DE102018116353B4 - Verfahren zum Nachweis und zur Zählung epigenetischer Immunzellen in humanen Blutproben für Immundiagnostik und Neugeborenen-Screening - Google Patents

Abstract

Verfahren für einen verbesserten Methylierungsassay zur Identifizierung von Blutimmunzellen, umfassend die Schritte vona) Bereitstellen einer Probe von humanem Blut, insbesondere von einem Neugeborenen, umfassend genomische DNA von Blutimmunzellen;b) Behandeln der genomischen DNA der Immunzellen mit Bisulfit, um unmethylierte Cytosine in Uracil umzuwandeln;c) Amplifizieren der behandelten genomischen DNA unter Verwendung geeigneter Primerpaare zur Herstellung von Amplikons undd) Identifizieren der Blutimmunzellen basierend auf der Analyse der Amplikons, wie amplifiziert, wobei die Amplifizierung und Analyse der Amplifizierung und/oder qPCR unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus mindestens einer der Gruppen von SEQ ID Nrn. 1 bis 12 für CD4, SEQ ID Nrn. 13 bis 20 für CD8beta, SEQ ID Nrn. 21 bis 28 für LRP5, SEQ ID Nrn. 29 bis 36 für MVD, SEQ ID Nrn. 37 bis 44 für LCN2 und SEQ ID Nrn. 45 bis 56 für CD3gamma/Delta umfasst, undwobei eine Demethylierung mindestens einer CpG-Position in dem Amplikon für mindestens eine Blutimmunzelle, ausgewählt aus CD3+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, Neutrophilen, CD14+ Monozyten, CD56+ NK-Zellen und CD19+ B-Zellen, hinweisend ist.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis und zur Zählung von epigenetischem Blut und Immunzellen in humanen Blutproben, insbesondere zur Immundiagnostik und zum Screening von Neugeborenen, sowie entsprechende Anwendungen und Kits.
• Hintergrund der Erfindung
• Quantitative Anomalien von lymphoiden und myeloischen Immunzellen sind ein Indikator für mehrere humane Krankheiten und stellen daher wichtige Parameter für die Diagnose und Patientenüberwachung dar. Derzeit wird die Quantifizierung von Immunzellen meist mittels Durchflusszytometrie (FCM) durchgeführt, was Flexibilität in Bezug auf die analysierten Zelltypen und Genauigkeit bietet (1). Obwohl die in diagnostischen Labors eingesetzten hämatologischen Analysatoren hoch entwickelt sind und die Probenlogistik umfassend angepasst wird, leidet die FCM unter intrinsischen Einschränkungen. Die FCM-basierte Zellzählung erfordert frische, antikoagulierte oder gut erhaltene Blutproben mit intakten Leukozyten. Auch bei frischen Proben ist es ratsam, schnell zu arbeiten, da die Analysedauer die Ergebnisse bei Zellabbau ab den ersten Stunden nach der Blutabnahme beeinflussen kann. Die Zeit bis zur Analyse beeinflusst die Ergebnisse aufgrund des Zellabbaus innerhalb weniger Stunden nach der Blutentnahme. Die Standardisierung bleibt aufgrund biologischer, technischer und betrieblicher Variationen eine Herausforderung (2-5) und es müssen noch standardisierte Protokolle erstellt werden, insbesondere für Proben mit geringer Anzahl bestimmter Zellpopulationen, z.B. bei Immundefiziten (6, 7). Eine entscheidende Herausforderung ist, dass die FCM-basierte Zellzählung intakte Leukozyten erfordert, aber frisches oder gut konserviertes Blut nicht für alle medizinischen Anwendungen verfügbar ist.
• Die größte Herausforderung besteht jedoch darin, dass nicht alle medizinischen Anwendungen die Verfügbarkeit von frischen oder gut konservierten Blutproben gewährleisten und die Durchflusszytometrie in diesen Fällen nicht angewendet werden kann.
• Die therapeutischen Empfehlungen für HIV-infizierte Patienten hängen von der CD4+ T-Zellzählung ab. Bei Frequenzen unter 500 CD4+ T-Zellen/µl Blut wird eine antiretrovirale Therapie empfohlen und wird unter 200 Zellen/µl zwingend erforderlich. In ressourcenarmen Regionen wird eine angemessene Zellzählung behindert, wenn die Blutentnahme und - messung nicht in unmittelbarer Folge durchgeführt werden kann. Daher wird die Behandlung ausschließlich aufgrund von HIV-bezogenen klinischen Symptomen eingeleitet, die zu suboptimalen Ergebnissen führen können (8, 9). Darüber hinaus ist FCM nicht anwendbar bei einem Neugeborenen-Screening auf schwere, aber behandelbare Geburtsfehler, die routinemäßig an getrockneten Blutflecken (DBS) durchgeführt werden. Primäre Immundefekte (PID) bilden eine solche Gruppe von angeborenen Krankheiten und werden als Teil von Screeningprogrammen betrachtet oder sind bereits Teil davon (10). Typischerweise führen genetische Defekte zu quantitativen Defiziten spezifischer Leukozytensubpopulationen. Schwere kombinierte Immundefekte (SCID) stellen eine solche PID dar und sind klinisch durch das Fehlen von T- oder B-Zellen gekennzeichnet. Der Nachweis von SCID bei Neugeborenen basiert derzeit auf quantitativen PCR-unterstützten T-Zell-Rezeptoren (TREC) und Immunglobulin-Kappa-deletierenden Rekombinationskreisen (KREC) (11). Diese Verfahren erkennen zuverlässig den Mangel an neueren Emigranten der thymischen T-Zellen und des Knochenmarks der B-Zellen, den vorherrschenden T- und B-Zell-Subtypen im neonatalen Blut. Die TREC/KREC-Analyse erkennt jedoch keine anderen spezifischen Lymphozyten-Subgruppen, die bei schwerer PID defekt sind, wie z.B. natürliche Killer (NK)-Zellen oder Neutrophile. Trotz dieser Einschränkung ist das TREC-Neugeborenen-Screening wirksam und zeigt aufgrund einer früheren Diagnose ein verbessertes Krankheitsergebnis (12). Die TREC-Analyse in der Neugeborenenanalyse wird ausschließlich für das Erstscreening eingesetzt. Die Differentialdiagnose und Patientenüberwachung vor und nach der heilenden hämatopoetischen Stammzelltransplantation erfordert einen Technologiewechsel und wird mittels Durchflusszytometrie durchgeführt.
• Um die derzeitigen technologischen und diagnostischen Einschränkungen zu überwinden und die Anwendbarkeit des Immunmonitorings zu erweitern, etablierten die Erfinder eine DNA-(un-)methylierungsbasierte, quantitative Bewertung von Immunzellen (epigenetische qPCR). Diese Technik liefert relative und absolute Immunzellenzahlen, die auf frisches, gefrorenes oder papierfleckiges, getrocknetes Blut anwendbar sind. Die Signale sind digital, d.h. sie zeigen entweder einen positiven oder negativen Wert pro Zelle an und nicht beliebig definierte Schwellenwerte für „Positivität“ wie im FCM. Es kann automatisiert und bedienerunabhängig durchgeführt werden und reduziert die Anfälligkeit für Reagenzienvariabilität, wie z.B. Antikörper.
• In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das vorstehende Ziel durch ein Verfahren für einen verbesserten Methylierungsassay zur Identifizierung von Blutimmunzellen gelöst, umfassend die Schritte von
1. a) Bereitstellen einer Probe von humanem Blut, insbesondere von einem Neugeborenen, umfassend genomische DNA von Blutimmunzellen;
2. b) Behandeln der genomischen DNA der Immunzellen mit Bisulfit, um unmethylierte Cytosine in Uracil umzuwandeln;
3. c) Amplifizieren der behandelten genomischen DNA unter Verwendung geeigneter Primerpaare zur Herstellung von Amplikons und
4. d) Identifizieren der Blutimmunzellen basierend auf der Analyse der Amplikons wie amplifiziert,
wobei die Amplifizierung und Analyse der Amplifizierung und/oder qPCR unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus mindestens eine der Gruppen von SEQ ID Nrn., 1 bis 12 für CD4, SEQ ID Nrn. 13 bis 20 für CD8beta, SEQ ID Nrn. 21 bis 28 für LRP5, SEQ ID Nrn. 29 bis 36 für MVD, SEQ ID Nrn. 37 bis 44 für LCN2 und SEQ ID Nrn. 45 bis 56 für CD3gamma/delta umfasst, und
wobei eine Demethylierung mindestens einer CpG-Position in dem Amplikon für mindestens eine Blutimmunzelle, ausgewählt aus CD3+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, Neutrophilen, CD14+ Monozyten, CD56+ NK-Zellen und CD19+ B-Zellen, hinweisend ist.
• Bevorzugt wird ein Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, das ferner eine Analyse eines Amplikons für CD3-Epsilon umfasst, wie beispielsweise in US 2012/0107810 A1 offenbart.
• Bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, ferner umfassend eine zusätzliche FCM der zu identifizierenden Blutimmunzellen.
• Die epigenetische Immunzellzählung bietet eine robuste Plattform, die in der Lage ist, Immundefekte zu diagnostizieren und optional und komfortabel die Analyse von Durchflusszytometrie und T-Zell-Rezeptor-Exzisionskreisen ohne deren jeweilige Einschränkungen zu ergänzen.
  Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die genaue Quantifizierung von Methylierungsdaten, wie sie mit dem oben genannten Assay erhalten wurden. Dies beinhaltet mehrere Komponenten und Überlegungen:
1. 1. Ein interner Standard, z.B. in silico konvertierte Plasmide.
2. 2. Ein (z.B.) GAPDH-Normalisierer im Gegensatz zur methylierten Variante eines bestimmten Gens.
3. 3. Dadurch einen Vergleich aller demethylierten Kopien durch das obligatorische demethylierte GAPDH mit dem spezifischen (aber in der gleichen Anzahl von Kopien vorliegenden) demethylierten Gen gemäß der Quantifizierung mit 1.
4. 4. Dennoch erlaubt das Vorstehende keine wirklich „absolute“ Quantifizierung, da der in silico konvertierte Standard nicht der biologischen Probe entspricht (die nur im Reaktionsgefäß konvertiert wird.
5. 5. Lösung des Problems unter 4. durch Hinzufügen und Messen eines so genannten GNoMs (Genomic Normaliser of Methylation), hier werden alle ursprünglichen Sequenzen äquimolar in ein Plasmid eingebracht und dann dem Gesamtprozess (Bisulfit-Behandlung und - reinigung) unterzogen. Da sie 1:1 vorliegen, kann nach der Quantifizierung mit den Standards unter 1. ein Standard identifiziert werden, der den Unterschied zwischen in silico und in situ Methylierung zeigt. Mit diesem Faktor kann der Methylierungswert der Messungen korrigiert werden, was das Ergebnis erheblich verbessert.
6. 6. Mit einer definierten Menge einer Nukleinsäure (Plasmid) mit einem Standardgen mit invertierten CG-Basen kann zudem jeder Materialverlust während des Prozesses berücksichtigt werden, was das Verfahren weiter verbessert.
7. 7. Zuverlässige und spezifische Testkomponenten, die für die klinische Praxis und die Bedürfnisse entwickelt wurden.
• Zelltypspezifische DNA-Methylierungsmarker (13-15), die mit qPCR amplifiziert sind, ermöglichen den Nachweis und die Quantifizierung von Immunzellen auch in Proben mit begrenzter Menge und Qualität. Die Begründung für die Identifizierung von zelltypspezifischen epigenetischen Markern wurde bereits beschrieben (14, 16-18). Alternative Verfahren zur DNA-Methylierungs-basierten Immunzellquantifizierung beinhalten die Analyse einzelner CpG-Standorte auf genomweiter Ebene unter Verwendung der Microarray-Analyse (19). Dieses Verfahren ermöglicht die Schätzung von Leukozytensubpopulationen auf der Grundlage berechneter Beta-Werte (Methylierungsintensitäten). Die Erfinder gingen davon aus, dass die locusspezifische individualisierte epigenetische qPCR hochspezifisch und sensitiv ist und sich daher gut für diagnostische Ansätze eignet.
• Für die epigenetische qPCR wird genomische DNA mit Bisulfit behandelt. Unmethylierte CpG-Dinukleotide werden in TpGs konvertiert, während methylierte CpGs unverändert bleiben. So übersetzt die Bisulfit-Konvertierung epigenetische Markierungen in Sequenzinformationen, was die Unterscheidung und Quantifizierung beider Varianten ermöglicht. Epigenetische qPCR ist nicht anfällig für den Verlust der Zellintegrität, da DNA ein stabiles Substrat ist. Es kann an frisch gefrorenem Blut, DBS oder anderen Proben durchgeführt werden, ohne besondere Anforderungen an den Konservierungszustand. Darüber hinaus werden PCR-Komponenten synthetisch hergestellt und die Standardisierung ist einfach zu erreichen. Dennoch ist die Zählung von Immunzellen mittels epigenetischer qPCR noch nicht nachgewiesen, da es keine genau definierten spezifischen Biomarker gibt und keine endgültige und absolute Quantifizierung vorliegt (20).
• Die Erfinder untersuchten immunzelltypspezifische epigenetische qPCR zur Quantifizierung von Leukozytenpopulationen im humanen Blut. Für die gesamten CD3+, CD4+ und CD8+ zytotoxischen T-Zellen (21, 22) wurden regulatorische Elemente in den Genen, die für die zelltypspezifischen Proteine kodieren, hinsichtlich ihres Methylierungsstatus analysiert. Epigenetische Marker für Neutrophile, B- und NK-Zellen wurden durch genomweite Entdeckung und Profilierung der resultierenden Kandidaten-Gene identifiziert. Die Bestimmung der absoluten Zellzahlen (d.h. Zellen/µl Blut) bildet den Goldstandard, z.B. für die Zählung von CD4+ T-Zellen bei HIV-Patienten. Die Erfinder testeten die definitive und absolute Zählung von Immunzellen auf der Grundlage ihrer zelltypspezifischen epigenetischen Signale bei gesunden Spendern sowie einer Gruppe von HIV-Patienten und analysierten ihre Äquivalenz mit FCM. Für DBS, bei denen das Blutvolumen schwer zu definieren ist, wurden Kopien von unmethylierten immunzelltypspezifischen Marker-Genen mit Kopien eines Universalnenners (GAPDH) in Beziehung gesetzt. Darüber hinaus wurde das diagnostische Potenzial der epigenetischen qPCR durch die Identifizierung von PID-Fällen in einer Gruppe von klinisch unauffälligen Neugeborenen unter Verwendung von DBS nachgewiesen.
• In einer bevorzugten Ausführungsform des/r Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren integriert und umfasst ferner eine Analyse und eine erste Normalisierung unter Verwendung eines Demethylierungsstandard-Gens, ausgewählt aus einem Gen, das in allen zu identifizierenden Zellen exprimiert wird, wie beispielsweise einem House-Keeping-Gen, wie beispielsweise GAPDH und Beta-Actin, vorzugsweise unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 57 bis 61 für das Gen für das GAPDH.
• In noch weiter bevorzugter Ausführungsform des/r Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren integriert und umfasst ferner eine zweite Normalisierung unter Verwendung einer in silico Bisulfit-konvertierten rekombinanten Nukleinsäure, die eine Sequenz umfasst, die alle CpG-Dinukleotide in GpC des mindestens einen Demethylierungsstandard-Gens (GAP[GC]-Konstrukts) umkehrt, vorzugsweise unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 62 bis 64 für das GAP[GC]-Konstrukt.
• In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des/r Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren integriert und umfasst ferner eine dritte Normalisierung unter Verwendung eines Kalibrier-Plasmids, das eine Kopie jeder Amplikonsequenz in ihrem nicht konvertierten genomischen (d.h. unmethylierten) Zustand umfasst.
• In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des/r Verfahren(s) gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren ferner eine Quantifizierung der identifizierten Blutimmunzellen.
• In einer bevorzugten Ausführungsform davon umfasst ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Folgendes
1. a) Bereitstellen eines definierten Volumens einer Probe humanen Blutes, insbesondere von einem Neugeborenen, umfassend (z.B. diploide) genomische DNA von zu quantifizierenden Blutzellen;
2. b) Bereitstellen einer in silico Bisulfit-konvertierten rekombinanten Nukleinsäure, umfassend ein Demethylierungsstandard-Gen, eine Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC des Demethylierungsstandard-Gens umwandelt, und ein blutzellspezifisches Gen;
3. c) Bereitstellen einer rekombinanten Nukleinsäure, umfassend die demethylierte genomische Sequenz des Demethylierungs-Standard-Gens von b), eine Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC des Demethylierungsstandard-Gens und des blutzellspezifischen Gens von b) umkehrt;
4. d) Bereitstellen einer rekombinanten Nukleinsäure, umfassend die Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC des mindestens einen Demethylierungs-Standard-Gens von b) invertiert;
5. e) Hinzufügen einer definierten Menge der rekombinanten Nukleinsäure von d) zu der Probe von a) („Spiking“);
6. f) Behandeln der (z.B. diploiden) genomischen DNA der zu quantifizierenden Zellen von a) und der rekombinanten Nukleinsäuren von c) und d) mit Bisulfit, um unmethylierte Cytosine in Uracil zu überführen;
7. g) Amplifizieren der Nukleinsäuremoleküle von a), b), c) und f) unter Verwendung geeigneter Primerpaare zur Herstellung von Amplikons; und
8. h) Identifizieren der Blutimmunzellen basierend auf der Analyse der Amplikons,
wobei die Amplifizierung und Analyse der Amplifizierung und/oder qPCR unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus mindestens einem der Sätze von SEQ ID Nrn., 1 bis 12 für CD4, SEQ ID Nrn. 13 bis 20 für CD8beta, SEQ ID Nrn. 21 bis 28 für LRP5, SEQ ID Nrn. 29 bis 36 für MVD, SEQ ID Nrn. 37 bis 44 für LCN2 und SEQ ID Nrn. 45 bis 56 für CD3gamma/delta umfasst, und
wobei eine Demethylierung mindestens einer CpG-Position in dem Amplikon für mindestens eine Blutimmunzelle, ausgewählt aus CD3+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, Neutrophilen, CD14+ Monozyten, CD56+ NK-Zellen und CD19+ B-Zellen, hinweisend ist.
• Optional ist ein Quantifizierungsschritt für die Blutimmunzellen enthalten, wie hierin beschrieben.
• Bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, ferner umfassend eine Analyse eines Amplikons für CD3 epsilon, wie oben beschrieben.
• Bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, ferner umfassend eine zusätzliche FCM der zu identifizierenden Blutimmunzellen.
• Vorzugsweise wird das Demethylierungs-Standard-Gen aus einem Gen ausgewählt, das in allen nachzuweisenden Zellen exprimiert wird, wie beispielsweise einem House-Keeping-Gen, wie beispielsweise GAPDH und beta-Actin.
• In einem Aspekt des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung werden mehr als ein blutzellspezifisches Gen analysiert, z.B. wird ein Panel von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 blutzellspezifischen Genen nach Bedarf oder Wunsch erzeugt, optional zusammen mit mehr als einem Demethylierungs-Standard-Gen, wie hier beschrieben.
• Vorzugsweise sind die Nukleinsäuren Plasmide, z.B. linearisierte Plasmide, wie bakterielle Plasmide, z.B. pUC, ein künstliches Hefe Chromosom (YAC), künstliches humanes Chromosom (HAC), künstliches PI-basiertes Chromosom (PAC), ein künstliches bakterielles Chromosom (BAC) und/oder ein PCR-Produkt.
• In einem Aspekt des Verfahrens wird die Amplifikation mit einer ersten in silico Bisulfit-konvertierten Nukleinsäure (Plasmid) normalisiert, die ein Demethylierungs-Standard-Gen (z.B. GAPDH), eine „künstliche Sequenz“ (die Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC umwandelt) sowie ein blutzellspezifisches Gen (ein „spezifisches Gen“, z.B. CD4) umfasst. Alle drei Elemente sind gleichmäßig (äquimolar) auf der Nukleinsäure vorhanden und werden in silico konvertiert. Daher können die Normalisierungskurve und die entsprechenden Kalibrierungskurven direkt mit der Probe verglichen werden, und die relative Zellzahl kann aus dem Verhältnis von blutzellspezifischem Gen zu Demethylierungs-Standard-Gen bestimmt werden. Dennoch entspricht die Nukleinsäure nicht der „realen“ Sequenz, da jedes C durch eine T ersetzt wird. Eine serielle Verdünnung und Bestimmung jeder Konzentration mit allen Genen, wie erwähnt, erzeugte die Kalibrierkurve für den Assay.
• Um die Genauigkeit der Anwendung zu verbessern, wird eine zweite Nukleinsäure (Plasmid) verwendet, die das Demethylierungs-Standard-Gen (z.B. GAPDH), die „künstliche Sequenz“ (die Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide zu GpC invertiert) und das blutzellspezifische Gen (ein „spezifisches Gen“) umfasst. Dennoch werden diese Sequenzen NICHT in silico Bisulfit-konvertiert und entsprechen den genomischen Sequenzen (soweit sie ein genomisches Gegenstück haben, siehe unten) - und können daher nur zur Messung der Effizienz der Amplifizierung (z.B. qPCR) verwendet werden.
• Der Grund für den zweiten Standard ist zweifach. A) Für eine definitive Quantifizierung ist ein Standard erforderlich, der identisch mit der zu analysierenden biologischen Probe ist (dies ist ebenfalls eine regulatorische Anforderung). In der ersten Nukleinsäure wird jedoch eine doppelsträngige AT-reiche Sequenz mit einer einzelsträngigen U-reichen Sequenz verglichen. Nur die „echte“ Bisulfit-Konversion der doppelsträngigen Nukleinsäure lässt diesen endgültigen Vergleich zu. Dann ergibt der Quotient aus der Bisulfit-Konversion von Blutzellspezifischem Gen in Demethylierungs-Standard-Gen, normalisiert mit der ersten Nukleinsäure, einen Faktor für die Effizienz. Das Gleiche gilt für einen Quotienten, der auf der Division der Bisulfit-Konversion der Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC invertiert, durch die Bisulfit-Konversion des Demethylierungs-Standard-Gens basiert.
• Vorzugsweise ist die „künstliche Sequenz“ (die Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC invertiert) eine zufällige Sequenz aus C- und CpG-Sequenzen (zur Bisulfit-Konversion), die im humanen Genom nicht vorkommt. In einer Ausführungsform ist die künstliche Sequenz die genaue Sequenz des zu amplifizierenden Teils von GAPDH (Amplikon), wobei die CpG-Sequenzen in GpC-Sequenzen invertiert werden. Die „künstliche Sequenz“ befindet sich auf allen drei Nukleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, nämlich auf der ersten (in silico Bisulfit-konvertiert), der zweiten (für die Bisulfit-Konversion) und - als einzige analysierte Sequenz - auf der dritten Nukleinsäure (in silico Bisulfit-konvertiert).
• Die dritte Nukleinsäure wird in einer definierten Menge in eine definierte Blutmenge, insbesondere von einem Neugeborenen, gegeben und anschließend analysiert (z.B. Aufreinigung, Bisulfit-Behandlung, zweite Aufreinigung, Desulfonierung, spezifische Amplifikation). Anschließend wird eine Normalisierung gegen die erste Nukleinsäure durchgeführt (wie viele Kopien wurden gemessen und in die Reaktion gegeben), die Effizienz wird durch einen Vergleich mit der zweiten Nukleinsäure bestimmt und die (verbleibende) Kopienzahl wird durch die dritte Nukleinsäure bestimmt. Alle Verluste werden mit einem Verlust genomischer DNA verglichen, die dem gleichen Verfahren unterzogen wurde. Der Gesamtprozess ermöglicht eine genaue definitive und absolute Quantifizierung der DNA und damit der Zellen in einer Blutprobe, wie zum Beispiel Vollblut.
• In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine künstliche Sequenz, die die genaue Sequenz des zu amplifizierenden Teils von GAPDH ist (Amplikon), wobei die CpG-Sequenzen in GpC-Sequenzen als Werkzeug bei der Durchführung der/s Verfahren(s) der vorliegenden Erfindung invertiert werden.
• Die Zusammensetzung des zellulären Immunsystems enthält wertvolle diagnostische Informationen für verschiedene Krankheiten. Die Standardtechnologie für die quantitative Überwachung von Immunzellen ist die Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ist jedoch auf Blutproben beschränkt, bei denen die Zellintegrität erhalten bleibt. In der klinischen Routine beschränkt sich die Analyse damit effektiv auf frische Blutproben als Analysesubstrat.
• Um den Anwendungsbereich des diagnostischen Immunmonitorings zu erweitern, implementierten die Erfinder epigenetische qPCR-Systeme zur Quantifizierung der wichtigsten Leukozytenpopulationen. Bei der Bestimmung von immunzelltypspezifischen Methylierungsmarkierungen wurde Vollblut von 25 gesunden Spendern, 97 HIV-Patienten und 325 Guthrie-Karten von Neugeborenen, darunter 25 Karten von Patienten mit primären Immundefizienzen (PID), einschließlich, aber nicht beschränkt auf XLA, SCID, SCN, analysiert. Die methodische Übereinstimmung zwischen durchflusszytometrischen und epigenetischen Daten für B-, NK-, Gesamt-T-Zellen, T-Helferzellen, Neutrophile und zytotoxische T-Zellen wurde bestimmt und die Fähigkeit dieser neuen Technik, quantitative Immunzelldefizite zu identifizieren, wurde getestet.
• Daten zeigen, dass die Quantifizierung mittels epigenetischer qPCR-Assays und Durchflusszytometrie bei gesunden Probanden und HIV-Patienten laut Bland-Altman-Test gleichwertig funktioniert. Die epigenetische Quantifizierung ist für die relative und absolute Häufigkeit von Leukozyten-Subgruppen in frischen und gefrorenen Blutproben anwendbar. Im Gegensatz zur Durchflusszytometrie identifiziert die Immunzellenanalyse von Guthrie-Karten die PID-Fälle bei Neugeborenen genau. Die epigenetische Quantifizierung von Immunzellpopulationen führt mit hoher Äquivalenz zur Standard-Durchflusszytometrie durch und bietet ein breiteres Anwendungsspektrum, einschließlich der Analyse von getrockneten Blutflecken, die möglicherweise einen Weg zur Blutzählung von Patienten in abgelegenen Gebieten oder von Neugeborenen weisen.
• Bevorzugt wird daher das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, wobei die Blutprobe ausgewählt ist aus peripheren, kapillaren oder venösen Blutproben oder Subfraktionen davon, wie zum Beispiel periphere Blutmonozyten, Blutgerinnsel und getrocknete Blutflecken.
• Ebenfalls bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, umfassend den Schritt der Diagnose von primären Immundefiziten (PID) bei einem Menschen, insbesondere einem Neugeborenen, basierend auf der Quantifizierung, wobei die Probe vorzugsweise eine getrocknete Probe, wie eine Guthrie-Karte (siehe auch weiter unten), oder DBS (getrocknete Blutflecken) ist.
• Bevorzugt wird ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, ferner umfassend den Schritt des Rückschließens auf den Immunstatus eines Menschen auf der Grundlage mindestens einer Quantifizierung des mindestens einen Immunzellentyps.
• Bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus einem Plasmid, einem künstlichen Hefe-Chromosom (YAC), einem künstlichen humanen Chromosom (HAC), einem künstlichen PI-basierten Chromosom (PAC), einem künstlichen bakteriellen Chromosom (BAC) und einem PCR-Produkt.
• Bevorzugt wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung, wobei das Demethylierungs-Standard-Gen ausgewählt ist aus einem Gen, das in allen nachzuweisenden Zellen exprimiert wird, wie beispielsweise einem House-Keeping-Gen, wie beispielsweise GAPDH und beta-Actin.
• Bevorzugt wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das blutzellspezifische Gen ausgewählt ist aus: einem Gen, von dem bekannt ist oder das in allen nachzuweisenden Blutzellen exprimiert wird, CD4, CD8beta und/oder alpha, Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-related Protein 5 (LRP5), Mevalonat-Pyrophosphat-Decarboxylase (MVD), Lipocalin-2 (LCN2) und der CD3gamma/Delta-Region (Gen).
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein diagnostisches Kit, das Materialien zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, optional mit Bedienungsanleitung. Bevorzugte Materialien sind die Nukleinsäuremoleküle und/oder ein Bisulfit-Reagenz. Bevorzugte Materialien werden aus Primern und Sonden ausgewählt, die aus einer der SEQ ID Nrn. ausgewählt werden. 1 bis 12 für das Gen für CD4, SEQ ID Nrn. 13 bis 20 für das Gen für CD8beta, SEQ ID Nrn. 21 bis 28 für das Gen für LRP5, SEQ ID Nrn. 29 bis 36 für das Gen für MVD, SEQ ID Nrn. 37 bis 44 für das Gen für LCN2, SEQ ID Nrn. 45 bis 56 für die genetische Region CD3gammaldelta, SEQ ID Nrn. 57 bis 61 für das Gen für GAPDH und SEQ ID Nrn. 62 bis 64 für das GAP[GC] Konstrukt.
• Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des Kits gemäß der Erfindung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der Erfindung.
• Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Behandlung einer immunbedingten Erkrankung bei einem Menschen, insbesondere einem Neugeborenen, der sie benötigt, umfassend die Durchführung eines Verfahrens wie hierin beschrieben und die Bereitstellung einer Behandlung der immunbedingten Erkrankung basierend auf den Ergebnissen des Verfahrens. Eine weitere Ausführungsform umfasst eine Immunzellenüberwachung, und immunverwandte Krankheiten sind beispielsweise PIDs, andere Immundefekte oder Krebs.
• Die derzeitige Überwachung von Immunzellen erfordert eine frische oder gut konservierte bluthemmende Diagnostik in medizinischen Bereichen, in denen solche Substrate nicht verfügbar sind. Hier beschreiben die Erfinder die immunzelltypspezifische epigenetische qPCR, die es ermöglicht, die Anzahl der Immunzellen aus unbeobachtet konserviertem, papierfleckigem Trockenblut oder frischen Proben zu bestimmen. Die allgemeine Machbarkeit der epigenetischen qPCR wurde zuvor mit Hilfe der „Treg spezifischen demethylierten Regionen (TSDR)“ in regulatorischen T-Zellen nachgewiesen (13). Nach Identifizierung spezifischer epigenetischer Marker für eine Reihe diagnostisch relevanter Immunzellpopulationen demonstrieren die Erfinder die Leistungsäquivalenz der entsprechenden epigenetischen qPCR mit den Goldstandardtechnologien (FCM, TREC/KREC-Analyse) der Immunzellanalytik. Dazu wurde die Quantifizierung von Immunzellen in frisch gefrorenem Blut und/oder DBS aus gesunden Kontrollen, eine Kohorte von primären (PID) oder erworbenen (HIV) Immundefiziten sowie eine Kohorte von Neugeborenen mit oder ohne angeborene Immundefizite analysiert.
• Ideale DNA-Methylierungsmarker für die Zelltyp-Identifikation sind unterschiedlich zwischen dem Ziel (nahe 0% Methylierung) und allen Kontrollzellen (nahe 100% Methylierung). Zusätzlich zur Analyse der T-Zell-assoziierten Gene CD3G/D, CD4 und CD8B wurden Loci in den Genen MVD, LRP5 und LCN2 nur in NK-Zellen, B-Zellen und Neutrophilen unmethyliert gefunden. MVD ist Bestandteil des Mevalonat-Signalweges (33) und wird im Hoden, Duodenum und Dickdarm exprimiert. LRP5 ist an der Knochenbildung beteiligt (34). LCN2 ist ein extrazelluläres Transportprotein und ein Hauptprotein der humanen Tränenflüssigkeit (35). Grund und Funktion der spezifischen Abwesenheit von Methylierung in diesen Regionen sind noch zu analysieren, haben aber keinen Einfluss auf ihre Verwendung zur Zellquantifizierung im peripheren Blut. Alle Marker wurden durch Bisulfit-Sequenzierung validiert und die unterscheidenden CpG-Dinukleotide für die qPCR-Entwicklung ausgewählt und an künstlich erzeugter methylierter und unmethylierter DNA charakterisiert. Die quantitative Amplifikation der Ziel-DNA wurde erreicht, ohne den Hintergrund von Nicht-Ziel-Templates zu erfassen. Die qPCR-Assay-Performance war robust und mit geringen Abweichungen, wie kleine intra- und interassay-CVs in frischem, gefrorenem oder getrocknetem Blut zeigen.
• Für die gleichzeitige Quantifizierung verschiedener Zelltypen in biologischen Proben entwickelten die Erfinder ein Kalibrator-Plasmid, das die unmethylierten genomischen Sequenzen von GAPDH als Referenz-Messwert und die zelltypspezifischen Marker enthält. Während GAPDH zuvor als instabiler Genexpressions-Normalisierer (36) beschrieben wurde und segmentale Duplikationen (37) beinhaltet, ist der hier ausgewählte GAPDH-Locus stabil diploid und immer unmethyliert. Durch die Anpassung der Quantifizierung biologischer Proben an den in silico Bisulfit-konvertierten Standard und durch den Kalibrator können daher assayspezifische technische Ineffizienzen korrigiert werden und ermöglichen eine endgültige Quantifizierung (20) der jeweiligen Loci in Bezug auf unmethyliertes GAPDH, d.h. alle nukleierten Zellen. Somit zeigt die epigenetische qPCR eine direkte proportionale Beziehung zu den von FCM bestimmten Zelltypen. Die verbleibenden beobachteten Abweichungen zwischen den Verfahren (38) können sich aus der biologischen und technischen Diskrepanzen zwischen nukleinsäurebasierten und antikörperbasierten Verfahren ergeben. Homogene Fehlerverteilung und Präzision waren vergleichbar mit Daten aus zuvor durchgeführten Methodenvergleichen zwischen verschiedenen Antikörper-basierten Verfahren (39). Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass epigenetische qPCR, sowohl aus flüssigen als auch aus getrockneten Blutsubstraten, gleichwertig mit FCM für die relative Quantifizierung von Immunzellen ist.
• Im Hinblick auf klinische Anwendungen wird die relative Zellquantifizierung von der WHO in den HIV-Behandlungsrichtlinien akzeptiert, aber in der medizinischen Praxis hängen die Behandlungsempfehlungen von der Zellzählung pro Volumen ab (40, 41). Für die epigenetische qPCR stellt dies ein Problem dar, da die DNA-Rückgewinnung nicht quantitativ ist und das Verhältnis zwischen DNA-Menge und Blutvolumen nicht festgelegt ist. Aus diesem Grund beinhaltete der Versuchsaufbau der Erfinder das Spiken einer definierten Konzentration von künstlichem GAP[GC] ins Blut, was bei der anschließenden qPCR-Analyse eine ungefähre Inferenz auf den ursprünglichen DNA-Gehalt in einem definierten Blutvolumen ermöglicht. Während unterschiedliche Wirkungsgrade von genomischer und Plasmid-DNA beschrieben wurden (42), werden diese Unterschiede nach der Bisulfit-behandlung und der daraus resultierenden genomischen DNA-Fragmentierung stärker reduziert. Bei Anwendung auf gesunde Spender und eine HIV-Kohorte zeigten die Daten eine hohe Korrelation und Abweichungen und Grenzen von Vereinbarungen, die den beschriebenen Daten für den Vergleich der relativen Quantifizierungsverfahren ähnlich sind. Dementsprechend kamen die Erfinder zu dem Schluss, dass die Zählung der Immunzellen pro Mikroliter mit epigenetischer qPCR durchgeführt werden kann, die dem FCM entspricht.
• Derzeit werden neonatale Screenings immer anhand von DBS durchgeführt. Da FCM auf dieses Substrat nicht anwendbar ist, wird die TREC/KREC-Analyse für das PID-Screening verwendet. Die Einführung epigenetischer qPCR in einem solchen Screening würde daher eine Äquivalenzprüfung mit TREC/KREC erfordern. Aufgrund verschiedener getesteter Parameter, d.h. DNA-Exzisionskreise vs. genomische DNA, ist ein Methodenvergleich nicht möglich. Stattdessen schätzten die Erfinder die Spezifität und Empfindlichkeit von TREC/KREC ab (43). Epigenetische qPCR identifizierte Neugeborene, die an verschiedenen Arten von PID leiden, zuverlässig mit ähnlicher Sensitivität und Spezifität bei Verwendung der 99%igen Konfidenzbereiche. Es gelang lediglich nicht, einen neugeborenen PID-Patienten mit mütterlicher Transplantation zu identifizieren, d.h. einen Patienten, bei dem das Fehlen von T- und B-Zellen durch mütterliche Zellen maskiert wird. Im Gegensatz zur Analyse von Exzisionskreisen ist die epigenetische Analyse nicht auf die wichtigsten Teilmengen der Lymphozyten beschränkt. Solche Probleme können durch eine Erweiterung des epigenetischen qPCR-Portfolios auf Marker für Gedächtnis-T- oder -B-Zellen gelöst werden, die bei Neugeborenen ohne Transplantation fehlen. Bei der Erkennung beim Neugeborenen können diese Marker die Erkennung von Transplantationen ermöglichen und damit auf das Fehlen eines gesunden inhärenten Immunsystems hinweisen.
• Weitere quantitative Defekte anderer Immunzellpopulationen treten in Neutrophilen und hochspezialisierten Tregs auf. Die Daten der Erfinder deuten darauf hin, dass die Identifizierung solcher Patienten basierend auf der epigenetischen qPCR für Neutrophile und Tregs frühzeitig nach der Geburt möglich ist, was eine frühzeitige Diagnose der SCN ermöglicht, die potenziell lebensbedrohliche PIDs darstellt (43, 44). Die Bedeutung der Erkennung und Behandlung dieser schweren Immunerkrankungen wurde bereits vorab veranschaulicht (46).
• Aufgrund der Seltenheit der Patienten stellt die Durchführung umfassender Studien zu seltenen genetischen Erkrankungen eine große Herausforderung dar. Hier wirkte sich diese Einschränkung am stärksten auf die Analyse von nur sechs SCN-Patienten aus, dennoch ist die Gruppe der SCID-Patienten mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund gut vergleichbar mit zuvor veröffentlichten Studien (47). Der begrenzte Datensatz dieser Erfindung belegt nur die technische Machbarkeit, erlaubt aber noch nicht die Umsetzung in ein Neugeborenen-Screening. Trotz der strengen Einschränkungen dieser Erfindung deuten die Daten der Erfinder darauf hin, dass die epigenetische qPCR eine Option in medizinischen Screening-Verfahren darstellen kann.
• Zusammenfassend zeigt die Erfindung, dass die epigenetische qPCR präzise und genaue Mittel zur Erkennung und Überwachung von Immunzellen bereitstellt, und sie unterstreicht, dass die epigenetische qPCR die aktuelle Immundiagnostik unterstützen oder sogar ersetzen kann, insbesondere bei nicht überwachbarem konservierten Blut oder DBS.
• Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen und Zahlen näher beschrieben und erläutert, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden alle hier zitierten Verweise in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen.
• 1 zeigt die Bisulfit-Sequenzierung der DNA-Methylierung von zellspezifischen Marker-Genen in gereinigten Immunzellen. Immunzelltypen sind in Spalten mit Amplikons (AMP) und den zugehörigen Namen der Gene in Zeilen angeordnet. Verschiedene Gen-Orte sind durch rote Linien getrennt, Amplikons innerhalb desselben Locus durch schwarze Linien. Jede einzelne Zeile repräsentiert einen einzelnen CpG-Standort. Die Methylierungsstufen sind farbcodiert von hellgrau (0%) bis dunkelgrau (100%).
• 2 zeigt einen Vergleich der Quantifizierung von Immunzellen durch FCM und epigenetische qPCR. Immunzellen aus 25 Blutproben unabhängiger Spender wurden mit Durchflusszytometrie (y-Achse) und epigenetischer qPCR (x-Achse) gemessen. In A) werden die relativen Immunzellenzahlen in Prozent der gesamten Leukozyten angegeben. In B) werden absolute Immunzellenzahlen als Zellzahl pro µl Vollblut angegeben. Die Regressionslinie wird rot dargestellt, wie sie aus allen Datenpunkten berechnet wird, die schwarze Linie zeigt die Halbierungslinie.
• 3 zeigt den Methodenvergleich von T-Zell-Subgruppen in einer HIV-Kohorte. Relative Anzahl von CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen in % der gesamten nukleierten Zellen, bestimmt durch (A) FCM und epigenetische qPCR in flüssigem Vollblut, (B) FCM wie in A) und epigenetische qPCR aus DBS, und (C) Vergleich der epigenetischen qPCR aus flüssigem Blut und DBS. Auf der linken Seite werden die Daten als Scatterplots dargestellt. Die Regressionslinie wird rot dargestellt, wie sie aus allen Datenpunkten berechnet wird, die schwarze Linie zeigt die Halbierungslinie. Auf der rechten Seite zeigen Bland-Altman-Plots die durchschnittliche Zellzählung der jeweiligen Analysen (x-Achse), die über ihre relative Differenz (y-Achse) aufgetragen wurden. Rote Linien zeigen die Grenzen der Übereinstimmung an. Die zentralen grauen Linien veranschaulichen die systematische Abweichung. Die jeweiligen 95% CIs werden als gestrichelte Linien dargestellt. Obere Platte: Gesamtzahl der CD3+ T-Zellen; Mittleres Feld: CD4+ T-Zellen; unten rechts: CD8+ T-Zellen.
• 4 zeigt die epigenetische qPCR des neonatalen DBS. Kopien von zelltypspezifischen qPCRs (y-Achse), die gegen GAPDH-Kopien (x-Achse) gezeichnet wurden. (A) unmethylierte CD3G/D, B) MVD und C) LRP5. DBS von gesunden Neugeborenen (n=250, graue Kreise) legen die Referenzbereiche für jeden Assay, definiert durch 99% Konfidenzbereich (rote Ellipse) und 99,9% Konfidenzbereich (blau) fest. 24 DBS von PID diagnostizierten Neugeborenen werden als farbige Kreise dargestellt, die sich jeweils auf die in Tabelle 2 dargestellten Krankheitsmerkmale beziehen.
• 5 zeigt die epigenetische qPCR auf DBS von Neugeborenen mit SCN. DBS aus gesunden Kontrollen (grau+Box) und Neugeborene mit bestätigtem SCN wurden epigenetisch qPCR zur Quantifizierung von CD15+ Neutrophilen unterzogen. Gesunde Kohorten werden im Boxplot dargestellt und Ergebnisse von erkrankten Patienten werden hellgrau dargestellt.
• 6 zeigt einen schematischen Überblick über die verschiedenen Quantifizierungsansätze für die epigenetische Zellzählung. In A) wird die ortsspezifische relative prozentuale Quantifizierung veranschaulicht. Die qPCRs ermöglichen das Zählen von Kopienzahlen, basierend auf der Berechnung von seriell verdünnten in silico konvertierten Plasmiden durch eine lineare Interpolation (f-1) der Amplifikationsergebnisse (f). Die relative prozentuale Methylierung am genomischen Locus wird durch die interpolierte Kopienzahl der ursprünglich unmethylierten Kopien an diesem Locus berechnet, dividiert durch alle Kopien an diesem Locus, d.h. die methylierten und unmethylierten. Die Umwandlung in der biologischen Probe stört die Integrität der genomischen DNA, während das Plasmid das Amplifikationsprodukt und nicht das Substrat darstellt. Die daraus resultierende Differenz in der Amplifizierungseffizienz wird durch einen unbekannten „Konvertierungsfaktor (CF)“ angegeben. Sie gilt als vernachlässigbar, wenn man die Amplifikation von zwei hochhomologen Sequenzen mit wenigen Methylierungsstatus-abhängigen SNPs vergleicht. In (B) wird der universell unmethylierte GAPDH-Locus (der die Gesamtzahl der genomischen DNA-Kopien darstellt) als Nenner verwendet, um das Verhältnis eines beliebigen zelltypspezifischen unmethylierten Locus zu bestimmen. Hier führt der CF zu erheblichen Verschiebungen zwischen den verschiedenen qPCR-Assays. In C) wird ein Kalibrator-Plasmid, das die äquimolare genomische Zielsequenzen enthält, verwendet, um die Konversionseffizienzen an den verschiedenen genomischen Orten zu kompensieren, indem der Effizienzfaktor (EF) eingeführt wird. D) Zur Zählung der absoluten Anzahl von Zellen in einem definierten Blutvolumen wird eine bekannte Kopienzahl von Plasmiden mit einer synthetischen, nicht natürlichen DNA-Sequenz (GAP-GC) ergänzt. Die Interpolation der Ausgangsmenge von GAP-GC ermöglicht die Überwachung der DNA-Präparation, - Konvertierung und qPCR und bietet einen guten Schätzer für die Prozesseffektivität.
• 7 zeigt eine Korrelationsanalyse der absoluten Quantifizierung für T-Zell-Subgruppen in einer HIV-Kohorte. Absolute Immunzellzahlen (gemessen in Zellen pro µl Blut) wurden aus Blutproben von 97 HIV+-Patienten mittels Durchflusszytometrie und epigenetischer qPCR-Analyse gemessen. Das Diagramm auf der linken Seite stellt drei T-Zellpopulationen dar, gemessen durch epigenetische qPCR-Analyse (x-Achse) und Durchflusszytometrie (y-Achse). Die Linien in Schwarz und Rot repräsentieren die Halbierungslinie bzw. die Regressionslinie. Pearson-Korrelationskoeffizient r=0,955 (p<0,0001). Die Diagramme auf der rechten Seite zeigen einen Bland-Altman-Plot mit der mittleren Zellzahl (Zellen pro µl), gemittelt zwischen jeder epigenetischen und zytometrischen Messung auf der X-Achse, dargestellt über ihre (relative) Differenz (y-Achse). Rote Linien spiegeln zeigen die Grenzen der Übereinstimmung an und die zentrale graue Linie veranschaulicht die systematische Abweichung. Über und unter jeder dieser Linien werden die jeweiligen 95% Konfidenzintervalle als gestrichelte graue Linien dargestellt. Oberes Panel: Gesamtzahl der CD3+ T-Zellen; mittleres Panel: CD8+ T-Zellen; unten rechts: CD4+ T-Zellen.
• 8 zeigt die Quantifizierung epigenetischer Immunzellen auf DBS von Neugeborenen. Getrocknete Blutflecken auf Guthrie-Karten wurden einer epigenetischen qPCR-Analyse zur Quantifizierung von unmethylierten CD4 (A; spezifisch für CD4+ T-Zellen) und CD8B (B, spezifisch für CD8B+ T-Zellen) Genkopien unterzogen. Berechnete Werte aus den immunzellspezifischen Assays (y-Achse) wurden über parallel gemessene GAPDH-Kopien (x-Achse) gestreut. Referenzproben von gesunden Neugeborenen (n=250, graue Punkte) wurden gemessen und verwendet, um Normalbereiche für jeden Assay zu schätzen, die durch rote (99% Konfidenzbereich) bzw. azurblaue (99,9% Konfidenzbereich) Ellipsen definiert sind. 24 Proben von Neugeborenen mit jeweils einer diagnostizierten PID (Klassifizierung gemäß dem Legendenfeld unten rechts) werden als roter, blauer, grüner und schwarzer Kreis dargestellt, die jeweils einem Kennzeichen zugeordnet sind, das sich auf Krankheitsmerkmale gemäß Tabelle 2 bezieht.

  

  

  

  

  

  

  

  Tabelle 7A/B: Oligonukleotide für die Bisulfit-Sequenzierung und qPCR und ihre jeweiligen Konzentrationen, wie sie in den Reaktionen verwendet werden.

  Gen	ENSEMBL-ID	Oligonukleotide für Bisulfit-Sequenzierung
  		Amp	Sequenz (5' - 3')	SEQ ID Nr.	Konz. [µM]
  CD4	ENSG	1255
  	00000010610	Fw.	GGTTTAGGAGGGGTTGTATATT	1	0.5
  		Rev.	GGTTTAGGAGGGGTTGTATATT	2	0.5
  CD4	ENSG	2000
  	00000010610	Fw.	GGGTTAGAGTTTAGGGTTGTT	3	0.5
  		Rev.	ACTATCCCCAATATCCTCTACTT	4	0.5
  CD4	ENSG	2001
  	00000010610	Fw.	TCTAAAATATACAAAACTAACCCAAT	5	0.5
  		Rev.	GTGTTAGATAGAGTTTGGGGGT	6	0.5
  CD8B	ENSG	2007
  	00000172116	Fw.	AATGTTTTATTTGGGGGTTTAT	13	0.5
  		Rev.	CCTACTACTCCTTCAATTCTCAA	14	0.5
  LRP5	ENSG	2249
  	00000162337	Fw.	ATTTTTGTGTGATTTTAGGGTT	21	0.5
  		Rev.	ATATCCAAATATCCTACCCTCC	22	0.5
  MVD	ENSG	2674
  	00000167508	Fw.	AACCCCTAATTTCCTTCTTACT	29	0.5
  		Rev.	GGTGTGGGTTTGAGTTTATTT	30	0.5
  LCN2	ENSG	1730
  	00000148346	Fw.	GATTAGGTTTGAGGTGGAGTT	37	0.5
  		Rev.	TATCCCTACCAAAAATACAACA	38	0.5
  CD3G/D	ENSG	1405
  	00000160654	Fw.	GATTTTTAGATGTTTGGGGTT	45	0.5
  	ENSG 00000167286	Rev.	TTATTCCACCTATTACCTTCCA	46	0.5
  CD3G/D	ENSG	1406
  	00000160654	Fw.	TTTAGGTTGTGTGTAAATGTGG	47	0.5
  	ENSG	Rev.	ATAAACCTCACTCCCATCAATA	48	0.5
  	00000167286
  CD3G/D	ENSG	1408
  	00000160654	Fw.	AGGATGAGGATAGTTAGGTTTTT	49	0.5
  	ENSG	Rev.	AATCCCTCCTAAATTCATTACC	50	0.5
  	00000167286
  GAPDH	ENSG	1570
  	00000111640	Fw.	AAACCCACTTCTTTAATTTACC	57	0.5
  		Rev.	TGGGGGTAGGGTAGTTG	58	0.5
  GAP [GC]	-

  Tabelle 7B

  Oligonukleotide für qPCR Analyse
  Gen	Assay-Variante	Sequenz (5' - 3')	SEQ ID Nr.	Konz. [µM]
  CD4	TpG
  	Fw.	CCCTACTCTTATAATAAACATTTTTATCAA	7	4.5
  	Rev.	GAAATTATTTTTTGAGTGTTTTTAATG	8	3
  	Sonde	TGATTTTGAGGGTGGTGGTTATTTTG	9	0.25
  CD4	CpG
  	Fw.	CCCTACTCTTATAATAAACATTTTTATC	10	1.5
  	Rev.	GGAAATTATTTTTCGAGTGTTTTTAACG	11	1.5
  	Sonde	ATTTTGAGGGCGGCGGTTATTTT	12	0.25
  CD8B	TpG
  	Fw.	GTGGTTAAGAAATTAATAGGAAAAAGAATG	15	1.5
  	Rev.	CTTCCCCACCACAATACAACA	16	1.5
  	Sonde	TGTTTGTGAGGTATTTAGTTGATGGGAGTTT	17	0.125
  CD8B	CpG
  	Fw.	GGTTAAGAAATTAATAGGAAAAAGAAC	18	1.5
  	Rev.	CCCCATATTACTTCCCCG	19	1.5
  	Sonde	CGTTTGTGAGGTATTTAGTCGACGGGAG	20	0.125
  LRP5	TpG
  	Fw.	AATATTACAACCATACACCCAACAA	23	1.5
  	Rev.	AAGTGATAGAATTTTATGTTTTTTTTATG	24	1.5
  	Sonde	TTAGTTGAGGTGAGGTGTTTTGTTAGT	25	0.25
  LRP5	CpG
  	Fw.	ATTAATATTACGACCGTACGC	26	1.5
  	Rev.	CGATAGAATTTTACGTTTTTTTTAC	27	1.5
  	Sonde	ACGAAACGCCTCGCCTCGA	28	0.25
  MVD	TpG
  	Fw.	GGTTTTGTGGTATTTTTATAGAGTAGT	31	1.5
  	Rev.	CCATATACACCCTCCTCAA	32	1.5
  	Sonde	CCCTAAACCACCTCTTCCCCTACAC	33	0.125
  MVD	CpG
  	Fw.	TTTTGTGGTATTTTTATAGAGTAGC	34	1.5
  	Rev.	CCATATACGCCCTCCTCG	35	1.5
  	Sonde	AAACCGCCTCTTCCCCTACG	36	0.25
  LCN2	TpG
  	Fw.	ACCAAAAATACAACACTTCAA	39	1.5
  	Rev.	GGTAATTGTTAGTAATTTTTGTG	40	1.5
  	Sonde	CACTCTCCCCATCCCTCTATC	41	0.15
  LCN2	CpG
  	Fw.	TACCAAAAATACAACACTCCG	42	1.5
  	Rev.	AGGTAATTGTTAGTAATTTTTACG	43	1.5
  	Sonde	CTCACTCTCCCCGTCCCTCTATC	44	0.15
  CD3G/D	TpG
  	Fw.	CCTAAACACTACCACATCTCAA	51	1.5
  	Rev.	AGAAATTTAGTTGTTATGGTTTGT	52	1.5
  	Sonde	AAAAAACCATCAACCCCATAACACAAA	53	0.25
  CD3G/D	CpG
  	Fw.	CTAAACACTACCACATCTCGA	54	1.5
  	Rev.	AAATTTAGTTGTTACGGTTTGC	55	1.5
  	Sonde	CCGTCGACCCCATAACGC	56	0.25
  GAPDH	TpG
  	Fw.	GGTTTTTGGTATTGTAGGTTTT	59	1.5
  	Rev.	CCAATTACAACATAACAACCA	60	1.5
  	Sonde	TGTTTGGATGTTGTGTTTGTGGTAGAGTG	61	0.25
  GAP	TpG
  [GC]	Fw.	GGTTTTGTGTATGTTAGGTTTG	62	0.75
  	Rev.	CCACATTACAACATAAACACAC	63	0.75
  	Sonde	TGTTGTGATGTTGGTTTTGGTGTAGAGGT	64	0.125

• Beispiele
• Studiendesign - Das Forschungsziel war es, festzustellen, ob epigenetische qPCR die aktuellen Verfahren zur diagnostischen Zählung von Immunzellen ergänzen kann. Um dies zu testen, identifizierten und bewerteten die Erfinder zelltypspezifische unmethylierte DNA-Loci für relevante Immunzellen wie CD15+ Neutrophile, CD19+ B, CD56+ NK, CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen und Tregs. Epigenetische qPCR wurde unter Verwendung etablierter Normalisierungsparameter entwickelt und standardisiert. Kritische Schritte für diese Normalisierung waren die Bereitstellung einer vergleichbaren Messung für alle zellspezifischen qPCRs durch Anpassung an die qPCR-Effizienz zwischen verschiedenen genomischen Loci und verschiedenen Bisulfit-Konversionseffekten verschiedener Regionen sowie die Normalisierung der DNA-Aufreinigung zur absoluten Quantifizierung von Zellen pro Blutvolumen. Sowohl die relative als auch die absolute Quantifizierung wurde angewendet, um Vollblut von 25 gesunden Spendern, 97 HIV-Patienten sowie getrocknete Flecken von 250 getrockneten Blutflecken von gesunden Neugeborenen und 24 Neugeborenen-Karten von Neugeborenen mit primären Immundefiziten zu bewerten. Die Ergebnisse der epigenetischen qPCR wurden auf Äquivalenz mit Standard-FCM überprüft und darüber hinaus in Anwendungen mit aktueller diagnostischer Unterversorgung bei der Zählung von Immunzellen, insbesondere primären und erworbenen Immundefiziten, getestet. Patientenmaterial wurde aus deutschen und kalifornischen Krankenhäusern zur Verfügung gestellt und vor der Datenanalyse verblindet.
• Getrocknete Blutflecken - Es wurden drei 3,2 mm DBS-Stempel von genetisch nachgewiesenen IPEX-, SCID-, SCN- und XLA-Patienten, von 250 zufällig ausgewählten anonymen Neugeborenen und aus Kapillarblut eines Patienten mit nachgewiesener IPEX gewonnen. Die Sequenzierung und genetische Bestätigung der erfassten PID-Patienten erfolgte in Übereinstimmung mit dem Praktizier-Toolkit des Clinical Sequencing Exploratory Research (CSER) Consortium. Für alle Teilnehmer wurde eine schriftliche Zustimmung der Eltern eingeholt. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer Sachsen oder dem Institutional Review Board der Universität Freiburg genehmigt.
• Peripheres Vollblut - EDTA-antikoaguliertes peripheres Blut wurde mit ethischer Zustimmung von 25 gesunden Probanden und 97 HIV+ Patienten an der Universität Leipzig entnommen. Die Proben wurden mit epigenetischer qPCR und mit Standard-FCM (48) untersucht. Die Informationen waren für die Experimentatoren verblindet.
• DNA-Präparation und Bisulfit-Konvertierung - Für gereinigte Zellen wurde genomische DNA isoliert und Bisulfit mit DNeasy-Tissue und EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben behandelt. Für EDTA-Blut wurde 20 µl Substrat mit 16 µl Lysepuffer, 3 µl Proteinase K (30 mg/ml) und GAP[GC] Plasmid (Endkonzentration 20.000 Kopien/µl) ergänzt und 10 Minuten lang bei 56°C lysiert. Für die Konvertierung wurde das EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit verwendet. 3x3,2 mm DBS-Stempel wurden 68,75 µl Lysepuffer, 10,75 µl Proteinase K (30 mg/ml), 20.000 Kopien/µl GAP[GC] Plasmid (Endkonzentration) hinzugefügt und 60 Minuten lang bei 56°C lysiert. Die Konversion erfolgte 45 Minuten lang bei 80°C mit 180 µl Ammonium-Bisulfit (68%-72%, pH 4,8-5,3, Chemos AG, München, Deutschland) und 60 µl Tetrahydrofurylalkohol (Sigma-Aldrich). Zur Reinigung wurde „My Silane Genomic DNA Kit“ (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach Herstellerangaben verwendet. Die Bisulfit-Konversionsraten wurden zuvor analysiert und sind in der Herstelleranleitung mit Werten über 98% (49) angegeben. Die Effizienz der Konversion wurde routinemäßig durch Bisulfit-Sequenzierung mit Raten von über 98% überprüft. Als Prozesskontrolle beinhaltete der genomische Kalibrator Konvertierungskontrollen in jeder einzelnen qPCR. BioPerl wurde für die Umwandlung von Sequenzen (50) in silico Bisulfit verwendet.
• Epigenetische qPCR - Thermischer Zyklus wurde wie folgt durchgeführt: 1 x 95°C für 10 oder 35 Minuten gefolgt von 50 x 95°C für 15 Sekunden und 61°C für 1 Minute in 5 µl (DBS) oder 10 µl (EDTA-Blut) mit Roche LightCycler 480 Probes Master. Für die Berechnung der Zellzahlen aus autosomalen Genen wurde ein Verhältnis von 2:1 Allel zu Zelle angenommen. Für RDls [%] wurden TpG-Kopien durch TpG- + CpG-Kopien geteilt. Für RDu [%] wurde der Quotient aus TpG-Kopien (des jeweiligen Immunzelltyps) und GAPDH-Kopien berechnet. Für DDu[%] wurde RDu korrigiert, indem der EF Leistungsunterschiede zwischen verschiedenen qPCRs kompensierte. Für assayspezifischen EF verwendeten die Erfinder einen plasmidbasierten Kalibrator, der die genomische Zielregion aller qPCRs beherbergt, einschließlich GAPDH (Universalnenner) und einer künstlichen GAP[GC] Region. Der Kalibrator wurde einer Bisulfit-Konvertierung unterzogen, gefolgt von einer qPCR. Der EF wurde berechnet, indem gemessene TpG-Kopien durch parallel gemessene GAPDH-Kopien dividiert wurden. Die EFen wurden aus etwa 25 Experimenten abgeleitet. 95% CI waren 0,90-1,19 (CD3G/D), 0,47-0,63 (CD4), 0,75-1,00 (CD8B), 0,58-0,77 (LRP5), 0,89-1,18 (MVD) und 0,38-0,48 (LCN2). Für die absolute Quantifizierung wurde eine künstliche GAPDH-Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide in GpC (GAP[GC]) umwandelt, und die entsprechende epigenetische qPCR ohne Kreuzreaktivität mit endogenem GAPDH entwickelt. Der EF für GAP[GC] war 0,87 mit einem 95% CI von 0,75-1,00.
• Kombinierter TREC/KREC Neugeborenen-Screening-Assay - Das TREC/KREC-Screening wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (51). Kurz gesagt, wurde DNA aus einem 3,2 mm Stempel des ursprünglichen DBS in einem 96-Well-Format extrahiert und quantitative Triplex-Real-Time-qPCR für TREC, KREC und ß-Actin (ACTB) mit einem ViiA7 Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die TREC- und KREC-Kopienzahlen wurden pro 3,2-mm-Stempel bestimmt. ACTB wurde verwendet, um geeignete DNA-Mengen pro DBS zu überprüfen und nicht, um TREC/KREC-Kopien zu normalisieren.
• Plasmide - Sequenzen, die methylierten oder unmethylierten, Bisulfit-konvertierten genomischen Regionen entsprechen, wurden in silico entwickelt und in das Plasmid pUC57 (Genscript Inc., Hongkong, China) eingesetzt und für die Assay-Etablierung und als qPCR-Quantifizierungsstandard verwendet. Standard-Plasmide beherbergen alle Assay-Zielsequenzen äquimolar. Plasmide wurden spektrophotometrisch quantifiziert, durch Seal linearisiert und seriell in 10 ng/µl λ-Phage DNA (New England Biolabs) verdünnt, um 31250, 6250, 1250, 250, 50 oder 30 Kopien in der endgültigen Reaktion zu erhalten. Das Kalibrator-Plasmid beherbergt alle Assay-Zielsequenzen äquimolar in genomischer, unkonvertierter, unmethylierter Version. Künstliches Spike-in-Plasmid trägt unkonvertiertes GAPDH mit invertierten CpG-Dinukleotiden (GAP[GC]).
• Oligonukleotide - Oligonukleotide (Metabion AG, München, Deutschland) sind in Tabelle 7 beschrieben.
• Durchflusszytometrie - Für die Leukozyten-Aufreinigung wurde peripheres Blut von gesunden erwachsenen Spendern durch FCM in CD15+, CD14+, CD56+ NK, CD19+ B, CD4+ und CD8+ T-Zellen mit Zellreinheiten >97% und Lebensfähigkeit >99% fraktioniert, wie zuvor beschrieben (13). Für die analytische Zellquantifizierung wurden die absoluten CD45+ Leukozytenzahlen mit einem MACSQuant Zytometer (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland) bestimmt. Die Frequenzen und absoluten Zahlen von CD15+ Neutrophilen, CD19+ B, CD56+ NK, CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen und FOXP3+ Tregs wurden wie zuvor beschrieben berechnet (13, 48).
• Statistische Analyse - CP (Crossing Point) von Dreifachmessungen wurde durch sekundäres Maximum unter Verwendung der LC480-Software (Roche, Mannheim, Deutschland) berechnet, um Kopienzahlen (Plasmideinheiten) zu erhalten, indem die Amplifikation (f) aus Kalibrierkurven, die mit seriellen Verdünnungen von Standards auf Plasmidbasis erzeugt wurden, interpoliert wurde. Die Stichprobengrößen für den Methodenvergleich wurden als 100 gewählt, um 95% CI für die Grenzwerte der Übereinstimmung bei +/- 0,34x der zugrunde liegenden Standardabweichung zu erhalten. Die Schätzung von Referenzbereichen erfordert eine gesunde Population von mindestens 120 Individuen für die nichtparametrische Schätzung der 95% CI. Die Zahl der gesunden Fälle wurde bis zur Erschöpfung der verfügbaren Proben erhöht, um die Mehrdimensionalität und die Schätzung extremer Quantilen zu berücksichtigen. Mit dem Henze-Zinkler-Test wurde die multivariate Normalität überprüft. Der Methodenvergleich zwischen durchflusszytometrischer und qPCR-basierter Messtechnik wurde wie folgt durchgeführt: Bivariate Daten aus den beiden Verfahren wurden in einem Scatterplot dargestellt. Die lineare Regression wurde durchgeführt, indem a) für eine von 1 verschiedene Steigung und b) ein von 0 unterschiedlicher Abschnitt getestet wurde, wobei Bland-Altman-Diagramme unter Analyse von Bias und Präzisionsstatistiken (29) untersucht wurden. Akzeptable Genauigkeit wurde als durchschnittliche Abweichung von der Verzerrung in Prozent betrachtet. Die durch den Inter-Assay-CV (0.2) definierte Quantifizierungsgrenze für qPCR-Assays wurde als Präzisionskriterium und akzeptable Übereinstimmungsgrenze von 0.4 verwendet. Der Wilcoxon-Rank-Summentest wurde verwendet, um Mittelwertdifferenzen festzustellen. Die geschätzte Abweichung, die Genauigkeitsstatistik und die jeweiligen 95% CI werden berichtet. Für die Korrelation wurden Pearson-Produkt-Moment-Korrelationen verwendet. Alle p-Werte sind zweiseitig. Es wurde die Statistiksoftware R 3.3.0 eingesetzt.
• Zelltypspezifische Bisulfit-Konversion - Methylierungsabhängige Konversion von CpG-Dinukleotiden wurde durch Bisulfit-Sequenzierung (24) analysiert mit dem Ziel, Marker für Immunzellpopulationen aus humanem peripherem Blut zu identifizieren. Die Kandidatenorte wurden aus der Literatur ausgewählt oder mit dem 450k Array-basierten Assay von Illumina entdeckt. Die Daten der Erfinder zeigten eine ausgeprägte Abwesenheit von Methylierung an einzelnen CpG-Positionen für CD56+ NK-Zellen, CD19+ B-Zellen und Neutrophile (Zielzelltypen), während die gleichen CpGs in Kontrollzelltypen methyliert wurden (Tabelle 3). Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Amplikons (AMP) für eine dichtere CpG-Methylierungsanalyse in den identifizierten Regionen entwickelt. Als wahrscheinlicher Marker für CD4+ T-Zellen entwickelten die Erfinder drei AMPs für die Bisulfit-Sequenzanalyse, die regulatorische Elemente im 5'-Bereich des ersten Introns (AMPs 1255, 2000 und 2001) im CD4-Gen (21, 22) abdecken. Unmethylierte CpG-Sites werden nach der Bisulfit-Konversion als TpG-Reste nachgewiesen und die Amplifikation erfolgt ausschließlich in Zielzellen, d.h. CD4+ T-Lymphozyten. Dieselben CpGs waren gegenüber der Bisulfit-Konversion in Kontrollzelltypen inert, einschließlich CD56+ NK-Zellen, CD8+ T-Lymphozyten, CD14+ Monozyten, CD19+ B-Lymphozyten und CD15+ Granulozyten (1). Anschließend untersuchten die Erfinder das CD8B-Gen als potenziellen epigenetischen Marker für CD8+ T-Zellen (21, 22), indem sie Amplikons entwarfen, die auf regulatorische Elemente innerhalb ihres dritten Introns abzielen (AMP2007). Hier wurde die Bisulfit-vermittelte Konversion von CpGs ausschließlich in CD8+ T-Zellen beobachtet, während diese CpGs gegenüber der Konversion in Kontrollzellen inert waren. Entsprechende epigenetische Markierungen wurden für B-Zellen, NK-Zellen und Neutrophile in den Genen identifiziert, die für das Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-bezogene Protein 5 (LRP5, AMP2249), Mevalonat-Decarboxylase (MVD, AMP2674) und Lipocalin 2 (LCN2, AMP1730) kodieren. Jedes AMP war im Zielzelltyp einzigartig unmethyliert und in den entsprechenden Kontroll-Leukozytenpopulationen vollständig methyliert (1). Die DNA-Methylierung der intergenen CD3G- und CD3D-Region (AMPs 1405, 1406 und 1408), die einen Marker für CD3+ T-Zellen bildet, und das Methylierungsprofil von GAPDH (AMP1570) wurden zuvor veröffentlicht (15).
• Locus-spezifische relative qPCR-Messungen - Um die oben beschriebenen differentiell methylierten CpG-Positionen zu erfassen, wurden unterscheidende qPCR-Assay-Systeme entwickelt. Diese wurden auf synthetischer Template-DNA charakterisiert, die zu Plasmiden kloniert wurde. Die Templates entsprechen der Bisulfit-modifizierten genomischen DNA, d.h. sie ersetzen alle Cytosine (C) durch Thymidine (T). Für das TpG-Template (imitiert unmethylierte CpGs) wurde ein universelles Plasmid mit Targets für alle Assays in einer äquimolaren Stöchiometrie entwickelt. Ein universelles CpG-Plasmid (imitiert methylierte CpGs) wurde entsprechend erzeugt. Für alle qPCRs wurde eine exklusive Amplifikation der gewünschten DNA-Sequenz ohne Kreuzreaktivität mit gegenseitig unterschiedlichen Templates nachgewiesen (Tabelle 1). Die Assay-Spezifität wurde an Immunzellpopulationen getestet, die wie im Abschnitt Materialien und Methoden beschrieben gereinigt wurden. Für Zielzellen wurden hohe Kopienzahlen in ihrem jeweiligen TpG-spezifischen System beobachtet und niedrige Kopienzahlen im entsprechenden CpG-System gemessen. Umgekehrt wurden für Kontrollzellen niedrige und hohe Kopien in den TpG- bzw. CpG-Systemen gefunden. Die ursprüngliche Kopienzahl des Zielgens wurde bestimmt, indem qPCR-Signale aus der entsprechenden Amplifikation (f) mit der Amplifikation von seriell verdünnten Standardplasmiden (f) in Beziehung gesetzt wurden, die jeweils eine definierte Konzentration der in silico-konvertierten unmethylierten Version aufweisen. Die relative Bestimmung der locusspezifisch unmethylierten DNA (RDls) lag zwischen 89,9 und 100% in den Zielzelltypen und zwischen 0 und 3% in den Kontrollen (Tabelle 1). Ausnahmen wurden für CD4+ T-Zellen beobachtet, die 8,9% RDls am CD8B-Locus zeigten und umgekehrt (d.h. 9,6% CD4 RDls in CD8+ T-Zellen), möglicherweise aufgrund von gegenseitigen und Restzellverunreinigungen.
• Universelle und eindeutige Quantifizierung - Die Amplifikationseffizienz und die geschätzte Kopienzahl variieren für jedes ortsspezifische qPCR-System (25). Daher wurde eine stets unmethylierte regulatorische Region des GAPDH (26)-Genes als universeller Nenner verwendet, um jeden zellartigen Ort relativ zu allen nukleierten Zellen zu bestimmen. Dieses System wurde auf gereinigte CD3+, CD4+ und CD8+ T-Zellen, Neutrophile, CD14+ Monozyten, CD56+ NK und CD19+ B Zellen angewendet. Die Quantifizierung unterscheidet sich bei der Verwendung methylierter und unmethylierter Amplifikationsdaten an spezifischen epigenetischen Loci (RDls) im Vergleich zur Quantifizierung des unmethylierten zelltypspezifischen Locus und des universell unmethylierten GAPDH als Nenner (RDu) (Tabelle 1).
• Da in silico konvertierte, doppelsträngige, GC-reiche Plasmide nicht vollständig de facto Bisulfit-konvertierte, einzelsträngige GC-depletierte DNA darstellen (27, 28), wurde ein „Kalibrator-Plasmid“ angenommen, das eine Kopie aller Assay-Targets in ihrem unkonvertierten genomischen (d.h. unmethylierten) Zustand enthält. Dieser Kalibrator wird parallel zu den Proben mit Bisulfit konvertiert. Wenn Kopienzahlen von diesem Kalibrator durch Standard-Plasmid-Interpolation erhalten werden, wurden systematische Amplifikationsdifferenzen zwischen den Assays erkannt und in einen Effizienzfaktor (EF) übersetzt, der um Abweichungen zwischen zelltypspezifischen Assays und GAPDH bereinigt ist. Zelltypspezifische EFen wurden in etwa 25 Experimenten zwischen 0,53 (95% Konfidenzintervall (CI) = 0,42, 0,61) für CD4 und 1,17 (95% CI = 0,95, 1,31) für CD3D/G gemessen (siehe „Epigenetische qPCR“ im Abschnitt Material und Methode). Berechnete EFen bieten eine universelle, endgültige Bestimmung der unmethylierten DNA (DDu) für jeden Assay (Tabelle 1). Mit diesem Ansatz wandten die Erfinder die epigenetische qPCR zur universellen und endgültigen Quantifizierung von Immunzellen aus biologischen Proben an. Die in dieser Arbeit verwendeten Konzepte zur Quantifizierung von Immunzellen sind in 6 dargestellt.
• Methodenvergleich von FCM und epigenetischer qPCR - Um eine absolute Zellquantifizierung vergleichbar mit FCM (d.h. Zelle/µl) zu ermöglichen, führten die Erfinder ein „Spike-in-Plasmid“ ein, das eine künstliche GAPDH-basierte Sequenz enthält, die durch Umkehrung aller CpG-Dinukleotide zu GpC (GAP[GC]) und einer entsprechenden epigenetischen qPCR entsteht. Zur absoluten Zählung der Immunzellen wurde dieses Plasmid den Blutproben in einer definierten Konzentration zugesetzt. Die in silico Bisulfit-konvertierte, künstliche GAP[GC]-Sequenz wurde in den Quantifizierungsstandard aufgenommen und die unkonvertierte Sequenz in das Kalibrator-Plasmid.
• Um die Gesamtleistung der epigenetischen Zellzählung zu beurteilen, wurden Marker für B-Zellen, NK-Zellen, CD3+, CD4+, CD8+ T-Zellen, FOXP3+ Tregs und Neutrophilen in Blutproben von 25 erwachsenen gesunden Spendern im Vergleich zu FCM analysiert. Die Daten aus beiden Verfahren wurden entweder als relative (2A) oder absolute Zellzahlen (2B) mit Pearson-Koeffizienten (r) von jeweils über 0,95 (p<0,0001) dargestellt.
• Bland-Altman-Analysen ((29) in 3A-C, (rechte Panels) bestimmen systematische Abweichungen und Präzision für alle Verfahren und Marker, die in Tabelle 6 aufgeführt sind. Biologische Auslesungen von FCM und epigenetischer Zählung aus beiden Substraten korrelierten gut mit den getesteten Zelltypen. Geringfügige Abweichungen (4,3-; -6,6; 10,3 für CD3, CD4, CD8) und hohe Präzision (alle < 20%) wurden zwischen FCM und epigenetischer qPCR von flüssigem Blut festgestellt, während eine ausgeprägte Variation (>20%) zwischen DBS und beiden anderen Verfahren für CD4+ T-Zellen beobachtet wurde. Um den Einfluss der Substratinstabilität in DBS zu untersuchen, wurden verschiedene Lagerzeiten und -bedingungen sowie Probenverdünnungen, die unbeobachtet gesammelte DBS nachahmen, überwacht. Die Daten zeigten keine Anzeichen einer Verschlechterung bei unterschiedlichen Lagerbedingungen mit einer Veränderung der Variation (CV) unter 15% für alle Temperaturen und Zeitpunkte (Tabelle 5). Der CV lag unter 30% bis hin zu Blutverdünnungen von 1:9 (Tabelle 6). Wie bereits von anderen analysiert, ist die genomische DNA ein stabiler Analyt und kann aus jahrelang gelagerten DBS extrahiert werden (30-32).
• Epigenetische qPCR in neonatalen Screening-Proben - Epigenetische qPCR wurde in einer Fall/Kontroll-Studie angewendet, die aus originalen neonatalen Screening-Karten (d.h. DBS) von 24 PID-Patienten und 250 zufällig ausgewählten Neugeborenen bestand, wobei die gesamten T-, B- und NK-Zellen gemessen wurden (4). PID-Fälle umfassten SCID-Patienten mit verschiedenen Gendefekten und X-chromosomal verknüpfte Agammaglobulinämie (XLA) im Zusammenhang mit BTK-Mutation (Tabelle 2). Referenzbereiche wurden aus der gemeinsamen Verteilung aller Leukozyten (GAPDHspezifische qPCR) und spezifischer Immunzelltypen ermittelt. Die Kopienzahlen wurden logarithmisch transformiert und zur Schätzung einer bivariaten Normalverteilung verwendet, deren Vertrauensbereiche (99%- und 99,9%-Kurven) Referenzbereiche für Neugeborene definiert haben. Da jedes der drei Panels auf 99% bzw. 99,9% Konfidenzbereiche abgestimmt ist, garantiert die Bonferroni-Korrektur Familienfehlerquoten unter 3% bzw. 0,3%, was zu einem Konfidenzgrad von 99,7 bzw. 97% führt.
• Bei CD3+ T-Zell- und GAPDH-Messungen lagen 13 von 16 Proben von SCID-Patienten außerhalb der 99,9 % Konfidenzregion, SCID15 wurde außerhalb der 99 %, aber innerhalb der 99,9 % Region gefunden und SCID9 und 18 als unverdächtig dargestellt. Allerdings lagen SCID15 und 18 außerhalb der 99,9%igen Konfidenzregion für NK-Zellen- und GAPDH-Messungen. Darüber hinaus wurde für B-Zellen- und GAPDH-Messungen SCID18 außerhalb der 99,9% Konfidenzregion und SCID15 außerhalb der 99%-Region gefunden (4). Daher wurden 15 von 16 SCID-Patienten durch epigenetische Tests auf der Grundlage ihrer Neugeborenen-Karten eindeutig als nicht normal identifiziert. SCID9, das mit maternaler Lymphozyten-Transplantation präsentiert wurde, wie durch FCM und Chromosomenanalyse nachgewiesen, zeigte jedoch keine quantitative Beeinträchtigung der Zellzahlen und wird als normal eingestuft. Epigenetische qPCR für CD4+, CD8+ T-Zellen und GAPDH bestätigten diese Ergebnisse, ohne der CD3+ T-Zellanalyse in SCID-Proben diagnostische Informationen hinzuzufügen. DBS von verzögert auftretendem SCID (DO-SCID) im Zusammenhang mit hypomorphen JAK3- oder ADA-Mutationen wurden ebenfalls analysiert.
• Der defiziente verzögerte JAK3-Patient (DO-SCID 14) zeigte reduzierte CD3-, NK-, B- und CD4, CD8-Werte (4) außerhalb der 99,9%igen Konfidenzregion. ADA-assoziierte DO-SCID4 lag außerhalb der 99,9% Konfidenzregion für NK- und B-Zellen und außerhalb der 99%-Region für CD3, während DO-SCID3 außerhalb der 99,9%igen Konfidenzregion für B-Zellen und der 99%igen Konfidenzregion für NK lag, aber normal für CD3+ T-Zellen. Insgesamt wurden alle drei DO-SCID-Proben auf der Grundlage einer epigenetischen Analyse identifiziert. DBS von vier von fünf Patienten mit XLA zeigten B-Zellzahlen außerhalb der 99,9%igen Konfidenzregion. Hypomorphes XLA24 lag außerhalb der 99%igen Konfidenzregion in B- und NK-Zellen. Die NK- und T-Zellzahlen lagen an den Grenzen der Referenzbereiche für andere XLA-Proben (XLA23 in NK und XLA20, XLA23 in T-Zellen). Insgesamt entsprach der XLA-Phänotyp dem B-Zell-Mangel. Der Vergleich mit TREC/KREC-Werten zeigte, dass die epigenetische Quantifizierung alle bis auf einen Patienten erkannte, während TREC/KREC zwei von fünf Fällen mit verzögertem Beginn oder hypomorphem genetischen Hintergrund nicht erkannte. Die mütterliche Transplantation maskiert jedoch die Erkennung durch epigenetische Zählung, während die TREC-Analyse nicht betroffen ist (Tabelle 2). Die Screening-Klassifizierung basiert auf den drei Tests für auffällige Zellzahlen, die eine Sensitivität von 0,958 und eine Spezifität von 0,984 unter Verwendung der 99% Konfidenzregionen erreichen. Für die 99,9% Konfidenzregionen sinkt die Sensitivität auf 0,9167, während die Spezifität 1 erreicht.
• IPEX und schwere angeborene Neutropenie (SCN) sind weitere Formen der schweren PID ohne derzeit verfügbares Neugeborenen-Screening. Angesichts ihrer schweren Frühphase und Morbidität würden die Patienten von der neonatalen Diagnose profitieren. Bei jugendlichen IPEX-Patienten sind die peripheren Tregs im Vergleich zu gesunden, altersgerechten Spendern und Krankheitskontrollen einzigartig erhöht (23).
• Bei der Anwendung der epigenetischen qPCR auf Neutrophile wurden neonatale Patienten mit SCN durch eine signifikante Reduktion (p = 4,4x10e-6) von Neutrophilen nachgewiesen (5A). Der mittlere Prozentsatz der Neutrophilen lag bei 55% in den Kontrollkarten (n=26) und bei 17% in Neutropenie-Patienten (n=6).
• Getestet wurde jeweils ein DBS von einem Neugeborenen und einem zweijährigen IPEX-Patienten mittels epigenetischer qPCR von Treg und CD3+ T-Zellen (5B). Das Verhältnis von Treg/CD3+ T-Zellen bei IPEX-Patienten ist im Vergleich zu den nicht betroffenen gesunden Spendern deutlich erhöht.
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Claims (13)

1. Verfahren für einen verbesserten Methylierungsassay zur Identifizierung von Blutimmunzellen, umfassend die Schritte von a) Bereitstellen einer Probe von humanem Blut, insbesondere von einem Neugeborenen, umfassend genomische DNA von Blutimmunzellen; b) Behandeln der genomischen DNA der Immunzellen mit Bisulfit, um unmethylierte Cytosine in Uracil umzuwandeln; c) Amplifizieren der behandelten genomischen DNA unter Verwendung geeigneter Primerpaare zur Herstellung von Amplikons und d) Identifizieren der Blutimmunzellen basierend auf der Analyse der Amplikons, wie amplifiziert, wobei die Amplifizierung und Analyse der Amplifizierung und/oder qPCR unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus mindestens einer der Gruppen von SEQ ID Nrn. 1 bis 12 für CD4, SEQ ID Nrn. 13 bis 20 für CD8beta, SEQ ID Nrn. 21 bis 28 für LRP5, SEQ ID Nrn. 29 bis 36 für MVD, SEQ ID Nrn. 37 bis 44 für LCN2 und SEQ ID Nrn. 45 bis 56 für CD3gamma/Delta umfasst, und wobei eine Demethylierung mindestens einer CpG-Position in dem Amplikon für mindestens eine Blutimmunzelle, ausgewählt aus CD3+ T-Zellen, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, Neutrophilen, CD14+ Monozyten, CD56+ NK-Zellen und CD19+ B-Zellen, hinweisend ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend eine Analyse des Methylierungsstatus eines Amplikons für CD3-Epsilon.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend eine Analyse und eine erste Normalisierung unter Verwendung eines Demethylierungs-Standard-Gens, ausgewählt aus einem Gen, das in allen zu identifizierenden Zellen exprimiert wird, wie beispielsweise einem House-Keeping-Gens, wie beispielsweise GAPDH und Beta-Actin, vorzugsweise unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 57 bis 61 für das Gen für das GAPDH.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend eine zweite Normalisierung unter Verwendung einer in silico Bisulfit-konvertierten rekombinanten Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz, die alle CpG-Dinukleotide zu GpC des mindestens einen Demethylierungs-Standard-Gens (GAP[GC]-Konstrukt) invertiert, vorzugsweise unter Verwendung von Primern und Sonden, ausgewählt aus SEQ ID Nrn. 62 bis 64 für das GAP[GC]-Konstrukt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend eine dritte Normalisierung unter Verwendung eines Kalibrier-Plasmids, das eine Kopie jeder Amplikonsequenz in ihrem unkonvertierten genomischen (d.h. unmethylierten) Zustand umfasst.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Analyse ferner eine Quantifizierung der identifizierten Blutimmunzellen umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren ferner eine zusätzliche FCM der zu identifizierenden Blutimmunzellen umfasst.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei mehr als ein blutzellspezifisches Gen analysiert wird, z.B. ein Panel von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 blutzellspezifischen Genen, gegebenenfalls zusammen mit mehr als einem Demethylierungs-Standard-Gen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Blutprobe ausgewählt ist aus peripheren, kapillaren oder venösen Blutproben oder Subfraktionen davon, wie zum Beispiel periphere Blutmonozyten, Blutgerinnsel und getrocknete Blutflecken.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, ferner umfassend den Schritt des Rückschließens auf den Immunstatus eines Menschen basierend auf mindestens einer Quantifizierung des mindestens einen Immunzelltyps.
11. Diagnostisches Kit, umfassend Materialien zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gegebenenfalls mit Gebrauchsanweisung.
12. Kit nach Anspruch 11, wobei die Materialien ausgewählt sind aus Primern und Sonden, ausgewählt aus einer der SEQ ID Nrn. 1 bis 12 für das Gen für CD4, SEQ ID Nrn. 13 bis 20 für das Gen für CD8beta, SEQ ID Nrn. 21 bis 28 für das Gen für LRP5, SEQ ID Nrn. 29 bis 36 für das Gen für MVD, SEQ ID Nrn. 37 bis 44 für das Gen für LCN2, SEQ ID Nrn. 45 bis 56 für die genetische Region CD3gamma/Delta, SEQ ID Nrn. 57 bis 61 für das Gen für GAPDH und SEQ ID Nrn. 62 bis 64 für das GAP[GC] Konstrukt.
13. Verwendung des Kits nach Anspruch 11 oder 12 zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

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