DE102011122230A1

DE102011122230A1 - Optikanordnung und Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts

Info

Publication number: DE102011122230A1
Application number: DE102011122230A
Authority: DE
Inventors: Michael Mei; Dr. Holzwarth Ronald; Dr. Fischer Marc
Original assignee: Menlo Sys GmbH; Menlo Systems GmbH
Current assignee: Menlo Sys GmbH; Menlo Systems GmbH
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2013-06-27
Anticipated expiration: 2031-12-24
Also published as: US8816302B2; DE102011122230B8; DE102011122230B4; US20130161538A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Optikanordnung (20) und auf ein Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts (46). Dabei werden ein erster Laserpuls mit einer ersten Zentralwellenlänge und ein zweiter Laserpuls mit einer zweiten, von der ersten Zentralwellenlänge verschiedenen Zentralwellenlänge erzeugt. Beide Pulse werden in oder auf dem Objekt (46) so miteinander überlagert, dass dort eine Multiphotonen-Absorption unter Beteiligung mindestens eines Photons des ersten Laserpulses und mindestens eines Photons des zweiten Laserpulses stattfindet.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Optik-Anordnung und auf ein Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts unter Einsatz einer Wechselwirkung mit gepulstem Laserlicht unterschiedlicher Wellenlängen.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von „Multiphotonen-Prozessen” oder einer „Multiphotonen-Wechselwirkung” die Rede ist, so sind damit Prozesse oder Wechselwirkungen mit zwei, drei oder mehr daran beteiligten Photonen zu verstehen. Insbesondere zählen im Rahmen der Erfindung folglich auch Zwei-Photonen-Prozesse zu Multiphotonen-Prozessen.
Die Demonstration einer Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie wurde erstmals in dem Artikel Denk W., Strickler JH, Webb WW: „Two-photon laser scanning fluorescence microscopy" in: Science (journal), 248, Nr. 4951, April 1990, S. 73–76 beschrieben, etwas später in der US 5,034,613 . Bei einer Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie findet in der Probe eine simultane Absorption zweier Photonen mit identischer Photonenenergie (d. h. identischer optischer Frequenz bzw. Wellenlänge) statt, um in einem Atom oder Molekül ein Elektron auf ein höheres Energieniveau zu heben. Gegebenenfalls nach einer Relaxation wird von dem das Elektron enthaltenden Atom oder Molekül Fluoreszenzstrahlung ausgesandt, die detektierbar ist. Üblicherweise finden solche Zwei-Photonen-Prozesse statt, wenn sehr kurze Laserpulse in ein Medium fokussiert werden, da die Zwei-Photonen-Absorption quadratisch von der Intensität abhängig ist und somit sehr hohe Intensitäten erfordert, welche am einfachsten mit gepulstem Licht erreicht werden können. Meist wird in der Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie die eigentlich zu untersuchende Substanz oder Probe mittels Farbstoffen oder auch Fluorophoren markiert. Durch eine selektive Kopplung gelingt es, diese Farbstoffe mit einem hohen Wirkungsgrad an die Probe zu binden. Dies kann z. B. durch ein chemisches oder biologisches Schlüssel-Schloss-Prinzip realisiert werden, in dem die Farbstoffe sich ausschließlich z. B. an bestimmte Zellen, z. B. Krebszellen, in der Probe heften. Mittels Anregung der Farbstoffe über die Zwei-Photonen-Absorption und anschließender Detektion der Fluoreszenz gelingt es dadurch, in indirekter Art Informationen über die Probe zu erlangen, z. B. Informationen über deren Zusammensetzung oder örtlicher Verteilung. Nachteilig an dieser herkömmlichen Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie ist, dass der verwendete Laser und die Probe bzw. ein Fluoreszenz-Farbstoff für die Probe exakt aufeinander abgestimmt werden müssen. Bei der geringen Zahl an zur Verfügung stehenden Lasermedien ist das eine gravierende Einschränkung. Die Energie eines einzelnen Photons reicht nicht aus, um das Molekül oder Atom von dessen Grundzustand in den angeregten Zustand zu heben. Beispielsweise werden also bei einer Zwei-Photonen-Absorption zwei Photonen bei einer Wellenlänge von 800 Nanometer (nm) verwendet, um einen Übergang bei 400 nm anzuregen.
Der Vorteil der Zwei-Photonen-Mikroskopie gegenüber herkömmlicher Mikroskopie mit Absorption eines einzelnen Photons besteht in einer höheren Ortsauflösung (da nur im Fokus die Wahrscheinlichkeit hoch genug für die gleichzeitige Absorption mehrerer Photonen ist), in einer größeren Zeitauflösung (da ein gepulstes System zur Beleuchtung verwendet wird) und in einer größeren Eindringtiefe, da Photonen mit längerer Wellenlänge wesentlich tiefer und mit weniger Streuung in die zu untersuchenden Medien eindringen. Allerdings bestehen auch Nachteile gegenüber der herkömmlichen Mikroskopie. Beispielsweise ist die Zwei-Photonen-Mikroskopie relativ unflexibel, da die Wellenlänge der eingestrahlten Laserpulse genau passen muss, um einen Übergang anzuregen. Zudem ist die Übergangswahrscheinlichkeit für Zwei-Photonen-Prozesse sehr viel geringer als für einen Ein-Photonen-Prozess, sodass häufig nur wenig Signalstrahlung zur Verfügung steht.
Ein anderer Multiphotonen-Prozess ist die Summenfrequenzerzeugung (sum frequency generation, SFG) die auch für die Summenfrequenzspektroskopie verwendet wird. Bei diesem Prozess wird aus einem Photon mit einer ersten Frequenz f_s und einem Photon einer zweiten Frequenz f_P ein Photon der Summenfrequenz f = f_s + f_p erzeugt, das damit die Summe der Energien der beiden Photonen aufweist. Bei der Summenfrequenzerzeugung handelt es sich wie bei der SHG um einen nicht-linearen optischen Prozess zweiter Ordnung. Er erfordert folglich ein optisches nicht-lineares Material, d. h. ein Material mit einer nicht-verschwindenden Suszeptibilität zweiter Ordnung χ⁽²⁾. Die Summenfrequenzmischung kann entweder an Grenzflächen oder in χ⁽²⁾ Materialien stattfinden. Ihr Einsatz ist daher begrenzt, da sie nicht direkt in Material ohne χ⁽²⁾ Suszeptibilität stattfinden kann.
Beschrieben wird die Summenfrequenzmischung in ihrer Anwendung für nicht-lineare Mikroskopie beispielsweise in der US 6,108,081 A .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Optik-Anordnung und ein Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts zur Verfügung zu stellen, die sehr flexibel in ihrem Einsatz sowie sehr präzise in ihrer Auflösung sind, und die darüber hinaus möglichst geringen Einschränkungen hinsichtlich der zu bearbeitenden oder zu untersuchenden Materialien unterliegen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Optik-Anordnung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 2 bzw. durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 9, sowie durch eine Verwendung einer solchen Optik-Anordnung oder eines solchen Verfahrens für eine Multiphotonen-Spektroskopie, eine Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskopie oder eine Multiphotonen-Materialbearbeitung.
Die erfindungsgemäße Optik-Anordnung zeichnet sich dadurch aus, dass sie einen ersten Laserpulserzeuger zum Erzeugen eines ersten Laserpulses mit einer ersten Zentralwellenlänge sowie einen zweiten Laserpulserzeuger zum Erzeugen eines zweiten Laserpulses mit einer zweiten, anderen Zentralwellenlänge aufweist. Unter Zentralwellenlänge ist dabei entweder die Wellenlänge des jeweiligen Laserpulses mit der höchsten Intensität zu verstehen, oder aber die Wellenlänge an der Mitte der vollen Halbwertsbreite (FWHM) des Spektrums des Laserpulses. Dabei ist zu beachten, dass jeder Laserpuls ein endliches Spektrum hat, das umso breiter ist (bzw. umso mehr Moden umfasst), je kürzer der Puls ist.
Die erfindungsgemäße Optik-Anordnung umfasst ferner ein Strahlformungssystem, das dazu eingerichtet ist, den ersten Laserpuls und den zweiten Laserpuls an einem bestimmten Zielort in oder auf dem Objekt so miteinander zur Überlagerung zu bringen, dass am Zielort eine Multiphotonen-Absorption unter Beteiligung mindestens eines Photons des ersten Laserpulses und mindestens eines Photons des zweiten Laserpulses stattfindet, d. h. zumindest eine Zwei-Photonen-Absorption mit zwei Photonen unterschiedlicher Energie bzw. Frequenz oder Wellenlänge. Eine solche Zwei- bzw. Multi-Photonen-Absorption wird stattfinden, wenn das Material des Objekts am Zielort ein Energieniveau aufweist, dessen Energiedifferenz zu einem Grundniveau der Summe der Photonenenergien der beiden Laserpulse entspricht.
Bei dem Objekt kann es sich um ein Werkstück oder um eine Probe handeln, aus organischen oder anorganischen, in der Regel transparenten Materialien, beispielsweise um eine biologische Probe oder um einen Kunststoff. Insbesondere bei biologischen Proben können, um den Effekt zu verstärken, spezielle Farbstoff- oder Markierungsmoleküle zum Einsatz kommen, d. h. die Proben werden mit einem oder mehreren Farbstoffen markiert. Dabei sollte das Objekt vorzugsweise sowohl für die Strahlung des ersten Laserpulses, als auch für die Strahlung des zweiten Laserpulses möglichst transparent sein, um Verluste der Strahlung vor dem Erreichen des Zielorts zu minimieren. Das Strahlformungssystem kann eine beliebige Anzahl und Gruppierung von verschiedenen optischen Elementen wie Spiegeln, Strahlteilern, Strahlkombinierern, Linsen und Linsensystemen sowie Blenden umfassen.
Der Vorteil der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung im Vergleich zur herkömmlichen Summenfrequenzmischung besteht primär darin, dass sich die erfindungsgemäße Mehrphotonen-Wechselwirkung nicht auf die Oberfläche oder Grenzflächen des Objekts beschränkt, sondern auch im Inneren des Objekts stattfinden kann, und zwar unabhängig vom Vorhandensein von Grenzflächen verschiedener Materialbereiche oder einer Suszeptibilität zweiter Ordnung. Darüber hinaus wird die Photonenimpulserhaltung in der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung auf einfache Art analog zur entarteten Zweiphotonen-Wechselwirkung erfüllt. In der herkömmlichen Summenfrequenzmischung hingegen führt die Photonenimpulserhaltung zur Einschränkung, dass das Licht mit der Summenfrequenz nur unter einem sehr kleinen Raumwinkel beobachtbar war und die beiden Grundfrequenzen zwingend herausgefiltert werden mussten.
Gegenüber der herkömmlichen „entarteten” Zwei-Photonen-Absorption mit der Absorption zweier Photonen identischer Energie hingegen liegt der besondere Vorteil der Erfindung darin, dass eine immense Vielfalt neuer Wechselwirkungen zwischen der Laserstrahlung und dem Material des Objekts ermöglicht wird, was zum Gewinnen neuer Informationen über das Objekt und sein Material genutzt werden kann. Darüber hinaus können bei der erfindungsgemäßen Wechselwirkung die Wahrscheinlichkeiten für einen Übergang des Materials vom Grundzustand in den angeregten Zustand durch Verändern der Parameter der Laserstrahlung geändert werden. Insbesondere kann die Übergangswahrscheinlichkeit gegenüber einer herkömmlichen „entarteten” Zwei-Photonen-Absorption deutlich erhöht werden. In vielen Fluorophoren können durch die von der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung erzeugte Wechselwirkung bislang nicht erreichbare Übergänge angeregt werden, die neue Prozesse in den zu untersuchenden oder zu bearbeitenden Objekten anstoßen können.
In einer ersten Variante der Erfindung sind als erster Laserpulserzeuger und als zweiter Laserpulserzeuger jeweils ein gepulster Laser vorgesehen, wobei diese beiden gepulsten Laser miteinander synchronisiert sind, beispielsweise durch elektronische Maßnahmen. Zweckmäßig ist es dabei, wenn der sogenannte „Jitter”, d. h. das Fluktuieren oder zeitliche Schwanken der Taktzeiten der beiden Laser, im Bereich der Pulsdauern der beiden Laser liegt oder sogar noch kleiner ist. Zum Beispiel könnte es sich bei dem einen Laser um einen Erbium-dotierten Faserlaser handeln, beim anderen um einen Ytterbium-dotierten Faserlaser.
Bei dieser ersten Variante der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung werden zwei (oder mehr) Laserpulse meist unterschiedlicher Wellenlänge nicht von einem gemeinsamen Laser erzeugt, sondern von zwei (oder mehr) Lasern. Dadurch erweitert sich der Anwendungsbereich, da alle Wellenlängen von Femtosekundenlasern damit in Frage kommen und damit viele der gängigen Farbstoffe und Übergänge angeregt werden können. Mindestens einer der Laser sollte dabei ein durch eine Synchronisationsvorrichtung angesteuertes Stellglied zur Variation der Pulswiederholrate aufweisen, da in diesem Falle die Laserpulse aus den unterschiedlichen Lasern mittels elektronischer Verfahren synchronisiert werden sollten, damit der zeitliche Überlapp der Laserpulse in der Probe oder an dem Objekt über einen längeren Zeitraum gewährleistet ist. In dem Falle von zwei Lasern kann dies z. B. durch einen Er:dotierten Femtosekunden-Faserlaser und einem Yb:dotierten Femtosekunden-Faserlaser realisiert werden, die auf eine gemeinsame Radiofrequenz synchronisiert werden (oder ein fs Laser ist der „Master”, der andere der „Slave” laser, d. h. der eine wird auf den anderen synchronisiert). Dabei muss die Synchronisation mindestens so gut sein, dass Teile der Pulse zeitlich in der Probe oder an dem Objekt überlappen. Dabei kann die Radiofrequenz z. B. durch einen unabhängigen, hochstabilen Quarz erzeugt werden oder aber aus der Pulswiederholrate eines Lasers abgeleitet werden.
Die Stabilisierung erfolgt über einen sog. Phasenregelkreis (engl. phase locked loop). Als Stellelement im Laserresonator dient im Allgemeinen ein Piezoaktuator, der hinter oder an einem der Spiegel des Laserresonators angebracht ist. Es kann aber zusätzlich oder alternativ auch ein elektrooptischer Modulator in dem Laserresonator oder ein Schrittmotor, der einen der Resonatorspiegel bewegt oder eine Kombination dieser Stellelemente, zum Einsatz kommen.
Zur Detektion kann auch das Verfahren der Kreuzkorrelation zum Einsatz kommen. Dabei werden die Pulse der beiden Laser in einem nichtlinearen Kristall überlagert und die Summenfrequenz erzeugt. Dies stellt einen sehr empfindlichen Detektor für die zeitliche Lage der Pulse zueinander dar. Das Signal der Kreuzkorrelation wird dann als Eingangssignal der Synchronisationsvorrichtung zugeleitet.
In einer anderen Variante der Erfindung ist ein gemeinsamer gepulster Laser für den ersten Laserpulserzeuger und den zweiten Laserpulserzeuger vorgesehen, wobei der eine Laserpulserzeuger dazu eingerichtet ist, die Zentralwellenlänge eines primären Laserpulses von dem gepulsten Laser um einen anderen Betrag zu verändern, beispielsweise zu verschieben, als der andere Laserpulserzeuger. Denkbar wäre es dabei insbesondere auch, dass nur der eine Laserpuls in seiner Zentralwellenlänge verändert wird, der andere jedoch nicht. Bei dieser Variante wird der primäre Laserpuls des gepulsten Lasers, beispielsweise eines Frequenzkamms oder Ultrakurzpulslasers, mittels eines Strahlteilers in zwei sekundäre Teile aufgeteilt. Der eine Laserpuls kann nun in seiner Zentralwellenlänge verändert werden, beispielsweise durch Selbstphasenmodulation, durch 2^nd oder 3^rd Harmonic Generation (SHG, THG) oder durch einen Raman-Shift, wie dies beispielsweise in der DE 10 2006 023 601 A1 beschrieben ist. Nach dieser Frequenzverschiebung können die beiden sekundären Teile des Laserpulses wieder zur Überlagerung gebracht werden, spätestens am Zielort in dem Objekt. Bei dieser Variante sind die beiden sekundären Teile des Laserpulses sogar weitgehend kohärent zueinander,
Bei noch einer anderen Variante der Erfindung ist ebenfalls ein gemeinsamer gepulster Laser für den ersten Laserpulserzeuger und den zweiten Laserpulserzeuger vorgesehen, wobei der eine Laserpulserzeuger dazu eingerichtet ist, aus dem primären Spektrum des gepulsten Lasers einen Spektralbereich mit einer anderen Zentralwellenlänge herauszufiltern als der andere Laserpulserzeuger. Auch hier kann als gemeinsamer gepulster Laser beispielsweise ein Frequenzkammgenerator verwendet werden, wie er aus der DE 199 11 193 A1 , der EP 1 161 782 B1 oder der DE 100 44 404 C2 bekannt ist, auf deren Offenbarung ausdrücklich Bezug genommen wird. Als Frequenzkammgenerator ist dort jeweils ein Kurzpuls- oder Ultrakurzpuls-Oszillator vorgesehen, d. h. ein modengekoppelter Laser mit Pulsdauern im Bereich von Femto- (fs) bis zu Nanosekunden (ns). Der Folge von Laserpulsen entspricht im Frequenzraum ein „Frequenzkamm”. Er setzt sich zusammen aus einer Vielzahl von scharfen δ-ähnlichen Funktionen bei verschiedenen diskreten Frequenzen, Moden f_n genannt. Rechnerisch lässt sich der Frequenzkamm beschreiben als f_n = f₀ + nΔf. Dabei ist f₀ die sogenannte Offset-Frequenz, Δf der Frequenzabstand benachbarter Moden, der dem Inversen der Resonatorumlaufzeit entspricht. Nach einer Aufteilung des primären Laserpulses des gepulsten Lasers durch einen Strahlteiler könnte in einem oder beiden der zwei Pfade eine spektrale Filterung stattfinden, die nur bestimmte Moden des Frequenzkamms passieren lässt. Als Ergebnis stünden zwei sekundäre Laserpulse mit unterschiedlichen Zentralwellenlängen zur Verfügung.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem ersten Laserpuls und/oder bei dem zweiten Laserpuls um einen ultrakurzen Laserpuls, d. h. um einen Sub-Pikosekunden-Laserpuls, d. h. um einen Laserpuls mit einer Dauer von weniger als einer Pikosekunde (ps). Diese Pulse zeichnen sich neben ihrer kurzen Dauer durch ihre hohe Spitzenintensität aus, die die Wahrscheinlichkeit für die angestrebte Multi-Photonen-Absorption gegenüber längeren Pulsen deutlich erhöht. Sollte eine geringere Wahrscheinlichkeit ausreichen, könnten jedoch auch einer oder beide der Laserpulse durch einen Laserpuls längerer Dauer oder im Extremfall sogar durch Licht eines Dauerstrich-Lasers (cw-Laser) ersetzt werden.
Zweckmäßig ist es, wenn das Strahlformungssystem eine erste Fokussieroptik zum Fokussieren des ersten Laserpulses an den Zielort und/oder eine zweite Fokussieroptik zum Fokussieren des zweiten Laserpulses an den Zielort aufweist. Diese Fokussieroptiken erhöhen die Intensität der Laserpulse am Zielort und vergrößern somit die Wahrscheinlichkeit für die angestrebte Multi-Photonen-Absorption. Zugleich verringern sie den Strahlquerschnitt und erhöhen somit die Auflösung. Es konnte zusätzlich oder alternativ auch eine gemeinsame Fokussieroptik für beide Laserpulse vorgesehen sein.
Die Optik-Anordnung kann ferner einen Detektor für eine Signalstrahlung aufweisen. Diese Signalstrahlung kann Photonen aufweisen, deren Energie der Summe eines Photons des ersten Laserpulses und eines Photons des zweiten Laserpulses entspricht – oder die leicht unter der Summe dieser Energien liegt, wenn die Signalstrahlung erst nach einer gewissen Relaxation in einen Zustand mit etwas niedrigerer Energie über dem Grundzustand ausgestrahlt wird. Dem Detektor könnte auch ein Filter zugeordnet sein, beispielsweise ein Bandpassfilter, um die Signalstrahlung passieren zu lassen und Rauschen und/oder die beiden Fundamentalwellenlängen zu unterdrücken. Denkbar wäre es darüber hinaus, dass es sich bei dem Detektor um einen konfokalen Detektor handelt, der also Strahlung von Bereichen des Objekts abseits des durch die beiden Laserpulse beleuchteten Zielorts verwirft.
Besondere Vorteile entstehen, wenn der erste Laserpulserzeuger und/oder der zweite Laserpulserzeuger durchstimmbar sind, d. h. wenn die Zentralwellenlänge der von ihnen erzeugten Laserpulse möglichst stufenlos veränderbar ist. Dies erlaubt es, entweder die Summe der Photonenenergien kontinuierlich zu verändern oder den Beitrag, den die einzelnen Photonen zu einer vorbestimmten Gesamtenergie leisten. Auf diese Weise lassen sich zusätzliche Informationen über das Material des Objekts gewinnen oder aber Zwischenniveaus oder virtuelle Zwischenniveaus im Material ausnutzen, um die Wahrscheinlichkeit für die Multiphotonen-Absorption zu verändern, insbesondere zu erhöhen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts. Bei diesem Verfahren werden ein erster Puls mit einer ersten Zentralwellenlänge und ein zweiter Puls mit einer zweiten, anderen Zentralwellenlänge derart auf das Objekt gestrahlt, das an einem bestimmten Zielort in oder auf dem Objekt eine Multiphotonen-Absorption unter Beteiligung mindestens eines Photons des ersten Laserpulses und mindestens eines Photons des zweiten Laserpulses stattfindet. Die unterschiedlichen Zentralwellenlängen bedeuten, dass die beiden Photonen dabei unterschiedliche Energien haben.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die ersten und zweiten Laserpulse entweder mittels zweier separater, miteinander synchronisierter Laser erzeugt werden, oder mittels erster und zweiter Laserpulserzeuger, die aus von einem gemeinsamen, gepulsten Laser bereit gestellten, primären Laserpulsen sekundäre bzw. zweite Laserpulse mit jeweils unterschiedlichen Zentralwellenlängen generieren.
Das Erfordernis, die beiden Laserpulse derart auf das Objekt zu applizieren, dass dort die gewünschte Multiphotonen-Absorption stattfindet, kann besonders gut erfüllt werden, indem die beiden Laserpulse zeitgleich oder maximal mit einem der halben Laserpulsdauer entsprechenden zeitlichen Abstand (d. h. Δt ≤ ½ τ_FWHM; mit τ_FWHM als der FWHM-Laserpulsdauer) am Zielort eintreffen und/oder bestimmte Mindestintensitäten der beiden Laserpulse am Zielort erreicht werden, beispielsweise durch geeignete Fokussierung der Laserstrahlung. Ziel ist es, dass sich die fokussierten Laserpulse räumlich und zeitlich zumindest partiell überlappen. Mit dieser Multiphotonen-Absorption mindestens zweier Photonen unterschiedlicher Energien ergeben sich die oben bereits ausführlich geschilderten Vorteile.
Hinsichtlich der Vorteile einer Verwendung eines Sub-Pikosekunden-Laserpulses für den ersten und/oder den zweiten Laserpuls sowie einer Fokussierung für den ersten und/oder den zweiten Laserpuls auf den Zielort auch im erfindungsgemäßen Verfahren wird ebenfalls auf die obigen Ausführungen verwiesen.
In einer vorteilhaften Variante der Erfindung wird eine Region des Objekts durch Verändern des Zielorts gerastert, d. h. gescannt. Dies ermöglicht es, nicht nur einen einzelnen Zielort des Objekts, sondern größere Regionen des Objekts hinsichtlich ihrer Materialeigenschaften zu untersuchen oder zu verändern. Das Verändern des Zielorts kann durchgeführt werden, indem das Objekt auf einem Probentisch oder in einer Halterung liegt und in einer oder mehreren Raumrichtungen translatorisch bewegt und/oder gedreht wird. Alternativ dazu könnte eine Scanneranordnung mit einem oder mehreren Scannerspiegeln vorgesehen sein, die einen oder beide Laserstrahlen des ersten bzw. des zweiten Laserpulses über das Objekt ablenken.
Wenn es gewünscht wird, die zeitliche Überlappung der Laserpulse und/oder die Position des Zielorts, an dem die beiden Laserpulse überlappen, zu variieren, stehen dafür verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung. Eine Variante besteht im sogenannten Asynchronous Optical Sampling (ASOPS) der beiden Laserstrahlen. Insbesondere während der Justage der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung kann dabei ein gewisser zeitlicher Bereich durchgefahren werden, damit der Arbeitspunkt gefunden wird, bei dem die Pulse zumindest teilweise zeitlich überlagert sind. Bei der ASOPS-Methode wird die herkömmliche mechanische Verzögerungsstrecke in dem einen Arm des Aufbaus durch eine Abtastmethode ersetzt, die keine mechanische Verzögerungsstrecke mehr benötigt. Dies wird realisiert, indem zwei (oder mehr) Laser mit unterschiedlichen Pulswiederholraten zueinander stabilisiert werden. Vorteilhaft ist, dass dieses rein optische Abtasten quasi beliebig schnell durchgeführt werden kann. Dadurch können auch Effekte einfach und schnell untersucht werden, die von zeitlich gegeneinander verschobenen Pulsen herrühren.
Eine andere Variante besteht aus dem sogenannten OSCAT-Verfahren (engl. Optical Sampling by Cavity Tuning, kurz OSCAT), das aus der DE 10 2008 026 484.9 bekannt ist, auf deren Offenbarung hinsichtlich dieses Verfahrens hier explizit verwiesen wird. Bei diesem OSCAT-Verfahren werden zwei Laserpulse in einen gemeinsamen oder zwei unterschiedliche Zielbereiche eingestrahlt, wobei der erste Puls direkt in einen ersten Zielbereich gelangt und der zweite Puls nach Zurücklegen einer Verzögerungsstrecke in einen zweiten Zielbereich gelangt. Zudem ist es möglich, die zeitliche Verzögerung der beiden Laserpulse im jeweiligen Zielbereich über die Pulswiederholungsrate des gepulsten Strahls einzustellen. Die erfindungsgemäße Optik-Anordnung mit einem Laser und zwei unterschiedlich langen passiven Strahlführungsstrecken (meist mittels Glasfasern realisiert) kann durch eine periodische Variation der Pulswiederholrate des Lasers ein optisches Abtasten gewähren und damit ähnliche Vorteile des ASOPS Verfahrens in der Anwendung realisieren. Vorteilhaft kann sich erweisen, dass hier nur ein Kurzpulslaser verwendet werden muss.
Wesentliche Vorteile bietet ferner eine Variante des Verfahrens, bei dem die erste und/oder die zweite Zentralwellenlänge verändert werden. Dies ermöglicht es, die Summe der Energien der von beiden Laserpulsen stammenden Photonen zu verändern, um andere Energieübergänge im Material des Objekts anzuregen. Alternativ dazu könnte auch die Summe der Photonenenergien konstant gehalten werden, während gleichzeitig die erste und die zweite Zentralwellenlänge gegenläufig zueinander verändert werden, um den Beitrag der Photonen der beiden Laserpulse zur Gesamtenergie zu verändern. Dabei könnte sich die Wahrscheinlichkeit für die gleichzeitige Absorption zweier Photonen im Material des Objekts in Abhängigkeit davon verändern, ob und bei welchen Energien Zwischenniveaus oder virtuelle Zwischenniveaus im Energiespektrum des Materials des Objekts vorhanden sind.
In noch einer weiteren Variante des Verfahrens kann der zeitliche Abstand zwischen dem Eintreffen der beiden ersten und zweiten Laserpulse am Zielort verändert werden und/oder es könnte die Intensität der beiden Laserpulse verändert werden. Auch aus diesen Veränderungen und den sich daraus ergebenden Veränderungen in dem vom Objekt ausgestrahlten und anschließend detektierten Signallicht lassen sich Informationen über das Material des Objekts gewinnen.
Die erfindungsgemäße Optik-Anordnung oder das erfindungsgemäße Verfahren können bevorzugt für die Multiphotonen-Spektroskopie, für die Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskopie des Objekts oder für eine Multiphotonen-Materialbearbeitung verwendet werden. Bei der Multiphotonen-Spektroskopie werden bei vorgegebenen oder variierten Kombinationen von Zentralwellenlängen der beiden Laserpulse Informationen über die Reaktion des Objekts gewonnen, insbesondere über die Wahrscheinlichkeit für eine Multiphotonen-Anregung des Materials des Objekts, um auf diese Weise Informationen über die Materialeigenschaften des Objekts zu erhalten. Bei einer Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskopie erfolgt eine lokale oder großflächige (gescannte) Anregung des Objekts bzw. einer Probe durch Multiphotonen-Absorption. Anschließend wird Fluoreszenzlicht aus der Probe detektiert, dessen Photonenenergie etwa der Summe der Photonenenergien der ursprünglichen Laserpulse entspricht. Die Optik-Anordnung kann also in ein (Fluoreszenz-)Mikroskop integriert sein, insbesondere in ein Laser-Scanning-Mikroskop.
Als Beispiel für eine Multiphotonen-Materialbearbeitung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bietet sich z. B. eine Multiphotonen-Polymerisation eines Werkstücks an. Dabei wird ein bestimmtes Polymer durch die Multiphotonen-Absorption angeregt und ausgehärtet. Dieser Effekt lässt sich auch erzielen, wenn ein Photosensibilisator wie beispielsweise Riboflavin in eine biologische Probe gegeben wird, die anschließend durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt wird. Alternativ könnte die Multiphotonen-Materialbearbeitung auch eine lokale Erwärmung des Objekts bis hin zu einem optischen Durchbruch mit Kavitationsblasenbildung umfassen, was für ein lokales Schneiden des Objekts verwendet werden könnte.
Die erfindungsgemäße Optik-Anordnung und das Verfahren umfassen optional ferner Methoden zur optimierten Anregung durch Ausnutzung der Polarisation des Anregungslichtes. So kann beispielsweise der erste Laserpuls eine lineare Polarisation haben und der zweite Laserpulse eine dazu senkrechte, ebenfalls lineare Polarisation. Dadurch kann beispielsweise eine vorteilhafte räumliche Überlagerung der Laserpulse mittels polarisationsabhängiger optischer Elemente erfolgen. Ebenso können, von linearer Polarisation unterschiedliche Polarisationen verwendet werden (z. B. elliptische Polarisationen), um vorteilhafte Effekte der Anregung auszunutzen.
Solche Polarisationseffekte können auch auf Seiten der Detektion eingesetzt werden. So können beispielsweise polarisationsabhängige Filter eingesetzt werden, um die Unterdrückung des Anregungslichtes vom Signal zu erhöhen.
Die Polarisation der einfallenden optischen Strahlung kann parallel oder senkrecht oder in einem beliebigen anderen Verhältnis zum molekularen Dipolmoment der biologischen Proben sein. Entsprechend wird die Kopplung stärker oder schwächer ausfallen. Dies erlaubt, eine Aussage über die Orientierung von Molekülen in biologischen Proben zu treffen. Die Verwendung von zwei Zentralwellenlängen mit zwei Polarisationssvektoren zur optischen Anregung eröffnet hier völlig neue Möglichkeiten.
Es gibt allgemein eine Polariationsabhängigkeit des optischen Kontrastes und eine Polarisationsabhängigkeit optischer Prozesse, wie z. B. bei der Zwei-Photonen-Absorption oder nichtlinearen kohärenten Effekten, die Aussagen über Orientierung von Molekülen in biologischen Proben liefern können.
Die Eigenschaft der Kohärenz von Laserpulsen spielt bei vielen Anwendungen eine entscheidende Rolle, so z. B. in den schon erwähnten Optischen Frequenzkämmen. In der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung können sowohl nicht-kohärente als auch kohärente Lichtpulse verwendet. Im Falle von kohärenten Lichtpulsen eröffnen sich teils neue Anwendungsbereiche der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung Die kohärenten Eigenschaften der Lichtpulse erlauben die Ausnutzung von quantenmechanischen Eigenschaften, insbesondere der kohärenten Manipulation von Übergangswahrscheinlichkeiten. Durch eine genau angepasste Folge von kohärenten Lichtpulsen kann eine effizientere Anregung erfolgen und es können neue Effekte auftreten. Durch den Einsatz von Pulsformern (engl. ”pulse shaper”) in einem oder mehr Pfaden können diese Effekte noch verstärkt werden. Die Pulsformer können auch als variable Abschwächer eingesetzt werden bzw. als optische Elemente, die die Phase der Lichtpulse beeinflussen.
Im Folgenden werden vorteilhafte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung und des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand einer Zeichnung näher erläutert. Im Einzelnen zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines Energiediagramms des Materials eines zu untersuchenden oder zu bearbeitenden Objekts bzw. des an das Material oder Objekt gebundenen Farbstoffes,
2 eine herkömmliche Optik-Anordnung zur Zwei-Photonen-Mikroskopie,
3 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Optik-Anordnung während ihrer Justage,
4 die in 3 dargestellte Optik-Anordnung während des Untersuchens oder Bearbeitens eines Objekts,
5 ein Diagramm, das mögliche Kombinationen von Photonen für einen Übergang bei 400 nm zeigt,
6 eine Darstellung von möglichen Kombinationen von Photonen für einen Übergang bei 640 nm, und
7 eine schematische Darstellung anderer Varianten der Optik-Anordnung.
Gleiche Komponenten sind in den Figuren durchgängig mit gleichen Bezugszeichen versehen.
1 zeigt schematisch ein Energiediagramm des Materials eines zu untersuchenden oder zu bearbeitenden Objekts bzw. des an das Material oder Objekt gebundenen Farbstoffes. Dieses Material hat einen charakteristischen Energieübergang von einem Grundzustand G in einen angeregten Zustand A. Die Energiedifferenz zwischen diesen beiden Zuständen eines Atoms oder Molekül des Materials beträgt Δ = A – G = hv, wobei h das Planck'sche Wirkungsquantum und v die Lichtfrequenz ist. Umgerechnet hat dieses Licht der Frequenz v eine Wellenlänge von 400 nm, daher die Bezeichnung „400” für den Bandübergang in 1. Ein Beispiel eines solchen Materials ist der Farbstoff DY-405 der Firma Dyomics, der eine Absorption bei 400 nm und eine Emission mit einem Maximum bei 423 nm zeigt.
Bei einer herkömmlichen, sogenannten „entarteten” Zwei-Photonen-Absorption wird dieser Bandübergang durch das simultane Absorbieren zweier Photonen mit identischer Energie bzw. mit einer identischen Wellenlänge von jeweils 800 nm überbrückt.
2 zeigt schematisch eine herkömmliche Optik-Anordnung 1, mit der eine „entartete” Zwei-Photonen-Absorption durchgeführt werden kann. Die herkömmliche Optik-Anordnung 1 hat einen vergleichsweise simplen Aufbau. Sie verfügt über einen Ultrakurzpulslaser bzw. Frequenzkammgenerator 2, der ultrakurze Laserpulse mit einer zeitlichen Dauer von weniger als einer Nanosekunde, vorzugsweise von weniger als einer Pikosekunde ausstrahlt. Beispielsweise kann dafür ein Frequenzkammgenerator vom Typ FC1500 der Menlo Systems GmbH verwendet werden. Die Strahlung 3 des Lasers 2 wird über einen Bandpassfilter 4 geführt, beispielsweise über einen Bandpassfilter 855/210 der Firma Semrock. Jenseits des Bandpassfilters 4 haben die Laserpulse des Lasers 2 eine Zentralwellenlänge von 855 nm, bei einer Bandbreite des Filters von 210 nm.
Eine schematisch als Linse dargestellte Fokussieroptik 5 fokussiert die in Form von ultrakurzen Laserpulsen vorliegende Strahlung 3 in ein Objekt 6, beispielsweise in eine (biologische) Probe. An einem Zielort 7 innerhalb des Objekts 6, nämlich am Ort des Fokus der Fokussieroptik 5, erfolgt die in 1 dargestellte Zwei-Photonen-Absorption, bei der simultan zwei Photonen der Wellenlänge von 800 nm absorbiert werden, um den Energieübergang im Material von 400 nm auszuführen.
Vom Zielort 7, d. h. von dem angeregten Bereich des Objekts 6, wird anschließend Fluoreszenzstrahlung 8 ausgesandt. Ist das Objekt 6 beispielsweise mit dem Farbstoff DY-405 versetzt, könnte es sich um Fluoreszenzstrahlung 8 bei einer Wellenlänge von 423 nm handeln. Über eine Abbildungsoptik 9 und einen Detektionsfilter 10, beispielsweise einen die Primärstrahlung 3 ausblendenden und lediglich die Fluoreszenzstrahlung 8 durchlassenden Tiefpassfilter, wird die Fluoreszenzstrahlung 8 auf einen Detektor 11 fokussiert. Bei der Fluoreszenzstrahlung 8 handelt es sich folglich um die Signalstrahlung, die mittels des Detektors 11 detektiert wird. Das Signal des Detektors 11 kann ausgewertet werden, um beispielsweise spektroskopische Informationen über das Material des Objekts 6 am Zielort 7 zu gewinnen.
Zurück zu 1: Dort ist zu sehen, dass der Energieübergang vom Grundzustand G zum angeregten Zustand A gemäß der Erfindung durch eine nicht-entartete Zwei-Photonen-Absorption (bzw. allgemein durch eine nicht-entartete Multiphotonen-Absorption) erfolgt, d. h. durch eine Absorption von Photonen unterschiedlicher Energien bzw. Wellenlängen. Beispielhaft ist in 1 angedeutet, dass eine Zwei-Photonen-Absorption eines ersten Photons bei einer Wellenlänge von 500 nm und eines zweiten Photons bei einer Wellenlänge von 2000 nm erfolgt, um insgesamt den 400 nm-Übergang anzuregen. Das Photon bei einer Wellenlänge von 500 nm hat eine größere Energie als die bisher verwendeten Photonen von 800 nm, und insbesondere eine deutlich größere Energie als das an der erfindungsgemäßen Zwei-Photonen-Absorption beteiligte, weitere Photon bei einer Wellenlänge von 2000 nm. Angedeutet sind in 1 darüber hinaus Zwischenniveaus Z zwischen den beiden Energiezuständen G, A. Bei diesen Zwischenniveaus Z kann es sich auch um virtuelle Zwischenniveaus handeln. Die Wahrscheinlichkeit für die erfindungsgemäße, nicht-entartete Multiphotonen-Absorption kann stark von dem Vorhandensein und der Lage solcher Zwischenniveaus Z abhängen. Sie kann insbesondere gegenüber der Wahrscheinlichkeit einer herkömmlichen, entarteten Multiphotonen-Absorption enorm erhöht sein, wenn der Abstand solcher Zwischenniveaus Z vom Grundzustand G oder vom angeregten Zustand A im Wesentlichen der Energie E eines der bei der nicht-entarteten Multiphotonen-Absorption beteiligten Photonen entspricht.
3 zeigt nun ein Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Optik-Anordnung 20 zu einem Zeitpunkt während ihrer Justage. Die Optik-Anordnung 20 verfügt über einen ersten Laserpulserzeuger 21 und einen zweiten Laserpulserzeuger 22, bei denen es sich jeweils um eine Gruppe mehrerer optischer Elemente handelt. Der erste Laserpulserzeuger 21 umfasst einen Sub-Pikosekunden-Laser bzw. Frequenzkammgenerator 23, der Laserpulse mit einer zeitlichen Dauer von weniger als einer Pikosekunde (ps) erzeugt. Beispielsweise kann dafür wiederum ein Frequenzkammgenerator vom Typ FC1500 der Menlo Systems GmbH verwendet werden. Ferner umfasst der erste Laserpulserzeuger 21 einen optischen Filter 24, beispielsweise einen Frequenz-Tiefpassfilter vom Typ 1500, 1750 oder 2000, die jeweils Strahlung mit einer Wellenlänge von über 1500 nm, 1750 nm oder 2000 nm bevorzugt passieren lassen. Jenseits des Filters 24, d. h. am Ausgang des ersten Laserpulserzeugers 21, haben die von diesem ersten Laserpulserzeuger 21 erzeugten Laserpulse folglich eine Zentralwellenlänge von beispielsweise 2000 nm. Zwischen dem Laser 23 und dem Filter 24 befindet sich noch optional eine Irisblende 25, um die Justage zu vereinfachen.
Über ein λ/2-Plättchen 26 beispielsweise für eine Wellenlänge von 2000 sowie eine Irisblende 27 gelangen die ersten Laserpulse auf einen Polarisationsstrahlteiler (PBS) 28. Bedingt durch die durch das λ/2-Plättchen 26 definierte Polarisation der ersten Laserpulse werden diese vom Strahlteiler 28 unter einem Winkel von 90° auf einen ersten Detektor 29 gelenkt, bei dem es sich um eine Fotodiode handelt.
Der zweite Laserpulserzeuger 22 verfügt ebenfalls über einen Ultrakurzpulslaser 30, beispielsweise über einen weiteren Frequenzkammgenerator vom Typ FC1500 der Menlo Systems GmbH. Zudem verfügt auch der zweite Laserpulserzeuger 22 über einen optischen Filter 31. Dieser Filter 31 ist nun jedoch dazu eingerichtet, aus dem Spektrum des gepulsten Lasers 30 einen anderen Spektralbereich herauszufiltern als der Filter 24 aus dem gepulsten Laser 23 des ersten Laserpulserzeugers 21. Beispielsweise kann es sich bei dem optischen Filter 31 um einen Bandpassfilter handeln, z. B. einen Bandpassfilter vom Typ 512/25 der Firma Semrock. Damit verlassen die Laserpulse den zweiten Laserpulserzeuger 22 mit einer Zentralwellenlänge von 500 nm. Zwischen dem Laser 30 und dem Filter 31 befindet sich eine Irisblende 32.
Hinter dem zweiten Laserpulserzeuger 22 durchlaufen die von diesem erzeugten, zweiten Laserpulse eine Polarisationsstelleinheit 33, die ihrerseits ein λ/2-Plättchen 34 und ein λ/4-Plättchen 35 für eine Wellenlänge bei oder in der Nähe von 500 nm umfasst, beispielsweise optimiert für eine Wellenlänge von 532 nm. Mittels des λ/2-Plättchens 34 kann die Polarisationsrichtung des vom zweiten Laserpulserzeugers 22 erzeugten Laserlichts um einen wählbaren Winkel gedreht werden. Mittels des λ/4-Plättchens 35 wird aus zirkular polarisiertem Licht linear polarisiertes Licht. Zusammen erlauben es die Elemente der Polarisations-Stelleinheit 33, die Polarisation der zweiten Laserpulse auf einen exakt definierten Wert zu stellen. Dieser Wert ist so gewählt, dass die zweiten Laserpulse anschließend von einem Polarisations-Strahlteiler 36 unter einem Winkel von 90° in einen ersten Pfad 37 abgelenkt werden. In diesem ersten Pfad 37 befindet sich ein Spiegel bzw. Reflektor 38, dessen Abstand D zum Strahlteiler 36 variabel veränderbar ist. Durch eine Veränderung des Abstandes D wird die Laufzeit der zweiten Laserpulse im ersten Pfad 37 verändert. Der erste Pfad 37 dient damit als variable Verzögerungsstrecke für die zweiten Laserpulse.
Zwischen dem polarisierenden Strahlteiler 36 und dem Reflektor 38 befindet sich ein weiters λ/4-Plättchen 39. Da es sowohl auf dem Hin-, als auch auf dem Rückweg durchlaufen wird, wirkt es insgesamt als λ/2-Plättchen und dreht die Polarisationsrichtung der zweiten Laserpulse um 90°. Dies führt dazu, dass die zweiten Laserpulse den Polarisations-Strahlteiler 36 verlustfrei und ohne Ablenkung durchlaufen und so in einen zweiten Pfad 40 gelangen. Analog zum ersten Pfad 37 verfügt auch der zweite Pfad 40 über einen Spiegel bzw. Reflektor 41 sowie ein zwischen dem Spiegel 41 und dem Strahlteiler 36 angeordnetes λ/4-Plättchen 42. Dieses wird zweimal von der Strahlung durchlaufen und dreht die Polarisationsrichtung dadurch wieder um 90°, sodass die zweiten Laserpulse anschließend vom Polarisationsstrahlteiler 36 um einen Winkel von 90° in einen dritten Pfad 43 abgelenkt werden, in dem sich zur Strahlformung eine weitere Irisblende 44 befindet. Dieser dritte Pfad 43 ist so ausgerichtet, dass er kollinear und exakt in entgegengesetzter Richtung zu den vom ersten Laserpulserzeuger 21 generierten ersten Laserpulsen am Polarisationsstrahlteiler 28 eintrifft. Von diesem Strahlteiler 28 werden die zweiten Laserpulse um einen Winkel von 90° auf einen zweiten Detektor 45 abgelenkt. Bei diesem zweiten Detektor 45 kann es sich um eine Avalanche-Photodiode handeln.
Die beiden Detektoren 29, 45 haben jeweils denselben Abstand zum Polarisationsstrahlteiler 28. Dadurch ist sichergestellt, dass die ersten Laserpulse vom ersten Laserpulserzeuger 21 und die zweiten Laserpulse vom zweiten Laserpulserzeuger 22 zeitgleich am Strahlteiler 28 eintreffen, wenn sie zeitgleich auf den beiden Detektoren 29 bzw. 45 detektiert werden. Um dies zu erkennen, werden die Signale der beiden Detektoren 29, 45 auf einem geeigneten Messgerät, beispielsweise einem Oszilloskop, zur Überlagerung gebracht und miteinander verglichen. Sollte eine zeitliche Differenz zwischen dem Eintreffen der beiden Laserpulse vorliegen, kann diese zeitliche Differenz nun mittels einer Änderung der Verzögerung des zweiten Laserpulses eliminiert werden. Zu diesem Zweck wird der Reflektor 38 im ersten Pfad 37 in seinem Abstand D zum Polarisationsstrahlteiler 36 verändert, bis die beiden Laserpulse zeitgleich am Strahlteiler 28 und damit an den beiden Detektoren 29, 45 eintreffen.
Die beiden optischen Filter 24, 31 haben neben einer Festlegung der Zentralwellenlängen der beiden Laserpulse noch einen weiteren Effekt: Sie verhindern, dass Licht vom ersten Laserpulserzeuger 21 in den Resonator des Lasers 30 des zweiten Laserpulserzeugers 22 geraten könnte, und umgekehrt. Auf diese Weise wird trotz der genau entgegen gesetzten Richtung der beiden Laserpulse eine eventuell störende Rückkopplung auf die Resonatoren der beiden Laser 23, 30 vermieden.
3 zeigt ferner eine Synchronisationsvorrichtung S zum Synchronisieren der beiden Laser 23, 30. Bei der Synchronisationsvorrichtung S kann es sich um eine elektronische Synchronisationsvorrichtung handeln, die dafür sorgt, dass die beiden Laser 23, 30 exakt im selben Takt oder in einem präzisen zeitlichen Verhältnis zueinander Laserpulse abgeben. Als Eingangssignal kann die Synchronisationsvorrichtung S das Signal aus einer Kreuzkorrelation zwischen den Laserpulsen der beiden Laser 23, 30 erhalten.
4 zeigt die erfindungsgemäße Optik-Anordnung 20 in einen Zustand, in dem sie bereit ist zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Nachdem durch die anhand von 3 erläuterte Justage sichergestellt wurde, dass der erste der Laserpuls und der zweite Laserpuls simultan am Ort des Polarisationsstrahlteilers 28 eintreffen, sind dieser Strahlteiler 28 und der erste Detektor 29 entfernt worden. Exakt an dem Ort des Strahlteilers 28 wurde stattdessen ein zu bearbeitendes bzw. im vorliegenden Fall ein zu untersuchendes Objekt 46 platziert, d. h. eine Probe, beispielsweise eine biologische Probe oder eine Substanz unbekannten Materials. Darüber hinaus wurden eine erste Fokussieroptik 47 für die ersten Laserpulse und eine zweite Fokussieroptik 48 für die zweiten Laserpulse hinzugefügt. Diese Fokussieroptiken 47, 48 können jeweils eine oder mehrere Linsen umfassen. Sie sind so konfiguriert und angeordnet, dass sie sowohl die vom ersten Laserpulserzeuger 21 erzeugten ersten Laserpulse, als auch die vom zweiten Laserpulserzeuger 22 erzeugten zweiten Laserpulse an einen gemeinsamen Zielort 49 fokussieren, der innerhalb des Objekts 46 liegt.
Zusammen bilden die erste Fokussieroptik 47 und die zweite Fokussieroptik 48 ein Strahlformungssystem 100, das dazu eingerichtet ist, den ersten Laserpuls und den zweiten Laserpuls an den Zielort 49 in oder auf dem Objekt 46 zu fokussieren. Auch die Irisblenden 27 und 44 können zum Strahlungsformungssystem 100 hingerechnet werden.
Senkrecht zu den Einstrahlungsrichtungen der beiden Laserpulse ist eine Detektionsoptik 50 vorgesehen, die im vorliegenden Fall als Teleskop aufgebaut ist und zwei Linsen 51, 52 umfasst. Die Detektionsoptik 50 dient dazu, die vom Zielort 49 erzeugte Fluoreszenzstrahlung 8 aus einem möglichst großen Winkel zu bündeln und auf den zweiten Detektor 45 zu führen. Zwischen den Linsen 51, 52 der Detektionsoptik 50 oder an einem anderen Ort zwischen dem Objekt 46 und dem zweiten Detektor 45 befindet sich ein optischer Filter 53, beispielsweise ein Frequenz-Hochpassfilter, der nur Strahlung mit einer Wellenlänge unterhalb von 700, 600 oder 500 nm passieren lässt.
Zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nun vom ersten Laserpulserzeuger 21 und vom zweiten Laserpulserzeuger 22 erste bzw. zweite Laserpulse erzeugt und über die Fokussieroptiken 47, 48 auf den Zielort 49 innerhalb des Objekts 46 fokussiert. Durch die Einstellung der variablen Verzögerung der zweiten Laserpulse, d. h. durch Justieren des Abstandes D des Reflektors 38 vom Polarisationsstrahler 36, ist sichergestellt, dass die beiden Laserpulse immer zeitgleich am Zielort 49 eintreffen. Dort findet die erfindungsgemäße Multiphotonen-Absorption statt, bei der beispielsweise ein Photon des ersten Laserpulses mit einer Wellenlänge von 2000 nm und ein Photon des zweiten Laserpulses mit einer Wellenlänge von 500 nm gleichzeitig absorbiert werden, um gemeinsam ein Atom oder Molekül des Materials des Objekts 46 am Zielort 49 mit einem 400 nm-Übergang in einen angeregten Zustand A zu bringen.
Nach einer gewissen Relaxation strahlt das Material des Objekts 46 vom Zielort 49 Fluoreszenzstrahlung 8 aus, die über die Detektionsoptik 50 auf den zweiten Detektor 45 gebündelt und dort detektiert wird. Die Intensität der Signalstrahlung 8 kann dabei als Maß für die Übergangswahrscheinlichkeit dienen und zu Erkenntnissen über die Materialeigenschaften des Objekts 46 herangezogen werden.
Ausgehend von dem Ausführungsbeispiel gemäß 4 können die erfindungsgemäße Optik-Anordnung 20 bzw. das erfindungsgemäße Verfahren in vielfacher Hinsicht verändert werden. So ist es möglich, dass die Optik-Anordnung 20 in ein Mikroskop integriert ist, um die Handhabung der Optik-Anordnung 20 zu erleichtern. Statt einer spektroskopischen Untersuchung des Materials des Objekts 46 kann dann insbesondere auch eine mikroskopische Untersuchung des Objekts 46 erfolgen. Bereits erläutert wurde, dass neben einer Untersuchung eines Objekts 46 auch eine Materialbearbeitung eines Objekts 46 in Frage kommt, beispielsweise eine Zwei-Photonen-Polymerisation des Materials des Objekts 46 am Zielort 49. In diesem Fall handelt es sich bei dem Objekt 46 um ein Werkstück, das sich beispielsweise in einer (ggf. verfahrbaren) Objekthalterung befinden kann.
Besondere Vorteile ergeben sich bei einer Variation der Einstellungen oder Parameter der Optik-Anordnung 20. Bei der in 4 gezeigten Optik-Anordnung 20 ist es beispielsweise auf sehr einfach Weise möglich, eine lineare Region innerhalb des Objekts 46 durch entsprechendes Verändern des Zielorts 49 zu rastern. Zu diesem Zweck wird der Abstand D des Spiegels 38 im Verzögerungspfad 37 nach und nach verändert. Dadurch treffen die zweiten Laserpulse entsprechend früher oder später im Objekt 46 ein, sodass sich der Zielort 49, an dem die beiden Laserpulse simultan eintreffen, entsprechend entlang des dritten Pfades 43 nach rechts bzw. nach links verschiebt. Zum Aufrechterhalten einer hohen Intensität am Zielort 49 wäre es empfehlenswert, wenn die beiden Fokussieroptiken 47, 48 geeignet mitbewegt werden, um die jeweiligen Laserpulse weiterhin an denjenigen Zielort 49 zu fokussieren, an dem die beiden Laserpulse nun zeitgleich eintreffen. Ein Scannen in einer der beiden Raumrichtungen senkrecht zur Einstellrichtung der beiden Laserpulse kann durch entsprechendes Verlagern des Objekts 46 erfolgen.
Eine weitere (und mit dem herkömmlichen „entarteten” Zwei-Photonen-Prozess unmögliche) Variationsmöglichkeit bietet sich durch das Verändern der Zentralwellenlänge eines oder beider Laserpulse. 5 zeigt exemplarisch verschiedene Kombinationsmöglichkeiten der Wellenlängen zweier Photonen, um durch simultane Absorptionen beider Photonen einen Ein-Photonen-Übergang mit einer Wellenlänge von 400 nm anzuregen. Dabei zeigt die Y-Achse die Wellenlänge eines Photons, das zu einem Photon mit einer auf der X-Achse angegebenen Wellenlänge (im Bereich von 450 nm bis zur „entarteten” Situation bei 800 nm) genau die fehlende Energie für den 400 nm-Übergang liefert. Als Kombinationsmöglichkeiten stehen damit beispielsweise Photonen mit 500 und 2000 nm zur Verfügung, mit 550 und etwa 1450 nm, mit 600 und 1250 nm, mit 650 und 1080 nm usw.
6 zeigt ein analoges Diagramm für Kombinationsmöglichkeiten zweier Photonen zum Anregen eines Ein-Photonen-Übergangs bei 640 nm mittels der erfindungsgemäßen nicht-entarteten Zwei-Photonen-Absorption. Auf der X-Achse sind dabei mögliche Wellenlängen des ersten Photons von 800 nm bis hin zu der nicht von der Erfindung erfassten „entarteten” Situation bei 1280 nm dargestellte, auf der Y-Achse entsprechenden Wellenlängen des zweiten Photons.
Zum Verändern der Zentralwellenlänge der Laserpulserzeuger 21, 22 können diese jeweils durchstimmbar sein. Erreicht werden kann dies, indem als erster Laserpulserzeuger 21 und/oder als zweiter Laserpulserzeuger 22 ein Optisch-Parametrischer Oszillator (OPO) verwendet wird, oder indem die in den Laserpulserzeugern 21 verwendeten Filter 24, 31 in ihren Eigenschaften variabel sind oder durch Filter mit anderen Filtereigenschaften ersetzt werden. Das Durchstimmen des ersten und/oder des zweiten Laserpulses insbesondere bei konstanter Gesamtenergie ermöglicht es, das in 1 gezeigte Energieniveau E zu verändern, vorzugsweise stufenlos. Eine solche Variation des Energieniveaus E ist mit dem herkömmlichen „entarteten” Zwei-Photonen-Prozessen nicht möglich. Das Verändern des Energieniveaus E ermöglicht bisher unerreichbare neue Erkenntnisse über das Material des Objekts 46, da die Übergangswahrscheinlichkeit von der Lage des Energieniveaus E relativ zu Zwischenniveaus Z abhängig sein kann. Mittels des Durchstimmens der beiden Laserpulse können folglich die Zwischenniveaus Z ermittelt werden. Außerdem erlaubt es das Durchstimmen des Energieniveaus E, die Übergangswahrscheinlichkeit deutlich zu erhöhen, bis hin zu einem Wert, der etwa dem eines Ein-Photonen-Übergangs entspricht. Dies ist auch für eine Materialbearbeitung hilfreich, da es die Effizienz der Materialbearbeitung entscheidend erhöht.
Als Variation der in den 3 und 4 gezeigten Optik-Anordnung 20 könnten dort als Laserpulserzeuger 21, 22 auch zwei unterschiedliche Ultrakurzpulslaser mit jeweils unterschiedlichen Zentralwellenlängen vorgesehen sein. Beispielsweise könnte der erste Laserpulserzeuger 21 ein Erbium-dotierten Faserlaser und der zweite Laserpulserzeuger 22 ein Ytterbium-dotierten Faserlaser sein.
7 zeigt schematisch weitere Variationsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Optik-Anordnung 20. Bei der in 7 gezeigten Variante ist ein gemeinsamer Ultrakurzpulslaser bzw. Frequenzkamm 80, bzw. ein Erbium- oder Ytterbium-dotierter Faserlaser 80, für sowohl den ersten Laserpulserzeuger 21, als auch den zweiten Laserpulserzeuger 22 vorgesehen. Die aus dem Ultrakurzpulslaser 80 austretenden Laserpulse werden durch einen Strahlteiler 81 in einen ersten Pfad 82 und einem zweiten Pfad 83 aufgeteilt. Zu Beginn der beiden Pfade 82, 83 haben die beiden aufgeteilten Laserpulse folglich identische Spektren. Im ersten Pfad 82 befindet sich nun jedoch ein Filter 84, um aus diesem Spektrum einen bestimmten Teil herauszufiltern und so die Zentralwellenlänge des den ersten Pfad 82 durchlaufenden Laserpulses zu verändern. Optional könnte auch im zweiten Pfad 83 ein gegebenenfalls anderer Filter 85 vorhanden sein, um auch das Spektrum des zweiten Laserpulses hinsichtlich seiner Zentralwellenlänge zu verändern. Alternativ dazu könnte das Spektrum des ersten Laserpulses im zweiten Pfad 83 auch unverändert bleiben. In einer weiteren Alternative befindet sich zusätzlich oder alternativ zum optischen Filter 48 im ersten Pfad 82 ein optisches Element 86, das die Zentralwellenlänge des Laserpulses beispielsweise durch Frequenzverdopplung, Frequenzvervielfachung oder durch ein Wellenlängenschieben wie beispielsweise einen Raman-Shift verändert, sodass die Zentralwellenlänge des Laserpulses vom ersten Laserpulserzeuger 21 anders ist als die Zentralwellenlänge des zweiten Laserpulses, der im zweiten Laserpulserzeuger 22 erzeugt wird. Jeder der beiden Pfade 82, 83 kann ferner über Strahlformungselemente 87 wie Blenden oder Linsensysteme verfügen, sowie über geeignete Verstärker oder Abschwächer für die jeweilige Laserstrahlung.
Mittels eines Strahlkombinierers 88 werden die Laserpulse aus den beiden Pfaden 82, 83 wieder zusammengeführt. Vorzugsweise sind die optischen Weglängen der beiden Pfade 82, 83 identisch, sodass die beiden Laserpulse zeitgleich, wenn auch mit unterschiedlicher Zentralwellenlänge, am Strahlkombinierer 88 eintreffen. Mittels einer Fokussieroptik 47 werden die beiden Laserpulse auf einen identischen Zielort 49 innerhalb des Objekts 46 fokussiert.
7 zeigt ferner eine Detektion des vom Zielort 49 ausgehenden Fluoreszenzlichts mittels eines Detektors 45. Dabei fokussiert eine Detektionsoptik 89 das Fluoreszenzlicht auf eine Lochblende 90, bevor dieses Licht auf den Detektor 45 gelangt. Optional kann im Detektionsstrahlengang ein optischer Filter 91 zum Durchlassen nur der Signalstrahlung vorhanden sein, um die Signalqualität zu verbessern.
In jeder denkbaren Konfiguration kann die erfindungsgemäße Optikanordnung 20 eine Raster- oder Scann-Vorrichtung zum Rastern einer ein-, zwei- oder dreidimensionalen Region des Objekts 46 durch Verändern des Zielorts 49 aufweisen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 5034613 [0003]
US 6108081 A [0006]
DE 102006023601 A1 [0018]
DE 19911193 A1 [0019]
EP 1161782 B1 [0019]
DE 10044404 C2 [0019]
DE 102008026484 [0030]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Denk W., Strickler JH, Webb WW: „Two-photon laser scanning fluorescence microscopy” in: Science (journal), 248, Nr. 4951, April 1990, S. 73–76 [0003]

Claims

Optik-Anordnung (20) zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts (46), umfassend: – einen ersten Laserpulserzeuger (21) zum Erzeugen eines ersten Laserpulses mit einer ersten Zentralwellenlänge, – einen zweiten Laserpulserzeuger (22) zum Erzeugen eines zweiten Laserpulses mit einer zweiten Zentralwellenlänge, wobei die zweite Zentralwellenlänge von der ersten Zentralwellenlänge verschieden ist, – einem Strahlformungssystem, das dazu eingerichtet ist, den ersten Laserpuls und den zweite Laserpuls an einem bestimmten Zielort (49) in oder auf dem Objekt (46) miteinander so zur Überlagerung zu bringen, dass am Zielort (49) eine Multiphotonen-Absorption unter Beteiligung mindestens eines Photons des ersten Laserpulses und mindestens eines Photons des zweiten Laserpulses stattfindet, wobei der erste Laserpulserzeuger (21) und der zweite Laserpulserzeuger (22) jeweils einen separaten, gepulsten Laser (23, 30) aufweisen, wobei die beiden gepulsten Laser (23, 30) miteinander synchronisiert sind.
Optik-Anordnung (20) zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts (46), umfassend: – einen ersten Laserpulserzeuger (21) zum Erzeugen eines ersten Laserpulses mit einer ersten Zentralwellenlänge, – einen zweiten Laserpulserzeuger (22) zum Erzeugen eines zweiten Laserpulses mit einer zweiten Zentralwellenlänge, wobei die zweite Zentralwellenlänge von der ersten Zentralwellenlänge verschieden ist, – einem Strahlformungssystem, das dazu eingerichtet ist, den ersten Laserpuls und den zweite Laserpuls an einem bestimmten Zielort (49) in oder auf dem Objekt (46) miteinander so zur Überlagerung zu bringen, dass am Zielort (49) eine Multiphotonen-Absorption unter Beteiligung mindestens eines Photons des ersten Laserpulses und mindestens eines Photons des zweiten Laserpulses stattfindet, wobei ein gemeinsamer gepulster Laser (80) für den ersten Laserpulserzeuger (21) und den zweiten Laserpulserzeuger (22) vorgesehen ist, und wobei die beiden Laserpulserzeuger (21, 22) dazu eingerichtet sind, aus den vom gemeinsamen, gepulsten Laser (80) bereit gestellten, primären Laserpulsen sekundäre erste bzw. zweite Laserpulse mit jeweils unterschiedlichen Zentralwellenlängen zu generieren.
Optik-Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der eine Laserpulserzeuger (21) dazu eingerichtet ist, die Zentralwellenlänge eines primären Laserpulses von dem gepulsten Laser (80) um einen anderen Betrag zu verschieben als der andere Laserpulserzeuger (22).
Optik-Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der eine Laserpulserzeuger (21) dazu eingerichtet ist, aus dem Spektrum des gepulsten Lasers einen Spektralbereich mit einer anderen Zentralwellenlänge herauszufiltern als der andere Laserpulserzeuger (22).
Optik-Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Laserpuls und/oder bei dem zweiten Laserpuls um einen Sub-Pikosekunden-Laserpuls handelt.
Optik-Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste Fokussieroptik (47) zum Fokussieren des ersten Laserpulses an den Zielort (49) und/oder eine zweite Fokussieroptik (48) zum Fokussieren des zweiten Laserpulses an den Zielort (49) vorgesehen sind.
Optik-Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor (45) für eine Signalstrahlung (8) vorgesehen ist.
Optik-Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Laserpulserzeuger (21) und/oder der zweite Laserpulserzeuger (22) durchstimmbar sind.
Verfahren zum Untersuchen oder Bearbeiten eines Objekts (46), mit folgenden Schritten: – Einstrahlen eines ersten Laserpulses mit einer ersten Zentralwellenlänge in das Objekt (46), – Einstrahlen eines zweiten Laserpulses mit einer zweiten Zentralwellenlänge in das Objekt (46), wobei die zweite Zentralwellenlänge von der ersten Zentralwellenlänge verschieden ist, – wobei das Einstrahlen des ersten Laserpulses und des zweiten Laserpulses derart erfolgt, dass an einem bestimmten Zielort (49) in oder auf dem Objekt (46) eine Multiphotonen-Absorption unter Beteiligung mindestens eines Photons des ersten Laserpulses und mindestens eines Photons des zweiten Laserpulses stattfindet, – wobei die ersten und zweiten Laserpulse entweder mittels zweier separater, miteinander synchronisierter Laser (23, 30) erzeugt werden, oder mittels erster und zweiter Laserpulserzeuger (21, 22), die aus von einem gemeinsamen, gepulsten Laser (80) bereit gestellten, primären Laserpulsen sekundäre erste bzw. zweite Laserpulse mit jeweils unterschiedlichen Zentralwellenlängen generieren.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem ersten Laserpuls und/oder bei dem zweiten Laserpuls um einen Sub-Pikosekunden-Laserpuls handelt.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Laserpuls und/oder der zweiten Laserpuls auf den Zielort (49) fokussiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Region des Objekts (46) durch Verändern des Zielorts (49) gerastert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder die zweite Zentralwellenlänge verändert werden.
Verwendung einer Optik-Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 13 für eine Multiphotonen-Spektroskopie, eine Multiphotonen-Fluoreszenz-Mikroskopie oder eine Multiphotonen-Materialbearbeitung.