DE10201174A1 - Desintegrationsverfahren mittels kontinuierlich alternierender elektrischer Felder mit abrupter Feldstärkeänderung - Google Patents
Desintegrationsverfahren mittels kontinuierlich alternierender elektrischer Felder mit abrupter FeldstärkeänderungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Desintegration von biologischem Zellmaterial zur Extraktion von Zellinhaltsstoffen oder Einschleusung von Wirkstoffen in biologisches Zellmaterial mittels kontinuierlich alternierender Felder mit abrupter Änderung der Feldstärke.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Desintegration von biologischem Zellmaterial zur Extraktion von Zellinhaltsstoffen oder Einschleusung von Wirkstoffen in biologisches Zellmaterial.
- Für die Untersuchung von biologischem Zellmaterial, zum Beispiel zur Analyse von Zellinhaltsstoffen, insbesondere Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate etc., müssen die Zellwände und Membranen aufgeschlossen werden, um die Zellinhaltsstoffe in einer geeigneten Form aus den Zellen extrahieren zu können.
- Darüber hinaus kann die Desintegration auch der Einschleusung von Wirkstoffen (Xenobiotika) in biologisches Zellmaterial dienen. Unter Desintegration wird dabei ein Prozess verstanden, der den Ordnungszustand des biologischen Zellmaterials modifiziert oder die Modifizierung initiiert oder begleitet.
- Nach dem Stand der Technik werden mechanische und nicht-mechanische Desintegrationsverfahren zum Aufschluss von biologischem Zellmaterial eingesetzt:
Mechanische Verfahren beruhen dabei zum Beispiel auf der Erzeugung lokaler Druckschwankungen oder Scherkräfte, wodurch Zellwände und Membranen regelrecht aufgebrochen werden. Vorrichtungen zur Erzeugung der zur Zellwandzerstörung notwendigen großen Druck- oder Scherkräfte sind zum Beispiel sogenannte Kugelmühlen oder die French-Presse. Diese Vorrichtungen bedürfen jedoch eines sehr großen technischen und mechanischen Aufwands und lassen sich schwer automatisieren. Ein großer Nachteil der Druck- und Scherbehandlung biologischen Zellmaterials besteht darin, dass insbesondere die langkettigen DNA-Moleküle dabei stark fragmentiert werden, so dass zum Beispiel eine nachfolgende DNA-Analyse aus den Zellinhaltsstoffen erschwert ist oder dass zum Beispiel DNA-Moleküle nach dem Einschleusen in das biologische Zellmaterial nicht mehr ihre bestimmungsgemäße Funktion besitzen. - Durch den "Kryo-Aufschluss" beispielsweise in flüssiger Luft durch wiederholtes schockartiges Einfrieren und Auftauen oder zusätzliches mechanisches Zermahlen in der Kälte ergeben sich ebenfalls die vorgenannten Nachteile der möglichen Zerstörung der extrahierten Zellinhaltstoffe beziehungsweise der einzuschleusenden Wirkstoffe (Xenobiotika).
- Andere mechanische Desintegrationsverfahren beruhen zum Beispiel auf dem Ultraschall-Prinzip, bei denen die Zellwände und Membranen durch die von der Ultraschallwelle erzeugten Kavitationen aufgerissen werden. Bei diesem Verfahren wird jedoch ein erheblicher Teil der Schall-Leistung vom biologischen Zellmaterial aufgenommen, wodurch dieses ungünstigerweise lokal erwärmt wird und es zur unerwünschten Bildung freier Radikale kommen kann. Durch die auftretenden lokalen Temperaturschwankungen ist eine genaue Prozessführung des Desintegrationsprozesses erschwert.
- Für die nicht-mechanische Desintegration von biologischem Zellmaterial auf ausschließlich chemischem Wege sind individuell auf die Zellen angepasste Chemikalien, insbesondere Enzyme und Detergentien, erforderlich, die jedoch zum Teil mit den Zellinhaltsstoffen oder Xenobiotika reagieren und zum Beispiel eine Analyse von unbekannten Zellinhaltsstoffen unmöglich machen. So kann es bei der Anwendung von Detergentien zu unerwünschten Denaturierungen von Proteinen kommen. Die zu verwendenden Chemikalien müssen zur erfolgreichen Desintegration zum Teil in hoher Konzentration und über mehrere Stunden auf das biologische Zellmaterial einwirken.
- Ein weiteres nicht-mechanisches, physikalisches Desintegrationsverfahren ist die Verwendung von elektrischen Feldern zum Aufschluss von zum Beispiel im flüssigen Medium suspendiertem biologischem Zellmaterial (DE 197 52 961, PCT/DE 98/02 979, PCT/EP 99/03047, PCT/EP 99/03039, DE 199 06 277, PCT/EP 00/01201, WO 97/08293, DE 37 33 927 A1, WO 98/02399, WO 98/54306).
- Hierbei werden spezielle, gepulste elektrische Felder mit variierender Feldstärke oder elektrische Felder mit konstanter elektrischer Feldstärke eingesetzt. Zum Teil werden, um einen zu großen Energieeintrag in das biologische Zellmaterial und dessen damit verbundene Überhitzung zu vermeiden, gepulste elektrische Felder mit Impulsdauern von einigen Sekunden eingesetzt. Bei stärkeren Feldern und ausreichender Impulsdauer, insbesondere bei einer wiederholten Behandlung, kommt es zu permanenten Änderungen in der Zellmembran, was zum Beispiel bei der Behandlung von lebenden biologischen Zellen zum Zelltod führt. Diese Vorgehensweise wird standardmäßig zur Abtötung von Mikroorganismen in Lebensmitteln eingesetzt.
- Da biologisches Zellmaterial elektrisch betrachtet aus einem elektrisch leitenden Inhalt besteht, der von einer elektrisch isolierenden, polarisierbaren Zellmembran umschlossen ist, verschieben sich die elektrischen Ladungsträger (Ionen) im Inneren beim Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes (Polarisation). Auf diese Weise entstehen lokale Potentialdifferenzen zwischen dem Zellinneren und dem Zelläußeren, die dazu führen, dass die Zellmembran ihre semipermeablen und/oder selektiv-permeablen Eigenschaften verliert und Zellinhaltsstoffe in Folge aus der Zelle austreten beziehungsweise Wirkstoffe (Xenobiotika) in das Zellinnere eindringen können.
- Um derartige elektrische Felder erzeugen zu können, sind nach dem Stand der Technik aufwendige Apparaturen notwendig, die im allgemeinen teuer sind und verhältnismäßig viel Platz beanspruchen. Darüber hinaus lassen sich die bisher bekannten Verfahren nur schwer automatisieren. Der Einsatz dieser Verfahren ist daher zum Beispiel für das Routinelabor oder die großtechnische Anwendung nur schwer möglich. Des Weiteren kann die Effizienz der bisher beschriebenen elektrischen Desintegrationsverfahren mangelhaft sein.
- Der vorliegenden Erfindung liegt damit das technische Problem zu Grunde, ein Verfahren zum Aufschluss von biologischem Zellmaterial bereitzustellen, das die schonende Extraktion von Zellinhaltsstoffen oder die Einschleusung von Wirkstoffen (Xenobiotika) in biologisches Zellmaterial ermöglicht, wobei das Verfahren insbesondere zur Verwendung in einfachen, kostengünstigen und platzsparenden elektrischen Anlagen geeignet ist und die vorstehend genannten Nachteile vollständig oder weitestgehend vermeidet. Das Verfahren soll für die Desintegration von verschiedenen Arten biologischen Zellmaterials universell einsetzbar sein, insbesondere soll die Verfahrenszeitdauer zur Extraktion und Isolation der Zellinhaltsstoffe oder zur Einschleusung von Xenobiotika deutlich reduziert sein. Des Weiteren soll die Effizienz des Desintegrationsverfahrens hoch sein und die Zellinhaltsstoffe und/oder die einzuschleusenden Wirkstoffe während seiner Anwendung geschont werden.
- Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, indem sie ein Verfahren zur Desintegration von biologischem Zellmaterial, insbesondere zur Extraktion von Zellinhaltsstoffen und/oder zur Einschleusung von Wirkstoffen in das biologische Zellmaterial, zur Verfügung stellt, wobei das biologische Zellmaterial mindestens einem elektrischen Feld mit kontinuierlich alternierender Feldstärke unter abrupter Änderung der Feldstärke ausgesetzt und dabei aufgeschlossen wird.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass die abrupte Feldstärkeänderung mindestens eines elektrischen Feldes, dem das biologische Zellmaterial ausgesetzt ist, einen periodischen rechteckförmigen oder periodischen dreieckförmigen Verlauf hat. Abrupte Änderungen der elektrischen Feldstärke aufgrund der rechteckförmigen oder dreieckförmigen Schwingungen unterstützen die Desintegration des biologischen Zellmaterials in besonderem Maße. Abrupte und damit schnelle Änderungen der elektrischen Feldstärke desintegrieren das biologische Zellmaterial besonders effizient. Dies liegt unter anderem an der Entwicklung kurzzeitiger, außerordentlich hoher, lokaler elektrischer Feldstärken am biologischen Zellmaterial. Zusätzlich zum vorgenannten Effekt der elektrischen Polarisation der Membran des biologischen Zellmaterials tritt in vorteilhafter Weise ein elektromechanisch wirkender Maxwell-Stress auf, der die Desintegration des biologischen Zellmaterials zusätzlich effektiv unterstützt.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird die abrupte Feldstärkeänderung durch Überlagerung einer periodischen Grundschwingung mit höherfrequenten periodischen Schwingungen erzeugt. Die abrupte Feldstärkeänderung enthält dabei Frequenzanteile von 1 mHz bis 10 GHz, bevorzugt von 100 KHz bis 1 MHz, besonders bevorzugt von 200 KHz bis 500 KHz.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiterhin dadurch aus, dass die Einwirkung eines elektrischen Feldes mit kontinuierlich alternierender abrupter Feldstärkeänderung in Abhängigkeit von Frequenz, Amplitude, Behandlungsdauer und Temperatur zu permanenten und/oder transienten Poren in der Membran des biologischen Zellmaterials führt, wobei die Poren verschiedene Durchmesser besitzen können. Durch die gebildeten Poren können extrazelluläre Stoffe in das biologische Zellmaterial gelangen und/oder umgekehrt intrazelluläre Zellinhaltsstoffe freigesetzt werden. Dabei hängt die Freisetzung beziehungsweise Einschleusung von Stoffen von der Stärke und Art der Wechselwirkung zwischen diesen Stoffen und/oder zwischen den Stoffen und dem biologischen Zellmaterial ab sowie von der Lebensdauer und dem Durchmesser der gebildeten Poren.
- Die durch die Einwirkung des kontinuierlich alternierenden elektrischen Feldes gebildeten Poren brauchen in einer Version des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht notwendigerweise eine ähnliche Größe wie die zu extrahierenden beziehungsweise einzuschleusenden Substanzen besitzen. Es wird insbesondere davon ausgegangen, dass es zu unmittelbaren Wechselwirkungen zwischen der desintegrierten Membran des biologischen Zellmaterials und den einzuschleusenden beziehungsweise zu extrahierenden Substanzen kommt, wobei diese, überraschenderweise, einem noch unklaren Mechanismus folgend durch die desintegrierte Membran hindurchtreten. In einer weiteren Version des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das biologische Zellmaterial durch die Einwirkung des kontinuierlich alternierenden elektrischen Feldes zu einem hohen Grad desintegriert, so dass die Zellmembran irreversibel und insbesondere vollständig aufgelöst wird und so die Zellinhaltsstoffe komplett in das Medium freigegeben werden.
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird - ohne durch die Theorie gebunden zu sein - davon ausgegangen, dass die durch die Desintegration zu extrahierenden Zellinhaltsstoffe das Zellinnere des biologischen Zellmaterials aufgrund von Diffusion und/oder osmotischen Vorgängen verlassen. Des Weiteren wird - ohne durch die Theorie gebunden zu sein - davon ausgegangen, dass die in das Zellinnere des biologischen Zellmaterials einzuschleusenden Wirkstoffe (Xenobiotika) während der Desintegration durch Diffusion und/oder osmotische Vorgänge in das Zellinnere eindringen.
- Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren befindet sich das biologische Zellmaterial in einem flüssigen oder gelartigen Medium, das in seiner physikalisch- chemischen Eigenschaft als Elektrolyt gekennzeichnet ist und das elektrisch leitend ist. Vorzugsweise hat das Medium einen spezifischen elektrischen Widerstand von 0,1 µS/cm bis 1 µS/cm, bevorzugt 0,1 mS/cm bis 100 mS/cm, besonders bevorzugt 1 mS/cm bis 10 mS/cm. In einer weiteren Ausführungsform ist das Medium gasförmig oder im Wesentlichen fest. In einer weiteren Ausführungsform ist das Medium dadurch gekennzeichnet, dass es kein Elektrolyt ist.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird das biologische Zellmaterial vor oder während der Desintegration mit Substanzen in Kontakt gebracht, die den Aufschluss unterstützen und/oder die Zellinhaltsstoffe stabilisieren und/oder die in das biologische Zellmaterial einzuschleusenden und/oder eingeschleusten Wirkstoffe stabilisieren. Substanzen mit diesen Funktionen sind zum Beispiel Detergenzien, Proteine, organische Lösungsmittel, Reduktionsmittel, Komplexbildner oder chaotrope Substanzen. Bevorzugt handelt es sich bei den Detergenzien um Natriumdodecylsulfat (SDS), Tween 20 oder Triton X100. Bei den Proteinen handelt es sich bevorzugt um Enzyme aus der Gruppe der Hydrolasen, besonders bevorzugt um Proteasen oder Lipasen. Bei den organischen Lösungsmitteln handelt es sich bevorzugt um Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerol, Ethanol oder Phenol. Bei den Reduktionsmitteln handelt es sich bevorzugt um β-Mercaptoethanol, Dithiothreitol, Liponsäure oder Glutathion. Bei den Komplexbildnern handelt es sich bevorzugt um Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Bei den chaotropen Substanzen handelt es sich bevorzugt um Harnstoff und/oder Guanidiumsalze.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren werden diese Substanzen insbesondere verwendet, indem sie auf das biologische Zellmaterial in der Art einwirken, dass der Zellinhalt leichter und schneller aus dem Inneren des biologischen Zellmaterials freigegeben wird. Zum Beispiel diffundieren diese Substanzen durch die elektrische Behandlung entstandenen Poren in der Membran in das Zellinnere, bauen beispielsweise Proteine ab oder schneiden gezielt DNA- Moleküle in kleinere Fragmente. Die entstandenen Proteine beziehungsweise DNA-Fragmente können dann ungehindert durch Poren nach außen diffundieren.
- Eine weitere Wirkungsweise der Substanzen besteht darin, dass die durch erfindungsgemäße elektrische Behandlung entstandenen transienten oder permanenten Poren in der Membran von biologischem Zellmaterial durch die Substanzen angegriffen werden. Dies kann zu einer Erweiterung der Poren führen, was den Durchtritt von Zellinhaltsstoffen aus dem Zellinneren beziehungsweise die Einschleusung von Wirkstoffen (Xenobiotika) von außen in das Zellinnere erleichtert.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform führen die eingesetzten Substanzen zum Abbau der Zellmembran beziehungsweise Zellwand des biologischen Zellmaterials.
- Da nach den erfindungsgemäßen Verfahren das biologische Zellmaterial mindestens einem kontinuierlich alternierenden elektrischen Feld ausgesetzt ist, sind zur Erzielung dieser erwünschten Effekte im Vergleich zum Stand der Technik geringere Konzentrationen der vorgenannten Substanzen, die mit dem biologischen Zellmaterial in Kontakt kommen, notwendig. Dies verhindert in vorteilhafter Weise, dass die eingesetzten Substanzen mit den zu extrahierenden Zellinhaltsstoffen beziehungsweise mit den einzuschleusenden Wirkstoffen reagieren.
- Des Weiteren kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden, dass es zu einer Steigerung der Ausbeute und der Effektivität der Desintegration kommt, wenn die vorgenannten Substanzen in üblichen Konzentrationen eingesetzt werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist die der kontinuierlich alternierenden Feldstärke zugrunde liegende Spannung in ihrem zeitlich veränderlichen Verlauf so gewählt, dass der von ihr einbeschriebene Stromfluss symmetrisch gegenüber seinem Nulldurchgang ist. Dies führt dazu, dass über den Zeitverlauf integriert keine Nettoladung über das Feld transportiert wird. Dies reduziert in besonders vorteilhafter Weise elektrochemische Prozesse an den Elektroden der zur Desintegration verwendeten Apparatur und minimiert die Kontamination des Mediums mit Elektrolyseprodukten. Bevorzugt verlassen die Zellinhaltsstoffe aufgrund von Diffusion und/oder aufgrund von osmotischen Vorgängen das Zellinnere des biologischen Zellmaterials. Die Einschleusung von Wirkstoffen (Xenobiotika) erfolgt bevorzugt nach denselben Mechanismen.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Zeitverlauf der kontinuierlich alternierenden Feldstärke dadurch gekennzeichnet, dass im Zeitmittel eine Nettoladung gerichtet über das Feld transportiert wird. Dies wird in einer Variante erreicht, indem der einbeschriebene Stromfluss im Zeitverlauf asymmetrisch gegenüber seinem Nulldurchgang ist. In einer weiteren Variante wird der gerichtete Transport einer Nettoladung dadurch erreicht, dass einem elektrischen Feld mit kontinuierlich alternierender Feldstärke mit symmetrischem Stromverlauf mindestens ein elektrisches Feld mit konstanter elektrischer Feldstärke und konstantem einbeschriebenem elektrischen Strom überlagert wird. Durch die Übertragung von Nettoladung ist es möglich, Zellinhaltsstoffe zum Beispiel nach dem Prinzip der Iontophorese aus dem Zellinneren heraus zu transportieren beziehungsweise Wirkstoffe auf diese Weise in das Zellinnere einzubringen.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform überlagern sich mindestens zwei elektrische Felder mit parallel verlaufenden Feldvektoren.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Wesentlichen von einer zweidimensionalen Anordnung ausgegangen, wobei mindestens zwei sich überlagernde elektrischen Felder in einer Variante senkrecht oder annähernd senkrecht zueinander verlaufende Feldvektoren besitzen. Beispielsweise kann das biologische Zellmaterial im Medium einem elektrischen Feld mit kontinuierlich alternierender Feldstärke ausgesetzt werden, um zum Beispiel die Desintegration zu ermöglichen, und gleichzeitig einem senkrecht oder annähernd senkrecht dazu verlaufenden elektrischen Feld ausgesetzt werden, das eine konstante Feldstärke besitzt, die eine iontophoretische Einschleusung von Wirkstoffen ermöglicht oder die elektrophoretische Trennung der extrahierten Zellinhaltsstoffe nach ihren elektrisch-physikalischen Eigenschaften (zum Beispiel isoelektrische Fokussierung, Zonenelektrophorese, Puls-Feldelektrophorese). In einer weiteren Variante dieser Ausführungsform besitzen die mindestens zwei sich überlagernden elektrischen Felder Feldvektoren, die in einem beliebigen Winkel zueinander verlaufen. In einer weiteren Variante dieser Ausführungsform wird im Wesentlichen eine dreidimensionale Anordnung verwendet, wobei die mindestens zwei sich überlagernden elektrischen Felder im Raum senkrecht oder annähernd senkrecht verlaufende Feldvektoren besitzen.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass die Amplitude der kontinuierlich alternierenden elektrischen Feldstärke 0 V/cm bis 20 MV/cm umfasst, insbesondere 1 mV/cm bis 10 MV/cm, bevorzugt 1 V/cm bis 1 kV/cm, besonders bevorzugt 10 V/cm bis 100 V/cm. Die Frequenz der periodischen Grundschwingung der kontinuierlich alternierenden Feldstärke beträgt 1 mHz bis 1 GHz, bevorzugt 100 kHz bis 1 MHz, besonders bevorzugt 200 kHz bis 500 kHz.
- In einer Variante dieses Verfahrens wird die Amplitude der kontinuierlich alternierenden Feldstärke über die Zeit langsam kontinuierlich oder diskontinuierlich verändert.
- In einer weiteren Variante wird die Frequenz der periodischen Grundschwingung der kontinuierlich alternierenden Feldstärke über die Zeit langsam kontinuierlich oder diskontinuierlich verändert.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiter dadurch aus, dass das biologische Zellmaterial den elektrischen Feldern für eine Behandlungsdauer von 1 ms bis 48 h, bevorzugt von 1 s bis 1 h, besonders bevorzugt von 10 s bis 30 min. ausgesetzt wird.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zu desintegrierende biologische Zellmaterial durch ein elektrisches Feld mit kontinuierlich alternierender Feldstärke erwärmt.
- In einer Variante dieses Verfahrens wird das zu desintegrierende biologische Zellmaterial im Medium so temperiert, dass es aufgrund der Einwirkung des elektrischen Feldes zu keiner messbaren Temperaturerhöhung kommt. Dadurch werden empfindliche zu extrahierende Zellinhaltsstoffe oder einzuschleusende Wirkstoffe (Xenobiotika) besonders gegen Abbau (beispielsweise durch Hydrolyse, Oxidation, Denaturierung) geschützt.
- In einer weiteren Variante dieses Verfahrens wird das biologische Zellmaterial so temperiert, dass sich durch die Einwirkung des elektrischen Feldes eine Temperatur von -196°C bis 200°C, insbesondere von -20°C bis 95°C, bevorzugt von 4°C bis 80°C, besonders bevorzugt von 40°C bis 79°C, einstellt. Bevorzugt kann durch die Verwendung eines hohen Temperaturniveaus in vorteilhafter Weise erreicht werden, dass die mit dem biologischen Zellmaterial in Kontakt gebrachten Substanzen ihre Wirkung optimal entfalten können und sich so zum Beispiel die Desintegration des biologischen Zellmaterials beschleunigt. Außerdem kann eine Erhöhung des Temperaturniveaus gegenüber der Raumtemperatur die Extraktion von Zellinhaltsstoffen beziehungsweise die Einschleusung von Wirkstoffen in das Zellinnere unmittelbar begünstigen, ohne das biologische Zellmaterial mit zusätzlichen Substanzen in Kontakt zu bringen. In einer weiteren Variante des Verfahrens kann durch starkes Abkühlen erreicht werden, dass der durch die erfindungsgemäßen kontinuierlich alternierenden Felder mit abrupter Feldstärkeänderung ausgeübte elektromechanisch wirkende Maxwell-Stress besonders wirksam die Desintegration des biologische Zellmaterials unterstützt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass der pH-Wert eines bevorzugt flüssigen oder gelartigen Mediums, worin das biologische Zellmaterial suspendiert ist, pH -0,3 bis pH 14,2 beträgt, bevorzugt pH 2 bis pH 12, besonders bevorzugt pH 6 bis pH 9. In einer Variante des Verfahrens wird durch starkes Ansäuern des Mediums mit beispielsweise 2 normaler Säure effektiv die Desintegration des biologischen Zellmaterials unterstützt.
- Durch den kontrollierten Einsatz der Parameter, Temperatur und pH-Wert des Mediums sowie der Amplitude und der Frequenz der einwirkenden elektrischen Felder können im Einzelnen Verfahrensbedingungen geschaffen werden, die ein Optimierung mit dem Ziel eines automatisierten, gegebenenfalls miniaturisierten und routinemäßigen Einsatzes des erfindungsgemäßen Desintegrationsverfahrens ermöglichen.
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "biologischem Zellmaterial" komplette Lebewesen oder Organismen, Gewebe, Gewebestücke oder biologische Zellen tierischen, pflanzlichen Ursprungs, Hefen, Bakterien, Bazillen aber auch alle Organellen von biologischen Zellen, Micellen, Viren, Mikroplasmen, Liposomen oder ähnliche durch ein- oder zweischichtige Lipid- oder Lipoprotein- Membranen umschlossene Kompartimente verstanden.
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen "Desintegration" und "Aufschluss" ein Prozess verstanden, der den Ordnungszustand des biologischen Zellmaterials modifiziert oder die Modifizierung initiiert oder begleitet.
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter "Zellinhaltsstoffe" sämtliche Stoffe verstanden, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem Inneren des biologischen Zellmaterials extrahierbar sind, insbesondere Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate oder weitere extrahierbare Moleküle und Strukturen aus dem Zellinneren.
- Unter den Begriffen "Wirkstoffe" und "Xenobiotika" werden sämtliche Stoffe verstanden, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in das Innere des biologischen Zellmaterials eingeschleust werden können, insbesondere Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate oder andere chemische Moleküle mit biologischer Wirkung.
- Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der Formulierung "kontinuierlich alternierend" ein im Zeitverlauf periodischer Vorgang verstanden, wobei mehr als zehn, bevorzugt mehr als hundert, besonders bevorzugt mehr als tausend, in Amplitude, Periodendauer und Phasenlage unmittelbar hintereinanderfolgende Wechsel vorliegen.
- Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele und den dazugehörigen Figuren näher erläutert:
- In Fig. 1A bis F sind bevorzugte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäß verwendeten elektrischen Felder dargestellt. In den Fig. 1A und 1B sind exemplarisch die erfindungsgemäßen rechteckförmigen beziehungsweise dreieckförmigen Feldstärkeverläufe im Medium dargestellt. In den Fig. 1C und 1D sind quasi-rechteckförmige beziehungsweise quasidreieckförmige Feldstärkeverläufe dargestellt, in den Fig. 1E und 1F sind exemplarisch die Amplituden der abrupten Feldstärkeänderungen dargestellt, die sich bei Feldstärkeverläufen gemäß der Fig. 1C und 1D ergeben.
- In Fig. 2 sind schematisch die Potentialverläufe entlang der Ausdehnung einer einzelnen Zelle des biologischen Zellmaterials dargestellt, links, bei Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, rechts, bei Behandlung nach dem Stand der Technik.
- Der genaue Inhalt der Figuren ergibt sich aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen.
- Biologisches Zellmaterial wird erfindungsgemäß in einem elektrisch leitenden, flüssigen Medium kontinuierlich alternierenden Feldern mit abrupter Feldstärkeänderung ausgesetzt. In den Fig. 1A, 1B, 1C und 1D sind die jeweils eingesetzten Ausführungsformen der erfindungsgemäß verwendeten kontinuierlich alternierenden elektrischen Felder dargestellt. Fünf verschiedene Ansätze werden verfolgt, wobei in
- A) das biologische Zellmaterial kontinuierlich alternierenden Feldern mit rechteckförmigem Verlauf ausgesetzt wird, in
- B) das biologische Zellmaterial kontinuierlich alternierenden Feldern mit dreieckförmigem Verlauf ausgesetzt wird, in
- C) biologisches Zelimaterial kontinuierlich alternierenden Feldern mit quasirechteckförmigem Verlauf ausgesetzt wird und in
- D) biologisches Zelimaterial kontinuierlich alternierenden Feldern mit quasidreieckförmigem Verlauf ausgesetzt wird.
- E) Zusätzlich wird ein aus dem Stand der Technik bekanntes Desintegrationsverfahren durchgeführt, das im Wesentlichen mit statischen elektrischen Feldern oder Feldern mit extrem niederfrequenten Wechselfeldanteilen mit einer Zahl an wiederkehrenden Impulsen von 1 bis 10 arbeitet.
- Bei Einsatz der erfindungsgemäß kontinuierlich alternierenden Feldern mit abrupter Feldstärkeänderung in den Ansätzen A bis D kommt es zu extrem hohen Änderungen der Spannung (dV/dt), des Potentials über die einzelnen Zellen des Zellmaterials (dφ/dt) beziehungsweise der Feldstärke (dE/dt) über die Zeit, wie in den Fig. 1E und 1F exemplarisch für die quasi-rechteckförmigen Feldstärkeverläufe (Ansatz C, Fig. 1C) beziehungsweise die quasidreieckförmigen Feldstärkeverläufen (Ansatz D, Fig. 1D) dargestellt. In den Fig. 1A bis 1F sind die Zeitpunkte, zu denen die erfindungsgemäßen abrupten Feldstärkeänderungen auftreten, mit Pfeilen markiert.
- Das bedeutet, dass erfindungsgemäß zu bestimmten Zeitintervallen, die der halben Periodendauer der der kontinuierlich alternierenden Felder zugrunde liegenden Grundschwingung entsprechen, extrem hohe Potentialdifferenzen im biologischen Zellmaterial generiert werden. Die Applikation möglichst hoher Feldstärken hat dabei einen vorteilhaften Effekt auf die Desintegration des biologischen Zellmaterials.
- Da vereinfacht nach Neumann et al., 1999 (in: Bioelectrochemistry and Bioenergy) hohe Membranpotentialdifferenzen (Δφind) in Richtung des externen elektrischen Feldvektors ( ≙) induziert werden. Ein wichtiger Faktor ist dabei außerdem der Polarwinkel (θ) zwischen dem elektrischen Feldvektor ( ≙) und dem Zellradius (rZ) wie in Fig. 2 dargestellt. Gleichung 1
- Dabei ist zusätzlich der Konduktivitätsfaktor (f( λ m)) eine Funktion des Zellradius (rZ) der elektrischen Zellmembrandicke (dZM), der spezifischen Leitfähigkeiten der Membran (λm), des Zellinneren (λi) und der externen Lösung (λo).
- In die Ansätze gemäß Teil (1) werden Substanzen wie Detergenzien, Proteine, organische Lösungsmittel, Reduktionsmittel, Komplexbildner und/oder chaotrope Substanzen wahlweise einzeln oder in Kombination verbracht und/oder wird im Medium der pH-Wert vom Neutralpunkt weg verschoben und/oder wird die Temperatur des Mediums variiert.
- Es kommt zu den im Folgenden beschriebenen zusätzlichen erfindungsgemäßen vorteilhaften Effekten:
- 1. Osmotische Einflüsse führen zu einer Vergrößerung der Zellen, da das biologische Zellmaterial hyperosmotisch zu dem es umgebenden Medium ist. Dadurch kommt es nicht nur zu einer Destabilisierung der Zellen, sondern auch zu einer Zunahme des Zellradius (rZ), was die Desintegration erleichtert (siehe Gleichung 1).
- 2. Die Interkalation und die Adsorption von Substanzen in beziehungsweise an die Zellmembran- und Zellwandstrukturen des biologischen Zellmaterials sowie die elektrisch relevante Dicke, die Fluidität und die spezifische Leitfähigkeit der Zellmembran- und Zellwandstrukturen sind unter Einfluss der vorgenannten Faktoren derart verändert, dass die Desintegration des biologischen Zellmaterials erleichtert wird.
- 3. Die in das Medium zugegebenen Substanzen verändern die spezifische Leitfähigkeit des die zu desintegrierenden Zellen umgebenden Mediums. Darüber hinaus modulieren die von den Zellen aufgenommenen Substanzen die spezifische Leitfähigkeit auch im Zellinneren. Durch diese Effekte wird der Konduktivitätsfaktor (f(λm)) der Zellmembran vergrößert, was zu einer zusätzlichen Verbesserung der Desintegration führt (siehe Gleichung 1).
- Die vorgenannten Vorgänge 1 bis 3 sind darüber hinaus temperaturabhängig und eine Temperaturerhöhung verstärkt diese vorteilhaften Effekte.
- Weitere für die Desintegration vorteilhafte Effekte sind:
- 1. Modulation der in lebendem biologischem Zellmaterial auftretenden Membranpotentiale (Δφnat), die auf der unterschiedlichen Verteilung der Ionen zwischen Intrazellulärraum und Extrazellulärraum basiert,
- 2. Modulation des Oberflächen-Membranpotentials (Δφs), welche die Folge des Überschusses an negativ geladenen Gruppen an der Grenzfläche zwischen der Membranoberfläche und dem wässrigen Medium ist.
- Dabei berechnet sich die intrinsische Membranpotentialdifferenz (Δφm), dass heißt die gesamte Potentialdifferenz über der Membran des biologischen Zellmaterials inklusive der des natürlichen Membranpotentials und des Oberflächen- Membranpotentials, aus Gleichung 2. Gleichung 2
- Lokal begrenzte Potentiale innerhalb der Membran des biologischen Zellmaterials an der Grenze zwischen den polaren oder geladenen Lipidköpfen und den Kohlenwasserstoffketten der Lipidmembran, die zwischen 150 mV und 600 mv betragen, werden bei dieser Betrachtung vernachlässigt. Nach Gleichung 1 und 2 ist Δφm an den Zellpolen maximal, da hier der Polarwinkel θ = 0° beziehungsweise 180° ist.
- Wenn Δφm einen kritischen Wert Δφc, der in der Regel bei 1 V liegt, erreicht, kommt es zum elektrischen Zusammenbruch der Lipidschicht des biologischen Zellmaterials, wobei Poren in der Zellmembran gebildet werden. Da die wirksame elektrische Dicke der Membran von biologischem Zellmaterial in der Regel im Bereich von 5-10 nm liegt, entspricht Δφc einem elektrischen Feld in der Zellmembran von über 1 MV/cm.
- Um diese Werte zu erreichen, ist es nach den herkömmlichen Verfahren notwendig, elektrische Felder von mehreren kV/cm über das biologische Zellmaterial zu applizieren. Eine erfolgreiche Desintegration des biologischen Zellmaterials kann nur mittels sehr hoher Feldstärken erreicht werden.
- Die Annahmen aus dem Stand der Technik beruhen auf statischen elektrischen Feldern oder Feldern mit extrem niederfrequenten Wechselfeldanteilen mit einer Zahl an wiederkehrenden Impulsen von 1 bis 10 für jeweils sphärische Geometrien des biologischen Zellmaterials (Geometriefaktor: 1,5, siehe Gleichungen 1 und 2).
- Erfindungsgemäß werden kontinuierlich alternierende Felder, wobei eine kontinuierliche niederfrequente Grundschwingung mit höherfrequenten Schwingungen überlagert werden, eingesetzt.
- Aus den durchgeführten Untersuchungen ergibt sich, dass auch niedrige elektrische Feldstärken zur Desintegration führen, bereits vor Erreichen des kritischen Werts Δφc.
- Somit werden erfindungsgemäß, gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik, weniger starke Felder benötigt, um die gewünschten Desintegrationseffekte im biologischen Zellmaterial zu erhalten.
- Dieses Ausführungsbeispiel entspricht Beispiel 1, wobei jedoch erfindungsgemäß zusätzlich hohe elektrische Feldstärken zur Desintegration des biologischen Zellmaterials eingesetzt werden. Dabei werden apparativ schnelle Spannungsänderungen erzeugt, um so kurzfristig hohe elektrische Feldstärkeänderungen zu erzielen.
-
- A) Mit ansteigender elektrischer Feldstärke wird die Desintegration des biologischen Zellmaterials gegen über den Ansätzen A-D aus Beispiel 1 noch weiter verbessert.
- B) Die Desintegration wird signifikant gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten elektrischen Desintegrationsverfahren erhöht.
- Wie bereits in Beispiel 1 dargestellt, führt der Einsatz der erfindungsgemäßen kontinuierlich alternierenden Wechselfelder zu einem synergistisch wirkenden geometrischen Effekt der Phänomene des a) induzierten Membranpotentials und des b) Maxwell- Stress, was in Folge zur vorteilhaften verbesserten Desintegration in Form einer Porenbildung in der Zellmembran führt. In Fig. 2 ist die erfindungsgemäße Behandlung einer biologischen Zelle (1), deren Plasmamembran durch zwei konzentrische Kreise dargestellt wird, aufgezeigt:
- a) Bei der erfindungsgemäßen Behandlung entwickelt sich ein Potentialverlauf über den Querschnitt der Zelle, wobei das induzierte Membranpotential (Δφind) deutlich größer ist als bei den Desintegrationsverfahren nach dem Stand der Technik. Die Porenbildung erfolgt vorzugsweise an den Polen der Zelle, die durch den Feldstärkevektor ( ≙) definiert sind (siehe Gleichung 2 für θ = 0 und θ = 180°).
- b) Ein weiterer die Desintegration unterstützender
Effekt tritt durch den Maxwell-Stress auf. Dies ist
ein elektromechanischer Stress, wobei Kräfte
auftreten, die die Zellen des biologischen
Zellmaterials deformieren. Durch den elektromechanischen
Maxwellstress kommt es primär zu einer Elongation der
Zellen entlang des Feldstärkevektors, der dazu
führt, dass die Porenbildung zusätzlich erleichtert
wird, da sich der Geometriefaktor verändert:
Während für sphärische Zellen der Geometriefaktor 3/2rZ gilt, wird dieser durch den Term lZ/2 ersetzt, wobei lZ die Länge der durch den Maxwellstress elongierten Zellen darstellt. Wird dabei das Verhältnis lZ/rZ größer als 3, ist Δφm bei elongierten Zellen größer als bei sphärischen Zellen. - Aus den Untersuchungen ergibt sich, dass bei der durch den Maxwell-Stress erzeugten Formveränderung der Zellen nach einer Elongation bei konstantem Volumen eine Elongation bei konstanter Oberfläche auftritt, womit die Länge der Zellen im Verhältnis noch stärker zunimmt und somit die Desintegration erfindungsgemäß weiter verbessert wird.
Claims (32)
1. Verfahren zur Desintegration von biologischem
Zellmaterial zur Extraktion von
Zellinhaltsstoffen oder Einschleusung von Wirkstoffen in das
biologiche Zellmaterial, wobei das biologische
Zellmaterial mindestens einem elektrischen Feld
mit kontinuierlich alternierender Feldstärke
unter abrupter Änderung der Feldstärke ausgesetzt
und dabei desintegriert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das biologische
Zelimaterial mehr als einem elektrischen Feld
ausgesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die
abrupte Feldstärkeänderung durch Überlagerung einer
periodischen Grundschwingung mit mindestens einer
höherfrequenten periodischen Schwingung gebildet
wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die mindestens
eine höherfrequente periodische Schwingung eine
Frequenz von 1 mHz bis 10 GHz, bevorzugt von
100 KHz bis 1 MHz, besonders bevorzugt von
200 kHz bis 500 kHz aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, wobei die
abrupte Feldstärkeänderung durch Überlagerung
periodischer Schwingungen verschiedener Frequenz einen
periodischen rechteckförmigen Verlauf hat.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, wobei die
abrupte Feldstärkeänderung durch Überlagerung
periodischer Schwingungen verschiedener Frequenz
einen periodischen dreieckförmigen Verlauf hat.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei sich das biologische Zellmaterial in
einem elektrisch leitenden Medium befindet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das Medium gasförmig oder flüssig oder
gelartig oder fest ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das biologische Zellmaterial mit
Substanzen in Kontakt gebracht wird, welche den
Aufschluss unterstützen und/oder die
Zellinhaltstoffe stabilisieren und/oder die in das
biologische Zellmaterial einzuschleusenden und/oder
eingeschleusten Wirkstoffe stabilisieren.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanzen
Detergentien, bevorzugt Natriumdodecylsulfat
(SDS) und/oder Tween 20 und/oder Triton X100,
sind.
11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanzen
Proteine, bevorzugt Hydrolasen, besonders
bevorzugt Proteasen und/oder Lipasen, sind.
12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanzen
organische Lösungsmittel, bevorzugt
Dimethylsulfoxid (DMSO) und/oder Glycerol und/oder Ethanol
und/oder Phenol, sind.
13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanzen
Reduktionsmittel, bevorzugt β-Mercaptoethanol
und/oder Dithiothreitol und/oder Liponsäure
und/oder Gluthathion, sind.
14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanzen
Komplexbildner, bevorzugt
Ethylen-diamin-tetraessigsäure (EDTA), sind.
15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Substanzen
chaotrope Substanzen, bevorzugt Harnstoff
und/oder Guanidiniumsalze, sind.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das mindestens eine elektrische Feld
homogen ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das mindestens eine elektrische Feld
inhomogen ist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die kontinuierlich alternierende
Feldstärke durch eine kontinuierlich alternierende
Umpolung ihres Spannungsvektors gekennzeichnet
ist.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der Zeitverlauf der kontinuierlich
alternierenden Feldstärke dadurch gekennzeichnet
ist, dass im Zeitmittel keine Nettoladung über
das Feld transportiert wird.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der Zeitverlauf der kontinuierlich
alternierenden Feldstärke dadurch gekennzeichnet
ist, dass im Zeitmittel eine Nettoladung
gerichtet über das Feld transportiert wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei einem elektrischen Feld mit
kontinuierlich alternierender Feldstärke mindestens ein
elektrisches Feld mit konstanter elektrischer
Feldstärke überlagert wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die mindestens zwei sich überlagernden
elektrischen Felder parallel verlaufende
Feldvektoren besitzen.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die mindestens zwei sich überlagernden
elektrischen Felder senkrecht oder annähernd
senkrecht zueinander verlaufende Feldvektoren
aufweisen.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die mindestens zwei sich überlagernden
elektrischen Felder in beliebigem Winkel
zueinander verlaufende Feldvektoren aufweisen.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die Amplitude der kontinuierlich
alternierenden elektrischen Feldstärke 1 mV/cm bis
10 MV/cm beträgt, bevorzugt 1 V/cm bis 1 kV/cm,
besonders bevorzugt 10 V/cm bis 100 V/cm.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Amplitude
kontinuierlich oder diskontinuierlich verändert
wird oder konstant bleibt.
27. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die Frequenz der periodischen
Grundschwingung der kontinuierlich alternierenden
Feldstärke 1 mHz bis 1 GHz beträgt, bevorzugt
100 kHz bis 1 MHz, besonders bevorzugt 200 kHz
bis 500 kHz.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Frequenz
der periodischen Grundschwingung der
kontinuierlich alternierenden elektrischen Feldstärke
kontinuierlich oder diskontinuierlich verändert wird
oder konstant bleibt.
29. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das biologische Zellmaterial dem
mindestens einen elektrischen Feld für eine
Behandlungsdauer von 1 ms bis 48 h, bevorzugt von 1 s
bis 1 h, besonders bevorzugt von 10 s bis 30 min
ausgesetzt wird.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das biologische Zellmaterial durch das
mindestens eine elektrische Feld mit
kontinuierlich alternierender Feldstärke erwärmt wird.
31. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die Temperatur -196°C bis 200°C
beträgt, insbesondere -20°C bis 95°C, bevorzugt
von 4°C bis 80°C, besonders bevorzugt von 40°C
bis 79°C.
32. Verfahren nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei der pH-Wert des Mediums pH -0,3 bis
pH 14,2 beträgt, bevorzugt pH 2 bis pH 12,
besonders bevorzugt pH 6 bis pH 9.
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