DE102012211735A1

DE102012211735A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Charakterisierung von Zellen

Info

Publication number: DE102012211735A1
Application number: DE201210211735
Authority: DE
Inventors: Josef Alfons Käs; Tobias Kiessling; Anatol Fritsch; Roland Stange
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2012-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2014-01-09
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: WO2014006145A1; DE102012211735B4

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verfahren sowie ein Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen anhand der Temperaturabhängigkeit ihrer mechanischen Eigenschaften. Die Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften ist dabei durch die teilweise Entkopplung von mechanischer Deformation und Erhitzung erstmalig experimentell zugänglich geworden. Erfindungsgemäß erfolgen die Deformation mittels einer mikrorheologischen Vorrichtung und die Erhitzung lokal an der Zelle durch mindestens einen Heizlaser mit von der Probe beabstandetem Strahlverlauf.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Charakterisierung von Zellen anhand der Temperaturabhängigkeit ihrer mechanischen Eigenschaften.
Aus der Biotechnologie sind bereits zahlreiche Möglichkeiten zur Charakterisierung von Zellen bekannt. So ermöglicht beispielsweise die Vielzahl der heute bekannten bildgebenden Verfahren eine differenzierte Unterscheidung von Zellen bereits anhand ihres Phänotyps. Aber auch andere Eigenschaften von Zellen, wie z.B. die an der Zelloberfläche vorliegenden Membranproteine, lassen sich mit Hilfe von biochemischen Essays zur Unterscheidung von Zellen ausnutzen. Dabei ist eine Abgrenzung der Zellen nicht nur anhand ihres Typs, sondern zum Teil auch anhand ihres Zustandes möglich.
Aus dem Stand der Technik sind zudem Möglichkeiten bekannt Zellen anhand Ihrer biomechanischen Eigenschaften zu unterscheiden. Vorrausetzung dafür sind mikrorheologische Vorrichtungen, die eine definierte und reproduzierbare mechanische Manipulation von Zellen, Zellorganellen oder Gewebeproben ermöglichen. Neben AFM-Kraftmikroskopen oder Mikromanipulatoren, bei denen die Zellen physisch kontaktiert und dadurch verformt werden, besteht mittlerweile auch die Möglichkeit biologische Proben berührungslos zu deformieren.
In der EP 1 059 871 B1 wird ein Optischer Strecker offenbart, der die berührungslose Positionierung und Deformation von dielektrischen Partikeln in einer zweistrahligen Laserfalle ermöglicht. Die beiden Laser weisen dabei, im Unterschied zu einem Optical Tweezer, einen leicht divergenten Strahlverlauf auf. Die Laserstrahlen besitzen, aufgrund der verschiedenen Brechungsindizes des organischen Materials und der umgebenden Lösung, innerhalb und außerhalb der Probe verschiedene Ausbreitungsgeschwindigkeiten. Dadurch wird sowohl beim Eintritt in als auch beim Austritt der Laserstrahlen aus der Probe ein Impuls auf diese übertragen. Daraus resultieren senkrecht auf die Oberfläche der Probe wirkende Kräfte, die, bei einem im Vergleich zur Lösung höheren Brechungsindex der Probe, eine Dehnung der Probe entlang der optischen Achse der Laserstrahlen bewirken.
Die Deformation von Zellen im optischen Strecker führt dabei zu einer starken Erhitzung der Probe in Zeiträumen von wenigen Millisekunden [Wetzel et al. Single cell viability and impact of heating by laser absorption, Eur Biophys J (20119 40: 1109–1114]. Diese immanente Kopplung von Deformation und Erhitzung der Zelle findet sich in allen aus dem Stand der Technik bekannten laserbasierten mikrorheologischen Messvorrichtungen. Eine isolierte Untersuchung der Temperaturabhängigkeit biomechanischer Eigenschaften von Zellen war daher bislang nicht möglich.
Aus der DE 10 2010 041 912 B3 ist ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen durch die Analyse der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen unter Verwendung eines optischen Streckers bekannt. Dabei wird ausgenutzt, dass ein gewisser Anteil von Tumorzellen unter Spannung eine Streckung entgegen der Spannungsrichtung aufweist. Anhand dieses Verhaltens können Tumorzellen von gesundem Gewebe differenziert werden. Allerdings zeigen Tumorzellen dieses Verhalten nur in einem Bereich mechanischer Belastungen, in dem eine lineare Verformung der Zelle zu erwarten ist. Diese Einschränkung hinsichtlich der auf die Zelle auszuübenden mechanischen Belastungen, ist bei Unkenntnis der Temperaturabhängigkeit der biomechanischen Eigenschaften von Krebszellen jedoch nur schwer umsetzbar. Daraus resultiert die Gefahr unzuverlässiger bzw. falscher Aussagen bei der Differenzierung von krankem und gesundem Gewebe.
Die Aufgabe der Erfindung besteht somit darin eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften von Zellen, Gewebeproben oder Partikeln bereitzustellen. Weiterhin soll ein neues Verfahren zur reproduzierbaren Charakterisierung und Differenzierung von Zellen vorgeschlagen werden, das die Diagnostik von Krebserkrankungen sowie die Optimierung von Verfahren zum Screening von Substanzen als potentielle medizinische Wirkstoffe ermöglicht.
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 7. Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Die Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften von Zellen, Gewebeproben und Partikeln kann erfindungsgemäß mit einer Vorrichtung, aufweisend:

a) einen Messkammer zur Aufnahme einer in einer Flüssigkeit, bevorzugt in einer wässrigen Lösung, befindlichen Probe,
b) eine Temperierungseinrichtung zur Einstellung der Temperatur von Messkammer und Flüssigkeit,
c) eine mikrorheologische Vorrichtung zur Erzeugung gezielter Spannungszustände in der Probe,
d) mindestens einen Heizlaser mit von der positionierten Probe beanstandeten Strahlverlauf,
e) mindestens einen Detektor zur Bestimmung der geometrischen Form und/oder der mechanischen Eigenschaften der Probe und
f) mindestens einen Detektor zur Bestimmung der Temperatur der Probe,

Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Messkammer zur Aufnahme einer in einer Flüssigkeit (nachfolgend auch Lösung), bevorzugt einer wässrigen Lösung, befindlichen Probe auf. Da es sich bei den Proben bevorzugt um biologische Proben, besonders bevorzugt um Zellen, insbesondere lebende Zellen, handelt, besteht die Messkammer bevorzugt aus nicht-toxischen, chemisch inerten Materialien und ist zur Aufnahme der Probe sowie einer für die Probe adäquaten Nährlösung (Zellkulturmedium) geeignet. Besonders bevorzugt ist die Messkammer aus Kunststoff oder Glas gebildet. Da die Messtechnik bei der Untersuchung von lebenden biologischen Systemen häufig auf optischen Prinzipien basiert, ist die Messkammer zudem bevorzugt transparent, und weist über einen weiten Spektralbereich eine zur Detektion kontrastreicher Signale ausreichende Transmission auf.
Die Messkammer ist weiterhin mit einer Temperierungseinrichtung verbunden, die eine Einstellung der Temperatur von Messkammer und Flüssigkeit erlaubt. Bevorzugt handelt es sich bei der Temperierungseinrichtung um einen Thermostat, mit dem sich das System aus Messkammer, Flüssigkeit und Probe auf eine bestimmte Zieltemperatur erwärmen und konstant auf dieser halten lässt. Um Umwelteinflüssen und Temperaturschwankungen entgegenzuwirken weist die Temperierungseinrichtung bevorzugt einen Feedback-Mechanismus auf, um schnell und zielgenau auf Veränderungen der Temperatur des Systems reagieren zu können.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist weiterhin eine mikrorheologische Vorrichtung auf, wobei dieser Begriff im Rahmen dieser Anmeldung alle Vorrichtungen bezeichnet, die eine Erzeugung gezielter Spannungszustände in der Probe bzw. eine gezielte Verformung der Probe ermöglichen. Weiterhin bevorzugt ist die mikrorheologische Vorrichtung zur Positionierung der Probe an einem definierten Ort der Messkammer fähig. Die mikrorheologische Vorrichtung ist zu diesem Zweck bevorzugt in der Lage Kräfte auf die Probe auszuüben, um diese innerhalb der Messkammer zu positionieren. Dabei ist es ausreichend, wenn ein Raumbereich der Messkammer vorhanden ist, an dem eine, durch geeignete Mittel in diesen Bereich transportierte, Probe mittels der mikrorheologischen Vorrichtung räumlich fixiert wird. Darüber hinaus ist die mikrorheologische Vorrichtung in der Lage gezielt Spannungszustände in der Probe zu erzeugen. Bevorzugt geschieht dies durch die Erzeugung von Oberflächenkräften ohne eine resultierende Kraft im Schwerpunktsystem der Probe.
Bei der mikrorheologischen Vorrichtung handelt es sich bevorzugt um eine Vorrichtung, bei der es zu einer physischen Kontaktierung der Probe kommt, bspw. um eine magnetische Pinzette, ein AFM-Kraftmikroskop oder eine Mikropipette für das Mikropipetten-Aspirationsverfahren. Bevorzugt ermöglicht die mikrorheologische Vorrichtung jedoch eine kontaktfreie Deformation der Probe und umfasst einen Optical Tweezer oder einen Ultraschallerzeuger. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der mikrorheologischen Vorrichtung um einen optischen Strecker, gemäß der EP 1 059 871 B1 , auf deren Inhalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird. Ebenfalls bevorzugt kann die Erzeugung gezielter Spannungszustände in einer Probe durch das Zusammenwirken einer mikrofluidischen Strömung und einem passiven mikrofluidischen System erfolgen, beispielsweise durch Verformung von Proben an in der Strömung befindlichen Hindernissen. In Falle eines solchen mikrofluidischen Strömungshindernis umfasst die mikrorheologische Vorrichtung bevorzugt Mittel zur Erzeugung mikrofluidischer Strömungen sowie geeigneter mikrofluidischer Strömungskanäle.
Um die Charakterisierung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Probe zu ermöglichen, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung zudem mindestens eine weitere Temperierungseinrichtung zur Einstellung der Temperatur lokal an der Probe auf. Diese Temperierungseinrichtung ermöglicht vorteilhaft die Erhitzung eines von Probe beabstandeten Volumens der diese umgebenden Flüssigkeit. Weiterhin vorteilhaft wird bei der Einstellung der Temperatur lokal an der Probe durch die Temperierungseinrichtung selbst kein Impuls auf die Probe übertragen bzw. keine Kräfte in dieser induziert (abgesehen von durch die Erwärmung in der Probe entstehenden Spannungen bspw. durch thermische Ausdehnung). Besonders bevorzugt weist die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Charakterisierung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Probe mindestens einen Heizlaser auf. Dieser Heizlaser weist einen Strahlverlauf auf, der von der positionierten Probe beabstandet ist. Die Probe befindet sich somit in dem Raumbereich, in dem sie mittels der mikrorheologischen Vorrichtung fixiert wird, nicht innerhalb des Strahlengangs des Heizlasers. Bei der Erhitzung der Probe durch den Heizlaser wird somit vorteilhaft kein zusätzlicher Impuls auf die Probe übertragen, bzw. keine zusätzliche Deformation der Probe durch den Heizlaser bewirkt. Dies ermöglicht erstmals die Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften biologischer Proben, insbesondere Zellen, wobei der Einfluss nicht-linearer Effekte aufgrund der Kopplung von Deformation und Erhitzung vorteilhaft vernachlässigbar ist. Die Erhitzung der Probe erfolgt im Wesentlichen durch Erhitzung der in der Messkammer befindlichen Flüssigkeit in Raumbereichen nahe der positionierten Probe durch die Heizlaser und anschließende Wärmeübertragung auf die Probe.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht somit vorteilhaft eine nahezu instantane Erhitzung der Probe von bis zu 100K, bevorzugt von bis zu 60K, in einer Zeit von 1 bis 5000ms, bevorzugt zwischen 1 und 2500ms und besonders bevorzugt zwischen 1 und 1000ms. Dies ermöglicht vorteilhaft erstmals die isolierte Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften des Zellmaterials, wobei der Einfluss durch temperaturabhängige regulatorische Prozesse in der Zelle vernachlässigbar ist. Dies liegt darin begründet, dass sich die Reaktionskinetik derartiger in der Zelle ablaufender Prozesse, an eine Veränderung der Umgebungstemperatur nur langsam, insbesondere nicht in Zeiträumen von Millisekunden, anzupassen vermag. Der Einfluss veränderter Reaktionsgleichgewichte bzw. veränderter Konzentrationen verschiedener Proteine in der Zelle auf die mechanischen Eigenschaften der Zelle, können somit bei der Untersuchung dieser Eigenschaften mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorteilhaft vernachlässigt werden.
Zur Charakterisierung der Probe anhand der Temperaturabhängigkeit ihrer mechanischen Eigenschaften weist die Vorrichtung weiterhin mindestens einen Detektor auf, um die geometrische Form und/oder die mechanischen Eigenschaften der Probe zu bestimmen. Da es sich bei der Probe bevorzugt um biologisches Gewebe und besonders bevorzugt um lebende Zellen handelt, ist ein Detektor bevorzugt, bei dem der Energieeintrag in die Probe möglichst gering ist. Besonders bevorzugt weist die Vorrichtung daher einen optischen Aufbau, bspw. ein Konfokalmikroskop und/oder Fluoreszenzmikroskop, zur Bestimmung der geometrischen Form der Probe auf.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist weiterhin einen Detektor zur Bestimmung der Temperatur der Probe auf. In Abhängigkeit vom Aufbau der Messkammer und der mikrorheologischen Vorrichtung kann die Bestimmung der Temperatur dabei mit oder ohne Kontaktierung der Probe erfolgen. Weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine mikrorheologischen Vorrichtung auf, bei der die Zellen durch Kontaktierung deformiert werden, bspw. durch den Cantilever eines AFM-Kraftmikroskops, erfolgt die Bestimmung der Temperatur bevorzugt ebenfalls unter Kontaktierung der Probe bspw. durch einen Temperaturfühler. Erfolgt die Deformation der Probe durch die mikrorheologische Vorrichtung kontaktfrei, bspw. mittels eines optischen Streckers, ist eine kontaktfreie Bestimmung der Temperatur bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Messkammer als ein mikrofluidischer Kanal ausgebildet. Der Kanal ist dabei bevorzugt mit einem Zu- und Abfluss versehen und mit einer mikrofluidischen Pumpe verbunden. Weiterhin bevorzugt ist die Vorrichtung mit einem Reservoir verbunden, in dem eine Vielzahl gleichartiger oder unterschiedlicher Proben in einem geeigneten Nährmedium suspendiert ist. Durch eine von der mikrofluidischen Pumpe vermittelte Strömung sind dann einzelne Proben erfassbar und durch den mikrofluidischen Kanal transportierbar. Die durch die Mikrofluidik transportieren Proben sind insbesondere in einen Raumbereich des Kanals transportierbar, in dem sie mittels der mikrorheologischen Vorrichtung räumlich fixierbar sind. Besonders bevorzugt weist die erfindungsgemäße Vorrichtung zudem eine Steuervorrichtung auf, mit der das Vorliegen einer Probe im Wirkungsbereich der mikrorheologischen Vorrichtung erfassbar ist. Ist eine Probe durch die mikrorheologische Vorrichtung fixiert, sind die mikrofluidischen Elemente, insbesondere die mikrofluidische Pumpe so ansteuerbar, dass die Strömung und somit der Transport der Probe durch den Kanal unterbrochen werden kann. Die Steuervorrichtung ermöglicht somit vorteilhaft einen stopped-flow Betrieb der Messkammer, bei dem diskontinuierlich eine Strömung im Kanal erzeugt wird. So kann eine einzelne Probe mittels einer mikrofluidischen Strömung zur mikrorheologischen Vorrichtung transportiert und dort die Temperaturabhängigkeit ihrer mechanischen Eigenschaften bestimmt werden, die Probe anschließend erneut mittels einer mikrofluidischen Strömung aus der Messregion abtransportiert und auf gleiche Weise mit einer anderen Probe verfahren werden.
Weiterhin bevorzugt ist die Messkammer mit einer Temperierungsvorrichtung ausgestattet und mittels dieser kontinuierlich mit einem temperierten Kühlmedium, bspw. Wasser, spülbar. Das Kühlmedium wird dabei bevorzugt über ein Umwälzthermostat auf eine bevorzugt in einem Bereich zwischen 0 und 100°C frei einstellbare Temperatur gebracht. Dabei ist eine Trennung zwischen der in der Messkammer befindlichen Nährlösung und dem Kühlmedium bzw. Wasser gewährleistet. Die Messkammer kann zudem weitere Vorrichtung zur Verbesserung der Wärmeübertragung vom Kühlmedium aufweisen, bspw. Kühlrippen oder eine anderweitig vergrößerte Oberfläche. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Messkammer mindestens einseitig durch eine Aluminiumplatte begrenzt, die durch mindestens einen innenseitigen Kanal mit temperiertem Kühlmedium durchspülbar ist. Weiterhin bevorzugt weist das Thermostat einen Temperatursensor auf, der in oder nahe der Messkammer positioniert ist. Dadurch ist die Temperatur der Messkammer bestimmbar und als Ausgangssignal für einen Feedbackmechanismus des Thermostats zur Temperaturkontrolle in der Messkammer verwendbar. Weiterhin bevorzugt ist die Messkammer und damit die Flüssigkeit (Nährlösung) durch elektrothermische Bauteile, bspw. unter Ausnutzung des Peltier-Effekts, temperierbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die mikrorheologische Vorrichtung durch mindestens einen stretch laser gebildet. Besonders bevorzugt wird die mikrorheologische Vorrichtung durch zwei, über lichtleitende Fasern in den mikrofluidischen Kanals gerichtete, zu diesem senkrecht sowie zueinander achsenfluchtend angeordnete stretch laser gebildet. Die aus den lichtleitenden Fasern emittierten Strahlen weisen dabei ein divergentes Strahlprofil ohne Fokalbereich im Inneren der Messkammer auf. Diese beiden divergenten Laserstrahlen bilden somit einen „Optischen Strecker“ im Sinne der EP 1 059 871 B1 . Dies ermöglicht eine berührungsfreie gezielte Deformation der Probe.
Weiterhin bevorzugt wird mindestens ein Heizlaser über eine von den stretch lasern separate lichtleitende Faser in den mikrofluidischen Kanal geleitet. Die Fasern sind dabei bevorzugt so zueinander angeordnet, dass sich deren Strahlverläufe innerhalb der Messkammer bzw. des mikrofluidischen Kanals nicht überlagern. Besonders bevorzugt ist die mindestens eine lichtleitende Faser des mindestens einen Heizlasers dabei parallel zu den Fasern der stretch laser und somit ebenfalls senkrecht zum mikrofluidischen Kanal angeordnet.
Der mindestens eine Heizlaser ermöglicht vorteilhaft die Erhitzung der Probe um bis zu 100K, bevorzugt von bis zu 60K, in Zeiträumen von 1 bis 5000ms, bevorzugt zwischen 1 und 2500ms und besonders bevorzugt zwischen 1 und 1000ms. ohne die Übertragung eines zusätzlichen Impulses auf die Probe. Somit ist vorteilhaft eine nahezu instantane Erhitzung der Probe möglich, die abgesehen von thermischen Effekten, keine zusätzliche Deformation der Probe bewirkt. Mit der bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Aufbaus ist somit eine, von deren Deformation entkoppelte Erhitzung der Probe möglich. Durch geeignete Wahl einer Hitzelasersequenz kann die Temperatur am Ort der Probe während der gesamten Messung an einer einzelnen Probe konstant gehalten werden, indem der Wärmeeintrag des stretch lasers am Ort der Probe ausgeglichen wird. Der aus der Faser des Heizlasers austretende Strahl weist bevorzugt ein divergentes Strahlprofil auf. Durchstrahlt solch ein divergenter Heizlaser den mit einer Flüssigkeit gefüllten mikrofluidischen Kanal kommt es vorteilhaft zu einer gleichmäßigen Erhitzung der Flüssigkeit im gesamten Volumen des Strahlengangs. Insbesondere kann die Ausbildung eines starken Temperaturgradienten, wie bspw. bei einem konvergenten Strahlprofil um das Fokalvolumen herum, vermieden werden.
Weiterhin bevorzugt weist die Vorrichtung mindestens einen Detektor zur Bestimmung von geometrischer Form und Temperatur der Probe auf, der in oder relativ zum mikrofluidischen Kanal angeordnet ist. Ebenfalls denkbar sind andere Detektortypen, die Rückschlüsse auf die mechanischen Eigenschaften der Probe ohne die Bestimmung der geometrischen Form ermöglichen, bspw. über die Ermittlung von Leitfähigkeitsunterschieden von Proben in verschiedenen Spannungszuständen. Besonders bevorzugt werden zur Detektion der geometrischen Form der Probe optische Verfahren, insbesondere lichtmikroskopische Verfahren genutzt.
Besonders bevorzugt ermöglicht es die parallele und beabstandete Anordnung der Fasern des mindestens einen Heizlasers zu den Fasern der stretch laser eine Überschneidung der Strahlengänge von Heiz- und stretch Lasern zu vermeiden. Weiterhin bevorzugt sind mehrere Heizlaser so in die Messkammer gerichtet, dass sich der Strahlverlauf keines der Heizlaser mit dem Strahlverlauf der stretch laser überschneidet. Dabei sind die Heizlaser bevorzugt ein- oder zweiseitig des mikrofluidischen Kanals sowie ein- oder zweiseitig der Fasern der stretch laser angeordnet. Der Abstand des mindestens einen Heizlasers zu der mittels der stretch laser positionierten Probe beträgt zwischen 1 und 1000µm, bevorzugt zwischen 10 und 300µm und besonders bevorzugt zwischen 80 und 200µm. Dieser Abstand zwischen dem Strahlengang des Heizlasers und der in der Messregion positionierten Probe ermöglicht somit vorteilhaft eine nahezu instantane Erhitzung der Probe bei gleichzeitiger Vermeidung einer zusätzlichen Deformation der Probe durch den Heizlaser.
Ebenfalls bevorzugt beträgt die Wellenlänge der stretch laser zwischen 800nm und 2000nm, weiterhin bevorzugt zwischen 800nm und 1064 und besonders bevorzugt 800nm. Durch die Wahl dieser Wellenlängenbereich kann die Erwärmung der Probe durch die stretch laser vorteilhaft minimiert werden. Diese Erwärmung resultiert zu einem Großteil aus der Wechselwirkung der Laser mit dem in der Probe befindlichen Wasser. Die Wahl von stretch lasern mit einer Wellenlänge, bei welcher der wellenlängenabhängige Absorptionskoeffizient von Wasser ein Minimum aufweist, führt daher vorteilhaft zu einer minimalen Erwärmung der Probe durch die stretch laser. Die Wellenlänge der Heizlaser beträgt bevorzugt zwischen 900nm und 3000nm, weiterhin bevorzugt 1400nm bis 1500nm und besonders bevorzugt 1450nm. Da die Erwärmung der Probe vorrangig durch die Erwärmung der Lösung bzw. eines für die Probe geeigneten Nährmediums erfolgt und diese zu einem großen Teil aus Wasser bestehen, ist die Wellenlänge der Heizlaser so gewählt, dass bei dieser der wellenlängenabhängig Absorptionskoeffizient von Wasser ein Maximum aufweist. Somit kann vorteilhaft eine maximale Erhitzung der Probe mittels der Heizlaser realisiert werden. Als Heizlaser werden bevorzugt Neodym-dotierte Yttrium-Aluminium-Granat-Laser mit einer Wellenlänge von 1064nm verwendet. Mit diesen Lasern ist eine Erhitzung lokal an der Probe um 7°K pro Watt realisierbar. Mit einem besonders bevorzugten Laser mit einer Wellenlänge von 1450nm, wären voraussichtlich 1,4°K pro mWatt realisierbar.
In der erfindungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt ein lichtmikroskopischer Aufbau relativ zum mikrofluidischen Kanal angeordnet, dass Abbildungen von Probe und Kanal an einen, zur Detektion optischer Informationen in einem Spektralbereich von 300 nm bis 800 nm geeigneten, Detektor überträgt. Bei dem lichtmikroskopischen Aufbau handelt es sich bevorzugt um ein Konfokal- und/oder Fluoreszenzmikroskop oder Durchlichtmikroskop. Bei den Abbildungen von Messkammer und Zelle handelt es sich bevorzugt um Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenkontrast- oder DIC-Aufnahmen. Für fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, wird die Fluoreszenz der Probe bevorzugt mit den stretch lasern angeregt. Der Detektor ermöglicht vorteilhaft die Umwandlung der optischen Abbildungen von Messkammer und Probe in digitale und speicherbare Bildinformationen.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Charakterisierung von Zellen, Gewebeproben oder Partikeln, wobei

a) eine zu untersuchende Probe zusammen mit einer Flüssigkeit, bevorzugt einer wässrigen Lösung, in einer Messkammer auf eine bestimmte Temperatur gebracht wird,
b) in der Probe mittels einer mikrorheologischen Vorrichtung gezielt Spannungszustände werden und diese dadurch verformt wird, wobei
c) zuvor, gleichzeitig oder während der Verformung, jedoch kausal unabhängig von dieser eine Erhitzung der Probe um bis zu 100 K in einer Zeit von 1 bis 1000 ms erfolgt,
d) die Verformung der Probe in Abhängigkeit von den mittels der mikrorheologischen Vorrichtung erzeugten Kräften, der Probentemperatur und der Zeit detektiert wird,
e) und daraus biomechanische und thermodynamische Kenngrößen abgeleitet werden.

Erfindungsgemäß wird bei diesem neuartigen Verfahren zur Charakterisierung einer Probe anhand der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften zunächst eine Probe gemeinsam mit einer Flüssigkeit (Lösung) innerhalb einer Messkammer auf eine bestimmte Temperatur gebracht. Die Temperierung der Probe erfolgt dabei bevorzugt durch Spülung der Messkammer mit einem temperierten Kühlmedium, bevorzugt Wasser. Die Temperierung erfolgt dabei so, dass der Probe, genügend Zeit gegeben wird sich an die jeweils eingestellte Temperatur anzupassen. Handelt es sich bei der Probe um eine Zelle ermöglicht die langsame Erhitzung das Einstellen neue Reaktionsgleichgewichte der in der Zelle ablaufenden aktiven Prozesse. Die Zeiträume in denen eine Probe sich an eine neue Umgebungstemperatur angepasst hat, sich also ein neues Reaktionsgleichgewicht eingestellt hat, und in denen somit eine Temperierung von Messkammer und Lösung zu erfolgen hat, betragen dabei zwischen 5s und 2h, bevorzugt zwischen 1min und 30min und besonders bevorzugt 20min..
Anschließend erfolgt durch eine mikrorheologische Vorrichtung eine Deformation der Probe durch die Erzeugung definierter Spannungszustände in der Probe. Die mikrorheologische Vorrichtung ist dabei gezielt einstellbar, so dass die auf die Probe ausgeübte Spannung über einen weiten Bereich variiert werden kann. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden dabei solche Spannungszustände eingestellt, dass die Probe deformiert wird, bzw. eine Deformation der Probe beobachtbar ist. Weiterhin bevorzugt wird die Probe wird dabei mittels der mikrorheologischen Vorrichtung in einem bestimmten Raumbereich der Probe positioniert. Dazu werden mittels der mikrorheologischen Vorrichtung Kräfte auf die Probe ausgeübt, was kontaktierend oder berührungsfrei erfolgt.
Erfindungsgemäß erfolgt weiterhin zuvor, gleichzeitig oder während der Verformung der Probe, jedoch kausal unabhängig von dieser eine Erhitzung der Probe um bis zu 100K, bevorzugt bis zu 60K, in einer Zeit von 1 bis 5000ms, bevorzugt zwischen 1 und 2500ms und besonders bevorzugt zwischen 1 und 1000ms. Erfolgt die Erhitzung der Probe zuvor, wird diese zunächst gezielt und nahezu instantan auf eine bestimmte Temperatur erhitzt. Anschließend werden mittels der mikrorheologischen Vorrichtung verschiedene Spannungszustände in der Probe eingestellt. Dadurch ist die Auswirkung der anfänglichen Probentemperatur auf die mechanische Antwort der Zelle auf die eingestellten Spannungszustände untersuchbar. Erfolgt die Erhitzung der Probe gleichzeitig mit der Verformung, findet während der gesamten Dauer der Erzeugung von Spannungszuständen in der Probe eine Erhitzung derselben statt. Erfolgt die Erhitzung der Probe während der Verformung derselben, erfolgt nach dem Beginn der Erzeugung der Spannungszustände und vor dem Ende der Erzeugung eine Erhitzung der Probe. Durch geeignete Wahl einer Hitzelasersequenz kann die Temperatur am Ort der Probe während der gesamten Messung an einer einzelnen Probe konstant gehalten werden, indem der Wärmeeintrag des stretch lasers am Ort der Probe ausgeglichen wird.
Im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Erhitzung der Probe derart, dass dadurch, abgesehen von thermischen Effekten, in dieser keine zusätzlichen Spannungszustände erzeugt werden. Davon ausgenommen sind Spannungen, die in der Probe gerade aufgrund der zu untersuchenden Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Probe entstehen, bspw. durch deren thermische Ausdehnung. Da es bei der Manipulation der Probe mittels der mikrorheologischen Vorrichtung dennoch zu einer Erwärmung der Probe kommen kann, bedeutet diese Form der Erhitzung eine zumindest teilweise Entkopplung von Deformation und Erhitzung. Diese Entkopplung ermöglicht vorteilhaft die Charakterisierung der thermorheologischen Eigenschaften der Probe.
Erfindungsgemäß wird die Verformung der Probe als Reaktion auf die erzeugten Spannungszustände in Abhängigkeit der mittels der mikrorheologischen Vorrichtung erzeugten Kräften und der Probentemperatur zeitaufgelöst detektiert. Bevorzugt erfolgt die Detektion der Probe mittels eines lichtmikroskopischen Aufbaus. Die Verformung der Probe wird dann als relative Deformation aus Abbildungen der Probe vor und während der Erzeugung der Spannungszustände mittels der mikrorheologischen Vorrichtung bestimmt. Simultan zu diesen Abbildungen erfolgt eine Messung der Temperatur der Probe. Die Erfassung dieser Daten ermöglicht vorteilhaft die Bestimmung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Probe.
Die Bestimmung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Probe erlaubt vorteilhaft die Bestimmung biomechanischer Kenngrößen. Einige dieser Kenngrößen stellen für verschiedenen Zelltypen konservierte Werte dar, so dass anhand der dieser Größen eine Charakterisierung der Zellen erfolgen kann. Weiterhin ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft die Bestimmung thermodynamischer Kenngrößen, wie bspw. den thermischen Ausdehnungskoeffizienten und womöglich eine zellspezifischer Glasübergangstemperatur.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe gemeinsam mit einer Lösung in einem mikrofluidischen Kanal auf eine bestimmte Temperatur gebracht. Weiterhin bevorzugt ist der mikrofluidische Kanal über einen geeigneten Zufluss mit einem Reservoir verbunden, in dem eine Vielzahl der zu untersuchenden Proben in einer Nährlösung suspendiert sind. Weiterhin bevorzugt erfolgt die Temperierung der Probe und der Lösung durch eine Temperierungseinrichtung, besonders bevorzugt durch ein Umwälzthermostat und geeignete am mikrofluidischen Kanal angebrachte Wärmetauscher.
Weiterhin bevorzugt ist der mikrofluidische Kanal mit einer mikrofluidischen Pumpe verbunden, so dass einzelne Proben mit Hilfe einer einstellbaren Strömung durch den Kanal hindurch transportiert werden. An einer Stelle des mikrofluidischen Kanals ist mindestens eine, bevorzugt zwei, lichtleitende Faser(n) senkrecht zum Kanal, und bevorzugt achsenfluchtend zueinander, angeordnet, wobei jede der Fasern ein divergentes Laserfeld emittiert. Wird die Probe mittels der mikrofluidischen Strömung in die Laserfelder transportiert, wird sie darin fixiert und positioniert. Durch diesen mindestens einen stretch laser kommt es zudem zu einer Verformung der positionierten Zelle. Diese hängt unter anderem von der Leistung der stretch laser ab. Für eine detaillierte Beschreibung der Positionierung und Verformung der Probe in dem durch die beiden divergenten Laser gebildeten „Optischen Strecker“ sei auf die EP 1 059 871 B1 verwiesen. Die auf die Probe wirkenden Kräfte sind für einen optischen Strecker insbesondere linear zu der Leistung der stretch laser und nach einer entsprechenden Kalibrierung aus dieser bestimmbar. Besonders bevorzugt erfasst eine Steuereinrichtung die zwischen den beiden stretch lasern positionierte Probe und stoppt für die Dauer der Messungen die durch die mikrofluidische Pumpe vermittelte Strömung.
In dieser bevorzugten Ausführungsform wird vor, gleichzeitig oder während der Verformung der Probe durch die stretch laser mittels mindestens eines Heizlasers ein von der Probe beabstandetes Volumen der Lösung um bis zu 100K, bevorzugt bis zu 60K, in einer Zeit von 1ms bis 5000ms, bevorzugt zwischen 1ms bis 2500ms und besonders bevorzugt zwischen 1ms bis 1000ms, und somit durch Wärmeübertragung auch die Probe erhitzt. Dies erfolgt durch thermische Anregung der Lösung bzw. des Lösungsmittels durch die Absorption des Laserlichts des mindestens einen Heizlasers. Dabei erfolgt die Erhitzung der die Probe umgebenden Lösung so, dass durch die Heizlaser kein zusätzlicher Impuls auf die Probe übertragen wird bzw. keine weiteren optischen Kräfte an der Zelle induziert werden. Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, dass sich die Strahlverläufe von stretch laser und Heizlaser im mikrofluidischen Kanal nicht überschneiden. Zusätzlich sind die Heizlaser so ansteuerbar, dass die Erhitzung der Lösung erst dann erfolgt, wenn eine durch den Kanal zu den stretch lasern transportierte Probe den Heizlaser passiert hat. Diese Form der indirekten Erhitzung der Probe führt vorteilhaft zu einer Entkopplung von Deformation und Erhitzung der Probe und macht die Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften einer Probe erstmalig experimentell zugänglich. Weiterhin ermöglicht diese Form der Erhitzung vorteilhaft eine sehr exakte Einstellung der Temperatur der Probe, basierend auf der Absorption des Laserlichts in der Lösung. Da der Wärmeübertrag mittels Absorption von Laserlicht realisiert wird, ist eine genaue Kenntnis des Absorptionskoeffizienten notwendig, um den gewünschten Wärmeeintrag zu erreichen. Der Absorptionskoeffizient lebender Zellen variiert von Zelle zu Zelle und ist darüber hinaus nicht bekannt. Der Absorptionskoeffizient der umgebenden Lösung ist allerdings genau und reproduzierbar bestimmbar. Daraus ergibt sich eine erhöhte Genauigkeit der durch Laserlicht eingebrachten Wärme in der Messregion. Da die Zellen nicht direkt bestrahlt werden, werden zudem negative Effekte wie 'photodamage' bzw. wellenlängenabhängige Absorption von Photonen durch Proteine vermieden.
In der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Verformung der Probe in Abhängigkeit der Leistung der stretch laser, der Probentemperatur und der Zeit mittels eines lichtmikroskopischen Aufbaus detektiert. Bevorzugt werden dabei Abbildungen der Probe zu verschiedenen Zeiten, bei verschiedenen Leistungen der stretch laser und bei verschiedenen Temperaturen bestimmt. Besonders bevorzugt wird durch die Vermessung der Abbilder der Probe nach einem reproduzierbaren Schema die zeitabhängige, relative Verformung der Zelle bestimmt. Diese Größe berechnet sich im Wesentlichen als Quotient einer beliebigen, reproduzierbar bestimmbaren Ausdehnung der zu untersuchenden Probe zu einer Anfangszeit t₀ = 0 und zu späteren Zeiten t > t₀. Bevorzugt wird eine Ausdehnung der Probe gewählt, die aufgrund der Einwirkung der stretch laser starken Veränderungen unterliegt. Weiterhin bevorzugt erfolgt eine Nachverfolgung der Konturlinien der Probe in den zu verschiedenen Zeiten erstellten Abbildungen, um etwaige Drift- oder Rotationsbewegungen der Zelle als Ganzes zu ermitteln. Derartige, die Deformation der Zelle überlagernde, Bewegungen werden bevorzugt über einen geeigneten Algorithmus aus den erfassten Daten heraus gerechnet. Weiterhin bevorzugt werden Datensätze, bei denen die Zellen eine Bewegung als Ganzes zeigen, die einen gewissen Grenzwert übersteigen, nicht zur Bestimmung der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Zelle herangezogen.
Um im erfindungsgemäßen Verfahren eine möglichst starke Erhitzung der Probe zu gewährleisten, ist die Wellenlänge des Heizlasers bevorzugt an die verwendete Flüssigkeit, bevorzugt einer wässrigen Lösung, angepasst. Bei der Probe handelt es sich bevorzugt um eine Zelle, die ein spezifisches Nährmedium zum optimalen Erhalt ihrer vitalen Funktionen benötigt. Diese Nährmedien sind in der Regel wasserbasiert, können aber aufgrund der gelösten Substanzen Unterschiede in der wellenlängenabhängigen Absorption von Licht zeigen. Um dennoch für jede Lösung einen optimalen Energieeintrag durch den Heizlaser zu gewährleisten, wird dessen Wellenlänge bevorzugt so gewählt, dass der Absorptionskoeffizient bei dieser Wellenlänge ein Maximum aufweist.
Durch die Korrelation der relativen Verformung der Zelle, mit den auf die Zelle wirkenden Kräften sowie Temperatur lässt sich die Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften der Probe quantifizieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Temperatur der Probe über einen, in der die Probe umgebenden Lösung enthaltenen, Fluoreszenzfarbstoff bestimmbar. Dieser Farbstoff weist eine temperaturabhängige Intensität der ausgestrahlten und somit detektierbaren Fluoreszenzstrahlung auf. Somit lässt sich über die Messung der Intensität der Fluoreszenzstrahlung dieses Farbstoffs die Temperatur der Lösung und der Probe bestimmen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren wird, wie obenstehend beschrieben, für eine Vielzahl gleichartiger Proben deren Verformung in Abhängigkeit der auf diese ausgeübten Kraft sowie der Probentemperatur bestimmt.
Für jede der Proben wird somit die relative Verformung in Abhängigkeit der an die stretch laser angelegten Leistung und der daraus resultierenden, auf die Probe wirkenden Kraft sowie in Abhängigkeit der Temperatur der jeweiligen Probe bestimmt. Aus den so bestimmten Daten, lässt sich das Kriechverhalten der Proben gemäß
bestimmen. Dabei ist die optisch in der Probe induzierte Spannung linear proportional zu der an den stretch lasern anliegenden Leistung. Die Proben zeigen dabei in der Regel bei verschiedenen Temperaturen ein verschiedenes Kriechverhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kurve von einer Probe, die bei einer ersten Temperatur bestimmt wurde, gemäß der der aus der Polymerphysik bekannten „time temperature superposition“ – Theorie (TTS) mittels eines Skalierungsfaktors der Zeit, des „time shift factors“ a_T,i, mit der, bei einer beliebigen anderen Probentemperatur T_i bestimmten, Kurve J(t) einer anderen Probe gemäß
zur Überlagerung gebracht werden. Voraussetzung dafür ist, dass die Temperatur der Messkammer und der Lösung als Ganzes, unabhängig von der Probentemperatur, während der Vielzahl von Messungen eine konstante Temperatur aufweisen.
Mit den für eine Vielzahl gleichartiger Proben ermittelten Daten zur relativen Verformung wird zunächst für jede Zelle das Kriechverhalten gemäß (1) charakterisiert. Anschließend werden nach der Wahl einer, bei einer Referenztemperatur bestimmten Referenzkurve, alle Kurven für gemäß (2) zur Deckung gebracht. Besonders bevorzugt werden dabei die Skalierungsfaktoren a_T,i solange variiert, bis die Fehlerquadrate der Überlagerung einen bestimmten Grenzwert unterschreiten.
Aus der TTS Polymertheorie ist weiterhin bekannt, dass die Skalierungsfaktoren a_T,i eine funktionelle Abhängigkeit von der Temperatur zeigen, die durch die Arrhenius-Gleichung
beschrieben werden kann. Dabei bezeichnet R die universelle Gaskonstante und E_A die Aktivierungsenergie.
Wie experimentelle Befunde zeigen, ist die Aktivierungsenergie E_A eine Größe, die für individuelle Zellen desselben Typs weitgehend erhalten ist, für Zellen verschiedenen Typs jedoch unterschiedliche Werte annimmt. Die Bestimmung der Aktivierungsenergie E_A, als Kenngröße der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften einer Probe, insbesondere lebender Zellen, ermöglicht somit vorteilhaft und überraschend die Charakterisierung und Unterscheidung von Zellen verschiedenen Zelltyps. Als Zellen unterschiedlichen Zelltyps gelten dabei Zellen verschiedener Organismen sowie Zellen, die innerhalb desselben Organismus verschiedene Funktionen innehaben. Darüber hinaus ist in bestimmten Fällen eine Unterscheidung der Zellen desselben Zelltyps anhand eines speziellen Zustandes, bspw. Zellalter, Stadium des Zell-Zyklus oder Viabilität, möglich.
Gemäß der TTS Theorie ist die Abhängigkeit (3) jedoch nicht für alle Polymere und Temperaturbereich gültig, bspw. wird für bestimmte Temperaturen die Abhängigkeit der Skalierungsfaktoren a_T,i von der Temperatur durch die William-Landel-Ferry-Gleichung beschrieben. Für glasartige Materialien, zu denen biologische Proben, insbesondere Zellen, häufig gezählt werden, beschreibt die Arrhenius-Gleichung das Verhalten der Skalierungsfaktoren für T < T_G und T > T_G + 50°K, wohingegen die William-Landel-Ferry-Gleichung die Temperaturabhängigkeit der a_T,i für T_G < T < T_G + 50°K beschreibt. Die Glasübergangstemperaturen biologischer Proben wurden jedoch bislang nicht bestimmt.
Im Sinne dieser Patentanmeldung ist die Gleichung (3) daher als Vorschrift zur numerischen Bestimmung einer Kenngröße, der Aktivierungsenergie E_A, zu verstehen. Diese Größe ist im Sinne dieser Anmeldung und unabhängig von jeder Theorie ausschließlich durch Gleichung (3) bestimmt. Die Anwendbarkeit der Gleichung (3) bestimmt sich somit allein dadurch, ob ein Wert E_A gefunden werden kann, mit dem diese Gleichung (3) die Temperaturabhängigkeit der für die Vielzahl gleichartiger Proben gefundenen Skalierungsfaktoren a_T,i mit einer vom Fachmann zu wählenden Genauigkeit beschreibt. Beispielsweise kann die Anpassung der Werte an einen zu ermittelnden Graphen gemäß (3) durch Minimierung der Fehlerquadrate erfolgen. Sollten diese Fehlerquadrate einen vom Fachmann selbst gewählten Grenzwert nicht unterschreiten, so ist (3) für die bestimmten Skalierungsfaktoren a_T,i nicht anwendbar.
Für den Fall, dass Gleichung (3) nicht anwendbar und die Aktivierungsenergie E_A somit nicht bestimmbar ist, kann anhand des qualitativen Verlaufs der Abhängigkeit der Skalierungsfaktoren a_T,i von der Temperatur eine Unterscheidung von Zellen verschiedenen Zelltyps erfolgen. Selbst wenn kein quantitativer Wert der Aktivierungsenergie E_A bestimmt werden kann, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft eine Charakterisierung bzw. Unterscheidung von Zellen anhand ihres Zelltyps möglich. Auf die Durchführung einer solchen Charakterisierung wird bei der Beschreibung der Verwendungsmöglichkeiten der Erfindung näher eingegangen.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Verformung einer Vielzahl gleichartiger Proben in Abhängigkeit der auf diese ausgeübten Kraft sowie der Probentemperatur bestimmt.
Für jede der Proben wird dabei wiederrum die relative Verformung in Abhängigkeit der an die stretch laser angelegten Leistung und der daraus resultierenden, auf die Probe wirkenden Kraft sowie in Abhängigkeit der Temperatur der jeweiligen Probe bestimmt. Aus den so bestimmten Daten, lässt sich das Kriechverhalten der Proben gemäß (1) bestimmen.
Die Proben zeigen dabei in der Regel ein verschiedenes Kriechverhalten bei verschiedenen Temperaturen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Kurve von J(t) einer Probe, die bei einer ersten Temperatur bestimmt wurde, gemäß der aus der Polymerphysik bekannten „time temperature superposition“ – Theorie (TTS) mittels eines Skalierungsfaktors der Zeit, des „time shift factors“ a_T,i, sowie eines Faktors zur Skalierung der gesamten Funktion, des „modulus shift factor“s b_T,i, mit der, bei einer beliebigen anderen Probentemperatur T_i bestimmten, Kurve J(t) einer anderen Probe gemäß
zur Überlagerung gebracht werden.
Weisen die Messkammer sowie die Lösung als Ganzes und unabhängig von der Probentemperatur dabei während der gesamten Zeit der Messungen eine weitgehend konstante Temperatur auf, so wird für den Skalierungsfaktor b_T,i bevorzugt ebenfalls eine Konstante gewählt. Unterhalb einer kritischen Temperatur T_crit nimmt b_T,i für verschiedene Temperaturen der Messkammer und der Lösung als Ganzes verschiedene konstante Werte an, die über einen weiten Bereich unabhängig von der Probentemperatur sind. Übersteigt die Probentemperatur jedoch die kritische Temperatur T_crit kann b_T,i nicht mehr konstant gesetzt werden. Vielmehr müssen die Werte für b_T,i für die bei verschiedenen Temperaturen TI gemessenen Kurven J_i variiert werden, soll eine hinreichende Überlappung der Kurven erreicht werden. Gemäß der TTS Theorie zeigen die Proben somit für eine Probentemperatur T > T_crit thermorheologisch komplexes Verhalten.
Zur Bestimmung der jeweiligen Werte von b_T,i werden die Skalierungsfaktoren a_T,i und b_T,i solange variiert, bis die Fehlerquadrate der Überlagerung einen bestimmten Grenzwert unterschreiten. Aus den somit ermittelten Werten für den modulus shift factor b_T,i ist die Temperatur T_crit bestimmbar, als die Temperatur, oberhalb derer die Temperaturabhängigkeit der Skalierungsfaktoren b_T,i nicht mehr durch mindestens eine Konstante beschrieben werden kann. Die kritische Temperatur T_CRIT ist somit die Temperatur, oberhalb derer die Gesamtheit der einzelnen Skalierungsfaktoren b_T,i eine Temperaturabhängigkeit aufweisen. Die kritische Temperatur wird dabei als Mittelwert der Temperaturen bestimmt, ab denen die Temperaturabhängigkeit der einzelnen Skalierungsfaktoren b_T,1, b_T,2, b_T,3 ... nicht mehr durch eine Konstante beschrieben werden kann.
Wie experimentelle Befunde zeigen, ist die kritische Temperatur T_crit eine Größe, die für individuelle Zellen desselben Typs weitgehend erhalten ist, für Zellen verschiedenen Typs jedoch unterschiedliche Werte annimmt. Die Bestimmung der kritischen Temperatur T_crit, als Kenngröße der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften einer Probe, insbesondere lebender Zellen, ermöglicht somit vorteilhaft und überraschend die Charakterisierung und Unterscheidung von Zellen verschiedenen Zelltyps. Darüber hinaus ist in bestimmten Fällen eine Unterscheidung der Zellen desselben Zelltyps anhand eines speziellen Zustandes, bspw. Zellalter, Stadium des Zell-Zyklus oder Viabilität, möglich.
Wie schon wie für die Skalierungsfaktoren a_T,i beschrieben, kann auch anhand des qualitativen Verlaufs der Abhängigkeit der Skalierungsfaktoren b_T,i von der Temperatur eine Unterscheidung von Zellen verschiedenen Zelltyps erfolgen. Selbst wenn kein quantitativer Wert der kritischen Temperatur T_CRIT bestimmt werden kann, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft eine Charakterisierung bzw. Unterscheidung von Zellen anhand ihres Zelltyps möglich. Auf die Durchführung einer solchen Charakterisierung wird bei der Beschreibung der Verwendungsmöglichkeiten der Erfindung näher eingegangen.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung aufweisend:

a) eine Messkammer zur Aufnahme einer in einer Flüssigkeit, bevorzugt einer wässrigen Lösung, befindlichen Probe,
b) eine Temperierungseinrichtung zur Einstellung der Temperatur von Messkammer und Lösung,
c) eine mikrorheologische Vorrichtung zur Erzeugung gezielter Spannungszustände in der Probe,
d) mindestens einen Heizlaser mit von der positionierten Probe beanstandeten Strahlverlauf,
e) mindestens einen Detektor zur Bestimmung der geometrischen Form und/oder der mechanischen Eigenschaften der Probe und
f) mindestens einen Detektor zur Bestimmung der Temperatur der Probe. zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Charakterisierung von Zellen, Gewebeproben oder Partikeln, wobei
g) eine zu untersuchende Probe zusammen mit einer Lösung in einer Messkammer auf eine bestimmte Temperatur gebracht wird,
h) in der Probe mittels einer mikrorheologischen Vorrichtung gezielt Spannungszustände erzeugt werden und diese dadurch verformt wird, wobei
i) zuvor, gleichzeitig oder während der Verformung, jedoch kausal unabhängig von dieser eine Erhitzung der Probe um bis zu 100 K in einer Zeit von 1ms bis 1000ms erfolgt,
j) die Verformung der Probe, in Abhängigkeit von den mittels der mikrorheologischen Vorrichtung erzeugten Kräften, der Probentemperatur und der Zeit, detektiert wird und

Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Diagnostik von Krebserkrankungen.
Wie Untersuchungen gezeigt haben, zeigen Tumorzellen ein anderes thermorheologisches Verhalten als gesunde Zellen desselben Gewebes. Insbesondere weisen gesunde Zellen in der Regel eine Viskosität auf, die der eines pseudoplastischen Fluides ähnelt. Tumorzellen hingegen weisen eine Viskosität auf, die der eines newtonschen Fluides ähnelt. Somit lässt sich gesundes Gewebe von Tumorgewebe bereist anhand der qualitativen thermorheologischen Eigenschaften der entsprechenden Zellen voneinander unterscheiden.
Zur Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnostik von Krebserkrankungen wird das erfindungsgemäße Verfahren an Gewebeproben eines potentiellen Tumors, bzw. an aus diesen gewonnenen einzelnen Zellen, eines Patienten durchgeführt.
Das so bestimmte thermorheologische Verhalten der in Frage stehenden Proben bzw. Zellen wird anschließend mit Referenzdaten verglichen. Die Referenzdaten werden dabei bevorzugt mittels der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an zweifelsfrei nicht tumorigem Gewebe des Patienten gewonnen. Ebenfalls bevorzugt können die Referenzdaten einer Datenbank entnommen werden aus der Daten zum thermorheologischen Verhalten des entsprechenden gesunden Gewebes abrufbar sind.
Besonders bevorzugt wird aus mindestens einer Gewebeprobe des potentiellen Tumors eines Patienten eine Vielzahl einzelner Zellen isoliert. Mittels der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an dieser Vielzahl von Zellen kann das thermorheologische Verhalten dieses Zelltyps mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Dazu wird insbesondere bei verschiedenen Temperaturen die mechanische Antwort der Zellen auf eine auf diese applizierte, bestimmte Spannung erfasst.
Anschließend werden bevorzugt Referenzdaten mittels der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an einer Vielzahl von gesunden Zellen desselben Gewebes des Patienten ermittelt. Dazu wird ebenfalls bevorzugt die mechanische Antwort der Zellen auf eine bestimmte auf diese applizierte Spannung bei verschiedenen Temperaturen erfasst. Weiterhin bevorzugt werden die Referenzdaten aus einer Datenbank abgerufen, in der das thermorheologische Verhalten dieses Zelltyps gespeichert ist, welches zuvor an einer Vielzahl von Zellen desselben gesunden Gewebes charakterisiert wurde.
Aus dem Vergleich des thermorheologischen Verhaltens der potentiellen Tumorzellen mit den Referenzdaten lässt sich eine Aussage treffen, ob es sich bei dem vom Patienten entnommen Gewebe um Proben eines Tumors handelt.
Wie weiterhin festgestellt wurde, nehmen thermorheologische bzw. im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmte biomechanischen Kenngrößen für gesunde und für Tumorzellen unterschiedliche Werte an. Dies trifft insbesondere auf die im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmbare Aktivierungsenergie E_A sowie die kritische Temperatur T_CRIT zu. Somit lässt sich gesundes Gewebe von Tumorgewebe besonders vorteilhaft anhand der quantitativen thermorheologischen Eigenschaften der entsprechenden Zellen voneinander unterscheiden. Vorteilhafterweise hat sich gezeigt, dass die Aktivierungsenergie E_A für Tumorzellen eines Gewebes andere Werte annimmt, als für gesunde Zellen desselben Gewebes.
Zur Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnostik von Krebserkrankungen wird das erfindungsgemäße Verfahren an Gewebeproben eines potentiellen Tumors, bzw. an aus diesen gewonnenen einzelnen Zellen, eines Patienten durchgeführt.
Wie vorab beschrieben wird anhand der gemessenen Daten die Aktivierungsenergie E_A und/oder die kritische Temperatur T_CRIT des vermessenen Zelltyps bestimmt. Die so gewonnen Daten werden mit Referenzdaten für die Aktivierungsenergie E_A und/oder die kritische Temperatur T_CRIT verglichen. Bei den Referenzdaten handelt es sich dabei um Werte, die für Zellen desselben, jedoch gesunden, Gewebes wie das potentielle Tumorgewebe bestimmt oder aus einer Datenbank, enthaltend solche Referenzdaten, entnommen wurden.
Besonders bevorzugt wird aus mindestens einer Gewebeprobe des potentiellen Tumors eines Patienten eine Vielzahl einzelner Zellen isoliert. Mittels der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an dieser Vielzahl von Zellen können die Aktivierungsenergie E_A und/oder die kritische Temperatur T_CRIT dieses Zelltyps mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Dazu wird insbesondere bei verschiedenen Temperaturen die mechanische Antwort der Zellen auf eine auf diese applizierte, bestimmte Spannung erfasst.
Anschließend werden bevorzugt Referenzdaten mittels der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens an einer Vielzahl von gesunden Zellen desselben Gewebes des Patienten ermittelt. Dazu wird ebenfalls bevorzugt die mechanische Antwort der Zellen auf eine bestimmte auf diese applizierte Spannung bei verschiedenen Temperaturen erfasst. Weiterhin bevorzugt werden die Referenzdaten aus einer Datenbank abgerufen, in der die Werte der Aktivierungsenergie E_A und/oder der kritischen Temperatur T_CRIT dieses Zelltyps gespeichert sind, welches zuvor für eine Vielzahl von Zellen desselben gesunden Gewebes bestimmt wurden.
Aus dem Vergleich Werte der Aktivierungsenergie E_A und/oder der kritischen Temperatur T_CRIT der potentiellen Tumorzellen mit den entsprechenden Referenzdaten lässt sich eine Aussage treffen, ob es sich bei dem vom Patienten entnommen Gewebe um Proben eines Tumors handelt. Bevorzugt wird dabei der Wert der Aktivierungsenergie der potentiellen Tumorzellen mit dem Wert der Aktivierungsenergie desselben gesunden Gewebes verglichen. Weisen die Zellen des potentiellen Tumorgewebes dabei eine klar abgrenzbare andere Aktivierungsenergie auf, als die gesunden Zellen desselben Gewebes, so handelt es sich bei den dem Patienten entnommen potentiellen Tumorzellen mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit tatsächlich um Tumorzellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Anlehnung an die hier beschriebenen Verwendung zur Diagnostik von Krebserkrankungen auch zur Klassifikation von Tumoren, zur Isolation, Identifizierung und Charakterisierung von Stammzellen, Seltenen Zellen und extrazellulären Flüssigkeiten, zur Diagnose einer Sepsis bzw. zur Blutanalyse allgemein und für die Reproduktionsmedizin eingesetzt werden.
Weiterhin Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Screening von Substanzen als potentielle medizinische Wirkstoffe.
Daher umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zum Screening von Substanzen als potentielle Wirkstoffe für die Onkologie (Screeningverfahren), bei dem der Einfluss der Substanzen auf biomechanische Eigenschaften von Tumorzellen, insbesondere auf die Werte der Aktivierungsenergie E_A und/oder der kritischen Temperatur T_CRIT, untersucht wird, indem die Dehnung einer Vielzahl von Tumorzellen unter mechanischer Belastung und bei verschiedenen Temperaturen analysiert wird. Dabei wird

i) mindestens eine Tumorzelle:
– mit einer Substanz kontaktiert und
– anschließend wird auf die Tumorzelle eine deformierende mechanische Spannung als mechanische Belastung bei verschiedenen Temperaturen so ausgeübt, dass die Tumorzelle verformt wird. Die Dehnung der Tumorzelle wird zum Zeitpunkt der Belastung bestimmt;
ii) Die Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen bei verschiedenen Temperaturen wird mit Referenzdaten der Analyse der Dehnung von gleichartigen unbehandelten Tumorzellen bei verschiedenen Temperaturen verglichen.

Die Substanz wird dann als potentieller Wirkstoff für die Onkologie eingestuft, wenn die Werte der Aktivierungsenergie E_A und/oder der kritischen Temperatur T_CRIT der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen näher an den Werten der Aktivierungsenergie E_A und/oder der kritischen Temperatur T_CRIT von Zellen desselben Gewebes wie des Tumors, die jedoch gesund sind, liegen.
Vorzugsweise wird die Substanz als potentieller Wirkstoff für die Onkologie eingestuft,

– wenn der Wert der Aktivierungsenergie E_A der mit der Substanz kontaktierten Tumorzellen im Vergleich zu den unbehandelten Tumorzellen geringer ist.

Substanzen, die in einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren analysiert werden, umfassen Moleküle, die natürlichen oder synthetischen Ursprung sind. Bevorzugte Substanzen, die in einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren analysiert werden, sind ausgewählt aus natürlichen Molekülen, insbesondere Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren, davon insbesondere siRNA, synthetischen organischen Molekülen, insbesondere Monomeren, Polymeren, synthetischen anorganischen Molekülen und small molecules.
In einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren werden Tumorzellen untersucht, die entweder aus einer Gewebeprobe eines Patienten stammen oder aber aus einer Zelllinie entstammen. Vorzugsweise werden in einem erfindungsgemäßen Screeningverfahren aufgrund deren leichteren Kultivierbarkeit und Erhältlichkeit Tumorzellen aus Zelllinien eingesetzt.
Als Referenzdaten dient dabei die Analyse der Dehnung gleichartiger Zellen, die nicht mit der Substanz kontaktiert, ansonsten aber identisch gehandhabt wurden (hierin auch „unbehandelte“ Zellen). Beim Einsatz von Zelllinien dient daher die Analyse der Dehnung von unbehandelten Tumorzellen der jeweiligen Zelllinie bei verschiedenen Temperaturen als Referenz. Diese Daten werden mit der Dehnung von Zellen derselben Zelllinie verglichen, die mit der Substanz kontaktiert wurden. Beim Einsatz von Zellen aus Gewebeproben, vorzugsweise Tumorgewebeproben, werden unbehandelte Zellen aus derselben Gewebeprobe als Referenz analysiert.
Besonders bevorzugt werden die Daten auch noch mit Normalreferenzdaten verglichen. Zur Erhebung der Daten der Normalreferenz dienen dabei Nicht-Tumorzellen der gleichen Art, für die die Dehnung bei verschiedenen Temperaturen nach dem gleichen Prinzip wie für die Tumorzellen bestimmt wird. Wird das erfindungsgemäße Screeningverfahren mit Tumorzelllinien durchgeführt, werden als Normalreferenz Zelllinien eingesetzt, die keine Tumorzellen enthalten. Wird das erfindungsgemäße Verfahren mit Tumorzellen aus Gewebeproben durchgeführt, so werden als Normalreferenz vorzugsweise Zellen des gleichen Gewebes eingesetzt, die jedoch nicht zu Tumorzellen degeneriert sind, oder alternativ Zellen eines gesunden Individuums aus dem gleichen Gewebe (beispielsweise wird das Screeningverfahren an Brustkrebszellen durchgeführt, so werden als Normalreferenz entweder Nicht-Tumorzellen des Brustgewebes desselben Patienten oder Zellen aus Brustgewebe eines gesunden Individuums eingesetzt). Werden die mechanischen Eigenschaften der Tumorzellen durch das Kontaktieren mit der Substanz in Richtung der Eigenschaften der Normalreferenz verändert, so ist auch dies ein Indiz dafür, dass die Substanz ein potentieller Wirkstoff für die Onkologie ist.
In einer besonderen Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Screeningverfahrens wird von derselben Tumorzelle die Dehnung bei verschiedenen Temperaturen unter mechanischer Belastung bestimmt. Besonders bevorzugt werden für die Tumorzelle die Werte der Aktivierungsenergie E_A und/oder der kritischen Temperatur T_CRIT bestimmt. Dabei wird zunächst die Dehnung der unbehandelten Tumorzelle bei verschiedenen Temperaturen unter Belastung ermittelt. Dafür muss ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Tumorzelle auch nach der Ermittlung der Dehnung bei verschiedenen Temperaturen vital ist. Dazu ist vorzugsweise die erfindungsgemäße Vorrichtung geeignet. Anschließend wird die Tumorzelle mit der Substanz kontaktiert und anschließend die Dehnung der mit der Substanz kontaktierten Tumorzelle bei verschiedenen Temperaturen ermittelt. In dieser Ausgestaltung kann der Einfluss der Substanz auf die mechanischen Eigenschaften der Tumorzellen besonders gut ermittelt werden, da identische Zellen vor und nach der Kontaktierung mit der Substanz analysiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Anlehnung an die hier beschriebene Verwendung des zum Screening von Substanzen als potentielle medizinische Wirkstoffe auch zur Thermoaktivierung von Gewebe, zur Charakterisierung weicher Materie und für die Proteomik eingesetzt werden.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels sowie anhand von Abbildungen näher erläutert, dabei zeigen:
1: den prinzipiellen Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung, mit einem mikrofluidischen Kanal (5) mit dazu senkrecht positionierten optischen Fasern (1–3), wobei das mittlere Faserpaar (2) als stretch laser einer Zweistrahllaserfalle und die peripheren Fasern (1 und 3) als Heizlaser verwendet werden;
2: im erfindungsgemäßen Verfahren bei verschiedenen Probentemperaturen gewonnene Deformationsdaten gemäß (1) für gesunde Brust Epithel-Zellen MCF-10A und krebsartige Zellen MDA-MB 231; unskaliert (linke Spalte) sowie mittels time shift factor a_T gemäß (2) skaliert (rechte Spalte);
3: die zur Skalierung der Deformationsdaten benutzten time shift factors a_T gemäß (3);
4: die Skalierungsfaktoren time shift factor a_T und modulus shift factor b_T in Abhängigkeit von der effektiven Probentemperatur.
Aufbau der Vorrichtung
Zur Untersuchung der mechanischen Antwort von lebenden, suspendierten MCF10A und MDA-MB 231 Brust-Epithel-Zellen auf optisch induzierte Kräfte wurde eine erfindungsgemäße Vorrichtung genutzt. Die Vorrichtung umfasst dabei einen mikrofluidischen Optischen Strecker Aufbau (µOS), der erfindungsgemäß so modifiziert wurde, dass die Temperatur der Zellen, auf kurzen Zeitskalen, insbesondere innerhalb von Millisekunden, beliebig einstellbar ist. Dazu wird erfindungsgemäß die bislang aus dem Stand der Technik beim Optischen Strecker bekannte, inhärente Kopplung von Erhitzung und Deformation zumindest teilweise aufgehoben. Durch die erfindungsgemäße Integration von Laserheizung in den Optischen Strecker, können in diesem gehaltene Zellen innerhalb von Millisekunden so erhitzt werden, dass sie keiner direkten Bestrahlung durch Laserlicht ausgesetzt sind. Gleichzeitig werden die in den Zellen optisch induzierten, mechanischen Spannungen, deren Stärke ausschließlich durch die Leistung der stretch laser bestimmt ist, konstant gehalten.
Der erfindungsgemäße Aufbau umfasst eine gerade Glass Kapillare mit einem inneren Durchmesser von 80µm sowie einer Wandstärke von 40µm (ST8508, VitroCom, USA). Diese Kapillare wurde senkrecht zu einer durch zwei Laserzweistrahlfalle angeordnet. Diese umfasst zwei senkrecht zu der Kapillare und zueinander mit einem Abstand von 200µm achsenfluchtend angeordneten Monomodefasern, wobei sich die Messregion für die Untersuchungen der mechanischen Eigenschaften der Zellen zwischen den Fasern befindet (Nr. 4 in 2). Alle Komponenten des Aufbaus wurden in einem Gel mit passendem Brechungsindex eingebettet, um ungewünschte Reflektion und Brechung an den Oberflächen der Kapillare zu verhindern.
Um die Temperatur des Aufbaus kontrollieren zu können, wurde die Kapillare auf einem Probenhalter aus Aluminium befestigt, der kontinuierlich mit temperiertem Wasser gespült wurde Das Wasser wurde dabei durch ein Umwälzthermostat (F10, Julabo, Germany) temperiert. Mittels eines externer Temperatursensors, der in der Nähe der Messregion installiert war, sowie einem Feedback-Steuerverfahren konnte die Temperatur des Aufbaus als Ganzes während der Messungen konstant gehalten werden sowie Temperaturänderungen des Aufbaus als Ganzes innerhalb von ca. 20min realisiert werden.
Um Temperatursprünge der Zellen innerhalb von Millisekunden realisieren zu können, wurden zudem zwei zusätzliche optische Fasern senkrecht zu der Kapillare und mit einem Abstand von 110µm zur Messregion positioniert. Durch die Emission von Laserlicht mit einer Wellenlänge von 1064nm wurde das, die in der Messregion befindliche Probe umgebende, Nährmedium schnell erhitzt, ohne dass die Zelle direkter Bestrahlung durch den Laser ausgesetzt wurde. Da der in der Messregion erwartete Temperaturanstieg stark von der Distanz der Fasern des Heizlasers abhängt, wurden diese möglichst nahe der Probenposition angebracht, indem Standard HI-1064 Monomodenfaser mittels Fluorwasserstoffsäure auf einen Durchmesser von 80µm herunter geätzt wurden.
Temperatur-Kalibrierung
Zur Bestimmung der Heizleistung der verwendeten Laser wurde eine Temperatur-Kalibrierung mit dem temperatursensitivem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamine B (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) durchgeführt. Dieser Farbstoff weist eine hohe Temperatursensitivität im Bereich von 0 bis 120°C auf. Um die Temperaturverteilung in der Kapillare möglichst weiträumig zu erfassen, wurde ein Axioobserver Z1 in Kombination mit einem 10× Objektiv (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) verwendet. Die Farbstofflösung wurde aus Rhodamine B (0,1mM) und Carbonatbuffer (20mM) erzeugt und in gemeinsam mit der die Zellen enthaltenden Suspension in die Kapillare eingefüllt. Der Farbstoff wurde kalibriert, indem die Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Temperaturen des Aufbaus gemessen wurde. Um die Temperaturerhöhung im Inneren der Glaskapillare zu bestimmen, wurde der Mittelwert aus 6 unabhängigen Messungen bei Temperaturen zwischen 15 und 40°C bestimmt. Dadurch konnte der Einfluss der Temperatur des Probenhalters oder von Nichtlinearitäten des Rhodamine B minimiert werden. Als Ergebnis für die Heizleistung wurden eine Temperaturerhöhung in der Messregion von 7°C/Watt durch die Heizlaser und 26°C/Watt durch die stretch laser ermittelt.
Zellpräparation
MCF-10A Zellen (CRL-10317), eine nicht nicht-tumorigene Zelllinie, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) bezogen. Die Zellen wurden in einem 1:1 Mix aus Dulbeccos modifiziertem Eagles’s Medium (DMEM) und Hams F12 Medium gehalten. Der Mix war zusätzlich mit 5% Pferde Serum, 20 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10 µg/ml Insulin, 100 ng/ml Cholera Toxin, 500 ng/ml Hydrocortison und 100 U/ml Penicillin / Streptomycin versetzt. Vor den Messungen wurden die Zellen, die in einer 25cm^2 Kulturflasche (TPP, Trasadingen, Schweiz) kultiviert wurden, zweimal mit Phosphat gebufferter Salzlösung gewaschen und durch die Zugabe von 1 ml 0.025% Trypsin-EDTA Lösung abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden anschließend in 3ml Kulturmedium suspendiert und bei 100g für 4min zentrifugiert. Schließlich wurden einzelne Zellen mit einer Konzentration von etwa 5 × 10^5 Zellen/ml in Kulturmedium re-suspendiert und in die Vorrichtung gegeben.
MDA-MB-231 Zellen (HTB-26), eine tumorartige Brustepithelzelllinie, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) bezogen. Die Zellen wurden mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), angereichert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 100µg/ml Penicillin / Streptomycin, kultiviert. Vor den Messungen wurden die Zellen, die in einem 25cm^2 Kolben (TPP, Trasadingen, Schweiz) kultiviert wurden, zweimal mit Phosphat gebufferter Salzlösung gewaschen und durch die Zugabe von 1 ml 0.025% Trypsin-EDTA Lösung abgelöst. Die abgelösten Zellen wurden anschließend in 3ml Kulturmedium suspendiert und bei 100g für 4min zentrifugiert. Schließlich wurden einzelne Zellen mit einer Konzentration von etwa 5 × 10^5 Zellen/ml in Kulturmedium re-suspendiert und in die Vorrichtung gegeben.
Messungen
Über einen Zeitraum von 5 Stunden wurde die Reaktion von 685 MCF-10A Zellen auf eine Deformation durch die stretch laser bei einer Leistung von P_stretch = 700mW detektiert. Eine Sekunde bevor die Deformation einsetzte, wurden die Heizlaser aktiviert um zufällig einen Strahl der Leistung zwischen 0 und 1700 mW zu emittieren. Dadurch wurde eine plötzliche Temperaturerhöhung in der Messregion bewirkt. Da die Temperatur der Vorrichtung als Ganzes durch das Umwälzthermostat konstant auf einer beliebigen Temperatur einstellbar und somit bekannt ist, lässt sich die effektive Temperatur der Probe wie folgt ermitteln T_off = T_Setup + P_stretchΔT + P_HeizΔT_H (5)
Dabei wird die Temperaturerhöhung durch die Heizlaser mit einer Leistung P_Heiz berücksichtigt. Entsprechend der zuvor durchgeführten Temperaturkalibrierung beträgt die
lokale Temperaturerhöhung in der Messregion durch die Heizlaser dabei ΔT_H ≈ 7° C / Watt . Die Durchführung der Messungen an den MDA-MB-231 Zellen erfolgte analog.
Datenanalyse
Die Extraktion quantitativer Werte aus den an einzelnen Zellen durchgeführten Experimenten verlangt zunächst die digitale Bearbeitung von Bilderstapeln, die mit 30fps mittels Video-Phasenkontrast-Mikroskopie aufgenommen wurden. Mittels eines implementierten Kantenerkennungs-Algorithmus wurde die äußere Begrenzung in jedem Querschnitt jeder einzelnen Zelle mit Subpixel-Genauigkeit bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde die Orientierung der Umhüllung der Zelle durch die aufgenommene Bilderfolge hindurch nachverfolgt, um so Messfehler zu korrigieren, die aus kleinen Rotationen der Zelle während der Messungen resultierten. Daten von Zellen die während der Messungen große Rotationen oder Rotationen um verschiedene Achsen zeigten wurden von der weiteren Evaluation ausgeschlossen. Die Deformation der verbleibenden Zellen wurde als relative Deformation gemäß
bestimmt, wobei die parallel zur Achse der stretch laser gemessene Länge der Zellen ist.
Implementierung der TTS und Bestimmung der Aktivierungsenergie
Die aus der bei verschiedenen Temperaturen gemessenen relativen Verformung und der Leistung der stretch laser gemäß (1) ableitbaren Kurven J(t) zum Kriechverhalten der Zellen, wurden mittels eines selbst konstruierten Algorithmus zu einer Master-Kurve überlappt. Dabei wurden alle diese Kurven, nach der Bestimmung einer Referenztemperatur, gemäß (2) skaliert, wobei der Skalierungsfaktor a_T systematisch variiert wurde, um den Fehler der Überlappung zu minimieren.
Aktivierungsenergie
Unter Verwendung des so bestimmten Skalierungsfaktors bestimmten time shift factors a_T, konnten die gemessenen Kurven zum Kriechverhalten J(t) überlappt werden (vgl. 2). Gemäß der Arrhenius Gleichung (3) kann aus den Skalierungsfaktoren a_T die Aktivierungsenergie bestimmt werden. Die gemessenen Shift-Faktoren erscheinen linear, wobei die Steigung proportional zur Aktivierungsenergie für den viskosen Fluss der Zellen ist. Daraus ergeben sich Werte für die Aktivierungsenergie von ~ 80 kJ/Mol (MCF-10A) und ~ 170 kJ/Mol (MDA-MB-231) (vgl. 3).
Diagnose von Krebserkrankungen
Aus den in 2 dargestellten Deformationsdaten für MCF-10A (gesund) und MDA-MB 231 (krebsartig) bei verschiedenen Temperaturen ist deutlich zu erkennen, dass die Antwort der gesunderen Zellen sich von den krebsartigen unterscheidet.
Durch die Bestimmung der zur Überlappung der Kurven benötigten shift factors, insbesondere des time shift factors a_T, lassen sich die gesunden Zellen zuverlässig von den krebsartigen Zellen unterscheiden (vgl. 3).
Kritische Temperatur
In der zuvor genannten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Charakterisierung von Zellen wurde die Temperatur T des Aufbaus als Ganzes konstant gehalten, während der Einfluss einer plötzlichen Erhöhung der Probentemperatur bestimmt wurde. Um zu bestimmen, wie die Zellen auf Temperaturänderungen über einen längeren Zeitraum reagieren, wurden das kriechverhalten der Zellen bei verschiedenen Temperaturen des Aufbaus als Ganzes T_setup bestimmt. Dabei hatten die Zellen einige Minuten bis Stunden Zeit, um sich an die veränderten Temperaturen anzupassen. Zu Beginn wurde die Vorrichtung als Ganzes auf 37°C temperiert und ca. 200 Zellen innerhalb von ungefähr 3h vermessen. Nachfolgend wurden der Probenhalter und die Kapillare erst auf 25°C, dann auf 15°C herunter gekühlt und die Messungen an ungefähr derselben Anzahl an Zellen und im selben Bereich der Laserpower wiederholt Ps_tretch (zufällig ausgewählt zwischen 500 und 1100mW) wiederholt. Bei jeder Abkühlung dauerte es in etwa 20 bis 25 Minuten, bis das gesamte Setup thermisch equibriliert war. Zellen, die während des Temperaturübergangs gemessen wurden, wurden von der weiteren Evaluation der Daten ausgeschlossen, da die wirkliche Temperatur in der Messkammer nicht exakt bestimmbar war.
Die so bestimmten Kurven des Kriechverhaltens J(t) wurden gemäß (4) unter Verwendung eines time shift factors a_T und eines modulus shift factors b_T zur Überlagerung gebracht. Für die bei 15°C bestimmten Kurven ist für alle Werte der Laserleistung Ps_tretch der Wert für b_T konstant. Die bei 25°C bestimmten Kurven hingegen können nur mit verschiedenen Werten für b_T zur Überlappung gebracht werden. Dasselbe trifft für die bei 37°C durchgeführten Messungen zu. Diesen Messungen ist zu entnehmen, dass alle Zellen für eine Temperatur T_eff > T_CRIT thermorheologisch komplexes Verhalten, charakterisiert durch die Notwendigkeit eines nicht konstanten modulus shift factors b_T, zeigen (vgl. 4B). Für die MCF-10A Zellen wurde die kritische Temperatur zu bestimmt. Die Temperatur T_CRIT ist dabei ein für Zellen gleichen Typs konservierter Wert und daher zur Charakterisierung und Differenzierung von Zellen anhand ihres Zelltyps geeignet. Zusätzlich kann man aus den Daten folgern, dass ein b_T immer auch dann nötig ist, wenn die Zellen eine charakteristisch lange Zeitspanne einer neuen Setup-Temperatur ausgesetzt sind.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1059871 B1 [0004, 0013, 0020, 0035]
DE 102010041912 B3 [0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

[Wetzel et al. Single cell viability and impact of heating by laser absorption, Eur Biophys J (20119 40: 1109–1114] [0005]
Standard HI-1064 [0088]

Claims

Vorrichtung zur Charakterisierung von Zellen, Gewebeproben oder Partikeln, aufweisend a) eine Messkammer zur Aufnahme einer in einer Flüssigkeit befindlichen Probe, b) eine Temperierungseinrichtung zur Einstellung der Temperatur von Messkammer und der Flüssigkeit, c) eine mikrorheologische Vorrichtung zur Erzeugung gezielter Spannungszustände in der Probe, d) mindestens einen Heizlaser mit von der Probe beabstandeten Strahlverlauf, e) mindestens einen Detektor zur Bestimmung der geometrischen Form und/oder der mechanischen Eigenschaften der Probe und f) mindestens einen Detektor zur Bestimmung der Temperatur der Probe.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrorheologische Vorrichtung einen Optical Tweezer, einen optischen Strecker, ein AFM-Kraftmikroskop, eine magnetische Pinzette, eine Mikropipette einen, Ultraschallerzeuger, ein mikrofluidisches Strömungshindernis und/oder eine Einrichtung zur Erzeugung von Elektrophorese umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a) die Messkammer als ein mikrofluidischer Kanal ausgebildet ist, b) die Messkammer kontinuierlich mit temperiertem Wasser spülbar ist, c) die mikrorheologische Vorrichtung durch zwei, über lichtleitende Fasern in den mikrofluidischen Kanal gerichtete, zu diesem senkrecht sowie zueinander achsenfluchtend angeordnete stretch laser gebildet ist, d) der mindestens eine Heizlaser über eine separate lichtleitende Faser in den mikrofluidischen Kanal geleitet wird und e) mindestens ein Detektor zur Bestimmung von geometrischer Form und Temperatur der Probe in oder relativ zum mikrofluidischen Kanal angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die lichtleitenden Fasern von stretch laser und Heizlaser so angeordnet sind, dass sich deren Strahlverläufe innerhalb der Messkammer nicht überlagern und /oder der Abstand des Heizlasers zu der mittels der stretch laser positionierten Probe zwischen 1µm und 1000µm beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge der stretch laser zwischen 300 nm und 2000 nm und die Wellenlänge der Heizlaser zwischen 900 nm und 3000 nm beträgt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein lichtmikroskopischer Aufbau relativ zum mikrofluidischen Kanal angeordnet ist und Abbildungen von Probe und Kanal an einen, zur Detektion optischer Informationen in einem Spektralbereich von 300 nm bis 800 nm geeigneten, Detektor übertragbar sind.
Verfahren zur Charakterisierung von Zellen, Gewebeproben oder Partikeln, wobei a) eine zu untersuchende Probe zusammen mit einer Flüssigkeit in einer Messkammer auf eine bestimmte Temperatur gebracht wird, b) in der Probe mittels einer mikrorheologischen Vorrichtung gezielt Spannungszustände erzeugt werden und diese dadurch verformt wird, wobei c) zuvor, gleichzeitig oder während der Verformung, jedoch kausal unabhängig von dieser eine Erhitzung der Probe um bis zu 100K in einer Zeit von 1ms bis 1000ms erfolgt, d) die Verformung der Probe, in Abhängigkeit von den mittels der mikrorheologischen Vorrichtung erzeugten Kräften, der Probentemperatur und der Zeit, detektiert wird und e) daraus biomechanische und thermodynamische Kenngrößen abgeleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine zu untersuchende Probe zusammen mit einer Flüssigkeit in einem mikrofluidischen Kanal auf eine bestimmte Temperatur gebracht wird, b) die Probe durch mindestens einen divergenten stretch laser verformt wird, c) zuvor, gleichzeitig oder während der Verformung mittels mindestens eines Heizlasers ein von der Probe beabstandetes Volumen der Flüssigkeit um bis zu 100K in einer Zeit von 1 ms bis 1000 ms erhitzt und dadurch die Probe erhitzt wird, d) die Verformung der Probe in Abhängigkeit der Leistung der stretch laser, der Probentemperatur und der Zeit mittels eines optischen Aufbaus detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 dadurch gekennzeichnet, dass die Wellenlänge des Heizlasers in Abhängigkeit des wellenlängenabhängigen Absorptionskoeffizienten der verwendeten Flüssigkeit gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probentemperatur über die temperaturabhängige Intensität der gemessenen Fluoreszenzstrahlung eines in der Flüssigkeit befindlichen Fluoreszenzfarbstoffs bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass a) für eine Vielzahl gleichartiger Proben deren Verformung, in Abhängigkeit der auf diese ausgeübten Kraft sowie der Temperatur T_i bestimmt wird, b) die so gewonnen Daten gemäß TTS mittels time shift factors a_T,i skaliert werden, c1) und aus den time shift factors a_T,i die zellspezifische Aktivierungsenergie E_A bestimmt wird und/oder c2) die Abhängigkeit der time shift factors a_T,i von der Temperatur qualitativ ausgewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass a) die gewonnen Daten gemäß TTS mittels eines time shift factors a_T,i und eines modulus shift factors b_T,i skaliert werden b1) und aus dem modulus shift factors b_T,i die zellspezifische kritische Temperatur T_CRIT bestimmt wird und/oder b2) die Abhängigkeit der modulus shift factors b_T,i von der Temperatur qualitativ ausgewertet wird.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einer der Ansprüche 7 bis 12.
Verwendung eines Verfahrens gemäß einer der Ansprüche 7 bis 12 oder einer Vorrichtung gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 zur Prognose und Diagnostik von Krebserkrankungen.
Verwendung eines Verfahrens gemäß einer der Ansprüche 7 bis 12 oder einer Vorrichtung gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6 zum Screening von Substanzen als potentielle medizinische Wirkstoffe.