DE102012016830B4

DE102012016830B4 - Präparationsvorrichtung für massenspektrometrische Proben

Info

Publication number: DE102012016830B4
Application number: DE102012016830.6A
Authority: DE
Inventors: Alexander Voßgröne
Original assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2021-08-26
Anticipated expiration: 2032-08-25
Also published as: CN203672846U; EP2700930B1; DE102012016830A1; US9121794B2; ES2946173T3; EP2700930A2; EP2700930A3; US20140056782A1

Abstract

Vorrichtung mit einem Dispenser zum Dispensieren von Flüssigkeiten auf Probenorte eines Probenträgers, der sich auf einem Tisch befindet, wobei Proben für eine Ionisierung in einem Massenspektrometer zu präparieren sind, dadurch gekennzeichnet, dass Dispenser und Probenträgertisch durch Antriebe mit Drehbewegungen um zwei exzentrische Achsen relativ zueinander positioniert werden, wobei die Drehbewegungen so ausgeführt werden, dass jeder Probenort auf dem Probenträger unter den Dispenser positioniert werden kann.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Vorrichtungen für die Präparation einer Vielzahl von Probenorten auf massenspektrometrischen Probenträgern, wobei Proben mit Flüssigkeiten so präpariert werden sollen, dass sie für eine Ionisierung in einem Massenspektrometer geeignet sind, beispielsweise für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI)
In der Erfindung wird vorgeschlagen, die Positionierung von Dispenser und Probenorten zueinander durch zwei Drehungen um zwei exzentrische Achsen vorzunehmen. Es kann beispielsweise der Dispenser an einem schwenkbaren Arm über die Probenorte auf einem ebenfalls schwenkbaren Probenträgertisch geführt werden, oder, bei feststehendem Dispenser, die Probenorte auf dem Probenträger mit einem gekoppelten Bewegungssystem mit zwei exzentrischen Drehungen unter den Dispenser. Für die Präparation wird wegen der verwendeten Säuren und aggressiven Lösungsmittel, die auf den Proben eindampfen müssen, vorzugsweise eine geschlossene Kammer mit Luftkreislauf, Filter, Dispenser und Aufnahmetisch für den Probenträger verwendet. Da die aggressiven Dämpfe sowohl Motoren wie auch komplizierte Kreuzschienen von XY-Verschiebetischen für die Bewegung der Probenträger sehr schnell zerstören würden, werden die Antriebe zur Positionierung von Dispenser und Probenträger zueinander bevorzugt außerhalb der Kammer gehalten.
Stand der Technik
Die Präparation von Proben für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) verlangt den Einsatz aggressiver organischer Lösungsmittel zum Aufbringen der Lösung mit Matrixmaterial auf die einzelnen Analysenproben, die manuell oder mit Pipettierautomaten auf den Probenträger aufgebracht wurden. Das Lösungsmittel muss anschließend verdampft werden, um Kristalle der Matrixsubstanz wachsen zu lassen, in die die Analytsubstanzen eingebaut werden. Da die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) weithin bekannt ist, werde hier auf eine Beschreibung verzichtet.
Für die massenspektrometrische Identifizierung von Mikrobenproben werden heutzutage in mikrobiologischen Laboratorien täglich viele Tausend Proben für eine Ionisierung durch matrixunterstütze Laserdesorption präpariert. Da nur die Substanzen aus dem Inneren der Mikroben für die massenspektrometrische Identifizierung brauchbar sind, müssen zunächst die Zellen der Mikroben aufgeschlossen werden. Das geschieht häufig ebenfalls auf dem Probenträger. Es werden dafür zunächst kleine, kaum sichtbare Mengen von etwa 10⁵ bis 10⁷ Mikroben aus Kolonien auf AgarPlatten auf die Probenorte des Probenträgers aufgebracht. Für den Zellaufschluss der Mikroben werden üblicherweise scharfe Säuren verwendet, die anschließend durch Verdampfen eintrocknen müssen. Im Gebrauch sind dafür 70-prozentige Ameisensäure (Siedepunkt 101°C; Dampfdruck 43 hPa bei 20°C) oder auch Trifluor-Essigsäure ähnlicher Konzentration (TFA; Siedepunkt 72°C; Dampfdruck 110 hPa bei 20°C). Es werden auf jede Probe Mengen von jeweils etwa einem Mikroliter aufgebracht; nach fast vollständigem Eintrocknen wird dann die Matrixlösung aufgebracht, ebenfalls in Mengen von etwa einem Mikroliter. Die Matrixlösung enthält meist eine feste organische Säure (meist α-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure, HCCA, aber beispielsweise auch 2,5-Dihydroxybenzoesäure, DHB) in einem Lösungsmittelgemisch aus Acetontril und Alkoholen, aus Gefährdungsgründen meist Ethanol, obwohl Methanol eine bessere Alternative wäre. Die Matrixlösung dringt durch die geschwächten Zellwände in die Mikroben ein, lässt sie platzen und bringt die löslichen Inhaltsstoffe in Lösung. Die Identifizierung der Mikroben wird dann anhand eines Massenspektrums der Inhaltsstoffe vorgenommen.
Die Probenträger haben meist die Größe von Mikrotiter-Platten (oder einen Bruchteil davon) und tragen heute meist 96 oder 384 sichtbare Probenorte für das Aufbringen und Präparieren der Proben. Es sind auch Probenträger mit 1536 Probenorten in Gebrauch. Die Probenorte mit Durchmessern von 0,8 bis 2,0 Millimetern können durch eingefräste Ringe markiert sein, wobei die Fräskanten ein Wegfließen der aufgebrachten Säuren und Lösungsmittel verhindern; die Probenorte können aber auch als hydrophile Flächen in hydrophober Umgebung ausgebildet sein.
Die Präparation wird heute weitgehend noch manuell mit Dosierpipetten ohne Abzug vorgenommen, da Abzüge in mikrobiologischen Laboratorien selten sind. Das kann bei mangelnder Belüftung gesundheitsschädlich sein. Selbst wenn ein Abzug vorhanden ist, wird die Benutzung des Abzugs oft unterlassen, weil das Pipettieren unter einem offenen Abzug sehr unbequem ist. Es besteht somit seit langem ein Bedarf für eine Vorrichtung zur automatischen Präparation, die das Aufbringen der Säuren und der Matrixlösungen erleichtert, keine schädlichen Dämpfe abgibt und möglichst auch ohne Abzug auskommt.
Die Flüssigkeitsmengen von etwa einem Mikroliter tropfen von der Pipettenspitze nicht selbständig ab, sondern müssen nach bisheriger Technik durch Berührung auf die Probe aufgetragen werden. Um Probenübertragungen zu vermeiden, muss für jede Probe eine neue Pipettenspitze verwendet werden. Besonders günstig wäre daher ein berührungsloses Aufbringen der Flüssigkeiten auf die Proben, da dann nicht immer wieder neue Pipettenspitzen benötigt werden.
Für ein berührungsloses Aufbringen ist es günstig, den Dispenser genau vertikal über die Probenorte zu bringen. Für eine automatische Präparation müssen somit Bewegungsvorrichtungen vorhanden sein, die Dispenser und Probenorte präzise untereinander bringen können. Da die verdampfenden Säuren und Lösungsmittel aber Oberflächen angreifen, insbesondere metallische Oberflächen in schleifendem Kontakt, kommen die üblichen Kreuzschlitten mit Antriebsbewegungen durch Schrittmotoren und Gewinde (wie bei einem X-Y-Verschiebetisch) nicht infrage.
In dieser Offenbarung wird auf die Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption (MALDI) Bezug genommen, bei der Ionen während der Desorption durch gepulste Laserstrahlen entstehen. Es versteht sich jedoch, dass auch Probenpräparationen möglich sein sollen, bei denen die Analytsubstanzen in den präparierten Proben unabhängig von ihrer Ionisierung in die Gasphase überführt werden können. Die Art der Ionisierung kann je nach Anwendung frei gewählt werden. Es kann beispielsweise auch eine einfache Laserdesorption in Kombination mit einer chemischen Ionisierung durchgeführt werden (LDCI) oder eine direkte Elektrosprüh-Ionisierung von der Oberfläche herunter (DESI). Aber auch andere Ionisierungsarten können Anwendung finden. Entsprechend ist der Begriff „Ionisierung mit matrix-unterstützter Laserdesorption“ nicht als Beschränkung zu verstehen.
Weiterhin ist in dieser Offenbarung gelegentlich davon die Rede, einen Tropfen auf eine Probe aufzubringen. Es versteht sich von selbst, dass der dispensierte Tropfen auch auf einen unbelegten Probenort des Probenträgers aufgebracht werden kann, beispielsweise als Vorbereitungsschritt zum nachfolgenden Belegen mit einer Mikrobenprobe. Auch derartige Ausführungen sind demnach keinesfalls als beschränkend anzusehen.
Das Patent US 6,323,035 B1 offenbart Systeme, Vorrichtungen und Verfahren zum Manipulieren und Handhaben von Mikrotitrationsplatten. Zum Stand der Technik gehören ebenfalls die Patentveröffentlichungen US 2002/0090320 A1 , US 5,944,476 A , DE 100 84 419 T5 , US 2004/0163670 A1 , US 2009/0180931 A1 und US 2012/0079875 A1 .
Aufgabe der Erfindung
Es ist eine Vorrichtung bereitzustellen, die die Probenorte auf massenspektrometrischen Probenträgern automatisch mit Flüssigkeiten für eine Ionisierung von Proben präparieren kann, beispielsweise für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption, und bei der der Einfluss freiwerdender Dämpfe auf die Bewegungsvorrichtungen verringert ist. Vorzugsweise ist die Vorrichtung so zu gestalten, dass auch die Benutzer nicht durch freiwerdende Dämpfe gefährdet werden können.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung ist durch eine spezielle Ausgestaltung der Positioniervorrichtungen gekennzeichnet, die ohne lineare Schiebebewegungen und damit ohne Gleitschienen, Gewinde oder andere korrosionsanfällige Elemente mit vergleichsweise großen und empfindlichen Oberflächen auskommt. Es kann beispielsweise durch einen ersten Antrieb ein Dispenser an einem schwenkbaren Arm über jeden Probenort auf einem durch einen zweiten Antrieb geschwenkten Probenträgertisch geführt werden, oder es kann, bei feststehendem Dispenser, jeder Probenort des Probenträgers mit einem gekoppelten Bewegungssystem mit zwei exzentrischen Drehungen unter den Dispenser bewegt werden. Techniken zum Auftragen der Flüssigkeitsmengen auf die Probenorte mit Dispensern, die sich senkrecht über den Probenorten befinden und berührungslos arbeiten, sind im Prinzip bekannt und können hier verwendet werden. Der Raum für die Präparation der Probenorte ist bevorzugt von dem Raum mit den elektromechanischen Antrieben (Antriebsmotoren) für die gegenseitige Positionierung von Dispenser und Probenorten zu trennen, beispielsweise durch eine Kammerwand oder eine sonstige Abschirmung, und die Kräfte, die zur Positionierung von Dispensern zu Probenorten notwendig sind, können mit Wellen durch abgedichtete Öffnungen der Kammerwand oder sonstigen Abschirmung in den Raum, in dem die Präparation erfolgt, übertragen werden.
Es können in diesem System auch mehrere Dispenser für mehrere verschiedenartige Flüssigkeiten vorhanden sein. Des Weiteren können Sensoren vorhanden sein, die ein korrektes Aufbringen der Flüssigkeiten überwachen können. Es können damit Probenorte für das spätere Aufbringen von Proben präpariert werden, insbesondere aber können Proben präpariert werden, die schon auf Probenorte aufgebracht wurden. Die Proben können einfache chemische Analytproben sein, insbesondere aber kleine Mengen von Mikroben, die massenspektrometrisch identifiziert werden sollen. Die Mikrobenzellen müssen für diese Identifizierung aufgeschlossen werden und benötigen dazu eine besondere Präparation mit scharfen Säuren. Mit Hilfsvorrichtungen kann jeder Dispenser bei Störungen, beispielsweise durch Auskristallisation von Matrixsubstanz, automatsch gewaschen werden, wobei die Reinigungsflüssigkeit entsorgt wird. Wird eine Kammer als Präparationsraum verwendet, ist sie zweckmäßigerweise mit Filtern und einem Luftkreislauf zum kontrollierten Trocknen der Flüssigkeiten auf den Probenorten versehen. Sie braucht dann nicht in einem Abzug zu stehen, und Gefährdungen des Benutzers sind vermieden.
Die Präparationsvorrichtung gemäß der Erfindung spart gegenüber manueller Präparation Zeit und Material ein. In der medizinischen Diagnostik ist der Zeitfaktor für die Identifizierung von Mikroben besonders wichtig, da er Leben retten und Kranksein verkürzen kann. Es können aber auch gegenüber der heute noch recht primitiven Präparation der Proben, insbesondere der Mikroben, intelligentere Verfahren eingesetzt werden, die es beispielsweise erlauben, durch bessere Präparationsverfahren gute Massenspektren von nur 10³ statt 10⁵ Mikroben zu erhalten, wodurch trotz länger dauernder Präparation sehr viel mehr Zeit bei der Kultivierung eingespart werden könnte.
Abbildungen
Die zeigt einerseits einen Schwenkarm (02) mit Dispenser (03), der sich um die Achse (01) längs des Teilkreises (04) drehen lässt. Andererseits zeigt die Abbildung einen Probenträgertisch (06), weitgehend verdeckt durch einen aufgelegtem Probenträger (22), der sich um die Achse (05) so drehen lässt, dass in Verbindung mit einer Drehung des Schwenkarms für den Dispenser jeder Probenort (dunkle Punkte) auf dem Probenträger (22) unter den Dispenser (03) positioniert werden kann. Der Probenträgertisch in Position (07) zeigt den Minimalabstand an, der zwischen den beiden Drehachsen (01) und (05) erforderlich ist, wenn beide Drehungen von unten durch eine Kammerwand geführt werden sollen.
Die bis zeigen, wie mit zwei exzentrischen Drehtischen (20) und (10) ein beliebig gewählter Probenort (24) auf dem Probenträger (22) unter einen feststehenden Dispenser (50) gebracht werden kann. Aus der Ausgangslage in wird zunächst der erste, kleine Drehtisch (20), wie in gezeigt, um den Winkel φ₂₀ so weit gedreht, dass der ausgewählte Probenort (24) auf den gestrichelten Kreis (26) zu liegen kommt. Dieser gestrichelte Kreis (26) ist zur Achse des zweiten, großen Drehtischs (10) konzentrisch angeordnet und kennzeichnet den Abstand des Dispensers (50) von der Drehachse des großen Drehtischs (10). Durch eine Drehung des zweiten, großen Drehtischs (10) unter Mitnahme des ersten, kleinen Drehtischs um den Winkel φ₁₀ ( ) kann jetzt der Probenort (24) unter den Dispenser (50) gedreht werden.
gibt schematisch ein Beispiel für einen möglichen Aufbau einer Kammer (70) wieder, in der sich ein fest installierter Dispenser (50) mit konzentrischen Kapillaren (52) befindet, mit dem sich durch einen Druckstoß eines Gases ein hängender Tropfen (60) berührungslos auf einen beliebig ausgewählten Probenort bringen lässt. Wie in den vorherigen bis gezeigt, lässt sich jeder Probenort des Probenträgers (22) durch Drehungen der Drehtische (10) und (20) genau unter den Präparationsdispenser (50) bringen. Die Drehungen der Drehtische (10) und (20) werden durch die Motoren (14) und (28) bewirkt, beispielsweise Schrittmotoren mit eingebautem Untersetzungsgetriebe. Die Wellen zur Übertragung der Drehmomente sind durch die Dichtringe (16) und (30) abgedichtet und so gelagert, dass sich die Drehtische frei und ohne Reibung (mit Ausnahme der Reibung in den Dichtungen) bewegen können. Die Anordnung enthält außerdem zwei Abfalltrichter (54) und (56) in den Drehtischen (20) und (10), die übereinanderstehen, wenn die beiden Drehtische in einer Ausgangsstellung stehen, wie sie zum Beispiel in gezeigt wird. Die beiden Abfalltrichter (54) und (56) sind so geformt, dass die Spülflüssigkeit sofort in den nächsten Trichter tropft oder rinnt, ohne sie in den Spalt zwischen den beiden Drehtischen gelangen zu lassen. Unter dem Drehtisch (10) ist ein Abfallbehälter (58) befestigt. Diese Anordnung dient dem Ausspülen und Reinigen des Dispensers, wenn dieser beispielsweise durch auskristallisiertes Matrixmaterial in seiner Funktion beeinträchtigt wird.
gibt schematisch einen etwas anderen Aufbau der Kammer mit der erfindungsgemäßen Positioniereinrichtung für Dispenser und Probenträgertisch wieder. Auch hier kann jeder Probenort des Probenträgers (22) durch Drehen des kleinen Drehtischs (20) und des großen Drehtischs (10) genau unter den Präparationsdispenser (50) gebracht werden. Die Drehung des großen Drehtischs (10) durch den Motor (14) wird hier über die relativ dünne Welle (12) direkt bewirkt, während die Drehung des kleinen Drehtischs (20) durch den Motor (28) mit eingebautem Untersetzungsgetriebe indirekt über die beiden Riemenantriebe (40/42) und (32/34) und die zur Welle (12) konzentrische Hohlwelle (38) mit Dichtring (36) bewirkt wird. Die Riemenantriebe können zur Erhöhung der Präzision auch durch Zahnräder ersetzt werden. Für die Zahnräder eignet sich am besten ein form- und lösungsmittelbeständiger, chemisch inerter Kunststoff wie beispielsweise Polyimid. Diese Anordnung besitzt in der Präparationskammer ein Riemen- oder Zahnradgetriebe, unterfällt aber wegen der ausschließlichen Drehantriebe dem Erfindungsgedanken.
Vorteilhafte Ausführungsformen
Die Erfindung ist durch eine spezielle Ausgestaltung der Positioniervorrichtungen für Dispenser und Probenträger gekennzeichnet, die sich in verschiedenen Ausführungsformen jeweils durch zwei exzentrische Drehbewegungen auszeichnet, wie sie besonders in den bis dargestellt sind. Die Positioniervorrichtung kann sich beispielsweise in einer hermetisch dichten Kammer mit Filtern und Luftkreislauf befinden. Techniken zum Auftragen der Flüssigkeitsmengen auf die Probenorte mit Dispensern, die sich senkrecht über den Probenorten befinden und berührungslos arbeiten, sind im Prinzip bekannt und können hier verwendet werden. Die Kräfte, die zur relativen Positionierung von Dispensern und Probenorten notwendig sind, können als Drehmomente mit Wellen durch abgedichtete Öffnungen in der Kammerwand, oder einer sonstigen Abschirmung, in den Raum der Präparation übertragen werden. Die Erfindung ist im Besonderen dadurch ausgezeichnet, dass sie ohne lineare Schiebebewegungen und damit ohne Gleitschienen, Gewinde oder andere großflächige, korrosionsanfällige Elemente in dem Präparationsraum auskommt.
Für das berührungslose Dispensieren der kleinen Flüssigkeitsmengen auf die Probenorte gibt es verschiedenartige technische Lösungen, wie beispielsweise Piezo-Dispenser. Besonders einfach und günstig ist, wie in einem Teil der zu ersehen, eine Dispensiereinheit (50), die zwei konzentrische Kapillaren (52) besitzt. Ein winzige Pumpe drückt einen Tropfen (60) von etwa einem Mikroliter aus der zentralen Kapillare heraus; ein kleiner Druckstoß von Luft oder einem anderen dazu geeigneten Gas aus der umgebenden Kapillare streift dann den hängenden Tropfen (60) von der zentralen Kapillare ab und lässt ihn auf den Probenort fallen. Der Druckstoß des Gases wie auch die Fallgeschwindigkeit des Tröpfchens müssen dabei so klein bleiben, dass der Tropfen nicht zerspritzt. Durch ein berührungsloses Aufbringen der Flüssigkeitstropfen werden für die Präparation keine auswechselbaren Pipettenspitzen mehr benötigt.
In einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist, wie in gezeigt, ein Dispenser (03) an einem schwenkbaren Arm (02) befestigt und kann über jeden Probenort eines Probenträgers (22), der sich auf einem ebenfalls schwenkbaren Probenträgertisch (06) befindet, geführt werden, indem beide Drehpositionen durch die Wellen (01) und (05) entsprechend eingestellt werden. Die Welle (01) für den Schwenkarm (02) kann von oben, die Welle (05) für den Probenträgertisch von unten in die Kammer geführt werden; es ist jedoch auch möglich, beide Wellen von unten zuzuführen. Die Flüssigkeiten und Gase, die für das Dispensieren benötigt werden, können beispielsweise durch Schläuche oder Röhrchen zugeführt werden, die durch eine hohl ausgeführte Welle (01) geleitet werden. Es können am Schwenkarm (02) auch mehrere Dispenser (03) verschiedenartige Flüssigkeiten und auch Sensoren für ein korrektes Aufbringen der Flüssigkeiten angebracht sein. Diese Ausführungsform der Erfindung ist besonders einfach.
In einer zweiten Ausführungsform wird, wie in gezeigt, mit feststehendem Dispenser (50) gearbeitet und es werden nur die Probenorte auf dem Probenträger (22) mit einem einfachen Bewegungssystem mit zwei exzentrischen Drehungen unter den Dispenser (50) bewegt. Da die Bewegung des Probenträgers (22) ohne großen mechanischen und korrosionsanfälligen Aufwand bewirkt werden soll, befindet sich der Probenträger (22) auf einem Drehtisch (20), der exzentrisch auf oder in einem größeren Drehtisch (10) drehbar befestigt ist. Durch Drehungen der beiden Drehtische kann jeder beliebige Probenort des Probenträgers (22) unter den Präparationsdispenser (50) bewegt werden, wie in den bis dargelegt wird. Der Probenträger (22) kann dabei in den Drehtisch (20) eingelassen sein, um eine ebene Oberfläche für einen Strom trocknender Luft zu bieten. Die Kontur einer Ausnehmung im Drehtisch (20) ist dann vorzugsweise an die Abmessungen des Probenträgers (22) angepasst. Die Drehtische (10) und (20) werden durch Motoren (14) und (28) gedreht, wobei die Motoren Schrittmotoren sein können. Die Schrittmotoren können mit Untersetzungsgetrieben, Encoderscheiben und Endschaltern ausgerüstet sein.
Vorteilhaft an Ausführungsformen mit feststehendem Dispenser ist, dass dessen Flüssigkeits- und Gaszuleitungen kurz gehalten werden können. Folglich werden zur Füllung der Zuleitungen keine großen Flüssigkeitsmengen benötigt, was im Besonderen Ausspül- und Reinigungsarbeiten erleichtert. Überdies wird durch die geringen Abmessungen Druckabfällen im Gas, die dazu führen könnten, dass ein Gasdruckstoß zum Abstreifen eines Tröpfchens von der Kapillare nicht ausreichend stark ist, vorgebeugt. Ferner kann mit feststehendem Dispenser die Dosierung des Tröpfchens durch Auspressen aus der Dispenserkapillare schon während der Bewegung der Drehtische erfolgen. Die Gefahr eines vorzeitigen Abschütteins des Tröpfchens durch Abbremsen der Drehbewegung oder die Gefahr von Pendelbewegungen des Tröpfchens, die ein gezieltes Abstreifen erschweren könnten oder eine Abklingzeit erfordern würden, sind bei dieser Ausgestaltung nicht mehr gegeben.
In den bis wird schematisch gezeigt, wie mit den beiden Drehtischen (10) und (20) ein beliebig ausgewählter Probenort (24) auf dem Probenträger (22) unter den Dispenser (50) gebracht werden kann. Aus der Ausgangslage in wird zunächst der kleine Drehtisch (20) um den Winkel φ₂₀ so weit gedreht, dass der Probenort (24) auf den gestrichelten Kreis (26) zu liegen kommt. Dieser gestrichelte Kreis (26) ist zum großen Drehtisch (10) konzentrisch angeordnet. Durch eine Drehung des großen Drehtischs (10) um den Winkel φ₁₀ unter Mitnahme des kleinen Drehtischs (20) kann jetzt der Probenort (24) unter den Dispenser (50) gedreht werden. Da die Geometrie der Anordnung genau bekannt ist, lassen sich die benötigten Drehwinkel φ₂₀ und φ₁₀ von einem Steuerprogramm leicht mathematisch berechnen. Besonders einfach werden diese Berechnungen, wenn der Radius des gestrichelten Kreises (26), der den Abstand des Dispensers (50) von der Achse des großen Drehtischs (10) angibt, gerade dem Abstand der Achsen der beiden Drehtische entspricht. Der Durchmesser des Kreises (26) muss mindestens so groß sein, wie der halbe größte Abstand der Probenorte auf dem Probenträger (22) voneinander. Die Berechnungen der absoluten Drehwinkel φ₂₀ und φ₁₀ für alle Probenorte, gerechnet von der Grundstellung aus, oder relativen Drehwinkel, gerechnet vom letztangefahrenen Probenort aus, können auch ein einziges Mal durchgeführt und dann in einer Tabelle gespeichert werden. Um Zeit zu sparen, können die beiden Drehbewegungen selbstverständlich gleichzeitig, oder zumindest teilweise zeitlich überlappend, erfolgen.
Die Drehbewegungen der beiden Drehtische können begrenzt sein, beispielsweise auf etwa plus-minus 180° oder etwas weniger. Es können dann für diese Begrenzungen Endschalter eingebaut werden. Eine solche Begrenzung erlaubt es, auch elektrische Anschlüsse an sich drehende Teile wie beispielsweise den Schrittmotor (28) in ohne die Verwendung von Schleifkontakten heranzuführen.
Die Präzision, die für die Einstellung der Drehwinkel φ₂₀ und φ₁₀ erforderlich ist, lässt sich für eine vorgegebene Positionspräzision ebenfalls aus geometrischen Überlegungen berechnen. Die erforderliche Präzision bestimmt dann die Untersetzung der Getriebe an den Schrittmotoren (14) und (28), und die Schrittweite der Schrittmotoren. Um eine reproduzierbare Einstellung der Positionen ohne mechanische Hysterese zu gewährleisten, können die Drehbewegungen durch Federn in eine Richtung vorgespannt sein, oder es können die Bewegungen in eine Präparationsposition immer aus der gleichen Richtung angesteuert werden, notfalls durch ein erstes Überfahren der Zielposition und darauffolgendes Zurückstellen.
Der feststehende Dispenser (50) und die Bewegungsvorrichtung mit den zwei Drehtischen (10) und (20) befinden sich vorzugsweise in einer hermetisch abgeschlossenen Kammer (70), wobei sich Antriebsmotoren, Getriebe und Encoderscheiben außerhalb der Kammer befinden, um sie vor den aggressiven Dämpfen zu schützen. Für die Abdichtung der Wellen, die die Drehkräfte in das Innere der Kammer (70) übertragen, sind in der mögliche Anordnungen mit Dichtringen (16, 30) dargestellt. Die Dichtringe können beispielsweise als O-Ringe, besser aber als Simmerringe mit Dichtlippen ausgeführt sein. Die Durchführung für die „Welle“ des großen Drehtischs (10) mit Dichtring (16) muss allerdings sehr groß sein, daher sollte diese Abdichtung mit einer losen Dichtlippe ausgeführt sein, um die Drehbewegung nicht zu sehr zu behindern.
Es kann aber auch statt des Dichtrings (16) oder zusätzlich zum Dichtring (16) der Spalt zwischen dem großen Drehtisch (10) und dem Kammerboden so ausgeführt sein, dass er zumindest teilweise mit einem dünnflüssigen Öl extrem niedrigen Dampfdrucks gefüllt werden kann. Besonders geeignet ist handelsübliches Diffusionspumpenöl. Diffusionspumpenöl ist extrem oxidations- und alterungsbeständig und hat bei den verwendeten Temperaturen einen kaum messbaren Dampfdruck. Es wird im Spalt kapillar festgehalten und erleichtert durch seine Schmierungseigenschaften die Drehbewegung. Der Abstand im Spalt kann, wenn nötig, durch Gleitnoppen geringen Reibungswiderstandes aufrecht gehalten werden. Gleiches gilt für den Spalt zwischen dem großen Drehtisch (10) und dem kleinen Drehtisch (20). Das Öl dient insbesondere auch zur Abdichtung der Kammer, um ein Eindringen von ätzenden Dämpfen in den Raum mit den empfindlichen Motoren (14, 28) zu verhindern. Damit das Öl nicht aus den Spalten auslaufen kann, können diese in Randbezirken oliophob beschichtet sein, beispielsweise durch oliophobe Aminosäuren. Es ist aber auch möglich, die Spalte an den Rändern durch aufgeklebte Streifen eines Löschblatts oder durch dünnen Filz zu verschließen.
Es sei hier nur angemerkt, dass im Rahmen der Erfindung auch eine Ausführungsform möglich ist, bei der zwei exzentrische Drehtische, deren Wellen von oben in die Kammer reichen, einen an ihnen befestigten Dispenser über die Probenorte auf einem ortsfest aufgelegten Probenträger fahren könnte. Diese Ausführungsform wird hier aber nicht weiter dargelegt.
Es soll hier noch kurz eine weitere Ausführungsform beschrieben werden, die in dargestellt ist und schematisch einen etwas anderen Aufbau der Bewegungsvorrichtungen in der Präparationskammer wiedergibt. Auch hier kann jeder Probenort des Probenträgers (22) durch Drehen des kleinen Drehtischs (20) und des großen Drehtischs (10) genau unter den Präparationsdispenser (50) gebracht werden. Während aber die Drehung des großen Drehtischs (10) durch den Motor (14) über die relativ dünne Welle (12) direkt bewirkt wird, wird die Drehung des kleinen Drehtischs (20) durch den Motor (28) mit eingebautem Untersetzungsgetriebe indirekt über die beiden Riemenantriebe (40/42) und (32/34) und die zur Welle (12) konzentrische Hohlwelle (38) mit Dichtring (36) bewirkt. Die Riemenantriebe können zur Erhöhung der Präzision auch durch Zahnräder ersetzt werden. Für die Zahnräder in der Präparationskammer eignet sich am besten ein form- und lösungsmittelbeständiger, chemisch inerter Kunststoff wie beispielsweise Polyimid.
Zweckmäßigerweise sind in allen Ausführungsformen, die eine Kammer (70) als Präparationsraum aufweisen, optional ein Luftkreislauf und Filter vorgesehen (nicht gezeigt). Die Kammer kann dann als Teil eines Tischgeräts ausgeführt werden, das nicht in einem Abzug zu stehen braucht. Als Filter können beispielsweise einfache Kohlefilter in Standardgrößen verwendet werden. Die gefilterte und von Lösungsmitteln, Säuren und überschüssiger Feuchte gereinigte Luft wird dann so wieder zugeführt, dass sie langsam über die Oberfläche des Probenträgers streicht, um Proben trocknen zu können. Auch die Luftfeuchtigkeit der Umluft kann geregelt werden. Die Kammer kann mit einem Deckel versehen sein, der sich manuell öffnen lässt, um die Probenträger auszuwechseln. Aus sicherheitstechnischen Gründen sollte der Deckel automatisch zufallen, wenn man ihn loslässt. Der Deckel dient dann auch als sicherheitstechnischer Explosionsschutz: Im Fall einer Explosion des Gemischs aus Lösungsmittel und Luft hebt sich der Deckel ein wenig an und lässt die Explosionsgase entweichen; eine Zerstörung der Kammer wird dadurch vermieden.
Für ein schnelleres Verdampfen der Flüssigkeiten ist es zweckmäßig, den Probenträgertisch (06), den Drehtisch (10), zusätzlich oder alternativ dazu auch den Drehtisch (20), durch ein eingebautes Heizelement mit Temperatursensor auf eine vorgegebene Temperatur, beispielsweise auf 40 °C, erhitzen zu können. Die elektrischen Leitungen für den Heizstrom und den Temperatursensor können beispielsweise durch die Welle (12) geführt werden, die zu diesem Zweck als Hohlwelle auszubilden wäre. Andererseits ist es auch möglich, den Strom der Umluft entsprechend zu erwärmen.
Es können in diesem System auch mehrere Dispenser für mehrere verschiedenartige Flüssigkeiten vorhanden sein. Obwohl nicht notwendig, ist es doch besonders günstig, wenn sich die verschiedenen Dispenser alle auf dem gestrichelten Kreis (26) der bis befinden. Zusätzlich lassen sich auf diesem Kreis oder auch an anderen Stellen der Vorrichtung Sensoren installieren, die ein ordnungsgemäßes Aufbringen der Flüssigkeiten kontrollieren. Ein solcher Sensor kann beispielsweise als Minikamera ausgeführt sein, deren Bild visuell oder auch automatisch ausgewertet wird. Es können aber auch Sonden verwendet werden, die die elektrische Kapazität zum Probenort oder vom Probenort zurückgeworfenes Streulicht messen.
Die Dispenser müssen gelegentlich gereinigt werden, um störende Rückstände, beispielsweise auskristallisiertes Matrixmaterial, zu beseitigen. Auskristallisiertes Matrixmaterial am Rande der zentralen Dispenserkapillare führt dazu, dass der Tropfen nicht mehr senkrecht abgestreift wird. Das Reinigen kann beispielsweise durch Durchspülen der Kapillare mit reinem Lösungsmittel geschehen. Die beiden Drehtisch (20) und (10) können dafür, wie in dargestellt, zwei Abfalltrichter (54) und (56) enthalten, die genau übereinanderstehen, wenn die beiden Drehtisch in einer Ausgangsstellung stehen, wie sie zum Beispiel in gezeigt wird. Die beiden Abfalltrichter (54) und (56) sind am besten so geformt, dass die Spülflüssigkeit sofort in den nächsten Trichter tropft oder rinnt, ohne dass Spülflüssigkeit in den Spalt zwischen den beiden Drehtischen gelangen kann. Unter dem Drehtisch (10) ist ein Abfallbehälter (58) befestigt. Die Reinigung des Dispensers kann auch durch eine neben dem Trichter (54) auf dem Drehtisch (10) fest installierte Bürste unterstützt werden, die durch leichtes Hin- und Herdrehen eines der beiden Drehtisch die Düse von unten abbürstet. Bei Spülvorgängen wird das ablaufende Lösungsmittel in den Abfallbehälter (58) hinein entsorgt. Der Abfallbehälter kann mit einer Pumpe (nicht gezeigt) versehen sein, um die Spülflüssigkeit abzusaugen.
Mit dieser Vorrichtung für das Präparieren von Probenorten auf Probenträgern können Probenorte für das spätere Aufbringen von Proben präpariert werden, insbesondere aber können Proben präpariert werden, die schon auf Probenorte aufgebracht wurden. Die Proben können einfache chemische Analytproben sein, insbesondere aber kleine Mengen von Mikroben, die massenspektrometrisch identifiziert werden sollen. Die Mikrobenzellen müssen für diese Identifizierung aufgeschlossen werden und benötigen dazu, wie oben beschrieben, eine besondere Präparation mit scharfen Säuren.
Es werde hier kurz die Umsetzung eines heute üblichen, manuellen Verfahrens zur MALDI-Präparation von Mikrobenproben auf einem Probenträger mittels der Vorrichtung, die gemäß Prinzipien dieser Erfindung ausgestaltet ist, dargestellt: Durch manuelles Anheben des Kammerdeckels kann ein fertig präparierter Probenträger entnommen und gegen einen frisch mit Proben belegten Probenträger ausgetauscht werden. Der Probenträger ist versenkt in dem kleinen Drehtisch (20) eingelassen, kann aber mit Fingergriffhöhlungen (nicht in den Abbildungen dargestellt) oder mit besonderen Werkzeugen herausgehoben werden. In wenigen Minuten ist der Probenträger auf die gewünschte Temperatur gebracht. Die Mikrobenproben, die sich bereits auf ausgewählten Orten auf dem Probenträger befinden, werden jetzt Probe für Probe berührungslos mit je etwa einem Mikroliter Ameisensäure beträufelt. Die Proben können beispielsweise Reihe für Reihe belegt werden, um die Fahrwege klein zu halten und damit Zeit zu sparen. Es können aber auch andere Reihenfolgen optimal sein, beispielsweise eine quadrantenweise Belegung. Bewegen und Belegen einer Probe kann in etwa einer halben Sekunde erfolgen; alle Proben eines Probenträgers mit 384 Proben sind somit in etwa 3,2 Minuten vollständig mit Ameisensäure belegt. Diese Zeit reicht aus, die Mikrobenzellen aufzuschließen; zumindest werden die Zellwände so geschwächt, dass sie spätestens bei nachfolgendem Aufbringen der Matrixlösung durch Osmose zum Platzen gebracht werden können. Wird die Heiztemperatur richtig gewählt, so ist nach Belegung der letzten Probe die erste Probe so weit getrocknet, dass die Lösung mit dem Matrixmaterial aufgebracht werden kann. Das Aufbringen auf alle Proben (in derselben Reihenfolge) dauert noch einmal 3,2 Minuten. Rechnet man für ein endgültiges Trocknen mit Auskristallisieren der Matrixsubstanz nochmals etwa fünf Minuten, so dauert eine Präparation der 384 Proben mit anfänglichem Aufwärmen nur etwa 15 Minuten; es lassen sich somit etwa vier Probenträger pro Stunde präparieren. Werden die Belegungen mit Sensoren überprüft, so ist mit längerer Zeit zu rechnen, doch ist auch hier die Präparation in maximal einer halben Stunde pro Probenträger durchgeführt.
Die Präparationsvorrichtung gemäß der Erfindung spart gegenüber manueller Präparation Zeit ein. Außerdem werden Pipettenspitzen eingespart. In der medizinischen Diagnostik ist neben dem Kostenfaktor der Zeitfaktor für die Identifizierung von unbekannten Mikroben besonders wichtig, da eine frühzeitige Identifizierung der Mikroben Leben retten und die Dauer von Krankheiten wesentlich verkürzen kann.
Es wurde aber in der kurzen Schilderung des Präparationsverfahrens für Mikrobenproben mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung nur die heute übliche Präparation umgesetzt. Es ist jedoch denkbar, dass gegenüber der heute noch recht primitiven Präparation der Mikroben intelligentere Verfahren eingesetzt werden, die es beispielsweise durch eine Erhöhung der Ionenausbeute im Massenspektrometer erlauben, gute Massenspektren von nur 10³ statt 10⁵ Mikroben zu erhalten, wodurch trotz länger dauernder Präparation viel mehr Zeit bei der Kultivierung eingespart werden könnte.
So wird heute beispielsweise diskutiert, ob die im Zellaufschluss freigewordenen Proteine nicht an protein-adsorptive Schichten, beispielsweise an Dinitrozellulose-Schichten, fest gebunden und dann mit Wasser gewaschen werden können, um Salze, aber auch andere die Ionisierung behindernde Stoffe („Inhibitoren“) zu entfernen, bevor die Matrixlösung aufgegeben wird. Ein Wasch-Dispenser kann in einfacher Weise aus einer äußeren Kapillare zur Zuführung des Waschwassers und einer inneren Kapillare zum Absaugen des Waschwassers bestehen. Der Wasch-Dispenser befindet sich dabei nur etwa einen halben Millimeter über der zu waschenden Probe. Da immer mit frischem Waschwasser gewaschen wird, ist eine Übertragung von Proteinen dabei nicht zu befürchten. Auch ein Waschen mit anderen Flüssigkeiten als Wasser ist möglich, beispielsweise, um Fettsäuren zu entfernen. In dieser Weise kann die Präparationskammer mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung nicht nur für jetzt übliche Präparationsverfahren verwendet werden, sondern erlaubt es auch, in der Zukunft kompliziertere Verfahren auszuführen, die manuell gar nicht ausgeführt werden können, gegebenenfalls unter Installation weiterer Dispenser oder auch Sensoren.
Selbstverständlich lassen sich mit der Vorrichtung nach dieser Erfindung auch Probenträger präparieren, auf denen nicht alle Probenorte mit Proben belegt sind. Dem Steuerprogramm sind zu diesem Zweck die mit Proben belegten Positionen mitzuteilen.
Die in dieser Offenbarung vorgestellte Positionierung des Probenträgers mittels zweier Drehbewegungen kann Anlass sein, sich von den bisher aus dem Stand der Technik bekannten (und auch hier in den Abbildungen gezeigten) rechteckigen Ausformungen von Probenträgern zu verabschieden und stattdessen runde, an die Drehungen angepasste Ausformungen zu wählen. Beispielsweise kann statt der üblichen Matrixanordnung der Probenorte auf dem Probenträger in Zeilen und Spalten eine Form sinnvoll sein, gemäß der die Probenorte ebenfalls auf gedachten, zur Drehachse des Drehtischs konzentrischen Kreisen unterschiedlicher Durchmesser, alternativ auf einer gedachten Spiralkurve, die vom Rand bis zum Zentrum des Probenträgers verläuft und die Drehachse des Drehtischs als Zentrum hat, angeordnet sind. Insbesondere können die Probenorte entlang einer gedachten Linie vom Zentrum des Kreises zum Umfang an gleichen Winkelpositionen aber auf unterschiedlichen Radien angeordnet sein. Ein Fachmann wird ohne weiteres geometrische Überlegungen anstellen können, um eine besonders vorteilhafte Probenträgerausformung zu finden.
Die Begriffe „exzentrisch“ oder „exzentrische Drehbewegungen“ sind im Rahmen dieser Offenbarung so zu verstehen, dass die beiden, für die Positionierung von Probenträgertisch und Dispenser relativ zueinander vorgesehenen (im Wesentlichen parallelen) Drehachsen in einem Abstand zueinander angeordnet sind. Sie sind nicht so zu verstehen, dass die um diese Achsen rotierenden Elemente, wie Schwenkarm oder Drehtische, eine zu diesen Achsen rotationssymmetrische Ausformung haben müssen (wenngleich eine solche in manchen Fällen zum Beispiel aus produktionstechnischen Gründen oder aus Gründen der Massenbalance vorteilhaft sein kann).

Claims

Vorrichtung mit einem Dispenser zum Dispensieren von Flüssigkeiten auf Probenorte eines Probenträgers, der sich auf einem Tisch befindet, wobei Proben für eine Ionisierung in einem Massenspektrometer zu präparieren sind, dadurch gekennzeichnet, dass Dispenser und Probenträgertisch durch Antriebe mit Drehbewegungen um zwei exzentrische Achsen relativ zueinander positioniert werden, wobei die Drehbewegungen so ausgeführt werden, dass jeder Probenort auf dem Probenträger unter den Dispenser positioniert werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Dispenser an einem Arm befestigt ist und dass sowohl der Arm mit dem Dispenser wie auch der Probenträgertisch mit dem Probenträger durch Antriebe um je eine Achse gedreht werden.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Dispenser fest installiert ist, und dass sich der Probenträger auf zwei exzentrisch verbundenen Drehtischen befindet, mit Antrieben, durch deren Drehungen jeder Probenort des Probenträgers unter den Dispenser bewegt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Drehtische einen Abfluss für Spülflüssigkeit, die zur Reinigung einer Dispenserspitze verwendet wird, und einen entsprechend angeschlossenen Abfallbehälter aufweisen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträgertisch oder mindestens einer der Drehtische mit einer Heizeinrichtung versehen ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Dispenser zum berührungslosen Dispensieren von Tröpfchen definierter Größe auf die Probenorte ausgelegt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Dispenser vorhanden sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Sensoren zur Kontrolle eines korrekten Aufbringens der Flüssigkeit vorhanden sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Antriebe für die Drehbewegungen als Schrittmotoren ausgebildet und mit Untersetzungsgetriebe, Encoderscheiben und/oder Endschaltern ausgerüstet sind.
Vorrichtung mit einem Dispenser in einer abdichtbaren Kammer zum Dispensieren von Flüssigkeiten auf Probenorte eines Probenträgers, der sich auf einem Tisch befindet, für eine Präparation von Proben für eine Ionisierung in einem Massenspektrometer, dadurch gekennzeichnet, dass die Antriebe für die relative Positionierung von Dispenser und Probenorten auf dem Probenträger außerhalb der Kammer angeordnet sind, und dass Wellen durch abgedichtete Öffnungen in die Kammer führen und Dispenser und Probenträger über exzentrische Drehbewegungen zueinander positionieren, wobei die Drehbewegungen so ausgeführt werden, dass jeder Probenort auf dem Probenträger unter den Dispenser positioniert werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Kammer mit einem Luftkreislauf und Filtern versehen ist.