DE102018212006B3 - Thioether als Modulatoren von Kv7.2/Kv7.3-Kanälen - Google Patents

Thioether als Modulatoren von Kv7.2/Kv7.3-Kanälen Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend eine Thioether-Struktur, ein Verfahren zu deren Herstellung und Verbindungen erhalten oder erhältlich nach diesem Verfahren. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Verwendung als Schmerzmittel und/oder zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie. Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Description

  • Die Erfindung betrifft eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) umfassend eine Thioether-Struktur, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie Verbindungen erhalten oder erhältlich nach diesem Verfahren.
  • Eine neuronale Übererregbarkeit spielt eine entscheidende Rolle bei chronischen Schmerzen, Epilepsie oder Migräne. In diesem Kontext stellt die Hyperpolarisation des Ruhemembranpotentials bestimmter Neurone durch Öffnung von Kaliumkanälen und die daraus folgende verringerte Generierung von Aktionspotentialen einen therapeutischen Ansatz dar, der bereits durch die Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin klinisch genutzt wird. Beide Arzneistoffe stehen aber in Zusammenhang mit seltenen aber schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen (vide infra) und sicherere Nachfolgersubstanzen dieser Arzneistoffe sind erforderlich, um eine wichtige therapeutische Alternative für zahlreiche Indikationen zu erhalten.
  • Ein spannungsabhängiger, langsam aktivierender und nicht inaktivierender Kaliumionenstrom, der im zentralen und peripheren Nervensystem auftritt, ist an der Steuerung des Feuerungsverhaltens und damit an der Regulierung der Erregbarkeit einer Vielzahl neuronaler Zellen beteiligt.[1] Die molekulare Basis des M-Stroms bilden Kv7-Kaliumkanäle. In den meisten Neuronen überwiegen Kv7.2- und Kv7.3-Untereinheiten.[2] Daneben kommen Kv7-Kaliumkanäle auch in den primären Sinneszellen des Innenohrs, in Skelettmuskelzellen und in Zellen der glatten Muskulatur vor.[3-5] Ähnlich wie bei anderen spannungsgesteuerten Kaliumkanälen bilden jeweils vier Untereinheiten einen Kanal. Dabei können sowohl Homo- als auch Heterotetramere gebildet werden.[6,7] Der Effekt der Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin auf Kv7-Kanäle ist abhängig davon aus welchen Untereinheiten sie aufgebaut sind.[8] Flupirtin und Retigabin wirken auf molekularer Ebene insbesondere über eine Stabilisierung der offenen Konformation der heterotetrameren Kv7.2/Kv7.3-Kanäle, die genaue Bindungsstelle konnte bisher nur durch Berechnungen abgeschätzt aber nicht durch Kristallstrukturanalyse bestimmt werden.[7-10]
  • Flupirtin wurde vom Chemiewerk Hornburg (später ASTA Medica) entwickelt. Es gehört chemisch betrachtet zur Klasse der Triaminopyridine und wird in Europa seit 1984 als Analgetikum mit muskelrelaxierenden Eigenschaften eingesetzt.[7] Es ist durch die EMA zur Schmerzbehandlung zugelassen und als Maleat-Salz in Form von Kapseln, Tabletten oder Injektionslösungen erhältlich. Der Wirkstoff erreicht seinen schmerzlindernden Effekt auf spinalen und supraspinalen Ebenen.[11] Opiodrezeptoren sind dabei genauso wenig an der Wirkung beteiligt wie eine Beeinflussung der Prostaglandinsynthese, alpha1- oder alpha2-Adreno- oder 5-HT-Rezeptoren.[12-14] Flupirtin ist ein positiver Modulator von Kv7-Kaliumkanälen und öffnet Kv7.2/7.3-Kanäle mit einer EC50 von ungefähr 5 µM.[15] Bei niedrigen mikromolaren Plasmakonzentrationen (2-6 µM), welche für einen analgetischen Effekt nötig sind, gilt dies als der hauptsächliche Wirkmechanismus von Flupirtin.[16]
  • Des Weiteren gibt es Indizien dafür, dass Flupirtin den Effekt von GABA am GABAA-Rezeptor verstärkt.[17] Flupirtin ist zugelassen für die Therapie von akuten und chronischen Schmerzen, beispielsweise bei schmerzhaften Verspannungen, degenerativen Gelenkerkrankungen, Spannungskopfschmerzen, Tumorschmerzen, Regelschmerzen oder postoperativen Schmerzen. Basierend auf dem Wirkungsmechanismus von Flupirtin sind theoretisch weitere Indikationen möglich. Dazu zählen multiple Sklerose, Tinnitusprophylaxe, überaktive Blase, neuropathische Schmerzen, periphere Neuropathien und Fibromyalgien.[13] Weiterhin verfügt Flupirtin über neuroprotektive Eigenschaften, die potentiell therapeutisch nutzbar sind.[18] Studien an Patienten mit postoperativen oder Tumorschmerzen haben gezeigt, dass Flupirtin in etwa die gleiche analgetische Wirkstärke wie schwache Opioide besitzt.[19-20] Flupirtin galt lange Zeit allgemeinhin als gut verträglich. Schlaflosigkeit, Schläfrigkeit, Schwindel, trockener Mund, Erbrechen und Unwohlsein im Magen-Darm-Bereich sind die häufigsten Nebenwirkungen. Im Rahmen der Pharmakavigilanz wurde jedoch ein ernst zu nehmendes Problem ersichtlich. Bis 2013 wurden 800 unerwünschte Arzneimittelwirkungen gemeldet. Mehr als ein Drittel dieser Meldungen beschreiben Leber- oder Gallenerkrankungen. Aus der Gesamtzahl aller Fallberichte endeten 24 tödlich und für 17 von diesen wurden wiederum lebertoxische Reaktionen berichtet. Nach einer erneuten Nutzen-Risiko-Bewertung besteht für Flupirtin-haltige Arzneimittel eine Einschränkung der therapeutischen Zielgruppe und eine Begrenzung der Behandlungsdauer auf zwei Wochen. [12] Mittlerweile hat der Pharmakavigilanz-Ausschuss (PRAC) der Europäischen Arzneimittelagentur EMA empfohlen, die Zulassungen für alle Flupirtin-haltigen Arzneimittel (Katadolon® und andere) zu widerrufen.[22]
  • In höheren Dosen verfügt Flupirtin auch über antikonvulsive Eigenschaften. Eine strukturelle Optimierung führte zur Entwicklung des deutlich potenteren, hochanalogen Wirkstoffs Retigabin, der in der Folge als Antiepileptikum zugelassen wurde.[23] Flupirtin und Retigabin sind nachfolgend dargestellt:
    Figure DE102018212006B3_0001
  • Der postulierte Wirkmechanismus von Retigabin ist vergleichbar mit dem von Flupirtin. Damit besitzt Retigabin einen gänzlich anderen Angriffspunkt als alle anderen aktuell verfügbaren Antiepileptika. Retigabin ist in nahezu jedem Epilepsie-Tiermodell aktiv mit einem Gesamtprofil, welches sich von jedem anderen Antiepileptikum unterscheidet.[23] Das macht es zu einem unverzichtbaren Arzneistoff bei Arzneimittel-resistenten Epilepsien.[24, 25]
  • Die häufigsten unerwünschten Arzneimittelwirkungen während einer Behandlung mit Retigabin (Trobalt ®) sind Benommenheit, Müdigkeit, Kopfschmerz, Verwirrtheit und Schwäche. Darüber hinaus wurden bei 12% der Behandelten renale und urologische Störungen beobachtet. Retigabin verursacht eine Harnretention, die über die Aktivierung von Kv7-Kanälen in der glatten Muskulatur der Blase zu erklären ist.[26] Im Gegensatz zu einigen anderen Antiepileptika ist Retigabin jedoch nicht mit kardialer, hämatologischer oder hepatischer Toxizität assoziiert und ist weder teratogen noch reproduktionstoxisch. Des weiteren besitzt Retigabin nur ein geringes Potential für Arzneimittelinteraktionen, da es Leberenzyme weder induziert noch inhibiert.[6] Diese Eigenschaften machen Retigabin im Allgemeinen zu einem gut verträglichen Antiepileptikum. Berichte aus klinischen Langzeitstudien über Pigmentveränderungen (Verfärbung) von Augengeweben einschließlich der Retina und blaugraue Verfärbungen der Haut, Lippen und Nägel führten jedoch zu einer Anwendungsbeschränkung. Retigabin ist inzwischen nur noch als Zusatztherapie für pharmakaresistente fokale Krampfanfälle mit oder ohne sekundärer Generalisierung bei erwachsenen Patienten mit Epilepsie zugelassen, wenn andere geeignete Arzneimittel unzureichend wirkten oder nicht vertragen wurden.[27] Im Juni 2017 erfolgte letztendlich die weltweite Marktrücknahme von Trobalt® durch GlaxoSmithKline. Eine mögliche Erklärung für die beobachtetet Toxizität ist die Bildung toxischer Metabolite.[28] In Greifswald wurde deshalb eine klinische Studie durchgeführt, in der Hinweise auf entstandene Oxidationsprodukte (Chinondiimine) gefunden wurden, die in Folgereaktionen Dimere bzw. Trimere bildeten und sich mit Glutathion zu entsprechenden Konjugaten umsetzen ließen.[29] Diese Glutathionkonjugate werden in Folgereaktionen wahrscheinlich zu Cystein- und Mercaptursäurekonjugaten metabolisiert.[30] Es wurde aus diesen Befunden abgeleitet, dass die Chinondiiminintermediate des Flupirtins für die Hepatotoxizität verantwortlich sind.[31] Dies ist beispielsweise für Paracetamol und Diclofenac bekannt, die ebenfalls Chinoniminintermediate bilden.[32,33]
  • In einer weiteren in vitro Reaktion konnte die Carbamatgruppe des Flupirtins durch Schweineleberesterasen gespalten werden. Die so entstandene primäre, aromatische Aminogruppe wurde wiederum von menschlichen N-Acetyltransferasen zum Metaboliten D13223 acetyliert. Dieser zeigte sich im Vergleich zu Flupirtin als weniger reaktiv gegenüber Peroxidasen. Die entsprechenden Chinondiimine konnten in vitro detektiert werden, d.h. sie sind relativ stabil.[29] Dies erklärt eventuell auch, dass der Metabolit D13223 des Flupirtins weniger hepatotoxisch ist als Flupirtin selbst.[31] Der N-acetylierte Metabolit von Flupirtin verfügt darüber hinaus noch über etwa ein Viertel der analgetischen Wirkung der Muttersubstanz.[34] Der Metabolismus von Retigabin unterscheidet sich etwas von dem des Flupirtins. Gemeinsam ist, dass auch Retigabin durch Acetylierung und Glucuronidierung verstoffwechselt wird. Beide Metabolite wurden in menschlichem Urin nach oraler Einmalgabe von 600 mg Retigabin detektiert.[35] Wie beim Metabolismus von Flupirtin konnte keine Beteiligung der Cytochrom P450 Monooxygenasen nachgewiesen werden.[36] Oxidative Prozesse scheinen im Retigabin-Metabolismus eine geringere Rolle zu spielen als beim Flupirtin. Über die in vivo Bildung von Dimeren gibt es keine Berichte. Dousa et al. identifizierten jedoch Retigabindimere als prozessbezogene Verunreinigungen aus der Retigabinsynthese. [37] Duggan et al. synthetisierten fluorierte Retigabinanaloga, um zu Analoga mit besseren Eigenschaften zu gelangen, ohne aber dabei ein spezielles Augenmerk auf die Metabolisierung zu legen.[38] Bei der Firma Grünenthal wurde die Struktur der an sich als sicher und gut verträglich erwiesenen Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin gänzlich verlassen, so dass zwar die damit verbundenen Probleme vermieden werden, aber eben auch nicht mehr auf die ungewöhnlich breiten Anwendungserfahrungen bezüglich der bei den allermeisten Patienten guten Langzeitverträglichkeit der bewährten Strukturen Bezug genommen werden kann.[39]
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung neuer Verbindungen, die eine ähnlich gute Wirksamkeit aufweisen wie beispielsweise Flupirtin bzw. Retigabin und bei denen die strukturbedingte Toxizität aufgehoben ist.
  • Die Aufgabe wurde gelöst mit Verbindung der allgemeinen Formel (I)
    Figure DE102018212006B3_0002
    wobei
    • R1
    ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus, bevorzugt ein Stickstoff- oder Sauerstoffatom, aufweist;
    R2
    ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F), verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
    R3
    ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
    R4
    ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt Br) und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe;
    X
    ein Stickstoffatom oder eine -CH- Gruppe ist;
    n
    Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist;
    m
    Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und
    p
    Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist.
  • Es wurde gefunden, dass ein Ersatz des N-Atoms der sekundären Aminogruppe von Flupirtin bzw. Retigabin durch ein Schwefelatom die Eigenschaften der erhaltenen Moleküle so verändert, dass eine Oxidation nicht mehr am dreifach substituierten Ring sondern an der Thioetherbrücke stattfindet. Vorteilhafterweise werden die Thioether durch Oxidationsmittel nicht zu toxischen Chinondiiminen, sondern zu Sulfoxiden oxidiert, die anders als die Chinodiimine des Flurpitins chemisch unreaktiv sind und nicht mit körpereigenen Nukleophilen reagieren können, womit die Grundlage der Toxizität auf molekularer Ebene aufgehoben ist. Die gebildeten Sulfoxide, die auch die wahrscheinlichen Metaboliten in vivo darstellen, sind nicht per se toxisch und es konnte gezeigt werden, dass durch Veränderung des Substitutionsmusters stärker wirksame Thioether erhalten werden können, deren Sulfoxidmetaboliten nicht hepatotoxisch sind.
  • Überraschenderweise zeigen die neu dargestellten Thioether in vitro eine mindestens gleichwertige Wirkung auf Kv7 .2/7.3-Kanäle wie Flupirtin und Retigabin, d.h. es handelt sich um potentielle Kv 7.2/3-Öffner; mittels eines Kaliumkanal-Assays wurde die Kaliumkanalaktivität der Substanzen basierend auf EC50 und Emax belegt. Die halbmaximale Effektkonzentration (EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt des eingesetzten Kaliumkanal-Assays zu beobachten ist, wenn die logarithmierte Konzentration einer Substanz gegen die zugehörigen korrigierten ΔF/F-Werte geplottet wird, womit die Wirkungsstärke (Potenz) einer Verbindung charakterisiert wird. Die intrinsische Aktivität einer Test-Verbindung wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich um die maximale Antwort, bezogen auf den eingesetzten Assay, welche durch die entsprechende Test-Substanz möglich ist (Plateaueffekt). Bei der Auswertung des eingesetzten Assays wurde Emax des als Referenz verwendeten Flupirtins, welches als Maleat eingesetzt wurde (Flupirtinmaleat), auf 100 % festgelegt und die maximalen Antworten der jeweiligen Substanz der allgemeinen Formel (I) relativ auf diesen Wert bezogen.
  • Je niedriger der EC50-Wert, desto höher ist die Potenz, während je größer der Emax-Wert ist, desto stärker wirksam ist die Verbindung. Viele Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeigten einen niedrigen EC50-Wert von weniger als 0,9 mikromolar (Mikromol pro Liter). Emax lag bei allen aktiven Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bei mindestens 60 %, woraus ein zumindest dem Flupirtinmaleat annhähernd vergleichbarer Kaliumefflux zu erwarten ist; viele der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen Emax-Werte von mehr als 100 % auf, was einen stärkeren Kaliumefflux im Vergleich zum Flupirtinmaleat anzeigt.
  • Zur Beurteilung des hepatotoxischen Potentials einer Substanz wurde der IC50-Wert verwendet. Als IC50 wurde die Konzentration einer Verbindung definiert, bei welcher die Viabilität der Zellen auf 50 % sank. Aus dem Zusammenspiel der Ergebnisse von Kv7.2/3-Öffnungsaktivität und den Hepatotoxizitäts-Ergebnissen in vitro ist ersichtlich, dass insgesamt Verbindungen der allgemeinen Formel (I) die Wirkung der Referenzsubstanz Flupirtinmaleat deutlich übertreffen.
  • In einer Ausführungsform der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist n Null. In einer Ausführungsform der Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist m 1. In einer Ausführungsform der Verbindung ist X ein Stickstoffatom.
  • Der Rest R1 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C4- bis C6-, bevorzugt C4,-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C4- bis C6-, bevorzugt C4,-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Sauerstoffatom im Cyclus aufweist; wobei R1 weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NH2-Gruppe, Methylgruppe, NH(CH3)-Gruppe, Pyrrolidin-Gruppe und Morpholin-Gruppe, weiter bevorzugt Pyrrolidin-Gruppe.
  • Der Rest R2 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mono- oder Difluorphenyl-Gruppe; CF3-Phenyl-Gruppe; F5S-Phenyl-Gruppe; C4- bis C8-Cycloalkylgruppe, bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe oder Cyclopropyl-Gruppe; verzweigter oder unverzweigter C1 - bis C5-Alkylgruppe, bevorzugt 2-Propyl-Gruppe; Biphenyl-Gruppe; Pyridin-Gruppe; Piperidin-Gruppe; Tetrahydropyran-Gruppe; Dioxolan-Gruppe und Phenyl-Gruppe, wobei die Phenyl-Gruppe mindestens einen Substituenten R2a ausgewählt aus Wasserstoffatom und Methoxy-Gruppe aufweist; wobei R2 weiter bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus C4- bis C8-Cycloalkylgruppe, bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe, Cyclobutyl-Gruppe oder Cyclopropyl-Gruppe, weiter bevorzugt Cyclohexyl-Gruppe; und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe, bevorzugt 2-Propyl-Gruppe; wobei R2 weiter bevorzugt eine Cyclohexyl-Gruppe oder 2-Propyl-Gruppe ist.
  • Der Rest R3 ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethoxy-Gruppe, Propyl-Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p Null oder 1 oder 2 ist; wobei R3 weiter bevorzugt eine (CH2)p-Phenylgruppe ist, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p 1 oder 2 ist.
  • Der Rest R4 ist bevorzugt ein Wasserstoffatom, ein Bromatom oder eine Methyl-Gruppe, weiter bevorzugt ein Wasserstoffatom.
  • In einer Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist n Null; m ist 1; X ist ein Stickstoffatom, R1 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NH2-Gruppe, Methylgruppe, NH(CH3)-Gruppe, Pyrrolidin-Gruppe und Morpholin-Gruppe, bevorzugt Pyrrolidin-Gruppe; R2 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclohexyl-Gruppe und 2-Propyl-Gruppe; R3 ist eine -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und Methoxy-Gruppe aufweist, wobei p 1 oder 2 ist; und R4 ist ein Wasserstoffatom.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ia) auf:
    Figure DE102018212006B3_0003
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ib) auf:
    Figure DE102018212006B3_0004
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weist die Verbindung die Formel (Ic) auf:
    Figure DE102018212006B3_0005
  • Bei der Verbindung der Formel (Ic), welche die im experimentellen Teil beschriebene potenteste Substanz 11 ist, werden so niedrige Substanzkonzentrationen (0,0014 µmol pro Liter) zur Erreichung des halbmaximalen Effekts auf Kaliumkanäle benötigt, dass toxische Effekte bei der resultierenden Dosierung sehr unwahrscheinlich sind. Die ermittelten Toxizitätsdaten zeigen, dass bei den durch Löslichkeit im Testmedium limitierten Konzentrationen von 63 µmol pro Liter für Verbindung 11 keine toxischen Effekte beobachtet wurden und der IC50 daher als größer als 63 µmol pro Liter angegeben werden kann. Entsprechend ist das Verhältnis von IC50 zu EC50 mindestens 85-mal größer bei Substanz 11 als bei Flupirtinmaleat. Leberschädigungen während der Therapie sollten damit weniger wahrscheinlich sein. Auch der biologische Effekt der Testsubstanz sollte größer sein (z.B. stärkere Analgesie), da Emax bei über 100 % lag und somit ein stärkerer Kaliumefflux zu erwarten ist als mit Flupirtinmaleat.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),
    Figure DE102018212006B3_0006
    wobei R1, R2, R3, R4, X, n, m und p die gleiche Bedeutung haben wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert, umfassend:
    1. (i) Bereitstellen einer Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II)
      Figure DE102018212006B3_0007
      wobei R1, R2, R4, m und n die gleiche Bedeutung haben wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert;
    2. (ii) Umsetzen der Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß (i) mit einer Verbindung H-R3, wobei R3 die gleiche Bedeutung hat wie voranstehend zu den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) definiert, unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Verbindung der allgemeinen Formel (I), erhalten oder erhältlich nach einem Verfahren wie voranstehend beschrieben.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I)
    Figure DE102018212006B3_0008
    wobei
    • R1
    ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus, bevorzugt ein Stickstoff- oder Sauerstoffatom, aufweist;
    R2
    ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F), verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
    R3
    ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt F) und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind;
    R4
    ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom (F, Cl, Br, I, bevorzugt Br) und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe;
    X
    ein Stickstoffatom oder eine -CH- Gruppe ist;
    n
    Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist;
    m
    Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und
    p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
    zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Human- oder Veterinär-Arzneimittel, weiter bevorzugt als Human-, Kleintier- oder Heimtier-Arzneimittel.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Human- oder Veterinär-Arzneimittel, weiter bevorzugt als Human-, Kleintier- oder Heimtier-Arzneimittel sind eingangs beschrieben im Hinblick auf die Verbindung der allgemeinen Formel (I) selbst; das gleiche gilt für die entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Salze, d.h. auch für die pharmazeutisch akzeptablen Salze sind die die gleichen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wie eingangs beschrieben im Hinblick auf die Verbindung der allgemeinen Formel (I) selbst, bevorzugt; gleiches gilt auch für Verbindungen der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren. Besonders bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (la), oder eine Verbindung der Formel (Ib), oder eine Verbindung der Formel (Ic), eingesetzt, was auch die Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes umfasst; weiter bevorzugt wird eine Verbindung der Formel (Ic) eingesetzt, wobei dies ebenfalls die Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes umfasst.
  • Pharmazeutisch verträgliche Salze sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Berge et al. „Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977) beschrieben. „Pharmazeutisch verträgliches Salz“ bedeutet ein nicht-toxisches, organisches oder anorganisches Säureadditionssalz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei die Verbindung der allgemeinen Formel (I) im Säureadditionssalz in kationischer Form vorliegt. Das pharmazeutisch akzeptable Salz ist insgesamt neutral geladen.
  • Ein pharmazeutisch verträgliches Salz kann aus einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Das Salz kann in situ während der Isolation und Aufreinigung der Verbindung der allgemeinen Formel (I) hergestellt werden oder durch separate Reaktion einer aufgereinigten Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und anschließender Isolation des erzeugten Salzes.
  • Bevorzugt ist das Anion des pharmazeutisch akzeptablen Salzes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, lodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caprat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorobenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Terephthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, β-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalen-1-sulfonat, Naphthalen-2-sulfonat, Mandelat, Adipat, Alginat, Mucat, Aspartat, Benzolsulfonat, Butyrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Hexanoat, 2-Hydroxyethansulfonat, 2-Napthalensulfonat, Nicotinat, Nitrat, Palmitat, Pectinat, Persulfat, Picrat, Pivalat, Salicylat, Thiocyanat, Tosylat, Arginat und Undecanoat.
  • In einer Ausführungsform wird die Verbindung der allgemeinen Formel (I) als Säureadditionssalz in Form des Chlorids, Sulfats, Mesylats, Besylats, Tosylats oder des Mono-, Di- oder Tricarbonsäuresalzes eingesetzt, wobei die Mono-, Di- oder Tricarbonsäure bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fumarsäure, Malonsäure, Apfelsäure, Succinsäure, Milchsäure, Glycolsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Asparginsäure und Mandelsäure.
  • Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) wird allein oder als Mischung von zwei oder mehr Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt bzw. als pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder als Mischung von zwei oder mehr pharmazeutisch akzeptablen Salzen von Verbindungen der allgemeinen Formel (I). Gleichfalls können Mischungen aus einer oder mehreren Verbindung(en) der allgemeinen Formel (I) mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Salz(en) von Verbindung(en) der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung als Schmerzmittel.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen, bevorzugt bei der Behandlung oder Prävention von neonatalen Krampfzuständen.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben oder erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von Schmerzzuständen, zur Prävention oder Behandlung von Tinnitus oder zur Prävention oder Behandlung von Krampfzuständen umfassend die Verabreichung einer präventiv oder therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, Bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie, umfassend die Verabreichung einer präventiv oder therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung, welche zumindest anteilig mit einer Veränderung von Kv7.2/Kv7.3-K+-Kanälen einhergeht, umfassend die Verabreichung an einen Probanden (human oder Tier), welcher einer solchen Behandlung oder Prävention bedarf, einer therapeutisch oder präventiv aktiven Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).
  • Die Erfindung betrifft ebenso eine Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie voranstehend beschrieben, oder einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) erhalten oder erhältlich nach dem voranstehend beschriebenen Herstellungsverfahren oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung von Schmerzzuständen, zur Prävention oder Behandlung von Tinnitus oder zur Prävention oder Behandlung von Krampfzuständen oder zur Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.
  • Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter erläutert, ohne sie hierauf zu beschränken.
  • Beispiele
  • Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
  • Herstellung der Nitro-Vorstufen
  • 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin
  • Figure DE102018212006B3_0009
  • 10 mmol 6-Amino-5-nitropyridin-2-thiol (1.71 g) wurden in 40 ml DMF gelöst und 4,3 ml 3 M NaOH hinzugefügt. Der dunkelbraunen Lösung wurden 10 mmol 4-Fluorbenzylbromid zugesetzt und für 3 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Produkt durch Zugabe von 100 ml Wasser präzipitiert. Abschließend wurde das Produkt mit 200 ml Wasser und 200 ml n-Hexan gewaschen. Gelber Feststoff (Smp.: 139-141 °C). Ausbeute: 1,98 g (70,0 %). Rf= 0.35 (n-Hexan/Ethylacetat). 1H-NMR [ppm]: δ = 4,46 (s, 2H), 6,61 (d, 1H, J= 8,8 Hz), 7,13 (m, 2H), 7,53 (m, 2H), 8,15 (d, 1H, J= 8,8 Hz), 8,18 (bs, 2H). 13C-NMR [ppm]: δ = 32,2, 110,3, 115,1 (d, 2C, 2JC,F = 22 Hz), 123,5, 131,1 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 134,2 (d, 4JC,F = 3 Hz), 134,5, 153,1, 160,1 und 162,5 (d, 1JC,F = 242 Hz), 166,3. IR [cm-1]: ṽ= 1342, 1558, 3332, 3456.
  • weitere Nitro-Vorstufen
  • Weitere Thioether-Vorstufen wurden in analoger Weise gemäß der Synthese aus 1.1.1 synthetisiert. Tabelle 1 zeigt die jeweiligen Edukte und die daraus erhaltene Nitro-Verbindung. Tabelle 1
    Übersicht der synthetisierten Thioether-Vorstufen und der zur Synthese eigesetzten Edukte.
    Edukte Produkt
    Figure DE102018212006B3_0010
    Figure DE102018212006B3_0011
    Figure DE102018212006B3_0012
    Figure DE102018212006B3_0013
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    Figure DE102018212006B3_0039
    Figure DE102018212006B3_0040
    Figure DE102018212006B3_0041
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    Figure DE102018212006B3_0055
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    Figure DE102018212006B3_0058
    Figure DE102018212006B3_0059
    Figure DE102018212006B3_0060
    Figure DE102018212006B3_0061
    Figure DE102018212006B3_0062
    Figure DE102018212006B3_0063
  • Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
  • Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0064
  • In einem 3-Hals-Kolben wurden 3,65 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,02 g) mit 18,6 mmol SnCl2•2H2O (5,1 eq, 4,2 g) vorgelegt und in 40 ml Ethanol suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde unter Argon-Atmosphäre für 25 h auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurde auf 40 °C abgekühlt und 37,2 mmol Et3N (10,2 eq, 5,16 ml) sowie 4,6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,26 eq, 0,44 ml) hinzugefügt. Nach 30 min wurde die Temperatur auf 55 °C erhöht und für eine Stunde gehalten. Nach abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Ansatz über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Evaporation der organischen Phase und waschen des Rückstandes mit n-Hexan ergab das saubere Produkt. Farbloser Feststoff (Smp.: 138-140 °C). Ausbeute: 0,75 g (47 %). Rf= 0,83 (Cyclohexan/Ethanol/Et3N 6:2:2). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,29 (s, 2H), 5,94 (s, 2H), 6,43 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,07-7,12 (m, 2 H), 7,40-7,45 (m, 3H), 8,57 (m, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,6, 60,3, 109,3, 115,0 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 131,8, 135,0 (d, 4JC,F = 3 Hz), 150,2, 152,8, 154,4, 159,9 und 162,3 (d, 1JC,F = 243 Hz). IR [cm-1]: ṽ= 1454, 1678, 2984, 3145, 3260, 3403. HRMS: [C15H16N3O2FS + H]+ berechnet: 322,1020, gemessen: 322,1027.
  • Ethyl-[2-amino-6-(benzylthio)pyridin-3-yl]carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0065
  • 2,31 mmol 6-(Benzylthio)-3-nitropyridin-2-amin (0,60 g) wurden in einer Mischung aus 15 ml Wasser und 25 ml Isopropanol suspendiert. 6,93 mmol Eisenpulver (3 eq, 0,39 g) und 10,4 mmol NH4Cl (4,5 eq, 0,56 g) wurden hinzugefügt und die Suspension für 6 h zum Rückfluss erhitzt. Die resultierende dunkelbraune Mischung wurde filtriert und der Rückstand mit 50 ml Isopropanol gewaschen. Anschließend wurden 13,9 mmol Et3N (6,0 eq, 1,91 ml) und 5,54 mmol Chlorameisensäureethylester (2,4 eq, 0,53 ml) hinzugefügt. Zur Vervollständigung der Reaktion wurden nach einer sowie zwei Stunden jeweils 5,54 mmol Chlorameisensäureethylester hinzugefügt. Nach zusätzlichen 5 Stunden wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand in 100 ml Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit 2×100 ml Wasser und 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknung über Na2SO4 wurde das Rohprodukt mittels Flashchromatographie gereinigt (Mobile Phase: n-Hexan/Ethylacetat 7:3) und der resultierende braune Feststoff mit wenig eiskaltem Diethylether gewaschen. Hellblauer Feststoff (Smp.: 100-101 °C). Ausbeute: 0,23 g (33,0 %). Rf= 0.72 (Cyclohexan/Ethanol/Et3N 6:2:2). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,30 (s, 2H), 5,93 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,21 (t, 1H, J= 7,3 Hz), 7,28 (t, 2H, J= 7,3 Hz), 7,39-7,41 (m, 3H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 33,5, 60,3, 109,2, 115,2, 126,8, 128,3 (2C), 128,8 (2C), 131,8, 138,6, 150,5, 152,7, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 1457, 1681, 2975, 3140, 3281, 3405. HRMS: [C15H17N3O2S + H]+ berechnet: 304,1114, gemessen: 304,1099.
  • Ethyl-{2-amino-6-[(3,4-difluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0066
  • 5 mmol 6-[(3,4-Difluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,49 g) wurden in einer Mischung aus 30 ml Wasser und 50 ml Isopropanol suspendiert. 15 mmol Eisenpulver (3,0 eq, 0,84 g) und 22,5 mmol NH4Cl (4,5 eq, 1,2 g) wurden hinzugefügt und die Mischung für 3,5 h zum Rückfluss erhitzt. Die resultierende Suspension wurde filtriert und der Rückstand mit 100 ml Isopropanol gewaschen. 15 mmol Et3N (3,0 eq, 2,07 ml) sowie 6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,2 eq, 0,57 ml) wurden zur Lösung gegeben und für 2 h bei 40 °C gerührt. Zur Vervollständigung der Reaktion wurden weitere 5,5 mmol Chlorameisensäureethylester sowie 5 mmol Et3N hinzugefügt. Nach weiteren 5 h wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in 100 ml Ethylacetat aufgenommen und mit 2×100 ml Wasser sowie 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Das Rohprodukt wurde mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: n-Hexan/Ethylacetat 7:3) aufgereinigt. Farbloser Feststoff (Smp.: 137-140 °C).
  • Ausbeute: 0,95 g (56,0 %). Rf= 0,39 (n-Hexane/Ethylacetate 7:3). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,29 (s, 2H), 5,99 (s, 2H), 6,42 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,24-7,36 (m, 2H), 7,40 (d, 1H, J= 6,3 Hz), 7,45-7,50 (m, 1H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,2, 60,4, 109,3, 115,3, 117,1 (d, 2JC,F = 17 Hz), 117,8 (d, 2JC,F = 17 Hz), 125,7 (dd, 3JC,F = 6 Hz, 4JC,F = 3 Hz), 132,0, 137,0 (dd, 3JC,F = 6 Hz, 4JC,F = 4 Hz), 147,2 und 149,6 (dd, 1JC,F = 245 Hz, 2JC,F = 13 Hz). 147,8 und 150,2 (dd, 1JC,F = 245 Hz, 2JC,F = 13 Hz), 152,9, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 1203, 1454, 1510, 1674, 2991, 3149, 3272, 3396. HRMS: [C15H15N3O2F2S + H]+ berechnet: 340,0926, gemessen: 340,0919.
  • Ethyl-(2-amino-6-{[4-(trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0067
  • In einem 3-Hals-Kolben wurden 1.52 mmol 3-Nitro-6-{[4-(trifluormethyl)benzyl]thio}pyridin-2-amin (0,50 g) sowie 7,9 mmol SnCl2•2H2O (5,2 eq, 1,79 g) vorgelegt und in 20 ml Ethanol suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde unter Argon-Atmosphäre für 23 h auf 70 °C erhitzt. Anschließend wurde der Ansatz auf 40 °C abgekühlt und 15,4 mmol Et3N (10,2 eq, 2,14 ml) sowie 1,9 mmol Chlorameisensäureethylester (1,27 eq, 0,18 ml) hinzugefügt. Nach 30 min wurde die Temperatur auf 55 °C erhöht und für eine weitere Stunde gerührt. Nach anschließendem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand in DCM aufgenommen. Nach waschen der organischen Phase mit Wasser und anschließender Trocknung über Na2SO4 wurde das Lösemittel im Teilvakuum entfernt und der Rückstand mit n-Hexan gewaschen. Farbloser Feststoff (Smp.: 166-168 °C). Ausbeute: 0,42 g (74,0 %). Rf= 0,58 (n-Hexan/Ethylacetate 7:3). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,39 (s, 2H), 5,97 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,41 (d, 1H, J= 5,6 Hz), 7,64 (s, 4H), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,8, 60,4, 109,3, 115,3, 122,9 and 125,6, 125,1 (q, 2C, 4JC,F = 4 Hz), 127,4 (q, 2JC,F = 32 Hz), 129,6 (2C), 131,8, 144,1, 149,6, 152,7, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 1113, 1460, 1685, 2980, 3174, 3307, 3423. HRMS: [C16H16N3O2F3S + H]+ berechnet: 372,0988, gemessen: 372,0970.
  • Ethyl-(2-amino-6-{[4-(pentafluor-A6-sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0068
  • 2 mmol 3-Nitro-6-((4-(pentafluor-λ6-sulfanyl)benzyl)thio)pyridin-2-amin (0,78 g) wurden in einer Mischung aus 12 ml Wasser und 20 ml Isopropanol suspendiert. Nach Zugabe von 6 mmol Eisenpulver (3,0 eq, 0,34 g) und 9 mmol NH4Cl (4,5 eq, 0,48 g) wurde für 2 h zum Rückfluss erhitzt. Die Suspension wurde anschließend filtriert und der Rückstand mit 100 ml Isopropanol gewaschen. Dem Filtrat wurden 10 mmol Et3N (5 eq, 1.38 ml) und 2,4 mmol Chlorameisensäureethylester (1,2 eq, 0,23 ml) zugegeben und der Ansatz auf 40 °C erhitzt. Nach 1,5 h wurden erneut 2,4 mmol Chlorameisensäureethylester hinzugefügt und für weitere 7 h gerührt. Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in 50 ml Ethylacetat aufgenommen und mit 2x50 ml Wasser sowie 50 ml gesättigte Kochsalzlösung gewaschen. Das Rohprodukt wurde anschließend mittels Flashchromatographie (Mobile Phase n-Hexan/Ethylacetat 7:3). Blauer Feststoff (Smp.: 157-158 °C). Ausbeute: 0,45 g (52,4 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,22 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,09 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,39 (s, 2H), 5,97 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J= 6,1 Hz), 7,64 (d, 2H, J= 8,5 Hz),7,80 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 8,57 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,5, 32,2, 60,3, 109,3, 115,4, 125,7 (t, 2C, 3JC,F = 5 Hz), 129,7 (2C), 131,9, 144,2, 149,4, 151,3 (q, 2JC,F = 15 Hz), 152,8, 154,4. IR [cm-1]: ṽ= 827, 1076, 1218, 1461, 1507, 1649, 1693, 2992, 3163, 3325, 3392. HRMS: [C15H16N3O2F5S2 + H]+ berechnet: 430,0677, gemessen: 430,0684.
  • N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid
  • Figure DE102018212006B3_0069
  • 1 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,28 g) wurden in 15 ml Isopropanol suspendiert und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 5 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol Buttersäurechlorid (1,2 eq, 0,12 ml) in 2 ml Ethylacetat über 10 min topfenweise hinzugefügt. Nach 2 h wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt, in wenig Isopropanol gelöst und mit Wasser präzipitiert. Der Feststoff wurde abfiltriert, aus DCM umkristallisiert und mit wenig n-Hexan gewaschen. Hellgelber Feststoff (Smp.: 163-164 °C). Ausbeute: 0,11 g (34,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,91 (t, 3H, J= 7,4 Hz), 1,60 (se, 2H, J= 7,4 Hz), 2,28 (t, 2H, J= 7,4 Hz), 4,30 (s, 2H), 5,90 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,10 (m, 2H), 7,44 (m, 2H), 7,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 8,98 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 13,6, 18,5, 32,6, 37,7, 109,2, 115,0 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, 3JC.F = 8 Hz), 132,7, 135,0 (d, 4JC,F = 3 Hz), 150,6, 152,9, 159,9 und 162,3 (d, JC,F = 243 Hz), 171,5. IR [cm-1]: ṽ= 753, 1208, 1456, 1504, 1589, 1650, 2960, 3147, 3334. HRMS: [C16H18N3OFS + H]+ berechnet: 320,1227, gemessen: 320,1232.
  • N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}pivalinsäureamid
  • Figure DE102018212006B3_0070
  • 1 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 4,5 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,3 mmol Pivalinsäurechlorid (1,3 eq, 0,16 ml) in 2 ml THF über 10 min topfenweise hinzugefügt. Nach 2 h wurde der Katalysator abfiltriert und das Produkt durch Zugabe von Wasser präzipitiert. Der Feststoff wurde abfiltriert und aus Toluen umkristallisiert. Hellgelbe Plättchen (Smp.: 165-166 °C). Ausbeute: 0,17 g (53,3 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,21 (s, 9H), 4,32 (s, 2H), 5,70 (s, 2H), 6,47 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 7,08-7,12 (m, 2H), 7,20 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 7,43-7,47 (m, 2H), 8,68 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 27,3 (3C), 32,5, 109,5, 115,0 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 115,2, 130,7 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 135,0 (d, 4JC,F = 4 Hz), 151,6, 154,4, 159,6 und 162,3 (d, 1JC,F = 243 Hz), 177,0. IR [cm-1]: ṽ= 753, 1220, 1440, 1504, 1590, 1647, 2960, 3181, 3381. HRMS: [C17H20N3OFS + H]+ berechnet: 334,1384, gemessen: 334,1388.
  • N-{2-Amino-6-[(cyclohexylmethyl)thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid
  • Figure DE102018212006B3_0071
  • 2 mmol 6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amine (0,53 g) wurden in 20 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Die Suspension wurde auf 0 °C abgekühlt und 1,4 mmol Et3N (2,8 eq, 0,39 ml) zugesetzt. Anschließend wurde eine Lösung von 2,4 mmol Buttersäurechlorid (1,2 eq, 0,25 ml) in 2 ml THF über 10 min tropfenweise hinzugefügt. Nach 3 h wurde der Reaktionsansatz filtriert und dem Filtrat 120 ml Wasser zugesetzt. Das Produkt wurde abfiltriert und zwei Mal aus Toluen umkristallisiert. Hellgelber Feststoff (Smp.: 107-109 °C). Ausbeute: 0,11 g (18,7 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,91 (t, 3H, J= 7,4 Hz), 0,97 (m, 2H), 1,10-1,23 (m, 3H), 1,48 (m, 1H), 1,59 (se, 2H, J= 7,3 Hz), 1,65-1,68 (m, 3H), 1,81 (d, 2H, J= 11,4 Hz), 2,28 (t, 2H, J= 7,4 Hz), 2,94 (d, 2H, J= 6,6 Hz), 5,79 (s, 2H), 6,43 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,42 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 9,00 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 13,6, 18,5, 25,5 (2C), 25,9, 32,1 (2C), 36,4, 37,5, 37,7, 109,2, 114,8, 132,7, 151,9, 152,9, 171,4. IR [cm-1]: ṽ= 1227, 1454, 1504, 1588, 1644, 2849, 2925, 3157, 3319, 3395. HRMS: [C16H25N3OS + H]+ berechnet: 308,1791, gemessen: 308,1797.
  • 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-N-[6-(isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0072
  • 1 mmol 6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 0,5 h gerührt. Anschließend wurde die Suspension auf 0 °C abgekühlt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)acetylchlorid (0,26 g) in 1,5 ml DCM über 15 min zugetropft. Nach 3 h wurden der Mischung 100 ml Wasser zugesetzt und mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 2×100 ml Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen sowie über Na2SO4 getrocknet. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt woraufhin ein grünes Öl zurückblieb. Dieses kristallisierte bei Lagerung im Kühlschrank aus und konnte anschließend aus Methanol umkristallisiert werden. Leicht grünliche Nadeln (Smp.: 137-138 °C). Ausbeute: 0,09 g (19,8 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,97 (d, 6H, J= 6,7 Hz), 1,77 (t, 4H, J= 6,6 Hz), 1,87 (sep, 1H, J= 6,7 Hz), 2,99 (d, 2H, J = 6,7 Hz), 3,37 (t, 4H, J= 6,6 Hz), 3,51 (s, 2H), 3,73 (s, 6H), 6,39 (t, 1H, J= 2,3 Hz), 6,48 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 6,50 (d, 2H, J= 2,4 Hz), 7,12 (d, 1H, J= 7,9 Hz), 9,39 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 21,7 (2C), 24,9 (2C), 28,4, 37,5, 42,9, 48,1 (2C), 55,1 (2C), 98,4, 107,2 (2C), 109,4, 114,5, 137,8, 137,9, 152,8, 153,9, 160,3 (2C), 169,5. IR [cm-1]: ṽ= 1054, 1148, 1203, 1439, 1515, 1594, 1649, 2863, 2959, 3256. HRMS: [C23H31N3O3S + H]+ berechnet: 430,2159, gemessen: 430,2171.
  • N-{6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl}-2-(3,5-dimethoxyphenyl)acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0073
  • 1 mmol 6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,32 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1,2 mmol 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)acetylchlorid (0,26 g) in 1,5 ml DCM über 15 min zugetropft. Nach 1 h wurde die Suspension filtriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und mit Wasser, gesättigter NaHCO3-Lösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und nach entfernen des Lösemittels aus Methanol umkristallisiert. Das Produkt wurde anschließend mittels präparativer HPLC aufgereinigt (Gradient: 50-90 % Methanol/Wasser, selbstgepackte C18-Säule). Dabei präzipitierte das Produkt nachdem der Methanol am Rotationsverdampfer entfernt wurde. Farbloser Feststoff (Smp.: 142-144 °C). Ausbeute: 0,04 g (8,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,95-0,98 (m, 2H), 1,09-1,24 (m, 5H), 1,55-1,82 (m, 10H), 2,98 (d, 2H, J= 5,8 Hz), 3,37 (m, 4H), 3,51 (s, 2H), 3,73 (s, 6H), 6,39-6,50 (m, 4H), 7,11 (d, 1H, J= 7,6 Hz), 9,39 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 24,9 (2C), 25,6 (2C), 25,9, 32,1 (2C), 36,0, 37,7, 42,9, 48,1 (2C), 55,1 (2C), 98,4, 107,2 (2C), 109,4, 114,4, 137,8, 137,9, 152,9, 153,9, 160,3 (2C), 169,6. IR [cm-1]: ṽ= 1064, 1142, 1200, 1446, 1517, 1589, 1650, 2848, 2919, 3243. HRMS: [C26H35N3O3S + H]+ berechnet: 470,2472, gemessen: 470,2485.
  • 3-(3,5-Difluorphenyl)-N-[6-(isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propionsäureamid
  • Figure DE102018212006B3_0074
  • 1 mmol 6-(Isobutylthio)-3-nitro-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin (0,28 g) wurden in 10 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 1 h gerührt. Dem Ansatz wurden 1,4 mmol Et3N (1,4 eq, 0,2 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 1 mmol 3-(3,5-difluorphenyl)propanoylchlorid (1,0 eq, 0,20 g) in 1,1 ml DCM über 10 min hinzugefügt. Nach 30 min wurde der Katalysator abfiltriert, dem Reaktionsansatz 100 ml Wasser zugesetzt und das Produkt mit 100 ml Diethylether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 100 ml Wasser, 100 ml gesättigter NaHCO3-Lösung und 100 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach trocknen der Etherphase über Na2SO4 und Evaporation des Lösemittels resultierte ein grüngefärbter Feststoff welcher aus einer Ethanol/Wasser-Mischung (9:1) umkristallisiert wurde. Farbloser Feststoff (Smp.: 138-140 °C). Ausbeute: 0,17 g (40,6 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,97 (d, 6H, J= 6,7 Hz), 1,77 (t, 4H, J= 6,6 Hz), 1,87 (sep, 6,7 Hz), 2,62 (t, 2H, J= 7,3 Hz), 2,92 (t, 2H, J= 7,3 Hz), 2,99 (d, 2H, J= 6,6 Hz), 3,32 (t, 4H, J= 6,6 Hz, 6,48 (d, 1H, J= 7,8 Hz), 6,97-7,08 (m, 3H), 7,06 (d, 1H, J= 7,8 Hz), 9,26 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 21,7 (2C), 25,0 (2C), 28,4, 30,2, 36,2, 38,9, 48,1 (2C), 101,4 (t, 2JC,F = 26 Hz), 109,4, 111,6 (dd, 2C, 2JC,F = 18 Hz, 3JC,F = 6 Hz), 114,4, 137,8, 146,0 (t, 3JC,F = 9 Hz), 152,7, 154,0, 160,0 und 163,5 (dd, 2C 1JC,F = 246 Hz, 3JC,F = 14 Hz), 170,7. IR [cm-1]: ṽ= 849, 1110, 1232, 1449, 1515, 1592, 1643, 2845, 2961, 3267. HRMS: [C22H27N3OF2S + H]+ berechnet:420,1916, gemessen: 420,1904.
  • N-{2-Amino-6-[(cyclopropylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-3-(3,5-difluorphenyl)propionsäureamid
  • Figure DE102018212006B3_0075
  • 2 mmol 6-[(Cyclopropylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,45 g) wurden in 20 ml THF gelöst und eine Spatelspitze Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe eines Ballons unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und intensiv für 3 h gerührt. Dem Ansatz wurden 2,8 mmol Et3N (1,4 eq, 0,39 ml) zugesetzt und anschließend eine Lösung von 2 mmol 3-(3,5-difluorphenyl)propanoylchlorid (1,0 eq, 0,40 g) in 2,2 ml DCM über 10 min hinzugefügt. Nach 1 h wurde der Katalysator abfiltriert und die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt. Der resultierende grüne Feststoff wurde zwei Mal aus einer Ethanol/Wasser-Mischung (8:2) umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 122-125 °C). Ausbeute: 0,24 g (33,1 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 0,24-0,28 (m, 2H), 0,49-0,54 (m, 2H), 1,02-1,11 (m, 1H), 2,66 (t, 2H, J= 15,3), 2,94 (t, 2H J= 15,2 Hz), 2,99 (d, 2H, J= 7,0 Hz), 5,81 (s, 2H), 6,44 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,00-7,07 (m, 3H), 7,37 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 9,03. 13C-NMR [ppm]: δ = 5,5 (2C), 10,8, 30,4, 34,9, 36,4, 101,4 (t, 2JC,F = 26 Hz), 109,1, 111,4 (dd, 2C, 2JC,F = 18 Hz, 3JC,F = 6 Hz), 114,5, 132,8, 145,9 (t, 3JC,F = 9 Hz), 152,2, 153,1, 161,1 und 163,5 (dd, 2C, 1JC,F = 246 Hz, 3JC,F = 14 Hz), 170,4. IR [cm-1]: ṽ= 771, 832, 968, 1114, 1463, 1523, 1592, 1639, 3091, 3154, 3283, 3465. HRMS: [C18H19N3OF2S + H]+ berechnet: 364,1290, gemessen: 364,1282.
  • Ethyl-{2-amino-5-brom-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0076
  • 0,5 mmol Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat (0,17 g) wurden in einer Mischung aus 5 ml THF und 5 ml ACN gelöst, 0,05 mmol Ammoniumacetat (0,1 eq, 0,004 mg) zugesetzt und der Reaktionsansatz auf 0 °C abgekühlt. Portionsweise wurden anschließend 0,5 mmol N-Bromsuccinimid (1 eq, 0,09 g) hinzugefügt. Nach 2h wurde die Suspension am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohprodukt mittels MPLC (Gradient: 0-100 % Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das resultierende Produkt wurde anschließend aus DCM umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 171-173 °C). Ausbeute: 0,06 g (28,5 %). 1H-NMR [ppm]: δ = 1,23 (t, 3H, J= 7,1 Hz), 4,11 (q, 2H, J= 7,1 Hz), 4,33 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 7,07-7,11 (m, 2H), 7,47-7,50 (m, 2H), 7,71 (s, 1H), 8,73 (s, 1H). 13C-NMR [ppm]: δ = 14,4, 32,9, 60,6, 101,2, 114,9 (d, 2C, 2JC,F = 21 Hz), 116,2, 131,0 (d, 2C, 3JC,F = 8 Hz), 133,5, 135,1 (d, 4JC,F = 3 Hz), 151,4, 154,3, 159,9 und 162,3 (d, 1JC,F = 243 Hz). IR [cm-1]: ṽ= 755, 837, 1054, 1217, 1265, 1434, 1505, 1608, 1664, 2985, 3244, 3362, 3470. HRMS: [C15H15N3O2FSBr+ H]+ berechnet: 400,0125, gemessen: 400,0113.
  • Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]-5-methylphenyl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0077
  • 1,75 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl(thio]-5-methyl-3-nitropyridin-2-amin (0,51 g) wurden zusammen mit 17,5 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,95 g) und 17,5 mmol NH4Cl (0,94 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 4 h zum Rückfluss erhitzt und anschließend über Kieselgur filtriert. Der Rückstand wurde mit 50 ml Ethylacetat gewaschen und dem Filtrat 50 ml Wasser zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit 2x50 ml Ethylacetat extrahiert. Den vereinten organischen Phasen wurden 17,5 mmol Et3N (10 eq, 2,4 ml) sowie 2,21 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,21 ml) zugesetzt und die Lösung bei 40 °C über Nacht gerührt. Die resultierende Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan/0,1 % Et3N). Farbloser Feststoff (Smp: 114-115 °C). Ausbeute: 0.08 g (22,14%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,56 (s, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,10 (m, 2H), 5,70 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,04 Hz, 2H), 1,98 (s, 3H), 1,25 (t, J= 6,96 Hz, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 162,2 (d, J= 243 Hz, 1C), 154,5, 135,6 (d, J= 3 Hz, 1C), 131,0 (d, J= 8 Hz, 2C), 117,0, 115,0 (d, J= 21 Hz, 2C), 60,3, 31,8, 16,6, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3446, 3355, 3287, 1679, 1509, 1442, 1259, 1219, 1083. HRMS: [C16H18N3O2FS + H]+ berechnet: 3336,1177, gemesssen: 336,1171.
  • Ethyl-{6-[(4-fluorbenzyl)thio]-2-methylpyridin-3-yl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0078
  • 1,8 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-2-methyl-3-nitropyridin (0,50 g) und 9 mmol SnCl2•2H2O (5 eq, 2,03 g) wurden in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C über Nacht gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C abgesenkt und 18,36 mmol Et3N (10,2 eq, 2,56 ml) sowie 2,34 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,22 ml) zugesetzt. Nach 3 h wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 30 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und das Produkt durch Wasserzugabe präzipitiert. Beiger Feststoff (Smp.: 102-103 °C); Ausbeute: 0.6 g (84%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,99 (s, 1H), 7,60 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,13 (m, 3H), 4,36 (s, 2H), 4,13 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 2,40 (s, 3H), 1,25 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 162,3 (d, J= 243 Hz, 1C), 154,4, 152,0, 134,7 (d, J= 3 Hz, 1C), 132,8, 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 129,5, 119,5, 115,1 (d, J=21 Hz, 2C), 60,43, 32,8, 20,8, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3284, 2980, 1689, 1509, 1442, 1250, 1061; HRMS: [C16H17N2O2FS + H]+ berechnet: 321.1068, gemessen: 321.1060.
  • N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}-3,4-difluorbenzamid
  • Figure DE102018212006B3_0079
  • 5 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (1,40 g) wurden zusammen mit 50 mmol Eisenpulver (10 eq, 2,80 g) und 50 mmol NH4Cl (10 eq, 2,68 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt und anschließend über Kieselgur filtriert. Dem Filtrat wurden 50 ml Wasser zugesetzt und mit 2x50 ml Ethylacetat extrahiert. Der organischen Phase wurden 7,5 mmol Et3N (1,5 eq, 1,05 ml) zugesetzt und die Lösung auf 0 °C abgekühlt. 5 mmol 3,4-Difluorbenzoylchlorid (1 eq, 0,63 ml) wurden tropfenweise über 30 min zugegeben und die Mischung anschließend für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Durch Aufkonzentration der Lösung am Rotationsverdampfer und Lagerung im Kühlschrank präzipitierte das Produkt und konnte abschließend aus DCM umkristalllisiert werden. Farbloser Feststoff (Smp.: 150-151 °C). Ausbeute: 0.68 g (35%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,64 (s, 1H), 8,08 (m, 1H), 7,86 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 7,63 (m, 1H), 7,56 (m, 2H), 7,34 (d, 1H), 7,13 (m, 2H), 6,49 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 6,09 (s, 2H), 4,34 (s, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 167,3, 162,3 (d, J= 241 Hz, 1C), 154,6, 152,5, 150,3, 147,8, 135,2, 135,0 (d, J= 3 Hz, 1C), 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 125,4, 117,5 (d, J= 9 Hz, 1C), 117,3 (d, J= 9 Hz, 1C), 115,1 (d, J= 21 Hz, 2C), 114,1, 109,0 , 32,5; IR [cm-1]: ṽ= 3396, 3298, 3150, 1629, 1504, 1462, 1226, 750; HRMS: [C19H14N3OF3S + H]+ berechnet: 388.0737, gemessen: 388.0747.
  • Ethyl-(6-{[(1,1'-biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-2-aminopyridin-3-yl)carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0080
  • 2 mmol 6-{[(1,1'-Biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-3-nitropyridin-2-amin (0,68 g) wurden zusammen mit 10 mmol SnCl2•2H2O (2,26 g) in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 24 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C reduziert und 20,4 mmol Et3N (10,2 eq, 2,85 ml) sowie 2,6 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,25 ml) zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht gerührt und die Suspension anschließend über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer aufkonzentriert und das Produkt durch Wasserzugabe gefällt. Abschließend wurde aus DCM umkristallisiert. Beiger Feststoff (Smp.: 165-167 °C); Ausbeute: 0.3 g (38 %); 1H NMR [ppm]: δ= 8,58 (s, 1H), 7,65 (m, 2H), 7,60 (m, 2H), 7,50 (m, 5H), 7,56 (m, 1H), 6,48 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,96 (s, 2H), 4,35 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 154,9, 154,2, 152,0, 139,6, 139,5, 130,8 (2C), 129,9, 128,9 (2C), 127,5, 126,5 (2C), 126,4 (2C), 120,1, 108,6, 60,6, 58,7, 14,4; IR [cm-1]: ṽ= 3484, 3290, 3161, 1703, 1622, 1460, 1219, 1065, 747; HRMS: [C21H21N3O2S - H]- berechnet: 378,1282, gemessen: 378,1272.
  • Ethyl-{2-amino-6-[(3,5-dimethoxybenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0081
  • 2,5 mmol 6-[(3,5-Dimethoxybenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,80 g) wurden zusammen mit 12,5 mmol SnCl2•2H2O (5 eq, 2,82 g) in 20 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C über Nacht gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C gesenkt und der Suspension 25,5 mmol Et3N (10,2 eq, 3,5 ml) sowie 3,25 mmol Chlorameisensäureethylester (1,3 eq, 0,31 ml) zugesetzt. Nach 4 h wurde der Reaktionsansatz über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 60 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das Produkt wurde abschließend in wenig Ethanol gelöst und durch Wasserzugabe präzipitiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 84-85 °C); Ausbeute = 0.46 g (52%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,57 (bs, 1H), 7,41 (d, J= 5,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J= 2,1 Hz, 2H), 6,44 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,34 (t, 1H), 5,94 (s, 2H), 4,22 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,70 (s, 6H), 1,24 (t, J= 7,0 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 160,2 (2C), 154,4, 152,8, 150,4, 140,9, 131,8, 115,2, 109,4, 106,7 (2C), 98,7, 60,3, 55,1 (2C), 33,7, 14,5; IR: ṽ= 3475, 3285, 3163, 2935, 1685, 1598, 1520, 1460, 1202, 1148, 1057 cm-1; HRMS: [C17H21N3O4S + H]+ berechnet: 364.1326, gemessen: 364.1317.
  • Ethyl-{2-amino-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0082
  • 1 mmol 3-Nitro-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-2-amin (0,26 g) wurden zusammen mit 4,6 mmol SnCl2•2H2O (4,6 eq, 1,04 g) in 10 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 22 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C abgesenkt und 10,2 mmol Et3N (10,2 eq, 1,4 ml) sowie 1,3 mmol Chlorameisensäureethylester (0,12 ml) zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde über Nacht gerührt und anschließend über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit Wasser versetzt und mit DCM extrahiert. Die organische Phase wurde evaporiert und der Rückstand mittels Flashchromatographie aufgereinigt. Brauner Feststoff (Smp.: 129-131 °C); Ausbeute: 0.09 g (30%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,57 (s, 1H), 8,49 (d, J= 4,3 Hz, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,50 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 7,41 (d, J= 6,0 Hz, 1H), 7,25 (m, 1H), 6,49 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,94 (s, 2H), 4,39 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 158,2, 154,5, 152,8, 150,3, 149,0, 136,7, 131,9, 130,1, 123,1, 122,1, 115,2, 109,2, 60,4, 45,6, 35,7, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3361, 3227, 2979, 2929, 1721, 1524, 1456, 1245, 1221, 1071; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 305.1067, gemessen: 305.1061.
  • Ethyl-(2-amino-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat
  • Figure DE102018212006B3_0083
  • 1 mmol 3-Nitro-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-2-amin (0,28 g) wurden zusammen mit 4,6 mmol SnCl2•2H2O (4,6 eq, 1,02 g) in 10 ml Ethanol suspendiert und unter Argon-Atmosphäre bei 70 °C für 25 h gerührt. Anschließend wurde die Temperatur auf 40 °C gesenkt und 10,2 mmol Et3N (10,2 eq, 1,4 ml) sowie 2,6 mmol Chlorameisensäureethylester (2,6 eq, 0,24 ml) zugesetzt. Die Suspension wurde für weitere 3 h gerührt, anschließend über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 60 ml Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt und mit DCM extrahiert. Die organische Phase wurde abschließend evaporiert. Brauner Feststoff (Smp.: 136-137 °C); Ausbeute: 0.1 g (32%); 1H NMR [ppm]: δ= 8,55 (s, 1H), 7,40 (d, J= 6.1 Hz, 1H), 6,44 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 5,82 (s, 2H), 4,12 (q, J= 7,1 Hz, 2H), 3,14 (q, J= 8,8 Hz, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,38 (m, 4H), 1,51 (m, 4H), 1,39 (m, 2H), 1,24 (t, J= 7,1 Hz, 3H); 13C NMR [ppm]: δ= 154,5, 152,8, 151,1, 131,9, 114,9, 109,3, 60,3, 58,2, 53,8 (2C), 26,9, 25,5 (2C), 24,0, 14,5; IR [cm-1]: ṽ= 3341, 3212, 2934, 1713, 1530, 1452, 1214, 1065; HRMS-ESI m/z [C15H24N4O2S +H]+ berechnet: 325.1693, gemessen: 325.1698.
  • N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorpheny)acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0084
  • 1,5 mmol 6-[(4-Fluorbenzyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,42 g) wurden zusammen mit 15 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,84 g) und 15 mmol NH4Cl (10 eq, 0,81 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für eine Stunde zum Rückfluss erhitzt, anschließend über ein Papierfilter filtriert und der Rückstand mit 75 ml Ethylacetat gewaschen. Dem Filtrat wurden 1,5 mmol Et3N (1 eq, 0,21 ml) sowie 2 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid zugesetzt und für 1 h bei 40 °C gerührt. Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Abschließend wurde aus Ethanol umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp: 166-167 °C). Ausbeute: 0.08 g (21,4%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,29 (s, 1H), 7,46 (m, 2H), 7,40 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 7,12 (m, 5H), 6,44 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 6,00 (s, 2H), 4,31 (s, 2H), 3,71 (s, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,5, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 240 Hz, 2C), 162,3, 159,9, 153,3, 151,4, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 135,0 (d, J= 3 Hz, 1C), 133,2, 130,8 (d, J= 8 Hz, 2C), 115,1 (d, J= 21 Hz, 2C), 114,6, 112,7 (dd, J= 7 Hz, J= 18 Hz, 2C), 109,1, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,8, 32,5; IR [cm-1]: ṽ= 3404, 3179, 1644, 1505, 1454, 1223, 1119, 839; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 404,1039, gemessen: 404,1038.
  • N-[6-(Benzylthio)-2-(methylamino)pyridin-3-yl]-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0085
  • 2,8 mmol 6-(Benzylthio)-N-methyl-3-nitropyridin-2-amin (0,77 g) wurden zusammen mit 28 mmol Eisenpulver (10 eq, 1,57 g) und 28 mmol NH4Cl (10 eq, 1,50 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 2 h zum Rückfluss erhitzt, die Suspension anschließend über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 2x50 ml Ethylacetat gewaschen. 50 ml Wasser wurden zugesetzt und die Phasen getrennt. Die wässrige Phase wurde mit 2x50 ml Ethylacetat extrahiert und den vereinten organischen Phasen wurden 5,6 mmol HATU (2 eq, 2,10 g) sowie 2,8 mmol 2,6-Dichlorphenylessigsäure (1 eq, 0,60 g) zugesetzt und die Mischung bei 40 °C über Nacht gerührt. Die Suspension wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Das Rohprodukt wurde in wenig Ethanol gelöst und durch Wasserzugabe präzipitiert. Lavendelfarbener Feststoff (Smp.: 201-202 °C); Ausbeute: 0.08 g (8%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,25 (s, 1H), 7,40 (m, 2H), 7,30 (m, 4H), 7,13 (m, 3H), 6,41 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 6,23 (d, J= 4,6 Hz, 2H), 4,38 (s, 2H), 3,70 (s, 2H), 2,89 (d, J= 4,6 Hz, 2H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,7, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 244 Hz, 2C), 153,2, 151,6, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 138,9, 133,2, 128,6 (2C), 128,3 (2C), 126,8, 115,1, 112,7 (dd, J= 6 Hz, J= 17 Hz, 2C), 107,9, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,8, 33,3, 27,9; IR [cm-1]: ṽ= 3442, 3404, 3269, 1652, 1591, 1496, 1389, 1230, 1119, 991, 696; HRMS: [C14H16N4O2S - H]- berechnet: 398.1144, gemessen: 398.1157.
  • N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)-acetamid
  • 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid
  • Figure DE102018212006B3_0086
  • 10 mmol 3,5-Difluorphenylessigsäure (1,72 g) wurden in 15 ml trockenem DCM gelöst und unter Stickstoffatmosphäre 11 mmol Oxalylchlorid (1,1 eq, 0,93 ml) hinzugefügt. Dem Reaktionsansatz wurden vorsichtig 4 Tropfen trockenes DMF zugesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde ohne weitere Aufreinigung für weitere Reaktionen eingesetzt.
  • N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0087
  • 0,8 mmol 3-Nitro-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-2-amin (0,22 g) wurden zusammen mit 8 mmol Eisenpulver (10 eq, 0,45 g) und NH4Cl (10 eq, 0,43 g) in einer Mischung aus 12 ml Ethanol und 3 ml Wasser suspendiert. Der Reaktionsansatz wurde für 3 h zum Rückfluss erhitzt, die Suspension anschließend über ein Papierfilter filtriert und der Rückstand mit 50 ml Ethylacetat gewaschen. Dem Filtrat wurden 1,5 mmol Et3N (1,9 eq, 0,17 ml) und 1,2 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid aus (a) zugesetzt. Die Lösung wurde für 1,5 h auf 40 °C erwärmt und anschließend im Rotationsverdampfer eingeengt. Das Produkt wurde abschließend mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Farbloser Feststoff (Smp.: 136-137 °C). Ausbeute: 0.21 g (54%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,27 (s, 1H), 7,38 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,44 (d, J= 7,96 Hz, 1H), 5,91 (s, 2H), 3,87 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,40 (m, 3H), 3,21 (m, 2H), 1,78 (m, 7H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,5, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 244 Hz, 2C), 153,3, 152,1, 140,4 (t, J= 10 Hz, 1C), 133,3, 114,3, 112,7 (dd, J= 7 Hz, J= 19 Hz, 2C), 109,1, 102,2 (t, J= 26 Hz, 1C), 76,4, 67,5, 41,8, 34,9, 30,6, 25,4, 22,7; IR [cm-1]: ṽ= 3305, 3180, 2940, 1645, 1463, 1114, 671; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 394,1395, gemessen: 394,1390.
  • N-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-2-morpholinopyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0088
  • 2 mmol 4-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-3-nitropyridin-2-yl)morpholin (0,65 g) wurde in 15 ml THF suspendiert und zwei Spatelspitzen Raney-Nickel zugesetzt. Der Reaktionsansatz wurde mittels Ballon unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 2 mmol Et3N (1 eq, 0,28 ml) sowie 3 mmol 2-(3,5-Difluorphenyl)acetylchlorid aus 1.2.23 (a) zugesetzt und für weitere 4 h gerührt. Die Suspension wurde danach über Kieselgur filtriert, das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand mittels Flashchromatographie (Mobile Phase: Ethylacetat/n-Hexan) aufgereinigt. Abschließend wurde das Produkt aus Ethanol umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 104 - 105 °C). Ausbeute: 0.24 g (27%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,34 (s, 1H), 7,73 (d, J= 8,20 Hz, 1H), 7,17 (m, 3H), 6,92 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 5,08 (t, J= 4,52 Hz, 1H), 3,94 (m, 2H), 3,84 (m, 2H), 3,75 (s, 2H), 3,44 (m, 4H), 3,35 (m, 4H), 3,05 (m, 4H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,2, 163,5 (dd, J= 13 Hz, J= 243 Hz, 2C), 154,2, 150,5, 140,1 (t, J= 10 Hz, 1C), 134,5, 120,8, 115,0, 112,5 (dd, J= 7 Hz, J= 17 Hz, 2C), 102,5, 102,3, 65,8 (2C), 64,6 (2C), 48,7 (2C), 42,2, 32,5; IR [cm-1]: ṽ= 3265, 1657, 1516, 1463, 1118, 958; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 452,1450, gemessen: 452,1452.
  • N-{2-Amino-6-[(cyclobutylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
  • Figure DE102018212006B3_0089
  • 2 mmol 6-[(Cyclobutylmethyl)thio]-3-nitropyridin-2-amin (0,48 g) wurden in 15 ml THF suspendiert und 2 Spatelspitzen Raney-Nickel hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wurde mittels Ballon unter Wasserstoffatmosphäre gesetzt und für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit 75 ml Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat wurde auf 0 °C abgekühlt und 2 mml Et3N (1 eq, 0,28 ml) sowie 2 mmol 2-(3,5-Difluophenyl)acetylchlorid tropfenweise zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde die Lösung am Rotationsverdampfer aufkonzentriert, worauf das Produkt präzipitierte. Abschließend wurde aus DCM umkristallisiert. Farbloser Feststoff (Smp.: 199 -200 °C). Ausbeute: 0.47 g (65%); 1H NMR [ppm]: δ= 9,99 (s, 1H), 7,81 (d, J= 8,00 Hz, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,71 (d, J= 8,12 Hz, 1H), 3,82 (s, 2H), 3,22 (d, J= 7,56 Hz, 2H), 2,07 (m, 2H), 1,85 (s, 4H); 13C NMR [ppm]: δ= 168,9, 163,4 (dd, J= 13 Hz, J= 245 Hz, 2C), 151,5, 140,1 (t, J= 10 Hz, 1C), 134,6, 112,8 (dd, J= 7 Hz, J= 17 Hz, 2C), 110,8, 102,3 (t, J= 26 Hz, 1C), 41,7, 37,3, 34,2, 27,1 (2C), 17,4; IR [cm-1]: ṽ= 3071, 1650, 1524, 1251, 1115, 991, 838; HRMS: [C14H16N4O2S +H]+ berechnet: 364,1290, gemessen: 364,1287.
  • In vitro Untersuchungen
  • eingesetzte Substanzen
  • Die in den in vitro Untersuchungen eingesetzten Substanzen sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    in den in vitro Untersuchungen eingesetzten Substanzen
    Nummer Struktur Name
    Vergleichs beispiel 1
    Figure DE102018212006B3_0090
         		Ethyl-2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)-amino]-3-pyridincarbamat-Maleat (Flupirtin-Maleat)
    1
    Figure DE102018212006B3_0091
         		Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}carbamat
    2
    Figure DE102018212006B3_0092
         		Ethyl-(2-amino-6-{[4-(trifluormethyl)-benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat
    3
    Figure DE102018212006B3_0093
         		Ethyl-{2-amino-6-[(3,4-difluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
    4
    Figure DE102018212006B3_0094
         		Ethyl-{2-amino-5-brom-6-[(4-fluorbenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
    5
    Figure DE102018212006B3_0095
         		Ethyl-(2-amino-6-{[4-(pentafluor-λ6-sulfanyl)benzyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat
    6
    Figure DE102018212006B3_0096
         		N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid
    7
    Figure DE102018212006B3_0097
         		N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}pivalinsäureamid
    8
    Figure DE102018212006B3_0098
         		N-{2-Amino-6-[(cyclohexylmethyl)-thio]pyridin-3-yl}buttersäureamid
    9
    Figure DE102018212006B3_0099
         		N-{6-[(Cyclohexylmethyl)thio]-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl}-2-(3,5-dimethoxyphenyl)acetamid
    10
    Figure DE102018212006B3_0100
         		2-(3,5-Dimethoxyphenyl)-N-(6-(isobutylthio)-2-[pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]acetamid
    11
    Figure DE102018212006B3_0101
         		3-(3,5-Difluorphenyl)-N-(6-[isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propionsäureamid
    12
    Figure DE102018212006B3_0102
         		N-{2-Amino-6-[(cyclopropylmethyl)-thio]pyridin-3-yl}-3-(3,5-difluorphenyl)propionsäureamid
    13
    Figure DE102018212006B3_0103
         		Ethyl-{2-amino-6-[(pyridin-2-ylmethyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
    14
    Figure DE102018212006B3_0104
         		Ethyl-(2-amino-6-{[2-(piperidin-1-yl)ethyl]thio}pyridin-3-yl)carbamat
    15
    Figure DE102018212006B3_0105
         		Ethyl-[2-amino-6-(benzylthio)pyridin-3-yl]carbamat (6b)
    16
    Figure DE102018212006B3_0106
         		Ethyl-{2-amino-6-[(3,5-dimethoxybenzyl)thio]pyridin-3-yl}carbamat
    17
    Figure DE102018212006B3_0107
         		Ethyl-(6-{[(1 ,1'-biphenyl)-4-ylmethyl]thio}-2-aminopyridin-3-yl)carbamat
    18
    Figure DE102018212006B3_0108
         		Ethyl-{6-[(4-fluorbenzyl)thio]-2-methylpyridin-3-yl)carbamat
    19
    Figure DE102018212006B3_0109
         		N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}-3,4-difluorbenzamid
    20
    Figure DE102018212006B3_0110
         		N-[6-(Benzylthio)-2-(methylamino)pyridin-3-yl]-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
    21
    Figure DE102018212006B3_0111
         		Ethyl-{2-amino-6-[(4-fluorbenzyl)thio]-5-methylphenyl}carbamat
    22
    Figure DE102018212006B3_0112
         		N-{2-Amino-6-[(4-fluorbenzyl)-thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetam id
    23
    Figure DE102018212006B3_0113
         		N-(2-Amino-6-{[(tetrahydro-2H-pyran-2-yl)methyl]thio}pyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
    24
    Figure DE102018212006B3_0114
         		N-(6-{[(1,3-Dioxolan-2-yl)methyl]thio}-2-morpholinopyridin-3-yl)-2-(3,5-difluorphenyl)acetamid
    25
    Figure DE102018212006B3_0115
         		N-{2-Amino-6-[(cyclobutylmethyl)thio]pyridin-3-yl}-2-(3,5-difluorphenyl)acetam id
  • Kaliumkanal-Assay
  • Heute ist es die gängige Meinung, dass die analgetische Wirkung von Flupirtin durch seine Öffnung der heterodimeren 7.2/3-Kaliumkanäle im ZNS zustande kommt. Deswegen wurde eine In-Vitro-Screening-Methode etabliert, um die Öffnung dieses Kanals in den mit humanen Kaliumkanal-Kv 7.2/3 transfektierten Zellen durch Testsubstanzen zu evaluieren.[40] Das Prinzip des Assays beruht darauf, dass HEK 293 Zellen, welche Kv 7.2/3 (spannungsabhängige Kaliumkanäle 7.2/3) exprimieren, mit einem Thallium-sensitiven Farbstoff beladen werden, der durch zellinterne Esterasen zum aktiven Thallium-komplexierenden Agens gespalten wird. Dieser bildet mit Thallium-Ionen, welche durch geöffnete Kv 7.2/3 einströmen, fluoreszierende Komplexe. Die Intensität des Thallium-Signals ist proportional zur Anzahl der geöffneten Kv 7.2/3-Kanäle. Da es sich bei den Test-Substanzen um potentielle Kv 7.2/3-Öffner handelt, ist der Assay geeignet, um die Kaliumkanalaktivität der Substanzen zu ermitteln.
  • Zur Charakterisierung dieser Eigenschaft wird die EC50 und Emax einer Test-Substanz bestimmt. Die halbmaximale Effektkonzentration (EC50) ist die Konzentration einer Substanz, bei der der halbmaximale Effekt des im folgend beschriebenen Assays zu beobachten ist, wenn die logarithmierte Konzentration einer Substanz gegen die zugehörigen korrigierten ΔF/F-Werte geplottet wird. Damit wird demnach die Potenz einer Verbindung charakterisiert. Die intrinsische Aktivität einer Test-Verbindung wird durch deren Emax-Wert beschrieben. Dabei handelt es sich um die maximale Antwort, bezogen auf den vorliegenden Assay, der Plateaueffekt, welche durch die entsprechende Test-Substanz möglich ist. Hierzu wurde Emax des als Referenz verwendeten Flupirtinmaleats auf 100 % festgelegt und die maximalen Antworten der Test-Substanzen relativ auf diesen Wert bezogen.
  • Für den zellbasierten Assay wurden HEK 293-Zellen (human embryonic kidney cells, SB-HEK-Kv7.2/7.3, SB Drug Discovery), welche Kv 7.2/3 exprimieren, verwendet. Diese adhärenten Zellen wurden in Zellkulturflaschen (z. B. TC-Flasche T75, Standard, #83.3911, Sarstedt) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit MEM (Minimum Essential Medium, #10370047, Thermo Fisher), welches 10 % FBS (fetales Kälberserum, F7524, Sigma Aldrich, hitzeinaktiviert), 2 mM L-Glutamin (G7513, Sigma Aldrich), 4 µg/ml Blasticidin S HCl (#203350-25, VWR), 1 % Penicillin-Streptomycin-Mix (#15070063, Thermo Fisher) und 0,78 mg/ml G418-sulfat (CP11.2, Carl Roth) beinhaltet, kultiviert. Am Vortag des Experiments wurden Zellen, die ungefähr 80 % Konfluenz aufwiesen, mit phosphatgepufferter Salzlösung (z. B. L1825, Biochrom) gewaschen, mithilfe von TrypLE™ Express (1x) (#12604013, Thermo Fisher) vom Zellkulturflaschenboden abgelöst (2 min bei 37 °C), dann mit MEM suspendiert, anschließend bei 1000 rpm 2 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme erneut in MEM resuspendiert. Die Zellzahl der Suspension wurde mit dem automatischen Zellzählmessgerät EVE™ (NanoEnTEK) bestimmt. Daraufhin wurden 60 000 Zellen/Well/100 µL in 96 Well Vision Plates™ (sterile schwarze TC-behandelte 96 Well Mikrotiterplatten mit optischem Boden, 4ti-0221, 4titude) ausgesät und 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.
  • Für die Messung der Kaliumkanalaktivität der Substanzen wurde der FLIPR® Kalium-Assay-Kit (R8222 Explorer Version, Molecular Devices) verwendet. Der Assay wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt, worauf im Folgenden näher eingegangen wird. Zur Herstellung des Loading Buffers wurde Komponente C in 30 µL DMSO (#A994.2, Carl Roth) gelöst und zusammen mit 10 ml Komponente B in das Gefäß der Komponente A überführt. Durch Mischen wurde eine homogene Lösung erzeugt. Zusätzlich wurde dem Loading Buffer Probenecid (sc-202773A, Santa Cruz Biotechnology) in einer Konzentration von 5 mM hinzugefügt, wobei zunächst von diesem Additiv eine 500 mM Stammlösung in 1 N NaOH-Lösung angefertigt wurde, die darauffolgend 1:1 (V/V) mit Komponente B verdünnt wurde. Der pH-Wert des Loading Buffers wurde anschließend mit 1 M HCl auf 7,4 mittels pH-Elektrode eingestellt. Zu den Zellen wurden 100 µL/Well Loading zugegeben. Anschließend wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 1 h inkubiert. Von den zu testenden Verbindungen wurde jeweils eine serielle Verdünnungsreihe (mindestens fünf Konzentrationen) in DMSO (#A994.2, Carl Roth) angefertigt, wobei die Konzentrationen dem 100fachen der gewünschten späteren in-Well Konzentrationen betrugen. Die Zellen wurden mit den vorbereiteten Substanzkonzentrationen, welche im Verhältnis 1:100 (V/V) hinzugefügt wurden, weitere 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Negativkontrolle beinhaltete nur Lösungsmittel (1 % DMSO). Für die Fluoreszenzintensitätsmessungen (485 nm Exzitation, 535 nm Emission, Messmodus Boden) wurde das Mikrotiterplattenlesegerät Infinite® F200 Pro (Tecan) verwendet. Die zu vermessende Platte wurde ins Gerät eingebracht. In einer Zeitspanne von 20 s, wobei alle 2,5-3 s Messwerte vom Gerät aufgenommen wurden, wurde die Fluoreszenzintensität jedes Wells bestimmt (Hintergrundmessung). Danach wurde zügig im Verhältnis 1:5 (V/V) Stimulus Buffer, welcher 7,5 mM Tl2SO4, 12,5 mM K2SO4 und 1x Chloride-free Buffer in destilliertem Wasser enthielt, zu den einzelnen Wells gegeben. Die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Wells wurde ungefähr für weitere 2 min periodisch alle 2,5-3 s bestimmt. Die Bestimmung der Kaliumkanalöffnungsaktivität einer Verbindung anhand der aufgenommenen Daten erfolgte in mehreren Schritten. Zunächst wurde für jede Verdünnungsstufe einer Substanz deren Fluoreszenzintensitätsänderung zu einem definierten Zeitpunkt gegenüber der gemittelten Fluoreszenzintensitäten der Hintergrundmessung berechnet (ΔF/F). Des Weiteren wurde dieses ermittelte Ergebnis um den analog berechneten Wert der Negativkontrolle bereinigt (korr. ΔF/F). Beim erwähnten definierten Zeitpunkt (t) war die Summe der jeweiligen um die Negativkontrolle korrigierten Fluoreszenzintensitätsänderungen der Verdünnungsreihe einer Substanz maximal. Durch visuelle Inspektion eines zugehörigen Fluoreszenzintensität-Zeit-Diagramms (Fluoreszenzintensität korrigiert um Negativkontrolle, relativ auf jeweiligen Hintergrund bezogen) wurde die Auswahl des Zeitpunkts kontrolliert. Folgende Gleichung fasst die beschriebene Berechnung zusammen: k o r r i g i e r t e Δ F F = F i ( t ) − < F i B > < F i B > − ( 1 − F K ( t ) < F K B > )
    Figure DE102018212006B3_0116
    Fi(t) bzw. Fk(t) ist die Fluoreszenzintensität zu einem definierten Zeitpunkt (Erläuterung s.o.) einer Test-Substanzkonzentration bzw. der Negativkontrolle. <FB> ist der Mittelwert der Fluoreszenzintensitäten, welche während der Hintergrundmessung generiert wurden. Mithilfe der GraphPad Prism Software (Version 6) wurde eine nichtlineare Regression der berechneten korrigierten ΔF/F-Werte und der zugehörigen logarithmierten Konzentrationswerte einer Verbindung durchgeführt, wobei als Passform der Kurve die vorgefertigte Gleichung „log(Agonist) gegen Effekt“ (variabler Anstieg, 4 Parameter) verwendet wurde, um unter anderem einen EC50-Wert zu generieren. Beim Emax-Wert einer Substanz handelt es sich um die Differenz des höchsten und niedrigsten korr. ΔF/F-Werts (Angabe im Auswertedatenblatt der jeweiligen nichtlinearen Regressionsanalyse durch Software) der erhaltenden sigmoidalen Kurve prozentual bezogen auf den maximal erreichten Aktivität des als Referenzsubstanz verwendeten Flupirtinmaleats.
  • zeigt zwei repräsentative Dosis-Wirkungskurven für die Öffnung des Kv 7.2/3 Kaliumkanals durch Flupirtinmaleat bzw. die wirkungsstärkste Substanz 11. Aus diesen Kurven sind sowohl die Wirkungsstärke als EC50-Wert als auch die intrinsische Aktivität der Substanz als Emax zu vermitteln. Je niedriger der EC50-Wert, desto höher ist die Wirkungsstärke (auch Potenz genannt), während je größer der Emax-Wert ist, desto stärker wirksam ist die Verbindung.
  • Hepatocytenviabilitätsassy
  • Die Nebenwirkung von Flupirtin, die auch für seinen Entzug vom Markt verantwortlich war, ist die Hepatotoxizität. Aus diesem Grund wurden zwei Zellkulturmodelle für Hepatotoxizität entwickelt, um auf toxische Wirkung der neuen Substanzen zu testen und toxische Kandidaten frühzeitig zu identifizieren. Als Zellviabilitätsassay wurde der etablierte MTT-Viabilitätsassay durchgeführt.[41] Das Prinzip des Assays beruht darauf, dass viable Zellen in der Lage sind, das gelbe, wasserlösliche MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) zum unlöslichen violetten Formazanprodukt durch mitochondriale Dehydrogenasen zu reduzieren (unter Verbrauch von NADH bzw. NADPH), dessen Absorption dann photometrisch bestimmt werden kann. Der erste zellbasierte Assay wurde mit der TAMH-Zelllinie der Maus (transforming growth factor-a transgenic mouse hepatocytes) durchgeführt, der bereits in früheren Arbeiten mit Flupirtin [41] als auch mit anderen hepatotoxischen Wirkstoffen Anwendung fand und als Prädiktor von Hepatotoxizität nützlich ist.[42] Zum anderen wurde eine humanen Hepatokarzinomzelllinie, die HEP-G2 (human hepatocellular carcinoma cells) als zweites Hepatotoxizitätsmodell benutzt [43], um mit einem humanen Zelllinien die Ergebnisse aus dem TAMH-Zellinie zu vergleichen. Beide Zelllinien wachsen als Monolayer in Kultur, die TAHM-Zelllinien in serumfreiem Medium, die HEP-G2-Linie in Kulturmedium mit 10 % fötalem Kälberserum.
  • Die beiden adhärenten Zelllinien wurden in Zellkulturflaschen (z. B. TC-Flasche T75, Standard, #83.3911, Sarstedt) im Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit mit, im Falle der TAMH-Zelllinie, DMEM/F12 (1:1 Mix) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F- 12, P04-41500, PAN Biotech), welches 5 % Panexin NTA (P04-95750, PAN Biotech), 10 mM Nicotinamid (N0636, Sigma Aldrich) und 0,1 % (V/V) 50 mg/ml Gentamicinsulfat-Lösung (in destilliertem Wasser, P06-03001P, PAN Biotech) beinhaltet, oder, HEP-G2-Zellen betreffend, mit RPMI 1640 (P04-16500, PAN Biotech), das 10 % FBS (fetales Kälberserum, F7524, Sigma Aldrich, hitzeinaktiviert) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Mix (P06-07100, PAN Biotech) enthält, kultiviert.
  • TAMH-Zellen, welche eine Konfluenz von mindestens 80 % aufwiesen, wurden mit HBSS (Hanks balanced salt solution, P04-34500, PAN-Biotech) gewaschen, mithilfe von Trypsin-EDTA-Lösung (T3924, SigmaAldrich), die ca. 10 s auf den Zellen verweilte, vom Zellkulturflaschenboden abgelöst (noch 2 min bei 37 °C), dann mit Soybean Trypsin Inhibitor (T6522, Sigma Aldrich) suspendiert, anschließend bei 400 g 5 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme mit DMEM/F12 (1:1 Mix) resuspendiert. HEP-G2-Zellen wiederum, welche eine Konfluenz von ungefähr 70 % aufwiesen, wurden mit phosphatgepufferter Salzlösung (z. B. L1825, Biochrom) gewaschen, mithilfe von Trypsin-EDTA-Lösung vom Zellkulturflaschenboden abgelöst (ca. 5 min bei 37 °C), dann mit RPMI 1640 suspendiert, anschließend bei 125 g 5 min zentrifugiert und nach Überstandabnahme erneut mit RPMI 1640 resuspendiert. Die Zellzahl beider Zellsuspension wurde mit dem automatischen Zellzählmessgerät EVE™ (NanoEnTEK) bestimmt. Von den murinen Zellen wurden anschließend 20 000 Zellen/Well/200 µL in 96 Well TC-Platten, Cell+, F (#83.3924.300, Sarstedt) ausgesät und 2-3 Tage bis zur vollständigen Konfluenz bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Von den humanen Zellen wurden 15 000 Zellen/Well/100 µL in 96 Well TC-Platten, Standard, F (#83.3924, Sarstedt) ausgesät und 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Von den zu testenden Verbindungen wurde jeweils eine serielle Verdünnungsreihe (mindestens fünf Konzentrationen) in DMSO (#A994.2, Carl Roth) angefertigt, wobei die Konzentrationen dem 100fachen der gewünschten späteren in-Well Konzentrationen betrugen. Nach erfolgter Inkubation beider Zelllinien wurde das jeweilige in den Platten befindliche Medium verworfen und die Wells nach einem bestimmten Muster mit jeweils 200 µL/Well mit den im nachfolgenden beschriebenen verschiedenen Lösungen beladen. Die angefertigte Verdünnungsreihe einer Substanz wurde dem entsprechendem Medium im Verhältnis 1:100 (V/V) beigemischt und zu den Zellen gegeben. Kontroll-Wells enthielten die entsprechenden Zellen, welche nur mit dem jeweiligen Medium und 1 % DMSO behandelt wurden. Wells, welche keine Zellen, sondern nur das entsprechende Medium mit 1 % DMSO enthielten, wurden zur Bestimmung des Hintergrunds herangezogen (Blank). Jede Bedingung wurde mindestens als Triplikat bestimmt. Die Platten wurden 24 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurde jegliche Flüssigkeit aus den Platten entfernt und eine Mischung aus dem jeweiligen Medium und einer 2,5 mg/ml MTT-Lösung (in Dulbecco's Puffer, L11939.06, Alfa Aesar) im Verhältnis 1:5 (V/V) zu den Zellen gegeben. Es folgte eine Inkubation von 1,5-4 h bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nun wurden die Platten komplett von der zugegebenen Mischung befreit und entstandene Formazankristalle mithilfe von DMSO (#7029.2, Carl Roth) in Lösung gebracht. Die Absorption der einzelnen Wells wurde bei λ = 570 nm mit dem SpectraMax 190 Mikroplattenlesegerät inkl. SoftMax Pro Software (Molecular Devices) ermittelt. Die Viabilität der mit der zu testenden Substanz behandelten Zellen wurde im Verhältnis zur Kontrolle angegeben. Dazu wurde der Absorptionswert eines einzelnen Wells, welches Zellen beinhaltete, die mit einer Verdünnungsstufe der Substanz behandelt wurden (T), durch den Mittelwert der Absorptionswerte der Kontroll-Wells (<C>) dividiert und mit 100 multipliziert. Beide Terme wurden zuvor um den Mittelwert der gemessenen Absorptionen der Wells für die Blank-Bestimmung (<Blank>) korrigiert. Somit ergibt sich folgende Formel: V i a b i l i t ä t [ % ] = T − < b l a n k > < G > − < B l a n k > ∗ 100
    Figure DE102018212006B3_0117
  • Zur Beurteilung des hepatotoxischen Potentials einer Substanz wurde der IC50-Wert verwendet. Als IC50 wurde die Konzentration einer Verbindung definiert, bei welcher die Viabilität der Zellen auf 50 % sank ( ). Zur Bestimmung dieser wurde wiederum mithilfe der MS Excel Software (2013, Microsoft) eine Analyse der linearen Regression der ermittelten Viabilitäten und der zugehörigen (logarithmierten) Konzentrationen einer Substanz durchgeführt und mittels der sich ergebenden linearen Gleichung die IC50 bestimmt.
  • Die Ergebnisse der Hepatoxizitäts-Untersuchung sind in Tabelle 3 zusammengefasst. In den meisten Fällen konnte kein IC50-Wert berechnet werden, weil die obere Löslichkeitsgrenze der Substanzen in Zellkulturmedium unterhalb die 50% toxische Konzentration lag; d.h. die Substanzen fiel aus, bevor eine IC50-Konzentration erreicht werden konnte.
  • Ergebnisse der biologischen Testung
  • Tabelle 3 fast die gesamten biologischen Testergebnisse der synthetisierte Substanzen zusammen und vergleicht sie mit der Referenzsubstanz Flupritinmaleat. Aus dem Zusammenspiel der Ergebnisse von Kv7.2/3-Öffnungsaktivität und den Hepatotoxizitäts-Ergebnissen in vitro ist ersichtlich, dass insgesamt Verbindungen der allgemeinen Strukturformen (I) die Wirkung von der Referenzsubstanz Flupirtinmaleat deutlich übertreffen. Insbesondere Verbindungen mit einem niedrigen EC50-Wert, bevorzugt einem EC50-Wert von weniger als 0,9 mikromolar (Mikromol pro Liter), weiter bevorzugt von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von weniger als 0,01 mikromolar, sind besonders geeignet. Bei der potentesten Substanz 11 werden so niedrige Substanzkonzentrationen (0,0014 µmol pro Liter) zur Erreichung des halbmaximalen Effekts auf Kaliumkanäle benötigt, dass toxische Effekte bei der resultierenden Dosierung sehr unwahrscheinlich sind. Die ermittelten Toxizitätsdaten zeigen, dass bei den durch Löslichkeit im Testmedium limitierten Konzentrationen von 63 µmol pro Liter für Verbindung 11 keine toxischen Effekte beobachtet wurden und der IC50 daher als größer als 63 µmol pro Liter angegeben werden kann. Entsprechend ist das Verhältnis von IC50 zu EC50 mindestens 85-mal größer bei Substanz 11 als bei Flupirtinmaleat. Leberschädigungen während der Therapie sollten damit weniger wahrscheinlich sein. Auch der biologische Effekt der Testsubstanz sollte größer sein (beispielsweise stärkere Analgesie), da Emax bei über 100 % lag und somit ein stärkerer Kaliumefflux zu erwarten ist als mit Flupirtinmaleat. Tabelle 3
    Ergebnisse der Kv7.2I3-Öffnungsaktivitäts-Untersuchung und der Hepatoxizitäts-Untersuchung
    Nr. Kv7.2/3-Öffnungsaktivität Hepatotoxizität in vitro
    TAMH HEP-G2
    EC50 [µM] ± SD [µM] Emax [%] IC50 [µM] ± SD [µM] IC50 [µM] ± SD [µM]
    Vergleichsbeispiel 1 0,918 ± 0,099 (n=6) 100 487 ± 51 (n=4) 547 ± 111 (n=7)
    1 1,279 ± 0,293 (n=4) 93 ± 13 > 40 (n=3) > 40 (n=3)
    2 0,237 ± 0,022 (n=3) 115 ± 19 > 20 (n=4) > 20 (n=4)
    3 0,771 ± 0,076 (n=4) 96 ± 9 > 30 (n=4) > 30 (n=4)
    4 > 10 (n=2) - >7.5 (n=4) >7.5 (n=4)
    5 0,240 ± 0,066 (n=4) 78 ± 10 > 30 (n=4) nicht bestimmt
    6 2,134 ± 0,457 (n=3) 140 ± 11 > 63 (n=4) > 63 (n=5)
    7 4,544 ± 1,457 (n=3) 118 ± 28 > 63 (n=4) > 63 (n=5)
    8 1,320 ± 0,440 (n=3) 120 ± 19 52 ± 16 (n=4) > 250 (n=5)
    9 0,021 ± 0,006 (n=3) 162 ± 9 > 125 (n=3) > 125 (n=4)
    10 0,0245 ± 0,0069 (n=3) 141 ± 11 > 125 (n=3) > 125 (n=4)
    11 0,001378 ± 0,00006 (n=3) 136 ± 13 >63 (n=3) >63 (n=4)
    12 0,515 ± 0,035 (n=3) 117 ± 22 > 250 (n=3) > 250 (n=4)
    13 > 10 (n=3) - > 1000 (n=5) 831 ± 149 (n=3)
    14 > 10 (n=4) - > 500 (n=3) > 500 (n=3)
    15 1,746 ± 0,347 (n=3) 110 ± 15 > 250 (n=3) 221 ± 102 (n=5)
    16 > 10 (n=2) - > 250 (n=3) 134 ± 22 (n=4)
    17 0,253 ± 0,042 (n=3) 69 ± 9 > 250 (n=2) > 250 (n=4)
    18 0,269 ± 0,031 (n=3) 129 ± 3 > 10 (n=5) > 30 (n=3)
    19 0,260 ± 0,082 (n=4) 100 ± 23 > 30 (n=3) 8 ± 3 (n=4)
    20 0,015 ± 0,002 (n=3) 147 ± 9 > 7.5 (n=3) > 10 (n=3)
    21 0,447 ± 0,293 (n=3) 72 ± 4 > 63 (n=3) 58 ± 12 (n=4)
    22 0,066 ± 0,013 (n=3) 114 ± 16 > 5 (n=6) > 10 (n=3)
    23 1,348 ± 0,185 (n=3) 106 ± 17 > 250 (n=4) 203 ± 59 (n=4)
    24 0,122 ± 0,031 (n=3) 112 ± 11 > 250 (n=2) > 250 (n=2)
    25 0,021 ± 0,003 (n=3) 107 ± 7 > 63 (n=3) > 63 (n=4)
  • Figurenliste
    • . zeigt repräsentative Dosis-Wirkungskurven für die Öffnung des Kv 7.2/3 Kaliumkanals durch Flupirtinmaleat und Substanz 11;
    • . zeigt repräsentative Dosis-Viabilitätskurven für Flupirtinmaleat in TAMH und HEP-G2-Zelllinien.
  • Angeführte Literatur
    • [1] M. A. Rogawski, KCNQ2IKCNQ3 K+ channels and the molecular pathogenesis of epilepsy: implications for therapy, Trends in Neuroseiences 2000, 23, 393-398.
    • [2] H. S. Wang, Z. Pan, W. Shi, B. 5. Brown, R. S. Wymore, I. S. Cohen, J. E. Dixon and D. McKinnon, KCNQ2 und KCNQ3 Potassium Channel Subunits: Molecular Correlates of the M-Channel, Science 1998, 282, 1890-1893.
    • [3] C. Kubisch, B. C. Schroeder, T. Friedrich, B. Lütjohann, A. El-Amraoul, M. 5., C. Petit and T. J. Jentsch, KCNQ a novel potassium channel expressed in sensory outer hair cells, is mutated in dominant deafness, Cell 1999, 96, 437-446.
    • [4] F. A. lannotti, E. Panza, V. Barrese, D. Viggiano, M. V. Soldovieri and M. Taglialatela, Expression, Localization, and Pharmacological Role of Kv7 Potossi um Channels in Skeletal Muscle Proliferation, Differentiation, and Survival after Myotoxic Insults, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2009,332, 811-820.
    • [5] I. A. Greenwood and S. Ohya, New tricks for old dogs: KCNQ expression and role in smooth muscle, British Journal of Pharmacology 2009, 156, 1196-1203.
    • [6] V. Barrese, F. Miceli, M. V. Soldovieri, P. Ambrosino, F. A. lannotti, M. R. Cilio, and M. Taglialatela, Neuronal potassium channel openers in the management of epilepsy: role and potential of retigabine, Clinical Pharmacology: Advances and Applications 2010, 225.
    • [7] F. Miceli, M. Soldovieri, M. Martire and M. Taglialatela, Molecular pharmacology and therapeutic potential of neuronal Kv7-modulating drugs, Current Opinion in Pharmacology 2008, 8, 65-74.
    • [8] L. Tatullan, P. Delmas, F. C. Abogadle and D. A. Brown, Activation of expressed KCNQ potassium Currents and native neuronal M-Type potassium currents by anti-convulsant Drug Retigabin, The Journal of Neoroscience 2001, 21, 5535-5545.
    • [9] T. V. Wuttke, The New Anticonvulsant Retigabine Favors Valtage-Oependent Opening of the Kv7.2 (KCNQ2) Channel by Binding to Its Activation Gate, Molecular Pharmacology 2005, 67, 1009-1017.
    • [10] W. Lange, J. Geissendorfer, A. Schenzer, J. Grotzinger, G. Seebohm, T. Friedrich and M. Schwake, Refinement of the Binding Site and Mode of Action of the Anticonvulsant Retigabine an KCNQ K+ Channels, Molecular Pharmacology 2008, 75, 272-280.
    • [11] H. Bleyer, C. Kari-Heinz, H.-J. Erkel and I. Jurna, Flupirtine depresses nociceptive activity evoked in rat thalamus, European Journal of Pharmacology 1988, 151, 259-265.
    • [12] B. Nickel, H. O. Borbe and I. Szelenyi, Investigations with the novel non-opioid analgesic flupirtine in regard to possible benzodiazepine-like abuse inducing potential, Arzneimittel-Forschung 1990, 40, 905-908.
    • [13] I. Szelenyi, Flupirtine, a re-discovered drug, revisited, Inflammation Research 2013, 62, 251-258.
    • [14] I. Szelenyi, B. Nickel, H. O. Borbe and K. Brune, Mode of antinociceptive action of flupirtine in the rat, British Journal of Pharmacology 1989, 97, 835-842.
    • [15] F. Klinger, P. Geier, M. M. Dorostkar, G. K. Chandaka, A. Yousuf, I. Salzer, H. Kubista and S. Boehm, Concomitant facilitation of GABAA receptors and KV7 channels by the non-opioid analgesic flupirtine, British Journal of Pharmacology 2012, 166, 1631-1642.
    • [16] T. Hummel, T. Friedmann, E. Pauli, G. Niebch, H.O. Borbe and G. Kobal, Dose-related an algesic effects of flupirtine, British Journal of Clinical Pharmacology 1991,32, 69-76.
    • [17] F. Popovici, M. Darostkar and S. Boehm, The non-opioid an algesie flupirtine is a modulator of GABM receptors involved in pain sensation, BMC Pharmacology 2008, 8, A14.
    • [18] N. N. Osborne, C. Cazevieille, J. P. M. Wood, M. S. Nash, G. Pergande, F. Block, C. Kosinski and M. Schwarz, Flupirtine, a nonopioid centrally acting analgesic, acts as an NMDA antagonist, General Pharmacology 1998, 30, 255-263.
    • [19] S. Naser, N. Sarkar, A. Bis was, F. Kamal, R. Prakash, Q. M. Rahaman and A. Das, Efficacy and safety of flupirtine maleate and tramadol hydrochloride in postoperative pain management--a prospective randomised double blinded study, Journal of the Indian Medical Association 2012, 110, 158-160.
    • [20] V. Lüben, H. Müller, M. Lobisch and R. Wörz, Treatment of tumor pain with flupirtine. Results of a double-blind study versus tramadol, Fortschritte der Medizin 1994, 112, 282-286.
    • [21] Rote-Hand-Brief: Einschränkung der therapeutischen Zielgruppe und Begrenzung der Behandlungsdauer für Flupirtinhaltige Arzneimittel nach Bewertung des Lebertoxizitätsrisikos, 2013.
    • [22] https://www. bfarm.de/Shared Docs/Risikoinformationen/Pharmakovigilanzl/DE/RV_STP /a-flflupirtin-10-2017.html;jsessionid= 9756209449B3B2D1D76A4DE1CD5001AC.2 _cid344; abgerufen am 20.02.2018.
    • [23] R. J. Porter, V. Nohria and C. Rundfeldt, Retigabine, Neurotherapeutics 2007,4, 149-154.
    • [24] M. Bialer, S. I. Johannessen, R. H. Levy, E. Perucca, T. Tomsan and H. S. White, Progress report an new antiepileptic drugs: A summary of the Thirteenth Eilat Conference an New Antiepileptic Drugs and Devices {EILAT XIII), Epilepsia 2017,58, 181-221.
    • [25] R. J. Porter, A. Partiot, R. Sachdeo, V. Nohria and W. M. Alves, Randomized, multicenter, dose-ranging trial of retigabine.
    • [26] F. Rode, J. Svalø, M. Sheykhzade and L. C. B. Ronn, Functional effects of the KCNQ modulators retigabine and XE991 in the rat urinary bladder, Europeon Journal of Pharmacology 2010, 638, 121-127.
    • [27] Rote-Hand-Brief: Einschränkungen für die Anwendung von Trobalt® (Retigabin)-Behandlung kann zu Pigmentveränderungen von Augengeweben, einschließlich der Retina, und der Haut, Lippen und/oder der Nägel führen, 2013.
    • [28] P. Hlavica and G. Niebch, Pharmacokinetics and biotransformation oft he analgesic f lupirtine in humans, Arzneimittelforschung 1985,35, 67-74.
    • [29] K. Methling, P. Reszka, M. Lalk, 0. Vrana, E. Scheuch, W. Siegmund, B. Terhaag and P. J. Bednarski, Investigation of the in vitro Metabolism of the Analgesie Flupirtine, Drug Metabolism and Disposition 2008, 37, 479-493.
    • [30] E. Scheuch, K. Methling, P. J. Bednarski, S. Oswald and W. Siegmund, Quantitative LC-MSIMS determination of flupirtine, its N-acetylated and two mercapturic acidderivatives in man, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2015, 102, 377-385.
    • [31] W. Siegmund, C. Modess, E. Scheuch, K. Methling, M. Keiser, A. Nassif, D. Rosskopf, P. J. Bednarski, J. Borlak and B. Terhaag, Metabolie activation and analgesic effect of flupirtine in healthy subjects, influence of the polymorphic NAT2, UGT1A1 and GSTP1, British Journal of Clinical Pharmacology 2015, 79, 501-513.
    • [32] U. Boelsterli, Diclofenac-induced liver injury: a paradigm of idiosyncratic drug toxicity, Toxicology and Applied Pharmacology 2003, 192, 307-322.
    • [33] B. K. Park, N. R. Kitteringham, J. L. Maggs, M. Pirmohamed and D. P. Williams, The Role of Metabolie Activation in Drug Induced Hepatotoxicity, Annual Review of Pharmacology and Toxicology 2005, 45, 177-202.
    • [34] K. Obermeier, G. Niebch and K. Thiemer, Pharmacokinetics and biotransformation of the analgesic flupirtine in the rat and dog, Arzneimittelforschung 1985, 35, 60-67.
    • [35] R. Hempel, H. Schupke, P. J. McNeilly, K. Heinecke, C. Kronbach, C. Grunwald, G. Zimmermann, C. Griesinger, J. Engel and T. Kronbach, Metabolism of retigabine, a novel anticonvulsant, Drug Metabolism and Disposition 1999, 27, 613-622.
    • [36] P. J. McNeilly, C. D. Torchin, L. W. Anderson, I. M. Kapetanovic, H. J. Kupferberg and J. M. Strang, In vitro glucuronidation of D-23129, a new anticonvulsant, by human liver microsomes and liver slices, Xenobiotica 2008, 27, 431-441.
    • [37] M. Dousa, J. Srbek, S. Radi, J. Cerny, 0. Klecan, J. Havlfcek, M. Tkadlecova, T. Pekarek, P. Gibala and L. Novakova, Identification,characterization, synthesis and HPLC quantification of new process-related impurities and degradation products in retigabine, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2014, 94, 71-76.
    • [38] M. E. Duggan, T. Furuya, S. D. Edwards, A. Purohit, Preparation of fluorinated 2-amino-4-(benzylamino)phenylcarbamate derivatives as pharmaceuticals and imaging agents, US 2013/0287686 A1 .
    • [39] S. Kühnert et al. WO 2010/102809 A1 , WO 2010/102779 A1 und WO 2010/102811 A1 .
    • [40] C. D. Weaver, D. Harden, S. I. Dworetzky, B. Robertson, R.J. Knox, A thallium-sensitive, fluorescence-based assay for detecting and characterizing potassium channel modulators in mammalian cells, Journal of Biomolecular Screening 2004, 9, 671-677.
    • [41] C. Lemmerhirt, M. Rombach, A. Bodtke, P. J. Bednarski, A. Link, Oxidation potentials of N-modified derivatives of the analgesic flupirtine linked to potassium KV7 channel opening activity but not hepatocyte toxicity, ChemMedChem 2015, 10, 368-379.
    • [42] M. Davis, B. D. Stamper, TAMH: A useful In Vitro model for assessing hepatotoxic mechanisms, Biomed Research International 2016, 10.1155/2016/4780872.
    • [43] A. Van Summeren, J. Renes, F. G. Bouwman, J.-P. Noben, J. H. M. van Delft,J. C. S. Kleinjans, E. C. M. Mariman, Proteomics investigations of drug-induced hepatotoxicity in HepG2 cells, Toxicological Sciences 2012, 120, 109-122.

Claims (9)

  1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
    Figure DE102018212006B3_0118
    wobei R1 ausgewählt ist aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C3- bis C9-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Heteroatom im Cyclus aufweist; R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, wobei mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus Stickstoff- und Sauerstoffatom umfasst ist, C6- bis C12-Arylgruppe; und C5- bis C11-Heteroarylgruppe, wobei die C1- bis C10-Alkylgruppe, C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe, oder C5- bis C11 -Heteroarylgruppe jeweils mindestens einen weiteren Substituenten R2a aufweist, wobei R2a ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoffatom, Halogenatom, verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe, verzweigter oder unverzweigter (per)halogenierter C1- bis C3-Alkylgruppe und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkoxygruppe, und wobei die C3- bis C10-Cycloalkylgruppe, C3- bis C10-Heterocycloalkylgruppe, C6- bis C12-Arylgruppe oder C5- bis C11-Heteroarylgruppe ein oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind; R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C10-Alkoxygruppe; verzweigter oder unverzweigter C1-C10-Alkylgruppe und -(CH2)p-C6- bis C12-Arylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom und C1- bis C3-Alkoxygruppe aufweist und wobei die C6- bis C12-Arylgruppe einen oder mehrere Ringsysteme umfasst, welche kondensiert oder separiert sind; R4 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Halogenatom und verzweigter oder unverzweigter C1-C5-Alkylgruppe; X ein Stickstoffatom oder eine -CH- Gruppe ist; n Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3 ist; m Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist; und p Null oder eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 ist.
  2. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, wobei n Null ist und/oder m 1 ist und/oder X ein Stickstoffatom ist.
  3. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei R1 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3-Alkylgruppe und -NR1aR1b-Gruppe, wobei R1a und R1b unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoffatom und verzweigter oder unverzweigter C1- bis C3- Alkylgruppe oder miteinander und mit dem Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe eine C4- bis C6-Heterocycloalklygruppe bilden, wobei die C4- bis C6-Heterocycloalklygruppe jeweils mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom und C1- bis C3-Alklygruppe aufweist und gegebenenfalls zusätzlich zum Stickstoffatom der NR1aR1b-Gruppe mindestens ein weiteres Sauerstoffatom im Cyclus aufweist; und/oder R2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mono- oder Difluorphenyl-Gruppe; CF3-Phenyl-Gruppe; F5S-Phenyl-Gruppe; C4- bis C8-Cycloalkylgruppe; verzweigter oder unverzweigter C1- bis C5-Alkylgruppe; Biphenyl-Gruppe; Pyridin-Gruppe; Piperidin-Gruppe; Tetrahydropyran-Gruppe; Dioxolan-Gruppe und Phenyl-Gruppe, wobei die Phenyl-Gruppe mindestens einen Substituenten R2a ausgewählt aus Wasserstoffatom und Methoxy-Gruppe aufweist; und/oder R3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethoxy-Gruppe, Propyl-Gruppe, tert-Butyl-Gruppe, -(CH2)p-Phenylgruppe, welche mindestens einen Substituenten ausgewählt aus Wasserstoffatom, Halogenatom und Methoxy-Gruppe aufweist und wobei p Null oder 1 oder 2 ist; und/oder R4 ein Wasserstoffatom, ein Bromatom oder eine Methyl-Gruppe ist.
  4. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung die Formel (Ia)
    Figure DE102018212006B3_0119
    oder (Ib)
    Figure DE102018212006B3_0120
    oder (Ic)
    Figure DE102018212006B3_0121
  5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I),
    Figure DE102018212006B3_0122
    wobei R1, R2, R3, R4, X, n, m und p die gleiche Bedeutung haben wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert, umfassend: (i) Bereitstellen einer Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II)
    Figure DE102018212006B3_0123
    wobei R1, R2, R4, m und n die gleiche Bedeutung haben wie in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert; (ii) Umsetzen der Nitro-Verbindung der allgemeinen Formel (II) gemäß (i) mit einer Verbindung H-R3, wobei R3 die gleiche Bedeutung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert hat, unter Erhalt einer Verbindung der allgemeinen Formel (I).
  6. Verbindung der allgemeinen Formel (I), erhalten oder erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5.
  7. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Arzneimittel.
  8. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 zur Verwendung als Schmerzmittel und/oder zur Verwendung bei der Tinnitusbehandlung oder -prävention und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention von Krampfzuständen und/oder zur Verwendung bei der Behandlung oder Prävention einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Inkontinenz, Angstzustand, Abhängigkeit, Manie, bipolare Störung, kognitive Störung und Dyskinesie.
  9. Pharmazeutische Zubereitung umfassend eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder gemäß Anspruch 6.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010102811A1 (de) * 2009-03-12 2010-09-16 Grünenthal GmbH Substituierte 2-mercaptochinolin-3-carboxamide als kcnq2/3 modulatoren
WO2010102779A1 (de) * 2009-03-10 2010-09-16 Grünenthal GmbH Substituierte 3-amino-2-mercaptochinoline als kcnq2/3 modulatoren
WO2010102809A1 (de) * 2009-03-12 2010-09-16 Grünenthal GmbH Substituierte nicotinamide als kcnq2/3 modulatoren
US20130287686A1 (en) * 2012-04-30 2013-10-31 Scifluor Life Sciences, Llc Fluorinated 2-Amino-4-(Benzylamino)Phenylcarbamate Derivatives

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2548909A1 (de) * 1975-10-31 1977-05-12 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von neuen 2-acylamino-anilinen
DE2651467A1 (de) * 1976-11-11 1978-05-18 Bayer Ag Substituierte o-phenylendiaminderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als arzneimittel
JPH1179912A (ja) * 1997-09-08 1999-03-23 Sankyo Co Ltd 除草性アニリン誘導体を含有する除草性組成物
US8722929B2 (en) * 2006-10-10 2014-05-13 Valeant Pharmaceuticals International N-[2-amino-4-(phenylmethoxy)phenyl] amides and related compounds as potassium channel modulators

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010102779A1 (de) * 2009-03-10 2010-09-16 Grünenthal GmbH Substituierte 3-amino-2-mercaptochinoline als kcnq2/3 modulatoren
WO2010102811A1 (de) * 2009-03-12 2010-09-16 Grünenthal GmbH Substituierte 2-mercaptochinolin-3-carboxamide als kcnq2/3 modulatoren
WO2010102809A1 (de) * 2009-03-12 2010-09-16 Grünenthal GmbH Substituierte nicotinamide als kcnq2/3 modulatoren
US20130287686A1 (en) * 2012-04-30 2013-10-31 Scifluor Life Sciences, Llc Fluorinated 2-Amino-4-(Benzylamino)Phenylcarbamate Derivatives

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WO2020016297A1 (de) 2020-01-23

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