KR102524320B1 - Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling - Google Patents

Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling Download PDF

Info

Publication number
KR102524320B1
KR102524320B1 KR1020200185429A KR20200185429A KR102524320B1 KR 102524320 B1 KR102524320 B1 KR 102524320B1 KR 1020200185429 A KR1020200185429 A KR 1020200185429A KR 20200185429 A KR20200185429 A KR 20200185429A KR 102524320 B1 KR102524320 B1 KR 102524320B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pad
bare
lateral flow
flow assay
gold nanoparticles
Prior art date
Application number
KR1020200185429A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20220094330A (en
Inventor
심원보
김솔아
이정은
문효영
Original Assignee
경상국립대학교산학협력단
압티지엠제이 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상국립대학교산학협력단, 압티지엠제이 주식회사 filed Critical 경상국립대학교산학협력단
Priority to KR1020200185429A priority Critical patent/KR102524320B1/en
Publication of KR20220094330A publication Critical patent/KR20220094330A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR102524320B1 publication Critical patent/KR102524320B1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 패드를 포함하는 농약 검출을 위한 측방유동 어세이용 스트립에 관한 것으로, 구체적으로는 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)를 버퍼에 농축시켜 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 자가 응집 없는 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립에 관한 것이다.The present invention relates to a strip for a lateral flow assay for detecting pesticides comprising a pad on which bare gold nanoparticles are stably fixed without self-aggregation, and specifically, bare gold nanoparticles are concentrated in a buffer. Manufacture of a strip for lateral flow assay including a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles are stably immobilized without self-aggregation, including dispensing on a pad for lateral flow assay and then drying A method and a strip for lateral flow assay including a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles prepared by the method are stably immobilized without self-aggregation.

Description

베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 패드를 포함하는 농약 검출을 위한 측방유동 어세이용 스트립{Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling}Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling}

본 발명은 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 패드를 포함하는 농약 검출을 위한 측방유동 어세이용 스트립에 관한 것이다.The present invention relates to a strip for a lateral flow assay for detecting pesticides including a pad on which bare gold nanoparticles are stably immobilized without self-aggregation.

농약은 곤충, 설치류, 균류, 잡초 등 농작물에 피해를 주는 해충을 방제하기 위해 사용되는 화학물질로 화학적 성질에 따라 크게 유기인계, 카바메이트계, 유기염소계, 피레드린 등 4개의 주요 그룹으로 분류된다. 그 중 유기인계 농약은 인산염 그룹을 가지고 있으며 척추동물과 무척추동물의 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE) 억제작용을 유발하여 시냅스에서 신경전달물질의 작용을 막아 신체를 마비시켜 사망에 이르게 하며, 인체에 대하여 독성이 높은 것으로 알려져 있다. 카바메이트계 농약은 카르바민산(carbamic acid)으로 부터 유도된 유기 농약으로 곤충 및 포유동물에 대해 독성이 매우 높고 콜린에스테라아제 억제작용을 유발하나 유기인계농약과는 다르게 특정 종에게 가역적으로 작용한다.Agrochemicals are chemical substances used to control pests that damage crops, such as insects, rodents, fungi, and weeds, and are classified into four major groups according to chemical properties: organophosphorus, carbamate, organochlorine, and pyrethrin. . Among them, organophosphorus pesticides have a phosphate group and cause inhibition of acetylcholinesterase (AChE) in vertebrates and invertebrates, blocking the action of neurotransmitters at synapses, paralyzing the body and leading to death. It is known to be highly toxic to humans. Carbamate-based pesticides are organic pesticides derived from carbamic acid that are highly toxic to insects and mammals and induce cholinesterase inhibitory action, but unlike organophosphate-based pesticides, they act reversibly on specific species.

인구가 증가함에 따라 농산물의 소비는 급증하고 있는 추세이며 이에 따라 농작물 생산량 증대의 필요성이 커지고 있으며 병충해를 방지하여 농작물의 수율을 높이기 위해서는 농약의 사용은 필수불가결하다.As the population increases, the consumption of agricultural products is rapidly increasing, and accordingly, the need to increase crop production is increasing, and the use of pesticides is indispensable to increase crop yield by preventing pests and diseases.

세계보건기구(World health organization) 산하 잔류농약규격부회(codex committee on pesticide residures)에서는 1966년부터 국제식품규격계획(join-FAO/WHO food standard programme)의 일환으로 식품 중 잔류농약의 국제적 허용량을 설정하는 작업이 추진된 바 있다. 우리나라에서도 1968년부터 잔류농약 모니터링을 실시하여 현재까지 국내의 유통 농산물들을 대상으로 모니터링을 실시하고 있다. 이와 같이 전세계적으로 농산물 중 저농도 농약을 검출할 수 있는 신속하고 민감도 높은 분석법 개발이 요구되는 추세이다.Since 1966, the codex committee on pesticide residues under the World Health Organization has established international allowable amounts of pesticide residues in food as part of the join-FAO/WHO food standard programme. work has been undertaken. In Korea, pesticide residue monitoring has been carried out since 1968, and monitoring has been conducted for agricultural products distributed in Korea until now. As such, there is a trend that requires the development of a rapid and highly sensitive analytical method capable of detecting low-concentration pesticides in agricultural products worldwide.

농약을 검출하기 위해 사용되는 방법으로는 주로 항원과 항체 반응을 이용한 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)과 AChE가 농약에 의해 억제되는 성질을 이용한 효소검출법, HPLC (high performance liquid chromatography)와 GC-MS (gas chromatograph-mass spectrometer)와 같은 기기분석법이 있다. ELISA의 경우 민감도는 높으나 검출까지 최소 2시간이 소요되며 항원의 합성이 어렵고 농약의 개발속도에 비해 항체의 개발속도가 뒤쳐지는 등의 문제점으로 실제 적용하기는 어려우며, 현재 사용되는 대부분의 농약 검출 키트들은 AChE의 성질을 이용하지만 검출한계는 대부분 ㎍/㎖ 수준으로 민감도가 낮다는 단점이 있다. 기기분석법의 경우 전처리 과정이 복잡하며, 회당 분석비용이 비싸고, 숙련된 전문가만이 기기를 다룰 수 있다는 단점이 있다.Methods used to detect pesticides include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an antigen and antibody reaction, enzyme detection method using properties that AChE is inhibited by pesticides, HPLC (high performance liquid chromatography) and instrumental analysis methods such as gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS). In the case of ELISA, the sensitivity is high, but it takes at least 2 hours to detect it, and it is difficult to actually apply it due to problems such as difficulty in synthesizing antigens and the development rate of antibodies lagging behind the development rate of pesticides. Most of the pesticide detection kits currently used They use the properties of AChE, but the detection limit is mostly at the μg/ml level, which has the disadvantage of low sensitivity. In the case of the instrumental analysis method, the preprocessing process is complicated, the analysis cost per analysis is expensive, and only skilled experts can handle the instrument.

최근 금 나노 입자(gold nanoparticle; GNP)는 LFA (Lateral Flow Assay) 이외에도 다양한 바이오센서에서 표지물질로 이용되고 있다. GNP는 일반적으로 양전하와 반응하여 응집이 일어나며 이로 인해 고유의 붉은색이 자주색으로 변하게 된다. 이러한 색 변화를 이용한 바이오센서 개발은 활발히 진행되고 있으나 분광광도계(spectrophotometer)와 같은 실험실 장비를 이용해야만 한다는 단점이 있다.Recently, gold nanoparticle (GNP) is used as a labeling material in various biosensors besides LFA (Lateral Flow Assay). GNPs generally react with positive charges to cause aggregation, which causes the intrinsic red color to change to purple. Biosensor development using this color change is actively progressing, but has a disadvantage in that laboratory equipment such as a spectrophotometer must be used.

한편, 한국등록특허 제1050421호에는 금 나노입자에 두 종류의 이중 DNA를 고정화하여 효소-면역반응으로 잔류농약의 농도를 검출하는 시스템에 관한 '잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류농약 검출방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0046466호에는 아세틸콜린에스테라제로 코팅된 막을 가지는 스트립을 이용한 '아세틸콜린에스테라제를 이용한 잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류농약 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 패드를 포함하는 농약 검출을 위한 측방유동 어세이용 스트립'에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 1050421 discloses a system for immobilizing two types of double DNA on gold nanoparticles and detecting the concentration of pesticide residues through an enzyme-immune reaction, 'a kit for detecting pesticide residues and a method for detecting pesticide residues using the same'. This is disclosed, and Korean Patent Publication No. 2009-0046466 discloses a 'kit for detecting pesticide residues using acetylcholinesterase and a method for detecting pesticide residues using the same' using a strip having a membrane coated with acetylcholinesterase. However, nothing has been described about the 'strip for lateral flow assay for pesticide detection including a pad on which bare gold nanoparticles are stably fixed without self-aggregation' of the present invention.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 베어 금 나노입자(bare-GNP)를 안정적으로 측방유동 어세이용 패드에 고정화시키기 위해, 농축된 bare-GNP를 다양한 버퍼 종류 및 패드 소재에 적용한 결과 수크로스를 포함하는 보레이트 버퍼(borate buffer)를 이용하여 MMM (mixed matrix membranes) 소재의 패드에 bare-GNP를 분주하여 건조할 경우, 건조 후에도 bare-GNP가 자가 응집 없이 안정적으로 고정되는 것을 확인하였다.The present invention was derived from the above needs, and the present inventors have prepared various types of buffers and pad materials to stably immobilize bare gold nanoparticles (bare-GNP) on pads for lateral flow assays. When bare-GNP is dispensed onto pads made of MMM (mixed matrix membranes) using a borate buffer containing sucrose and dried, the bare-GNP is stably fixed without self-aggregation even after drying. confirmed that

또한, 상기 조건으로 bare-GNP를 자가 응집 없이 안정적으로 측방유동 어세이용 패드에 고정한 후 이를 포함하는 측방유동 어세이 스트립을 제조하여 시료 내 농약 검출을 분석한 결과, 패드에 고정된 bare-GNP의 응집 여부에 따른 비색 차이에 기반하여 시료 내 농약 유무를 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.In addition, bare-GNP was stably fixed to the pad for lateral flow assay without self-aggregation under the above conditions, and then a lateral flow assay strip containing it was prepared to analyze the detection of pesticides in the sample. As a result, bare-GNP fixed to the pad The present invention was completed by confirming that the presence or absence of pesticides in the sample could be detected based on the colorimetric difference according to the presence or absence of aggregation.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)를 버퍼에 농축시켜 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자를 자가 응집 없이 측방유동 어세이용 패드에 안정적으로 고정시키는 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention comprises the steps of concentrating bare gold nanoparticles in a buffer, dispensing them on a pad for lateral flow assay, and then drying them. A method for stably immobilizing nanoparticles on a pad for lateral flow assay without self-aggregation is provided.

또한, 본 발명은 베어 금 나노입자를 버퍼에 농축시켜 측방유동 어세이용 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles are stably immobilized without self-aggregation, including the step of concentrating bare gold nanoparticles in a buffer, dispensing them to a pad for lateral flow assay, and then drying them. A method for manufacturing a strip for lateral flow assay is provided.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 자가 응집 없는 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립을 제공한다.In addition, the present invention provides a strip for lateral flow assay including a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles prepared by the above method without self-aggregation are stably immobilized without self-aggregation.

본 발명의 방법은 베어 금 나노입자를 자가 응집 없이 안정적으로 측방유동 어세이용 패드에 고정화시킬 수 있고, 베어 금 나노입자의 응집에 따른 비색 차이에 기반하여 검출 결과를 육안으로 확인할 수 있으므로, 잔류 농약 검출을 위한 스트립 형태(strip type)로 개발되어 현장검사에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The method of the present invention can stably immobilize bare gold nanoparticles on a pad for lateral flow assay without self-aggregation, and can visually check the detection result based on the colorimetric difference according to the aggregation of bare gold nanoparticles, so pesticide residues remain. It will be developed in a strip type for detection and will be useful for on-site inspection.

도 1은 본 발명에서 개발한 진단 스트립의 비색 반응 원리를 표현한 모식도이다.
도 2는 베어 금 나노입자(bare-GNP)의 원액을 conjugated pad에 분주한 후 건조시켜 확인한 결과이다.
도 3은 다양한 버퍼를 이용하여 농축한 bare-GNP를 conjugated pad에 분주한 후 건조시켜 확인한 결과이다.
도 4는 1% 수크로스를 포함하는 증류수, MES 버퍼 또는 borate 버퍼에 농축한 bare-GNP를 다양한 패드 소재에 분주한 후 건조시켜 확인한 결과이다.
도 5는 수크로스를 1%, 2% 또는 3% 첨가한 증류수, MES 버퍼 또는 borate 버퍼에 농축한 bare-GNP를 MMM (mixed matrix membrane)에 분주한 후 건조시켜 확인한 결과이다.
도 6은 1% 수크로스를 포함하는 borate 버퍼를 사용하여 농축한 bare-GNP를 MMM (mixed matrix membrane)에 분주하여 bare-GNP를 고정화한 패드 부분을 포함하는 일자 스트립을 사용한 농약 반응 실험 결과로, 전개(running) 버퍼의 종류에 따른 결과를 보여준다.
도 7은 1%, 2% 또는 3% 수크로스를 포함하는 borate 버퍼를 사용하여 농축한 bare-GNP를 MMM (mixed matrix membrane)에 분주하여 bare-GNP를 고정화한 패드 부분을 포함하는 일자 스트립을 사용한 농약 반응 실험 결과이다.
도 8은 베어 금 나노입자가 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이 스트립을 제조하고, 1 내지 5일간 상온에 방치한 후 각각의 스트립을 이용하여 농약 검출능을 분석한 실험 결과이다.1 is a schematic diagram expressing the colorimetric reaction principle of the diagnostic strip developed in the present invention.
2 is a result confirmed by drying after dispensing a stock solution of bare gold nanoparticles (bare-GNP) on a conjugated pad.
3 shows the results confirmed by dispensing concentrated bare-GNPs using various buffers to conjugated pads and then drying them.
Figure 4 shows the results confirmed by dispensing bare-GNP concentrated in distilled water containing 1% sucrose, MES buffer, or borate buffer to various pad materials and then drying them.
5 is a result confirmed by dispensing bare-GNP concentrated in distilled water, MES buffer, or borate buffer to which 1%, 2%, or 3% sucrose was added, to a mixed matrix membrane (MMM), and then drying.
6 is a pesticide reaction experiment result using a straight strip including a pad portion on which bare-GNP is immobilized by dispensing concentrated bare-GNP using a borate buffer containing 1% sucrose on a mixed matrix membrane (MMM). , shows the results according to the type of running buffer.
7 shows a straight strip including a pad portion on which bare-GNP is immobilized by dispensing concentrated bare-GNP using a borate buffer containing 1%, 2%, or 3% sucrose on a mixed matrix membrane (MMM). This is the result of the pesticide reaction experiment used.
8 is an experimental result obtained by preparing a lateral flow assay strip including a pad for lateral flow assay to which bare gold nanoparticles are immobilized, leaving it at room temperature for 1 to 5 days, and then analyzing the pesticide detection ability using each strip. am.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)를 버퍼에 농축시켜 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자를 자가 응집 없이 측방유동 어세이용 패드에 안정적으로 고정시키는 방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention comprises the steps of concentrating bare gold nanoparticles in a buffer, dispensing them to a pad for lateral flow assay, and then drying them, A method for stably immobilizing bare gold nanoparticles on a pad for lateral flow assay without self-aggregation is provided.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 "베어 금 나노입자"란 단백질 또는 펩타이드 등으로 블록킹(blocking) 처리되지 않아 표면에 음전하가 유지되어, 금 나노입자 고유의 붉은색을 띠는 금 나노입자를 의미한다. 베어 금 나노입자(bare-GNP)의 표면은 전기적으로 음전하를 띄고 있어 콜로이드 용액의 형태를 유지하게 되는데, 이로 인해 양전하와 반응하게 되면 응집하는 성질을 가지고 있다. 응집이 일어나지 않는 경우는 bare-GNP 고유의 붉은색(red wine)을 유지하며, 응집이 일어나게 되면 청자색(purple)으로 변하기 때문에, 색 차이에 의한 bare-GNP의 응집 유무를 육안으로 측정할 수 있다. 그러나, 불안정한 상태인 bare-GNP의 특성 상 진단 스트립에 적용하기 위해 bare-GNP를 패드에 고정할 경우, 건조 과정 중에 bare-GNP의 색이 적자색 (또는 회색)으로 쉽게 변해 bare-GNP를 안정하게 고정 및 건조시키는 것이 중요하다.In the method according to the present invention, the term "bare gold nanoparticles" refers to gold nanoparticles that are not blocked with proteins or peptides, so that negative charges are maintained on the surface and have a red color inherent to gold nanoparticles. do. The surface of bare gold nanoparticles (bare-GNP) is electrically negatively charged and maintains the form of a colloidal solution, which causes aggregation when reacted with a positive charge. When aggregation does not occur, the unique red wine color of bare-GNP is maintained, and when aggregation occurs, it turns purple, so the presence or absence of aggregation of bare-GNP can be visually measured by the color difference. . However, due to the nature of bare-GNP, which is in an unstable state, when bare-GNP is fixed to a pad to be applied to a diagnostic strip, the color of bare-GNP easily changes to reddish purple (or gray) during the drying process, making bare-GNP stable. It is important to fix and dry.

본 발명에 따른 방법은 건조 단계 후에도 측방유동 어세이용 패드에 고유의 색을 유지하며, 자가 응집이 없는 bare-GNP를 안정적으로 고정시키는 방법을 제공함으로써, bare-GNP를 이용한 비색 검출용 현장검시 스트립의 제조를 가능하게 한다.The method according to the present invention maintains its own color on the pad for lateral flow assay even after the drying step and provides a method for stably fixing bare-GNP without self-aggregation, thereby providing a spot test strip for colorimetric detection using bare-GNP. enables the manufacture of

본 발명의 방법에 있어서, 상기 버퍼는 바람직하게는 0.5~1.5 %(w/v)의 비환원당을 포함하는 보레이트 버퍼(borate buffer)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method of the present invention, the buffer may preferably be a borate buffer containing 0.5 to 1.5% (w/v) of non-reducing sugar, but is not limited thereto.

또한, 상기 비환원당은 수크로스(sucrose), 비시아노스(vicianose), 트레할로스(threhalose), 라피노스(raffinose), 멜레치토스(melezitose), 스타치오스(stachyose) 또는 버바스코스(verbascose)일 수 있고, 바람직하게는 수크로스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the non-reducing sugar may be sucrose, vicianose, trehalose, raffinose, melezitose, stachyose or verbascose. And, preferably, it may be sucrose, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 버퍼는 0.5~1.5 %(w/v)의 수크로스를 포함하며 pH가 7.2~7.6인 15~25 mM 농도의 보레이트 버퍼(borate buffer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.8~1.2%(w/v)의 수크로스를 포함하며 pH가 7.3~7.5인 18~22 mM 농도의 보레이트 버퍼(borate buffer)일 수 있고, 가장 바람직하게는 1.0 %(w/v)의 수크로스를 포함하며 pH가 7.4인 20 mM 농도의 보레이트 버퍼(borate buffer)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the buffer may be a borate buffer containing 0.5 to 1.5% (w/v) sucrose and having a pH of 7.2 to 7.6 at a concentration of 15 to 25 mM. More preferably, it may be a borate buffer containing 0.8 to 1.2% (w / v) of sucrose and having a pH of 7.3 to 7.5 at a concentration of 18 to 22 mM, most preferably 1.0% ( w/v) of sucrose and may be a 20 mM borate buffer having a pH of 7.4, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 패드는 MMM (mixed matrix membranes) 소재일 수 있다. 상기 MMM 소재의 패드에 전술한 버퍼를 이용하여 bare-GNP를 분주하여 건조시킬 경우, 건조 과정 및 건조 후에 패드에 고정된 bare-GNP의 색이 고유의 붉은색을 유지할 수 있었다.In addition, in the method according to one embodiment of the present invention, the pad may be a MMM (mixed matrix membranes) material. When bare-GNP was dispensed and dried using the above-described buffer on the MMM material pad, the color of the bare-GNP fixed to the pad could maintain its original red color during the drying process and after drying.

본 발명은 또한, 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)를 버퍼에 농축시켜 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립의 제조 방법을 제공한다.The present invention also relates to self-aggregation of bare gold nanoparticles, which includes the step of concentrating bare gold nanoparticles in a buffer, dispensing them to a pad for lateral flow assay, and then drying them. Provided is a method for manufacturing a strip for lateral flow assay including a pad for lateral flow assay stably fixed without

본 발명에 따른 제조 방법은 베어 금 나노입자(bare-gold)가 자가 응집 없이 안정적으로 측방유동 어세이용 패드에 고정되도록, 농축된 bare-gold를 0.5~1.5 %(w/v)의 비환원당을 포함하는 보레이트 버퍼(borate buffer)를 이용하여 MMM (mixed matrix membranes) 소재의 패드에 분주하여 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.In the manufacturing method according to the present invention, 0.5 to 1.5% (w/v) of non-reducing sugar is added to concentrated bare-gold so that bare-gold is stably fixed on a pad for lateral flow assay without self-aggregation. It may include dispensing and drying a pad made of MMM (mixed matrix membranes) using a borate buffer containing a borate buffer.

상기 버퍼의 구체적인 설명은 전술한 것과 같다.A detailed description of the buffer is the same as described above.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립은 당업계에 공지된 측방유동 어세이 형태의 스트립 제조 방법을 이용하여 제조될 수 있다.In the manufacturing method according to the present invention, the strip for lateral flow assay including the pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles are stably immobilized without self-aggregation is a strip manufacturing method in the form of lateral flow assay known in the art. can be manufactured using

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 자가 응집 없는 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 스트립을 제공한다.The present invention also provides a lateral flow assay comprising a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles without self-aggregation prepared by the above method are stably immobilized without self-aggregation strips are provided.

본 발명에 있어서, 상기 스트립은 바람직하게는 농약 검출용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 농약은 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 유기인계(organophosphorus) 또는 카바메이트계(carbamate) 농약일 수 있고, 더욱 바람직하게는 말라옥손(malaoxon), 말라티온(malathion), 디아지논(diazinon), 페니트로티온(fenitrothion), 디클로르보스(dichlorvos), 포레이트(phorate), 이피엔(EPN), 메티다티온(methidathion), 메타미도포스(methamidophos), 피리미포스메틸(pirimiphos-methyl), 모토크로토포스(monocrotophos), 메트리포네이트(trichlorfon), 펜설포티온(organophosphate), 아세페이트(acephate), 클로르펜빈포스(chlorfenvinphos), 클로로피리포스메틸(chlorpyrifos-methyl), 에토프로프(ethoprophos), 파라티온메틸(parathion-methyl), 펜토에이트(phenthoate), 테부피림포스(tebupirimfos), 터부포스(terbufos), 톨클로포스메틸(tolclofos-methyl), 트리아조포스(triazophos) 또는 에티온(ethion) 등의 유기인계 농약, 또는 카바릴(carbaryl), 옥사밀(oxamyl), 메소밀(methomyl), 카벤다짐(carbendazim), 카보퓨란(carbofuran), 카보설판(carbosulfan), 이프로발리카브(Iprovalicarb), 피리미카브(Pirimicarb) 또는 벤디오카브(bendiocarb) 등의 카바메이트계 농약일 수 있다.In the present invention, the strip may preferably be used for detecting pesticides, but is not limited thereto. The pesticide is not limited thereto, but may preferably be an organophosphorus or carbamate pesticide, more preferably malaoxon, malathion, or diazinon , fenitrothion, dichlorvos, phorate, EPN, methidathion, methamidophos, pirimiphos-methyl, monocrotophos, trichlorfon, organophosphate, acephate, chlorfenvinphos, chlorpyrifos-methyl, ethoprophos , parathion-methyl, phenthoate, tebupirimfos, terbufos, tolclofos-methyl, triazophos or ethion ), etc., or carbaryl, oxamyl, methomyl, carbendazim, carbofuran, carbosulfan, iprovalicarb , It may be a carbamate-based pesticide such as Pirimicarb or Bendiocarb.

또한 상기 농약 검출은 농축산물 시료 또는 혈청을 대상으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the pesticide detection may be performed on agricultural and livestock samples or serum, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 스트립은 검출 대상 시료를 흡착하는 흡착(absorbent) 패드; 상기 흡착 패드로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 자가 응집 없는 베어(bare) 금 나노입자가 고정화된 패드; 및 상기 금 나노입자가 고정화된 패드로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 시료 패드가 순차적으로 구비되는 것일 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the strip may include an absorbent pad adsorbing a sample to be detected; a pad on which bare gold nanoparticles without self-aggregation are immobilized and located at a point spaced apart from the adsorption pad; and a sample pad positioned at a point spaced apart from the pad on which the gold nanoparticles are immobilized by a predetermined interval, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 농약 검출용 스트립은 베어 금 나노입자(bare-GNP)의 응집 여부에 따른 비색 차이를 측정하는 방법에 기반한 것으로, bare-GNP의 응집 여부는 시료 내 농약이 존재할 경우 억제되는 아세틸콜린에스테라제(AChE)의 활성에 의해 결정된다. 아세틸콜린(ATC)은 아세틸콜린에스테라제(AChE)에 의해 양전하와 음전하를 가진 양극성 티올콜린(thiocholine)으로 분해되는데, 상기 티올콜린의 양전하가 표면에 음전하를 띄는 bare-GNP와 반응하면서 응집을 일으키게 된다. 그러나, 시료 내에 유기인계 또는 카바메이트계 농약이 존재할 경우 AChE의 활성이 저해되어 ATC을 티올콜린으로 분해하지 못하기 때문에 bare-GNP의 응집이 발생하지 않게되어 고유의 붉은색이 유지되며, 시료에 농약이 존재하지 않을 경우 bare-GNP의 응집이 유도되어 적자색으로 색 변화를 일으키게 된다.In one embodiment of the present invention, the pesticide detection strip is based on a method for measuring the colorimetric difference according to the aggregation of bare gold nanoparticles (bare-GNP). It is determined by the activity of acetylcholinesterase (AChE), which is inhibited when present. Acetylcholine (ATC) is decomposed into positively and negatively charged thiocholine by acetylcholinesterase (AChE), and the positive charge of the thiocholine reacts with the negatively charged bare-GNP on the surface to cause aggregation will wake up However, when organophosphorus or carbamate pesticides are present in the sample, the activity of AChE is inhibited and ATC cannot be decomposed into thiolcholine, so the aggregation of bare-GNP does not occur and the original red color is maintained. In the absence of pesticides, aggregation of bare-GNP is induced, causing a color change to reddish purple.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples are only to illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.

1. 실험 재료1. Experiment materials

실험에 사용된 금 나노입자 용액을 제조하기 위해 사클로로금(Ⅲ)산 (tetrachloroauricacid), 구연산나트륨(sodium citrate), 혈청(USA-male)은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, USA)에서 구입하였으며, 말라옥손(malaoxon), 말라티온(malathion), 디아지논(diazinon), 페니트로티온(fenitrothion), 디클로르보스(dichlorvos), 포레이트(phorate), 이피엔(EPN), 메티다티온(methidathion), 메타미도포스(methamidophos), 피리미포스메틸(pirimiphos-methyl), 모토크로토포스(monocrotophos), 메트리포네이트(trichlorfon), 펜설포티온(organophosphate), 아세페이트(acephate), 클로르펜빈포스(chlorfenvinphos), 클로로피리포스메틸 (chlorpyrifos-methyl), 에토프로프(ethoprophos), 파라티온메틸(parathion-methyl), 펜토에이트(phenthoate), 테부피림포스(tebupirimfos), 터부포스(terbufos), 톨클로포스메틸(tolclofos-methyl), 트리아조포스(triazophos), 에티온(ethion), 카바릴(carbaryl), 옥사밀(oxamyl), 메소밀(methomyl), 카벤다짐(carbendazim), 카보퓨란(carbofuran), 카보설판(carbosulfan), 이프로발리카브(Iprovalicarb), 피리미카브(Pirimicarb) 및 벤디오카브(bendiocarb)는 Kemidas사(Korea)에서 구입하였다. 농약은 10% MeOH in PBS로 희석하여 원하는 농도로 사용하였다.To prepare the gold nanoparticle solution used in the experiment, tetrachloroauricacid, sodium citrate, and serum (USA-male) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). and malaoxon, malathion, diazinon, fenitrothion, dichlorvos, phorate, EPN, methidathion ), methamidophos, pirimiphos-methyl, monocrotophos, trichlorfon, organophosphate, acephate, chlorfenvinphos ( chlorfenvinphos), chlorpyrifos-methyl, ethoprophos, parathion-methyl, phenthoate, tebupirimfos, terbufos, tolclo Tolclofos-methyl, triazophos, ethion, carbaryl, oxamyl, methomyl, carbendazim, carbofuran, Carbosulfan, Iprovalicarb, Pirimicarb and Bendiocarb were purchased from Kemidas (Korea). Pesticides were diluted with 10% MeOH in PBS and used at the desired concentration.

또한 실험에 사용된 6종의 패드 absorbance pad (Bore Da Biotech, Grate 222), sample pad (Bore Da Biotech, Grade 319), conjugated pad (Bore Da Biotech, Grade 8964), filter pad (whatman™, No. 1004-110), MMM (mixed matrix membrane; Pall, T9EXPPA0045S00M), nitrocellulose membrane (Nupore Filtration Systems pvt ltd, LFNC-c-HS03-15μ)은 각각 구입하여 사용하였다.In addition, six types of pads used in the experiment were absorbance pad (Bore Da Biotech, Grate 222), sample pad (Bore Da Biotech, Grade 319), conjugated pad (Bore Da Biotech, Grade 8964), filter pad (whatman™, No. 1004-110), MMM (mixed matrix membrane; Pall, T9EXPPA0045S00M), and nitrocellulose membrane (Nupore Filtration Systems pvt ltd, LFNC-c-HS03-15μ) were purchased and used.

2. 베어(bare) 금 나노입자(Gold nano particle, GNP) 합성2. Synthesis of bare gold nano particle (GNP)

실험에 사용된 GNP 용액은 Frens 등(Nature, 1973, 241:20-22)의 방법으로 제조하였다. 0.01 %(w/v) 사클로로금(Ⅲ)산 100 ㎖을 교반하면서 가열하고 끓기 시작하면 환원제인 1 %(w/v) 구연산나트륨을 5 ㎖ 첨가하여 용액을 제조하였다. 합성된 GNP 용액은 Particle Size & Zeta Potential Analyzer (Malvern panalytical, UK)로 직경을 확인한 후 실험에 사용하였다.The GNP solution used in the experiment was prepared according to the method of Frens et al. (Nature, 1973, 241:20-22). 100 ml of 0.01% (w/v) tetrachloroauric acid (III) was heated while stirring, and when it started to boil, 5 ml of 1% (w/v) sodium citrate as a reducing agent was added to prepare a solution. The synthesized GNP solution was used in the experiment after checking the diameter with a Particle Size & Zeta Potential Analyzer (Malvern panalytical, UK).

실시예 1. bare-GNP의 안정적인 고정을 위한 버퍼 선정Example 1. Buffer selection for stable fixation of bare-GNP

본 발명자는 일자 스트립에 bare-GNP를 고정하여 사용하기 위해, 합성한 bare-GNP 용액을 농축 없이 conjugated pad에 10 또는 20 ㎕ 분주한 후 37℃에서 15 내지 20분간 건조시킨 후 패드 상의 bare-GNP의 색을 관찰하였다. 그 결과, 합성한 bare-GNP의 원액은 고유의 붉은색이 선명하게 확인되지 않아(도 2), 농축하여 사용해야 함을 알 수 있었다.In order to immobilize and use bare-GNP on a straight strip, the present inventor dispensed 10 or 20 μl of the synthesized bare-GNP solution onto a conjugated pad without concentration, dried it at 37 ° C for 15 to 20 minutes, and then dried the bare-GNP on the pad. The color of was observed. As a result, it was found that the stock solution of the synthesized bare-GNP was not clearly identified in its own red color (Fig. 2), so it was necessary to concentrate and use it.

먼저, bare-GNP의 농축을 위해 다양한 버퍼를 테스트하여 최적의 버퍼 조성을 찾고자 하였다. 간단하게, 1.5 ㎖ 튜브에 합성한 bare-GNP 1 ㎖를 넣고 12,000 rpm에서 10분간 원심분리시켜 상등액을 제거한 후, 농축 및 버퍼 교환을 위해 증류수, MES (0.1M, pH 6.0), PBS (1X, pH 7.4), TBS (1X, pH 7.6), borate 버퍼 (20 mM, pH 7.4) 또는 Tris-HCl (0.1M, pH 6.8)을 준비하고 농축한 bare-GNP가 들어있는 튜브에 각각 100 ㎕을 넣고 10배 농축시켰다. 농축한 bare-GNP를 conjugate pad (3 mm x 5 mm)에 각각 10 ㎕씩 분주하고 37℃ 인큐베이터에서 15-20분간 건조시켰다. 그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이, PBS, TBS, Tris-HCl 버퍼의 경우 튜브 상에서 염 등에 의해 응집(적자색, 회색)된 상태로 나타났으며, 증류수와 MES, borate 버퍼에서 bare-GNP의 고유한 붉은색이 유지되는 것으로 나타났다. 그러나, 상온에서 일정 시간 지난 후 모든 조건에서 bare-GNP가 응집되는 현상이 나타나 bare-GNP를 적용할 pad(G pad)의 선정이 필요한 것으로 판단되었다.First, various buffers were tested to find the optimal buffer composition for enrichment of bare-GNP. Briefly, 1 ml of the synthesized bare-GNP was put in a 1.5 ml tube, centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, and then distilled water, MES (0.1M, pH 6.0), PBS (1X, pH 7.4), TBS (1X, pH 7.6), borate buffer (20 mM, pH 7.4), or Tris-HCl (0.1M, pH 6.8), and put 100 μl of each into a tube containing concentrated bare-GNP. concentrated 10 times. Concentrated bare-GNP was dispensed in 10 µl each on a conjugate pad (3 mm x 5 mm) and dried in an incubator at 37°C for 15-20 minutes. As a result, as shown in FIG. 3, in the case of PBS, TBS, and Tris-HCl buffer, they appeared in a state of aggregation (red-purple, gray) by salt on the tube, and the uniqueness of bare-GNP in distilled water, MES, and borate buffer A red color was observed. However, after a certain period of time at room temperature, aggregation of bare-GNP occurred under all conditions, and it was determined that it was necessary to select a pad (G pad) to which bare-GNP was applied.

실시예 2. bare-GNP의 안정적인 고정을 위한 패드 선정Example 2. Pad selection for stable fixation of bare-GNP

bare-GNP를 적용할 pad(G pad)의 선정을 위해 다양한 종류의 패드를 테스트하였다. 간단하게, 1.5 ㎖ 튜브에 합성한 bare-GNP 1 ㎖를 넣고 12,000 rpm에서 10분간 원심분리시켜 상등액을 제거한 후, 수크로스를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하여 준비한 증류수, MES (0.1M, pH 6.0) 또는 borate 버퍼 (20 mM, pH 7.4)를 사용하여 상기 실시예 1에서와 같이 농축시켰다. 그 후, 농축한 bare-GNP를 6종의 패드 소재 (absorbance pad, sample pad, conjugate pad, filter pad, MMM, NC membrane)에 각각 5 ㎕씩 분주하여 37℃ 인큐베이터에서 15-20분간 건조시켰다. 그 후 패드 상의 bare-GNP 점적 부위의 색 변화를 확인한 결과, bare-GNP의 농축 과정에서 증류수만 사용할 경우 6종의 패드 소재 모두에서 응집 현상이 나타났으며, 수크로스를 포함한 버퍼 중 borate 버퍼를 사용한 경우 자가 응집 없이 가장 붉은색으로 bare-GNP가 고정된 것을 확인할 수 있었다(도 4).To select a pad (G pad) to which bare-GNP is applied, various types of pads were tested. Briefly, after putting 1 ml of synthesized bare-GNP in a 1.5 ml tube, centrifuging at 12,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, distilled water, MES (0.1M, pH 6.0) prepared by adding sucrose to a final concentration of 1% ) or borate buffer (20 mM, pH 7.4) and concentrated as in Example 1 above. Thereafter, 5 μl of the concentrated bare-GNP was dispensed into each of 6 types of pad materials (absorbance pad, sample pad, conjugate pad, filter pad, MMM, NC membrane) and dried in an incubator at 37° C. for 15-20 minutes. After that, as a result of confirming the color change of the bare-GNP dot site on the pad, when only distilled water was used in the concentration process of bare-GNP, aggregation appeared in all six pad materials, and borate buffer among buffers containing sucrose When used, it was confirmed that bare-GNP was fixed in the most red color without self-aggregation (FIG. 4).

또한, 수크로스의 첨가 농도를 1%, 2% 또는 3%로 조정하여 MMM (mixed matrix membrane)에 전술한 것과 동일하게 실험한 결과, 증류수의 경우 수크로스의 농도에 관계없이 bare-GNP 색이 불안정하였고, borate 버퍼에서 bare-GNP의 색이 가장 안정한 것으로 확인되었다(도 5). 비록, 수크로스의 첨가 농도가 높을수록 bare-GNP의 색이 진하게 나타났으나, 육안상으로 큰 차이가 없어 1% 수크로스를 포함하는 borate 버퍼를 이용하여 이후 실험을 수행하였다.In addition, as a result of the same experiment as described above on MMM (mixed matrix membrane) by adjusting the concentration of sucrose to 1%, 2%, or 3%, in the case of distilled water, the bare-GNP color was obtained regardless of the concentration of sucrose. It was unstable, and the color of bare-GNP in borate buffer was confirmed to be the most stable (Fig. 5). Although, the higher the concentration of sucrose, the darker the color of the bare-GNP, but there was no significant difference to the naked eye. Subsequent experiments were performed using a borate buffer containing 1% sucrose.

실시예 3. bare-GNP를 안정적으로 고정한 패드 적용 진단 스트립의 농약 검출능 분석Example 3. Analysis of Pesticide Detectability of Pad-Applied Diagnostic Strips Stably Immobilized Bare-GNP

상기 실시예 1 및 2의 결과를 통해, 1% 수크로스를 포함하는 borate 버퍼 (20 mM, pH 7.4)를 이용하여 bare-GNP를 농축하고 이를 MMM 패드에 분주하여 건조할 경우, bare-GNP의 안정화가 우수함을 알 수 있었다. 본 발명자는 상기 조건을 통해 bare-GNP를 고정화한 패드 부분을 포함하는 일자 스트립을 제조한 후(도 6 참고), 농약 검출 반응을 테스트하였다.Through the results of Examples 1 and 2, when bare-GNP is concentrated using a borate buffer (20 mM, pH 7.4) containing 1% sucrose and dispensed on an MMM pad and dried, the amount of bare-GNP It was found that stabilization was excellent. The present inventors prepared a straight strip including a pad portion on which bare-GNP was immobilized through the above conditions (see FIG. 6), and then tested the pesticide detection reaction.

먼저, 10-2 희석한 인간 혈청 63.5 ㎕와 다이아지논(diazinon) 83.5 ㎕를 섞고 5분간 반응시킨 후 50 mM의 아세틸콜린 용액 20 ㎕를 추가로 가하고, 2분간 반응시켰다. 그 후, 상기 반응액에 제조한 일자 스트립의 흡착 패드(absorbance pad)를 담궈 전개시키며, bare-GNP 점적 부위의 색 변화를 관찰하였다. 이 때, 다이아지논을 10%(v/v) 메탄올을 포함하는, 증류수, MES (0.1 M, pH 6.0), borate 버퍼 (20 mM, pH 7.4), PBS (0.1X, pH 7.4), TBS (0.1X, pH 7.6) 또는 Tris-HCl (0.1M, pH 6.8)에 각각 녹여 동일한 조성의 버퍼를 전개 버퍼로 사용하였다. 그 결과, 10 %(v/v) 메탄올을 포함하는 증류수, 10 %(v/v) 메탄올을 포함하는 borate 버퍼 및 10 %(v/v) 메탄올을 포함하는 PBS를 전개 버퍼로 사용한 경우 농약 유무에 따른 bare-GNP 점적 부위 색 변화가 명확하게 차이나는 것을 확인할 수 있었다(도 6).First, 63.5 μl of 10 -2 diluted human serum and 83.5 μl of diazinon were mixed and reacted for 5 minutes, and then 20 μl of 50 mM acetylcholine solution was additionally added and reacted for 2 minutes. Thereafter, the absorbance pad of the prepared straight strip was immersed in the reaction solution and developed, and the color change of the bare-GNP dot site was observed. At this time, diazinon containing 10% (v / v) methanol, distilled water, MES (0.1 M, pH 6.0), borate buffer (20 mM, pH 7.4), PBS (0.1X, pH 7.4), TBS ( 0.1X, pH 7.6) or Tris-HCl (0.1M, pH 6.8), respectively, and buffers having the same composition were used as development buffers. As a result, when distilled water containing 10% (v/v) methanol, borate buffer containing 10% (v/v) methanol, and PBS containing 10% (v/v) methanol were used as development buffers, pesticides were not present. It was confirmed that the color change of the bare-GNP drop site was clearly different according to (FIG. 6).

또한, 상기와 동일한 조건으로 농약 시료를 준비한 다음, 10 %(v/v) 메탄올을 포함하는 PBS를 전개 버퍼로 사용하여, bare-GNP 농축 시 borate 버퍼에 첨가되는 수크로스 농도별 차이를 분석한 결과, 3% 수크로스를 포함하는 borate 버퍼를 사용하여 농축시킨 bare-GNP 점적 패드를 포함하는 스트립보다, 1% 수크로스를 포함하는 borate 버퍼를 사용하여 농축시킨 bare-GNP 점적 패드를 포함하는 스트립에서 농약 유무에 따른 색 변화가 선명하게 차이나는 것을 확인할 수 있었다(도 7).In addition, pesticide samples were prepared under the same conditions as above, and then PBS containing 10% (v / v) methanol was used as a development buffer to analyze the difference by concentration of sucrose added to the borate buffer when enriching bare-GNP. As a result, a strip containing a bare-GNP dot pad concentrated using a borate buffer containing 1% sucrose rather than a strip containing a bare-GNP dot pad concentrated using a borate buffer containing 3% sucrose. It was confirmed that the color change according to the presence or absence of pesticides was clearly different (FIG. 7).

실시예 4. 고정된 bare-GNP의 안정화 검증Example 4. Stabilization verification of fixed bare-GNP

또한 본 발명자는 측방유동 어세이용 패드에 고정된 베어 금 나노입자의 안정성을 확인하고자, 베어 금 나노입자가 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이 스트립을 제조하고, 1 내지 5일간 상온에 방치한 후 각각의 스트립을 이용하여 전술한 실시예 3에서와 같은 조건으로 농약 검출능을 분석하였다. 그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이, 상온에서 5일간 보관하였던 스트립 상의 고정된 베어 금 나노입자가 시료의 농약 유무에 따라 색 변화의 차이를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 방법에 따라 측방유동 어세이용 패드에 고정 및 건조화된 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정되었음을 알 수 있었다.In addition, in order to confirm the stability of the bare gold nanoparticles immobilized on the pad for lateral flow assay, the present inventors prepared a lateral flow assay strip including a pad for lateral flow assay to which bare gold nanoparticles were fixed, and tested for 1 to 5 days. After leaving at room temperature, pesticide detection ability was analyzed using each strip under the same conditions as in Example 3 described above. As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the fixed bare gold nanoparticles on the strip stored at room temperature for 5 days showed a difference in color change depending on the presence or absence of pesticides in the sample. From this, it was found that the bare gold nanoparticles fixed and dried to the pad for lateral flow assay according to the method of the present invention were stably fixed without self-aggregation.

Claims (9)

베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)를 0.5~1.5 %(w/v)의 비환원당을 포함하는 보레이트 버퍼(borate buffer)에 농축시켜 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 MMM (mixed matrix membranes) 소재 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자를 자가 응집 없이 측방유동 어세이용 패드에 안정적으로 고정시키는 방법.MMM (mixed matrix) for lateral flow assay by concentrating bare gold nanoparticles in borate buffer containing 0.5-1.5% (w/v) non-reducing sugar A method for stably immobilizing bare gold nanoparticles on a pad for lateral flow assay without self-aggregation, comprising dispensing on a membranes) material pad and then drying. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 비환원당은 수크로스(sucrose), 비시아노스(vicianose), 트레할로스(threhalose), 라피노스(raffinose), 멜레치토스(melezitose), 스타치오스(stachyose) 또는 버바스코스(verbascose)인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the non-reducing sugar is sucrose, vicianose, trehalose, raffinose, melezitose, stachyose or verbascos ( A method characterized in that it is verbascose). 삭제delete 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)를 0.5~1.5 %(w/v)의 비환원당을 포함하는 보레이트 버퍼(borate buffer)에 농축시켜 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 MMM (mixed matrix membranes) 소재 패드에 분주한 후 건조시키는 단계를 포함하는, 베어 금 나노입자가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이용 스트립의 제조 방법.MMM (mixed matrix) for lateral flow assay by concentrating bare gold nanoparticles in borate buffer containing 0.5-1.5% (w/v) non-reducing sugar A method of manufacturing a strip for lateral flow assay including a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles are stably immobilized without self-aggregation, comprising dispensing on membranes) material pad and then drying. 제5항에 있어서, 상기 버퍼는 0.5~1.5 %(w/v)의 수크로스를 포함하는 보레이트 버퍼(borate buffer)인 것을 특징으로 하는 측방유동 어세이용 스트립의 제조 방법.The method of claim 5, wherein the buffer is a borate buffer containing 0.5 to 1.5% (w/v) of sucrose. 제5항의 방법에 의해 제조된 자가 응집 없는 베어(bare) 금 나노입자(gold nanoparticles)가 자가 응집 없이 안정적으로 고정된 측방유동 어세이용 패드를 포함하는 측방유동 어세이(lateral flow assay)용 스트립.A strip for lateral flow assay comprising a pad for lateral flow assay in which bare gold nanoparticles prepared by the method of claim 5 are stably immobilized without self-aggregation. 제7항에 있어서, 상기 스트립은 농약 검출용인 것을 특징으로 하는 스트립.8. The strip according to claim 7, wherein said strip is for detecting pesticides. 제7항에 있어서, 상기 스트립은 검출 대상 시료를 흡착하는 흡착(absorbent) 패드; 상기 흡착 패드로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 자가 응집 없는 베어(bare) 금 나노입자가 고정화된 패드; 및 상기 금 나노입자가 고정화된 패드로부터 일정 간격이 이격된 지점에 위치하는 시료 패드가 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 스트립.The method of claim 7, wherein the strip comprises: an absorbent pad adsorbing a sample to be detected; a pad on which bare gold nanoparticles without self-aggregation are immobilized and located at a point spaced apart from the adsorption pad; and a sample pad positioned at a point spaced apart from the pad on which the gold nanoparticles are immobilized by a predetermined distance, sequentially provided.
KR1020200185429A 2020-12-29 2020-12-29 Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling KR102524320B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200185429A KR102524320B1 (en) 2020-12-29 2020-12-29 Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200185429A KR102524320B1 (en) 2020-12-29 2020-12-29 Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220094330A KR20220094330A (en) 2022-07-06
KR102524320B1 true KR102524320B1 (en) 2023-04-26

Family

ID=82400551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200185429A KR102524320B1 (en) 2020-12-29 2020-12-29 Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102524320B1 (en)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101834642B1 (en) * 2016-06-14 2018-03-05 성균관대학교산학협력단 Nano particle based coloriometric sensor capable of fixing, redispersible and detecting on substrate and method fabricating thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H.Li et al., Talanta, Vol. 87, 2011, pp. 93-99.
M.Amini et al., Journal of Experimental Nanoscience, Vol. 15, No. 1, 2020, pp. 266-279.
Mahmoudi et al., Analytical Science Advances, Vol. 1, No. 3, (2020.06.23.), pp. 161-172.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220094330A (en) 2022-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yao et al. Advances in immunoassays for organophosphorus and pyrethroid pesticides
Jin et al. A facile microfluidic paper-based analytical device for acetylcholinesterase inhibition assay utilizing organic solvent extraction in rapid detection of pesticide residues in food
Andreou et al. A portable fiber-optic pesticide biosensor based on immobilized cholinesterase and sol–gel entrapped bromcresol purple for in-field use
Campanella et al. Reliable new immunosensor for atrazine pesticide analysis
Kavruk et al. Portable bioactive paper-based sensor for quantification of pesticides
Moris et al. Chemiluminescence assays of organophosphorus and carbamate pesticides
Chen et al. Colorimetric bio-barcode immunoassay for parathion based on amplification by using platinum nanoparticles acting as a nanozyme
Soldatkin et al. Biosensors. A quarter of a century of R&D experience
Bucur et al. Insecticide identification using a flow injection analysis system with biosensors based on various cholinesterases
Oujji et al. A Simple Colorimetric Enzymatic-Assay, based on immobilization of acetylcholinesterase by adsorption, for sensitive detection of organophosphorus insecticides in olive oil
Fernando et al. Rapid detection of anticholinesterase insecticides by a reusable light addressable potentiometric biosensor
KR20200084725A (en) Simultaneous diagnostic method and kits for the Ralstonia Solanacearum and Fusarium Oxysporum using semi-quantitative lateral flow immunoassay
KR102524320B1 (en) Lateral flow assay strip for detecting pesticides containing pad stably fixed with bare gold nanoparticles without self-assembling
Rogers et al. Light addressable potentiometric biosensor for the detection of anticholinesterases
JP4553181B2 (en) Pesticide residue analysis method
JP2007068531A (en) Detection method for agrochemicals, detection kit for agrochemicals, and detection strip for agrochemicals
KR102539171B1 (en) Composition for detecting pesticide including extracellular vesicle and use thereof
Khaled et al. Rapid detection of methomyl and organophosphorous pesticides with portable potentiometric biosensor
Khattab et al. An ELISA assay for avian serum butyrylcholinesterase: a biomarker for organophosphates
KR20060104704A (en) Strip for detecting a remained pesticide, attached acetylcholinesterase or its mutant and photosensitive material
Siegfried et al. Immunological detection of greenbug (Schizaphis graminum) esterases associated with resistance to organophosphate insecticides
Yaneva et al. DETERMINATION OF N-METHYL CARBAMATES IN A LIVER SAMPLE USING AN OPTICAL BIOSENSOR.
Wongta et al. Developing an in-house colorimetric method for detecting organophosphate and carbamate residue using cricket cholinesterase
US5200311A (en) Method of determination of pesticides by radiobiochemistry
van Heyningen Conformational changes in subunit A of cholera toxin following the binding of ganglioside to subunit B.

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right