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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung
von wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe, insbesondere von
Tumorzellen. Zwischen normalen und kranken Zellen, wie zum Beispiel
Tumorzellen, sowie ihrer unmittelbaren Zellumgebung bestehen messbare
Unterschiede. Dabei weist die extrazellulare Flüssigkeit, die
jede Zelle umgibt, bei Tumorzellen gegenüber gesunden Zellen
ein verändertes Schwingungsverhalten auf, wenn die Zellen
extern zum Schwingen angeregt werden.
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Möglichkeiten,
Zellen in Schwingung zu versetzen, sind in den vergangenen Jahrzehnten
viele bekannt geworden. So existiert eine große Anzahl von
Veröffentlichungen, die eine mechanische Schwingungsanregung,
etwa mit Ultraschall, zum Gegenstand haben. Bei größeren
Zellverbänden ist bei der Übertragung von mechanischer
Schwingungsenergie aber immer nachteilig, dass alle Zellen der Schwingung
ausgesetzt werden müssen.
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Das
Schwingungsverhalten der Zellen ist durch eine Vielzahl von unterschiedlichen
Eigenschaften der Zellen sowie ihrer unmittelbaren Zellumgebung
bestimmt. Insbesondere wird das spezifische Schwingungsverhalten
der Zellen durch deren Steifigkeit und die Beschaffenheit des Zytoskeletts
sowie durch die Viskosität des Zytoplasmas, durch die Plasmamembran,
die Kernflüssigkeit, die Kern/Plasma Relation, den osmotischen
Druck, die Steifigkeit und Beschaffenheit der extrazellulären
Matrix; die Viskosität und die Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit
und die Geschwindigkeit der zellulären Aggregationsprozesse
bestimmt. Je nach Art der Schwingungsanregung tragen jeweils unterschiedliche
Zellkomponenten zum Schwingungsverhalten bei.
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Ein
gravierender, struktureller Unterschied zwischen gesunden und kranken
Zellen ist insbesondere dadurch gegeben, dass kranke Zellen eine
veränderte Organisation der zellulären und der
extrazellulären Filamentnetze aufweisen. Bei gesunden Zellen
sind die zellulären Filamente gebunden und geordnet, wobei
hingegen in kranken Zellen die Filamente diffus und nicht gebunden
angeordnet sind. Das führt dazu, dass bei kranken Zellen
der zelluläre Kraftfluss weitgehend über gebündelte
Aktinstränge erfolgt. Durch diese Störung der
Aktinbündelung und der makromolekularen Verbindungsproteine
ist ein Verlust der funktionellen Zellsteifigkeit und damit eine deutliche
Veränderung des Schwingungsverhalten der kranken Zelle
bzw. der extrazellularen Flüssigkeit der Zelle gegeben.
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Ferner
ist durch die Störung der Aktinbündelung eine
Reduzierung der Viskosität der kranken Zelle gegenüber
einer gesunden Zelle gegeben, wodurch die kranken Zellen eine deutlich
stärkere Schwingungsamplitude gegenüber der gesunden Zellen
aufweisen.
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Ein
weiterer wesentlicher Unterschied betrifft die extrazelluläre
Flüssigkeit. Die extrazelluläre Flüssigkeit
umgibt die Zellmembran und versorgt die Zelle mit den nötigen
Nährstoffen sowie mit Sauerstoff, außerdem führt
sie die verbrauchten Stoffe ab. Damit dies geschieht, bestehen zwischen
dem Inneren der Zellen und der extrazellulären Flüssigkeit
Konzentrationsunterschiede sowie ein Konzentrationsgradient. Der
Konzentrationsunterschied bildet hierbei das treibende Gefälle,
welches nötig ist, damit die Stoffe durch die Zellmembran
hindurch diffundieren können. Entlang dieser Diffusionswege
besteht ein Konzentrationsgradient, dessen Steigung dem jeweiligen Fließgleichgewicht
für den jeweiligen Stoff entspricht. Da es sich bei vielen
der mit der Zelle ausgetauschten Stoffe um Ionen handelt, die eine
elektrische Ladung aufweisen, verläuft entsprechend den
Konzentrationsgradienten auch ein Ladungsgradient, der typisch für
die jeweilige Versorgungssituation für die Zelle ist, wobei
eine typische, gesunde Zelle eine Ladung von ca. +70 mV im Zellinneren
sowie eine negative Ladung in der extrazellulären Flüssigkeit
aufweist.
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Bei
kranken Zellen ist die Versorgungssituation deutlich verändert,
bei Tumorzellen beträgt die Ladung in der Zelle oft –30
mV und in der extrazellulären Flüssigkeit +30
mV. Auch ist die Nährstoffsituation erheblich verändert
und die Konzentrationsgradienten sind anders. Dies führt
auch zu einer veränderten Reaktion auf Schwingungsanregungen
sowie zu einem veränderten Schwingungsverhalten.
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Durch
diese Unterschiede des Schwingungsverhaltens sind für kranke
Zellen, insbesondere Tumorzellen, bestimmte Frequenzen gegeben,
die die kranke Zelle derart in Schwingung versetzen, dass sie zerstört
wird. Hierbei handelt es sich um die Resonanzfrequenz für
das System der kranken Zellen, so dass die kranke Zelle mittels
dieser durch die Resonanzfrequenz induzierten Resonanzkatastrophe
zerstört wird. Durch die Schwingung in der Resonanz wird
die Zellmembran der kranken Zelle zerstört. Die Art und
Weise, wie die Zerstörung der Zellmembran erfolgt, ist
aber stark abhängig von der Methode der Schwingungsanregung.
Verschiedene Arten der Schwingungsanregung führen auch
zu unterschiedlichen Resonanzfrequenzen.
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Aufgrund
der physikalischen Unterschiede von kranken und gesunden Zellen
sind die Resonanzfrequenzen der kranken Zellen, insbesondere der
Tumorzellen, verschieden zu den Resonanzfrequenzen der gesunden
Zellen. Durch diesen Unterschied ist es möglich, eine Schwingung
mit einer entsprechender Resonanzfrequenz in die kranke Zelle einzubringen,
ohne die gesunden Zellen zu beeinflussen, so dass die kranken Zellen
zerstört werden und die gesunden Zellen nicht in Mitleidenschaft
gezogen werden.
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Unterschiedliche
Arten von kranken Zellen, insbesondere von Tumorzellen, weisen entsprechend
ihrer physikalischen Eigenschaften ganz unterschiedliche Resonanzfrequenzen
auf, was auch zu Diagnosezwecken genutzt werden kann. Es hat daher
in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, sich diese unterschiedlichen
Eigenschaften diagnostisch oder therapeutisch zunutze zu machen.
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So
zeigt die
US 4,767,611
A eine Behandlung von Krebs, bei der der Organismus einer
relativ niedrigen Frequenz eines elektromagnetischen Feldes ausgesetzt
wird. Durch das elektromagnetische Feld wird Energie in den Organismus
eingebracht, die die kranken Zellen selektiv erhitzt, jedoch die
gesunden Zellen nicht beeinflussen soll. Hierzu werden dem Zellorganismus,
bevor dieser in das elektromagnetische Feld angeordnet wird, sogenannte
Minutenteilchen zugeführt. Hierbei handelt es sich um Teilchen,
die einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer
aufweisen. Diese Teilchen weisen die Eigenschaft auf, in die kranke Zelle
einzudringen, jedoch die gesunden Zellen zu meiden. Auch bei diesem
Verfahren ist von Nachteil, dass zunächst ein Aktivierungsteilchen
in die Zelle eingebracht werden muss, so dass dieses Behandlungs verfahren
sehr aufwendig ist, da die Menge der einzubringenden Aktivierungsteilchen
vorher genau bestimmt werden muss.
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Die
US 4,472,506 A zeigt
ein Verfahren und eine Vorrichtung, die es ermöglicht,
den elektrischen Zusammenbruch der Zellmembran einer Zellprobe zu
bestimmen. Der Zusammenbruch der Zellmembran ist hierbei durch eine
Umkehrung des elektrischen Zellwiderstandes gekennzeichnet. Hierzu
wird eine bestimmte Zusammenbruchspannung für die Zellen
verwendet. Die Zellen werden hierzu in ein elektrisches Feld gebracht,
wobei die Zellen in dem elektrischen Feld bewegt werden, sodass
sich in den Zellen ein entsprechender elektrischer Feldgradient ergibt.
Das elektrische Feld wird gepulst und weist vorbestimmte Spannungen
auf, die in vorherigen Testverfahren ermittelt worden sind, den
sogenannten Zusammenbruchspannungen. Durch den Feldgradienten des
elektrischen Feldes wird ein elektrischer Strom in der Zelle erzeugt.
Durch An- und Abschalten dieses elektrischen Feldes mit einer bestimmten
Pulsfrequenz wird bei einer bestimmten Größe des
elektrischen Stroms der Zellwiderstand durch den Stromfluss überwunden
und es kommt zu einer Umkehrung bzw. zu freien Stromfluss in der Zelle
ohne jeglichen Widerstand, was gleichbedeutend mit dem Zusammenbruch
des Zellmembran ist. Nachteilig bei dieser Art von Vorrichtung und
Verfahren ist die Tatsache, dass die Zellen in dem elektrischen
Feld bewegt werden müssen, um einen entsprechenden Gradienten
des elektrischen Feldes in der Zellprobe und einen damit verbundenen
Stromfluss zu erhalten. Dadurch wird der Aufbau der Vorrichtung
entsprechend aufwendig und funktionsanfällig. Zudem ist
von Nachteil, dass durch das elektrische Feld die Zellen derart
erwärmt werden, dass auch gesunde Zellen des Organismus
entsprechend erwärmt werden, was zu negativen Einflüssen
für die gesunden Zellen führt. Auch wird nicht
die Frequenz, sondern die Spannungsamplitude variiert, so dass keineswegs
gesichert ist, dass die Resonanzfrequenz getroffen wurde.
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Die
Schriften
US 5,087,336
A ,
US 5,143,588 A ,
US 5,215,633 A ,
US 5,215,642 ,
US 5,312,534 beschreiben eine Schwingungsanregung
mittels eines fluktuierenden magnetischen Feldes. Diese Art der Anregung
zielt auf die Resonanzfrequenz bestimmter Ionen, beispielsweise
Ca++ oder Mg++, wobei das Ladungs/Massenverhältnis der
Zyklotronresonanzfrequenz entspricht. Diese Ionen können
bei Anlegen derartiger Frequenzen durch die Zellmembran wandern,
wodurch therapeutische Effekte erreicht wer den können.
Allerdings ist die Erzeugung derartiger magnetischer Felder sehr
aufwändig. Auch sind die Diagnosemöglichkeiten
beschränkt, da die Resonanzfrequenzen nicht auf den Gesundheitszustand der
Zelle abstellen, sondern auf die Wanderung bestimmter Ionen.
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Die
Schrift
WO 99/11771
A1 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung einer Zellkultur,
bei der alle Zellen außer einer bestimmten Art von Zellen,
beispielsweise Stammzellen, aus einer Kultur oder während
einer Blutwäsche, etwa bei Blutkrebs, herausselektiert
werden sollen, wobei alle übrigen Zellen verworfen bzw.
zerstört werden können. Hierbei wird ein gepulstes
elektrisches Feld eingesetzt, wobei Rechteckwellen bevorzugt werden,
die Pulsdauer ist im Bereich von Millisekunden. Durch Wahl geeigneter
Parameter bezüglich angelegter Spannung, Zeitdauer und
Anzahl der Pulse und der Ionenkonzentration in der Lösung
können hohe Reinheiten erreicht werden. So wird vorgeschlagen,
ein elektrisches Feld anzulegen, welches eine Feldstärke
von 20 kV/cm erreicht, eine Pulsdauer von 2–20 μs
und Pulsfrequenzen von 0 bis 20 kHz. Eine Resonanzfrequenz wird
jedoch nicht eingestellt und die Frequenz wird auch nicht variiert.
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Es
ist die somit Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren
anzugeben, bei dem mittels der Vitalität einer Zellprobe,
insbesondere einer Tumorzelle, die Resonanzfrequenz der Zellprobe genau
bestimmt wird. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit
den Merkmalen des Anspruch 1 sowie mit den Merkmalen des Anspruchs
13 gelöst.
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Um
nun einzelne Resonanzfrequenzen für verschiedene kranke
Zellen, insbesondere für unterschiedliche Tumorzellen,
zu bestimmen, ist erfindungsgemäß vorgesehen,
dass eine entnommene Zellprobe in einer Halteeinrichtung angeordnet
ist, wobei die Zellprobe zweckmäßig in einer Messschale angeordnet
ist. Mittels eines ersten Frequenzgenerators wird eine elektromagnetische
Welle bzw. Schwingung mit einer bestimmten Trägerfrequenz bereitgestellt.
Die Trägerwelle bzw. Trägerschwingung wird mit
einer elektromagnetischen Modulationswelle bzw. Modulationsschwingung
gekoppelt, die mittels eines zweiten Frequenzgenerators bereitgestellt
wird. Mittels der Halteeinrichtung zugeordneten Einbringungsmitteln
wird die gekoppelte Schwingung aus Trägerschwingung und
Modulationsschwingung an die Zellprobe gebracht. Die Zellprobe wird
mittels einer Beobachtungseinrichtung beobachtet und deren Vitalität
ermittelt. Die Frequenz der Mo dulationswelle wird mittels des zweiten
Frequenzgenerators variiert. Während der Variation der
Frequenz der Modulationswelle wird die die Zellprobe weiter beobachtet
und deren Vitalität ermittelt. Durch die Modulationsschwingung
wird die Zellprobe in Schwingung versetzt. Wird nun während
der Variation der Frequenz der Modulationsfrequenz für
die Zellvitalität ermittelt, dass diese plötzlich
abfällt und keine Vitalität in der Zelle mehr
beobachtet wird, so bedeutet dies, dass die mit der Trägerschwingung eingebrachte
Modulationsschwingung eine Frequenz aufweist, die die Zellprobe
derart in Schwingung versetzt, dass deren Zellmembran durch die
Schwingung zerstört worden ist. Bei dieser Frequenz handelt es
sich um die Resonanzfrequenz für die Zellprobe, die in
dem System der Zellprobe zu der die Zelle zerstörenden
Resonanzkatastrophe führt. Damit wird durch die Ermittlung
der abfallenden und verschwindenden Vitalität der Zellprobe
die Resonanzfrequenz für die Zellprobe bestimmt (Frequenzsensitivitätstest).
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Die
Wirkung ist hierbei die, dass das elektrische Feld Energie auf die
Zellmembran und die sie umgebende extrazelluläre Flüssigkeit überträgt
und diese Region erwärmt. Zwar beträgt die Erwärmung zur
ca. 0,01 K, aufgrund der sehr kleinen räumlichen Abmessungen
entspricht dies aber einem sehr großen Temperaturgradienten,
der zu entsprechender Thermodiffusion führt und dabei die
Zellmembran zerstört.
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Die
Variation der Frequenz der Modulationsschwingung erfolgt bevorzugt
kontinuierlich, wodurch sichergestellt ist, dass bei der Variation
der Frequenz der Modulationsschwingung die Resonanzfrequenz der
Zellprobe erreicht wird, wobei die Frequenz der Modulationsschwingung
zweckmäßig zwischen 1 Hz und 10.000 kHz liegt.
Beispielsweise kann die Frequenz in Schritten von 1 Hz kontinuierlich
erhöht werden.
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Es
versteht sich, dass die Frequenzen der Modulationsschwingung auch über
10.000 kHz hinaus vorgesehen sein kann, wobei die Bereitstellung einer
Schwingung bis 10.000 kHz jedoch ohne größeren
Aufwand erfolgt. Bei Modulationsschwingungen mit Frequenzen im MHz
oder GHz Bereich sind auch Resonanzen für die Zellproben
zu messen, hierbei handelt es sich dann um die höheren
Eigenmoden des Systems der Zellprobe. Diese sind ebenfalls durch
die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe messbar, da
die physikalischen Eigenschaften dem Grunde nach dieselben sind
wie bei den niedrigen Eigenmoden, insbesondere der Resonanzfrequenz
im Bereich von 1 Hz bis 10.000 KHz.
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Es
versteht sich ferner, dass die Variation der Frequenz der Modulationsschwingung
auch diskret erfolgen kann, wobei der Abstand zwischen den einzelnen
Frequenzen durch die gewünschte Genauigkeit für
die Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe bestimmt ist.
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Zur
Ermittlung der Vitalität der Zellprobe ist vorteilhaft
wenigstens eine Beobachtungseinrichtung vorgesehen.
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Aufgrund
der vielseitigen Unterschiede zwischen kranken und gesunden Zellen
umfasst die Beobachtungseinrichtung verschiedene Mittel zur Beobachtung
und Ermittlung der Vitalität der Zellprobe. Hierbei ist
bevorzugt vorgesehen, dass die Beobachtungseinrichtung optische
Mittel umfasst. Durch die optischen Mittel wird erreicht, dass die
Schwingung der Zellprobe, in welche diese durch der Modulationswelle
angeregt wird, sehr genau beobachtbar ist, da durch die optischen
Mittel die Schwingung der Zellprobe eins zu eins abgebildet wird.
Durch diese genaue Beobachtung des Schwingungsverhalten der Zellprobe
ist eine genaue Ermittlung der Vitalität der Zellprobe
gegeben, so dass der Abfall der Vitalität der Zellprobe
und die den Abfall bewirkende Frequenz der Modulationsschwingung
genau ermittelt wird, wodurch die genaue Bestimmung der Resonanzfrequenz
für die Zellprobe weiter sichergestellt ist.
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Die
Beobachtungseinrichtung umfasst vorteilhaft Aufzeichnungsmittel,
wie zum Beispiel eine Video- oder CCD-Kamera, die die Schwingung
der angeregten Zellprobe über einen bestimmten Zeitraum
aufzeichnet. Die Variation der Frequenz der Modulationsschwingung
nimmt einen bestimmten Zeitraum in Anspruch, so dass während
dieses Beobachtungszeitraums die Modulationsfrequenz mittels des
zweiten Frequenzgenerators variiert und mittels der Kopplung mit
der Trägerschwingung in die Zellprobe eingebracht wird.
Um nun sicherzustellen, dass die Vitalität der Zellprobe
in dem gesamten Beobachtungszeitraum genau ermittelt wird, wird
das Schwingungsverhalten der Zellprobe durch die Aufzeichnungsmittel
während des gesamten Beobachtungszeitraums aufgezeichnet.
Durch die Aufzeichnung des Schwingungsverhaltens der Zellprobe ist ferner
vorteilhaft erreicht, dass das Schwingungsverhalten der Zellprobe
beständig festgehalten und nachträglich Bild für
Bild analysiert wird, wodurch die genaue Bestimmung der Resonanzfre quenz
der Zellprobe gewährleistet ist. Zudem ist eine mehrfache Analyse
des Schwingungsverhalten der Zellprobe möglich.
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Die
Aufzeichnungsmittel sind vorteilhaft mit dem zweiten Frequenzgenerator
gekoppelt, so dass eine eindeutige Zuordnung der Frequenz der Modulationswelle
zu den beobachteten Schwingungsverhalten der Zellprobe möglich
ist. Hierzu wird zum Beispiel kontinuierlich die Frequenz der Modulationsschwingung
in die Aufzeichnungsmittel eingespielt, so dass beim nachträglichen
Betrachten der Aufzeichnung des Schwingungsverhalten zu jedem Zeitpunkt
die Frequenz der Modulationsschwingung zu erkennen und der Schwingung
der Zellprobe zuzuordnen ist. Dadurch wird die Auswertung und Analyse
des beobachteten Schwingungsverhaltens der Zellprobe und die Bestimmung
der Resonanzfrequenz erleichtert.
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Zweckmäßigerweise
umfasst die Beobachtungseinrichtung wenigstens ein Mikroskop, wodurch die
Beobachtung der angeregten Zellen weiter sichergestellt wird, da
mittels der vergrößerten Darstellung der Zellprobe
durch das Mikroskop eine genaue Beobachtung Zellprobe möglich
ist. Ein Mikroskop bietet hierzu den Vorteil, dass die zu beobachtende Zellprobe
entsprechend vergrößert dargestellt wird. So ist
dadurch ebenfalls möglich, dass lediglich ein bestimmter
Ausschnitt der Zellprobe mittels der Beobachtungseinrichtung beobachtet
wird, an dem die Vitalität genau ermittelt wird. So ist
zum Beispiel möglich, dass lediglich ein Teilstück
der Zellmembran einer bestimmten Zelle der Zellprobe, in die die
Modulationsschwingung eingebracht wird, mittels des Mikroskops in
einer Vergrößerung beobachtet wird. Der Abfall
der Vitalität der Zelle ist durch die Zerstörung
der Zellmembran gekennzeichnet, so dass bei einer vergrößerten
und damit sehr genauen Beobachtung der Zellmembran eine genaue Ermittlung
für den Abfall bzw. Verlust der Zellvitalität
gegeben ist. Dadurch ist die genaue Bestimmung der Resonanzfrequenz
für die Zellen weiter sichergestellt.
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Es
ist ferner vorteilhaft vorgesehen, dass zur Ermittlung der Vitalität
der Zellprobe ein so genannter ATP(Adenosintriphosphat)-Test erfolgt.
ATP ist eine universelle Form unmittelbar verfügbarer Energie
in der Zelle, der bei Bedarf freigesetzt werden kann. Zweckmäßig
ist die Zellprobe in einer Nährflüssigkeit oder
in einem Nährmedium in der Halteeinrichtung zum Beispiel
in einer Petrischale angeordnet. Die Zellprobe wird nun mittels der
durch die Trägerwelle eingebrachten Modulationswelle in
Schwingung versetzt. Wird bei der Variation der Frequenz der Modulationswelle
die Resonanzfrequenz für die Zellprobe erreicht, d. h.
befindet sich die Zellprobe in der Resonanzkatastrophe, wird die
Zellmembran der Zelle zerstört. Dadurch tritt ATP aus der
Zelle aus, wobei das ATP in das Nährmedium gelangt. Das
ATP führt nun zu einer Umfärbung des Nährmediums.
Durch die Umfärbung des Nährmediums ist somit
ein Indikator für die Zerstörung der Zellmembran
und somit für den Abfall bzw. den Verlust der Zellvitalität
der Zellprobe gegeben. Das bedeutet, dass durch die Umfärbung
des Nährmediums die Resonanzfrequenz für die Zellprobe
bestimmbar ist.
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Durch
Einbringen der Trägerwelle und der Modulationswelle wird
die extrazelluläre Flüssigkeit erwärmt.
Dabei werden Ionen von der extrazellulären Flüssigkeit
in die Zelle transportiert, so dass sich der Ladungsunterschied
zwischen dem Zellinneren und der extrazellulären Flüssigkeit
verändert und die Zelle unter Stress steht. Wird nun während
der Variation der Frequenz der Modulationsschwingung die Resonanzfrequenz
der entsprechenden Zellprobe erreicht, so wird die Zellmembran zerstört
und die Ionenwanderung von der extrazellulären Flüssigkeit
in das Zellinnere erfolgt ohne Behinderung durch die Zellmembran,
so dass die Ladungsänderung zwischen extrazellulären
Flüssigkeit und dem Zellinneren sprunghaft ansteigt. Dieser
sprunghafte Anstieg der Ladungsänderung ist messbar. Damit
ist durch die Messung der Ladungsänderung eine Ermittlung des
mit der Zerstörung der Zellmembran einhergehenden Abfalls
der Zellvitalität gegeben und somit eine Bestimmung der
Resonanzfrequenz der Zellprobe möglich.
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Die
Zellprobe ist zweckmäßig einem Nährmedium
in einer Petrischale angeordnet ist, wodurch auch die Messung der
Temperatur des Nährmediums zur Bestimmung der Resonanzfrequenz
der Zellprobe verwendet werden kann. Hierzu wird die Temperatur
des Nährmediums mittels eines entsprechenden Thermometers
während der Variation der Frequenz der Modulationsschwingung
gemessen. Diese Temperatur ist im wesentlichen konstant. Wird nun
die Zellprobe mit der Resonanzfrequenz in Schwingung versetzt und
die Zellmembran zerstört, wird das Nährmedium
erwärmt, wobei dieser Temperaturanstieg gemessen wird.
Wird nun dieser Temperaturanstieg in dem Nährmedium gemessen,
bedeutet das, dass die Zellmembran zerstört ist und die
Zellprobe mit der Resonanzfrequenz zum Schwingen angeregt worden
ist, so dass durch die Ermittlung des Temperaturanstiegs in dem
Nährmedium die Resonanzfrequenz der Zellprobe bestimmbar
ist.
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Gegenüber
der Messung der inneren Zelltemperatur ist die Messung der Temperatur
des Nährmedium wesentlich einfacher, da hierzu gewöhnliche
Thermometer verwendet werden können, wobei hingegen bei
der Messung der inneren Zelltemperatur Spezialthermometer in die
Zellprobe eingebracht werden müssten.
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Zudem
wird durch die Ionenwanderung in die Zelle der innere Druck in der
Zelle erhöht, so dass auch die Änderung des Drucks
gemessen werden kann. Wird der Druck in der Zelle zu groß,
so wird auch dadurch die Zellmembran der Zelle zerstört
und ein plötzlicher Abfall des Drucks kennzeichnet den Abfall
bzw. den Verlust der Zellvitalität, so dass auch durch
eine Druckmessung im Inneren der Zelle eine genaue Bestimmung der
Resonanzfrequenz der Zellprobe gegeben ist.
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In
einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Beobachtungseinrichtung
ein Interferometer auf, mittels dem eine Spektralanalyse während der
Modulation der Frequenz der Modulationsschwingung bzw. Modulationswelle
der Zellprobe erstellt wird.
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Es
versteht sich, dass die vorbeschriebenen Vorgehensweisen zur Bestimmung
der Resonanzfrequenz der Zellprobe mittels Ermittlung der Vitalität der
Zellprobe sowohl jeweils einzeln als auch in Kombination vorgesehen
sein können. Es ist bevorzugt, dass zumindest zwei der
Mess- und Ermittlungsverfahren der Vitalität der Zellprobe
miteinander kombiniert werden, um eine effiziente Kontrolle der
Messung der Resonanzfrequenz zu erhalten.
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Die
mit der Trägerschwingung gekoppelte Modulationsschwingung
wird durch die Einbringungsmittel an die Zellprobe gebracht. Die
Einbringungsmittel weisen vorteilhaft wenigstens zwei Elektroden
auf, wobei die Zellprobe zwischen den beiden Elektronen angeordnet
ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Modulationswelle sicher
in die Zellprobe eingebracht wird. Hierbei ist zum Beispiel vorgesehen,
dass die beiden Elektroden an der Petrischale, in dem Zellprobe
vorgesehen ist, angeordnet sind.
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Die
Frequenz der Trägerwelle weist immer eine Frequenz von
13,56 MHz auf, dadurch wird ermöglicht, dass die Trägerfrequenz
in die Zellprobe eindringt und die Modulationswelle mit der Modulationsfrequenz
an die kranken Zellen gebracht wird und diese zu entsprechenden
Schwingung angeregt wird.
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Weitere
Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen
Ansprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung.
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Die
Erfindung wird nachstehend anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
unter Bezugnahme auf die anliegende Zeichnung näher erläutert.
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1 zeigt
in eine Seitenansicht eines bevorzugten Ausführungsbeispiels
einer erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. eines
Verfahren zur Bestimmung wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe.
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In 1 ist
ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe,
insbesondere einer Tumorzellprobe, gezeigt. Die Zellprobe 1 ist
in einem Nährmedium 2 vorgesehen, die in einer
eine Petrischale 3 umfassenden Halteeinrichtung 4 angeordnet
ist. Das mit der Zellprobe 1 gemischte Nährmedium 2 ist
ungefähr bis zur Hälfte in der Petrischale 3 vorgesehen.
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Die
Petrischale 3 umfasst einen Boden 5 und eine nach
oben gerichtete Seitenwand 6, wobei der Boden 5 vorzugsweise
eine kreisförmige Grundfläche aufweist. Es versteht
sich, dass der Boden 5 der Petrischale 3 auch
jede andere Art von Grundfläche, zum Beispiel rechteckig,
aufweisen kann.
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An
der nach oben gerichteten Seitenwand 6 sind gegenüberliegend
zwei Elektroden 7 an der Petrischale 3 angeordnet.
Die beiden Elektroden 7 sind mit einem ersten Frequenzgenerator 8 über
zwei Leitungen 8a verbunden. Der erste Frequenzgenerator 8 stellt
eine Trägerwelle bzw. Trägerschwingung bereit.
Die Trägerschwingung weist eine Frequenz von 13,56 MHz
auf.
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Mit
dem ersten Frequenzgenerator 8 ist ein zweiter Frequenzgenerator 9 gekoppelt.
Der zweite Frequenzgenerator 8 stellt eine Modulationsschwingung
bereit, wobei die Frequenz der Modulationsschwingung mittels des
zweiten Frequenzgenerators 9 variierbar ist. Es versteht
sich, dass der zweite Frequenzgenerator 9 mit dem ersten
Frequenzgenerator 8 einem Gehäuse gemeinsam angeordnet
sein kann.
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Die
Trägerschwingung des ersten Frequenzgenerators 8 wird
mit der Modulationsschwingung des zweiten Frequenzgenerators 9 gekoppelt.
Hierzu ist ein Applikator 10 in dem ersten Frequenzgenerator 8 vorgesehen.
Es versteht sich, dass der Applikator zur Kopplung der Trägerschwingung
mit der Modulationsschwingung auch separat vorgesehen sein kann.
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Die
gekoppelte Schwingung von Trägerschwingung und Modulationsschwingung
wird über die beiden Elektroden 7 in die in der
Petrischale 3 angeordnete Zellprobe 1 eingebracht,
wodurch die Zellprobe 1 in Schwingung versetzt wird.
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Oberhalb
der Petrischale 3 ist eine Beobachtungseinrichtung 11 zum
Beobachten der Zellprobe 1 in dem Nährmedium 2 vorgesehen.
Die Beobachtungseinrichtung 11 umfasst optische Mittel 12,
die ein Mikroskop 13 aufweisen. Das Mikroskop 13 weist ein
Objektiv 14 auf, das auf die in der Petrischale 3 angeordnete
Zellprobe 1 gerichtet ist. Das Mikroskop 13 ist
mit einer Kamera 15, vorzugsweise einer CCD-Kamera, verbunden.
Durch die CCD-Kamera 15 wird ermöglicht, dass
während eines bestimmten längeren Zeitraums die
Zellprobe 1 ununterbrochen in der Petrischale 3 beobachtet
wird.
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Das
Verfahren zur Bestimmung wenigstens einer Resonanzfrequenz einer
Zellprobe funktioniert nun wie folgt:
Die Zellprobe 1 wird
in dem Nährmedium 2 eingebracht und in der Petrischale 3 bereit
gestellt. Dann werden die beiden Frequenzgeneratoren 8 und 9 betätigt,
so dass durch den ersten Frequenzgenerator 8 die Trägerschwingung
mit der Frequenz von 13,56 MHz und durch den zweiten Frequenzgenerator
die Modulationsfrequenz zum Beispiel mit einer Frequenz von 1 Hz
bereit gestellt ist.
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Die
durch den Applikator 10 gekoppelte Schwingung der Trägerschwingung
und der Modulationsschwingung wird mittels der beiden seitlich an der
Petrischale 3 angeordneten Elektroden 7 in die Zellprobe 1 eingebracht.
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Die
durch die eingebrachte Schwingung in Schwingung versetzte Zellprobe 1 wird
mittels des Mikroskops 13 beobachtet. Die mit dem Mikroskop 13 gekoppelte
CCD-Kamera 15 zeichnet das Schwingungsverhalten der Zellprobe 1 während
des gesamten Beobachtungszeitraums auf, in dem die die Frequenz
der Modulationsschwingung mittels des zweiten Frequenzgenerators 9 variiert
wird. Die Kamara weist zur Speicherung der Aufzeichnung eine Speichereinheit 15a auf.
Es versteht sich, dass die Speichereinheit zur Aufzeichnung des
Schwingungsverhalten der Zellprobe auch separat vorgesehen sein,
zum Beispiel ein Speichermedium bzw. Speicherkarte oder eine Festplatte
in einem Computer.
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Nun
wird die Frequenz der Modulationsschwingung mittels der zweiten
Frequenzgenerators 9 variiert, wobei die Frequenz kontinuierlich
erhöht wird, vorzugsweise in Schritten von 1 Hz. Durch
die kontinuierliche Aufzeichnung des Schwingungsverhalten durch
die CCD-Kamera 15 wird die Schwingung der Zellprobe 1 bei
jeder Frequenz der eingebrachten Modulationsschwingung aufgezeichnet,
so dass ein vollständiges Bild des Schwingungsverhaltens
der Zellprobe erhalten wird.
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Erreicht
nun die Frequenz der Modulationsschwingung die Resonanzfrequenz
der Zellprobe 1, gerät diese in die Resonanzkatastrophe
und schwingt derart, dass die Zellmembran der Zellprobe 1 zerstört
wird. Durch das Mikroskop 13 wird die Zellprobe 1 beobachtet,
so dass zum Beispiel die Zerstörung der Zellmembran der
Zellprobe 1 optisch ermittelt wird.
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Die
Erfindung ist vorstehend anhand eines Ausführungsbeispiels
näher beschrieben worden, bei dem die Beobachtungsmittel
ein Mikroskop und eine CCD-Kamera umfassen, um den Abfall bzw. den
Verlust der Vitalität der Zellprobe optisch zu ermitteln, wobei
die Zellmembran der Zellprobe durch die Schwingung zerstört
wird. Es versteht sich, dass auch weitere Messmethoden zur Ermittlung
der Vitalität der Zell probe vorgesehen sein können,
wie zum Beispiel die ATP-Messung oder die Temperaturmessung des
Nährmediums.
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Es
versteht sich ferner, dass die weiteren Ermittlungsarten zur Ermittlung
der Vitalität der Zellprobe auch mit den optischen Mitteln
wie dem Mikroskop gekoppelt sein können, wie zum Beispiel
die Messung des ATP. Insbesondere eine ATP-Messung und eine damit
gekoppelte Fluoreszenzmessung ist auf bevorzugte Weise vorgesehen,
da sowohl die ATP-Messung als auch die Fluoreszenzmessung optisch über
das Mikroskop messbar sind und mittels der CDD-Kamera aufgezeichnet
werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
-
- - US 4767611
A [0011]
- - US 4472506 A [0012]
- - US 5087336 A [0013]
- - US 5143588 A [0013]
- - US 5215633 A [0013]
- - US 5215642 [0013]
- - US 5312534 [0013]
- - WO 99/11771 A1 [0014]