404, 3179, 1644, 1505, 1454, 1223, 1119, 839; HRMS: [C 14 H 16 N 4 O 2 S + H] + calculated: 404.1039, Measured: 404.1038.

N-[6-(Benzylthio)-2-(methylamino)pyridin-3-yl]-2-(3,5-difluorphenyl)acetamidN- [6- (benzylthio) -2- (methylamino) pyridin-3-yl] -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide

Figure DE102018212006B3_0085
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2,8 mmol 6-(Benzylthio)-N-methyl-3-nitropyridin-2-amin (0,77 g) wurden zusammen mit 28 mmol Eisenpulver (10 eq, 1,57 g) und 28 mmol NH4Cl (10 eq, 1,50 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 2 h zum Rückfluss erhitzt, die Suspension anschließend über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 2x50 ml Ethylacetat gewaschen. 50 ml Wasser wurden zugesetzt und die Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde mit 2x50 ml Ethylacetat extrahiert und den vereinten organischen Phasen wurden 5,6 mmol HATU (2 eq, 2,10 g) sowie 2,8 mmol 2,6-Dichlorphenylessigsäure (1 eq, 0,60 g) zugesetzt und die Mischung bei 40 °C über Nacht gerührt. Die Suspension wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das Rohprodukt wurde in wenig Ethanol gelöst und durch Wasserzugabe präzipitiert. Lavendelfarbener Feststoff (Smp.: 201-202 °C); Ausbeute: 0.08 g (8%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,25 (s, 1H), 7,40 (m, 2H), 7,30 (m, 4H), 7,13 (m, 3H), 6,41 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 6,23 (d, J= 4,6 Hz, 2H), 4,38 (s, 2H), 3,70 (s, 2H), 2,89 (d, J= 4,6 Hz, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,7, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 244 Hz, 2C), 153,2, 151,6, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 138,9, 133,2, 128,6 (2C), 128,3 (2C), 126,8, 115,1, 112,7 (dd, J= 6 Hz, J= 17 Hz, 2C), 107,9, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,8, 33,3, 27,9; IR [cm-1]: ṽ= 3442, 3404, 3269, 1652, 1591, 1496, 1389, 1230, 1119, 991, 696; HRMS: [C14H16N4O2S - H]- berechnet: 398.1144, gemessen: 398.1157.2.8 mmol of 6- (benzylthio) -N-methyl-3-nitropyridin-2-amine (0.77 g) was added along with 28 mmol iron powder (10 eq, 1.57 g) and 28 mmol NH 4 Cl (10 eq, 1.50 g) in a mixture of 12 ml of ethanol and 3 ml of water. The reaction mixture was heated to reflux for 2 h, then the suspension was filtered through kieselguhr and the residue was washed with 2 × 50 ml of ethyl acetate. 50 ml of water were added and the phases separated. The aqueous phase was extracted with 2x50 ml of ethyl acetate and to the combined organic phases were added 5.6 mmol HATU (2 eq, 2.10 g) and 2.8 mmol 2,6-dichlorophenylacetic acid (1 eq, 0.60 g) and the mixture was stirred at 40 ° C overnight. The suspension was concentrated on a rotary evaporator and purified by flash chromatography (mobile phase: ethyl acetate / n-hexane). The crude product was dissolved in a little ethanol and precipitated by addition of water. Lavender solid (m.p. 201-202 ° C); Yield: 0.08 g (8%); 1 H NMR [ppm]: δ = 9.25 (s, 1H), 7.40 (m, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.13 (m, 3H), 6.41 (i.e. , J = 7.8 Hz, 1H), 6.23 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 4.38 (s, 2H), 3.70 (s, 2H), 2.89 (i.e. , J = 4.6 Hz, 2H); 13 C NMR [ppm]: δ = 168.7, 163.4 (dd, J = 13 Hz, J = 244 Hz, 2C), 153.2, 151.6, 140.4 (t, J = 10 Hz , 1C), 138.9, 133.2, 128.6 (2C), 128.3 (2C), 126.8, 115.1, 112.7 (dd, J = 6 Hz, J = 17 Hz, 2C), 107.9, 102.2 (t, J = 26 Hz, 1C), 41.8, 33.3, 27.9; IR [cm -1 ]: ṽ = 3442, 3404, 3269, 1652, 1591, 1496, 1389, 1230, 1119, 991, 696; HRMS: [C 14 H 16 N 4 O 2 S - H] - Calculated: 398.1144; found: 398.1157.

N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)-acetamid N- (2-amino-6 - {[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl) methyl] thio} pyridin-3-yl) -2- (3,5-difluorophenyl) -acetamide

2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid2- (3,5-difluorophenyl) acetyl chloride

Figure DE102018212006B3_0086
Figure DE102018212006B3_0086

10 mmol 3,5-Difluorphenylessigsäure (1,72 g) wurden in 15 ml trockenem DCM gelöst und unter Stickstoffatmosphäre 11 mmol Oxalylchlorid (1,1 eq, 0,93 ml) hinzugefügt. Dem Reaktionsansatz wurden vorsichtig 4 Tropfen trockenes DMF zugesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde ohne weitere Aufreinigung für weitere Reaktionen eingesetzt.10 mmol of 3,5-difluorophenylacetic acid (1.72 g) was dissolved in 15 ml of dry DCM and 11 mmol of oxalyl chloride (1.1 eq, 0.93 ml) was added under a nitrogen atmosphere. To the reaction mixture was carefully added 4 drops of dry DMF and stirred at room temperature overnight. The solution was used without further purification for further reactions.

N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamidN- (2-amino-6 - {[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl) methyl] thio} pyridin-3-yl) -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide

Figure DE102018212006B3_0087
Figure DE102018212006B3_0087

0,8 mmol 3-Nitro-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-2-amin (0,22 g) wurden zusammen mit 8 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,45 g) und NH4Cl (10 eq, 0,43 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 3 h zum Rückfluss erhitzt, die Suspension anschließend über ein Papierfilter filtriert und der Rückstand mit 50 ml Ethylacetat gewaschen. Dem Filtrat wurden 1,5 mmol Et3N (1,9 eq, 0,17 ml) und 1,2 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid aus (a) zugesetzt. Die Lösung wurde für 1,5 h auf 40 °C erwärmt und anschließend im Rotationsverdampfer eingeengt. Das Produkt wurde abschließend mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Farbloser Feststoff (Smp.: 136-137 °C). Ausbeute: 0.21 g (54%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,27 (s, 1H), 7,38 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,44 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 5,91 (s, 2H), 3,87 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,40 (m, 3H), 3,21 (m, 2H), 1,78 (m, 7H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,5, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 244 Hz, 2C), 153,3, 152,1, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 133,3, 114,3, 112,7 (dd, J= 7 Hz, J= 19 Hz, 2C), 109,1, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 76,4, 67,5, 41,8, 34,9, 30,6, 25,4, 22,7; IR [cm-1]: ṽ= 3305, 3180, 2940, 1645, 1463, 1114, 671; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 394,1395, gemessen: 394,1390. 0.8 mmol of 3-nitro-6 - {[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl) -methyl] -thio} -pyridine-2-amine (0.22 g) was added together with 8 mmol iron powder (10 eq, 0, 45 g) and NH 4 Cl (10 eq, 0.43 g) suspended in a mixture of 12 ml of ethanol and 3 ml of water. The reaction mixture was heated to reflux for 3 h, then the suspension was filtered through a paper filter and the residue was washed with 50 ml of ethyl acetate. To the filtrate was added 1.5 mmol of Et 3 N (1.9 eq, 0.17 ml) and 1.2 mmol of 2- (3,5-difluorophenyl) acetyl chloride from (a). The solution was heated to 40 ° C for 1.5 h and then concentrated in a rotary evaporator. The product was finally purified by flash chromatography (mobile phase: ethyl acetate / n-hexane). Colorless solid (mp. 136-137 ° C). Yield: 0.21 g (54%); 1 H NMR [ppm]: δ = 9.27 (s, 1H), 7.38 (d, J = 7.96 Hz, 1H), 7.14 (m, 3H), 6.44 (d, J = 7.96 Hz, 1H), 5.91 (s, 2H), 3.87 (m, 1H), 3.70 (s, 2H), 3.40 (m, 3H), 3.21 (m , 2H), 1.78 (m, 7H); 13 C NMR [ppm]: δ = 168.5, 163.4 (dd, J = 13 Hz, J = 244 Hz, 2C), 153.3, 152.1, 140.4 (t, J = 10 Hz , 1C), 133.3, 114.3, 112.7 (dd, J = 7 Hz, J = 19 Hz, 2C), 109.1, 102.2 (t, J = 26 Hz, 1C), 76 , 4, 67.5, 41.8, 34.9, 30.6, 25.4, 22.7; IR [cm -1 ]: ṽ = 3305, 3180, 2940, 1645, 1463, 1114, 671; HRMS: [C 14 H 16 N 4 O 2 S + H] + calculated: 394.1395, Measured: 394.1390.

N-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-2-morpholinopyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamidN- (6 - {[(1,3-dioxolan-2-yl) methyl] thio} -2-morpholinopyridine-3-yl) -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide

Figure DE102018212006B3_0088
Figure DE102018212006B3_0088

2 mmol 4-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-3-nitropyridin-2-yl)morpholin (0,65 g) wurde in 15 ml THF suspendiert und zwei Spatelspitzen Raney-Nickel zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde mittels Ballon unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 2 mmol Et3N (1 eq, 0,28 ml) sowie 3 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid aus 1.2.23 (a) zugesetzt und für weitere 4 h gerührt. Die Suspension wurde danach über Kieselgur filtriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Abschließend wurde das Produkt aus Ethanol umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 104 - 105 °C). Ausbeute: 0.24 g (27%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,34 (s, 1H), 7,73 (d, J= 8,20 Hz, 1H), 7,17 (m, 3H), 6,92 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 5,08 (t, J= 4,52 Hz, 1H), 3,94 (m, 2H), 3,84 (m, 2H), 3,75 (s, 2H), 3,44 (m, 4H), 3,35 (m, 4H), 3,05 (m, 4H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,2, 163,5 (dd, J= 13 Hz, J= 243 Hz, 2C), 154,2, 150,5, 140,1 (t, J= 10 Hz, 1C), 134,5, 120,8, 115,0, 112,5 (dd, J= 7 Hz, J= 17 Hz, 2C), 102,5, 102,3, 65,8 (2C), 64,6 (2C), 48,7 (2C), 42,2, 32,5; IR [cm-1]: ṽ= 3265, 1657, 1516, 1463, 1118, 958; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 452,1450, gemessen: 452,1452.2 mmol of 4- (6 - {[(1,3-dioxolan-2-yl) methyl] thio} -3-nitropyridin-2-yl) morpholine (0.65 g) was suspended in 15 ml of THF and two Raney spatula tips Nickel added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere using a balloon and stirred for 2 h at room temperature. Subsequently, 2 mmol of Et 3 N (1 eq, 0.28 ml) and 3 mmol of 2- (3,5-difluorophenyl) acetyl chloride from 1.2.23 (a) were added and the mixture was stirred for a further 4 h. The suspension was then filtered through kieselguhr, the filtrate was concentrated on a rotary evaporator and the residue was purified by flash chromatography (mobile phase: ethyl acetate / n-hexane). Finally, the product was recrystallized from ethanol. Colorless solid (mp. 104-105 ° C). Yield: 0.24 g (27%); 1 H NMR [ppm]: δ = 9.34 (s, 1H), 7.73 (d, J = 8.20 Hz, 1H), 7.17 (m, 3H), 6.92 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.08 (t, J = 4.52 Hz, 1H), 3.94 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.75 (s, 2H ), 3.44 (m, 4H), 3.35 (m, 4H), 3.05 (m, 4H); 13 C NMR [ppm]: δ = 168.2, 163.5 (dd, J = 13 Hz, J = 243 Hz, 2C), 154.2, 150.5, 140.1 (t, J = 10 Hz , 1C), 134.5, 120.8, 115, 0, 112.5 (dd, J = 7Hz, J = 17Hz, 2C), 102.5, 102.3, 65.8 (2C), 64.6 (2C), 48.7 (2C), 42.2, 32.5; IR [cm -1 ]: ṽ = 3265, 1657, 1516, 1463, 1118, 958; HRMS: [C 14 H 16 N 4 O 2 S + H] + calculated: 452.1450, Measured: 452.1452.

N-{2-Amino-6-[(cyclobutylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetamidN- {2-amino-6 - [(cyclobutylmethyl) thio] pyridin-3-yl} -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide

Figure DE102018212006B3_0089
Figure DE102018212006B3_0089

2 mmol 6-[(Cyclobutylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,48 g) wurden in 15 ml THF suspendiert und 2 Spatelspitzen Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mittels Ballon unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 75 ml Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde auf 0 °C abgekühlt und 2 mml Et3N (1 eq, 0,28 ml) sowie 2 mmol 2-(3,5-Difluophenyl)acetylchlorid tropfenweise zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Lösung am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, worauf das Produkt präzipitierte. Abschließend wurde aus DCM umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 199 -200 °C). Ausbeute: 0.47 g (65%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,99 (s, 1H), 7,81 (d, J= 8,00 Hz, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,71 (d, J= 8,12 Hz, 1H), 3,82 (s, 2H), 3,22 (d, J= 7,56 Hz, 2H), 2,07 (m, 2H), 1,85 (s, 4H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,9, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 245 Hz, 2C), 151,5, 140,1 (t, J= 10 Hz, 1C), 134,6, 112,8 (dd, J= 7 Hz, J= 17 Hz, 2C), 110,8, 102,3 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,7, 37,3, 34,2, 27,1 (2C), 17,4; IR [cm-1]: ṽ= 3071, 1650, 1524, 1251, 1115, 991, 838; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 364,1290, gemessen: 364,1287.2 mmol of 6 - [(cyclobutylmethyl) thio] -3-nitropyridin-2-amine (0.48 g) were suspended in 15 ml of THF and 2 Raney nickel spatula tips added. The reaction batch was placed under a hydrogen atmosphere using a balloon and stirred for 2 h at room temperature. The suspension was then filtered through kieselguhr and the residue was washed with 75 ml of ethyl acetate. The filtrate was cooled to 0 ° C and 2 mL of Et 3 N (1 eq, 0.28 mL) and 2 mmol of 2- (3,5-difluorophenyl) acetyl chloride added dropwise. After 2 hours, the solution was concentrated on a rotary evaporator, whereupon the product precipitated. Finally, it was recrystallized from DCM. Colorless solid (mp. 199-200 ° C). Yield: 0.47 g (65%); 1 H NMR [ppm]: δ = 9.99 (s, 1H), 7.81 (d, J = 8.00 Hz, 1H), 7.14 (m, 3H), 6.71 (d, J = 8.12 Hz, 1H), 3.82 (s, 2H), 3.22 (d, J = 7.56 Hz, 2H), 2.07 (m, 2H), 1.85 (s, 4H ); 13 C NMR [ppm]: δ = 168.9, 163.4 (dd, J = 13 Hz, J = 245 Hz, 2C), 151.5, 140.1 (t, J = 10 Hz, 1C), 134.6, 112.8 (dd, J = 7 Hz, J = 17 Hz, 2C), 110.8, 102.3 (t, J = 26 Hz, 1C), 41.7, 37.3, 34 , 2, 27, 1 (2C), 17.4; IR [cm -1 ]: ṽ = 3071, 1650, 1524, 1251, 1115, 991, 838; HRMS: [C 14 H 16 N 4 O 2 S + H] + calculated: 364.1290, Measured: 364.1287.

In vitro UntersuchungenIn vitro investigations

eingesetzte Substanzenused substances

Die in den in vitro Untersuchungen eingesetzten Substanzen sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 in den in vitro Untersuchungen eingesetzten Substanzen Nummer Struktur Name Vergleichs beispiel 1

Figure DE102018212006B3_0090
Ethyl-2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)-amino]-3-pyridincarbamat-Maleat (Flupirtin-Maleat) 1
Figure DE102018212006B3_0091
 Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}carbamat 2
Figure DE102018212006B3_0092
 Ethyl-(2-amino-6-{[4-(trifluormethyl)-benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat 3
Figure DE102018212006B3_0093
 Ethyl-{2-amino-6-[(3,4-difluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 4
Figure DE102018212006B3_0094
 Ethyl-{2-amino-5-brom-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 5
Figure DE102018212006B3_0095
 Ethyl-(2-amino-6-{[4-(pentafluor-λ6-sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat 6
Figure DE102018212006B3_0096
 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid 7
Figure DE102018212006B3_0097
 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}pivalinsäureamid 8
Figure DE102018212006B3_0098
 N-{2-Amino-6-[(cyclohexylmethyl)-thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid 9
Figure DE102018212006B3_0099
 N-{6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl}-2-(3,5-dimethoxyphenyl)acetamid 10
Figure DE102018212006B3_0100
 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-N-(6-(isobutylthio)-2-[pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]acetamid 11
Figure DE102018212006B3_0101
 3-(3,5-Difluorphenyl)-N-(6-[isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propionsäureamid 12
Figure DE102018212006B3_0102
 N-{2-Amino-6-[(cyclopropylmethyl)-thio]pyridin-3-yl}-3-(3,5-difluorphenyl)propionsäureamid 13
Figure DE102018212006B3_0103
 Ethyl-{2-amino-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 14
Figure DE102018212006B3_0104
 Ethyl-(2-amino-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat 15
Figure DE102018212006B3_0105
 Ethyl-[2-amino-6-(benzylthio)pyridin-3-yl]carbamat (6b) 16
Figure DE102018212006B3_0106
 Ethyl-{2-amino-6-[(3,5-dimethoxybenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat 17
Figure DE102018212006B3_0107
 Ethyl-(6-{[(1 ,1'-biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-2-aminopyridin-3-yl)carbamat 18
Figure DE102018212006B3_0108
 Ethyl-{6-[(4-fluorbenzyl)thio]-2-methylpyridin-3-yl)carbamat 19
Figure DE102018212006B3_0109
 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}-3,4-difluorbenzamid 20
Figure DE102018212006B3_0110
 N-[6-(Benzylthio)-2-(methylamino)pyridin-3-yl]-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid 21
Figure DE102018212006B3_0111
 Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]-5-methylphenyl}carbamat 22
Figure DE102018212006B3_0112
 N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetam id 23
Figure DE102018212006B3_0113
 N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid 24
Figure DE102018212006B3_0114
 N-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-2-morpholinopyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid 25
Figure DE102018212006B3_0115
 N-{2-Amino-6-[(cyclobutylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetam id The Substances used in the in vitro studies are shown in Table 2. Table 2 in the in vitro tests substances used number structure Surname Comparative Example 1
Figure DE102018212006B3_0090
 Ethyl 2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) amino] -3-pyridinecarbamate maleate (flupirtine maleate) 1
Figure DE102018212006B3_0091
 Ethyl {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate 2
Figure DE102018212006B3_0092
 Ethyl (2-amino-6 - {[4- (trifluoromethyl) benzyl] thio} pyridin-3-yl) carbamate 3
Figure DE102018212006B3_0093
 Ethyl {2-amino-6 - [(3,4-difluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate 4
Figure DE102018212006B3_0094
 Ethyl {2-amino-5-bromo-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate 5
Figure DE102018212006B3_0095
 Ethyl (2-amino-6 - {[4- (pentafluoro-λ 6 -sulfanyl) benzyl] thio} pyridin-3-yl) carbamate 6
Figure DE102018212006B3_0096
 N- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} butyric acid 7
Figure DE102018212006B3_0097
 N- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} pivalinsäureamid 8th
Figure DE102018212006B3_0098
 N- {2-amino-6 - [(cyclohexylmethyl) thio] pyridin-3-yl} butyric acid 9
Figure DE102018212006B3_0099
 N- {6 - [(Cyclohexylmethyl) thio] -2- (pyrrolidin-1-yl) pyridin-3-yl} -2- (3,5-dimethoxyphenyl) acetamide 10
Figure DE102018212006B3_0100
 2- (3,5-dimethoxyphenyl) -N- (6- (isobutylthio) -2- [pyrrolidin-1-yl) pyridin-3-yl] acetamide 11
Figure DE102018212006B3_0101
 3- (3,5-difluorophenyl) -N- (6- [isobutylthio) -2- (pyrrolidin-1-yl) pyridin-3-yl] propionamide 12
Figure DE102018212006B3_0102
 propionamide -3- (3,5-difluorophenyl) - N- {[(cyclopropylmethyl) thio] pyridin-3-yl 2-amino-6} 13
Figure DE102018212006B3_0103
 Ethyl {2-amino-6 - [(pyridin-2-ylmethyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate 14
Figure DE102018212006B3_0104
 Ethyl (2-amino-6 - {[2- (piperidin-1-yl) ethyl] thio} pyridin-3-yl) carbamate 15
Figure DE102018212006B3_0105
 Ethyl [2-amino-6- (benzylthio) pyridin-3-yl] carbamate (6b) 16
Figure DE102018212006B3_0106
 Ethyl {2-amino-6 - [(3,5-dimethoxybenzyl) thio] pyridin-3-yl} carbamate 17
Figure DE102018212006B3_0107
 Ethyl (6 - {[(1,1'-biphenyl) -4-ylmethyl] thio} -2-aminopyridin-3-yl) carbamate 18
Figure DE102018212006B3_0108
 Ethyl {6 - carbamate [(4-fluorobenzyl) thio] -2-methyl-pyridin-3-yl) 19
Figure DE102018212006B3_0109
 N- {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} -3,4-difluorobenzamide 20
Figure DE102018212006B3_0110
 N- [6- (benzylthio) -2- (methylamino) pyridin-3-yl] -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide 21
Figure DE102018212006B3_0111
 Ethyl {2-amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] -5-methylphenyl} carbamate 22
Figure DE102018212006B3_0112
 N- {2-Amino-6 - [(4-fluorobenzyl) thio] pyridin-3-yl} -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide id 23
Figure DE102018212006B3_0113
 N- (2-amino-6 - {[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl) methyl] thio} pyridin-3-yl) -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide 24
Figure DE102018212006B3_0114
 N- (6 - {[(1,3-dioxolan-2-yl) methyl] thio} -2-morpholinopyridine-3-yl) -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide 25
Figure DE102018212006B3_0115
 N- {2-Amino-6 - [(cyclobutylmethyl) thio] pyridin-3-yl} -2- (3,5-difluorophenyl) acetamide id

Kaliumkanal-AssayPotassium channel assay

Heute ist es die gängige Meinung, dass die analgetische Wirkung von Flupirtin durch seine Öffnung der heterodimeren 7.2/3-Kaliumkanäle im ZNS zustande kommt. Deswegen wurde eine In-Vitro-Screening-Methode etabliert, um die Öffnung dieses Kanals in den mit humanen Kaliumkanal-Kv 7.2/3 transfektierten Zellen durch Testsubstanzen zu evaluieren.[40] Das Prinzip des Assays beruht darauf, dass HEK 293 Zellen, welche Kv 7.2/3 (spannungsabhängige Kaliumkanäle 7.2/3) exprimieren, mit einem Thallium-sensitiven Farbstoff beladen werden, der durch zellinterne Esterasen zum aktiven Thallium-komplexierenden Agens gespalten wird. Dieser bildet mit Thallium-Ionen, welche durch geöffnete Kv 7.2/3 einströmen, fluoreszierende Komplexe. Die Intensität des Thallium-Signals ist proportional zur Anzahl der geöffneten Kv 7.2/3-Kanäle. Da es sich bei den Test-Substanzen um potentielle Kv 7.2/3-Öffner handelt, ist der Assay geeignet, um die Kaliumkanalaktivität der Substanzen zu ermitteln.Today, it is widely believed that the analgesic effect of flupirtine is due to its opening of the 7.2 / 3 potassium channel in the CNS. That's why an in vitro screening Method to evaluate the opening of this channel in the human potassium channel K v 7.2 / 3 transfected cells by test substances. [40] The principle of the assay is based on the fact that HEK 293 cells expressing K v 7.2 / 3 (voltage-dependent potassium channels 7.2 / 3) are loaded with a thallium-sensitive dye, which is cleaved by the cell-internal esterases to the active thallium-complexing agent. This forms fluorescent complexes with thallium ions, which flow through opened K v 7.2 / 3. The intensity of the thallium signal is proportional to the number of open K v 7.2 / 3 channels. Since the test substances are potential K v 7.2 / 3 openers, the assay is suitable for determining the potassium channel activity of the substances.

Zur Charakterisierung dieser Eigenschaft wird die EC50 und Emax einer Test-Substanz bestimmt. Die halbmaximale Effektkonzentration (EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt des im folgend beschriebenen Assays zu beobachten ist, wenn die logarithmierte Konzentration einer Substanz gegen die zugehörigen korrigierten ΔF/F-Werte geplottet wird. Damit wird demnach die Potenz einer Verbindung charakterisiert. Die intrinsische Aktivität einer Test-Verbindung wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich um die maximale Antwort, bezogen auf den vorliegenden Assay, der Plateaueffekt, welche durch die entsprechende Test-Substanz möglich ist. Hierzu wurde Emax des als Referenz verwendeten Flupirtinmaleats auf 100 % festgelegt und die maximalen Antworten der Test-Substanzen relativ auf diesen Wert bezogen.To characterize this property, the EC 50 and Emax of a test substance are determined. The half-maximal effect concentration (EC 50 ) is the concentration of a substance at which the half-maximal effect of the assay described below is observed when the logarithmic concentration of a substance is plotted against the associated corrected ΔF / F values. Thus, the power of a connection is characterized. The intrinsic activity of a test compound is described by its E max value. This is the maximum response, based on the present assay, the plateau effect, which is possible by the corresponding test substance. For this, Emax of the flupirtine maleate used as a reference was set to 100% and the maximum responses of the test substances relative to this value.

Für den zellbasierten Assay wurden HEK 293-Zellen (human embryonic kidney cells, SB-HEK-Kv7.2/7.3, SB Drug Discovery), welche Kv 7.2/3 exprimieren, verwendet. Diese adhärenten Zellen wurden in Zellkulturflaschen (z. B. TC-Flasche T75, Standard, #83.3911, Sarstedt) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit MEM (Minimum Essential Medium, #10370047, Thermo Fisher), welches 10 % FBS (fetales Kälberserum, F7524, Sigma Aldrich, hitzeinaktiviert), 2 mM L-Glutamin (G7513, Sigma Aldrich), 4 µg/ml Blasticidin S HCl (#203350-25, VWR), 1 % Penicillin-Streptomycin-Mix (#15070063, Thermo Fisher) und 0,78 mg/ml G418-sulfat (CP11.2, Carl Roth) beinhaltet, kultiviert. Am Vortag des Experiments wurden Zellen, die ungefähr 80 % Konfluenz aufwiesen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (z. B. L1825, Biochrom) gewaschen, mithilfe von TrypLE™ Express (1x) (#12604013, Thermo Fisher) vom Zellkulturflaschenboden abgelöst (2 min bei 37 °C), dann mit MEM suspendiert, anschließend bei 1000 rpm 2 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme erneut in MEM resuspendiert. Die Zellzahl der Suspension wurde mit dem automatischen Zellzählmessgerät EVE™ (NanoEnTEK) bestimmt. Daraufhin wurden 60 000 Zellen/Well/100 µL in 96 Well Vision Plates™ (sterile schwarze TC-behandelte 96 Well Mikrotiterplatten mit optischem Boden, 4ti-0221, 4titude) ausgesät und 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.For the cell-based assay, HEK 293 cells (human embryonic kidney cells, SB-HEK-Kv7.2 / 7.3, SB Drug Discovery) expressing K v 7.2 / 3 were used. These adherent cells were incubated in cell culture flasks (e.g., T75 TC standard, # 83.3911, Sarstedt) in incubator at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% humidity with MEM (Minimum Essential Medium, # 10370047, Thermo Fisher containing 10% FBS (fetal calf serum, F7524, Sigma Aldrich, heat-inactivated), 2 mM L-glutamine (G7513, Sigma Aldrich), 4 μg / ml blasticidin S HCl (# 203350-25, VWR), 1% penicillin. Streptomycin mix (# 15070063, Thermo Fisher) and 0.78 mg / ml G418 sulphate (CP11.2, Carl Roth) cultured. On the day before the experiment, cells of approximately 80% confluence were washed with phosphate buffered saline (eg L1825, Biochrom), detached from the cell culture flask bottom using TrypLE ™ Express (1x) (# 12604013, Thermo Fisher) (2 min 37 ° C), then suspended with MEM, then centrifuged for 2 min at 1000 rpm and resuspended in MEM after supernatant. The cell number of the suspension was determined with the automatic cell counter EVE ™ (NanoEnTEK). Then, 60,000 cells / well / 100 μL were seeded in 96 well Vision Plates ™ (96-well sterile black TC-treated 96-well microtiter plates, 4ti-0221, 4titude) and at 37 ° C, 5% CO 2, and 95 h for 24 h % Humidity incubated.

Für die Messung der Kaliumkanalaktivität der Substanzen wurde der FLIPR® Kalium-Assay-Kit (R8222 Explorer Version, Molecular Devices) verwendet. Der Assay wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt, worauf im Folgenden näher eingegangen wird. Zur Herstellung des Loading Buffers wurde Komponente C in 30 µL DMSO (#A994.2, Carl Roth) gelöst und zusammen mit 10 ml Komponente B in das Gefäß der Komponente A überführt. Durch Mischen wurde eine homogene Lösung erzeugt. Zusätzlich wurde dem Loading Buffer Probenecid (sc-202773A, Santa Cruz Biotechnology) in einer Konzentration von 5 mM hinzugefügt, wobei zunächst von diesem Additiv eine 500 mM Stammlösung in 1 N NaOH-Lösung angefertigt wurde, die darauffolgend 1:1 (V/V) mit Komponente B verdünnt wurde. Der pH-Wert des Loading Buffers wurde anschließend mit 1 M HCl auf 7,4 mittels pH-Elektrode eingestellt. Zu den Zellen wurden 100 µL/Well Loading zugegeben. Anschließend wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Von den zu testenden Verbindungen wurde jeweils eine serielle Verdünnungsreihe (mindestens fünf Konzentrationen) in DMSO (#A994.2, Carl Roth) angefertigt, wobei die Konzentrationen dem 100fachen der gewünschten späteren in-Well Konzentrationen betrugen. Die Zellen wurden mit den vorbereiteten Substanzkonzentrationen, welche im Verhältnis 1:100 (V/V) hinzugefügt wurden, weitere 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Negativkontrolle beinhaltete nur Lösungsmittel (1 % DMSO). Für die Fluoreszenzintensitätsmessungen (485 nm Exzitation, 535 nm Emission, Messmodus Boden) wurde das Mikrotiterplattenlesegerät Infinite® F200 Pro (Tecan) verwendet. Die zu vermessende Platte wurde ins Gerät eingebracht. In einer Zeitspanne von 20 s, wobei alle 2,5-3 s Messwerte vom Gerät aufgenommen wurden, wurde die Fluoreszenzintensität jedes Wells bestimmt (Hintergrundmessung). Danach wurde zügig im Verhältnis 1:5 (V/V) Stimulus Buffer, welcher 7,5 mM Tl2SO4, 12,5 mM K2SO4 und 1x Chloride-free Buffer in destilliertem Wasser enthielt, zu den einzelnen Wells gegeben. Die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Wells wurde ungefähr für weitere 2 min periodisch alle 2,5-3 s bestimmt. Die Bestimmung der Kaliumkanalöffnungsaktivität einer Verbindung anhand der aufgenommenen Daten erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurde für jede Verdünnungsstufe einer Substanz deren Fluoreszenzintensitätsänderung zu einem definierten Zeitpunkt gegenüber der gemittelten Fluoreszenzintensitäten der Hintergrundmessung berechnet (ΔF/F). Des Weiteren wurde dieses ermittelte Ergebnis um den analog berechneten Wert der Negativkontrolle bereinigt (korr. ΔF/F). Beim erwähnten definierten Zeitpunkt (t) war die Summe der jeweiligen um die Negativkontrolle korrigierten Fluoreszenzintensitätsänderungen der Verdünnungsreihe einer Substanz maximal. Durch visuelle Inspektion eines zugehörigen Fluoreszenzintensität-Zeit-Diagramms (Fluoreszenzintensität korrigiert um Negativkontrolle, relativ auf jeweiligen Hintergrund bezogen) wurde die Auswahl des Zeitpunkts kontrolliert. Folgende Gleichung fasst die beschriebene Berechnung zusammen: k o r r i g i e r t e Δ F F = F i ( t ) − < F i B > < F i B > − ( 1 − F K ( t ) < F K B > )

Figure DE102018212006B3_0116
Fi(t) bzw. Fk(t) ist die Fluoreszenzintensität zu einem definierten Zeitpunkt (Erläuterung s.o.) einer Test-Substanzkonzentration bzw. der Negativkontrolle. <FB> ist der Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten, welche während der Hintergrundmessung generiert wurden. Mithilfe der GraphPad Prism Software (Version 6) wurde eine nichtlineare Regression der berechneten korrigierten ΔF/F-Werte und der zugehörigen logarithmierten Konzentrationswerte einer Verbindung durchgeführt, wobei als Passform der Kurve die vorgefertigte Gleichung „log(Agonist) gegen Effekt“ (variabler Anstieg, 4 Parameter) verwendet wurde, um unter anderem einen EC50-Wert zu generieren. Beim Emax-Wert einer Substanz handelt es sich um die Differenz des höchsten und niedrigsten korr. ΔF/F-Werts (Angabe im Auswertedatenblatt der jeweiligen nichtlinearen Regressionsanalyse durch Software) der erhaltenden sigmoidalen Kurve prozentual bezogen auf den maximal erreichten Aktivität des als Referenzsubstanz verwendeten Flupirtinmaleats.The FLIPR ® Potassium Assay Kit (R8222 Explorer Version, Molecular Devices) was used to measure the potassium channel activity of the substances. The assay was performed according to the manufacturer's instructions, which will be discussed in more detail below. To prepare the Loading Buffer, Component C was dissolved in 30 μL DMSO (# A994.2, Carl Roth) and transferred together with 10 ml of Component B into the vessel of Component A. Mixing produced a homogeneous solution. In addition, the Loading Buffer Probenecid (sc-202773A, Santa Cruz Biotechnology) was added at a concentration of 5 mM initially by this additive prepared a 500 mM stock solution in 1 N NaOH solution, which was subsequently 1: 1 (v / v ) was diluted with component B. The pH of the Loading Buffer was then adjusted to 7.4 with 1 M HCl by means of a pH electrode. To the cells was added 100 μL / well loading. The mixture was then incubated in the dark at room temperature for 1 h. Of the compounds to be tested, serial serial dilutions (at least five concentrations) were made in DMSO (# A994.2, Carl Roth) with concentrations 100 times the desired later in-well concentrations. The cells were incubated with the prepared substance concentrations, added in the ratio 1: 100 (v / v), for a further 30 min in the dark at room temperature. The negative control included only solvent (1% DMSO). For the fluorescence intensity measurements (485 nm excitation, 535 nm emission, measurement mode floor) the microtiter plate reader Infinite ® F200 Pro (Tecan) was used. The plate to be measured was placed in the device. The fluorescence intensity of each well was determined over a period of 20 s, with all 2.5-3 s readings being taken by the instrument (background measurement). Thereafter, a rapid 1: 5 (v / v) stimulus buffer containing 7.5 mM Tl 2 SO 4 , 12.5 mM K 2 SO 4 and 1 x chloride-free buffer in distilled water was added to the individual wells , The fluorescence intensity of the respective wells was determined approximately every 2 min periodically every 2.5-3 s. The determination of the potassium channel opening activity of a compound based on the recorded data was carried out in several steps. First, for each dilution step of a substance, its fluorescence intensity change was calculated at a defined time relative to the averaged fluorescence intensities of the background measurement (ΔF / F). Furthermore, this determined result was adjusted by the analogously calculated value of the negative control (corr. ΔF / F). At the mentioned defined time (t) was the sum the respective corrected by the negative control fluorescence intensity changes the dilution series of a substance maximum. By visual inspection of an associated fluorescence intensity-time diagram (fluorescence intensity corrected for negative control, relative to respective background), the timing selection was controlled. The following equation summarizes the described calculation: k O r r i G i e r t e Δ F F = F i ( t ) - < F i B > < F i B > - ( 1 - F K ( t ) < F K B > )
Figure DE102018212006B3_0116
 F i (t) or F k (t) is the fluorescence intensity at a defined time (see above) of a test substance concentration or the negative control. <F B > is the mean of the fluorescence intensities generated during the background measurement. Using the GraphPad Prism software (version 6), a nonlinear regression of the calculated corrected ΔF / F values and the associated logarithmic concentration values of a compound was performed using the prefixed equation "log (agonist) versus effect" (variable slope, 4 parameters) was used to generate, inter alia, an EC 50 value. The E max value of a substance is the difference between the highest and lowest corr. ΔF / F value (data in the evaluation data sheet of the respective nonlinear regression analysis by software) of the sigmoidal curve obtained, expressed as a percentage of the maximum activity of the flupirtine maleate used as the reference substance.

zeigt zwei repräsentative Dosis-Wirkungskurven für die Öffnung des Kv 7.2/3 Kaliumkanals durch Flupirtinmaleat bzw. die wirkungsstärkste Substanz 11. Aus diesen Kurven sind sowohl die Wirkungsstärke als EC50-Wert als auch die intrinsische Aktivität der Substanz als Emax zu vermitteln. Je niedriger der EC50-Wert, desto höher ist die Wirkungsstärke (auch Potenz genannt), während je größer der Emax-Wert ist, desto stärker wirksam ist die Verbindung. shows two representative dose-response curves for the opening of the K v 7.2 / 3 potassium channel by Flupirtinmaleat or the most potent substance 11. From these curves both the potency as EC 50 value and the intrinsic activity of the substance as Emax to mediate. The lower the EC 50 value, the higher the potency (also called potency), while the larger the E max value, the more effective the compound is.

HepatocytenviabilitätsassyHepatocytenviabilitätsassy

Die Nebenwirkung von Flupirtin, die auch für seinen Entzug vom Markt verantwortlich war, ist die Hepatotoxizität. Aus diesem Grund wurden zwei Zellkulturmodelle für Hepatotoxizität entwickelt, um auf toxische Wirkung der neuen Substanzen zu testen und toxische Kandidaten frühzeitig zu identifizieren. Als Zellviabilitätsassay wurde der etablierte MTT-Viabilitätsassay durchgeführt.[41] Das Prinzip des Assays beruht darauf, dass viable Zellen in der Lage sind, das gelbe, wasserlösliche MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) zum unlöslichen violetten Formazanprodukt durch mitochondriale Dehydrogenasen zu reduzieren (unter Verbrauch von NADH bzw. NADPH), dessen Absorption dann photometrisch bestimmt werden kann. Der erste zellbasierte Assay wurde mit der TAMH-Zelllinie der Maus (transforming growth factor-a transgenic mouse hepatocytes) durchgeführt, der bereits in früheren Arbeiten mit Flupirtin [41] als auch mit anderen hepatotoxischen Wirkstoffen Anwendung fand und als Prädiktor von Hepatotoxizität nützlich ist.[42] Zum anderen wurde eine humanen Hepatokarzinomzelllinie, die HEP-G2 (human hepatocellular carcinoma cells) als zweites Hepatotoxizitätsmodell benutzt [43], um mit einem humanen Zelllinien die Ergebnisse aus dem TAMH-Zellinie zu vergleichen. Beide Zelllinien wachsen als Monolayer in Kultur, die TAHM-Zelllinien in serumfreiem Medium, die HEP-G2-Linie in Kulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum.The side effect of flupirtine, which was also responsible for its withdrawal from the market, is hepatotoxicity. For this reason, two hepatotoxicity cell culture models have been developed to test for the toxic effects of the new substances and to identify toxic candidates at an early stage. As a cell viability assay, the established MTT viability assay was performed. [41] The principle of the assay is based on the ability of viable cells to convert the yellow, water-soluble MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) to the insoluble purple formazan product to reduce mitochondrial dehydrogenases (with consumption of NADH or NADPH), whose absorption can then be determined photometrically. The first cell-based assay was performed with the transforming growth factor-a transgenic mouse hepatocytes (TAMH) cell line, which has been used in previous studies with flupirtine [41] as well as other hepatotoxic agents and is useful as a predictor of hepatotoxicity. [42] Secondly, a human hepatocarcinoma cell line using human hepatocellular carcinoma (HEP-G2) as the second hepatotoxicity model [43] was used to compare the results from the TAMH cell line with a human cell line. Both cell lines grow as monolayers in culture, the TAHM cell lines in serum-free medium, the HEP-G2 line in culture medium with 10% fetal calf serum.

Die beiden adhärenten Zelllinien wurden in Zellkulturflaschen (z. B. TC-Flasche T75, Standard, #83.3911, Sarstedt) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit, im Falle der TAMH-Zelllinie, DMEM/F12 (1:1 Mix) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F- 12, P04-41500, PAN Biotech), welches 5 % Panexin NTA (P04-95750, PAN Biotech), 10 mM Nicotinamid (N0636, Sigma Aldrich) und 0,1 % (V/V) 50 mg/ml Gentamicinsulfat-Lösung (in destilliertem Wasser, P06-03001P, PAN Biotech) beinhaltet, oder, HEP-G2-Zellen betreffend, mit RPMI 1640 (P04-16500, PAN Biotech), das 10 % FBS (fetales Kälberserum, F7524, Sigma Aldrich, hitzeinaktiviert) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Mix (P06-07100, PAN Biotech) enthält, kultiviert.The two adherent cell lines were incubated in cell culture flasks (eg T75 TC standard, # 83.3911, Sarstedt) in the incubator at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% relative humidity, in the case of the TAMH cell line, DMEM / F12 (1: 1 mix) (Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12, P04-41500, PAN Biotech) containing 5% Panexin NTA (P04-95750, PAN Biotech), 10mM Nicotinamide (N0636, Sigma Aldrich) and 0.1% (v / v) of 50 mg / ml gentamicin sulfate solution (in distilled water, P06-03001P, PAN Biotech), or concerning HEP-G2 cells, with RPMI 1640 (P04-16500, PAN Biotech ) containing 10% FBS (fetal calf serum, F7524, Sigma Aldrich, heat-inactivated) and 1% penicillin-streptomycin mix (P06-07100, PAN Biotech).

TAMH-Zellen, welche eine Konfluenz von mindestens 80 % aufwiesen, wurden mit HBSS (Hanks balanced salt solution, P04-34500, PAN-Biotech) gewaschen, mithilfe von Trypsin-EDTA-Lösung (T3924, SigmaAldrich), die ca. 10 s auf den Zellen verweilte, vom Zellkulturflaschenboden abgelöst (noch 2 min bei 37 °C), dann mit Soybean Trypsin Inhibitor (T6522, Sigma Aldrich) suspendiert, anschließend bei 400 g 5 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme mit DMEM/F12 (1:1 Mix) resuspendiert. HEP-G2-Zellen wiederum, welche eine Konfluenz von ungefähr 70 % aufwiesen, wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (z. B. L1825, Biochrom) gewaschen, mithilfe von Trypsin-EDTA-Lösung vom Zellkulturflaschenboden abgelöst (ca. 5 min bei 37 °C), dann mit RPMI 1640 suspendiert, anschließend bei 125 g 5 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme erneut mit RPMI 1640 resuspendiert. Die Zellzahl beider Zellsuspension wurde mit dem automatischen Zellzählmessgerät EVE™ (NanoEnTEK) bestimmt. Von den murinen Zellen wurden anschließend 20 000 Zellen/Well/200 µL in 96 Well TC-Platten, Cell+, F (#83.3924.300, Sarstedt) ausgesät und 2-3 Tage bis zur vollständigen Konfluenz bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Von den humanen Zellen wurden 15 000 Zellen/Well/100 µL in 96 Well TC-Platten, Standard, F (#83.3924, Sarstedt) ausgesät und 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Von den zu testenden Verbindungen wurde jeweils eine serielle Verdünnungsreihe (mindestens fünf Konzentrationen) in DMSO (#A994.2, Carl Roth) angefertigt, wobei die Konzentrationen dem 100fachen der gewünschten späteren in-Well Konzentrationen betrugen. Nach erfolgter Inkubation beider Zelllinien wurde das jeweilige in den Platten befindliche Medium verworfen und die Wells nach einem bestimmten Muster mit jeweils 200 µL/Well mit den im nachfolgenden beschriebenen verschiedenen Lösungen beladen. Die angefertigte Verdünnungsreihe einer Substanz wurde dem entsprechendem Medium im Verhältnis 1:100 (V/V) beigemischt und zu den Zellen gegeben. Kontroll-Wells enthielten die entsprechenden Zellen, welche nur mit dem jeweiligen Medium und 1 % DMSO behandelt wurden. Wells, welche keine Zellen, sondern nur das entsprechende Medium mit 1 % DMSO enthielten, wurden zur Bestimmung des Hintergrunds herangezogen (Blank). Jede Bedingung wurde mindestens als Triplikat bestimmt. Die Platten wurden 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurde jegliche Flüssigkeit aus den Platten entfernt und eine Mischung aus dem jeweiligen Medium und einer 2,5 mg/ml MTT-Lösung (in Dulbecco's Puffer, L11939.06, Alfa Aesar) im Verhältnis 1:5 (V/V) zu den Zellen gegeben. Es folgte eine Inkubation von 1,5-4 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nun wurden die Platten komplett von der zugegebenen Mischung befreit und entstandene Formazankristalle mithilfe von DMSO (#7029.2, Carl Roth) in Lösung gebracht. Die Absorption der einzelnen Wells wurde bei λ = 570 nm mit dem SpectraMax 190 Mikroplattenlesegerät inkl. SoftMax Pro Software (Molecular Devices) ermittelt. Die Viabilität der mit der zu testenden Substanz behandelten Zellen wurde im Verhältnis zur Kontrolle angegeben. Dazu wurde der Absorptionswert eines einzelnen Wells, welches Zellen beinhaltete, die mit einer Verdünnungsstufe der Substanz behandelt wurden (T), durch den Mittelwert der Absorptionswerte der Kontroll-Wells (<C>) dividiert und mit 100 multipliziert. Beide Terme wurden zuvor um den Mittelwert der gemessenen Absorptionen der Wells für die Blank-Bestimmung (<Blank>) korrigiert. Somit ergibt sich folgende Formel: V i a b i l i t ä t [ % ] = T − < b l a n k > < G > − < B l a n k > ∗ 100

Figure DE102018212006B3_0117
TAMH cells, which had a confluence of at least 80%, were washed with HBSS (Hanks balanced salt solution, P04-34500, PAN-Biotech) using trypsin-EDTA solution (T3924, Sigma Aldrich), which was used for about 10 sec on the cells, detached from the cell culture flask bottom (2 min at 37 ° C), then suspended with soybean trypsin inhibitor (T6522, Sigma Aldrich), then centrifuged at 400 g for 5 min and after supernatant with DMEM / F12 (1: 1 Mix ) resuspended. In turn, HEP-G2 cells, which had a confluency of approximately 70%, were washed with phosphate buffered saline (e.g., L1825, Biochrom), stripped from the cell culture flask bottom using trypsin-EDTA solution (at 37 ° C for approximately 5 minutes) ), then suspended with RPMI 1640, then centrifuged at 125 g for 5 min and after Supernatant removed resuspended with RPMI 1640. The cell count of both cell suspensions was determined with the EVE ™ Automated Cell Counter (NanoEnTEK). Of the murine cells, 20,000 cells / well / 200 μL were then seeded in 96 well TC plates, Cell +, F (# 83.3924.300, Sarstedt) and 2-3 days to complete confluency at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% humidity incubated. Of the human cells, 15,000 cells / well / 100 μL were seeded in 96 well TC plates, Standard, F (# 83.3924, Sarstedt) and incubated for 24 h at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% humidity. Of the compounds to be tested, serial serial dilutions (at least five concentrations) were made in DMSO (# A994.2, Carl Roth) with concentrations 100 times the desired later in-well concentrations. After incubation of both cell lines, the respective medium contained in the plates was discarded and the wells loaded according to a specific pattern with 200 μL / well each with the various solutions described below. The prepared dilution series of a substance was admixed to the appropriate medium in a ratio of 1: 100 (v / v) and added to the cells. Control wells contained the appropriate cells which were treated only with the respective medium and 1% DMSO. Wells containing no cells, but only the appropriate medium containing 1% DMSO were used to determine the background (blank). Each condition was determined at least as triplicate. The plates were incubated for 24 h at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% humidity. Subsequently, any liquid was removed from the plates and a mixture of the respective medium and a 2.5 mg / ml MTT solution (in Dulbecco's buffer, L11939.06, Alfa Aesar) in the ratio 1: 5 (v / v) to the Given cells. This was followed by an incubation of 1.5-4 h at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% humidity. Now the plates were completely freed from the added mixture and formed Formazankristalle using DMSO (# 7029.2, Carl Roth) brought into solution. The absorption of the individual wells was determined at λ = 570 nm using the SpectraMax 190 microplate reader incl. SoftMax Pro software (Molecular Devices). The viability of the cells treated with the substance to be tested was expressed in relation to the control. For this, the absorbance value of a single well, which included cells treated with a dilution step of the substance (T), was divided by the mean of the absorbance values of the control wells (<C>) and multiplied by 100. Both terms were previously corrected for the mean value of the measured absorbances of the wells for the blank determination (<Blank>). This results in the following formula: V i a b i l i t ä t [ % ] = T - < b l a n k > < G > - < B l a n k > * 100
Figure DE102018212006B3_0117

Zur Beurteilung des hepatotoxischen Potentials einer Substanz wurde der IC50-Wert verwendet. Als IC50 wurde die Konzentration einer Verbindung definiert, bei welcher die Viabilität der Zellen auf 50 % sank ( ). Zur Bestimmung dieser wurde wiederum mithilfe der MS Excel Software (2013, Microsoft) eine Analyse der linearen Regression der ermittelten Viabilitäten und der zugehörigen (logarithmierten) Konzentrationen einer Substanz durchgeführt und mittels der sich ergebenden linearen Gleichung die IC50 bestimmt.To assess the hepatotoxic potential of a substance, the IC 50 value was used. The IC 50 was defined as the concentration of a compound at which the viability of the cells dropped to 50% ( ). To determine this, an analysis of the linear regression of the determined vivilities and the associated (logarithmic) concentrations of a substance was again carried out with the help of the MS Excel software (2013, Microsoft) and the IC 50 was determined by means of the resulting linear equation.

Die Ergebnisse der Hepatoxizitäts-Untersuchung sind in Tabelle 3 zusammengefasst. In den meisten Fällen konnte kein IC50-Wert berechnet werden, weil die obere Löslichkeitsgrenze der Substanzen in Zellkulturmedium unterhalb die 50% toxische Konzentration lag; d.h. die Substanzen fiel aus, bevor eine IC50-Konzentration erreicht werden konnte.The results of the hepatotoxicity study are summarized in Table 3. In most cases, no IC 50 value could be calculated because the upper solubility limit of the substances in cell culture medium was below the 50% toxic concentration; ie, the substances precipitated before an IC 50 concentration could be achieved.

Ergebnisse der biologischen TestungResults of biological testing

Tabelle 3 fast die gesamten biologischen Testergebnisse der synthetisierte Substanzen zusammen und vergleicht sie mit der Referenzsubstanz Flupritinmaleat. Aus dem Zusammenspiel der Ergebnisse von Kv7.2/3-Öffnungsaktivität und den Hepatotoxizitäts-Ergebnissen in vitro ist ersichtlich, dass insgesamt Verbindungen der allgemeinen Strukturformen (I) die Wirkung von der Referenzsubstanz Flupirtinmaleat deutlich übertreffen. Insbesondere Verbindungen mit einem niedrigen EC50-Wert, bevorzugt einem EC50-Wert von weniger als 0,9 mikromolar (Mikromol pro Liter), weiter bevorzugt von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von weniger als 0,01 mikromolar, sind besonders geeignet. Bei der potentesten Substanz 11 werden so niedrige Substanzkonzentrationen (0,0014 µmol pro Liter) zur Erreichung des halbmaximalen Effekts auf Kaliumkanäle benötigt, dass toxische Effekte bei der resultierenden Dosierung sehr unwahrscheinlich sind. Die ermittelten Toxizitätsdaten zeigen, dass bei den durch Löslichkeit im Testmedium limitierten Konzentrationen von 63 µmol pro Liter für Verbindung 11 keine toxischen Effekte beobachtet wurden und der IC50 daher als größer als 63 µmol pro Liter angegeben werden kann. Entsprechend ist das Verhältnis von IC50 zu EC50 mindestens 85-mal größer bei Substanz 11 als bei Flupirtinmaleat. Leberschädigungen während der Therapie sollten damit weniger wahrscheinlich sein. Auch der biologische Effekt der Testsubstanz sollte größer sein (beispielsweise stärkere Analgesie), da Emax bei über 100 % lag und somit ein stärkerer Kaliumefflux zu erwarten ist als mit Flupirtinmaleat. Tabelle 3 Ergebnisse der Kv7.2I3-Öffnungsaktivitäts-Untersuchung und der Hepatoxizitäts-Untersuchung Nr. Kv7.2/3-Öffnungsaktivität Hepatotoxizität in vitro TAMH HEP-G2 EC50 [µM] ± SD [µM] Emax [%] IC50 [µM] ± SD [µM] IC50 [µM] ± SD [µM] Vergleichsbeispiel 1 0,918 ± 0,099 (n=6) 100 487 ± 51 (n=4) 547 ± 111 (n=7) 1 1,279 ± 0,293 (n=4) 93 ± 13 > 40 (n=3) > 40 (n=3) 2 0,237 ± 0,022 (n=3) 115 ± 19 > 20 (n=4) > 20 (n=4) 3 0,771 ± 0,076 (n=4) 96 ± 9 > 30 (n=4) > 30 (n=4) 4 > 10 (n=2) - >7.5 (n=4) >7.5 (n=4) 5 0,240 ± 0,066 (n=4) 78 ± 10 > 30 (n=4) nicht bestimmt 6 2,134 ± 0,457 (n=3) 140 ± 11 > 63 (n=4) > 63 (n=5) 7 4,544 ± 1,457 (n=3) 118 ± 28 > 63 (n=4) > 63 (n=5) 8 1,320 ± 0,440 (n=3) 120 ± 19 52 ± 16 (n=4) > 250 (n=5) 9 0,021 ± 0,006 (n=3) 162 ± 9 > 125 (n=3) > 125 (n=4) 10 0,0245 ± 0,0069 (n=3) 141 ± 11 > 125 (n=3) > 125 (n=4) 11 0,001378 ± 0,00006 (n=3) 136 ± 13 >63 (n=3) >63 (n=4) 12 0,515 ± 0,035 (n=3) 117 ± 22 > 250 (n=3) > 250 (n=4) 13 > 10 (n=3) - > 1000 (n=5) 831 ± 149 (n=3) 14 > 10 (n=4) - > 500 (n=3) > 500 (n=3) 15 1,746 ± 0,347 (n=3) 110 ± 15 > 250 (n=3) 221 ± 102 (n=5) 16 > 10 (n=2) - > 250 (n=3) 134 ± 22 (n=4) 17 0,253 ± 0,042 (n=3) 69 ± 9 > 250 (n=2) > 250 (n=4) 18 0,269 ± 0,031 (n=3) 129 ± 3 > 10 (n=5) > 30 (n=3) 19 0,260 ± 0,082 (n=4) 100 ± 23 > 30 (n=3) 8 ± 3 (n=4) 20 0,015 ± 0,002 (n=3) 147 ± 9 > 7.5 (n=3) > 10 (n=3) 21 0,447 ± 0,293 (n=3) 72 ± 4 > 63 (n=3) 58 ± 12 (n=4) 22 0,066 ± 0,013 (n=3) 114 ± 16 > 5 (n=6) > 10 (n=3) 23 1,348 ± 0,185 (n=3) 106 ± 17 > 250 (n=4) 203 ± 59 (n=4) 24 0,122 ± 0,031 (n=3) 112 ± 11 > 250 (n=2) > 250 (n=2) 25 0,021 ± 0,003 (n=3) 107 ± 7 > 63 (n=3) > 63 (n=4) Table 3 summarizes almost all the biological test results of the synthesized substances and compares them to the reference substance flupritin maleate. From the interaction of the results of Kv7.2 / 3-opening activity and the hepatotoxicity results in vitro, it can be seen that total compounds of the general structural forms (I) significantly exceed the effect of the reference substance flupirtine maleate. In particular, compounds having a low EC 50 value, preferably an EC 50 value of less than 0.9 micromolar (micromoles per liter), more preferably less than 0.1, more preferably less than 0.01 micromolar, are especially suitable. For the most potent substance 11, such low substance concentrations (0.0014 μmol per liter) are needed to achieve the half-maximal effect on potassium channels that toxic effects in the resulting dosage are very unlikely. The determined toxicity data show that at concentrations of 63 μmol per liter for compound 11, which are limited by solubility in the test medium, no toxic effects were observed and the IC 50 can therefore be given as greater than 63 μmol per liter. Accordingly, the ratio of IC 50 to EC 50 is at least 85 times greater for substance 11 than for flupirtine maleate. Liver damage during therapy should therefore be less likely. Also, the biological effect of the test substance should be greater (for example, stronger analgesia), since Emax was over 100% and thus a stronger potassium effluent is to be expected than with flupirtine maleate. Table 3 Results of K v 7.2I3 opening activity study and hepatotoxicity study No. Kv7.2 / 3 opening activity Hepatotoxicity in vitro TAMH HEP-G2 EC 50 [μM] ± SD [μM] E max [%] IC 50 [μM] ± SD [μM] IC 50 [μM] ± SD [μM] Comparative Example 1 0.918 ± 0.099 (n = 6) 100 487 ± 51 (n = 4) 547 ± 111 (n = 7) 1 1.279 ± 0.293 (n = 4) 93 ± 13 > 40 (n = 3) > 40 (n = 3) 2 0.237 ± 0.022 (n = 3) 115 ± 19 > 20 (n = 4) > 20 (n = 4) 3 0.771 ± 0.076 (n = 4) 96 ± 9 > 30 (n = 4) > 30 (n = 4) 4 > 10 (n = 2) - > 7.5 (n = 4) > 7.5 (n = 4) 5 0.240 ± 0.066 (n = 4) 78 ± 10 > 30 (n = 4) not determined 6 2.134 ± 0.457 (n = 3) 140 ± 11 > 63 (n = 4) > 63 (n = 5) 7 4,544 ± 1,457 (n = 3) 118 ± 28 > 63 (n = 4) > 63 (n = 5) 8th 1.320 ± 0.440 (n = 3) 120 ± 19 52 ± 16 (n = 4) > 250 (n = 5) 9 0.021 ± 0.006 (n = 3) 162 ± 9 > 125 (n = 3) > 125 (n = 4) 10 0.0245 ± 0.0069 (n = 3) 141 ± 11 > 125 (n = 3) > 125 (n = 4) 11 0.001378 ± 0.00006 (n = 3) 136 ± 13 > 63 (n = 3) > 63 (n = 4) 12 0.515 ± 0.035 (n = 3) 117 ± 22 > 250 (n = 3) > 250 (n = 4) 13 > 10 (n = 3) - > 1000 (n = 5) 831 ± 149 (n = 3) 14 > 10 (n = 4) - > 500 (n = 3) > 500 (n = 3) 15 1.746 ± 0.347 (n = 3) 110 ± 15 > 250 (n = 3) 221 ± 102 (n = 5) 16 > 10 (n = 2) - > 250 (n = 3) 134 ± 22 (n = 4) 17 0.253 ± 0.042 (n = 3) 69 ± 9 > 250 (n = 2) > 250 (n = 4) 18 0.269 ± 0.031 (n = 3) 129 ± 3 > 10 (n = 5) > 30 (n = 3) 19 0.260 ± 0.082 (n = 4) 100 ± 23 > 30 (n = 3) 8 ± 3 (n = 4) 20 0.015 ± 0.002 (n = 3) 147 ± 9 > 7.5 (n = 3) > 10 (n = 3) 21 0.477 ± 0.293 (n = 3) 72 ± 4 > 63 (n = 3) 58 ± 12 (n = 4) 22 0.066 ± 0.013 (n = 3) 114 ± 16 > 5 (n = 6) > 10 (n = 3) 23 1.348 ± 0.185 (n = 3) 106 ± 17 > 250 (n = 4) 203 ± 59 (n = 4) 24 0.122 ± 0.031 (n = 3) 112 ± 11 > 250 (n = 2) > 250 (n = 2) 25 0.021 ± 0.003 (n = 3) 107 ± 7 > 63 (n = 3) > 63 (n = 4)

Figurenlistelist of figures

  • . zeigt repräsentative Dosis-Wirkungskurven für die Öffnung des Kv 7.2/3 Kaliumkanals durch Flupirtinmaleat und Substanz 11; , shows representative dose-response curves for the opening of the K v 7.2 / 3 potassium channel by flupirtine maleate and substance 11;
  • . zeigt repräsentative Dosis-Viabilitätskurven für Flupirtinmaleat in TAMH und HEP-G2-Zelllinien. , shows representative dose-response curves for flupirtine maleate in TAMH and HEP-G2 cell lines.

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Claims (9)

Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Figure DE102018212006B3_0118
wobei R1 ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus aufweist; R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11 -Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom, verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind; R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind; R4 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe; X ein Stickstoffatom oder eine -CH- Gruppe ist; n Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; m Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist.Compound of the general formula (I)
Figure DE102018212006B3_0118
 wherein R 1 is selected from branched or unbranched C 1 to C 5 alkyl group and -NR 1a R 1b group, wherein R 1a and R 1b are independently selected from hydrogen and branched or unbranched C 1 to C 5 alkyl group or with each other and with the nitrogen atom of the NR 1a R 1b group form a C3 to C9 heterocycloalkyl group, the C3 to C9 heterocycloalkyl group each having at least one substituent selected from hydrogen atom and C1 to C3 alkyl group and optionally in addition to the nitrogen atom of the NR 1a R 1b group has at least one further heteroatom in the cycle; R 2 is selected from the group consisting of branched or unbranched C 1 to C 10 alkyl, C 3 to C 10 cycloalkyl, C 3 to C 10 heterocycloalkyl, wherein at least one heteroatom selected from nitrogen and oxygen is included, C 6 to C 12 aryl group; and C5 to C11 heteroaryl group, wherein the C1 to C10 alkyl group, C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, C6 to C12 aryl group, or C5 to C11 heteroaryl group each have at least one further substituent R 2a , wherein R 2a is selected from the group consisting of hydrogen atom, halogen atom, branched or unbranched C1 to C3 alkyl group, branched or unbranched (per) halogenated C1 to C3 alkyl group and branched or unbranched C1 to C3 Alkoxy group, and wherein the C3 to C10 cycloalkyl group, C3 to C10 heterocycloalkyl group, C6 to C12 aryl group or C5 to C11 heteroaryl group includes one or more ring systems which are condensed or separated; R 3 is selected from the group consisting of branched or unbranched C 1 to C 10 alkoxy group; branched or unbranched C1-C10 alkyl group, and - p (CH 2) -C6- C12 aryl group having at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom, and comprises C1 to C3 alkoxy group and wherein the C6 to C12 aryl group, a or more ring systems which are condensed or separated; R 4 is selected from hydrogen, halogen and branched or unbranched C 1 -C 5 alkyl group; X is a nitrogen atom or a -CH group; n is zero or an integer in the range of 1 to 3; m is zero or an integer in the range of 1 to 5; and p is zero or an integer in the range of 1 to 5. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, wobei n Null ist und/oder m 1 ist und/oder X ein Stickstoffatom ist. Compound of general formula (I) according to Claim 1 where n is zero and / or m is 1 and / or X is a nitrogen atom. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C4- bis C6-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C4- bis C6-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Sauerstoffatom im Cyclus aufweist; und/oder R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mono- oder Difluorphenyl-Gruppe; CF3-Phenyl-Gruppe; F5S-Phenyl-Gruppe; C4- bis C8-Cycloalkylgruppe; verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe; Biphenyl-Gruppe; Pyridin-Gruppe; Piperidin-Gruppe; Tetrahydropyran-Gruppe; Dioxolan-Gruppe und Phenyl-Gruppe, wobei die Phenyl-Gruppe mindestens einen Substituenten R2a ausgewählt aus Wasserstoffatom und Methoxy-Gruppe aufweist; und/oder R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethoxy-Gruppe, Propyl-Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p Null oder 1 oder 2 ist; und/oder R4 ein Wasserstoffatom, ein Bromatom oder eine Methyl-Gruppe ist.Compound of general formula (I) according to Claim 1 or 2 in which R 1 is selected from the group consisting of branched or unbranched C 1 - to C 3 -alkyl group and -NR 1a R 1b group, where R 1a and R 1b are selected independently of one another from hydrogen atom and branched or unbranched C 1 - to C 3 -cycloalkyl Alkyl group or with each other and with the nitrogen atom of the NR 1a R 1b group form a C4 to C6 Heterocycloalklygruppe, wherein the C4 to C6 Heterocycloalklygruppe each having at least one substituent selected from hydrogen atom and C1 to C3 alkyl group and optionally in addition to Nitrogen atom of the NR 1a R 1b group has at least one further oxygen atom in the cycle; and / or R 2 is selected from the group consisting of mono- or difluorophenyl group; CF 3 phenyl group; F 5 S-phenyl group; C4 to C8 cycloalkyl group; branched or unbranched C1 to C5 alkyl group; Biphenyl group; Pyridine group; Piperidine group; Tetrahydropyran group; Dioxolane group and phenyl group, wherein the phenyl group has at least one substituent R 2a selected from hydrogen atom and methoxy group; and / or R 3 is selected from the group consisting of ethoxy group, propyl group, tert-butyl group, - (CH 2 ) p -phenyl group which has at least one substituent selected from hydrogen atom, halogen atom and methoxy group and where p is zero or 1 or 2; and / or R 4 is a hydrogen atom, a bromine atom or a methyl group. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung die Formel (Ia)
Figure DE102018212006B3_0119
oder (Ib)
Figure DE102018212006B3_0120
oder (Ic)
Figure DE102018212006B3_0121
 Compounds of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 3 in which the compound has the formula (Ia)
Figure DE102018212006B3_0119
 or (Ib)
Figure DE102018212006B3_0120
 or (Ic)
Figure DE102018212006B3_0121
 Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),
Figure DE102018212006B3_0122
wobei R1, R2, R3, R4, X, n, m und p die gleiche Bedeutung haben wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, umfassend: (i) Bereitstellen einer Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II)
Figure DE102018212006B3_0123
wobei R1, R2, R4, m und n die gleiche Bedeutung haben wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert; (ii) Umsetzen der Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß (i) mit einer Verbindung H-R3, wobei R3 die gleiche Bedeutung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert hat, unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Formel (I). Process for the preparation of a compound of general formula (I),
Figure DE102018212006B3_0122
 wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , X, n, m and p have the same meaning as in one of Claims 1 to 7 comprising, (i) providing a nitro compound of the general formula (II)
Figure DE102018212006B3_0123
 wherein R 1 , R 2 , R 4 , m and n have the same meaning as in one of Claims 1 to 7 Are defined; (ii) reacting the nitro compound of general formula (II) according to (i) with a compound HR 3 , wherein R 3 has the same meaning as in one of Claims 1 to 4 has been defined to obtain a compound of general formula (I). Verbindung der allgemeinen Formel (I), erhalten oder erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5.A compound of the general formula (I) obtained or obtainable by a process according to Claim 5 , Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Arzneimittel.Compound of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 4 or according to Claim 6 or pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 4 or according to Claim 6 for use as a medicine. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Schmerzmittel und/oder zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.Compound of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 4 or according to Claim 6 or pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 4 or according to Claim 6 for use as a painkiller and / or for use in tinnitus treatment or prevention and / or for use in the treatment or prevention of convulsive conditions and / or for use in the treatment or prevention of a disease selected from Group consisting of incontinence, anxiety, dependence, mania, bipolar disorder, cognitive disorder and dyskinesia. Pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6.Pharmaceutical preparation comprising a compound of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 4 or according to Claim 6 or a pharmaceutically acceptable salt of a compound of the general formula (I) according to one of the Claims 1 to 4 or according to Claim 6 ,
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