DE102011053775A1

DE102011053775A1 - Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Tau-Proteinablagerungen im Auge

Info

Publication number: DE102011053775A1
Application number: DE201110053775
Authority: DE
Inventors: Michael Kempe; Tobias Schmitt-Manderbach; Jochen Herms; Christian Schön; Boris Schmidt; Daniel Kieser; Alexander Boländer
Original assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU; Carl Zeiss AG; Technische Universitaet Darmstadt
Current assignee: Ludwig Maximilians Universitaet Muenchen LMU; Carl Zeiss AG; Technische Universitaet Darmstadt
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2013-03-21
Also published as: WO2013041522A1

Abstract

Es werden Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von gepaarten helikalen τ-Filamenten τ-PHF im Auge (100) bereitgestellt, bei welchen beispielsweise mittels einer Kameraeinrichtung (103) ein Übersichtsbild erstellt wird und mit einer Laserscannereinrichtung auf Basis des Übersichtsbildes identifizierte interessierende Bereiche abgerastert werden, um Fluoreszenz von an gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) gebundenen Sonden (108) zu detektieren.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von Ablagerungen des τ-Proteins im Auge zur Diagnose von Erkrankungen aus dem Formenkreis der sogenannten Tauopathien, beispielsweise an der Retina eines menschlichen Auges.
So genannte Tauopathien gehören zu einer Gruppe von neurodegenerativen Krankheiten, denen eine pathologische Ablagerung von τ-Proteinen im Gehirn gemeinsam ist. Zur Gruppe der Tauopathien zählen beispielsweise Morbus Alzheimer, Morbus Pick, kortikobasale Degeneration, frontotemporale Demenz oder auch die progressive supranukleäre Blickparese. Morbus Alzheimer, d. h. Alzheimer-Krankheit, ist dabei bei weitem die häufigste und auch die am intensivsten erforschte Krankheit dieser Gruppe und dient daher im Folgenden als Anwendungsbeispiel.
Die Alzheimer-Krankheit betrifft als häufigste Form von fortschreitenden neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen ca. 40%–50% in der Altersgruppe der 85–90jährigen 60% der weltweit von Demenz betroffenen Menschen sind an Alzheimer erkrankt. Derzeit kann Alzheimer nur nach dem Tod des Erkrankten mittels Autopsie des Gehirns mit Sicherheit diagnostiziert werden.
Gehirne von an einem Morbus Alzheimer erkrankten Personen enthalten im neuronalen Gewebe neben charakteristischen extrazellulären Ablagerungen, den so genannten Amyloid-Plaques, dystrophierte Neuriten und neurofibrilläre Bündel (engl. „neurofibrillary tangles”, NFT). Diese neurofibrillären Bündel bestehen aus pathologischen Ablagerungen des τ-Proteins, das für eine Stabilisierung von Mikrotubuli vor allem in Axonen eine wichtige Rolle spielt. Eine abnorme Hyperphosphorylierung wird als ursächlich für die Ausbildung von gepaarten helikalen τ-Filamenten (engl. „paired helical filaments”, PHF), welche nicht mehr mit den Mikrotubuli interagieren können, angesehen. Als Folge dieser pathologischen Veränderungen können extrazelluläre τ-PHF-Ablagerungen als neurofibrilläre Läsionen in Gehirnen von Alzheimer-Patienten beobachtet werden.
Auf zellulärer Ebene läuft dabei die Bildung von neurofibrillären Bündeln aus τ-Proteinen ungefähr wie folgt ab:
Im Verlauf ihrer Bildung und Anhäufung fügen sich gepaarte helikale Filamente des τ-Proteins zunächst innerhalb des Zytoplasmas zusammen, wahrscheinlich aus τ-Oligomeren, die während oder vor der PHF-Bildung verkürzt werden. Daraus entstehen klassische intrazelluläre neurofibrilläre Bündel. In diesem Zustand bestehen die τ-PHFs aus einem Kern von verkürzten τ-Proteinen und einem ausgefransten äußeren Bereich mit vollständigen τ-Proteinen. Es wird angenommen, dass diese Aggregate zu einer funktionellen Beeinträchtigung der betroffenen Neurone führen.
Derzeit wird das Ausmaß einer Alzheimer-Erkrankung am lebenden Patienten im Wesentlichen indirekt anhand von kognitiven Tests, Liquor-Untersuchungen oder morphologischen Veränderungen beispielsweise des Gehirnvolumens oder von Stoffwechselstörungen betroffener Gehirnbereiche mittels Magnetresonanztomographie (MRT) oder FDG-PET (Positronenemissionstomographie unter Verwendung von ^18F-Fluordesoxyglukose) diagnostiziert. Die Spezifität derartiger indirekter Methoden, welche häufig mit hohen statistischen Schwankungsbreiten der Ergebnisse verbunden sind, sind gegenüber einem direkten Nachweis von τ-PHF im Gehirn als gering einzuschätzen.
Daher wäre es wünschenswert, τ-PHF-Ablagerungen frühzeitig erfassen zu können oder auch den Verlauf einer τ-Pathie quantitativ bewerten zu können. Dies könnte Therapien erleichtern und frühzeitig ermöglichen.
Seit einiger Zeit werden hauptsächlich für Studienzwecke Positronenemissionstomogramme (PT) des Gehirns unter Verwendung von Kontrastmitteln (z. B. [¹¹C]PIB, [¹⁸F]FDDNP) durchgeführt, die durch selektive Bindung an Amyloid-Plaques und/oder τ-PHF einen direkten Hinweis auf pathologische Veränderungen des Nervengewebes geben. Aufgrund von sehr hohen Kosten für derartige Untersuchungen und einen hohen apparativen Aufwand sind derartige Untersuchungen jedoch kaum für großflächige Vorsorgeuntersuchungen oder für eine kontinuierliche Überwachung einer Therapie geeignet. Zudem können derartige Untersuchungen aufgrund der Strahlenbelastung an einem Patienten nicht beliebig oft wiederholt werden.
In der WO 2011/038892 A1 wird vorgeschlagen, τ-PHF in einer Retina eines Auges, welche dem Gehirn zuzurechnen ist, nachzuweisen, wobei hierzu Fluoreszenzmarker verwendet werden können. Hierzu wird die Verwendung verschiedener optischer Geräte wie so genannter Funduskameras, d. h. Kameras zur Aufnahme des Augenhintergrundes, oder hochauflösender Laser Scanning Ophtalmoskope (LSO) vorgeschlagen.
Ausgehend hiervon ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, effiziente Verfahren und Vorrichtungen zum Nachweis von gepaarten helikalen τ-Filamenten im Auge bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren nach Anspruch 1 sowie eine Vorrichtung gemäß Anspruch 15. Die Unteransprüche definieren weitere Ausführungsbeispiele.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Detektion von gepaarten helikalen τ-Filamenten (τ-PHF) im Auge vorgeschlagen, umfassend:
Aufnehmen eines Übersichtsbildes einer Retina des Auges,
Identifizieren von mindestens einem interessierenden Gebiet der Retina auf Basis des Übersichtsbildes,
Abtasten des mindestens einen interessierenden Gebiets mit einem Laserstrahl, und
Detektieren von Lichtemission von für gepaarte helikale τ-Filamente sensitiven Sonden in Antwort auf das Abtasten mit dem Laserstrahl.
Indem zunächst ein Übersichtsbild aufgenommen wird und dann mindestens ein interessierendes Gebiet der Retina auf Basis des Übersichtsbildes identifiziert wird, kann eine effiziente Untersuchung durchgeführt werden. Insbesondere können die interessierenden Gebiete mittels des Abtasten mit Laserstrahl exakt untersucht werden, ohne dass eine Gesamtdauer der Untersuchung unnötig lang wird.
Die interessierenden Gebiete können dabei insbesondere Gebiete sein, bei welchen auf dem Übersichtsbild Lichtemission von den Sonden identifizierbar ist.
Die Lichtemission kann insbesondere eine Fluoreszenzemission oder eine Emission von inelastisch gestreutem Streulicht, z. B. durch Ramanstreuung, umfassen.
Das Verfahren umfasst bei einem Ausführungsbeispiel weiterhin eine Durchführung einer ergänzenden Diagnostik wie einer polarisationsbasierten oder einer auf optischer Kohärenztomographie basierten morphologischen Charakterisierung des neuronalen Gewebes der Retina, umfassend z. B. eine Schichtdickenmessung der retinalen Nervenfaserzellschicht bzw. der gesamten Retina.
Auf Basis derartiger Messungen können dann verschiedene Tauopathien, d. h. dem Vorhandensein von τ-PHF, assoziierte Erkrankungen unterschieden werden, beispielsweise Augenerkrankungen wie Glaukom von neurodegenerativen Erkrankungen.
Bevorzugt umfasst die Detektion eine Lebensdauermessung der Fluoreszenz, wodurch an gepaarte helikale τ-Filamente gebundene Sonden von ungebundenen Sonden unterschieden werden können.
Über eine optische Kohärenztomographie können zudem morphologische Informationen gewonnen werden, welche mit Informationen aus der Detektion der Fluoreszenz gekoppelt werden können, um die Fluoreszenz zellulären Strukturen in verschiedenen Schichten des Auges zu ermöglichen.
Die Auflösung des Abtastens beträgt bevorzugt 20 μm oder darunter, noch bevorzugter 10 μm oder darunter.
Als Sonden werden bevorzugt ein oder mehrere Substanzen ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Arylaminothiazole, 4,6-Divinylpyrimidine, 2,5- und 3,6-Divinylpyrazine, [4-(1,3-Benzothiazol-2-yl)phenyl]hydrazone, Diarylharnstoffe, Tetracyclin, 4,4'-(1E,1'E)-2,2'-(1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)bis-2-methoxyphenole, 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)benzonitril und 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)-N-benzamide. Es können jedoch auch andere für gepaarte helikale τ-Filamente sensitive Sonden verwendet werden.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
1 ein Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
2 ein Diagramm eines weiteren Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
3(a) bis (j) verschiedene in Ausführungsbeispielen der Erfindung einsetzbare Sonden,
4 ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
5 histologische Schnitte einer Retina von Patienten mit Tauopathien, und
6 in vivo Aufnahmen von τ-PHF in retinalen Ganglienzellen eines Mausmodells der Alzheimer-Erkrankung.
Im Folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es ist zu bemerken, dass Merkmale verschiedener Ausführungsbeispiele miteinander kombiniert werden können, sofern nichts anderes angegeben ist. Auf der anderen Seite ist eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit einer Vielzahl von Merkmalen nicht dahingehend auszulegen, dass alle diese Merkmale zur Ausführung der Erfindung notwendig sind, da andere Ausführungsbeispiele weniger Merkmale oder alternative Merkmale aufweisen können.
In 1 ist ein Blockdiagramm einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Detektion von gepaarten helikalen τ-Filamenten (τ-PHT) 107 in einem Auge 100, beispielsweise einem menschlichen Auge, dargestellt. Zur Detektion der gepaarten helikalen τ-Filamente werden bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel Sonden 108, 109, welche charakteristische Fluoreszenzeigenschaften aufweisen und welche auf gepaarte helikale τ-Filamente sensitiv sind, d. h. an diese binden, verabreicht. Bei dem in 1 dargestellten Ausführungsbeispiel sind die Sonden 108 bereits an gepaarte helikale τ-Filamente 107 gebunden, während eine Sonde 109 ungebunden ist.
Die Vorrichtung des Ausführungsbeispiels der 1 umfasst zur Untersuchung des Auges 100 eine Laserscannereinrichtung 102 und eine Kameraeinrichtung 103, welche bei dem Ausführungsbeispiel der 1 über eine gemeinsame Ophthalmoskoplinse 101 optisch mit dem Auge 100 gekoppelt sind, um insbesondere eine Retina des Auges 100, in welcher τ-PHT 107 eingelagert ist, beleuchten zu können und von der Retina ausgehende optische Strahlung aufnehmen zu können. Die Laserscannereinrichtung 102 und die Kameraeinrichtung 103 werden über eine Steuerung 104 gesteuert. Die Steuerung 104 kann beispielsweise mittels eines Computers implementiert sein und weist bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel einen Bildschirm 106 und eine Eingabeeinrichtung 105 auf, wobei die Eingabeeinrichtung 105 beispielsweise eine Tastatur und/oder eine Maus umfassen kann.
Zur Untersuchung des Auges 100 ist die Steuerung 104 eingerichtet, die Kameraeinrichtung 103 zur Aufnahme eines Übersichtsbildes der Retina des Auges 100 anzusteuern. Hierzu kann insbesondere die Kameraeinrichtung 103 eine Beleuchtung zum Beleuchten der Retina aufweisen, welche an eine Anregungswellenlänge der Sonden 108, 109 angepasst ist, um die Sonden 108, 109 zur Fluoreszenz anzuregen. Zudem kann zur Aufnahme des Übersichtsbildes ein Farbfilter bereitgestellt werden, welcher im Wesentlichen nur Licht mit Wellenlängen entsprechend dem Fluoreszenzlicht der Sonden 108, 109 nach Anregung durch die Beleuchtung passieren lässt, sodass ein Übersichtsbild über die Fluoreszenz der Retina aufgenommen wird. Bei anderen Ausführungsbeispielen können zudem oder alternativ auch andere Arten von Bildern, beispielsweise mehrfarbige Bilder zur Identifizierung von Strukturen oder Infrarotbilder aufgenommen werden.
Die Steuerung 104 ist weiter eingerichtet, das aufgenommene Übersichtsbild auszuwerten und ein oder mehrere interessierende Gebiete (ROI, vom englischen „region of interest”) zu definieren. Die interessierenden Gebiete können dabei insbesondere Gebiete sein, in welchen auf dem Übersichtsbild Fluoreszenz von den Sonden 108, 109 vorhanden ist. Eine derartige Auswertung kann vollautomatisch mittels entsprechender automatischer Bildverarbeitung erfolgen. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann die Auswahl interessierender Gebiete auch halbautomatisch erfolgen. Beispielsweise kann das Übersichtsbild auf dem Bildschirm 106 angezeigt werden, wobei Gebiete mit Fluoreszenz von den Sonden 108, 109 hervorgehoben oder markiert sein können, und ein Benutzer kann dann mittels der Eingabeeinrichtung 105 die interessierenden Gebiete auswählen. Die Steuerung 104 steuert dann die Laserscannereinrichtung 102 an, die interessierenden Gebiete mit einem Laserstrahl abzurastern und von dem der Retina in Antwort auf den Laserstrahl ausgehendes Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, zu detektieren. Die Ortsauflösung bei einem derartigen Abtasten der interessierenden Gebiete beträgt bevorzugt weniger als 20 μm, noch bevorzugter weniger als 10 μm. Die Detektion kann dabei insbesondere zeitaufgelöst erfolgen, beispielsweise mittels FLI (Fluorescence Lifetime Imaging), und/oder spektralaufgelöst erfolgen, um auf diese Weise gebundene Sonden 108 von ungebundenen Sonden 109 unterscheiden zu können, da sich typischerweise durch die Bindung an gepaarte helikale τ-Filamente eine Lebensdauer und/oder ein Spektrum der Fluoreszenz verändert. Die Laserscannereinrichtung kann dabei insbesondere als konfokales Laser Scanning Ophthalmoskop (cSLO, Confocal Scanning Laser Ophthalmoscope) arbeiten.
Neben derartigen Fluoreszenzmessungen können bei manchen Ausführungsbeispielen mit der Laserscannereinrichtung 102 auch optische Kohärenztomographiemessungen oder polarisationsabhängige Messungen durchgeführt werden, um zusätzlich zu einer bevorzugt tiefenaufgelösten Fluoreszenzverteilung morphologische Informationen über die Retina zu erhalten. Die morphologischen Informationen und die aus der Fluoreszenz gewonnenen Informationen können dann von der Steuerung 104 verknüpft werden und beispielsweise auf dem Bildschirm 106 zur Begutachtung beispielsweise durch einen Arzt dargestellt werden.
Insbesondere können auf diese Weise Fluoreszenzsignale von den Sonden zellulären Strukturen in der inneren Körnerschicht (INL, „inner nuclear layer”) oder der Ganglienzellschicht (GCL, „ganglion cell layer”) oder anderen Schichten zugeordnet werden.
In 2 ist ein detaillierteres Diagramm eines weiteren Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung dargestellt, wobei insbesondere eine Laserscannereinrichtung und eine Kameraeinrichtung detailliert gezeigt sind. In dem Ausführungsbeispiel der 2 ist eine Steuerung wie die Steuerung 104 der 1 nicht explizit dargestellt, kann aber entsprechend der Beschreibung zur 1 bereitgestellt sein.
Als Laserscannereinrichtung umfasst das Ausführungsbeispiel der 2 ein konfokales Laser Scanning Ophthalmoskop (cSLO), welches eine oder mehrere Laserlichtquellen 1, einen Gehäusekopf 41 sowie eine Detektionseinrichtung 15 umfasst. Zudem umfasst das Ausführungsbeispiel der 2 eine Kameraeinrichtung 40.
Anzahl und Art der Laserlichtquellen 1 können in Abhängigkeit von verwendeten Sonden 50, welche in einem Auge 10 nachzuweisen sind, gewählt werden, sodass die ein oder mehreren Laserlichtquellen entsprechende Anregungswellenlängen emittieren, um die Sonde 50 zur Fluoreszenz anzuregen. Die ein oder mehreren Laserlichtquellen 1 sind über Lichtleiter 2, bevorzugt singlemodige Fasern, an den Gehäusekopf 41 angekoppelt. Das von den Lichtleitern 2 emittierte Laserlicht wird mittels Kollimatorlinsen 3 kollimiert. Bei mehreren Laserlichtquellen 1 wird das Laserlicht der verschiedenen Laserlichtquellen, in dem Beispiel der 2 zwei Laserlichtquellen, über einen Umlenkspiegel 4 und einen dichroitischen Strahlteiler 29 oder eine andere optische Einrichtung zu einem einzigen Beleuchtungsstrahl vereinigt, welcher über einen weiteren Umlenkspiegel 4 zu einem weiteren dichroitischen Strahlteiler 30 gelenkt wird.
Der dichroitische Strahlteiler 30 dient zur Trennung eines Beleuchtungsstrahlengangs, über welchen das von den Laserlichtquellen 1 emittierte Laserlicht letztendlich in das Auge 10 gelenkt wird, von einem Detektionsstrahlengang, mit welchem von dem Auge 10 ausgehendes Licht zu der Detektoreinrichtung 15 gelenkt wird. Von dem dichroitischen Strahlteiler 30 gelangt das Laserlicht des Beleuchtungsstrahls zu einem Scannerspiegel 5, welcher bevorzugt in einer konjugierten Pupillenebene der optischen Anordnung angeordnet ist. Der Scannerspiegel 5 kann beispielsweise einen zweiachsigen Scannerspiegel oder zwei hintereinander geschaltete einachsige Scannerspiegel aufweisen, um durch Bewegung des Scannerspiegels 5 eine Fläche im Auge 10, insbesondere auf einer Retina des Auges 10, abtasten zu können. Die Scanbewegung des Scannerspiegels 5 kann dabei beispielsweise durch die Steuerung 104 der 1 gesteuert werden.
Mittels eines Objektivs 6, eines Objektivs 7, einem Strahlteiler 8 und einer Ophthalmoskoplinse 9 wird das Laserlicht dann auf eine gewünschte Schicht, insbesondere die Retina bzw. eine Schicht der Retina, im Auge 10 fokussiert. Das Objektiv 6 kann auch als Scanobjektiv bezeichnet werden, das Objektiv 7 kann auch als Feldobjektiv bezeichnet werden. Der Strahlteiler 8 kann beispielsweise ein- und ausschwenkbar sein, um wahlweise die Laserscannereinrichtung oder die Kameraeinrichtung 40 nutzen zu können. Bei anderen Ausführungsbeispielen benutzen Laserscannereinrichtung und Kameraeinrichtung unterschiedliche Wellenlängen, und der Strahlteiler 8 kann als wellenlängenselektiver, beispielsweise dichroitischer, Strahlteiler ausgestaltet sein.
Das in Antwort auf die Beleuchtung mit Laserlicht von der Retina des Auges 10 emittierte bzw. gestreute Licht, insbesondere Fluoreszenzlicht, welches durch Anregung der Sonde 50 mit Laserlicht entsteht, wird in umgekehrter Richtung wie das Beleuchtungslicht über Ophthalmoskoplinse 9, Strahlteiler 8, Objektiv 7, Objektiv 6 und Scannerspiegel 5 zu dem dichroitischen Strahlteiler 30 gelenkt, geht durch diesen zumindest teilweise hindurch und wird dann über eine Pinholelinse 11 auf ein Pinhole 12 fokussiert. Das Pinhole 12 weist bevorzugt eine variable Größe auf, sodass Konfokalität und Signalstärke an der Detektionseinrichtung 15 anpassbar sind, wobei ein weiter geöffnetes Pinhole eine schlechtere Konfokalität bei gleichzeitig höherer Signalstärke bewirkt. Über eine Linse 13 wird dann das das Pinhole 12 passierende Licht in einen Lichtleiter 14, bevorzugt eine Multimode-Faser, eingekoppelt, welche das Licht zu der Detektionseinrichtung 15 leitet. Die Detektionseinrichtung 15 ist dabei zur spektral aufgelösten Detektion und/oder zur zeitaufgelösten Detektion bzw. zur Fluoreszenzlebensdauermessung (Fluorescence Lifetime Imaging, FLI) eingerichtet, um wie bereits erläutert gebundene von ungebundenen Sonden unterscheiden zu können.
Die Kameraeinrichtung 40 des Ausführungsbeispiels der 2 weist eine Beleuchtung 16 auf, welche ein oder mehrere Lichtquellen, insbesondere breitbandig emittierende Lichtquellen, aufweisen kann, beispielsweise eine Blitzlampe, eine oder mehrere Weisslichtleuchtdioden oder Kombinationen von Leuchtdioden, welche in verschiedenen Spektralbereichen emittieren. Über einen Kollimator 17, ein Objektiv 18 (Feldobjektiv), ein Objektiv 20 (Ringblendenobjektiv) und ein Objektiv 22, welches insbesondere als Anti-Reflexpunktobjektiv ausgestaltet sein kann und hierfür entsprechende Beschichtungen aufweisen kann, und einen Strahlteiler 23 gelangt das Licht über den bereits beschriebenen Strahlteiler 8 zur Ophthalmoskoplinse 9 und beleuchtet das Auge 10. Zusätzlich sind eine Netzhautblende 19 sowie eine Feldblende 21 bereitgestellt. Über einen bevorzugt wechselbaren Farbfilter 31 kann ein Spektralbereich zur Beleuchtung des Auges 10 ausgewählt werden, beispielsweise ein Spektralbereich, in welchem eine Fluoreszenz der Sonde 50 angeregt werden kann.
Der Strahlteiler 23 ist bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel als Lochspiegel ausgelegt, so dass bei dem dargestellten Beispiel der Detektionsstrahlengang der Kameraeinrichtung wie dargestellt „innerhalb” des Beleuchtungsstrahlengangs verläuft.
Das von dem Auge 10, insbesondere der Retina des Auges 10, in Antwort auf das von der Beleuchtung 16 emittierte Licht ausgehende Licht wird über die Ophthalmoskoplinse 9 durch die Strahlteiler 8 und 23 hindurch zu einem Objektiv 24 gelenkt, von wo es über einen Strahlteiler 28 und ein Kameraobjektiv 25 zu einer Kamera 27 gelenkt wird, mit welcher ein Bild aufgenommen werden kann. Zudem wird durch den Strahlteiler 28 hindurchgehendes Licht über ein Kameraobjektiv 25 zu einer weiteren Kamera 26 gelenkt. Die weitere Kamera 26 kann beispielsweise eine Infrarotkamera sein, während die Kamera 27 beispielweise eine Farbbildkamera sein kann. Es können jedoch auch zwei Farbbildkameras oder zwei Infrarotkameras oder auch eine Schwarz-Weiss-Kamera vorgesehen sein. Vor der Kamera 27 ist bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel ein bevorzugt wechselbarer Farbfilter 32 angeordnet, welcher beispielsweise ausgelegt sein kann, nur Licht im Wellenlängenbereich einer Fluoreszenz der Sonde 50 platzieren zu lassen, so dass mit der Kamera 27 ein Übersichtsbild der Fluoreszenz in dem Auge 10 angefertigt werden kann, auf Basis dessen dann wie bereits unter Bezugnahme auf 1 erläutert die Laserscannereinrichtung, insbesondere der Scannerspiegel 5 angesteuert werden kann, interessierende Bereiche abzurastern. Die weitere Kamera 26 kann beispielsweise zur Verfolgung von Bewegungen des Auges 10 oder für andere Einstellungen genutzt werden.
Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel weisen die Objektive 7 und 24 einen variablen Fokus auf, so dass mittels auch dieser Objektive auf einen interessierenden Bereich des Auges 10, insbesondere die Retina des Auges 10, fokussiert werden kann.
Als Sonden zum Nachweis von gepaarten helikalen τ-Filamenten, insbesondere Aggregaten hiervon, können beispielsweise die in 3 dargestellten Stoffe verwendet werden, beispielsweise Arylaminothiazole (3(a)), 4,6-Divinylpyrimidine (3(b)), 2,5-Divinylpyrazine (3(c)), Benzothiazolylphenylhydrazone (z. B. die in 3(d) gezeigte Substanz), 3,6-Divinylpyridanzine (3(e)), Diarylharnstoffe (3(f)), Tetracycline (3(g)), Stilbenderivate, 3,5-Divinylpyrazolen oder die in 3(h) bis 3(j) gezeigten Strukturen, nämlich 4,4'-(1E,1'E)-2,2'-(1-Aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)bis-2-methoxyphenole (3(h)), 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)benzonitril (3(i)), oder 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)-N-benzamide (3(j)).
Die dargestellten Reste können beispielsweise C₁-C₆-Alkylreste sein.
Die Auswahl an Sonden ist jedoch nicht auf die dargestellten Beispiele beschränkt.
Die genannten Verbindungen wirken vorzugsweise als fluoreszente Sonden. Sie besitzen eine (vorzugsweise hohe) Affinität für das Aβ-Protein, α-Synuclein und/oder für Tau-PHF-Aggregate und binden – vorzugsweise spezifisch – an diese. Die Bindung der erfindungsgemäßen Verbindungen an eines oder mehrere der oben genannten Zielproteine ist optisch detektierbar.
Bevorzugt weisen verwendete Sonden eine hinreichende Löslichkeit, geringe Lipophilie (logP < 5) und eine selektive Bindung an τ-PHF auch in Gegenwart anderer β-Faltblatt-Aggregate wie β-Amyloid auf. Bevorzugt liegt eine Dissoziationskonstante von verwendeten Sonden in einem in-vitro-Verdrängungsassay gegen Thioflavin-S oder Thioflavin-T oder Autoverdrängungsassay gegen radiomarkierte Analoga bei IC/EC₅₀ < 200 nM. Eine Einphotonenfluoreszenzanregung der an τ-PHF gebundenen Sonden liegt bevorzugt zwischen 390 und 550 nm, wobei auch andere Wellenlängen möglich sind, wobei dann die entsprechende Anregungswellenlänge, beispielsweise durch die Laserlichtquellen 1 oder die Beleuchtung 6, entsprechend anzupassen sind.
Bei manchen der beschriebenen Stoffe, insbesondere der 2,5-Divinylpyramizine und 4,6-Divinylpyrimidine, führen unterschiedliche Geometrien und Quatrupolmomente bei ähnlicher Affinität zu τ-PHF, insbesondere Tau-Aggregaten, und gleichbleibender Selektivität gegenüber anderen β-Faltblatt-Aggregaten zu unterschiedlichen Photoneneinfangquerschnitten bei einer Einphotonenanregung und einer Zweiphotonenanregung.
Zusammenfassend weisen als Sonden verwendete Stoffe bevorzugt 3 oder mehr der folgenden Eigenschaften a)–f) auf:

a) eine größer fünffache, bevorzugt größer zehnfache Extinktionszunahme bei einer Detektionswellenlänge nach Bindung an τ-PHF-Aggregate (oder auch an β-Amyloid) gegenüber einem ungebundenen Zustand,
b) einen Stokes-Shift von > 10 nm, bevorzugt > 20 nm,
c) einen Extinktionskoeffizienten E > 5000 L·mol^–1·cm^–1, bevorzugt größer 10000 L·mol^–1·cm^–1
d) EC50 < 400 nM, bevorzugt < 200 nM in einem Verdrängungsassay gegen fluoreszente Referenzsonde oder im Autoverdrängungsassay gegen die radioisotopenmarkierte Verbindung
e) eine Löslichkeit/Lipophilie mit logP < 5, bevorzugt zwischen 1 und 2,8, und
f) eine topologische polare Oberflächenfläche (TPSA, vom Englischen „Topological Polar Surface Area”) < 200 Å², bevorzugter < 100 Å², noch bevorzugter < 80 Å².

Die oben erwähnte Extinktionszunahme bei Bindung beispielsweise an τ-PHF kennzeichnet insbesondere eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses und kann experimentell beispielsweise durch Änderung, beispielsweise Verringerung, eines Hintergrundrauschens bestimmt werden. Die Bestimmung des Extinktionskoeffizienten E kann beispielsweise bei 25°C, einem pH-Wert von 7, bei einem jeweiligen Absorptionsmaximum des jeweiligen Stoffes mit DMSO (Dimethylsulfoxid) als Lösungsmittel gemessen werden.
Die Stokes-Shift bezeichnet einen Unterschied zwischen Anregungs-(Exzitations-)Maximum und Emissionsmaximum. Eine größere Stokes-Shift erleichtert eine Trennung von Anregungslicht und Fluoreszenz, beispielsweise durch die oben erwähnten dichroitischen Strahlteiler oder Farbfilter.
Der oben erwähnte EC50-Wert kennzeichnet die Affinität der jeweiligen Sonde zu dem nachzuweisenden Stoff, beispielsweise τ-PHF, und kann beispielsweise durch die Verdrängung von fluoreszenten oder radioaktiven Referenzliganden indirekt bestimmt werden, beispielsweise eine Verdrängung von Thioflaviri S, Thioflavin T oder 11C-FIB. Ein geeignetes Messverfahren ist beispielsweise in Lockhart, et al., The Journal of Biological Chemistry, 280, 7677–7684 vom 4. März 2005 unter Material und Methoden beschrieben.
Bei Ausführungsbeispielen weisen Sonden, beispielsweise die oben erwähnten Arylaminotyazole, 4,6-Divinylpyrimidine, 3,6-Divinylpyridazine, 2,5-Divinylpyrazine, [4-(1,3-Benzothiazol-2-yl)phenyl]hydrazone und/oder Diarylharnstoffe 2, bevorzugt mindestens 3 aromatische Ringe auf, welche direkt, über eine Vinylbrücke oder eine Harnstoffbrücke miteinander verbunden sind. Insbesondere können verwendete Stoffe 3 aromatische Ringe aufweisen, welche über Vinylbrücken miteinander verbunden sind, was zu ausgedehnten p-Elektronensystemen führt.
Bei Ausführungsbeispielen werden insbesondere Verbindungen der vorgenannten Klassen mit delokalisierten Elektronen, beispielsweise p-Elektronensystemen, über mindestens 15 beteiligte Atome, beispielsweise mindestens 20 Atome, insbesondere 22 oder mehr Atome, verwendet.
Bevorzugt sind Sonden deren Konformation im angeregten Zustand durch Bindung an das Zielprotein stabilisiert werden. Diese Stabilisierung kann durch Wasserstoffbrückenbindung oder van der Waals-Interaktionen der Aryleinheiten mit dem Zielprotein erfolgen. Dies führt bei bevorzugten Sonden zu einer Stabilisierung des nicht-planaren, angeregten Zustandes. Derartige Verdrillung kann durch 1,3-Allylspannung oder durch 1,4-Butadienspannung alkylierter Vinylaromaten induziert werden.
Besonders bevorzugt sind weiterhin Verbindungen, die eine Halbwertszeit in vivo von > 60 min besitzen. Hierzu werden in bestimmten Ausführungsformen Verweildauer und Ausscheidungsrate entsprechend markierter Sonden (z. B. 3H, 11C, 18F) bestimmt.
Bevorzugt sind Verbindungen, die eine erhöhte potentielle Hirngängigkeit bei reduzierter Bindung an weiße Hirnmasse aufweisen sowie eine reduzierte Plasmaprotein-Bindung besitzen. Das Diffusionsvermögen einer Verbindung durch die Endothelien der Blut-Hirn-Schranke wird maßgeblich durch seine Fettlöslichkeit (Lipophilie) und Größe bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Molmasse < 500 g/mol.
Der log P-Wert und der log D-Wert sind Modellmaße für das Verhältnis zwischen Lipophilie (Fettlöslichkeit) und Hydrophilie (Wasserlöslichkeit) einer Substanz. Die Erwartung ist, mit Hilfe des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten die Verteilungskoeffizienten dieses Stoffes in anderen Systemen mit einer wässrigen und einer lipophilen Phase abschätzen zu können. Der log P-Wert ist größer als eins, wenn eine Substanz besser in fettähnlichen Lösungsmitteln wie n-Oktanol löslich ist, kleiner als eins wenn sie besser in Wasser löslich ist. Entsprechend ist log P-Wert positiv für lipophile und negativ für hydrophile Substanzen. Bevorzugt sind Verbindungen, die einen log P-Wert von 1 bis 2,8 haben. In weiteren Ausführungsformen sind Verbindungen mit einem log D-Wert < 5 bevorzugt. Die Messung des log P-Werts oder des log D-Werts erfolgt über ein Oktanol/Wasser-Zwei-Phasensystem und UV/VIS-Spektroskopie bei 25°C und pH 7. Da nicht für alle Chemikalien der log P-Wert und/oder der log D-Wert gemessen werden kann, gibt es auch andere Modelle für die Vorhersage, z. B. durch Quantitative Struktur-Aktivitats-Beziehungen (QSAR) oder durch Linear Free Energy Relationships (LFER).
Die potentielle Hirngängigkeit der Verbindungen kann auch über die topological polar surface area (TPSA) definiert werden. Diese ist definiert als die Summe der Oberflächenbeiträge der polaren Atoms (in der Regel Sauerstoffatome, Stickstoffe und/oder Wasserstoffatome) in einem Molekül. Die Berechnung wurde unter anderem von Ertl, P. et al., Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment based contributions and its application to the prediction of drug transport properties, J. Med. Chem., 2000, 43, 3714–3717 beschrieben.
Ladungsfreiheit bzw. eine schwache Basizität der Verbindungen fördern die gute Penetration durch die Blut-Hirnschranke. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind weiterhin durch eine gute Photostabilität (geringe Photobleichung) und durch eine kurzlebige Singulettanregung gegenüber einer langlebigen Triplettanregung charakterisiert.
In 4 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Das Verfahren der 4 kann insbesondere unter Verwendung der Vorrichtungen der 1 oder 2 durchgeführt werden, kann jedoch auch unabhängig davon implementiert werden.
Zur Vorbereitung des eigentlichen Verfahrens werden in einem Schritt 140 beispielsweise einem menschlichen Patienten oder einem zu untersuchenden Tier τ-PHF sensitive Sonden zugeführt, beispielsweise eine der unter Bezugnahme auf 3 erläuterten Sonden. Diese Sonden lagern sich nach einer gewissen Zeit an τ-PHF im Auge an.
In Schritt 141 wird dann ein Übersichtsbild eines Augenhintergrundes mit einer entsprechenden Kameraeinrichtung wie den unter Bezugnahme auf 1 und 2 erläuterten Kameraeinrichtungen erstellt. Hierbei kann wie unter Bezugnahme auf 2 bereits erläutert eine Wellenlänge einer Beleuchtung und eine Detektion mittels einer Kamera beispielsweise mittels Farbfilter wie der Farbfilter 31 und 32 der 2 spektral an die Anregungswellenlänge bzw. Emissionswellenlänge der entsprechenden Sonde angepasst werden.
Beim Erstellen des Übersichtsbildes wird dabei allgemein der Augenhintergrund großflächig zur Fluoreszenz angeregt. Zur Vermeidung des Einflusses von Streulicht oder anderem Fremdlicht, beispielsweise Streulicht an einer dem Augenhintergrund vorgelagerten Schicht, beispielsweise der Augenlinse, können verschiedene Maßnahmen ergriffen werden. Beispielsweise kann der Augenhintergrund strukturiert beleuchtet werden, so dass sich hellere und dunklere Bereiche auf dem Augenhintergrund ergeben. Aus Intensitätsmessungen in den dunkleren Bereichen kann über die Kamera ein ortsaufgelöstes Untergrundsignal als Falschlichtverteilung ermittelt werden, das von einem das Falschlicht enthaltenden später aufgenommenen und gleichmäßig ausgeleuchteten Bild des Augenhintergrundes subtrahiert wird. So kann eine von Falschlicht im Wesentlichen freie Abbildung des Augenhintergrundes erzeugt werden. Die Ortsauflösung entspricht dabei der Auflösung der verwendeten Kamera wie der Kamera 27 der 2 und hängt unter anderem von der Anzahl von Bildpunkten der Kamera ab.
Bevorzugt werden dabei vor der eigentlichen Aufnahme zwei verschiedene Lichtmuster so erzeugt, dass die hellen Bereiche der beiden Lichtmuster sich zu einem vollständigen lückenlosen Bild (Hellbild) ergänzen und die dunkleren Bereiche der beiden Lichtmuster sich ebenso lückenlos zu einem Bild (Dunkelbild) ergänzen. So können bei der Streulichtverteilung Streuzentren in einem gesamten Querschnitt des Strahlengangs der Kameraeinrichtung berücksichtigt werden. Zudem kann so eine Streulichtverteilung mit hoher Genauigkeit ermittelt werden. Details zu entsprechenden Verfahren der Streulichtbestimmung finden sich beispielsweise in der DE 103 30 716 , der DE 103 47 389 , der DE 10 2004 053 730 und der DE 10 2006 031 177 .
In einem Schritt 142 werden dann interessierende Bereich definiert, insbesondere Bereiche, in welchen auf dem Übersichtsbild Fluoreszenz erkennbar ist. Dies kann vollautomatisch durch Bildanalyse oder halbautomatisch unter Einbeziehung von Benutzereingaben geschehen.
Bei manchen Ausführungsbeispielen wird bei der Erstellung des Übersichtsbildes und der Definition der interessierenden Bereiche nicht zwischen Fluoreszenz von an τ-PHF gebundenen Sonden und ungebundenen Sonden unterschieden. Bei anderen Ausführungsbeispielen werden bereits bei der Erstellung des Übersichtsbildes eine Fluoreszenzlebensdauer und/oder eine spektrale Fluoreszenzverteilung, beispielsweise durch Verwendung einer Farbkamera, bestimmt, um gebundene von ungebundenen Sonden unterscheiden zu können, da eine Bindung der Sonden an τ-PHF insbesondere eine langsame Komponente eines exponentiellen Abfalls eines Fluoreszenzabklingverhaltens der Fluoreszenz beeinflusst. Eine derartige Lebensdauermessung kann insbesondere dadurch bewerkstelligt werden, dass die Beleuchtung bei mindestens zwei Frequenzen bevorzugt im Megahertzbereich kombiniert wird und als Kamera eine Laufzeitkamera verwendet wird. Durch die Verwendung einer Spektralanalyse, auch als „Spectral Unmixing” bezeichnet, kann zudem Fluoreszenz von den interessierenden Sonden anderen Fluoreszenzquellen, beispielsweise Autofluoreszenz des Augenhintergrundes, unterschieden werden.
Bei Verwendung derartiger Verfahren können dann die interessierenden Bereiche in Schritt 142 nur auf Basis der an τ-PHF gebundenen Fluoreszenz erstellt werden.
In Schritt 143 werden dann die in Schritt 142 definierten interessierenden Bereiche mit einem Laser abgerastert und Fluoreszenz detektiert. Hierzu kann insbesondere ein konfokales Laser Scanning Ophthalmoskop wie auch in 2 dargestellt verwendet werden. Bei dieser Bildaufnahme kann insbesondere eine pixelweise spektrale Detektion auf mindestens zwei Kanälen erfolgen. Im Darauffolgenden können dann Strukturen segmentiert werden, d. h. identifiziert werden, welche Merkmale aufweisen, welche Merkmalen gepaarter helikaler τ-Filamente ähneln oder entsprechen. Zudem kann eine Lebensdauermessung durchgeführt werden, wobei hierzu eine Anzahl von Datenpunkten bei manchen Ausführungsbeispielen auf eine oder wenige Datenpunkte in den interessierenden Bereichen und angrenzenden Gebieten oder in den oben erwähnten Strukturen mit den den τ-PHF ähnlichen Merkmalen und benachbarten Gebieten beschränkt werden. Anstelle der Lebensdauermessung kann analog durch eine mikrospektroskopische Untersuchung, z. B. Ramanspektroskopie, molekülspezifisch die Anwesenheit und Bindung der Sonde an helikale τ-Filamente nachgewiesen werden. Derartige Messungen von Streulicht einer inelastischen Streuung, z. B. Ramangestreutem Licht, kann bei manchen Ausführungsbeispielen alternativ oder zusätzlich zu Fluoreszenzmessungen zum Nachweis der Sonden verwendet werden.
Zusätzlich oder alternativ zu einer derartigen Lebensdauermessung kann bei manchen Ausführungsbeispielen eine optische Kohärenztomographieaufnahme mit einer entsprechenden Laserscannereinrichtung erfolgen. Durch die Definition von interessierenden Bereichen, welche relativ klein sein können, und durch Beschränkung der Lebensdauer- bzw. spektroskopischen Messungen auf nur wenige Datenpunkte kann dabei insbesondere eine relativ kurze Untersuchungszeit erreicht werden, was für einen Patienten angenehmer ist und bei gleicher Zeit eine genauere Untersuchung der eigentlich interessierenden Bereiche ermöglicht.
Verschiedene Möglichkeiten und Varianten der Implementierung des Schrittes 143, insbesondere der oben erwähnten Maßnahmen, werden nun noch etwas genauer erläutert.
Generell erfolgt mit Laserscanneranordnungen eine serielle punktförmige Anregung der fluoreszierenden Objekte, wobei das punktförmig angeregte Feld konfokal in eine Feldblende abgebildet wird, welche bevorzugt von vor einem Detektor, bevorzugt einem Einzeldetektor, angeordnet ist. Aus nacheinander von jedem Punkt detektiertem Licht erfolgt nach Durchgang durch ein Sperrfilter ein Aufbau eines zweidimensionalen Bildes des fluoreszierenden Objekts. Durch die Konfokalität, welche bei dem Ausführungsbeispiel der 2 beispielsweise durch die Größe des Pinholes 12 beeinflusst werden kann, wird der Einfluss von Fluoreszenz- oder Streulicht aus Schichten, die sich nicht in der Fokalebene des Anregungs- oder Abbildungssystems befinden, stark reduziert.
Die Laserwellenlänge wird dabei insbesondere passend zu der verwendeten Sonde ausgewählt, d. h. es wird eine Laserwellenlänge ausgewählt, bei welcher die Sonde eine erhöhte Absorption und/oder Streuung und/oder Anregung zur Fluoreszenz bzw. Biolumineszenz aufweist. Die Laserwellenlänge kann dabei im sichtbaren oder infraroten Spektralbereich liegen.
Eine spektral aufgelöste Detektion, beispielsweise für das oben erwähnte „Spectral Unmixing” zur Unterscheidung gebundener Sonden von ungebundenen Sonden bzw. anderen Fluoreszenzquellen kann beispielsweise eine spektrale Aufspaltung des Lichtes und simultane Detektion in mehreren Kanälen erfolgen, beispielsweise in der Detektionseinrichtung 15 der 2. Zur Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer (Fluorescence Lifetime Imaging) kann beispielsweise eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung wie beispielsweise in der DE 199 20 158 oder der DE 101 45 823 beschrieben eingesetzt werden.
In einer verwendeten Detektionseinrichtung wie der Detektionseinrichtung 15 kann zu dem Reflexionslicht, d. h. Licht mit der Anregungswellenlänge, von Fluoreszenzlicht getrennt werden, beispielsweise durch entsprechende Farbfilter. So kann gleichzeitig mit Fluoreszenzmessungen ein Reflexionsbild aufgenommen werden, auf dessen Grundlage beispielsweise ein Ausgleich von Augenbewegungen zwischen den Einzelmessungen, beispielsweise Messungen an verschiedenen Punkten oder zwischen spektral aufgelöster Messung und Lebensdauermessung, erfolgen kann.
Optional kann in Schritt 144 noch eine ergänzende Diagnostik erfolgen, wobei diese auch parallel zu den vorhergehenden Schritten vorgenommen werden kann. Beispielsweise kann eine Autofluoreszenzdetektion erfolgen, oder es können andere Arten von Messungen wie optische Kohärenztomographiemessungen durchgeführt werden, beispielsweise um zusätzlich Augenerkrankungen, insbesondere mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziierte Augenerkrankungen, feststellen zu können.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren der 4 gewonnenen Informationen können dann zur Diagnose benutzt werden. Hierzu können die Daten beispielsweise mit Daten vorhergehender Untersuchungen am selben Patienten oder Daten einer Datenbank verglichen werden. Dabei können beispielsweise Größe und Struktur von fluoreszierenden Gebieten, spektrale Signaturen und Fluoreszenzlebensdauer in den fluoreszierenden Gebieten im Vergleich zur Umgebung, die Zuordnung von fluoreszierenden Gebieten zu Schichten der Retina, beispielsweise auf Basis von Lebensdauerdaten und/oder im Vergleich zu einer Morphologie der Retina, welche beispielsweise mit optischer Kohärenztomographie aufgenommen wurden, erfolgen, und eine Gesamtverteilung der Gebiete in der Retina berücksichtigt werden.
Während der Bildgebung, d. h. der Schritte 141 und 143 der 4, kann dabei eine Bewegung des Patienten und somit des zu untersuchenden Auges erfasst werden und berücksichtigt werden, wobei eine derartige Bewegung beispielsweise durch die Infrarotkamera 26 der 2 erfasst werden kann.
Durch die dargestellten erfindungsgemäßen Verfahren und Vorrichtungen kann insbesondere eine ante-mortem-Diagnose von Tauopathien erfolgen, ein Krankheitsverlauf überwacht werden und/oder eine entsprechende Therapie kontrolliert werden.
Zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung sind in 5 histologische Schnitte der Retina von Patienten gezeigt, die an zwei verschiedenen Tauopathien litten. Links ist eine Retina eines an Morbus Alzheimer (AD) erkrankten Patienten gezeigt, und rechts ist die Retina eines an progressiver Supranukleärer Blickparese (PSP) leidenden Patienten gezeigt. Mit Pfeilen sind τ-PHF-Ablagerungen in der inneren Körnerschicht (INL) gezeigt, welche in diesem Fall durch Färbung mit einem spezifischen Antikörper AT8 sichtbar gemacht wurden.
Die 6 zeigt in vivo Aufnahmen von τ-PHF in retinalen Ganglienzellen eines Mausmodells der alzheimerschen Erkrankung. Links ist eine Aufnahme bei einer Voruntersuchung dargestellt, rechts ist eine Aufnahme 48 Stunden nach Gabe einer spezifischen Sonde (FSB) dargestellt, die dargestellte Laser Scanning Ophthalmoskopaufnahme zeigt hell so markierte τ-PHF-Ablagerungen. Hieraus ist ersichtlich, dass die beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren zum Nachweis von τ-PHF in einer Retina geeignet sind.
Es ist zu bemerken, dass bei anderen Ausführungsbeispielen auch nur eine Kameraeinrichtung oder nur eine Laserscannereinrichtung zum Einsatz kommen kann.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2011/038892 A1 [0009]
DE 10330716 [0068]
DE 10347389 [0068]
DE 102004053730 [0068]
DE 102006031177 [0068]
DE 19920158 [0077]
DE 10145823 [0077]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Lockhart, et al., The Journal of Biological Chemistry, 280, 7677–7684 vom 4. März 2005 unter Material und Methoden [0055]
Ertl, P. et al., Fast calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment based contributions and its application to the prediction of drug transport properties, J. Med. Chem., 2000, 43, 3714–3717 [0062]

Claims

Verfahren zum Detektieren von gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) im Auge (10; 100), umfassend: Aufnehmen eines Übersichtsbildes einer Retina des Auges (10; 100), Identifizieren mindestens eines interessierenden Gebietes der Retina auf Basis des Übersichtsbildes, Abtasten des mindestens einen interessierenden Gebietes mit einem Laserstrahl, und Detektieren von Lichtemission von für gepaarte helikale τ-Filamente (107) sensitive Sonden in Antwort auf das Abtasten mit dem Laserstrahl.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bestimmen mindestens eines interessierenden Gebietes ein Identifizieren von Lichtemission von den Sonden (108, 109) in dem Übersichtsbild und ein Bestimmen des mindestens einen interessierenden Gebietes auf Basis der identifizierten Fluoreszenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Identifizieren der Lichtemission ein Unterscheiden von von an gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) gebundenen Sonden (108) stammender Lichtemission von von ungebundenen Sonden (109) stammender Lichtemission umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Detektieren von Lichtemission in Antwort auf den Laserstrahl ein Unterscheiden von von an gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) gebundenen Sonden (108) stammender Lichtemission von von ungebundenen Sonden (109) stammender Lichtemission umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Unterscheiden auf Basis eines Spektrums der Lichtemission und/oder auf Basis einer Dauer der Lichtemission erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Detektieren von Lichtemission in Antwort auf das Abtasten eine zeitaufgelöste Messung der Lichtemission umfasst, wobei die zeitaufgelöste Messung nur in einem Teil der interessierenden Gebiete durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Aufnehmen eines Übersichtsbildes ein Beleuchten der Retina des Auges in einem ersten Wellenbereich, in welchem eine Anregungswellenlänge der Sonden (108, 109) liegt, und ein Filtern von der Retina in Antwort auf das Beleuchten ausgehenden Lichtes derart, dass das Übersichtsbild auf Basis von Licht in einem zweiten Wellenlängenbereich, welche eine Lichtemissionswellenlänge der Sonden (108, 109) enthält, umfasst, wobei sich der erste Wellenlängenbereich von dem zweiten Wellenlängenbereich unterscheidet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Abtasten und das Detektieren mit einem Laser Scanning Ophthalmoskop erfolgen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–8, weiter umfassend Aufnahme einer Morphologie der Retina des Auges, und Korrelieren der detektierten Lichtemission mit der Morphologie des Auges.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–9, weiter umfassend Durchführen einer zusätzlichen optischen Messung zur Detektion vor für Augenkrankheiten typischen Merkmalen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Abtasten mit einer Ortsauflösung < 20 μm erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–11, wobei die Sonde ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Arylaminothiazole, 4,6-Divinylpyrimidine, 2,5- und 3,6-Divinylpyrazine, [4-(1,3-Benzothiazol-2-yl)phenyl]hydrazone, Diarylharnstoffe, Tetracyclin, 4,4'-(1E,1'E)-2,2'-(1-aryl-1H-pyrazole-3,5-diyl)bis(ethene-2,1-diyl)bis-2-methoxyphenole, 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)benzonitril, 2,5-Bis(4-hydroxystyryl)-N-benzamide.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei die Lichtemission eine Fluoreszenz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–13, wobei die Lichtemission inelastisch gestreutes Streulicht umfasst.
Vorrichtung zur Detektion von gepaarten helikalen τ-Filamenten (107) in einer Retina eines Auges, umfassend: eine Kameraeinrichtung (103; 40) zum Aufnehmen eines Übersichtsbildes einer Retina des Auges (10; 100), eine Steuerung (104) zum Bestimmen mindestens eines interessierenden Gebietes des Auges auf Basis des Übersichtsbildes und zum Ansteuern einer Laserscannereinrichtung (102; 41, 1, 2, 14, 15) derart, dass die Laserscannereinrichtung (102; 41, 1, 2, 14, 15) das mindestens eine interessierende Gebiet mit einem Laserstrahl abtastet und Lichtemission von für gepaarte τ-Filamente sensitiven Sonden (108, 109) in Antwort auf das Abtasten mit dem Laserstrahl detektiert.
Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Kameraeinrichtung (103; 40) eine Beleuchtung (16), einen Farbfilter (31) zum Selektieren eines Wellenlängenbereichs umfassend eine Anregungswellenlänge der Sonde (50; 108, 109) zur Beleuchtung der Retina, eine Kamera (27) und einen zweiten Farbfilter (32) zum Selektieren der Lichtemission von den Sonden (108, 109) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–14 ausgestaltet ist.