DE102011053541A1

DE102011053541A1 - Chemical marker useful for binding to purified biomolecule e.g. antibodies binds to human epidermal growth factor receptor 2 in breast cancer cells, comprises dendrimer comprising chromophores and reactive coupling group

Info

Publication number: DE102011053541A1
Application number: DE201110053541
Authority: DE
Inventors: Dr. Böse Guido
Original assignee: Nanospot GmbH
Current assignee: Nanospot GmbH
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2011-09-12
Publication date: 2013-03-14

Abstract

Chemical marker comprises dendrimer comprising several chromophores and bound reactive coupling group. An independent claim is included for method of optical detection of binding of an antibody to binding site.

Description

Die Erfindung betrifft einen Marker zum optischen Nachweis der Bindung eines Biomoleküls, insbesondere eines Antikörpers an eine Bindungsstelle.The invention relates to a marker for the optical detection of the binding of a biomolecule, in particular an antibody to a binding site.

Ein wichtiges Ziel der medizinischen Diagnostik ist der Nachweis von Antigenen in verschiedenen Proben, z.B. aus Gewebe oder Blut. Antigene können durch spezifische Antikörpern gebunden und erkannt werden. Eine häufige Anwendung ist der „Enzyme Linked Immunosorbent Assay“ (ELISA), der für zahlreiche medizinisch-diagnostische Verfahren eingesetzt wird, z.B. zum Nachweis von Antigenen aus Blutproben im Nachweis verschiedener Erreger, Autoimmunkrankheiten oder der Quantifizierung von Blutbestandteilen. Hierbei wird eine Antigen-Antikörper-Bindung im Assay in ein colorimetrisches oder fluoreszentes Signal umgewandelt, um ein nachweisbares Messsignal zu erhalten. Ein ausreichend starkes colorimetrisches oder fluoreszentes Signal erhält man beim ELISA Assay dadurch, dass an den Antikörper ein Enzym, beispielsweise eine Peroxidase, gebunden ist, die die chemische Umwandlung von nicht farbigen oder nicht fluoreszenten Substratmolekülen in farbige oder fluoreszente Substratmoleküle katalysiert. Die so erzeugten Substratmoleküle sind allerdings nicht an den Antikörper gebunden, sondern diffundieren frei im Medium, beispielsweise in einer Lösung. Dadurch ist zwar die quantitative Bestimmung eines Antigens möglich, aber nicht dessen direkte Beobachtung und Lokalisation, etwa auf einer Zelloberfläche.An important goal of medical diagnostics is the detection of antigens in various samples, e.g. from tissue or blood. Antigens can be bound and recognized by specific antibodies. A common application is the Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), which is used in numerous medical diagnostic procedures, e.g. for the detection of antigens from blood samples in the detection of various pathogens, autoimmune diseases or the quantification of blood constituents. Here, an antigen-antibody binding in the assay is converted into a colorimetric or fluorescent signal to obtain a detectable measurement signal. A sufficiently strong colorimetric or fluorescent signal is obtained in the ELISA assay by binding to the antibody an enzyme, for example a peroxidase, which catalyzes the chemical conversion of non-colored or non-fluorescent substrate molecules into colored or fluorescent substrate molecules. However, the substrate molecules thus produced are not bound to the antibody, but diffuse freely in the medium, for example in a solution. Thus, although the quantitative determination of an antigen is possible, but not its direct observation and localization, such as on a cell surface.

Zur Analyse von Zellen und insbesondere der Diagnostik von Krebszellen hinsichtlich verschiedener Parameter wie Zelltypus, Differenzierung, Tumorentstehung oder Metastasierung ist es allerdings notwendig, einzelne Antigene auf Zelloberflächen nachzuweisen. Hierfür werden spezifische Antikörper an die nachzuweisenden Zelloberflächenantigene gebunden und der Antikörper muss durch einen Marker sichtbar gemacht werden. Dies kann entweder durch eine direkte Fluoreszenzmarkierung des Primärantikörpers oder zum Beispiel durch eine Bindung eines fluoreszenzmarkierten Zweitantikörpers an den Primärantikörper und die anschließende Detektion in einem Fluoreszenzmikroskop erfolgen. Unter „Fluoreszenzmarkierung“ ist die kovalente Bindung eines Fluorophors zu verstehen.However, for the analysis of cells and in particular the diagnosis of cancer cells with respect to various parameters such as cell type, differentiation, tumorigenesis or metastasis, it is necessary to detect individual antigens on cell surfaces. For this purpose, specific antibodies are bound to the cell surface antigens to be detected and the antibody must be made visible by a marker. This can be done either by a direct fluorescence labeling of the primary antibody or, for example, by a binding of a fluorescently labeled second antibody to the primary antibody and the subsequent detection in a fluorescence microscope. By "fluorescent label" is meant the covalent attachment of a fluorophore.

Die Bindung des fluoreszenten Chromophors, d.h. eines zur Fluoreszenz anregbaren Farbstoffes, an den Zweitantikörper erfolgt über am Antikörper vorhandene Aminogruppen oder Zuckerreste, die oxidiert und dann modifiziert werden. Ein Problem hierbei ist, dass an den Zweitantikörper nur ein oder wenige Chromophore gebunden werden können. Dadurch wird kein hinreichend intensives Fluoreszenzsignal erzeugt, welches in einem üblichen Fluoreszenzmikroskop sichtbar wäre. Es müssen also viele Antikörper und fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper an die Zellen gebunden werden, um ein nachweisbares Fluoreszenzsignal zu erzeugen. Dies setzt aber voraus, dass auch viele Antigene auf der Zelloberfläche vorhanden sind, was oft nicht der Fall ist. So ist aus diesem Grund zum Beispiel der Nachweis des Her2-Antigens auf Zellen nicht direkt nachweisbar. Das Her2-Protein wird in ca. 20% der Patientinnen mit invasivem Mammakarzinom überexprimiert, so dass ein immunhistochemischer Nachweis für die Diagnose, Prognose und Behandlung wünschenswert ist. Im Blut sind aber nur wenige Zellen mit geringer Antigendichte vorhanden, so dass das beschriebene Nachweisverfahren nicht angewandt werden kann.The binding of the fluorescent chromophore, i. a fluorescent stimulable dye to the secondary antibody via the amino groups present on the amino groups or sugar residues, which are oxidized and then modified. A problem with this is that only one or a few chromophores can be bound to the secondary antibody. As a result, no sufficiently intense fluorescence signal is generated, which would be visible in a conventional fluorescence microscope. Thus, many antibodies and second fluorescently labeled antibodies must be bound to the cells to produce a detectable fluorescent signal. However, this presupposes that many antigens are present on the cell surface, which is often not the case. For this reason, for example, the detection of the Her2 antigen on cells is not directly detectable. The Her2 protein is overexpressed in about 20% of patients with invasive breast cancer, so immunohistochemical evidence is desirable for diagnosis, prognosis and treatment. In the blood, however, only a few cells with low antigen density are present, so that the described detection method can not be used.

Um dieses Problem zu lösen, wird zur Verstärkung des Fluoreszenzsignals der Antigen-Antikörper-Bindung, aber auch der Interaktion eines Biomoleküls mit einem anderen der O-Link-Assay im Handel angeboten. Hierbei ist an einem Biomolekül eine kurze Nukleinsäure gebunden, an die zunächst eine weitere Nukleinsäure hybridisiert wird. Durch eine Polymerase wird in einer „Rolling Circle Amplifikation“ dieser Strang verlängert. An den verlängerten Strang können dann viele Oligonukleotide gebunden werden, die jeweils mit einem Fluorophor markiert sind. So kann ein verstärktes Fluoreszenzsignal erzeugt und gemessen werden. Hierfür ist allerdings sowohl die Fixierung der Zellen als auch verschiedene Wasch-, Polymerisations- und Hybridierungsschritte notwendig. Diese Nachweismethode ist daher sehr zeitaufwendig und kostenintensiv.To solve this problem, the amplification of the fluorescent signal of the antigen-antibody binding, but also the interaction of one biomolecule with another of the O-link assay is commercially available. Here, a short nucleic acid is bound to a biomolecule, to which first a further nucleic acid is hybridized. A polymerase prolongs this strand in a rolling circle amplification. Many oligonucleotides, each labeled with a fluorophore, can then be attached to the extended strand. Thus, an amplified fluorescence signal can be generated and measured. For this, however, both the fixation of the cells and various washing, polymerization and hybridization steps is necessary. This detection method is therefore very time consuming and costly.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen kostengünstigen Marker zum optischen Nachweis der Bindung eines Biomoleküls, insbesondere eines Antikörpers, an eine Bindungsstelle vorzuschlagen, der ein verstärktes optisches Signal liefert und eine höhere Messgenauigkeit ermöglicht.The object of the invention is therefore to propose a cost-effective marker for the optical detection of the binding of a biomolecule, in particular an antibody, to a binding site, which provides an amplified optical signal and enables a higher accuracy of measurement.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass der Marker ein Dendrimer umfasst, an dem mehrere Chromophore und eine reaktive Kopplungsgruppe gebunden sind. Ein Marker im Sinne der Erfindung ist eine optische Sonde zum Nachweis von Biomolekülen. Dendrimere sind Kaskadenpolymere, die ausgehend von einem Verzweigungskern („Core“) repetitive Molekülketten aufweisen. Es kann eine Verzweigung zu zwei oder auch mehr Verknüpfungsstellen geben. Durch die baumartige Struktur können sehr viele Chromophore in günstiger räumlicher Anordnung, bevorzugt endständig, an die Molekülketten des Dendrimers gebunden werden. Der erfindungsgemäße Marker weist außerdem eine reaktive Kopplungsgruppe auf, die an Biomoleküle bindet, wodurch diese durch den Marker markiert werden. So können vor einer Messung beispielsweise Antikörper zu dem Marker zugegeben werden. Ein Antikörper bindet dann kovalent jeweils an die eine reaktive Kopplungsgruppe des Markers. Unmarkierte Antikörper oder ungebundene Marker sollten abgetrennt werden. Das Biomolekül, der im genannten Beispiel als Antikörper ausgebildet ist, kann dann wiederum hochspezifisch an eine Bindungsstelle binden. Eine Bindungsstelle ist ein Epitop eines Antigens, an das der hierfür spezifische Antikörper bindet. Die für den Nachweis der Bindung bzw. des Antigens notwendige Verstärkung des optischen Signals erfolgt dadurch, dass nicht ein oder wenige, sondern sehr viele Chromophore an das Dendrimer gebunden sind, wobei bis etwa 1000 Chromophore an das Dendrimer gekoppelt sein können. Hierdurch wird ein sehr intensives optisches Signal geliefert, wodurch es möglich ist, lokalisiert einzelne Biomoleküle, insbesondere Antikörper, mikroskopisch sichtbar zu machen und nachzuweisen, die an eine Bindungsstelle bzw. ein Antigen gebunden haben. Durch das starke optische Signal ist das einzelne Biomolekül, bzw. der einzelne Antikörper, also in einem Fluoreszenzmikroskop direkt sichtbar. Somit kann auch eine Bindung dieses Antikörpers, beispielsweise an ein Protein auf einer Zelloberfläche oder in einer Zelle, direkt sichtbar gemacht werden. Ein weiterer, erheblicher Vorteil besteht darin, dass der erfindungsgemäße Marker auch an mehreren oder einzelnen lebenden Zellen eingesetzt werden kann und diese in vivo untersucht werden können.This object is achieved in that the marker comprises a dendrimer to which a plurality of chromophores and a reactive coupling group are bonded. A marker according to the invention is an optical probe for the detection of biomolecules. Dendrimers are cascade polymers that have repetitive molecular chains starting from a "core". There may be a branch to two or more junctions. Due to the tree-like structure, a large number of chromophores can be bonded to the molecular chains of the dendrimer in a favorable spatial arrangement, preferably terminally. The marker according to the invention also has a reactive coupling group which binds to biomolecules, whereby these are marked by the marker. For example, antibodies may be added to the marker prior to measurement. One Antibody then covalently binds each to one reactive coupling group of the marker. Unlabeled antibodies or unbound markers should be separated. The biomolecule, which is designed as an antibody in the example mentioned, can then in turn bind highly specifically to a binding site. A binding site is an epitope of an antigen to which the specific antibody binds. The amplification of the optical signal necessary for the detection of the binding or of the antigen takes place in that not one or a few, but very many chromophores are bound to the dendrimer, it being possible for up to about 1000 chromophores to be coupled to the dendrimer. This provides a very intense optical signal, which makes it possible to visualize and detect localized individual biomolecules, in particular antibodies, which have bound to a binding site or an antigen. As a result of the strong optical signal, the individual biomolecule, or the individual antibody, is directly visible in a fluorescence microscope. Thus, also a binding of this antibody, for example to a protein on a cell surface or in a cell, can be directly visualized. Another significant advantage is that the marker according to the invention can also be used on several or individual living cells and these can be examined in vivo.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben und werden nachfolgend erläutert.Advantageous embodiments are specified in the subclaims and are explained below.

Wenn die Chromophore als, insbesondere hoch-wasserlösliche, Fluorophore ausgebildet sind, kann als optischer Nachweis das Fluoreszenzsignal des Farbstoffes verwendet werden. Um eine gute Löslichkeit in wässrigen und biologischen Lösungen zu erreichen, werden vorzugsweise Fluorophore der kommerziellen Oyster-Serie eingesetzt. Diese Fluorophore enthalten eine spezielle Gruppe, welche den eher hydrophoben aromatischen Ring des Farbstoff-Kerns mit zahlreichen geladenen Gruppen abschirmt und somit eine Adhäsion an Oberflächen und Lipidmembranen vermindert. Um Kosten zu reduzieren, können die Oyster-Fluorophore auch gemeinsam mit kostengünstigeren Fluorophoren mit weniger aufwendiger Abschirmung der eher hydrophoben, chromophoren Gruppe an ein Dendrimer gebunden werden. Das Mischungsverhältnis von hoch abgeschirmtem und somit hydrophilem, aber kostenaufwändigem Fluorophor und dem weniger hydrophilen, aber kostengünstigerem Fluorophor an einem Dendrimer kann so eingestellt werden, dass der Marker durch einen ausreichenden Anteil an hydrophilem Fluorophor immer noch hydrophil genug ist, um nicht an Oberflächen, Membranen und Biomoleküle zu adsorbieren oder sogar zu aggregieren, andererseits aber durch einen Anteil an einfacherem Fluorophor hinreichend kostengünstig ist.If the chromophores are formed as, in particular highly water-soluble, fluorophores, the fluorescence signal of the dye can be used as optical detection. In order to achieve good solubility in aqueous and biological solutions, fluorophores of the commercial Oyster series are preferably used. These fluorophores contain a specific group which shields the more hydrophobic aromatic ring of the dye core with numerous charged groups and thus reduces adhesion to surfaces and lipid membranes. To reduce costs, the Oyster fluorophores can also be attached to a dendrimer together with less expensive fluorophores with less extensive shielding of the more hydrophobic, chromophore group. The mixing ratio of highly shielded, and thus hydrophilic, but costly fluorophore and the less hydrophilic but less expensive fluorophore on a dendrimer can be adjusted so that the marker is still hydrophilic enough by a sufficient proportion of hydrophilic fluorophore to avoid surfaces, membranes and to adsorb or even aggregate biomolecules, but on the other hand is sufficiently inexpensive by a proportion of simpler fluorophore.

Wenn das Dendrimer geeignete chemische Gruppen aufweist, vorzugsweise endständige, bevorzugt Aminogruppen, können die Chromophore an die Gruppen des Dendrimers gebunden sein, vorzugsweise über Tetrafluorophenyl-Ester- oder N-Hydroxysuccinimid-Ester-Bindungen.When the dendrimer has suitable chemical groups, preferably terminal, preferably amino, groups, the chromophores may be attached to the groups of the dendrimer, preferably via tetrafluorophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester linkages.

Die reaktive Kopplungsgruppe kann über einen Linker am Dendrimer gebunden sein. Bei dem Linker handelt es sich um ein Molekül, dass die Bindung der reaktiven Kopplungsgruppe an das nachzuweisenden Biomolekül sterisch erleichtert. Das eine Ende des Linkers ist am Dendrimer gebunden, während an dessen anderen Ende die reaktive Kopplungsgruppe gebunden ist. Dadurch verbindet der Linker das Dendrimer und die reaktive Kopplungsgruppe miteinander. Der Linker ist vorzugsweise ein Polyethylenglykolrest (PEG), der wasserlöslich ist. Der PEG-Linker hat insbesondere ein Molekulargewicht von 0,5 bis 5 kDa, um einerseits einen genügenden Abstand zu ermöglichen und andererseits keine zu große sterische Abschirmung zu erzeugen.The reactive coupling group can be linked to the dendrimer via a linker. The linker is a molecule that sterically facilitates the binding of the reactive coupling group to the biomolecule to be detected. One end of the linker is bound to the dendrimer, while at the other end the reactive coupling group is bound. As a result, the linker connects the dendrimer and the reactive coupling group with each other. The linker is preferably a polyethylene glycol residue (PEG) which is water soluble. In particular, the PEG linker has a molecular weight of 0.5 to 5 kDa, on the one hand to allow a sufficient distance and on the other hand not to produce too much steric shielding.

Es hat sich gezeigt, dass als reaktive Kopplungsgruppe ein Maleimidrest, Azidrest, Arylrest, ein N-Hydroxysuccinimid-Ester oder ein Tetrafluorophenyl-Ester besonders geeignet ist.It has been found that a maleimide radical, azide radical, aryl radical, an N-hydroxysuccinimide ester or a tetrafluorophenyl ester is particularly suitable as the reactive coupling group.

Der Linker, vorzugsweise der Polyethylenglykol-Linker, ist vorzugsweise an seinem der reaktiven Kopplungsgruppe gegenüberliegenden Ende, insbesondere über eine Maleimidgruppe, an den Verzweigungskern („Core“) des Dendrimers gebunden. Der Verzweigungskern wird vorzugsweise durch ein Cystamin gebildet. Ein Cystaminkern bietet gute monofunktionale Kopplungseigenschaften für den Linker. Hierdurch wird vorteilhafterweise eine einzelne Kopplung genau eines Linkers erreicht und eine Kreuzvernetzung von Antikörpern durch mehrere Linker verhindert.The linker, preferably the polyethylene glycol linker, is preferably attached at its opposite end of the reactive coupling group, in particular via a maleimide group, to the branching core ("core") of the dendrimer. The branching nucleus is preferably formed by a cystamine. A cysteine core offers good monofunctional coupling properties for the linker. This advantageously achieves a single coupling of exactly one linker and prevents cross-linking of antibodies by a plurality of linkers.

An die reaktive Kopplungsgruppe kann ein aufgereinigtes Biomolekül wie Antikörper, RNA, DNA, Nukleotide, Rezeptor-Liganden, Aptamere, Zucker, Hormone und dergleichen gekoppelt sein. Die Biomoleküle können so direkt optisch nachgewiesen werden oder sie können ihrerseits an die Bindungsstelle eines Biomoleküls binden, welches auf diese Weise optisch nachweisbar ist.The reactive coupling group may be coupled to a purified biomolecule such as antibodies, RNA, DNA, nucleotides, receptor ligands, aptamers, sugars, hormones, and the like. The biomolecules can thus be directly detected optically or they can in turn bind to the binding site of a biomolecule, which is optically detectable in this way.

Ein an den Marker gekoppeltes Biomolekül kann ausgebildet sein, spezifisch an die Bindungsstelle zu binden, um diese nachzuweisen. Durch die Bindung des an den Marker gekoppelten Biomoleküls kann zum Beispiel eine einzelne Bindungsstelle einer Zelle lokalisiert nachgewiesen werden.A biomolecule coupled to the marker may be designed to specifically bind to the binding site to detect it. By binding the biomolecule coupled to the marker, for example, a single binding site of a cell can be detected localized.

In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Marker einen Antikörper mit einer Bindungsregion auf, der spezifisch an ein nachzuweisendes Antigen bindet. Hierdurch kann das Antigen einzeln lokalisiert und optisch gemessen werden, vorzugsweise durch ein Fluoreszenzmikroskop. Der Antikörper ist über die reaktive Kopplungsgruppe mit den anderen Bestandteilen des Markers verbunden. Der Marker ist dann nur für ein bestimmtes Antigen einsetzbar. Damit der Marker universell einsetzbar ist, kann der Antikörper auch als sekundärer Antikörper ausgebildet sein, der eine Bindungsstelle für einen weiteren, primären Antikörper aufweist. Dieser primäre, spezifische Antikörper ist austauschbar und weist die eigentliche Bindungsregion auf, die an das nachzuweisende Epitop des Antigens spezifisch bindet. In diesem Fall ist der primäre Antikörper also über den sekundären Antikörper an die reaktive Kopplungsgruppe gebunden. In a preferred embodiment, the marker comprises an antibody having a binding region that specifically binds to an antigen to be detected. This allows the antigen to be individually localized and optically measured, preferably by a fluorescence microscope. The antibody is linked to the other components of the marker via the reactive coupling group. The marker can then only be used for a specific antigen. In order for the marker to be used universally, the antibody can also be designed as a secondary antibody which has a binding site for a further, primary antibody. This primary, specific antibody is exchangeable and has the actual binding region that specifically binds to the epitope of the antigen to be detected. In this case, therefore, the primary antibody is bound to the reactive coupling group via the secondary antibody.

Wenn der Antikörper an seinem Fc-Abschnitt über dessen Zuckerreste an die reaktive Kopplungsgruppe gebunden ist, wird eine sterische Hinderung der Bindung des nachzuweisenden Antigens verhindert oder minimiert.When the antibody is attached at its Fc portion via its sugar residues to the reactive coupling group, steric hindrance of the binding of the antigen to be detected is prevented or minimized.

Der Antikörper, bei der Ausführungsform mit zwei Antikörpern der primäre Antikörper, kann eine Bindungsregion aufweisen, die spezifisch an ein Epitop des Her2-Rezeptors auf einer Mammakarzinomzelle bindet. Hierdurch ist es möglich, wenige Mammakarzinomzellen in einem Pool vieler Zellen im Sinne einer „rare-cell-Analyse“ unmittelbar optisch nachzuweisen und so diagnostische und/oder prognostische Aussagen zum Verlauf oder zur Therapie einer Krebserkrankung zu machen.The antibody, in the two antibody embodiment, the primary antibody, may have a binding region that specifically binds to an epitope of the Her2 receptor on a mammary carcinoma cell. This makes it possible to directly visually detect a few breast cancer cells in a pool of many cells in the sense of a "rare-cell analysis" and thus to make diagnostic and / or prognostic statements on the course or therapy of a cancer.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Anwendung des oben beschriebenen Markers.The invention further relates to a method for using the above-described marker.

Erfindungsgemäß wird der Marker bei dem Verfahren an eine Bindungsstelle gebunden. Die Bindungsstelle kann sich an einem Biomolekül oder an bzw. in einer biologischen Zelle befinden. Insbesondere kann das Biomolekül ein Antigen sein, dass eine Bindungsstelle für einen Antikörper aufweist. Das Biomolekül wird dann durch das optische Signal des Markers detektiert, vorzugsweise mittels eines Fluoreszenzmikroskops.According to the invention, the marker is bound to a binding site in the process. The binding site can be located on a biomolecule or on or in a biological cell. In particular, the biomolecule may be an antigen that has a binding site for an antibody. The biomolecule is then detected by the optical signal of the marker, preferably by means of a fluorescence microscope.

Durch den Marker können auch Biomoleküle oder Zielstrukturen, insbesondere Antigene, nachgewiesen werden, die sich in oder auf einzelnen, fixierten oder lebenden biologischen Zellen befinden. Die Antigene können beispielsweise Membranproteine sein. Die Verwendung des beschriebenen Markers hat mehrere Vorteile: So werden zum einen nur geringe Probenmengen benötigt. Zum anderen ist es mit dem Marker sogar möglich, einzelne Antigene auf Einzelzellen nachzuweisen. Weiterhin ist der Nachweis an lebenden Zellen möglich, wodurch Stoffwechselvorgänge dynamisch beobachtet werden können. Außerdem kann das Antigen beispielsweise auf einer Zelloberfläche lokalisiert nachgewiesen und im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden, d.h. es kann beispielsweise nachgewiesen werden, an welchem Ort auf oder in der Zelle das Antigen lokalisiert ist. Hierdurch lassen sich funktionelle und strukturelle Informationen über biologische Objekte gewinnen.The marker can also be used to detect biomolecules or target structures, in particular antigens, which are located in or on individual, fixed or living biological cells. The antigens may be, for example, membrane proteins. The use of the described marker has several advantages: on the one hand, only small amounts of sample are needed. On the other hand, it is even possible with the marker to detect single antigens on single cells. Furthermore, the detection of living cells is possible, whereby metabolic processes can be observed dynamically. In addition, for example, the antigen can be detected localized on a cell surface and visualized in the fluorescence microscope, i. For example, it can be shown at which location on or in the cell the antigen is located. This allows functional and structural information about biological objects to be gained.

Der Marker kann auch zum Nachweis eines mit einem Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) fixierten Antigens verwendet werden. Bei dem nach dem Stand der Technik bekannten ELISA Assay wird das Antigen nicht direkt nachgewiesen, sondern der Substratumsatz des an den spezifischen Antikörper gekoppelten Enzyms wird optisch gemessen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird statt des Antikörper-Enzym-Komplexes der erfindungsgemäße Marker verwendet, der ein fluoreszenzmarkiertes Dendrimer und den daran gebundenen spezifischen Antikörper umfasst. Hierdurch kann das Antigen direkt und außerdem lokalisiert gemessen und sichtbar gemacht werden, was einerseits die Messgenauigkeit erhöht und andererseits zusätzliche Informationen liefert.The marker can also be used to detect an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fixed antigen. In the ELISA assay known in the art, the antigen is not detected directly, but the substrate turnover of the enzyme coupled to the specific antibody is measured optically. In the method according to the invention instead of the antibody-enzyme complex of the marker according to the invention is used, which comprises a fluorescently labeled dendrimer and the specific antibody bound thereto. As a result, the antigen can be measured directly and also localized and made visible, which on the one hand increases the accuracy of measurement and on the other hand provides additional information.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf eine Zeichnung beispielhaft beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Merkmale den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.The invention will be described by way of example with reference to a drawing, wherein further advantageous features are shown in the figures of the drawing.

Funktionsmäßig gleiche Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen. Die Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:Functionally identical parts are provided with the same reference numerals. The figures of the drawing show in detail:

1 ein nach dem Stand der Technik bekanntes Dendrimer; 1 a dendrimer known in the art;

2 ein anderes, besonders geeignetes Dendrimer; 2 another, particularly suitable dendrimer;

3 eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform des Markers; und 3 a schematic view of a first embodiment of the marker; and

4 eine schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform des Markers. 4 a schematic view of a second embodiment of the marker.

1 zeigt ein nach dem Stand der Technik bekanntes Dendrimer 2. Dendrimere sind Kaskadenpolymere mit sich verzweigenden, repetitiven Molekülketten 24. Das Dendrimer 2 weist einen Verzweigungskern 20 („Core“) auf, von dem die repetitiven Molekülketten 24 ausgehen. Es kann eine Verzweigung zu zwei oder auch mehr Verknüpfungsstellen geben. Der Verzweigungskern 20 wird durch ein Cystamin gebildet. Der Cystaminkern bietet gute monofunktionale Kopplungseigenschaften für einen Linker 5 (nicht gezeigt, siehe 3). Durch die baumartige Struktur können sehr viele (nicht gezeigte) Chromophore in günstiger räumlicher Anordnung an die Molekülketten des Dendrimers 2 gebunden werden. 1 shows a known in the art dendrimer 2 , Dendrimers are cascade polymers with branching, repetitive molecular chains 24 , The dendrimer 2 has a branching core 20 ("Core") on which the repetitive molecular chains 24 out. There may be a branch to two or more junctions. The branching kernel 20 is formed by a cystamine. The cysteine core offers good monofunctional coupling properties for a linker 5 (not shown, see 3 ). Through the tree-like Structure can be very many chromophores (not shown) in a favorable spatial arrangement to the molecular chains of the dendrimer 2 be bound.

2 zeigt ein anderes, besonders geeignetes Dendrimer 2. Dieses ist stärker verzweigt und zeigt eine ungefähr kugelförmige Struktur auf. Die „Kugelschale“ wird von zahlreichen, endständigen Hydroxygruppen 21 gebildet, an die Chromophore (nicht gezeigt) gebunden werden können. Das Dendrimer 2 weist ebenfalls einen Verzweigungskern 20 auf, von dem die repetitiven Molekülketten 24 ausgehen. Der Verzweigungskern 20 wird aber durch ein Alkin gebildet. Der Alkinkern bietet ebenfalls gute monofunktionale Kopplungseigenschaften für einen Linker 5, vorzugsweise mit einer Azidgruppe (nicht gezeigt, siehe 3). Hierdurch wird vorteilhafterweise eine einzelne Kopplung genau eines Linkers 5 erreicht und eine Kreuzvernetzung von Antikörpern durch mehrere Linker 5 verhindert. 2 shows another, particularly suitable dendrimer 2 , This is more branched and displays an approximately spherical structure. The "ball shell" is made of numerous, terminal hydroxy groups 21 formed, can be bound to the chromophores (not shown). The dendrimer 2 also has a branching core 20 on which the repetitive molecular chains 24 out. The branching kernel 20 but is formed by an alkyne. The alkyne nucleus also provides good monofunctional coupling properties for a linker 5 , preferably with an azide group (not shown, see 3 ). This advantageously becomes a single coupling of exactly one linker 5 achieved cross-linking of antibodies by multiple linkers 5 prevented.

3 zeigt eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform des Markers 1. Der Marker 1 weist als Basis ein zentrales Dendrimer 2 auf. Dieses ist schematisch als Kreis dargestellt. An den (nicht dargestellten) Aminogruppen des Dendrimers 2 sind zahlreiche hydrophile Fluorophore 3 gebunden. Fluorophore 3 sind Farbstoffe, die zur Fluoreszenz angeregt werden können. Der Anzahl nach sind mindestens zwei vorgesehen, bevorzugt sind zehn bis hundert Fluorophore 3 oder bis zu tausend. 3 shows a schematic view of a first embodiment of the marker 1 , The marker 1 has a central dendrimer as a basis 2 on. This is shown schematically as a circle. At the (not shown) amino groups of the dendrimer 2 are numerous hydrophilic fluorophores 3 bound. fluorophores 3 are dyes that can be excited to fluoresce. The number after at least two are provided, preferably ten to a hundred fluorophores 3 or up to a thousand.

Der Marker 1 weist außerdem eine reaktive Kopplungsgruppe 4 auf, die spezifisch an ein Biomolekül (nicht gezeigt) bindet. Die reaktive Kopplungsgruppe 4 kann beispielsweise einen Maleimid- oder N-Hydroxysuccinimidesterrest aufweisen, der kovalent an eine Thiol- oder Aminogruppe des Biomoleküls bindet. Bei dem Biomolekül kann es sich beispielsweise um ein zuvor aufgereinigtes (nicht gezeigtes) Peptid, Protein, ein Virus oder dergleichen handeln. Dieses Biomolekül kann dann an die Bindungsstelle einer Zielstruktur spezifisch binden, wodurch diese über den am Biomolekül befindlichen Marker lokalisiert nachgewiesen wird. Die reaktive Kopplungsgruppe 4 kann aber auch an einen (nicht gezeigten, siehe 4) Antikörper 12 gebunden sein, der dann wiederum spezifisch an das nachzuweisende Antigen 11 bindet.The marker 1 also has a reactive coupling group 4 which binds specifically to a biomolecule (not shown). The reactive coupling group 4 For example, it may have a maleimide or N-hydroxysuccinimide ester moiety which covalently binds to a thiol or amino group of the biomolecule. The biomolecule may be, for example, a previously purified (not shown) peptide, protein, virus or the like. This biomolecule can then specifically bind to the binding site of a target structure, thereby detecting it localized via the marker located on the biomolecule. The reactive coupling group 4 but also to a (not shown, see 4 ) Antibodies 12 be bound, which in turn specific to the antigen to be detected 11 binds.

Die Kopplungsgruppe 4 ist über einen länglichen Polyethylenglykol-Linker 5 an den Verzeigungskern 20 (nicht gezeigt, siehe 2) des Dendrimers 2 gebunden. Der Linker 5 fungiert als Abstandshalter zwischen dem Dendrimer 2 und der Kopplungsgruppe 4. Hierdurch wird einerseits die Bindung an ein Biomolekül 11 sterisch erleichtert und andererseits ein eventuelles Quenching des Fluoreszenzsignals durch ein nachzuweisendes Biomolekül 11 vermieden.The coupling group 4 is via an elongated polyethylene glycol linker 5 to the branching core 20 (not shown, see 2 ) of the dendrimer 2 bound. The linker 5 acts as a spacer between the dendrimer 2 and the coupling group 4 , On the one hand, this binds to a biomolecule 11 sterically relieved and on the other hand a possible quenching of the fluorescence signal by a biomolecule to be detected 11 avoided.

Zum Nachweis eines Biomoleküls 11 wird der Marker 1 einer Lösung ausgesetzt, die einen für das Biomolekül 11 spezifischen Antikörper 12 enthält. Der Marker 1 bindet über seine reaktive Kopplungsgruppe 4 an den Antikörper 12. Nicht gebundener Marker 1 und nicht gebundener Antikörper 12 sollte ausgewaschen werden. Danach wird der Marker 1 mit dem gebundenen Antikörper 12 zu dem nachzuweisenden Biomolekül 11 gegeben und der Antikörper 12 bindet nichtkovalent an die spezifische Bindungsstelle 10 des Biomoleküls 11. Nicht gebundener Antikörper-Marker-Komplex wird ausgewaschen und das Biomolekül 11 kann über die Fluoreszenz des am Antigen-Antikörper-Komplex gebundenen Markers 1 direkt nachgewiesen werden. Da der Marker 1 bzw. das mit dem Marker 1 markierte Biomolekül 11 in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar ist, ist ein direkter, lokalisierter Nachweis des Biomoleküls 11 möglich.For the detection of a biomolecule 11 becomes the marker 1 exposed to a solution, the one for the biomolecule 11 specific antibody 12 contains. The marker 1 binds via its reactive coupling group 4 to the antibody 12 , Unbound markers 1 and unbound antibody 12 should be washed out. After that, the marker becomes 1 with the bound antibody 12 to the biomolecule to be detected 11 given and the antibody 12 noncovalently binds to the specific binding site 10 of the biomolecule 11 , Unbound antibody-marker complex is washed out and the biomolecule 11 may be due to the fluorescence of the marker bound to the antigen-antibody complex 1 be detected directly. Because the marker 1 or with the marker 1 labeled biomolecule 11 visible in a fluorescence microscope is a direct, localized detection of the biomolecule 11 possible.

Durch die mögliche große Anzahl an Fluorophoren 3 wird das Fluoreszenzsignal für jedes nachzuweisende Biomolekül 11 um einen Faktor verstärkt, der ungefähr der Anzahl der Fluorophore 3 entspricht. Hierdurch ist der Nachweis auch bei kleinen Mengen von Biomolekülen 11 bei verbesserter Messqualität möglich.By the possible large number of fluorophores 3 becomes the fluorescence signal for each biomolecule to be detected 11 amplified by a factor of about the number of fluorophores 3 equivalent. As a result, the detection is also for small amounts of biomolecules 11 possible with improved measuring quality.

4 zeigt eine schematische Ansicht einer zweiten Ausführungsform des Markers 1. Wie in 3 weist der Marker 1 ein fluoreszenzmarkiertes Dendrimer 2, einen Linker 5 und eine reaktive Kopplungsgruppe 4 auf. Der Marker 1 umfasst zusätzlich einen Antikörper 12. Der Antikörper 12 ist über eine geeignete Bindungsgruppe 6 an seinem Fc-Abschnitt 7 kovalent an die reaktive Kopplungsgruppe 4 gebunden. Der Antikörper 12 weist an seinen Fab-Armen 8 eine Antigen-Bindungsregion 9 auf. Die Bindungsregion 9 bindet spezifisch an eine bestimmte Bindungsstelle 10 bzw. ein Epitop eines Antigens 11 (das Antigen 11 ist nicht Bestandteil des Markers 1). Bei dem Antigen 11 kann es sich beispielsweise um ein äußeres Membranprotein oder eine äußere Domäne eines Membranproteins in einer lebenden Zelle (nicht gezeigt) handeln. Es kann auch ein fixiertes, nachzuweisendes Antigen 11 eines ELISA Assays sein. Hierdurch ist der direkte und lokalisierte Nachweis von Antigenen (11) mit hoher Messgenauigkeit möglich. 4 shows a schematic view of a second embodiment of the marker 1 , As in 3 has the marker 1 a fluorescently labeled dendrimer 2 , a linker 5 and a reactive coupling group 4 on. The marker 1 additionally includes an antibody 12 , The antibody 12 is via a suitable binding group 6 at his Fc section 7 covalently attached to the reactive coupling group 4 bound. The antibody 12 points to his Fab-arms 8th an antigen-binding region 9 on. The binding region 9 binds specifically to a specific binding site 10 or an epitope of an antigen 11 (the antigen 11 is not part of the marker 1 ). For the antigen 11 it may be, for example, an outer membrane protein or an outer domain of a membrane protein in a living cell (not shown). It can also be a fixed antigen to be detected 11 an ELISA assay. This is the direct and localized detection of antigens ( 11 ) with high measuring accuracy possible.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11: Marker marker
22: Dendrimer dendrimer
33: Fluorophor fluorophore
44: Kopplungsgruppe coupling group
55: Linker left
66: Bindungsgruppe bond group
77: Fc-Abschnitt Fc portion
88th: Antikörper-Fab-Arme Antibody Fab arms
99: Bindungsregion binding region
1010: Epitop epitope
1111: Protein protein
1212: Antikörper antibody
2020: Verzweigungskern branching core
2121: Endständige Gruppen Terminal groups
2424: Molekülketten molecular chains

Claims

Marker (1) zum optischen Nachweis der Bindung eines Biomoleküls, insbesondere eines Antikörpers (12), an eine Bindungsstelle (10), umfassend ein Dendrimer (2), an dem mehrere Chromophore (3) und eine reaktive Kopplungsgruppe (4) gebunden sind.Markers ( 1 ) for the optical detection of the binding of a biomolecule, in particular an antibody ( 12 ), to a binding site ( 10 ) comprising a dendrimer ( 2 ), at which several chromophores ( 3 ) and a reactive coupling group ( 4 ) are bound.

Marker (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Chromophore als, insbesondere hoch-wasserlösliche, Fluorophore (3) ausgebildet sind, vorzugsweise als Fluorophore (3) der Oyster-Serie.Markers ( 1 ) according to claim 1, characterized in that the chromophores as, in particular highly water-soluble, fluorophores ( 3 ), preferably as fluorophores ( 3 ) of the Oyster series.

Marker (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Dendrimer chemische Gruppen aufweist, vorzugsweise endständige, bevorzugt Aminogruppen, um die Chromophore an das Dendrimer zu binden, vorzugsweise über Tetrafluorophenyl-Ester- oder N-Hydroxysuccinimid-Ester-Bindungen.Markers ( 1 ) according to claim 1 or 2, characterized in that the dendrimer has chemical groups, preferably terminal, preferably amino groups to bind the chromophores to the dendrimer, preferably via tetrafluorophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester bonds.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Kopplungsgruppe (4) über einen Linker (5) am Dendrimer (2) gebunden ist, vorzugsweise über einen Polyethylenglykol-Linker (5).Markers ( 1 ) according to any one of the preceding claims, characterized in that the reactive coupling group ( 4 ) via a linker ( 5 ) at the dendrimer ( 2 ), preferably via a polyethylene glycol linker ( 5 ).

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Kopplungsgruppe (4) ein Maleimidrest, Azidrest, Arylrest, ein N-Hydroxysuccinimid-Ester oder ein Tetrafluorophenyl-Ester ist.Markers ( 1 ) according to any one of the preceding claims, characterized in that the reactive coupling group ( 4 ) is a maleimide radical, azide radical, aryl radical, an N-hydroxysuccinimide ester or a tetrafluorophenyl ester.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker (5), vorzugsweise der Polyethylenglykol-Linker, ist insbesondere über eine Maleimidgruppe an den Verzweigungskern (20) des Dendrimers gebunden, welcher vorzugsweise durch ein Cystamin gebildet wird.Markers ( 1 ) according to any one of the preceding claims, characterized in that the linker ( 5 ), preferably the polyethylene glycol linker, is in particular via a maleimide group at the branching nucleus ( 20 ) of the dendrimer, which is preferably formed by a cystamine.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass an die reaktive Kopplungsgruppe (4) an ein aufgereinigtes Biomolekül wie Antikörper, RNA, DNA, Nukleotide, Rezeptor-Liganden, Aptamere, Zucker, Hormone und dergleichen gekoppelt ist.Markers ( 1 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the reactive coupling group ( 4 ) is coupled to a purified biomolecule such as antibodies, RNA, DNA, nucleotides, receptor ligands, aptamers, sugars, hormones and the like.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein an den Marker gekoppeltes Biomolekül ausgebildet ist, spezifisch an die Bindungsstelle zu binden, um diese nachzuweisen.Markers ( 1 ) according to one of the preceding claims, characterized in that a biomolecule coupled to the marker is designed to specifically bind to the binding site in order to detect it.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Antikörper (12) mit einer Bindungsregion (9) aufweist, der spezifisch an ein nachzuweisendes Antigen (11) bindet.Markers ( 1 ) according to one of the preceding claims, characterized in that it contains an antibody ( 12 ) with a binding region ( 9 ) which is specific to an antigen to be detected ( 11 ) binds.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper (12) an seinem Fc-Abschnitt (7) über dessen Zuckerreste an die reaktive Kopplungsgruppe (4) gekoppelt ist.Markers ( 1 ) according to any one of the preceding claims, characterized in that the antibody ( 12 ) at its Fc section ( 7 ) via its sugar residues to the reactive coupling group ( 4 ) is coupled.

Marker (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper (12) eine Bindungsregion (9) aufweist, die spezifisch an ein Epitop des Her2-Rezeptors auf einer Mammakarzinomzelle bindet.Markers ( 1 ) according to any one of the preceding claims, characterized in that the antibody ( 12 ) a binding region ( 9 ) which specifically binds to an epitope of the Her2 receptor on a mammary carcinoma cell.

Verfahren zum optischen Nachweis der Bindung eines Antikörpers an eine Bindungsstelle, dadurch gekennzeichnet, dass ein Marker (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 11 an eine Bindungsstelle (10), insbesondere ein Antigen (11), gebunden und sein optisches Signal detektiert wird, vorzugsweise mittels eines Fluoreszenzmikroskops.Method for the optical detection of the binding of an antibody to a binding site, characterized in that a marker ( 1 ) according to one of claims 1 to 11 to a binding site ( 10 ), in particular an antigen ( 11 ), and its optical signal is detected, preferably by means of a fluorescence microscope.

Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsstelle (10), insbesondere das Antigen (11), in oder auf einer oder mehreren fixierten oder lebenden biologischen Zellen nachgewiesen wird.Process according to claim 12, characterized in that the binding site ( 10 ), in particular the antigen ( 11 ), in or on one or more fixed or living biological cells.

Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker (1) zum Nachweis eines mit einem Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) fixierten Antigens (11) verwendet wird.Method according to claim 12, characterized in that the marker ( 1 ) for the detection of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fixed antigen ( 11 ) is used.