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Stand der Technik
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Bei konventionellen Laser-Scanning Mikroskopen (LSM) wird ein zweidimensionales Bild der Probe aufgenommen, indem ein Beleuchtungsstrahl punktweise über die Probe geführt wird. Die Ablenkung des Strahls erfolgt üblicherweise mittels beweglichen Scanspiegeln. Hierzu wird beispielhaft auf J. Pawley, „Handbook of biological confocal microscopy" verwiesen.
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Je nach gewünschter Bildgröße, Auflösung und Abtastung kann die Pixelanzahl des Bildes eingestellt werden. Ein häufiges Bildformat ist z. B. 512×512 Pixel.
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Die Größe des abgescannten Probenbereiches kann bei unveränderter Pixelzahl geändert werden, indem der maximale Scan-Winkel der Scannerspiegel geändert wird. Diese Veränderung des Abbildungsmaßstabes ist praktisch stufenlos möglich und wird als Zoom bezeichnet.
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Bei LSM mit Multispotanregung wird die Probe mit mehreren Strahlen gleichzeitig abgescannt. Dadurch kann eine Probe gegenüber der Aufnahme mit Einzelpunktanregung schneller abgescannt werden.
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In 6 ist beispielhaft eine Anordnung zur Multispotbestrahlung dargestellt.
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Folgende Bezugszeichen werden mit folgender Bedeutung verwendet:
- F:
- Faser
- KO:
- Faserkollimatorlinse
- Hft.
- Hauptfarbteiler des Mikroskops
- LA1 ... n>:
- Linsenarray aus n Einzellinsen
- L:
- Multispotlinse
- SC:
- Scanner
- SCO:
- Scanobjektiv
- ZB:
- Zwischenbild
- O:
- Mikroskopobjektiv
- DE:
- Detektionsstrahlengang
- PHO:
- Pinholeobjektiv
- PH:
- Einzelpinhole
- ZB1, ZB2:
- Zwischenbildebenen
- DE1 ... n:
- Detektorenarray aus n Einzeldetektoren
- PHA:
- Pinholearray
- MLAPH:
- Pinhole-Mikrolinsenarray
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Im Teil 6a) die Beleuchtungsrichtung in Richtung der Probe, im Teil 6b) die Detektionsrichtung des Detektierten Probenlichtes und im Teil 6c) ist der Strahlengang vor dem Detektor dargestellt.
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Das Beleuchtungslicht tritt aus einer Faser F divergent aus und gelangt, über einem Kollimator KO kollimiert, vom Hauptfarbteiler HFT des Mikroskops in Richtung der Probe reflektiert, auf ein Linsenarray LA.
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Die in einem Zwischenbild ZB1 vom LA erzeugten Beleuchtungsspots werden über die Multispotlinse L kollimiert und zur optischen Achse hin gebrochen und treffen sich bei telezentrischer Beleuchtung im rückwärtigen Brennpunkt von L in der der Scanner SC abgeordnet ist.
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Die im Zwischenbild ZB2 nach den Scanobjektiv SCO erzeugten Foki werden weiter über das nicht dargestellte Mikroskopobjektiv O auf die Probe abgebildet, wodurch durch den mindestens eindimensionalen Scanner die Beleuchtungspunkte auf der Probe bewegt werden.
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Das von der Probe kommende Licht gelangt über dieselben Elemente in Richtung der Detektion DE über ein Pinholeobjektiv und ein Pinhole zu Einzeldetektoren DE1–Den.
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Die nach dem Durchgang durch LA kollimierten Einzelstrahlen werden von dem Pinholeobjektiv in der Ebene eines Pinholes gebündelt, es ist also hier nur ein einziges Pinhole erforderlich.
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In der doppelten Brennweite des PHO liegen den einzelnen beleuchteten Probenpunkten entsprechende Detektoren DE1 ... n zur Detektion der auf der Probe erzeugten Fluoreszenzverteilung.
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Anstelle des Einzelpinholes PH kann auch in der Detektion durch ein hier nicht dargestelltes Array von Einzellinsen auf ein Pinholearray fokussiert werden dem wiederum ein Detektorenarray DE1 ... n nachgeordnet ist.
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Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang am HFT können auch vertauscht sein, so dass das Beleuchtungslicht durch den HFT transmittiert in Richtung der Probe gelangt und der HFT das Probenlicht in Richtung der Detektion ausspiegelt.
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Die Spots sind in der Regel so angeordnet, dass jeder Spot einen Teilbereich des Bildes abscannt, wobei der Abstand der Spots in der Probenebene fest vorgegeben ist. In Bild 1 ist beispielhaft ein Feld von 32×32 Pixeln dargestellt, das von 4 Spots abgescannt wurde. Jeder Spot scannt ein Viertel des Bildfeldes ab und die 4 Teilbilder werden zu einem Gesamtbild zusammengesetzt. Bei vorgegebener Zeilenanzahl des Bildes ergibt sich der geometrische Abstand der Zeilen in der Probenebene aus der Bedingung, dass die Teilbilder benachbarter Spots nach Abschluss des Scanvorgangs direkt aneinander anschließen müssen. Das Feld, bei dem jeder Spot ein gleich großes Teilfeld überstreicht, so dass das gesamte Feld aus N Teilfeldern (bei N Spots) zusammengesetzt wird, wird als Feld der maximalen Vergrößerung bezeichnet.
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Wird nun versucht auf herkömmliche Weise durch Änderung des maximalen Scanwinkels zu zoomen, verändert sich zwar die Feldgröße in Richtung der schnellen Scanachse, aber der Abstand der Spots bleibt unverändert, so dass ein gleichmäßiges Abscannen des Feldes, bei dem die Teilbilder aller Spots gleichgroß sind und einander anstoßen, nur bei bestimmten Feldgrößen möglich ist. Besonders problematisch ist ein Zoom, wenn die Pixelzahl des Bildes (z. B. 512×512 Pixel) vorgegeben ist.
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US 7385165 B2 beschreibt eine Technik, die ein Zoomen nur in wenigen, sehr groben Stufen erlaubt.
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Es werden Felder abgescannt, deren Größe ein ganzzahliges Vielfaches der Feldgröße bei maximaler Vergrößerung ist, wobei sich zudem das ganzzahlige Vielfache als Potenz L
K zweier natürlicher Zahlen, mit L > 1, darstellen lässt. Wird das abgescannte Feld um das L
K-fache vergrößert, verringert sich die Zahl der Zeilen pro Spot und Teilbild ebenfalls um das L
K-fache. Das wirkt auf die Anzahl von wählbaren Zoomstufen sehr stark einschränkend. Mit den Randbedingungen, dass die Spots einen minimalen Abstand nicht unterschreiten können, damit deren erzeugte Fluoreszenzsignale auf dem Detektor nicht ineinander übersprechen und dass jedes Mikroskop nur ein maximales Feld zu übertragen vermag, ergeben sich für L = 2 gerade mal 5 verfügbare Zoomstufen mit den Faktoren 1, 2, 4, 8, 16 gegenüber der maximalen Vergrößerung. Bei L > 2 wird die Einschränkung des in
US 738565B2 beschriebenen Verfahrens noch offensichtlicher. Zudem ist gemäß dieser Methode ausgehend von der sogenannten „maximalen Vergrößerung” nur ein Wechsel zu kleineren Vergrößerungen möglich.
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In
US 6028306 wird ein Lichtarray in kleinen Regionen um die Scanspots eines Lichtarrays herum bewegt. Dies erschwert eine Zoomfunktion die über die Scanner realisiert werden soll.
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Aufgabe der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung soll es ermöglichen, die möglichen Zoomstufen bei vorgegebener Pixelauflösung feiner abzustufen. Bei typischen Pixelrastern (z. B. 512×512 Pixel) soll ein nahezu stetiges Zoomen möglich sein.
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Außerdem ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zoomen sowohl zu größeren, als auch zu kleineren Feldern zu ermöglichen.
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Erfinderische Lösung
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Im Folgenden werden folgende Begriffe näher definiert um eine eindeutige Verwendung zu ermöglichen:
Spots bzw. Lichtspots S1–SN: Sind Beleuchtungspunkte auf der Probe die von N fokussierten Laserstrahlen bzw. einem in N Teile aufgeteilten Laserstrahl gleichzeitig erzeugt werden.
Spotabstand d: Abstand zwischen den benachbarten Beleuchtungsspots auf der Probe.
Pixel oder Bildpixel: P1-M, P1-M1: Sind von der Detektionseinheit einem Bildpunkt zugeordnete Detektionswerte.
Sie werden rasterartig aufgezeichnet, d. h. bei kontinuierlicher Scanbewegung erfolgt eine getaktete Detektion, so dass rasterförmig Werte detektiert werden, die einem punktartigen Probenbereich entsprechen.
Der Pixelabstand: Ist in der Regel der Abstand der Mitten zweier detektierter Pixel.
Das Scanfeld F entspricht einem aufzuzeichnenden Bild einer Probe, das optisch durch die Scannerbewegung überstrichen wird.
Das Scanfeld oder Bildfeld ist durch die verwendete Mikroskopoptik in seiner Ausdehnung begrenzt.
Rastergebiet: Ist ein Teilgebiet des Scanfeldes, das durch einen der Beleuchtungsspots abgerastert wird, wobei die abgerasterten Bildpunkte detektiert und abgespeichert werden können.
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Die beschriebene Lösung beschreibt eine Methode, die es bei einem Multispot-LSM ermöglicht, bei vorgegebenen Scanfeldgrößen eine fein abgestufte Zoomfunktion zu ermöglichen.
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Die Erfindung wird nachstehend anhand der schematischen Darstellungen näher erläutert.
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Die erfinderische Lösung erfolgt mit einem Multispot-LSM mit N Spots, S1 bis SN. Die Spots liegen beispielsweise in Y-Richtung und haben voneinander vorzugsweise den gleichen Abstand d. Der schnelle Scan über die Probe erfolgt beispielsweise in X-Richtung.
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Es sei ein Scanfeld F wie in 1 vorgegeben, das eine vorgegebene Anzahl von Pixeln enthalten soll, beispielsweise 32×32 = 1024 in 1.
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Wird nun der (durch die Mikroskopanordnung) vorgegebene Spotabstand d auf der Probe in k (ganzzahlige) gleiche Teile unterteilt, und der Scan in X und Y erfolgt in diesem Raster, das heißt in Schritten 1 bis k, so ist nach k Zeilen in Y Richtungen Bereich bis zu einem Punkt PM in Y Richtung von M = N × k Zeilen abgescannt. Werden auch in X-Richtung M1 Punkte bis zu einem Punkt Pm1 gescannt, so ergibt sich ein gescannter Bereich von M×m1 Pixeln. Jeder Einzelspot hat einen Bereich von m1×K Pixeln gescannt und die Zusammensetzung der N Einzelbilder ergibt das gesamte Feld von M×m1 Pixeln.
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Soll nun das abgescannte Feld F2 bei gleicher Pixelanzahl M×m1 wie in 3 vergrößert werden, so kann das geschehen, indem der Spot-Abstand (ganzzahlig) in L Teile unterteilt wird, wobei nun L < K und L >= 1 ist.
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Nach L Zeilen ist ein Bereich von N (Spotanzahl) × L (Unterteilung Spotabstand) Zeilen abgescannt.
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Bis zur Zeile M fehlen dann noch (K – L) × N Zeilen.
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Diese Zeilen werden vorteilhaft gescannt, indem der Zeilenscan um L × (N – 1) + 1 Zeilen versetzt weitergeführt wird (3). Diese Vorgehensweise wird so oft wiederholt, bis alle M Zeilen abgescannt wurden. Dabei kann es sein, dass beim letzten Bereich nicht mehr alle Spots benötigt werden. Dies kann durch Abschaltung in der Beleuchtung oder detektionsseitig anhand des detektierten Punktrasters korrigiert werden.
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Im Ergebnis dieser Vorgehensweise ergibt sich ein Bild mit wiederum M×m1 Pixeln, das aber vorteilhaft um den Faktor K/L größer ist.
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Ebenso kann das abgescannte Feld bei gleicher Pixelanzahl M×m1 verkleinert werden, indem der Spot-Abstand in P (ganzzahlig) Teile unterteilt wird, wobei P > K ist. (2). Nach P Zeilen wäre bereits ein Bereich abgescannt, der um (P – K) × N Zeilen größer ist als der gewünschte Bereich von M Zeilen. Deshalb werden wie oben erwähnt nicht alle Daten aller Spots für die Bilddarstellung verwendet.
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Im Ergebnis dieser Vorgehensweise ergibt sich ein Bild mit M×m1 Pixeln, das um den Faktor P/K kleiner ist.
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Wenn n Laserspots im Scanfeld entlang der langsamen Scanachse in der Probenebene jeweils im Abstand d zueinander angeordnet sind und
sich der Abstand der gescannten Zeilen in der Probenebene zu a = d/K mit K ∈ N ergibt,
erfolgt die Variation der Größe des Scanfeldes vorteilhaft durch Variation von K und nach dem Scannen von K Zeilen erfolgt erfindungsgemäß ein vertikaler Sprung derart, dass die gescannten Teilbilder aneinander anschließen, vorzugsweise durch einen Sprung um (n – 1) × K + 1 Zeilen in Scanrichtung oder (n + 1) × K – 1 Zeilen gegen Scanrichtung, bis mindestens Y Zeilen gescannt wurden.
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Die erfinderische Lösung soll auch an einem Beispiel erläutert werden:
Bild 1 zeigt ein Scanfeld F von 32×32 Pixeln, das hier mit 4 Spots S1–S4 abgescannt wurde. Die Pixel jedes Spots wurden wegen der Anschaulichkeit als zueinander jeweils unterschiedlich gefüllte Kreise (dunkel und hell) dargestellt.
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Die Scanbewegung zwischen den Anfangspunkten P1–PM der horizontalen Scanbewegung ist schematisch in 4 durch Bewegungslinien dargestellt. Der Scan erfolgt in 1 beispielsweise so, dass der Abstand zwischen zwei benachbarten Pixeln ein Achtel des Spotabstandes beträgt. So ist nach 8 Zeilenscans das gesamte Bildfeld abgescannt. Jeder Spot hat ein Feld von 8×32 Pixeln abgescannt und das gesamte Feld wird aus den 4 Rastergebieten zusammengesetzt, so dass eine Aufnahme des Bildfeldes F mit 1024 Pixeln Auflösung erfolgt.
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In 1a ist ausschnittsweise der linke Teil von 1 vergrößert dargestellt.
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Die jeweiligen Anfangspunkte des Spots S1 in Y bei Verschiebung der X Zeile in vertikaler Richtung sind P1–Pk, in einem Abstand d/k zueinander.
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Analog haben die Spots S2–S4 die Anfangspunkte P2–P2k, P3–P3k, P4–P4k jeweils im Abstand d/k zueinander.
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Im Bild 3 ist dargestellt, wie ein gegenüber F in 1 größeres Feld F2 ebenfalls mit 32×32 Pixeln abgescannt werden kann. Der Pixelabstand beträgt hier z. B. ein Fünftel des Spotabstandes. Nach 5 Zeilenscans sind also von S1–S4 20 Zeilen abgescannt. Nun muss für S1–S3 ein Sprung in Y-Richtung um 15 Pixel in die Anfangspositionen der Zeilen S1.1, S2.1, S3.1 erfolgen. Anschließend werden die restlichen Zeilen gescannt. Dazu sind noch einmal 5 Zeilenscans notwendig, wobei nicht die Daten aller Einzelspots zur Darstellung des Feldes benötigt werden. Vom ersten und zweiten Spot werden alle Zeilen benötigt, vom dritten Spot nur die ersten beiden Zeilen und die Daten des letzten Spots werden gar nicht benötigt. Aus der Zusammensetzung der Einzelfelder ergibt sich wieder das gesamte Feld. Das Feld ist 1,6 mal so groß wie das in Bild 1 dargestellte.
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Dabei ist es vorteilhaft, wenn sich die Einzelspots einzeln abschalten lassen. Dadurch wird es möglich, eine unnötige Belichtung dieser Objektbereiche zu vermeiden.
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In Bild 2 ist dargestellt, wie erfindungsgemäß ein gegenüber F kleineres Feld F1 ebenso mit 32×32 Pixeln abgescannt werden kann. Der Pixelabstand beträgt hier ein Zehntel des Spotabstandes. Nach 10 Zeilenscans sind 40 Zeilen abgescannt, also schon 8 mehr als benötigt. Die Teilbereiche werden wieder zum Gesamtbereich zusammengesetzt, wobei vom vierten Einzelspot nur die ersten beiden Zeilen benötigt werden. Ab der dritten Zeile kann der vierte Einzelspot abgeschaltet werden. Die erreichte Feldgröße ist um den Faktor 0.8 kleiner als das Feld in Bild 1.
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Je nach Feldgröße und Spotanzahl lässt sich auf die beschriebene Weise vorteilhaft eine unterschiedlich feine Abstufung der Feldgrößen und damit der Vergrößerung erreichen.
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In Tabelle 5 ist die Abstufung der Feldgrößen am Beispiel von 512×512 Pixeln und 4 Einzelspots dargestellt.
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Wählt man den Pixelabstand als 1/128 des Spotabstandes, so ist nach 128 Zeilenscans das gesamte Feld abgescannt. Jeder Einzelspot hat einen Teilbereich von 128×512 Pixeln abgescannt. Auf diese Feldgröße wurden alle anderen Feldgrößen bezogen. Sie beträgt also 100%. Der Scan des gesamten Feldes konnte durch einen abgeschlossenen Scan aller 4 Einzelspots erfolgen.
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In der Tabelle ist für einige mögliche Zeilenabstände dargestellt, wie viele Scanbereiche notwendig sind, um das gesamte Feld mit 512×512 Pixeln abzuscannen. In der dritten Zeile ist dargestellt, wie sich die Feldgröße relativ verändert.
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Im Bereich sehr kleiner Felder erfolgt der Scan nur noch mit 3 oder 2 Einzelspots. Ab 512 Zeilen-Bereichen erfolgt nur noch ein Einzelspotscan.
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Im üblichen Zoombereich ergibt sich eine fast steige Unterteilung der Vergrößerungsstufen, also ein praktisch kontinuierlicher Zoom.
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Dies kann vorteilhaft zur Erhöhung der Flexibilität auch noch durch Variation eines optischen Zooms im Beleuchtungsstrahlengang des LSM oder durch (einstellbare oder auswechselbar gestaltete) Veränderung der Spotabstände des Beleuchtungsrasters ergänzt werden.
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Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in 7 dargestellt.
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Die Darstellung beruht auf der 3 und der zugehörigen Beschreibung (F2 grösser F). Allerdings ist hier ein durch > Linien eingegrenzter Überlappungsbereich OL von (beispielhaft) zwei Zeilen vorgesehen der sowohl vom vierten Spot (S4) als auch anschließend vom ersten Spot (S1.1) abgetastet wird. Vorteilhaft aber nicht notwendig besteht der Überlappungsbereich aus einer ganzzahligen Anzahl von Zeilen.
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Um eine unnötig hohe Probenbelastung im Bereich OL zu vermeiden wird im Überlappungsbereich durch geeignete Mittel wie beispielsweise einem AOTF die Beleuchtungsintensität der betreffenden Punkte herabgesetzt, zweckmäßig beispielsweise auf jeweils 50%, um die Gesamt-Probenbelastung konstant zu halten.
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Wie dargestellt besteht hier der Scanbereich S3.1 im Gegensatz zur 3 aus vier Zeilen so dass die Gesamtzahl der pro Bild abgetasteten Pixel vorteilhaft konstant ist, hier wiederum 1034 Bildpunkte.
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Der Zweck des dargestellten Überlappungsbereiches OL besteht darin, eine perfekte Bildüberdeckung der von den einzelnen Spots (hier S1–S4) abgetasteten Bereiche zu einem Gesamtbild zu gewährleisten.
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Im Überlappungsbereich OL erfolgt zu diesem Zweck beispielsweise für die beteiligten beiden Spots eine Strukturanalyse der aufgenommenen Probenmerkmale (wie Kontrastkanten) und mit den bekannten Mitteln der Bildbearbeitung und Korrelationsanalyse eine genaue Zusammensetzung der von den einzelnen Spots aufgenommenen Bildteile zu einem „nahtlosen” Gesamtbild.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 7385165 B2 [0018]
- US 738565 B2 [0019]
- US 6028306 [0020]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- J. Pawley, „Handbook of biological confocal microscopy” [0001]
