DE102007025425A1

DE102007025425A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Eliminierung störender Fluoreszenz bei der Fluoreszenzauswertung von Objekten, beispielsweise des Augenhintergrundes

Info

Publication number: DE102007025425A1
Application number: DE200710025425
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr. Ing. habil. Schweitzer; Martin Dr. rer. nat. Hammer
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2007-05-30
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2008-12-04

Abstract

Aufgabe war es, bei beliebiger bildgebender Fluoreszenzauswertung von Objekten strörende Fluoreszenz vollständig zu eliminieren, ohne die Fluoreszenzauswertung des zu untersuchenden Objekts zu beeinträchtigen. Erfindungsgemäß wird bei der Beleuchtung (1) des Objekts (2) zu dessen Fluoreszenzanregung ein lokal begrenzter Bereich (10) des Objekts (2) mittels einer Blende (9) abgeschattet. Für diesen abgeschatteten Bereich (10) wird die störende Fluoreszenz gemessen und ein vorzugsweise statistisches Störfluoreszenzsignal gewonnen, welches für jeden Pixel des Fluoreszenzbildes des Objekts (2) von dessen gesamten Fluoreszenzsignal substrahiert wird. Die Erfindung ist beispielsweise für opthalmologische Anwendungen vorgesehen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Eliminierung von störender Fluoreszenz, die im optischen Strahlengang vor dem in seiner Fluoreszenz auszuwertenden Objekt liegt, bei der Auswertung, insbesondere Messung, der Fluoreszenz dieses Objekts. Für medizinische Anwendungen ist die Erfindung beispielsweise zur Fluoreszenzmessung oder -beobachtung des Augenhintergrundes interessant, welche insbesondere durch Störfluoreszenz der Augenlinse beeinträchtigt sein kann. Eine solche Störfluoreszenz entsteht insbesondere durch am Augehintergrund reflektiertes oder in der Augenlinse gestreutes Licht. Die Erfindung ist jedoch nicht auf ophthalmologische Anwendungen beschränkt. Ein weiteres Anwendungsgebiet ist z. B. die Fluoreszenzmikroskopie, bei der die Eigenfluoreszenz der Mikroskopoptik die Beobachtung schwacher Fluoreszenzen des Objektes stören kann.
Das Prinzip der Aperturblendenteilung zur Beobachtung des Augenhintergrundes unter Ausschaltung der störenden Reflexe der vorderen Augenmedien ist seit der Einführung des Augenspiegels nach Helmholtz (1851) bekannt. Dieses Prinzip schließt auch Fluoreszenzen der Augenlinse von der Beobachtung aus, sofern diese direkt durch die Beleuchtung, beispielsweise eines Ophthalmoskops oder einer Funduskamera, entstehen. Da die Fluoreszenz der Linse jedoch viel stärker als die Eigenfluoreszenz des Augenhintergrundes sein kann, ist es möglich, dass die Fluoreszenz des Augenhintergrundes durch die Fluoreszenz der Linse, welche durch am Augehintergrund reflektiertes oder in der Linse gestreutes Licht angeregt wird, überstrahlt wird. Abhilfe kann hier die Verwendung einer Anregungswellenlänge schaffen, die keine Linsenfluoreszenz anregt (z. B. R. F. Spaide: Fundus autofluorescence and age-related macular degeneration, Ophthalmology 110(2), 2003, p. 392–9). Diese regt jedoch auch am Augenhintergrund nur bestimmte Fluorophore an und schränkt somit die mögliche diagnostische Aussagekraft der Fluoreszenzbeobachtung ein.
Eine andere Möglichkeit der Unterdrückung des Fluoreszenzlichtes besteht in der Anwendung der im Scanning Laser Ophthalmoskop (SLO) realisierten konfokalen Abbildung (R. H. Webb and G. W. Hughes: Scanning loser ophthalmoscope, IEEE Trans Biomed Eng 28(7), 1981, p. 488–92). Hier unterdrückt eine vor dem Photoempfänger in einer zum zu untersuchenden Objekt (Augenhintergrund) konjugierten Ebene angebrachte Blende (einhole) Licht aus anderen Tiefen des Objektes, also auch der Augenlinse. Allerdings unterdrückt auch dieses Verfahren die Linsenfluoreszenz nicht vollständig (D. Schweitzer, M. Hammer and F. Schweitzer: Limits of the confocal laser-scanning technique in measurements of time-resolved autofluorescence of the ocular fundus, Biomed Tech (Berl) 50(9), 2005, p. 263–7).
Deshalb haben Schweitzer et al ein Verfahren und eine Vorrichtung vorgeschlagen, die es ermöglicht, die Fluoreszenz in verschiedenen Tiefenebenen zu messen und miteinander zu verrechnen ( DE 10 2004 042 197 A1 und DE 10 2004 042 198 A1 ).
Die beschriebenen technischen Lösungen sind jedoch sehr speziell und beschränkt auf die Anwendung in einem konfokalen Scanning Laser Ophthalmoskop (SLO). Das Verfahren nach DE 10 2004 042 197 A1 erfordert die Aufnahme von mindestens zwei Fluoreszenzbildern aus unterschiedlichen Objekttiefen, wozu mindestens eine Linse zusätzlich in den Strahlengang zu bringen oder in ihrer Position zu verändern ist. Mehrere Fluoreszenzaufnahmen bergen die Gefahr von Bewegungsartefakten sowie von unterschiedlichen Aufnahmebedingungen für die Fluoreszenzbilderfassung, welche die Auswertung verfälschen können.
Die Vorrichtung nach DE 10 2004 042 198 A1 erfordert dagegen ein System von zueinander ausgerichteten Apertur- und Feldblenden, was ausschließlich in einer konfokalen Optik realisiert werden kann, wodurch eine universelle Anwendbarkeit ebenfalls nicht gegeben ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, bei beliebiger bildgebender Fluoreszenzauswertung von Objekten störende Fluoreszenz vollständig zu eliminieren, ohne die Fluoreszenzauswertung des zu untersuchenden Objekts zu beeinträchtigen.
Die Fluoreszenzauswertung (Messung oder Beobachtung) mit besagter Störfluoreszenzeliminierung soll mit beliebigen optischen Systemen, beispielsweise Funduskamera, Scanning Laser Ophthalmoskop, Mikroskop etc., anwendbar sowie mit lediglich einer einzigen Fluoreszenzaufnahme des zu untersuchenden Objekts möglich sein, um insbesondere eventuelle Bewegungsartefakte sowie unterschiedliche Aufnahmebedingungen für die Fluoreszenzbilderfassung auszuschließen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in einem beliebigen bildgebenden optischen System zur Fluoreszenzauswertung gelöst, indem bei der Beleuchtung des Objekts zu dessen Fluoreszenzanregung ein lokal begrenzter Bereich des Objekts mittels einer optischen Blende von dieser Beleuchtung abgeschattet wird und das gesamte Fluoreszenzbild des beleuchteten Objekts mit dem von der Beleuchtung abgeschatteten Bereich aufgenommen wird. Aus diesem Fluoreszenzbild wird ein dem abgeschatteten Bereich entsprechendes Störfluoreszenzsignal gewonnen, welches im Strahlengang vor dem Objekt entstehendes (störendes) Licht repräsentiert. Dieses Licht (das im Falle einer Fluoreszenzauswertung des Augenhintergrundes beispielsweise in der Augenlinse entsteht) wird in Intensität, in spektraler Zusammensetzung, im Zeitverhalten etc. separat erfasst und dient dazu, die Werte der Fluoreszenz außerhalb der lokalen Objektabschattung durch die Blende (die als Überlagerung der Fluoreszenz des Objektes mit der besagten Störung in Erscheinung treten) zu korrigieren. Hierzu wird das dem Bereich der lokalen Blendenabschattung des Objekts entsprechende Störfluoreszenzsignal, insbesondere als statistische Größe, beispielsweise als Mittelwert oder als Median, erfasst und für jeden Pixel des Fluoreszenzbildes des Objekts von dessen gesamtem Fluoreszenzsignal subtrahiert. Diese pixelweise Subtraktion zur Störfrequenzeliminierung kann rechentechnisch und damit relativ aufwandgering durchgeführt werden.
Durch die Erfindung gelingt mit nur einer einzigen erforderlichen Fluoreszenzaufnahme vom Objekt eine vollständige und zuverlässige Eliminierung der besagten Störfluoreszenz. Für medizinische Anwendungen (z. B. zur Fluoreszenzmessung oder -beobachtung des Augenhintergrundes, welche insbesondere durch Störfluoreszenz der Augenlinse beeinträchtigt sein kann) ist dieser Vorteil von besonderem Interesse, da für die Fluoreszenzauswertung nicht mehrere Aufnahmen vom Objekt erstellt werden müssen, zumal in der Praxis Bewegungsartefakte sowie unterschiedliche Aufnahmebedingungen kaum auszuschließen sind.
Vorteilhaft ist auch, dass die vorgeschlagene Störfluoreszenzeliminierung für beliebige bildgebende Verfahren und Systeme zur Fluoreszenzauswertung, gleich ob Funduskamera, Scanning Laser Ophthalmoskop, Mikroskop etc., und auch ohne jegliche Beschränkung des Wellenlängenbereiches bei der Fluoreszenzauswertung des Objekts anwendbar ist.
Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in der Zeichnung dargestellten ophthalmologischen Ausführungsbeispiels näher erläutert werden.
Eine Lichtquelle 1 beleuchtet einen in seiner durch Beleuchtung zur Fluoreszenz angeregten Augenhintergrund 2 als auszuwertendes Objekt über ein für ophthalmologische Geräte an sich bekanntes optisches System, enthaltend einen Lochspiegel 3, zwei im Beleuchtungs- und im Beobachtungsstrahlengang angeordnete und aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellte Aperturblenden, deren Bilder 4 in der Ebene einer Augenlinse 5 räumlich getrennt voneinander entstehen, sowie eine Objektivlinse 6.
Für die Fluoreszenzbeobachtung werden ein optischer Anregungsfilter 7 in den Beleuchtungsstrahlengang sowie ein die Anregungswellenlänge ausschließender Sperrfilter 8 in den Beobachtungsstrahlengang gebracht. Die Aperturblenden mit ihren Aperturblendenbildern 4 verhindern durch ihre Aufteilung, dass Reflexions- oder Fluoreszenzlicht aus der Augenlinse 5 zur Beobachtung gelangt. Jedoch kann am Augenhintergrund 2 reflektiertes Licht die Linsenfluoreszenz auch in dem Bereich der Augenlinse 5 anregen, durch den das zur Beobachtung gelangende Licht tritt. Diese überlagert somit in bekannter Weise die zu beobachtende Fluoreszenz des Augenhintergrundes 2.
Erfindungsgemäß wird nun eine Blende 9 in den Beleuchtungsstrahlengang eingeführt. Diese Blende 9 befindet sich in einer zum Augenhintergrund 2 konjugierten Ebene, so dass sie ein scharf begrenztes Blendenbild 10 auf diesen wirft. Durch dieses Blendenbild 10 wird der Augenhintergrund 2 lokal begrenzt von der Beleuchtung der Lichtquelle 1 abgeschattet.
Wird nun in einer zum Objekt (Augenhintergrund 2) konjugierten Bildebene 11 beobachtet, so kann auf einem Abbild 12 des auf den Augenhintergrund 2 abgebildeten Blendenbildes 10 die Linsenfluoreszenz, d. h. die vor dem Augenhintergrund 2 entstehende Störfluoreszenz, gemessen werden. Zur Messung bzw. Beobachtung der integralen Fluoreszenz eignet sich beispielsweise ein in der Bildebene 11 vorgesehener an sich bekannter CCD-Bilddetektor 13.
Um die Fluoreszenz spektral oder zeitlich aufzulösen, können auch entsprechende abbildende Spektrographen bzw. Fluorescence Lifetime Imaging(FLIM)-Ausrüstung zur Anwendung kommen (ebenfalls nicht dargestellt).
Eine grobe spektrale Auflösung kann erzielt werden, indem statt eines CCD-Sensors eine Farb-CCD-Kamera verwendet wird.
Um dieses Abbild 12 herum, kann die Fluoreszenz des Augenhintergrundes 2 gemessen werden, die durch Beleuchtung des Augenhintergrundes 2 (außerhalb des die Beleuchtung abschattenden Blendenbildes 10 herum) entsteht und welcher die Störfluoreszenz, hervorgerufen durch die Augenlinse 5, überlagert ist.
Zur Elimination dieser der Fluoreszenz des Augenhintergrundes 2 überlagerten Linsenfluoreszenz wird im Abbild 12 der Bildebene 11 ein Störfluoreszenzsignal als statische Größe, beispielsweise als Mittelwert oder als Median, ermittelt, welches vom gesamten Fluoreszenzbild in der Bildebene 11 pixelweise subtrahiert wird. Zur bildlichen Aufnahme der Fluoreszenz des Augenhintergrundes 2 in der Bildebene 11 sowie der im Bild 12 des Schattens (Blendenbild 10) detektierbaren Störfluoreszenz dient ein Bildsensor 13, beispielsweise eine CCD-Kamera. Die Fluoreszenzaufnahme sowie die Kompensation der Störfluoreszenz kann je nach Aufnahmentechnik integral oder in jedem spektralen oder zeitlichen Kanal geschehen. Dabei sollten nur Messwerte aus dem zentralen Kernschatten des Abbildes 12 verwendet werden um das von außeraxialen Strahlen auf den Rand des Abbildes 12 des Blendenbilds 10 abgebildetes Fluoreszenzlicht des Augenhintergrundes 2 von der Messung der Störfluoreszenz der Augenlinse 5 auszuschließen.
Die pixelweise Subtraktion des Störfluoreszenzsignals vom Fluoreszenzsignal des Augenhintergrundes 2 erfolgt durch nicht abgebildete Auswerte- und Rechentechnik, welche an den oder die Bildaufnahmeelemente in der Bildebene 11 angeschlossen werden.
Um die Lage des durch die Blende 9 von der Beleuchtung und Fluoreszenzanregung abgeschatteten lokal begrenzten Bereichs zu verändern (oder gänzlich auszublenden), ist es möglich, die Blende 9 bewegbar anzuordnen (nicht in der Zeichnung dargestellt), um die Blende 9 beispielsweise in den Beleuchtungsstrahlengang ein- und ausschwenken zu können.

1: Lichtquelle
2: Augenhintergrund
3: Lochblende
4: Aperturblendenbilder
5: Augenlinse
6: Objektivlinse
7: Anregungsfilter
8: Sperrfilter
9: Blende
10: Blendenbild der Blende 9
11: Bildebene (zum Augenhintergrund 2 konjugiert)
12: Abbild des Blendenbildes 10
13: Bildsensor (z. B. CCD-Matrix)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 102004042197 A1 [0004, 0005]
- DE 102004042198 A1 [0004, 0006]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- R. F. Spaide: Fundus autofluorescence and age-related macular degeneration, Ophthalmology 110(2), 2003, p. 392–9 [0002]
- R. H. Webb and G. W. Hughes: Scanning loser ophthalmoscope, IEEE Trans Biomed Eng 28(7), 1981, p. 488–92 [0003]
- D. Schweitzer, M. Hammer and F. Schweitzer: Limits of the confocal laser-scanning technique in measurements of time-resolved autofluorescence of the ocular fundus, Biomed Tech (Berl) 50(9), 2005, p. 263–7 [0003]

Claims

Verfahren zur Eliminierung störender Fluoreszenz bei der Fluoreszenzauswertung von Objekten, beispielsweise des Augenhintergrundes, bei dem das Objekt beleuchtet und von dem beleuchteten Objekt ein Fluoreszenzbild erfasst wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein lokal begrenzter Bereich des Objekts von dieser Beleuchtung abgeschattet wird, dass das gesamte Fluoreszenzbild des beleuchteten Objekts mit dem von der Beleuchtung abgeschatteten Bereich aufgenommen wird, dass aus diesem Fluoreszenzbild ein dem abgeschatteten Bereich entsprechendes Störfluoreszenzsignal gewonnen wird und dass das Störfluoreszenzsignal für jeden Pixel des Fluoreszenzbildes des Objekts von dessen gesamtem Fluoreszenzsignal subtrahiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Störfluoreszenzsignal für den von der Beleuchtung abgeschatteten Bereich des Objekts als statistische Größe, beispielsweise als Mittelwert oder als Median, für die Subtraktion vom gesamten Fluoreszenzsignal des Objekts erfasst wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenz bei der Erzeugung des Fluoreszenzbildes vom Objekt sowie bei der Erfassung des Störfluoreszenzsignals mittels bildgebender Spektroskopie spektral aufgelöst wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenz bei der Erzeugung des Fluoreszenzbildes vom Objekt sowie bei der Erfassung des Störfluoreszenzsignals mittels einer Farbkamera in diskreten spektralen Kanälen aufgenommen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenz durch Beobachtung deren zeitlichen Abklingverhaltens, insbesondere durch Fluoreszenz Lifetime Imaging, ausgewertet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zwecks Vermeidung von Bewegungsartefakten sowie unterschiedlichen Aufnahmebedingungen für die Fluoreszenz bilderfassung des Objekts lediglich eine einzige Fluoreszenzaufnahme unter Abschattung des lokal begrenzten Bereichs des zu untersuchenden Objekts, vorgenommen wird.
Vorrichtung zur Eliminierung störender Fluoreszenz bei der Fluoreszenzauswertung von Objekten, beispielsweise des Augenhintergrundes, bei der in einem optischen System eine Lichtquelle zur Beleuchtung des Objekts vorgesehen ist, deren Licht über optische Elemente, wie Linsen und Spiegel, auf das Objekt abgebildet wird, sowie mit Mitteln zur Aufnahme eines durch die Beleuchtung entstehenden Fluoreszenzbildes vom Objekt, dadurch gekennzeichnet, dass im Beleuchtungsstrahlengang zur Beleuchtung des Objekts (2) eine Blende (9) in einer zum Objekt (2) konjugierten Ebene angeordnet ist, durch welche das Objekt (2) lokal begrenzt von der Beleuchtung (1) abgeschattet ist, und dass Mittel vorgesehen sind zur Messung (13) der im von der Beleuchtung (1) abgeschatteten Bereich des Objekts (2) auftretenden Störfluoreszenz sowie zu dessen pixelweisen Subtraktion von dem durch die Beleuchtung des Objekts (2) entstehenden gesamten Fluoreszenzbild.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel zur Subtraktion der Störfluoreszenz vom gesamten Fluoreszenzbild rechentechnisch realisiert sind.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches System eine Funduskamera vorgesehen ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches System ein Scanning Laser Ophthalmoskop vorgesehen ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als optisches System ein Mikroskop vorgesehen ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Blende (9) zur lokal begrenzten Abschattung des Objekts (2) schwenkbar angeordnet ist.