DE102018130133A1 - Method for the detection of analytes based on immobilized proteins - Google Patents

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DE102018130133A1
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Gerhard Rödel
Kai Ostermann
Julia Döring
Christian Dahmann
Tilo Pompe
David Rettke
Steve Martin
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Technische Universitaet Dresden
Universitaet Leipzig
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Technische Universitaet Dresden
Universitaet Leipzig
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zur Detektion von Analyten, insbesondere von niedermolekularen Analyten. Erfindungsgemäß wird dabei ein einfaches Verfahren zur Detektion von niedermolekularen Analyten bereitgestellt, bei dem die zu detektierenden Analyten als Kompetitoren für immobilisierte Enzyme agieren. Durch die Inhibierung kann über den reduzierten Substratumsatz auf die Analytkonzentration geschlossen werden. Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Detektion von Glyphosat bereitgestellt.The invention relates to a method and a kit for the detection of analytes, in particular of low molecular weight analytes. According to the invention, a simple method for the detection of low molecular weight analytes is provided, in which the analytes to be detected act as competitors for immobilized enzymes. The inhibition allows conclusions to be drawn about the analyte concentration via the reduced substrate conversion. In particular, a method for detecting glyphosate is provided according to the invention.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Analyten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion von niedermolekularen Analyten.The invention relates to a method for the detection of analytes. In particular, the invention relates to a method for the detection of low molecular weight analytes.

Der Nachweis von niedermolekularen Analyten gestaltet sich aktuell aufwändig. Insbesondere der Nachweis von Pflanzenschutzmitteln in Trinkwasser und Bodenproben und deren gesundheitliche Auswirkungen sind aktuell von hohem Interesse. Problematisch erscheint dabei vor allem die Verunreinigung von Nahrungsmitteln inklusive Trinkwasser mit Glyphosat.The detection of low molecular weight analytes is currently complex. In particular, the detection of pesticides in drinking water and soil samples and their health effects are currently of great interest. The contamination of food including drinking water with glyphosate appears to be particularly problematic.

Die Detektion von Verunreinigungen mit Pflanzenschutzmitteln in Lebensmitteln erfolgt nach der Multimethode DFG S19, wobei zur Probenvorbereitung verschiedene Extraktionsschritte erfolgen und nachfolgend die Analyse mittels LC-MS oder GC-MS erfolgt.The detection of contaminants with pesticides in food is carried out according to the DFG multi-method S19 , with different extraction steps taking place for sample preparation, followed by analysis using LC-MS or GC-MS.

Im Stand der Technik sind zudem verschiedene Verfahren zur Bestimmung von Glyphosat bekannt.Various methods for determining glyphosate are also known in the prior art.

So offenbart die CN102207495A ein Verfahren zur Bestimmung des Glyphosat-Gehalts in Bodenproben mittels HPLC.So the reveals CN102207495A a method for determining the glyphosate content in soil samples by means of HPLC.

Auch die WO2008118899 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat mittels LC/GC gekoppeltem MS. Alternativ werden auch Nachweismethoden mittels Biolumineszenz ( WO2010104861A1 ) und ELISA ( WO2000014538A1 ) beschrieben.Also the WO2008118899 A1 discloses a method for the detection of glyphosate by means of LC / GC coupled MS. Alternatively, detection methods using bioluminescence ( WO2010104861A1 ) and ELISA ( WO2000014538A1 ) described.

Die WO2018057647 A1 beschreibt einen Assay für einen Biochip, bei dem Pestizide auf einer Sensorplattform detektiert werden können. Der Nachweis basiert dabei auf der Amplifikation von korrespondierenden Nukleinsäuren, was zu deutlich langen Analysezeiten führt.The WO2018057647 A1 describes an assay for a biochip in which pesticides can be detected on a sensor platform. The detection is based on the amplification of corresponding nucleic acids, which leads to significantly long analysis times.

Der Nachweis entsprechender niedermolekularer Analyten ist bisher experimentell aufwändig und nicht geeignet um Vor-Ort-Analyse zu ermöglichen.The detection of corresponding low molecular weight analytes has so far been experimentally complex and not suitable to enable on-site analysis.

Es besteht daher ein Bedürfnis eine Nachweismethode anzugeben, die einen einfachen Nachweis niedermolekularer Analyten vor Ort ermöglicht.There is therefore a need to specify a detection method that enables simple detection of low molecular weight analytes on site.

Die Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Detektion von Analyten anzugeben, das die Nachteile im Stand der Technik überwinden kann.The object of the invention is therefore to provide a method for the detection of analytes which can overcome the disadvantages in the prior art.

Die Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.The object is achieved by the method according to the invention. Advantageous refinements are specified in the dependent claims.

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Detektion von Analyten in einer Probe vorgeschlagen, umfassend die Schritte:

  • - Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner eine Affinität zur Interaktion mit einem zu detektierenden Analyten aufweist,
  • - Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert,
  • - Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Substrat, wobei das Substrat durch den Analytbindungspartner zu einem Produkt umgesetzt wird,
  • - Quantifizierung des Produkts und
  • - Korrelation des quantifizierten Produkts mit einer Referenzprobe.
According to the invention, a method for the detection of analytes in a sample is proposed, comprising the steps:
  • Providing a surface with an immobilized analyte binding partner, the analyte binding partner having an affinity for interaction with an analyte to be detected,
  • Contacting the analyte binding partner with a sample containing the analyte, the analyte interacting with the analyte binding partner,
  • Contacting the analyte binding partner with a substrate, the substrate being converted into a product by the analyte binding partner,
  • - quantification of the product and
  • - Correlation of the quantified product with a reference sample.

Unter niedermolekularen Analyten werden Stoffe oder Moleküle mit einer Molmasse von <800 g/mol verstanden.Low molecular weight analytes are understood to mean substances or molecules with a molecular weight of <800 g / mol.

In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt eine parallele Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten und dem Substrat.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is contacted in parallel with the analyte and the substrate.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Protein oder Peptid aufweisend eine enzymatische Aktivität.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is a protein or peptide having an enzymatic activity.

Unter einem Substrat wird im Sinne der Erfindung zumindest ein Stoff verstanden, der von einer Proteindomäne des Analytbindungspartners, welche eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt aufweist, umgesetzt wird. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Substrat auch zwei oder mehr Stoffe, welche von der Proteindomäne des Analytbindungspartners, welche eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt aufweist, umgesetzt werden. In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Substrat Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat.For the purposes of the invention, a substrate is understood to mean at least one substance which is converted by a protein domain of the analyte binding partner which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product. In embodiments of the invention, the substrate also comprises two or more substances which are converted by the protein domain of the analyte binding partner, which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product. In embodiments of the invention, the substrate comprises shikimate 3-phosphate and phosphoenol pyruvate.

In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner die enzymatische Aktivität des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS, EC 2.5.1.19) auf. Die EPSPS katalysiert dabei die Umsetzung von Shikimat-3-phosphat und Phosphoenolpyruvat zu 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat, wobei Phosphat freigesetzt wird. Die Verwendung der EPSPS kann dabei vorteilhaft für den Nachweis von Glyphosat genutzt werden, da dieses die EPSPS inhibiert und somit über die verminderte enzymatische Aktivität der Nachweis für das Vorhandensein von Glyphosat in der zu untersuchenden Probe erfolgt. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner die enzymatische Aktivität des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase aus E. coli (https://www.uniprot.org/uniprot/P0A6D3) auf. Bevorzugt umfasst der Analytbindungspartner die SEQ ID No. 1.In embodiments of the invention, the analyte binding partner has the enzymatic activity of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS, EC 2.5.1.19). The EPSPS catalyzes the conversion of shikimate-3-phosphate and phosphoenolpyruvate to 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate, whereby phosphate is released. The use of the EPSPS can be used advantageously for the detection of glyphosate, since this inhibits the EPSPS and thus the detection of the presence of glyphosate in the sample to be examined is carried out via the reduced enzymatic activity. In embodiments of the invention, the analyte binding partner has the enzymatic activity of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from E. coli (https://www.uniprot.org/uniprot/P0A6D3). The analyte binding partner preferably comprises SEQ ID No. 1.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is designed as a fusion protein. The fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.

In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt. Durch die Proteindomäne mit enzymatischer Aktivität kann das Substrat zu dem Produkt umgesetzt werden, wobei das Produkt oder ein Nebenprodukt der katalysierten Reaktion nachfolgend detektiert werden kann.In embodiments of the invention, the analyte binding partner comprises a protein domain, which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product. The substrate can be converted to the product by the protein domain with enzymatic activity, the product or a by-product of the catalyzed reaction subsequently being detectable.

In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne und eine Proteindomäne aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt auf.In embodiments of the invention, the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers, and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality. The analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain. In embodiments of the invention, the analyte binding partner has a hydrophobin domain and a protein domain having an enzymatic activity for converting the substrate to the product.

In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.In embodiments of the invention, the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa. The analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain. The hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface. In embodiments of the invention, the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.

In Ausführungsformen der Erfindung wird der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt. Die angegebenen Mischungsverhältnisse beziehen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf die Stoffmengen.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1 : 5 lies. For the purposes of the present invention, the mixing ratios given relate to the amounts of substance.

In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5.In embodiments of the invention, a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N. ) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5.

In Ausführungsformen der Erfindung wird der Analytbindungspartner durch Interaktion mit dem Analyten gehemmt. Dabei weist der Analytbindungspartner eine enzymatische Aktivität auf, welche durch die Interaktion mit dem Analyten gehemmt wird. Die Hemmung kann dabei kompetitiv oder nicht kompetitiv erfolgen. Durch Interaktion mit dem Analyten wird somit die Umsetzung des Substrats zum Produkt zumindest vermindert oder verlangsamt.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is inhibited by interaction with the analyte. The analyte binding partner has an enzymatic activity which is inhibited by the interaction with the analyte. The inhibition can be competitive or non-competitive. Interaction with the analyte thus at least reduces or slows down the conversion of the substrate to the product.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analyt ein Pflanzenschutzmittel ausgewählt aus der Gruppe der Phosphonate, Bipyridine, 1,3-Cyclohexandione, Benzothiadiazole, Phenylpyridazine und Phenoxypropionsäuren.In embodiments of the invention, the analyte is a crop protection agent selected from the group of the phosphonates, bipyridines, 1,3-cyclohexanediones, benzothiadiazoles, phenylpyridazines and phenoxypropionic acids.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analyt Glyphosat. Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)glycin) ist ein nicht-selektives Blattherbizid (Breitband- oder Totalherbizid) mit systemischer Wirkung, das über jegliche grünen Pflanzenteile aufgenommen wird. Glyphosat wird in der Landwirtschaft gegen einkeim- und zweikeimblättrige Unkräuter im Acker-, Wein- und Obstbau, beim Anbau von Zierpflanzen, auf Wiesen, Weiden und Rasenflächen sowie im Forst verwendet. Die Blätter nehmen Glyphosat durch Diffusion auf und in der Pflanze wird Glyphosat über das Phloem verteilt. Glyphosat wirkt über die Blockade des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), das zur Synthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin über den Shikimatweg in Pflanzen, wie auch in den meisten Mikroorganismen, benötigt wird. Durch die Ähnlichkeit des Glyphosats mit Phosphoenolpyruvat wird das Enzym 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) gehemmt.In embodiments of the invention, the analyte is glyphosate. Glyphosate (N- (phosphonomethyl) glycine) is a non-selective leaf herbicide (broad spectrum or total herbicide) with a systemic effect that is absorbed by any green part of the plant. Glyphosate is used in agriculture against single and double germ weeds in arable, wine and fruit growing, in the cultivation of ornamental plants, on meadows, pastures and lawns as well as in the forest. The leaves absorb glyphosate by diffusion and in the plant glyphosate is distributed over the phloem. Glyphosate works by blocking the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS), which is required for the synthesis of the aromatic amino acids phenylalanine, tryptophan and tyrosine via the shikimate route in plants, as in most microorganisms. The enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) is inhibited by the similarity of the glyphosate with phosphoenolpyruvate.

In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Quantifizierung des Produkts durch optische Detektion. Durch die Möglichkeit der optischen Detektion ist eine einfache Quantifizierung des Analyten möglich. Bevorzugt erfolgt die optische Detektion über einen Farbstoff, der eine einfache optische Detektion erlaubt. In embodiments of the invention, the product is quantified by optical detection. The possibility of optical detection enables simple quantification of the analyte. The optical detection is preferably carried out using a dye which allows simple optical detection.

In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Quantifizierung des Produkts photometrisch. Dadurch ist eine einfache Quantifizierung möglich. Vorzugsweise erfolgt die Quantifizierung durch Korrelation mit einem Standard oder einer Probe ohne Analyten.In embodiments of the invention, the product is quantified photometrically. This enables simple quantification. The quantification is preferably carried out by correlation with a standard or a sample without analyte.

In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Quantifizierung des Produkts mit Malachitgrün. Dabei wird der Gehalt an Phosphat mittels Malachitgrün ermittelt. So wird bei der Hemmung der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) durch Glyphosat die Reaktion mit Phosphoenolpyruvat gehemmt, sodass eine Umsetzung zu 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat und Phosphat nicht oder nur verlangsamt erfolgt. Durch Nachweis mit Malachitgrün kann das in der Reaktion gebildete Phosphat bestimmt werden und somit als Maß für die Inhibierung der EPSPS genutzt werden.In embodiments of the invention, the product is quantified with malachite green. The phosphate content is determined using malachite green. For example, when 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) is inhibited by glyphosate, the reaction with phosphoenolpyruvate is inhibited, so that conversion to 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate and phosphate does not take place or only slows down. The phosphate formed in the reaction can be determined by detection with malachite green and thus used as a measure for the inhibition of the EPSPS.

In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche an der die Immobilisierung des Analytbindungspartners erfolgt als Partikel ausgebildet. Bevorzugt ist die Oberfläche als Hydrogelpartikel ausgebildet. Dadurch kann der Nachweis des Analyten in Lösung erfolgen. Dies ist beispielsweise vorteilhaft, wenn eine photometrische Bestimmung erfolgen soll.In embodiments of the invention, the surface on which the analyte binding partner is immobilized is formed as a particle. The surface is preferably designed as a hydrogel particle. This enables the analyte to be detected in solution. This is advantageous, for example, if a photometric determination is to be carried out.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Oberfläche aufweisend den erfindungsgemäßen Analytbindungspartner.The invention also relates to a surface having the analyte binding partner according to the invention.

In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche im Wesentlichen planar ausgebildet. Beispielsweise kann die Oberfläche ein Glas- oder Kunststoffformkörper sein z. B. ein Objektträger, Deckgläschen, Siliziumwafer oder ähnliches. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche als 96-Well-Platte ausgebildet. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche als Partikel ausgebildet.In embodiments of the invention, the surface is essentially planar. For example, the surface can be a glass or plastic molded body such. B. a slide, coverslip, silicon wafer or the like. In embodiments of the invention, the surface is designed as a 96-well plate. In embodiments of the invention, the surface is designed as a particle.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is designed as a fusion protein. The fusion protein has, for example, different protein domains which have different functionalities.

In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt. Durch die Proteindomäne mit enzymatischer Aktivität kann das Substrat zu dem Produkt umgesetzt werden, wobei das Produkt oder ein Nebenprodukt der katalysierten Reaktion nachfolgend detektiert werden kann.In embodiments of the invention, the analyte binding partner comprises a protein domain, which has an enzymatic activity for converting the substrate to the product. The substrate can be converted to the product by the protein domain with enzymatic activity, the product or a by-product of the catalyzed reaction subsequently being detectable.

In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf.In embodiments of the invention, the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, ECM proteins, S-layer proteins, peptide linkers, and protein tags. This enables directional immobilization to the surface, at least one protein domain mediating the linkage and a further protein domain having further functionality. The analyte binding partner preferably has a hydrophobin domain.

In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.In embodiments of the invention, the analyte binding partner has a hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N.) crassa. The analyte binding partner preferably has the SEQ. ID. No. 5 on.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und zumindest eine Proteindomäne, aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung des Substrats zu dem Produkt.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is a fusion protein having a hydrophobin domain and at least one protein domain, having an enzymatic activity for converting the substrate to the product.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain. The hydrophobin domain enables the analyte binding partner to be immobilized on the surface. In embodiments of the invention, the fusion protein has SEQ ID No. 6 on.

In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.In embodiments of the invention, the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1 : 5 lies.

In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5. Durch Variation des Verhältnisses von Fusionsprotein und Hydrophobin auf der Oberfläche kann zusätzlich die Sensitivität gegenüber Glyphosat sehr gezielt eingestellt werden und ermöglicht damit einen Nachweis von Glyphosat über einen weiten Konzentrationsbereich.In embodiments of the invention, a mixture of the fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain (SEQ ID No. 6) and the hydrophobin domain Ccg2 from Neurospora (N. ) crassa (SEQ ID No. 5) in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5. By varying the ratio of fusion protein and hydrophobin on the surface, the sensitivity to glyphosate can additionally be set in a very targeted manner and thus enables detection of glyphosate over a wide concentration range.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Detektion von Analyten umfassend einen Analytbindungspartner aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung eines Substrats sowie ein Hydrophobin. Die im Kit enthaltenen Analytbindungspartner sowie das Hydrophobin werden vorteilhaft zur Immobilisierung im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt im Verhältnis 1:5 gemischt und auf einer Oberfläche immobilisiert. Dabei stabilisiert das Hydrophobin die Oberfläche während der Analytbindungspartner zur Interaktion mit dem Analyten ausgebildet ist.The invention also relates to a kit for the detection of analytes comprising an analyte binding partner having an enzymatic activity for converting a substrate and a hydrophobin. The analyte binding partners and the hydrophobin contained in the kit are advantageously mixed for immobilization in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably 1: 3 to 1: 8, particularly preferably in a ratio of 1: 5 and immobilized on a surface. The hydrophobin stabilizes the surface while the analyte binding partner is designed to interact with the analyte.

In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Kit als Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne.In embodiments of the invention, the kit comprises as analyte binding partner a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain.

In Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Kit ein Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 sowie ein Hydrophobin mit der SEQ ID No. 5.In embodiments of the invention, the kit comprises a fusion protein with SEQ ID No. 6 and a hydrophobin with SEQ ID No. 5.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des erfindungsgemäßen Kits zur Detektion von Analyten.The invention also relates to the use of the method according to the invention and the kit according to the invention for the detection of analytes.

Zur Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.To implement the invention, it is also expedient to combine the above-described embodiments and features of the claims.

Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden schematischen Zeichnungen und Ausführungsbeispielen, anhand derer die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden soll, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.Further features and advantages of the present invention result from the following schematic drawings and exemplary embodiments, by means of which the invention is to be explained in more detail by way of example, without restricting the invention to these.

Dabei zeigt:

  • 1: die schematische Darstellung des Assays, beruhend auf dem Nachweis von anorganischem Phosphat,
  • 2: die Aktivitätsmessung mittels Malachitgrün-Assay bei unterschiedlichen Belegungsdichten,
  • 3: die Glyphosat-abhängige Hemmung der EcEPSPS auf der Oberfläche (1 µM Ccg2_GS_EcEPSPS : 5µM Ccg2) mittels Malachitgrün-Assay,
  • 4: im Vergleich dazu, die Glyphosat-abhängige Hemmung von 1µM EcEPSPS in Lösung mittels Malachitgrün-Assay,
  • 5: die Entfernung verschiedener Phosphatkonzentrationen aus Lösung mittels zweier verschiedener Phosphat-bindenden Substanzen.
It shows:
  • 1 : the schematic representation of the assay based on the detection of inorganic phosphate,
  • 2nd : the activity measurement using a malachite green assay at different occupancy densities,
  • 3rd : the glyphosate-dependent inhibition of EcEPSPS on the surface (1 µM Ccg2_GS_EcEPSPS: 5µM Ccg2) using a malachite green assay,
  • 4th : in comparison, the glyphosate-dependent inhibition of 1µM EcEPSPS in solution using a malachite green assay,
  • 5 : the removal of different phosphate concentrations from solution using two different phosphate-binding substances.

Das Prinzip der Nachweismethode ist in 1 gezeigt. Es beruht auf dem Malachitgrün-Assay, welcher zum allgemeinen Nachweis von anorganischem Phosphat eingesetzt wird ( Baykov et al. 1988 ). Aus der zu analysierenden Lösung muss zunächst Phosphat mit Hilfe einer Phosphat-bindenden Substanz entfernt werden. Anschließend wird der Analyt, gemeinsam mit den benötigten Substraten Shikimat-3-phosphat (S3P) und Phosphoenolpyruvat (PEP) auf eine vorbereitete Oberfläche, beispielsweise eine 96-well-Platte (beschichtet mit Mischung aus Hydrophobin Ccg2 (SEQ ID No. 4) und dem Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6)) gegeben und für 30-45 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Malachitgrün-Arbeitslösung zur Detektion des bei der Reaktion gebildeten anorganischem Phosphats (Pi) hinzugefügt und für 20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Durch Messen der Absorption bei 630 nm und Vergleich mit einer Kontrolle/Standard kann dann die in der Analytlösung vorhandene Glyphosatmenge bestimmt werden.The principle of the detection method is in 1 shown. It is based on the malachite green assay, which is used for the general detection of inorganic phosphate ( Baykov et al. 1988 ). Phosphate must first be removed from the solution to be analyzed using a phosphate-binding substance. Then the analyte, together with the required substrates shikimate-3-phosphate (S3P) and phosphoenolpyruvate (PEP), is placed on a prepared surface, for example a 96-well plate (coated with a mixture of hydrophobin Ccg2 (SEQ ID No. 4) and given the fusion protein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6)) and incubated for 30-45 minutes. The malachite green working solution for detecting the inorganic phosphate (Pi) formed in the reaction is then added and incubated for 20 minutes in the dark. The amount of glyphosate present in the analyte solution can then be determined by measuring the absorption at 630 nm and comparing it with a control / standard.

Zum Einstellen eines guten Signal-Rauschverhältnisses des Assays wurden in 2 verschiedene Belegungsdichten auf Polystyrol-Oberflächen getestet. Hierfür wurde insbesondere die Hydrophobinkonzentration variiert. Mit steigender Hydrophobinkonzentration ist eine höhere Enzymfunktion zu verzeichnen. Ab einer Hydrophobinkonzentration von 5 µM ist keine weitere Aktivitätssteigerung mehr zu beobachten. Die Hemmung des Enzyms mit 0,5 µM Glyphosat ist bei diesem Verhältnis detektierbar.To establish a good signal-to-noise ratio of the assay, in 2nd Different coverage densities tested on polystyrene surfaces. For this, the hydrophobin concentration was varied in particular. With increasing hydrophobin concentration, a higher enzyme function can be observed. From a hydrophobin concentration of 5 µM, no further increase in activity can be observed. The inhibition of the enzyme with 0.5 µM glyphosate can be detected at this ratio.

Als Machbarkeitsbeweis wurden in 3 verschiedene Glyphosatkonzentrationen zu einer funktionalisierten Glasoberfläche (Beschichtung mit 1 µM Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6): 5 µM Ccg2 (SEQ ID No. 5)) gegeben und der Malachitgrün-Assay durchgeführt. Die Hemmung der Enzymaktivität bei verschiedenen Glyphosatkonzentrationen wird deutlich.As proof of feasibility, in 3rd Various glyphosate concentrations were added to a functionalized glass surface (coating with 1 µM Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6): 5 µM Ccg2 (SEQ ID No. 5)) and the malachite green assay was carried out. The inhibition of enzyme activity at different glyphosate concentrations becomes clear.

Im Vergleich zu 3, wurde für 4 die Glyphosat-abhängige Hemmung von 1 µM EcEPSPS (SEQ ID No. 4) in Lösung getestet. Die Hemmung des Enzyms wird hier nicht sichtbar.Compared to 3rd , was for 4th tested the glyphosate-dependent inhibition of 1 µM EcEPSPS (SEQ ID No. 4) in solution. The inhibition of the enzyme is not visible here.

Ebenfalls als Machbarkeitsnachweis wurden für 5 zwei verschiedene Phosphat-bindende Substanzen zu Lösungen mit verschiedenen Phosphatkonzentrationen gegeben und diese mindestens eine Stunde inkubiert, anschließend abzentrifugiert und mit Hilfe des Malachitgrün-Assays die verbleibende Phosphatmenge bestimmt.Also as proof of feasibility for 5 two different phosphate-binding substances are added to solutions with different phosphate concentrations and these are incubated for at least one hour, then centrifuged off and the remaining amount of phosphate is determined using the malachite green assay.

Der Malachitgrün-Assay ist ein bekanntes Verfahren zum Nachweis von anorganischem Phosphat. Er beruht auf der Komplexierung von anorganischem Phosphat mit Molybdat. In Anwesenheit von Malachitgrün führt diese Komplexierung zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums nach ca. 630 nm. Dementsprechend deutet eine hohe Absorption bei 630 nm auf eine hohe Konzentration an Pi hin. Dieses entsteht bei der Reaktion der EPSPS mit ihren Substraten Phosphoenolpyruvat (PEP) und Shikimat-3-phosphat (S3P). Dementsprechend kann der Malachitgrün-Assay für den Aktivitätsnachweis der EPSPS genutzt werden. Glyphosat führt zur Hemmung der EPSPS, da es mit PEP um die Bindung im aktiven Enzymzentrum konkurriert. Je mehr Glyphosat im umgebenden Medium ist, desto geringer ist die EPSPS-Aktivität.The malachite green assay is a well-known method for the detection of inorganic phosphate. It is based on the complexation of inorganic phosphate with molybdate. In the presence of malachite green, this complexation leads to a shift in the absorption maximum to approx. 630 nm. Accordingly, a high absorption at 630 nm indicates a high concentration of Pi. This occurs during the reaction of the EPSPS with its substrates phosphoenolpyruvate (PEP) and shikimate-3-phosphate (S3P). Accordingly, the malachite green assay can be used to demonstrate the activity of the EPSPS. Glyphosate inhibits EPSPS because it competes with PEP for binding in the active enzyme center. The more Glyphosate in the surrounding medium, the lower the EPSPS activity.

In einer Variante des Nachweisverfahrens kann das EcEPSPS alternativ zu einer Chip-Oberflächen funktionserhaltend an suspendierte Hydrogelmikropartikel (Herstellung über Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid mit anschließender radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, mittlerer Radius 20 µm) gekoppelt. Damit können größere Oberflächen mit immobilisierter EcEPSPS in kleineren Analytlösungen erzeugt und somit höhere Sensitivitäten erreicht werden.In a variant of the detection method, as an alternative to a chip surface, the EcEPSPS can be coupled to suspended hydrogel microparticles in a function-preserving manner (production via emulsion and free-radical precipitation polymerization of polyethylene glycol diacrylamide with subsequent radical grafting of acrylic acid monomers to introduce the carboxyl groups, average radius 20 μm). This means that larger surfaces can be generated with immobilized EcEPSPS in smaller analyte solutions and higher sensitivities can be achieved.

Ausführungsbeispiel 1: Nachweis von Glyphosat mittels funktionalisierter Oberfläche und Malachitgrün-AssayEmbodiment 1: Detection of glyphosate by means of a functionalized surface and malachite green assay

Für die Erzeugung einer funktionalisierten Oberfläche wurden Fusionsproteine aus dem Hydrophobin Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa und der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase aus Escherichia (E.) coli (EcEPSPS) benötigt. Hierzu wurden die kodierenden Bereiche der jeweiligen Gene, verbunden über die Sequenz für einen flexiblen Glycin-Serin-Linker, in den Expressionsvektor pET28b (Novagen, Deutschland) übertragen. Hierbei liegt die Sequenz des Hydrophobins (SEQ ID No. 2) 5'-seitig und die der EcEPSPS (SEQ ID No. 1) 3'-seitig von der Linkersequenz. Zusätzlich befindet sich 5'-seitig von der Sequenz für das Fusionsprotein die Sequenz für einen (His)6-Tag, welcher für die Detektion und Reinigung des Fusionsproteins erforderlich ist. Weiterhin wurde für die Oberfläche das Hydrophobin ohne EcEPSPS benötigt. Die Gensequenz (SEQ ID No. 2) wurde dementsprechend ohne den Linker und die EcEPSPS-Sequenz in den Vektor pET28b übertragen. Die auf diese Weise modifizierten Vektoren wurden nach vollständiger Sequenzierung der eingebrachten Sequenzen, in denE. coli Expressionsstamm SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) übertragen. Dieser Expressionsstamm ist vorteilhaft für die Expression der Hydrophobine, da er zusätzlich für eine Disulfidbrückenisomerase kodiert, welche die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken der Hydrophobine begünstigt. Diese spielen eine wesentliche Rolle für die richtige Faltung des Proteins.Fusion proteins from the hydrophobin Ccg2 from Neurospora (N.) crassa and the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia (E.) coli (EcEPSPS) were required to create a functionalized surface. For this purpose, the coding regions of the respective genes, linked via the sequence for a flexible glycine-serine linker, were transferred into the expression vector pET28b (Novagen, Germany). The sequence of the hydrophobin (SEQ ID No. 2) is on the 5 'side and that of the EcEPSPS (SEQ ID No. 1) on the 3' side of the linker sequence. In addition, on the 5 'side of the sequence for the fusion protein there is the sequence for a (His) 6 day, which is required for the detection and purification of the fusion protein. Furthermore, the hydrophobin without EcEPSPS was required for the surface. The gene sequence (SEQ ID No. 2) was accordingly transferred into the vector pET28b without the linker and the EcEPSPS sequence. The vectors modified in this way were, after complete sequencing of the introduced sequences, into the E. coli expression strain SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) transferred. This expression strain is advantageous for the expression of the hydrophobins, since it additionally codes for a disulfide bridge isomerase, which favors the correct formation of the disulfide bridges of the hydrophobins. These play an essential role in the correct folding of the protein.

Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) zu E. coli-Zellen, welche sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, gestartet. Nach der Induktion wurden die Zellen für 4 weitere Stunden bei 30°C und 180 Umdrehungen in der Minute inkubiert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und gewaschen, um sie dann für die Proteinreinigung weiter verwenden zu können. Die angewendete Reinigungsmethode ist abhängig von der Löslichkeit der Proteine. Die löslichen Fusionsproteine (Ccg2_GS_EcEPSPS, SEQ ID No. 6) wurden mittels Nickel-Affinitätschromatografie unter nativen Bedingungen nach Herstellerangaben gereinigt, während die unlöslichen Hydrophobine mittels denaturierender Nickel-Affinitätschromatografie nach Herstellerangaben gereinigt wurden. Die Hydrophobine wurden vor der Dialyse durch Ultrafiltration konzentriert, für die Fusionsproteine war dies nicht nötig. Nach der Reinigung wurden die Hydrophobine gegen einen Redox-Rückfaltepuffer (10mM Glutathion reduziert, 1mM Glutathion oxidiert; pH 5,4) und die Fusionsproteine gegen den Monsanto-Dialysepuffer (10 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 5% (v/v) 99,9% Glycerin, 1mM DTT, pH 7) dialysiert, anschließend im Kühlschrank gelagert und für die Funktionalisierung von 96-Wellplatten aus Polystyrol eingesetzt.Protein expression was started by adding 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) to E. coli cells that were in the exponential growth phase. After induction, the cells were incubated for an additional 4 hours at 30 ° C and 180 revolutions per minute. The cells were then pelleted and washed so that they could then be used for protein purification. The cleaning method used depends on the solubility of the proteins. The soluble fusion proteins (Ccg2_GS_EcEPSPS, SEQ ID No. 6) were purified using nickel affinity chromatography under native conditions according to the manufacturer's instructions, while the insoluble hydrophobins were purified using denaturing nickel affinity chromatography according to the manufacturer's instructions. The hydrophobins were concentrated by ultrafiltration before dialysis; this was not necessary for the fusion proteins. After purification, the hydrophobins were reduced against a redox refolding buffer (10mM glutathione, 1mM glutathione oxidized; pH 5.4) and the fusion proteins against the Monsanto dialysis buffer (10mM MOPS, 0.5mM EDTA, 5% (v / v ) 99.9% glycerol, 1mM DTT, pH 7) dialyzed, then stored in the refrigerator and used for the functionalization of 96-well plates made of polystyrene.

Die Funktionalisierung der 96-Well-Platten erfolgte durch Aufpipettieren der entsprechenden Proteinlösung mit anschließender 30-minütiger Inkubation. Daraufhin wurde der Überstand abgenommen, erneut für 5 Minuten inkubiert und die Wells danach gründlich mit Dialysepuffer gewaschen, um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. Die Oberfläche wurde mit Dialysepuffer überschichtet und konnte dann für den Malachitgrün-Assay eingesetzt werden.The 96-well plates were functionalized by pipetting on the corresponding protein solution and then incubating for 30 minutes. The supernatant was then removed, incubated again for 5 minutes and the wells were then washed thoroughly with dialysis buffer in order to remove non-specifically bound protein. The surface was overlaid with dialysis buffer and could then be used for the malachite green assay.

Die beiden verschiedenen Proteinvarianten wurden benötigt, um ein optimales Verhältnis zwischen Fusionsprotein (bindet Glyphosat) und Hydrophobin (zur Stabilisierung der Oberfläche) einstellen zu können. Hierfür wurden die Proteinvarianten in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt und die Oberflächen funktionalisiert. Anschließend wurde der Malachitgrün-Assay durchgeführt. Der Malachitgrün-Assay ist ein Nachweisverfahren für anorganisches Phosphat.The two different protein variants were required in order to be able to set an optimal ratio between the fusion protein (binds glyphosate) and hydrophobin (to stabilize the surface). For this, the protein variants were mixed in different ratios and the surfaces were functionalized. The malachite green assay was then performed. The malachite green assay is a detection method for inorganic phosphate.

Durch Testung verschiedener Verhältnisse von Fusionsprotein zu Hydrophobin konnte gezeigt werden, dass ein Verhältnis von 1 µM Fusionsprotein zu 5 µM Hydrophobin für den Assay gut geeignet ist (2). Bei diesem Verhältnis zeigte sich eine gute EPSPS-Aktivität, d.h. es lag ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis vor. Steigende Hydrophobinkonzentrationen brachten keine weitere Aktivitätssteigerung. Geringere Mengen des Fusionsproteins führen zu geringeren Signalstärken, ebenso wie höhere Fusionsproteinkonzentrationen. Dies könnte auf eine sterische Behinderung der Proteinaktivität untereinander auf Grund einer zu dichten Funktionalisierung zurückzuführen sein. Ein weiterer Punkt der zu berücksichtigen ist, ist das mit steigender Fusionsproteinkonzentration die Sensitivität des Assays gegenüber Glyphosat abnimmt, da mehr freie Bindestellen abgesättigt werden müssen, um den Aktivitätsverlust in Anwesenheit von Glyphosat messen zu können.By testing different ratios of fusion protein to hydrophobin it could be shown that a ratio of 1 µM fusion protein to 5 µM hydrophobin is well suited for the assay ( 2nd ). This ratio showed good EPSPS activity, ie there was a good signal-to-noise ratio. Increasing concentrations of hydrophobin brought no further increase in activity. Lower amounts of the fusion protein lead to lower signal strengths, as do higher concentrations of the fusion protein. This could be due to steric hindrance to protein activity due to too dense functionalization. Another point to be considered is that the sensitivity of the assay to glyphosate decreases with increasing fusion protein concentration, since more free binding sites have to be saturated in order to be able to measure the loss of activity in the presence of glyphosate.

Die entwickelte Oberfläche bietet hier einen entscheidenden Vorteil gegenüber gelöstem Protein. Im verwendeten Konzentrationsbereich ist die Oberfläche deutlich sensitiver gegenüber Glyphosat als gelöstes Protein (Vergleich 3 und 4). Durch Variation des Verhältnisses von Fusionsprotein und Hydrophobin auf der Oberfläche kann zusätzlich die Sensitivität gegenüber Glyphosat sehr gezielt eingestellt werden und ermöglicht damit einen Nachweis von Glyphosat über einen weiten Konzentrationsbereich. The developed surface offers a decisive advantage over dissolved protein. In the concentration range used, the surface is significantly more sensitive to glyphosate than dissolved protein (comparison 3rd and 4th ). By varying the ratio of fusion protein and hydrophobin on the surface, the sensitivity to glyphosate can additionally be set in a very targeted manner and thus enables detection of glyphosate over a wide concentration range.

Um Falsch-Positive Ergebnisse zu verhindern, muss vor der Durchführung des Malachitgrün-Assays Phosphat aus der Analyselösung entfernt werden. Dies lässt sich durch den Einsatz von kommerziell erhältlichen Phosphatbindern oder durch eine Eisenchlorid-Lösung realisieren ( 5).To prevent false positives, phosphate must be removed from the analysis solution before performing the malachite green assay. This can be achieved by using commercially available phosphate binders or by using an iron chloride solution ( 5 ).

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte PatentliteraturPatent literature cited

  • CN 102207495 A [0005]CN 102207495 A [0005]
  • WO 2008118899 A1 [0006]WO 2008118899 A1 [0006]
  • WO 2010104861 A1 [0006]WO 2010104861 A1 [0006]
  • WO 2000014538 A1 [0006]WO 2000014538 A1 [0006]
  • WO 2018057647 A1 [0007]WO 2018057647 A1 [0007]

Zitierte Nicht-PatentliteraturNon-patent literature cited

  • Baykov et al. 1988 [0049]Baykov et al. 1988 [0049]

Claims (18)

Verfahren zur Detektion von Analyten in einer Probe umfassend die Schritte: - Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner eine Affinität zur Interaktion mit einem zu detektierenden Analyten aufweist, - Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert, - Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Substrat, wobei das Substrat durch den Analytbindungspartners zu einem Produkt umgesetzt wird, - Quantifizierung des Produkts und - Korrelation des quantifizierten Produkts mit einer Referenzprobe.Method for the detection of analytes in a sample comprising the steps: Providing a surface with an immobilized analyte binding partner, the analyte binding partner having an affinity for interaction with an analyte to be detected, Contacting the analyte binding partner with a sample containing the analyte, the analyte interacting with the analyte binding partner, Contacting the analyte binding partner with a substrate, the substrate being converted into a product by the analyte binding partner, - quantification of the product and - Correlation of the quantified product with a reference sample. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet ist.Procedure according to one of the Claims 1 , characterized in that the analyte binding partner is designed as a fusion protein. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner eine Proteindomäne umfasst, aufweisend die enzymatische Aktivität des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase.Procedure according to Claim 1 or 2nd , characterized in that the analyte binding partner comprises a protein domain, having the enzymatic activity of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner eine Proteindomäne umfasst, ausgewählt aus Hydrophobinen, bevorzugt die Hydrophobin-Domäne Ccg2 mit der SEQ ID No.5Method according to one of the preceding claims, characterized in that the analyte binding partner comprises a protein domain selected from hydrophobins, preferably the hydrophobin domain Ccg2 with SEQ ID No.5 Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner als Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 ausgebildet ist.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the analyte binding partner as a fusion protein with SEQ ID No. 6 is formed. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner durch Interaktion mit dem Analyten gehemmt wird.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the analyte binding partner is inhibited by interaction with the analyte. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt Glyphosat ist.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the analyte is glyphosate. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegtMethod according to one of the preceding claims, characterized in that the analyte binding partner is immobilized on the surface in a mixture with hydrophobins, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 and 1: 8, particularly preferably around 1: 5 Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 mit der SEQ ID No. 5 im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5 erfolgt.Procedure according to Claim 8 , characterized in that for the immobilization of the analyte binding partner a mixture of the fusion protein with the SEQ ID No. 6 and the hydrophobin domain Ccg2 with SEQ ID No. 5 in a ratio of 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5, very particularly preferably 1: 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung des Produkts durch optische Detektion des Produkts, bevorzugt photometrisch erfolgtMethod according to one of the preceding claims, characterized in that the quantification of the product is carried out by optical detection of the product, preferably photometrically Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Quantifizierung des Produkts mit Malachitgrün erfolgt.Method according to one of the preceding claims, characterized in that the quantification of the product is carried out with malachite green. Oberfläche aufweisend einen Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist.Surface having an analyte binding partner, the analyte binding partner being a fusion protein comprising a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain. Oberfläche nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert ist, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.Surface after Claim 12 , characterized in that the analyte binding partner is immobilized in a mixture with hydrophobins on the surface, the mixture of the analyte binding partner with the hydrophobin in the range from 1: 2 to 1:10, preferably between 1: 3 to 1: 8, particularly preferably around 1: 5 lies. Oberfläche nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein ist, welches die SEQ ID No. 6 aufweist.Surface according to one of the Claims 12 or 13 , characterized in that the analyte binding partner is a fusion protein which has the SEQ ID No. 6 has. Kit zur Detektion von Analyten umfassend einen Analytbindungspartner aufweisend eine enzymatische Aktivität zur Umsetzung eines Substrats sowie ein Hydrophobin.Kit for the detection of analytes comprising an analyte binding partner having an enzymatic activity for converting a substrate and a hydrophobin. Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit als Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne umfasst.Kit after Claim 15 , characterized in that the kit as analyte binding partner comprises a fusion protein having a hydrophobin domain and a 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase domain. Kit nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit ein Fusionsprotein mit der SEQ ID No. 6 sowie ein Hydrophobin mit der SEQ ID No. 5 umfasst.Kit after Claim 15 or 16 , characterized in that the kit contains a fusion protein with SEQ ID No. 6 and a hydrophobin with SEQ ID No. 5 includes. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, einer Oberfläche nach einem der Ansprüche 12 bis 14 sowie eines Kits nach Anspruch 15 bis 17 zur Detektion von Analyten.Use of a method according to one of the Claims 1 to 11 , a surface after one of the Claims 12 to 14 as well as a kit Claim 15 to 17th for the detection of analytes.
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