DE102006012317A1 - New macromolecular compounds comprising nucleotide and nucleoside building blocks, are useful in enzymatic reactions and nucleic acid analysis - Google Patents

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Abstract

Macromolecular compounds (I) are new. Macromolecular compounds (I) of formula (Nuc-linker) n-marker, are new. Nuc : nucleotide or nucleoside; linker : a linker component, the Nuc components and macromolecular marker components are bonded; marker : a macromolecular marker component; and n : 1-1000. Independent claims are included for: (1) oligonucleotide or polynucleotide comprising at least one Nuc macromolecule per nucleic acid chain; (2) modifying nucleic acid chains comprising using Nuc macromolecules for coupling; and (3) a kit comprising macromolecular compounds.

Description

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

1. Einführung1. Introduction

1.1 Einordnung in das technologische Feld1.1 classification in the technological field

In einer Ausführung bezieht sich die Erfindung auf die Struktur, die Herstellung und die Verwendung modifizierter Nukleotid- und Nukleosidbausteine, im folgenden „Nuk-Makromoleküle".In an execution The invention relates to the structure, the production and the use of modified nucleotide and nucleoside building blocks, in the following "nuc-macromolecules".

Niedermolekulare Stoffe spielen eine wichtige Rolle in lebendigen Organismen. Sie dienen Beispielsweise als Bausteine von Polymeren, als Botenstoffe, als Energieträger. In der Diagnostik werden sie zur Bestimmung von medizinisch relevanter Parameter eingesetzt. Dabei werden diese Stoffe oft mit bestimmten Signal-Trägern markiert. Ein Beispiel für die niedermolekularen Stoffe bieten Nukleotide und Nukleoside.low molecular weight Substances play an important role in living organisms. she serve as building blocks of polymers, as messenger substances, as an energy source. In diagnostics, they are used to determine medically relevant Parameters used. These substances are often with certain Signal sources marked. An example for the low molecular weight substances provide nucleotides and nucleosides.

Sie spielen ebenfalls eine zentrale Rolle in unterschiedlichen Stoffwechselvorgängen der lebenden Organismen ("Biochemie und Pathobiochemie", G. Löffler, 2003) und stellen in der modernen Biotechnologie verbreitete Elemente dar ("Molecular-Cloning", ). Sambrook, band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5), beispielsweise für künstliche Detektionssysteme ("DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray-Biochip Technology" M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6). Aus diesem Grund werden modifizierte Nukleotide, Nukleotid-Analoga, in unterschiedlichen Bereichen der Biotechnologie, Medizin und Pharmakologie eingesetzt ("Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy", Cheson, 1997).she play a central role in different metabolic processes of the living organisms ("biochemistry and Pathobiochemistry ", G. Löffler, 2003) and are common elements in modern biotechnology ("Molecular Cloning",). Sambrook, tied 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5), for example for artificial detection systems ("DNA Microarrays", Bowtell, 2003, ISBN 0-87969-624-9, "Microarray biochip Technology "M Schena, 2000, ISBN 1-881299-37-6). For this reason are modified Nucleotides, nucleotide analogues, in different areas of the Biotechnology, medicine and pharmacology used ("Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleosides and Nucleic Acid Chemistry ", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleosides Analogs in cancer therapy ", Cheson, 1997).

Eines der wichtigsten Felder der modernen Life-Science sind Analysen der Nukleinsäuren. Ein großer Bereich dieser Analysen befasst sich mit dem Nachweis der Nukleinsäuren oder deren Bestandteilen im biologischen Präparat. In vielen Fällen wird zu diesem Zweck ein Reaktionspartner markiert, der mit der zu analysierenden Nukleinsäure reagieren kann. Dem Fachmann sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Markierung der Nukleinsäuren bekannt. Einerseits können einzelne Nukleinsäurebausteine, Nukleotide bzw. Nukleoside modifiziert sein, andererseits können kurze Fragmente von Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder Polynukleotide zum Nachweis eingesetzt werden.One The most important fields of modern life science are analyzes of Nucleic acids. A big area This analysis deals with the detection of nucleic acids or their components in biological preparation. In many cases will For this purpose, a reactant labeled with the to be analyzed nucleic acid can react. The person skilled in the art has different possibilities for labeling the nucleic acids known. On the one hand can individual nucleic acid components, On the other hand, short nucleotides or nucleosides may be modified Fragments of nucleic acids, Oligonucleotides or polynucleotides are used for detection.

Konventionell modifizierte Nukleotide sind beispielsweise in Lee et al. Nucleic acid research 1992, V. 20, S.2471; Augustin et. al. J. Biotechnology 2001 V. 86, S.289-301; US Patent 4828979; Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, S. 3857 beschrieben. Diese Nukleotide haben einen niedermolekularen detektierbaren Teil, der direkt (wie beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoffmolekül) oder indirekt detektiert werden kann (wie beispielsweise bei einem Biotin-Molekül, das erst nach Kopplung mit einem Streptavidin-Farbstoff-Konjugat nachgewiesen wird). Solche Nukleotide stellen Beispiele für die Stand der Technik der Nukleotid-Modifikationen dar. Viele modifizierte Nukleotide können kommerziell erworben werden, z.B. von NEN Life Science Products (Biotin-11-dUTP, DNP-11-dATP, Fluorescein-12-dCTP), von Amersham Bioscience dCTP-Cy3, dCTP-Cy5) oder von Roche (Biotin-l6-dUTP). Entsprechende Nachweisreagenzien, z.B. markiertes Streptavidin, markierte Antikörper, können von den selben Anbietern bezogen werden.Conventional modified nucleotides are described, for example, in Lee et al. Nucleic acid research 1992, V. 20, p.2471; Augustin et. al. J. Biotechnology 2001, V. 86, pages 289-301; U.S. Patent 4,828,979; Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 P. 3857. These nucleotides have a low molecular weight detectable part directly (such as a fluorescent dye molecule) or can be indirectly detected (such as in a biotin molecule, the first detected after coupling with a streptavidin-dye conjugate becomes). Such nucleotides are examples of the state of the art Nucleotide modifications. Many modified nucleotides can be commercial be purchased, e.g. by NEN Life Science Products (Biotin-11-dUTP, DNP-11-dATP, fluorescein-12-dCTP), from Amersham Bioscience dCTP-Cy3, dCTP-Cy5) or from Roche (Biotin-16-dUTP). Appropriate detection reagents, e.g. labeled streptavidin, labeled antibodies, may be from the same suppliers be obtained.

Zur Vereinfachung der Darstellung werden im Folgenden modifizierte Nukleotide besprochen. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass auch modifizierte Nukleoside für die enzymatische und nicht enzymatische Synthesen eingesetzt werden können, konventionell modifizierte Nukleoside sind erhältlich beispielsweise bei Trilink Biotechnologies oder Eurogentec.to Simplification of the presentation will be modified nucleotides below discussed. It should be obvious to a person skilled in the art that also modified nucleosides for the enzymatic and non-enzymatic syntheses are used can, Conventionally modified nucleosides are available, for example, from Trilink Biotechnologies or Eurogentec.

Konventionell modifizierte Nukleotide haben ein äquimolares Verhältnis zwischen der Nukleotid-Komponente und dem niedermolekularen detektierbaren Teil, z.B. Farbstoff-Molekül bzw. Biotin-Molekül. Zwischen beiden Teilen liegt ein Linker mit einer durchschnittlichen Länge von 5-30 Atomen.Conventional modified nucleotides have an equimolar ratio between the nucleotide component and the low molecular detectable Part, e.g. Dye molecule or biotin molecule. Between the two Sharing is a linker with an average length of 5-30 atoms.

Solche Nukleotide können von Polymerasen in den wachsenden Strang eingebaut werden und somit ein signaltragendes Molekül (Farbstoff) oder signalvermittelndes Molekül (Biotin oder Digoxigenin) in die Nukleinsäurekette einführen. Nach dem Einbau von modifizierten Nukleotiden kann die Signaldetektion im Fall von farbstoffmarkierten Nukleotiden direkt erfolgen oder nach Inkubation mit einem sekundären signaltragenden Molekül (z.B. Strepavidin-Farbstoff-Konjugat im Fall von Biotin), wenn signalvermittelnde Moleküle verwendet werden. Die nachträgliche Kopplung der signaltragenden Moleküle, wie Streptavidin, erfolgt oft mit unzureichenden Ausbeuten von 20-60%.Such nucleotides can be incorporated by polymerases into the growing strand and thus introduce a signal-carrying molecule (dye) or signal-transmitting molecule (biotin or digoxigenin) into the nucleic acid chain. Following incorporation of modified nucleotides, signal detection may be direct in the case of dye-labeled nucleotides or after incubation with a secondary signal-carrying molecule (eg, strepavidin-dye conjugate in the case of biotin) when using signal-transmitting molecules become. The subsequent coupling of the signal-carrying molecules, such as streptavidin, often occurs with insufficient yields of 20-60%.

Sehr oft werden bei der Markierung der Nukleinsäuren Signalvervielfältigungsschritte eingesetzt. Diese können auf unterschiedlichen Stufen der Analyse durchgeführt werden. Beispiele dafür stellen Materialvervielfältigung (PCR), mehrfacher Einbau von markierten Nukleotiden, mehrstufige nachträgliche Markierung von Biotin-Nukleotiden ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5). Diese Verfahren führen zu einer Verzerrung der Signale, da sie aus mehreren, oft ungenügend kontrollierten Schritten bestehen, die mit unterschiedlichen Ausbeuten ablaufen und von vielen Faktoren beeinflusst werden können.Very often in the labeling of nucleic acids signal amplification steps used. these can be carried out at different stages of the analysis. Examples of this make material duplication (PCR), multiple incorporation of labeled nucleotides, multistep subsequent Labeling of biotin nucleotides ("Molecular Cloning", J. Sambrook, vol. 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5). These methods lead to a distortion of the Signals, since they consist of several, often insufficiently controlled steps, which occur with different yields and many factors can be influenced.

Bestimmte Verfahren, beschrieben beispielsweise in Seeger WO 0018956, Kartalov WO02072892, sind auf die Detektion der Signale von einzelnen Nukleotid-Molekülen angewiesen. Beim Einsatz konventioneller Nukleotide beeinflussen mehrere Phänomene wie z.B. das Ausbleichen der Farbstoffe oder Blinking die Ergebnisse der Einzelmoleküldetektion. Für solche Verfahren bedeutet eine Steigerung von Signalstärke und Intensität der Nukleotidmarkierung eine Verringerung der Fehlerrate bei der Detektion.Certain Methods described, for example, in Seeger WO 0018956, Kartalov WO02072892, rely on the detection of signals from single nucleotide molecules. When using conventional nucleotides affect several phenomena such as e.g. bleaching the dyes or blinking the results the single molecule detection. For such Method means an increase in signal strength and intensity of nucleotide labeling a reduction in the error rate during detection.

Es besteht somit ein Bedarf an modifizierten Nukleotiden oder Nukleosiden mit einer verbesserten signalgebenden oder signalvermittelnden Wirkung, insbesondere für deren Einsatz zur Markierung von Nukleinsäuren bei der Nukleinsäureanalyse.It There is thus a need for modified nucleotides or nucleosides with an improved signaling or signal-transmitting effect, especially for their use for labeling nucleic acids in nucleic acid analysis.

Aufgaben der Erfindung:Objects of the invention:

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Bereitstellung von modifizierten Nukleotiden oder Nukleosiden, die ihre Substrateigenschaften für Polymerasen oder andere Enzyme beibehalten und nach ihrem Einbau in die Nukleinsäuren eine verbesserte Signalintensität bei deren Analyse gewährleisten.A The object of the present invention is therefore the provision of modified nucleotides or nucleosides that have their substrate properties for polymerases or other enzymes, and after their incorporation into the nucleic acids improved signal intensity to ensure their analysis.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren mit erfindungsgemäß modifizierten Nukleotiden.A Another object of the invention is the provision of methods for labeling nucleic acids with modified according to the invention Nucleotides.

Die vorliegende Erfindung beschreibt in einer Ausführungsform eine neue Klasse an modifizierten Nukleotiden, die Nuk-Makromoleküle. Nuk-Makromoleküle sind dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Nukleotid-Komponenten mit einem oder mehreren signalgebenden oder signalvermittelnden makromolekularen Komponenten (Marker) über einen Linker verbunden sind. Die jeweilige Nuk-Komponente bewahrt in einem Nuk-Makromolekül seine Substratfunktion für Enzyme. Eine signalgebende makromolekulare Komponente trägt beispielsweise mehrere Farbstoffmoleküle.The The present invention describes a new class in one embodiment on modified nucleotides, the nuc macromolecules. Nuc-macromolecules are characterized in that one or more nucleotide components with one or more signaling or signal-transmitting macromolecular components (markers) connected via a linker are. The respective nuc-component retains its in a nuc-macromolecule Substrate function for Enzymes. For example, a signaling macromolecular component carries several dye molecules.

Nuk-Makromoleküle können wie konventionell modifizierte Nukleotide in verschiedenen Bereichen der Biotechnologie und Medizin verwendet werden. Im Folgenden sollte lediglich als Beispiel deren Einsatz für die Nukleinsäuremarkierung dargestellt werden. Andere Einsatzbereiche der Nuk-Makromoleküle sind dem Fachmann bereits bekannt s.o.Nuc-macromolecules can be like conventionally modified nucleotides in various fields biotechnology and medicine. The following should merely as an example its use for the nucleic acid tag being represented. Other uses of nuc macromolecules are the expert already known s.o.

1.3 Begriffe/Definitionen:1.3 Terms / Definitions:

  • 1.3.1. Makromolekulare Verbindung – Ein Molekül, oder ein Molekülkomplex, oder ein Nanokristall oder ein Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2kDa und 20kDa, 2kDa und 50kDa, 2kDa und 100kDa, 100kDa und 200kDa, 200kDa und 1000kDa oder 1MDa und 100MDa oder 100MDa und 1000Da liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Dextran, Polyacrylat, Nanogold-Partikel aber auch Komplexe, die aus mehreren Makromolekülen bestehen.1.3.1. Macromolecular compound - A molecule, or a molecular complex, or a nanocrystal or nanoparticle whose mass is between 2kDa and 20kDa, 2kDa and 50kDa, 2kDa and 100kDa, 100kDa and 200kDa, 200kDa and 1000kDa or 1MDa and 100MDa or 100MDa and 1000Da. examples for Macromolecular compounds are nucleic acids such as oligonucleotides with a length of more than 10 nucleotides, polynucleotides, polypeptides, proteins or enzymes, quantum dots, polymers such as PEG, mowiol, dextran, polyacrylate, Nanogold particles as well as complexes consisting of several macromolecules.
  • 1.3.2. Niedermolekulare Verbindung – ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2kDa) beträgt, z.B. Biotin, natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-l6-dUTP.1.3.2. Low molecular weight compound - a molecule or a molecular complex, whose mass is less than 2000 Da (2kDa), e.g. Biotin, natural nucleotides, dATP, dUTP, many dyes, such as Cy3, Rhodamine, and Fluorescein conventionally modified nucleotides, such as biotin-16-dUTP.
  • 1.3.3. Ein Nuk-Makromolekül im Sinne dieser Anmeldung ist eine chemische Struktur, die eine oder mehrere Nuk-Komponenten, eine oder mehrere Linker-Komponenten und eine Marker-Komponente einschließt, 1 oder 2: (Nuk-Linker)-nMarker wobei
    Nuk
    – eine Nuk-Komponente ist
    Linker
    – eine Linker-Komponente ist
    Marker
    – eine Makrer-Komponente ist
    n
    – eine Zahl von 1 bis 1000 ist
    1.3.3. For the purposes of this application, a nuc macromolecule is a chemical structure which includes one or more nuc-components, one or more linker components and a marker component, 1 or 2 : (Nuk linker) - n markers where
    Nuk
    - is a nuc component
    left
    - is a linker component
    marker
    - is a Makrer component
    n
    - is a number from 1 to 1000

In einer Ausführungsform der Erfindung ist Linker wasserlöslich. Seine Zusammensetzung ist nicht eingeschränkt, solange die Substrat-Eigenschaften der Nukleotide nicht verloren gehen. Seine Länge liegt zwischen 2 und 100.000 Atome.In an embodiment In the invention, linker is water-soluble. Its composition is not limited as long as the substrate properties the nucleotides are not lost. Its length is between 2 and 100,000 Atoms.

In einer weiteren Ausführungsform besteht die Linker-Komponente aus einer Kopplungseinheit L für die Kopplung des Linkers an die Nuk-Komponente, aus einem wasserlöslichen Polymer und aus einer Kopplungseinheit T für die Kopplung des Linkers an die Marker-Komponente. In dieser bevorzugten Ausführungsform hat ein Nuk-Makromolekül folgende Struktur, 1 oder 2:
(Nuk-L-Polymer-T)n-Marker
wobei

Nuk
– ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)
L
– ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen Nuk und dem Linkerrest darstellt (Kopplungseinheit L)
T
– ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt (Kopplungseinheit T)
Polymer
– ein Teil des Linkers ist, das ein wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 5 und 100.000 Atome ist (Kopplungseinheit L, Polymerlinker, Kopplungseinheit T sind bei dieser Ausführungsform als Linker-Komponente zusammengefaßt)
Marker
– eine Marker-Komponente
n
– eine Zahl von 1 bis 1000, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.
In a further embodiment, the linker component consists of a coupling unit L for the coupling of the linker to the nuc-component, of a water-soluble polymer and of a coupling unit T for the coupling of the linker to the marker component. In this preferred embodiment, a nuc-macromolecule has the following structure, 1 or 2 :
(Nuk-L polymer T) n label
in which
Nuk
Is a nucleotide or nucleoside monomer (nuc-component)
L
Is a part of the linker which represents the connection between nuc and the linker residue (coupling unit L)
T
Is a part of the linker that represents the link between the linker residue and the marker (coupling unit T)
polymer
Is a part of the linker which is a water-soluble polymer having an average length between 5 and 100,000 atoms (coupling unit L, polymer linker, coupling unit T are combined in this embodiment as a linker component)
marker
- a marker component
n
A number from 1 to 1000, where (n) can represent an average value.

1.3.3.1 Nuk-Komponente1.3.3.1 Nuc component

Nuk-Komponente kann sowohl ein Nukleotid als auch ein Nukleosid darstellen. Im folgenden werden bei der Beschreibung Nukleotide betrachtet. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass auch Nukleoside in entsprechender Weise modifiziert und in entsprechenden Reaktionen werden können.Nuc-component may be both a nucleotide and a nucleoside. in the The following are considered nucleotides in the description. a It should be obvious to those skilled in the art that nucleosides too modified in a corresponding manner and in corresponding reactions can be.

In einer Ausführungsform ist Nuk-Komponente ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer, das mit der Linker-Komponente gekoppelt ist. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid-akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid-Varianten als Nuk- Komponente des Nuk-Makromoleküls dienen, so dass sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk-Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zucker- oder Phosphat-Teile modifiziert werden, 3. Viele Beispiele für Nukleotid-Modifikationen sind dem Fachmann bekannt ("Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021-4, "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben.In one embodiment, nuc-component is a nucleotide or nucleoside monomer coupled to the linker moiety. In principle, all conventional nucleotide variants suitable as substrate for nucleotide-accepting enzymes can serve as nuc-component of the nuc-macromolecule, so that both natural and modified nucleotides (nucleotide analogues) are suitable for the nuc-component. For modified nucleotides, base, sugar or phosphate moieties can be modified, 3 , Many examples of nucleotide modifications are known in the art ("Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527-29021-4, "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleosides and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in Cancer Therapy", Cheson, 1997) in the text are also given further examples of the modifications of the nucleotides.

Die Nuk-Komponente schließt vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker-Komponente (Zucker) und wahlweise eine Phosphat-Komponente (Phosphat) ein. Base, Zucker und Phosphat können modifiziert sein, d.h. die Grundstruktur sieht den natürlichen Nukleotiden oder Nukleotiden ähnlich, trägt aber beispielsweise zusätzliche chemische Gruppen. Beispiele für Kombinationen aus verschiedenen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Solche Nuk-Komponenten können in vielen enzymatischen und chemischen Reaktionen eingesetzt werden (G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-).The Nuk component closes preferably a base component (base), a sugar component (Sugar) and optionally a phosphate component (phosphate). Base, sugar and phosphate can be modified be, i. the basic structure resembles the natural nucleotides or nucleotides, but carries, for example additional chemical groups. examples for Combinations of different components are known in the art. Such nuc-components can be used in many enzymatic and chemical reactions (Wright, Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, pp. 447-).

In einer anderen Ausführungsform ist eine Nuk-Komponente mit weiteren Nukleotiden gekoppelt, z.B in einer Nukleinsäurekette. Dabei tritt die Nuk-Komponente als ein Monomer eines Polymers auf.In another embodiment a nuc-component is coupled to other nucleotides, e.g. a nucleic acid chain. In this case, the nuc-component occurs as a monomer of a polymer.

1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat1.3.3.1.1 Variations on the phosphate

In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Monophosphat dar. In einer anderen Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Diphosphat dar. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat usw.) können verwendet werden.In one embodiment, the nuc-component is a nucleoside. In another embodiment, the nuc-component is a nucleoside monophosphate. In another embodiment, the nuc-component is a nucleoside diphosphate. In another embodiment, the nuclide component Component is a nucleoside triphosphate. Also, higher phosphate derivatives (tetraphosphate, etc.) can be used become.

Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei Nukleosid-Triphosphaten an der 5'-Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an der 3'-Position.The mentioned phosphate modifications can as nucleoside triphosphates at the 5'-position or also sit at other positions of the sugar part of the nucleotide, for example, at the 3 'position.

Wahlweise kann die Phosphat-Komponente Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, A. Draganescu et al. J. Biol.Chem. 2000 v.275, 4555-). In einer werteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente Thiotriphosphat-Verbindungen ein (Burges et al. PNAS 1978 v. 75, S. 4798-).Optional For example, the phosphate component may include modifications Close modifications for example, in one embodiment a linker (D.Jameson et al., Methods in Enzymology 1997, V. 278, p. 363-, A. Draganescu et al. J. Biol. Chem. 2000 v.275, 4555-). In a werteren embodiment includes the phosphate component of the nuc-component thiotriphosphate compounds (Burges et al., PNAS 1978 v. 75, pp. 4798-).

In einer weiteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente geschützte Phosphat-Gruppen (z.B. Phosphoroamidite) ein.In a further embodiment includes the phosphate component of the nuc component protected Phosphate groups (e.g., phosphoroamidites).

In einer Ausführungsform stellt die Phosphat-Komponente die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar.In an embodiment the phosphate component makes the connection between the nuc-component and the linker component of nuc-macromolecules.

1.3.3.1.2 Variationen an der Base1.3.3.1.2 Variations at the base

Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid oder Nukleosid oder seine Analoga darstellen, vorzugsweise die an Watson-Crick-Paarbildung teilnehnem, beispielsweise Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin, oder eine modifizierte Base, wie z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 6-Thioadenin, einschließen, Literatur s. oben. Wahlweise kann die Base Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen an die Base gekoppelten Linker wie beispielsweise ein Amino-propargyl-Linker oder ein Amino-Allyl-Linker ein, weitere Beispiele für die Linker sind bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). In einer Ausführungsform stellt der an die Base gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar. Weitere Modifikationen an der Base sind beispielsweise im Katalog von Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, Ausgabe 2003 auf Seite 38 aufgeführt.The nuc-component may be a nucleotide or nucleoside or its analogues occurring naturally in the nucleic acids, preferably those participating in Watson-Crick pair formation, for example adenine, guanine, thymine, cytosine, uracil, inosine or a modified base such as eg 7-deazaadenine, 7-deazaguanine, 6-thioadenine, literature see. above. Alternatively, the base may include modifications, such as, for example, in one embodiment, include a linker coupled to the base, such as an amino-propargyl linker or an amino-allyl linker, further examples of the linkers are known (Ward et al Pat 4711955, G. Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Hobbs et al., U.S. Patent 5,047,519, or other linkers, eg, Klevan U.S. Pat. 4,828,979, Seela U.S. Pat pat. EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996, v.274, p.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, 3857, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, p. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). In one embodiment, the linker coupled to the base is the link between the nuc-component and the linker component of the nuc-macromolecules. Further modifications to the base are, for example, in the catalog of Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, 2003 Edition on page 38.

1.3.3.1.3 Variationen am Zucker1.3.3.1.3 Variations on the sugar

Dem Fachmann sind verschiedene Variationen der Zucker-Komponente der Nukleotide bekannt, die z.B. in der Diagnostik, Therapie oder Forschung eingesetzt werden. Solche Variationen schließen z.B. Ribose , 2'-Deoxyribose oder 2',3'-Dideoxyribose ein. Wahlweise kann die Zucker-Komponente Modifikationen einschließen (M. Metzger et aL. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259-, Tsien WO 91/06678), solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein. Die modifizierende Gruppe oder Linker kann beispielsweise reversibel an die Zucker-Komponente gekoppelt sein (Hovinen et al. J.Chem.Soc.Prking Trans. 1994, S. 211-, Canard US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. 6664079, Fahnestock et al. WO 91066678, Cheeseman US Pat. 5302509, Parce et al. WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497).the Specialists are different variations of the sugar component of the Nucleotides known e.g. in diagnostics, therapy or research be used. Such variations include e.g. Ribose, 2'-deoxyribose or 2 ', 3'-Dideoxyribose. Optionally, the sugar component may include modifications (M. Metzger et al., Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, Tsien WO 91/06678), such modifications include for example in a embodiment a linker. For example, the modifying group or linker reversible to the sugar component (Hovinen et al., J. Chem. Soc.Prking Trans., 1994, p. 211, Canard US Pat. No. 5,798,210, Kwiatkowski US Pat. No. 6,254,575, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. No. 666,409, Fahnestock et al. WO 91066678, Cheeseman US Pat. 5,302,509, Parce et al. WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497).

In einer Ausführungsform stellt der an die Zucker-Komponente gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der Nuk-Makromoleküle dar.In an embodiment the linker coupled to the sugar component connects between the nuc-component and the linker component of the nuc-macromolecules.

In einer weiteren Ausführungsform schließt die Zuker-Komponente z.B. folgende Modifikationen ein: wahlweise kann die 3'- oder die 2'-OH-Gruppen durch folgende Atome oder Gruppen ersetzt werden: Halogenatome, Wasserstoff, Amino-, Merkapto- oder Azido-Gruppe (Beabealashvilli et al. Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. 306, 185-).In a further embodiment includes the sugar component, e.g. following modifications: optional can the 3'- or the 2'-OH groups be replaced by the following atoms or groups: halogen atoms, Hydrogen, amino, mercapto or Azido group (Beabealashvilli et al., Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. Chr. 306, 185-).

In einer weiteren Ausführungsform schließt die Nuk-Komponente azyklische Nukleotid- oder Nukleosid-Modifikationen ein (A. Holy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567-, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-). In einer weiteren Ausführung kann die Zucker-Komponente eine Doppeltbindung einschließen.In a further embodiment includes the nuc-component acyclic nucleotide or nucleoside modifications (A. Holy Current Pharmaceutical Design 2003 v. Chr. 9, 2567, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, p. 447-). In a further embodiment can the sugar component includes a double bond.

In der Anmeldung werden 2'-Deoxynukleotide, beispielsweise 2'-Deoxyuridin-Triphosphat, 2'-Deoxycytidin-Triphosphat, 2'-Deoxyadenosin-Triphosphat, 2'-Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.In the application becomes 2'-deoxynucleotides, for example, 2'-deoxyuridine triphosphate, 2'-deoxycytidine triphosphate, 2'-deoxyadenosine triphosphate 2'deoxyguanosine triphosphate referred to as dUTP, dCTP, dATP and dGTP.

1.3.3.1.4 Kopplung von NT und Linker1.3.3.1.4 Coupling of NT and linker

Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente kann sich an der Base, am Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose), oder am Phosphat-Teil befinden.The Nuk component is connected to the linker at a coupling site. The coupling site of the linker to the nuc-component may be at the base, on the sugar (ribose or deoxyribose), or on the phosphate part are located.

Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent.The Connection between the linker component and the nuk component is preferably covalent.

Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6,7,8 bei den Purin-Basen (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Am Zucker können die Positionen 2', 3', 4' oder 5' die Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.When the coupling site is at the base, it is preferably located at positions 4 or 5 at pyrimidine bases and at positions 6, 7, 8 at the purine bases (Ward et al., US Patent 4,711,955, G. Wright et Pharmac.Ther 1990, V. 47, pages 447-, Hobbs et al., US Patent 5,047,519, or other linkers, eg, Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US Patent 6211158, US Pat. EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996, v.274, p.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, 3857, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, p. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). On the sugar positions 2 ', 3', 4 'or 5' can represent the coupling sites. The coupling to the phosphate groups can take place on the alpha, beta or gamma phosphate group. Examples of the coupling site to the base are described in Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (see also commercially available nucleotides (Amersham, Roche), on the ribose in Herrlein et al., Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al., Methodology in Enzymology, 1997, V. 278, p 363, Canard US Pat. 5,798,210, Kwiatkowski US Pat. 6,254,475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, to phosphate groups in Jameson et Method in Enzymology, 1997, v. 278, p.

Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der NT-Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für die Markierung von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet. Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des Nuk-Makromoleküls freigesetzt werden soll.The Position of the coupling point hangs from the field of application of NT macromolecules. For example for the Labeling of nucleic acids, at the nucleic acid strand should remain, preferably coupling sites on the sugar or on the base used. The coupling to the gamma or beta phosphate groups can be done, for example, when the mark during installation of the nuc macromolecule shall be.

Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt beispielsweise über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.The Connection between the nuc-component and the linker component takes place for example via a coupling unit (L) which is a part of the linker component.

Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.The Connection between the nuc-component and the linker can be in one embodiment resistant be, e.g. at temperatures up to 130 ° C, for pH ranges between 1 and 14, and / or resistant to hydrolytic enzymes (e.g., proteases, esterases) be. In another embodiment the invention is the connection between the nuc-component and the linker under mild conditions fissile.

Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker-Komponenten. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18 S.1021, Metzker et al. NAR 1994, V.22, S.4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18, S.19, Milton et al. WO 2004018493, Odedra at al. WO 0192284) oder single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382. Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z.B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter "milden Bedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht zerstören, wobei z.B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen 0°C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z.B. Tm ist 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).These fissile connection allows the removal of linker and marker components. This can be, for example in the methods of sequencing by the synthesis of importance such as Pyrosequencing, BASS (Canard et al., U.S. Patent 5,798,210, Rasolonjatovo nucleosides & nucleotides 1999, V.18 p.1021, Metzker et al. NAR 1994, V.22, p.4259, Welch et al. Nucleosides & nucleotides 1999, V.18, p.19, Milton et al. WO 2004018493, Odedra et al. WHERE 0192284) or single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382. Your choice is not limited provided they are stable under the conditions of enzymatic reaction remains, no irreversible disorder of the enzymes (e.g., polymerase) and under mild conditions can be split off. Under "mild Conditions "are to understand such conditions, for example, nucleic acid primer complexes do not destroy, whereby e.g. the pH preferably between 3 and 11 and the temperature between 0 ° C and a temperature value (x). This temperature value (x) depends on the Tm of the nucleic acid primer complex (Tm is the melting point) and is used, for example, as Tm (nucleic acid-primer complex) minus 5 ° C calculated (e.g., Tm is 47 ° C, then the maximum temperature is 42 ° C; under these conditions Ester, thioester, acetals, phosphoester, Disulfide compounds and photolabile compounds as cleavable Links).

Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Disulfid-, Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082, „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V.184 S.584, Lomant et al. J.MoI.Biol. 1976 V.104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S.Patai 1969 Interscience Publ.). Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S.1, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V.9 S.225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H.Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S.M.Bühler, 1999, Konstanz)..Preferably, said cleavable compound belongs to chemically or enzymatically cleavable or photolabile compounds. As examples of chemically cleavable groups, ester, thioester, disulfide, acetal compounds are preferred (Short WO 9949082, "Chemistry of protein conjugation and crosslin King "Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al Method in Enzymology 1990 V.184 S.584, Lomant et al., J. MoI.Biol., 1976. V. 104 243," Chemistry of carboxylic acid and esters S.Patai 1969 Interscience Publ.) Examples of photolabile compounds can be found in the following references: Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 p.1, V. Pillai Org. Photochem., 1987 V.9 p.225, Dissertation "New Photolabile Protecting Groups for Light-Controlled Oligonucleotide Synthesis" H.Giegrich, 1996, Konstanz, PhD Thesis "New Photolabile Protecting Groups for Light-Controlled Oligonucleotide Synthesis" SM Buehler, 1999, Constance). ,

1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten1.3.3.1.5 Number of linked Nuc-components

In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein Nuk-Makromolekül nur eine Nuk-Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 250, 250 bis 500, 500 bis 1000 Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.In an embodiment According to the invention, only one nuc-component is coupled per one nuc-macromolecule. In another embodiment According to the invention, several nuc-components are coupled per nuc-macromolecule. Several nuc components can be uniform or different, for example, average 2 to 5, 5 to 10, 10 to 25, 25 to 50, 50 to 100, 100 to 250, 250 to 500, 500 to 1000 nuc-components per one nuk macromolecule coupled could be.

1.3.3.2 Linker-Komponente1.3.3.2 Linker component

Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf den gesamten strukturellen Abschnitt des Nuk-Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente. Der Linker ist vorzugsweise wasserlöslich. Die genaue Linkerzusammensetzung ist nicht eingeschänkt und kann variieren.The Designation Linker or linker component becomes synonymous in the application used and refers to the entire structural section of the nuc macromolecule between the nuk component and the marker component. The linker is preferred water soluble. The exact linker composition is not limited and may vary.

In einer bevorzugten Form haben Nuk-Makromoleküle einen kurzen Linker. Seine Länge beträgt zwischen 2 und 30 Kettenatomen. Solche Linker können funktionelle Gruppen tragen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Mercapto- und Hydroxygruppen. An diese Gruppen können weitere Moleküle, z.B. Makromoleküle, wie wasserlösliche Polymere, gekoppelt werden. Beispiele von kurzen Linkern gekoppelt an Nukleotide sind dem Fachmann bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Der Linker kann eine oder mehrere Einheiten von wasserlöslichen Polymeren enthalten, wie beispielsweise Aminosäuren, Zucker, PEG-Einheiten oder Carbonsäuren. Weitere Beispiele für kurze Linker kann die Kopplungseinheit (L) eines langen Linkers dienen s.u. Linker mit der Lönge zwischen 2 und 20 Atome, werden vorzugsweise in Nuk-Makromolekülen eingesetzt, deren Marker-Komponente lineare wasserlösliche Polymere aufweist.In In a preferred form, nuc macromolecules have a short linker. His Length is between 2 and 30 chain atoms. Such linkers can carry functional groups, such as amino, carboxy, mercapto and hydroxy groups. To these groups can other molecules, e.g. Macromolecules, like water-soluble Polymers are coupled. Examples of short linkers coupled nucleotides are known to the person skilled in the art (Ward et al., US Pat 4711955, US Pat. G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, p. 447-, Hobbs et al. U.S. Patent 5,047,519 or other linkers e.g. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, p.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363-, hero et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, 3857, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, p. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). The linker may contain one or more units of water-soluble Contain polymers such as amino acids, sugars, PEG units or carboxylic acids. Further examples of short linker may be the coupling unit (L) of a long linker serve s.u. Left with the Lönge between 2 and 20 atoms, are preferably used in nuc macromolecules, whose marker component comprises linear water-soluble polymers.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein langer Linker eingesetzt, mit eine Länge von mehr als 30 Ketten-Atomen.In a further preferred embodiment The invention uses a long linker with a length of more than 30 chain atoms.

Nachfolgend werden Beispiele für die Zusammensetzung der Linker angeführt.following will be examples of the composition of the linker is given.

1.3.3.2.1 Linker-Bestandteile1.3.3.2.1 Linker components

Die Linker-Komponente stellt einen Teil des Nuk-Markromoleküls dar, der zwischen der jeweiligen Nuk-Komponente und der Marker-Komponente liegt.The Linker component is part of the nuclomycin molecule between the respective nuc-component and the marker component lies.

Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur beispielsweise folgende Bestandteile:

  • 1) Kopplungseinheit L
  • 2) wasserlösliches Polymer
  • 3) Kopplungseinheit T
The linker component has in its structure, for example, the following components:
  • 1) coupling unit L
  • 2) water-soluble polymer
  • 3) coupling unit T

Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen Bestandteil gerechnet werden.The Division of the linker component into individual components is pure functional and intended only to illustrate the structure serve. Depending on the perspective, individual structures of the Linkers be reckoned for one or the other component.

Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk-Komponente zu verbinden. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, von 1 bis 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid und von dem jeweiligen Polymer des Linkers ab. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z.B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382(siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Heivetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. 6664079, Parce WO 0050642., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 .The coupling unit L has the function of connecting the linker component and the nuk component. Preferred are short, unbranched compounds, from 1 to 20 atoms in length. The particular structure of the coupling unit L depends on the coupling site of the linker to the nucleotide and of the respective Polymer of the linker. Some examples of the coupling units L are given in Examples 1 to 33. Many conventionally modified nucleotides carry a short linker, these short linkers serve as further examples of the coupling unit L, eg short linkers on the base: Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (see also commercially available nucleotides (Amersham, Roche) , short linkers to the ribose in Herrlein et al Heivetica Chimica Acta, 1994, v. 77, p 586, Jameson et al., Method in Enzymology, 1997, v. 278, p 363, Canard US, patent 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al US Pat. 6664079, Parce WO 0050642., Short linkers to phosphate groups in Jameson et al., Method in Enzymology, 1997, V. 278, p.

Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:
R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-R7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-B-R7, R6-(CH=CH-)n-R7, R6-(A-CH=CH-)n-R7, R6-(CH=CH-B-)n-R7, R6-A-CH=CH-(CH2-)n-R7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7, R6-(-CH=CH-CH2-CH2)n-B-R7, R6-(C≡C-)n-R7, R6-(A-C≡C-)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-R7, R6-(-C≡C-CH2-CH2)n-B-R7,
wobei R6 – die Nuk-Komponente ist, R7 – de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 istStill further examples of the coupling unit L are given below:
R 6 -NH-R 7 , R 6 -OR 7 , R 6 -SR 7 , R 6 -SS-R 7 , R 6 -CO-NH-R 7 , R 6 -NH-CO-R 7 , R 6 -CO-OR 7 , R 6 -O-CO-R 7 , R 6 -CO-SR 7 , R 6 -S-CO-R 7 , R 6 -P (O) 2 -R 7 , R 6 -Si R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -R 7 , R 6 -A- (CH 2 ) n -R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (CH = CH-) n -R 7 , R 6 - (A-CH = CH-) n -R 7 , R 6 - (CH = CH-B-) n -R 7 , R 6 -A-CH = CH- (CH 2 -) n -R 7 , R 6 - (- CH = CH-CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (- CH = CH-CH 2 -CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (C≡C-) n -R 7 , R 6 - (AC≡C-) n -R 7 , R 6 - (C≡CB-) n -R 7 , R 6 -AC≡C- (CH 2 -) n -R 7 , R 6 - (- C≡C-CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (- C≡C-CH 2 -CH 2 ) n -BR 7 ,
wherein R 6 is the nuc-component, R 7 is the polymer and A and B include the following structural elements: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH- CO, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P (O) 2 -, -Si-, - (CH 2 ) n -, a photolabile group where n - is 1 to 5

Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente, auf der anderen mit Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z.B. Fluka). Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind unter Beispielen 1 bis 33 angegeben.The Coupling unit L is on a side with the Nuk component, on the other covalently bonded to polymer. The type of coupling depends on the type of polymer. In a preferred form, the polymer has reactive groups, for example NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, Halogen groups. Such polymers are commercially available (e.g., Fluka). Some variants for the coupling of polymers to the coupling units are under Examples 1 to 33 indicated.

Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polyamide (z.B. Polypeptide), Polysaccharide und deren Derivate, Dextran und seine Derivate, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(oleflnische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Säure, polyglycolic Säure, Poly(epsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(betahydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure), Poly(tartronic Säure), Poly(ortho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.The water-soluble Polymer forms the major portion in a preferred embodiment the linker component. It is a polymer, preferably hydrophilic, consisting of the same or different monomers. Examples for suitable Polymers make polyethylene glycol (PEG), polyamides (e.g., polypeptides), polysaccharides and their derivatives, dextran and its derivatives, polyphosphates, polyacetates, Poly (alkyleneglycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, Poly (olefinic alcohols), poly (vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides), Poly (hydroxyalkyl methacrylates), poly (x-hydroxy acids), poly-acrylic acid and their derivatives, poly-acrylamides in their derivatives, poly (vinyl alcohol), Polylactate acid, polyglycolic Acid, poly (epsilon-caprolactone), Poly (beta-hydroxybutyrate), poly (beta-hydroxyvalerate), polydioxanone, Poly (ethylene terephthalate), poly (malic acid), poly (tartronic acid), poly (ortho esters), polyanhydrides, polycyanoacrylates, poly (phosphoesters), polyphosphazenes, Hyaluronidates, polysulfones.

Dieses Polymer schließt in einer Ausführungsform verzweigte oder weiteren Ausführungsform nicht verzweigte Polymere ein. Das Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, dass für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so dass die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für Nuk-Makromoleküle oft keine exakte Massenangabe gemacht werden.This Polymer closes in one embodiment branched or further embodiment non-branched polymers. The polymer can differ from several consist of long sections, each section being the same Monomers and monomers in different sections are different. It should be obvious to a person skilled in the art that for a macromolecular linker usually only an average Mass can be determined so that the information on the molecular weights one Mean ("Macromolecules, Chemical Structure and Synthesis ", Vol. 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). For this reason can for Nuc-macromolecules often no exact mass specification is made.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Linker-Komponente ein lineares, nicht verzweigtes Polymer ein und trägt keine sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Liganden. Solche Linker ermöglichen eine geringe sterische Hinderung der enzymatischen Erkennung der Nuk-Komponenten.In a preferred embodiment the invention concludes the linker component is a linear, unbranched polymer and carries no sterically demanding chemical structures, such as Dyes, fluorescent dyes, ligands. Enable such linkers a slight steric hindrance of the enzymatic recognition of Nuc-components.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer der Linker-Komponente linear, die Linker-Komponente trägt jedoch eine oder mehrere sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe. Die Einführung der sterisch anspruchsvollen Gruppen erlaubt bei manchen Verfahren eine Kontrolle der enzymatischen Reaktion (Tcherkassov WO 02088382). Weitere Beispiele für sterisch anspruchsvolle Gruppen sind im Abschnitt 1.3.19 angegeben.In a further preferred embodiment of the invention, the polymer of the linker component is linear, the Carries linker component but one or more sterically demanding chemical structures, such as dyes. The introduction of sterically demanding In some methods, groups allow control of the enzymatic Reaction (Tcherkassov WO 02088382). Other examples of steric Demanding groups are given in section 1.3.19.

Sterisch anspruchsvollen Liganden bzw. Strukturen können an unterschiedliche Linker-Abschnitte gekoppelt sein. Die durchschnittliche Zahl der an den Linker gekoppelten sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50. Die Kopplung von sterisch anspruchsvollen Gruppen sollte die Tatsache berücksichtigen, dass eine raumfordernde Struktur in der Nähe der Nukleotid-Komponente zur Aufhebung der Substrateigenschaften führen kann, s. Beispiel 25. Sterisch anspruchsvolle Liganden können gleichmäßig oder zufällig über die gesamte Länge des Linkers gekoppelt sein, oder in einem bestimmten Abstand von der Nuk-Komponte am Linker gekoppelt sein. Der Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem sterischen Hindernis beträgt beispielsweise 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000 Kettenatome. Die sterisch anspruchsvolle Gruppe kann als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.Sterically demanding ligands or structures can be coupled to different linker segments. The average number of sterically bulky ligands coupled to the linker can vary, for example between 1 and 3, 3 and 5, 5 and 20, 20 and 50. The coupling of sterically demanding groups should take into account the fact that a space-occupying structure near the nucleotide component can lead to the abrogation of the substrate properties, s. Example 25. Sterically demanding ligands may be uniformly or randomly coupled along the entire length of the linker, or coupled to the linker at a certain distance from the nuc-component. The distance between the nuc-component and the steric barrier is, for example, 10 to 15, 15 to 20, 20 to 25, 25 to 30, 30 to 35, 35 to 40, 40 to 45, 45 to 50, 50 to 55, 55 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 100 to 200, 200 to 1000, 1000 to 5000 chain atoms. The sterically demanding group can be considered as part of the linker or as part of the marker. For example, the consideration may depend on whether or not a sterically demanding group has certain signal properties.

1.3.3.2.2 Linker-Länge1.3.3.2.2 Linker length

Die durchschnittliche Linkerlänge beträgt zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Atome (gezählt werden Ketten-Atome), somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Angström (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).The average linker length is between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 40, 40 to 50, 50 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10,000, 10,000 to 100,000 atoms (counting chain atoms), thus is the average linker length between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 40, 40 to 50, 50 to 60, 60 to 70, 70 to 80, 80 to 90, 90 to 100, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10,000, 10,000 to 100,000 angstroms (measured on a potential maximally outstretched molecule).

Falls ein Nuk-Makromolekül mehrere Linker-Komponenten einschließt, können diese Linker-Komponenten untereinander gleiche oder auch unterschiedlich lang sein.If a nuc macromolecule includes multiple linker components, these linker components be the same or different lengths.

Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.Some Sections of the linker can contain rigid areas and other sections can be flexible areas contain.

1.3.3.2.3 Linker-Kopplung in einem Nuk-Makromolekül1.3.3.2.3 Linker coupling in a nuc macromolecule

Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu kann der Linker an seinen Enden Kopplungseinheiten haben, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk-Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z.B. Fluka). Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind in Beispielen 1 bis 33 angegeben, Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.Of the Linker is on one side to the nuk component and on the other Bound to the marker component. This can be done by the linker have its ends coupling units that fulfill this function. The Connection with the Nuk components was discussed above. The link between the linker and the marker components is via coupling unit T. Preferred are short, unbranched compounds, up to max. 20 Atoms in length. The respective structure of the coupling unit T depends on the coupling point on the marker component and on the respective polymer of the linker. The coupling unit T is covalently bonded to the polymer. The Type of coupling depends on the type of polymer. In a preferred form, the polymer reactive groups at its ends, for example NH 2 (amino), OH (Hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide, halogen groups. Such polymers are commercially available (e.g., Fluka). Some examples for the coupling units L are given in Examples 1 to 33, Further examples of the chemical and affine couplings s. in the literature: "Chemistry of protein conjugation and crosslinking "Shan S. Wong 1993," Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996.

Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen (9) s. Beispiele 22, 23, 24,31.The linker may also contain other functional groups or sections, for example one or more cleavable groups under mild conditions ( 9 ) s. Examples 22, 23, 24, 31.

Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker-Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.A fissile connection within the linker allows removal of one Part of the linker and the marker component. After the split remains a linker residue at the nuc-component, examples of cleavable compounds are specified in section 1.3.3.1.4.

1.3.3.3 Marker-Komponente1.3.3.3 Marker component

Die Marker-Komponente kann unterschiedliche Strukturen haben. Die Strukturen im einzelnen sind nicht eingeschränkt, solange sie die Substrateigenschaften der Nuk-Komponenten für Enzyme nicht aufheben. Diese Struktur hat vorzugsweise eine signalgebende oder eine signalvermittelnde Funktion. Der Marker kann auch andere Funktionen haben, beispielsweise strukturturelle, antitoxische oder affine Funktion (beispielsweise in Arzneimittel oder Zuberetungen).The Marker component can have different structures. The structures In particular, they are not limited as long as they have the substrate properties the nuk components for enzymes do not pick up. This structure preferably has a signaling or a signal-switching function. The marker may be different Have functions, such as structural, antitoxic or Affine function (for example, in medicines or Zuberetungen).

1.3.3.3.1 Die Zusammensetzung der Marker-Komponente (Marker)1.3.3.3.1 The composition the marker component (marker)

Der Marker schließt in einer Ausführung eine niedermolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine makromolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere niedermolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere makromolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine Kombination aus niedermolekularen und makromolekularen Einheiten ein. Die Marker-Einheiten können eine signalgebende oder signalvermittelnde Funktion haben.Of the Marker closes in one execution a low molecular weight marker unit. In a further embodiment includes the marker is a macromolecular marker unit. In a further embodiment includes the marker several low molecular weight marker units. In a another embodiment includes the marker inserts several macromolecular marker units. In a Another embodiment includes the marker a combination of low molecular weight and macromolecular units one. The marker units can have a signaling or signal-switching function.

Diese Einheiten können Moleküle mit geringer Molekularmasse, z.B. unter 2000 Da, oder auch selbst Makromoleküle sein. Dabei schließt die Zahl der signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten, die zu einer Marker-Komponenten zusammengefaßt sind, folgende Bereichen ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.These Units can molecules low molecular weight, e.g. below 2000 Da, or even macromolecules. It concludes the number of signaling or signaling devices, which are combined to form a marker components, the following areas a: 1 and 2, 2 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 100, 100 and 500, 500 and 1000. 1000 and 10000, 10000 and 100000.

Falls mehrere Marker-Einheiten in einem Marker zusammengefasst: sind, sind diese Einheiten in einer Ausführungsform an ein Gerüst gebunden, die Kern-Komponente des Markers (4b,4c). Diese Kern-Komponente verbindet die Einheiten untereinander. Die Kern-Komponente kann die Verbindung zu einem oder mehreren Nuk-Linker-Komponenten herstellen (5). Die Kern-Komponente schließt niedermolekulare oder makromolekulare Verbindungen ein.If several marker units are combined in one marker: in one embodiment, these units are linked to a framework, the core component of the marker ( 4b . 4c ). This core component connects the units with each other. The core component can connect to one or more nuc-linker components ( 5 ). The core component includes low molecular weight or macromolecular compounds.

1.3.3.3.2 Struktur der signalgebenden oder der signalvermittelnden Einheiten des Markers1.3.3.3.2 Structure of the signaling or the signal-transmitting units of the marker

Die strukturellen Marker-Einheiten schließen folgende Gruppen ein:The structural marker units include the following groups:

1.3.3.3.2.1 Strukturen mit niedriger Molmasse:1.3.3.3.2.1 Structures with low molecular weight:

Biotin-Moleküle, Hapten-Moleküle (z.B. Digoxigenin), radioaktive Isotope (z.B. P32, J131), oder deren Verbindungen, seltene Erden , Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenz-Quencher (z.B. Dabsyl) (viele dieser Moleküle sind kommerziell erhältlich z.B. von Molecular Probes, Inc., oder Sigma-Aldrich) mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, Farbstoffe, die untereinander FRET eingehen. Thermochrome, photochrome oder chemolumineszente Substanzen (erhältlich z.B. bei Sigma-Aldrich), Chromogene Substanzen (z.B. als Substrate für Peptidasen beschrieben in „Proteolytic enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).Biotin molecules, hapten molecules (eg digoxigenin), radioactive isotopes (eg P 32 , J 131 ), or their compounds, rare earths, dyes, fluorescent dyes, fluorescence quenchers (eg dabsyl) (many of these molecules are commercially available eg from Molecular Probes, Inc., or Sigma-Aldrich) with the same or different spectral properties, dyes that undergo FRET among themselves. Thermochromic, photochromic or chemiluminescent substances (available from Sigma-Aldrich, for example), chromogenic substances (eg as substrates for peptidases described in "Proteolytic enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).

Auch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Merkapto-, Aldehyd-, Jodacetat-, Acryl-, Dithio-, Thioester-Verbindungen können als signalvermittelnde strukturelle Einheiten dienen (6a). Nach dem Einbau können diese reaktiven Gruppen mit signalgebenden Elementen, wie beispielsweise Farbstoffe mit entsprechenden reaktiven Gruppen (beispielsweise NHS-Ester, Merkapto-, Amino-Gruppen) modifiziert werden (6b). Allgemeine Grundlagen für die Wahl eines passenden Paares von reaktiven Gruppen sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 dargestellt.Also chemically reactive groups, such as amino, carboxy, mercapto, aldehyde, iodoacetate, acrylic, dithio, thioester compounds can serve as signal-transmitting structural units ( 6a ). After incorporation, these reactive groups can be modified with signaling elements, such as, for example, dyes having corresponding reactive groups (for example NHS esters, mercapto, amino groups) ( 6b ). General bases for the selection of a suitable pair of reactive groups are presented in "Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993.

In einer speziellen Ausführungsform erfühlt die Kombination aus einer Nuk-Einheit, einer markomolekularen Linker-Komponente und einem Marker mit niedriger Molmasse bereits die Anforderungen der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung. Sie können sowohl als Zwischenprodukte für die chemische Synthese von Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen Marker, z.B. dUTP-PEG-Biotin, als auch selbständig in den enzymatischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise mit nur einem Farbstoff markierte Nukleotide.In a special embodiment He feels the combination of a Nuk unit, a markomolecular linker component and a low molecular weight marker already meets the requirements of the present invention. Such compounds are also subject matter this invention. You can both as intermediates for the chemical synthesis of nuc macromolecules with a macromolecular Markers, e.g. dUTP-PEG-biotin, and independently in enzymatic reactions can be used, such as labeled with only one dye Nucleotides.

Als Farbstoffe können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auftreten, ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, solange sie die enzymatische Reaktion nicht wesentlich beeinflußen. Beispiele für Farbstoffe sind Rhodamine (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin, erhältlich bei Fluka-Sigma), Cyanin-Farbstoffe (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 von Amersham Bioscience), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, Alexa-Farbstoffe: z.B. Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Viele Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande (im weiteren als Molecucular Probes bezeichnet) oder von Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland). Beispiele für die Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem niedermolekularem Marker ist in Beispiel 19, 20, 23, 36, 37, 38 angegeben.When Dyes can different fluorescent dyes occur, their choice is not limited, as long as they do not significantly affect the enzymatic reaction. Examples for dyes Rhodamine (Rhodamine 110, tetramethylrhodamine, available from Fluka sigma), cyanine dyes (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 from Amersham Bioscience), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, Alexa Dyes: e.g. Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Many dyes are commercially available, for example from Molecular Probes Europe, Leiden, The Netherlands (hereinafter referred to as Molecular Probes) or Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Germany). Examples of the Synthesis of a Nuc Macromolecule Having a Low Molecular Weight Marker is given in Example 19, 20, 23, 36, 37, 38.

In einer Ausführungsform schließt ein Marker mehrere Marker-Eirheiten ein. Dabei können die Marker-Einheiten untereinander gleiche oder verschiedene Eigenschaften haben. Beispielsweise können Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die FRET-Paare bilden.In one embodiment, a marker includes multiple marker units. The marker units can have the same or different properties among each other. For example, fluorescent dyes with different spectral properties can be used. In one embodiment, who used the fluorescent dyes that form FRET pairs.

1.3.3.3.2.2 Strukturen mit hoher Masse (Makromoleküle)1.3.3.3.2.2 Structures high mass (macromolecules)

1.3.3.3.2.2.1 Nanokristalle1.3.3.3.2.2.1 Nanocrystals

Nanokristalle, z.B. Quantum Dots können als Marker-Einheiten auftreten. Dabei können in einer Marker-Komponente Quantum Dots mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, US Pat. 6.322.901, US Pat. 6.423.551, US Pat. 6.251.303, US Pat. 5.990.479).Nanocrystals e.g. Quantum Dots can occur as marker units. It can be in a marker component Quantum dots with the same or different spectral properties US Pat. No. 6,322,901, US Pat. No. 6,423,551, US Pat. 6,251,303, US Pat. 5,990,479).

1.3.3.3.2.2.2 Nano oder Mikro-Teilchen.1.3.3.3.2.2.2 Nano or Micro-particles.

Nano oder Mikro-Teilchen können als Marker-Einheiten auftreten, wobei die größten Ausmaße dieser Teilchen von 1nm bis 2nm, von 2nm bis 5nm, von 5nm bis 10nm, von 10nm bis 20 nm, von 20nm bis 50nm, von 50nm bis 100nm, von 100 nm bis 200nm, von 200nm bis 500nm, von 500nm bis 1000nm, von 1000 nm bis 5000 nm betragen. Das Material der Teilchen können beispielsweise reine Metalle wie Gold, Silber, Aluminium (beispielsweise Teilchen mit surfiace plasmon resonance), – Protein-Au-Konjugate: J. Anal.Chem. 1998, V. 70,S. 5177, – Nukleinsäure-Au-Konjugaten: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, S.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000, V. 122, S. 9071 , Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, S. 817, Anal. Chem. 2001, V. 73, S. 4450), – Latex (z.B. Latex-Nanopartikel, Anal. Chem. 2000,V. 72, S. 1979) – Kunststoff (Polystyrene), – paramagnetische Verbindungen/Gemische Zhi ZL et al. Anal Biochem. 2003 Jul 15;318(2):236-43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Jul 22;100(15):8817-22„ – Metall-Teilchen, – magnetische Verbindungen/Gemische Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar; 3(2):153-61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30;42(21):2372-2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 Jul 15;75(14):3144-51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15;66A(4):870-9, JOSEPHSON Lee et al. US Pat. 2003092029, KLICHE: KAY-OLIVER et al. WO0119405.Nano or micro-particles can occur as marker units, with the largest dimensions of these particles of 1nm up to 2nm, from 2nm to 5nm, from 5nm to 10nm, from 10nm to 20nm, from 20nm to 50nm, from 50nm to 100nm, from 100nm to 200nm, from 200nm to 500nm, from 500nm to 1000nm, from 1000nm to 5000nm. The material of the particles can For example, pure metals such as gold, silver, aluminum (for example Particles with surfiace plasmon resonance), - protein Au conjugates: J. Anal. Chem. 1998, V. 70, p. 5177, - nucleic acid-Au conjugates: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, p.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000 V. 122, p. 9071, Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, p. 817, anal. Chem. 2001, V. 73, p. 4450), latex (e.g., latex nanoparticles, Anal. Chem. 2000, V. 72, p. 1979) - plastic (polystyrene), - paramagnetic Compounds / Mixtures Zhi ZL et al. Anal Biochem. 2003 Jul 15; 318 (2): 236-43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sci USA 2003 Jul 22; 100 (15): 8817-22 "- Metal Particles, - Magnetic Compounds / Mixtures Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar; 3 (2): 153-61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30; 42 (21): 2372-2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 Jul 15; 75 (14): 3144-51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15; 66A (4): 870-9, JOSEPHONE Lee et al. US Pat. No. 2003092029, KLICHE: KAY-OLIVER et al. WO0119405.

1.3.3.3.2.2.3 Proteinmoleküle,1.3.3.3.2.2.3 Protein molecules,

Proteinmoleküle können als Marker-Einheiten auftreten, wobei sie folgende Gruppen schließen: Enzyme (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphotase, Unease, beta-Galaktosidase, Proteinasen), – fluoreszierenden Proteine (z.B. aus GFP-Protein-Familie oder Phycobiliproteine (z.B. Phycoerythrin, Phycocyanin), erhältlich z.B. von Molecular Probes Inc.), Antigen-bindende Proteine (z.B. Antikörper, Tetramere, Affibodies (Nord et. Al Nature Biotechnology, V. 15 (S.772-777) oder deren Bestandteile (z.B. Fab-Fragmente), Nukleinsäurebindende Proteine (z.B. Transcriptionsfaktor)Protein molecules can be considered as Marker units occur, closing the following groups: enzymes (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase, unease, beta-galactosidase, proteinases), - fluorescent proteins (e.g., from GFP protein family or phycobiliproteins (e.g., phycoerythrin, Phycocyanin), available e.g. from Molecular Probes Inc.), antigen-binding proteins (e.g., antibodies, tetramers, Affibodies (Nord et al., Al Nature Biotechnology, V. 15 (S.772-777)). or their components (e.g., Fab fragments), nucleic acid binding agents Proteins (e.g., transcription factor)

1.3.3.3.2.2.4 Nukleinsäureketten,1.3.3.3.2.2.4 Nucleic acid chains,

Die Nukleinsäureketten einschließlich der Gruppe, Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, können als Marker-Einheiten auftreten. Die Länge der Nukleinsäureketten liegt vorzugsweise in folgenden Bereichen von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5.000, von 5.000 bis 10.000, von 10.000 bis 100.000 Nukleotiden. Es können DNA, RNA, PNA-Moleküle verwendet werden. Nukleinsäureketten können zusäzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise freie Aminogruppen, Farbstoffe und andere signalgebende Moleküle, z.B. makromolekulare Stoffe, Enzyme oder Nanokristalle ( 7a,4c). Modifizierte Nukleinsäureketten sind kommerziell zugängig, z.B. MWG-Biotech. Weitere Beispiele für Makromoleküle oder Makromolekülkomplexe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Marker oder Marker-Einheiten in der Marker-Komponente für die Signalverstärkung eingesetzt werden können, sind in US Pat. 4882269, US Pat. 4687732, WO 8903849, US Pat. 6017707, US Pat. 6627469 beschrieben.The nucleic acid chains, including the group, oligonucleotides, modified oligonucleotides, can occur as marker units. The length of the nucleic acid chains is preferably in the following ranges of 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 5000, 5,000 to 10,000, 10,000 up to 100,000 nucleotides. DNA, RNA, PNA molecules can be used. Nucleic acid chains can carry additional modifications, such as free amino groups, dyes and other signaling molecules, eg macromolecular substances, enzymes or nanocrystals ( 7a . 4c ). Modified nucleic acid chains are commercially available, eg MWG Biotech. Further examples of macromolecules or macromolecule complexes which can be used in the present invention as markers or marker units in the signal amplification marker component are described in US Pat. No. 4,882,269, US Pat. No. 4,683,732, WO 8903849, US Pat. No. 6,017,707 , US Pat. No. 6627469.

Auch anderen Marker-Einheiten, wie Lektine; Wachstumsfaktoren, Hormone, Rezeptor-Moleküle können eingesetzt werden.Also other marker units, such as lectins; Growth factors, hormones, Receptor molecules can be used become.

1.3.3.3.3 Die Kern-Komponente der Marker-Komponente1.3.3.3.3 The core component the marker component

Die Kernkomponente hat die Funktion mehrere strukturelle Elemente der Nuk-Makromoleküle zu binden. Beispielsweise bindet die Kern-Komponente mehrere Marker-Einheiten zusammen. In einer weiteren Ausführungsform können Linker-Komponenten an die Kern-Komponente gebunden werden s. 5. Der Begriff der Kern-Komponente ist funktionell und dient zur Erläuterung von möglichen Strukturen von Nuk-Makromolekülen. Unterschiedliche chemische Strukturen, die Linker und Marker-Einheiten zusammenhalten, können als Kern-Komponente bezeichnet werden. Im Folgenden sind Beispiele für Bestandteile der Kernkomponente angegeben.The core component has the function of binding several structural elements of the nuc macromolecules. For example, the core component binds several marker units together. In another embodiment, linker components can be attached to the core component. 5 , The term core component is functional and is used to illustrate possible structures of nuc macromolecules. Different chemical structures holding linker and marker units together can be used Nuclear component. The following are examples of components of the core component.

1.3.3.3.3.1 Bestandteile der Kernkomponente1.3.3.3.3.1 Components the core component

In einer Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einer oder mehreren niedermolekularen Verbindungen. Sie haben die Funktion, die Marker-Einheiten untereinander zu verbinden. Die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und den Marker-Einheiten kann kovalent oder affin sein. Bei kovalenter Bindung können beispielsweise Verbindungen mit allgemeiner Struktur-Formel (F)m-R-(H)n als Ausgangsmateriel dienen, wo (F) und (H) – reaktive Gruppen darstellen, und R – eine Verbindungskomponente, wobei Zahl solcher Gruppen und ihre Anordnung stark variieren kann. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, z.B. Verbindungen aus der Gruppe Cross-Linker („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.). Die Struktur ist nicht eingeschränkt. Sie ist vorzugsweise wasserlöslich. Beispielsweise schließen (F) und (H) unabhängig von einander folgende Gruppen ein: NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid. Beispiele für (R) stellen wasserlösliche Polymere wie PEG oder Polypeptid-Ketten oder kurze aliphatische Ketten dar.In one embodiment, the core component is one or more low molecular weight compounds. They have the function of connecting the marker units with each other. The connection between the core component and the marker moieties may be covalent or affine. For example, in the case of covalent bonding, compounds of general structural formula (F) m -R- (H) n may serve as the starting material where (F) and (H) - are reactive groups, and R - is a linking component wherein number of such groups and their arrangement can vary widely. Many examples are known to the person skilled in the art, for example compounds from the group of cross-linkers (Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.) The structure is not restricted and is preferably water-soluble ) and (H) independently of each other include: NH 2 (amino), OH (hydroxy), SH (mercapto), COOH (carboxy), CHO (aldehyde), acrylic or maleimide Examples of (R) represent water-soluble polymers such as PEG or polypeptide chains or short aliphatic chains.

In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem wasserlöslichen Polymer, dabei kann das Polymer aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen.In a further embodiment The core component consists of a water-soluble polymer, it can the polymer consist of the same or different monomers.

Beispiele für den Kern-Komponennte stellen folgende Polymere und deren Derivate dar: Polyamide (z.B. Polypeptide wie Poly(glutamin) oder Poly(Glutamin säure)) und deren Derivate, Poly-Acrylsäure und deren Derivate, natürliche oder synthetische Polysaccharide (z.B. Stärke, Hydroxy-Ethyl-Stäärke), Dextran und seine Derivate (z.B. Aminodextran, Carboxy-Dextran), Dextrin, Poly-Acrylamide und deren Derivate (z.B. N-(2-hydroxypropyl)-methacdylamid) , Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäuren, Proteine. Diese Polymere können linear, globulär, z.B. Streptavidin oder Avidin, oder verzweigt sein, z.B. Dendrimere (8a). Auch vernetzte lösliche Polymere, wie beispielswiese vernetzte Poly-Acrylamide (Crosslinker Bisacrylamid in Kombination mit Poly-Acrylamid), eingesetzt werden.Examples of the Kern-Komponennte represent the following polymers and derivatives thereof: polyamides (eg polypeptides such as poly (glutamine) or poly (glutamic acid)) and their derivatives, polyacrylic acid and derivatives thereof, natural or synthetic polysaccharides (eg, starch, hydroxy Ethyl starch), dextran and its derivatives (eg, aminodextran, carboxy-dextran), dextrin, polyacrylamides and their derivatives (eg, N- (2-hydroxypropyl) -methacdylamide), polyvinyl alcohols and their derivatives, nucleic acids, proteins , These polymers can be linear, globular, eg streptavidin or avidin, or branched, eg dendrimers ( 8a ). Crosslinked soluble polymers, such as, for example, crosslinked polyacrylamides (crosslinker bisacrylamide in combination with polyacrylamide), are used.

Da sowohl die Linker-Komponente als auch die Marker-Komponente wasserlösliche Polymere enthalten können, kann in einer Ausführungsform ein solches Polymer sowohl als Linker als auch als Kern-Komponente dienen. In diesem Fall kann ein Abschnitt eines solchen Polymers als Linker, ein anderer Abschnitt als Kern-Komponente betrachtet werden.There both the linker component and the marker component water-soluble polymers can contain can in one embodiment such a polymer both as a linker and as a core component serve. In this case, a section of such a polymer as a linker, another section can be considered as a core component.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden lineare oder wenig verzweigte Polymere als Kernkomponenten eingesetzt, beispielsweise Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure, Polysaccharide, Dextran, Poly-Acrylamide, Poly-Vinylalkohole. Das Polymer kann aus einheitlichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen. Insbesondere in dieser Ausführungsform kann die Linker-Komponente weniger als 50 Kettenatome aufweisen. So können auch Linker-Längen von ca. 5 bis 10, 10 bis 20 oder 20 bis 50 Kettenatome ausreichend sein, um die Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle für Enzyme zu bewahren. Eine solche Kern-Komponente des Markers erfüllt die Funktion der Linker-Komponente: sie schafft räumlichen Abstand zwischen sterisch anspruchsvollen Marker-Einheiten und aktiven Zentren der jeweiligen Enzyme.In an advantageous embodiment The invention relates to linear or less branched polymers than Core components, for example polyamides (e.g., polypeptides), Poly-acrylic acid, Polysaccharides, dextran, polyacrylamides, polyvinyl alcohols. The polymer may be off consist of uniform or different monomers. Especially in this embodiment For example, the linker component may have less than 50 chain atoms. So can also linker lengths from about 5 to 10, 10 to 20 or 20 to 50 chain atoms sufficient be to the substrate properties of nuc-macromolecules for enzymes to preserve. Such a core component of the marker meets the Function of the linker component: it creates spatial distance between steric sophisticated marker units and active centers of each Enzymes.

Die wasserlöslichen Polymere haben vorzugsweise eine durchschnittliche Ketten-Länge von 20 bis 1.000.000 Kettenatomen. Beispielsweise liegt die durchschnittliche Kettenlänge zwischen 20 und 100, 100 und 500, 500 und 5000, 5000 und 100000, 100000 und 1000000 Kettenatome.The water-soluble Polymers preferably have an average chain length of 20 to 1,000,000 chain atoms. For example, the average is chain length between 20 and 100, 100 and 500, 500 and 5000, 5000 and 100000, 100,000 and 1,000,000 chain atoms.

In einer Ausführungsform liegt das Polymer in wässriger Phase bei pH zwischen 4 und 10 vorwiegend in einer neutralen Form vor (z.B. Dextran oder Polyacrylamid). In einer anderen Ausführungsform liegt das Polymer in einer wässrigen Phase bei pH zwischen 4 und 10 in einer geladen Form vor. Es kann sowohl positive (z.B. Polylysin) oder negative Ladungen (z.B. Polyacrylsäure) tragen.In an embodiment the polymer is in aqueous Phase at pH between 4 and 10 predominantly in a neutral form before (e.g., dextran or polyacrylamide). In another embodiment the polymer is in an aqueous Phase at pH between 4 and 10 in a charged form. It can carry both positive (e.g., polylysine) or negative (e.g., polyacrylic acid) charges.

Die Kopplung von Marker-Einheiten an ein wasserlösliches Polymer hängt von der Art des Polymers ab. Die für die Kopplung notwendigen reaktiven Gruppen können bereits im Polymer vorhanden sein (z.B. Polylysin oder Polyacrylsäure) oder in einem getrennten Schritt in das Polymer eingeführt werden. Beispielsweise bei Dextran sind viele Varianten der Einführung von reaktiven Gruppen und chemischen Kopplungen bekannt (Molteni L. Methods in Enzymology 1985, v.112, 285, Rogovin A.Z. et al. J.Macromol Sci. 1972, A6, 569, Axen R. et al. Nature 1967, v. 214, 1302, Bethell G.S. et al. J. Biol.Chem. 1979, v.254, 2572, Lahm O. et al. Carbohydrate Res. 1977, v. 58, 249, WO 93/01498, WO 98/22620, WO 00/07019).The Coupling of marker units to a water-soluble polymer depends on the type of polymer. The for The coupling necessary reactive groups may already be present in the polymer its (e.g., polylysine or polyacrylic acid) or in a separate Step introduced into the polymer become. For example, with dextran, many variants are the introduction of reactive groups and chemical couplings known (Molteni L. Methods in Enzymology 1985, v.112, 285, Rogovin A.Z. et al. J.Macromol Sci. 1972, A6, 569, Axen R. et al. Nature 1967, v. 214, 1302, Bethell G. S. et al. J. Biol. Chem. 1979, v.254, 2572, Lahm O. et al. Carbohydrate Res. 1977, v. 58, 249, WO 93/01498, WO 98/22620, WO 00/07019).

Die Kern-Komponennte hat vorzugsweise mehrere Kopplungsstellen, an die weitere Elemente gebunden werden können, z.B. strukturelle Marker-Einheiten oder Nuk-Linker-Komponente.The Kern-Komponennte preferably has multiple coupling points, to the other elements can be bound, e.g. structural marker units or Nuk linker component.

Beispielsweise Poly-Lysin-Moleküle haben multiple freie Aminogruppen, an die mehrere Farbstoffmoleküle, Biotinmoleküle, Haptenmoleküle oder Nukleinsäureketten gekoppelt werden können. Poly-Lysine haben unterschiedliche Molmasse, z.B. 1000-2000, 2000-10000, 10000-50000 Da können käuflich erworben werden.For example Poly-lysine molecules have multiple free amino groups to which multiple dye molecules, biotin molecules, hapten molecules or nucleic acid chains can be coupled. Poly-lysines have different molecular weights, e.g. 1000-2000, 2000-10000, 10000-50000 There you can for sale be acquired.

Als weiteres Beispiel für die Kernkomponente dienen Nukleinsäurenstränge, wobei die Nukleinsäureketten eine Länge von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5000, von 5000 bis 10000 Nukleotiden haben. Diese Nukleinsäuren dienen als Bindungspartner für sequenzkomplementäre Markereinheiten (7b).As a further example of the core component serve nucleic acid strands, wherein the nucleic acid chains have a length of 10 to 20, from 20 to 50, from 50 to 100, from 100 to 200, from 200 to 500, from 500 to 1000, 1000 to 5000, of 5000 to have 10,000 nucleotides. These nucleic acids serve as binding partners for sequence-complementary marker units ( 7b ).

In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem Dendrimer, z.B. Polypropylenimine, Polyaminoamine. Beispiele für andere Dendrimere sind bekannt: Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers Nr. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, S. 199, Manduchi et al. Physiol. Genomics 2002, V.10, S.169, Sharma et al. Electrophoresis. 2003, V. 24, S. 2733, Morgan et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Nov;5(6):966-73, Benters et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2):E10, Nilsen et al. J Theor Biol. 1997 Jul 21;187(2):273-84. Viele Dendrimere sind kommerziell erwerblich (Genisphere, www.genisphere.com, Chimera Biotech GmbH).In a further embodiment if the core component consists of a dendrimer, e.g. polypropylenimines, Polyaminoamines. examples for Other dendrimers are known: Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers No. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, p. 199, Manduchi et al. Physiol. Genomics 2002, V.10, p.169, Sharma et al. Electrophoresis. 2003, V. 24, p. 2733, Morgan et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Nov; 5 (6): 966-73, Benters et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15; 30 (2): E10, Nilsen et al. J Theor Biol. 1997 Jul 21; 187 (2): 273-84. Many dendrimers are commercially available (Genisphere, www.genisphere.com, Chimera Biotech GmbH).

Weitere Kombinationen für die Kern-Komponennte aus den oben dargestellten Bestandteilen sind einem Fachmann naheliegend.Further Combinations for the core components of the components shown above are obvious to a person skilled in the art.

1.3.3.3.3.2 Kopplung der Marker-Einheiten1.3.3.3.3.2 Coupling of the Marker units

Marker-Einheiten können an die Kern-Komponente oder an die Linker-Komponente durch eine kovalente Bindung, beispielsweise über einen Cross-linker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), oder über eine affine Kopplung erfolgen, beispielsweise Biotin-Streptavidin-Verbindung oder Hybridisierung von Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkung ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).Marker units can to the core component or to the linker component by a covalent bond, for example via a cross-linker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2), or over an affine coupling, for example, biotin-streptavidin compound or hybridization of nucleic acid strands or antigen-antibody interaction ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).

Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt in einer Ausführungsform bereits während der Synthese der Nuk-Makromoleküle.The Coupling of marker units to the core component takes place in an embodiment already during the synthesis of nuc macromolecules.

In einer anderen Ausführungsform erfolgt zunächst die chemische Synthese von Nuk-Makromoleküle, bei denen die Markerkomponente nur aus der Kern-Komponente besteht. Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt erst nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette. Durch eine große Zahl der potenziellen Bindungsstellen am Kernteil ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente und somit an die eingebaute Nuk-Komponente wesentlich größer im Vergleich zu konventionellen Nukleotid-Strukturen. Die Kopplungschemie im einzelnen hängt von der Struktur der Marker-Einheiten und der Struktur der Kern-Komponente ab.In another embodiment takes place first the chemical synthesis of nuc macromolecules, at where the marker component consists only of the core component. The coupling of marker units to the core component takes place only after the incorporation of nuc-macromolecules into the nucleic acid chain. By a big Number of potential binding sites at the core part is the probability the binding of the marker units to the core component and thus to the built-in Nuk component much larger in comparison to conventional nucleotide structures. The coupling chemistry in individual hangs on the structure of the marker units and the structure of the core component from.

Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein (Beispiel 33), z.B. bei Temperaturen bis zu 100°C, für pH-Bereiche zwischen 3 und 12, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.covalent Coupling: The link between the marker units and the core component can be found in an embodiment resistant (Example 33), e.g. at temperatures up to 100 ° C, for pH ranges between 3 and 12, and / or resistant to hydrolytic enzymes (e.g., esterases). In another embodiment of the invention the connection between the nuc-component and the linker under mild Conditions fissile.

Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuren an Dendrimere (entspricht einer Kopplung von Marker-Einheiten an eine Kernkomponente) sind z.B. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug 1;27(15):3035-41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21;(24):2954 dargestellt.Examples for the Coupling of nucleic acids on dendrimers (corresponds to a coupling of marker units to a core component) are e.g. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug 1; 27 (15): 3035-41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21; (24): 2954.

1.3.3.3.3.3 Kopplung zwischen Linker und Marker1.3.3.3.3.3 Coupling between Linker and marker

Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente ab. In einer Ausführungsform ist die Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit gebunden, 4a. Dabei kann der Marker aus nur einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen.The connection between the linker component and the marker depends on the particular structure of the marker units or the structure of the core component. In one embodiment, the linker moiety is bound directly to the signaling or signal-mediating marker moiety, 4a , It can the marker consists of only one or more marker units.

In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Linker-Komponenten an die Kern- Komponente des Markers gebunden, 5d.In another embodiment, one or more linker moieties are attached to the core component of the label, 5d ,

Die Bindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z.B. "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).The Binding between the linker component and the marker can be both covalent as well as affine. Many examples are the expert known, s. e.g. "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. "Chemistry of protein conjugation and crosslinking "Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).

Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 130°C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen)sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.covalent Coupling: The connection between the linker component and the link Marker can in one embodiment resistant be, e.g. at temperatures up to 130 ° C, for pH ranges between 1 and 14, and / or resistant to hydrolytic enzymes (e.g., proteases, esterases). In another embodiment the invention is the connection between the nuc-component and the linker under mild conditions fissile.

Die für die Markierung von Nukeotiden erfindugnsgemäß eingesetzten Makromolekulare Verbidungen schließen in einigen Ausführungsformen wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Die Linker der Nukmakromoleküle schließen ebenfalls wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die Zuordung einzelner Polymere zum Linker oder zum Marker einen beschreibenden Charakter hat.The for the Labeling of Nukeotiden Makromolekulare inventively used Close connections in some embodiments water-soluble Polymers (see above). The linkers of the nucmacromolecules also close water-soluble Polymers (see above). It is for the skilled artisan recognizable that the assignment of individual polymers to Left or to the marker has a descriptive character.

1.3.3.3.4 Das Verhältnis der Nuk- Komponenten in einem Nuk-Makromolekül1.3.3.3.4 The ratio of Nuc components in a nuc macromolecule

Ein Nuk-Makromolekül kann durchschnittlich 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 1000 Nuk-Komponenten einschließen.One Nuc-macromolecule can average 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 30, 30 to 100, 100 to 1000 nuc-components.

In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk-Komponenten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, bei sättigender Konzentration von Nuk-Linker- Komponenten, eine einheitliche Population an Nuk-Makromolekülen entsteht.In an embodiment all have nuc macromolecules an equal number of nuc components per a nuc macromolecule. For example, you can maximum for one strepavidin molecule 4 biotin molecules be bound at saturating Concentration of nucl linker components, a uniform population on nuc macromolecules arises.

In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Anzahl von Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk- Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk- Komponenten pro Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar.In another embodiment have the nuc macromolecules population has a defined average number of nuclei Components per nuc-macromolecule, in the Population itself, however, finds a distribution of actual Occupation of the nuc macromolecules with Nuk components instead. The distribution information of nuc components per nuc-macromolecule in this case represent an average.

1.3.3.3.5 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül1.3.3.3.5 The ratio of Marker units in a nuc macromolecule

Die Zahl der Marker-Einheiten in einem Nuk-Makromolekül schließt folgende Bereiche ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.The Number of marker units in a nuc macromolecule includes the following Ranges: 1 and 2, 2 and 5, 5 and 20, 20 and 50, 50 and 100, 100 and 500, 500 and 1000. 1000 and 10000, 10000 and 100000.

In einer Ausführungsform der Erfindung haben Nuk-Makromoleküle eine feste Anzal von signalgebenden Einheiten pro Marker.In an embodiment According to the invention, nuc macromolecules have a fixed number of signaling Units per marker.

In einer anderen Ausführunsform kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise einen konstanten Wert für jedes einzelne Nuk-Makromolekül darstellen.In another embodiment may be the distribution of marker units in a nuc-macromolecule population do not waver and do not have to necessarily represent a constant value for each nuc-macromolecule.

In einer Ausführungsform haben alle Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl der Marker-Einheiten pro ein Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, Avidin-Biotin-Technology, Methods in Enzymology v.184, 1990..In an embodiment all have nuc macromolecules an equal number of marker units per one nuc macromolecule. For example can per one strepavidin molecule a maximum of 4 biotin molecules be bound, avidin biotin technology, Methods in Enzymology v.184, 1990.

In einer anderen Ausführungsform haben die Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt. Bei sättigenden Konzentrationen bei der Synthese von Marker-Komponenten findet eine zunehmend einheitlichere Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt.In another embodiment have the nuc macromolecules a population a defined average number of marker units per nuc-macromolecule, in the population itself, however, finds a distribution of the actual Occupation of the nuc macromolecules held with marker units. At saturating concentrations The synthesis of marker components is becoming increasingly uniform Occupation of the nuc macromolecules held with marker units.

So spielt beispielsweise in Bereichen, wo es um den qualitativen Nachweis geht, die exakte Zahl der Marker-Einheiten pro Nuk-Makromolekül eine untergeordnete Rolle. In solchen Fällen ist das Vorhandensein eines stabilen Signals an sich von Bedeutung.For example, in areas where qualitative evidence is concerned, the exact number of marker units per nuc-macromolecule plays a subordinate role. In such cases, the presence is a stable signal in itself of importance.

Es sollte einem Fachmann naheliegend erscheinen, dass die angeführten Marker-Komponenten eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst. Weiterhin sollten andere Beispiele für makromolekulare Marker-Komponenten einem Fachmann naheliegend erscheinen.It It should be obvious to a person skilled in the art that the listed marker components are a considerable larger molecule size and mass have, as the respective nuk component itself. Furthermore, should other examples of macromolecular marker components to a person skilled in the obvious.

1.3.3.3.6 Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle1.3.3.3.6 Substrate properties the nuc macromolecules

Die Nuk-Komponente gebunden an ein Nuk-Makromolekül kann als Substrat für unterschiedliche Enzyme dienen. Beispielsweise dient die Nuk-Komponente, in dieser Ausführungsform als Nukleosid-Triphosphat, als Substrat für eine Polymerase, so dass die Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang durch eine Polymerase eingebaut werden kann und somit das gesamte Nuk-Makromolekül an den Strang kovalent gekoppelt wird.The Nuk component bound to a nuc macromolecule may serve as a substrate for different Serve enzymes. For example, the nuk component is used in this embodiment as a nucleoside triphosphate, as a substrate for a polymerase, so that the nuc-component in a growing strand by a polymerase can be incorporated and thus the entire nuc-macromolecule to the Strand is covalently coupled.

Weitere Beispiele für Enzyme stellen Kinasen, Phosphorylasen, Transferasen dar.Further examples for Enzymes are kinases, phosphorylases, transferases.

Als Monomer-Teil einer Nukleinsäurekette können Nuk-Makromoleküle ebenfalls als Substrate für Enzyme auftreten, beispielsweise für die 3'- oder 5'-Exonukleasen oder Endonukleasen ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), oder für die entsprechenden Teilaktivitäten von Polymerasen, wie beispielsweise in für real-time-PCR beschrieben (S. Meuer "Rapid cycle real time PCR", Springer 2004, ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner "PCR-Technology: current innovations" CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5).When Monomer part of a nucleic acid chain can Nuc-macromolecules also as substrates for Enzymes occur, for example for the 3 'or 5' exonucleases or endonucleases ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), or for the corresponding sub-activities of Polymerases, as described for example in real-time PCR (S. Meuer "Rapid cycle real time PCR ", Springer 2004, ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner "PCR Technology: current innovations "CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5).

Die Substrateigenschaften der Nuk-Komponente(n) bestimmt/bestimmen die Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle. So kann die Nuk-Komponente als ein Terminator dienen, so dass nur ein einziges Nuk-Makromolekül eingebaut werden kann. In einer anderen Ausführungsform dient die Nuk-Komponente als ein reversibler Terminator, der die Durchführung einer schrittweise kontrollierten Verlängerungsreaktion erlaubt, wie z.B. in Ju et al. US Pat. 6664079, Tcherkassov WO 02088382 dargestellt ist.The Substrate properties of the nuc-component (s) determine / determine the Substrate properties of the nuc macromolecules. So can the nuk component serve as a terminator, so that only a single nuc-macromolecule is incorporated can be. In another embodiment, the nuc-component is used as a reversible terminator, which controlled the implementation of a gradual extension reaction allowed, such as in Ju et al. US Pat. No. 6664079, Tcherkassov WO 02088382 is shown.

Als Monomer-Teil einer Nukleinsäurekette können sie alleine für die enzymatischen Eigenschaften bestimmtend sein, wie z.B. für Exonuklease-Aktivität. In einer anderen Ausführungsform bestimmen die enzymatischen Eigenschaften nicht nur die Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle, sondern auch die benachbarten Nukleotide, wie im Falle der Endonukleasen.When Monomer part of a nucleic acid chain can she alone for the enzymatic properties are determined, e.g. for exonuclease activity. In a another embodiment determine the enzymatic properties not only the nuc-components of the nuc-macromolecules, but also the adjacent nucleotides, as in the case of endonucleases.

1.3.3.3.7 Funktion der Marker1.3.3.3.7 Function of the marker

Die makromolekulare Marker-Komponente kann in einer Ausführungsform eine signalgebende Funktion haben. In einer anderen Ausführungsform hat sie eine signalvermittelnde Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine katalytische Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine affine Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat der Marker mehr als nur eine Funktion, sondern z.B. vereinigt sowohl signalgebende als auch eine signalvermitteldne Funktion. Weitere Kombinationen sind nahe liegend.The Macromolecular marker component may be in one embodiment have a signaling function. In another embodiment does it have a signal-switching function? In a further embodiment does it have a catalytic function. In a further embodiment does she have an affine function? In a further embodiment the marker has more than one function, but e.g. united both signaling and a Signalvermitteldne function. Other combinations are obvious.

Bei der signalgebenden Funktion enthält die Marker-Komponente Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an Nuk-Makromoleküle gebunden werden, s. Beispiel 33.at contains the signaling function the marker component constituents already during the chemical synthesis to nuc-macromolecules are bound, s. example 33rd

Bei der signalvermittelnden Funktion trägt die Marker-Komponente Bestandteile, die erst durch eine Reaktion mit signalgebenden Molekülen ihre Signaleigenschaften entfalten, s. Beispiel 32.at the signal-transmitting function carries the marker component components, the first through a reaction with signaling molecules their Develop signal properties, s. Example 32.

Beispielsweise können mehrere Biotin-Moleküle, z.B. 100 Biotin-Moleküle, den Marker-Teil bilden. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle erfolgt eine Nachweisreaktion mit modifizierten Streptavidin-Molekülen. In einem anderen Beispiel haben die Nukleinsäureketten die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau von Nuk-Makromoleküle, erfolgt eine Hybridisierung von einheitlichen Oligonukleotiden mit detektierbaren Einheiten, z.B. Fluoreszenzfarbstoffen (MWG-Biotech) an die Marker-Komponente. In einem weiteren Beispiel haben Amino- oder Merkapto-Gruppen, beispielsweise 50 Aminogruppen pro Marker, die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau der Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette erfolgt eine chemische Modifikation mit reaktiven Komponenten, z.B. mit Farbstoffen, wie beispielsweise für eingebaute Allyl-Amino-dUTP beschrieben, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, Nr. 16 e79.For example can several biotin molecules, e.g. 100 biotin molecules, the marker part form. After incorporation of the nuc-macromolecules, a detection reaction is carried out with modified streptavidin molecules. In another example, the nucleic acid chains have the signal-transmitting Function. After incorporation of nuc-macromolecules, hybridization occurs of uniform oligonucleotides with detectable units, e.g. Fluorescent dyes (MWG Biotech) to the marker component. In one further examples have amino or mercapto groups, for example 50 amino groups per marker, the signal-transmitting function. To the incorporation of the nuc macromolecules into the nucleic acid chain a chemical modification with reactive components, e.g. with dyes, such as for incorporated allyl-amino-dUTP described, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, No. 16 e79.

In einer anderen Ausführungsform hat die makromolekulare Marker-Komponente eine katalytische Funktion (in Form eines Enzyms oder Ribozyms). Dabei können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Dank der Kopplung an die Nuk-Komponente kann das jeweilige Enzym durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen an den Nukleinsäurestrang kovalent gebunden werden.In another embodiment, the macromolecular marker component has a catalytic Function (in the form of an enzyme or ribozyme). Different enzymes can be used, eg peroxidase or alkaline phosphatase. Thanks to the coupling to the nuc-component, the respective enzyme can be covalently bound to the nucleic acid strand by the incorporation of nuc-macromolecules.

In einer weiteren Ausführungsform hat die makromolekularer Marker-Komponente eine Affinitätsfunktionalität zu einem anderen Molekül. Beispiele für solche Marker bilden Streptavidin-Moleküle, Antikörper oder Nukleinsäureketten, Beispiel 30 oder 32.

  • 1.3.4. Niedermolekularer Marker – zum Stand der Technik gehörende Markierung von Nukleotiden beispielsweise mit ein oder zwei Biotin-Molekülen, ein oder zwei Farbstoff-Molekülen, ein oder zwei Hapten-Moleküln (z.B. Digoxigenin).
  • 1.3.5. Konventionell modifiziertes Nukleotid – ein Nukleotid mit einem Linker (durchschnittliche Länge zwischen 5 und 30 Atomen) und einem Marker. Üblicherweise trägt ein konventionell modifiziertes Nukleotid einen niedermolekularen Marker, z.B. ein Farbstoff- oder ein Biotinmolekül.
In another embodiment, the macromolecular marker component has an affinity functionality to another molecule. Examples of such markers are streptavidin molecules, antibodies or nucleic acid chains, example 30 or 32.
  • 1.3.4. Low Molecular Markers - prior art labeling of nucleotides, for example, with one or two biotin molecules, one or two dye molecules, one or two hapten molecules (eg, digoxigenin).
  • 1.3.5. Conventionally modified nucleotide - a nucleotide with a linker (average length between 5 and 30 atoms) and a marker. Usually, a conventionally modified nucleotide carries a low molecular weight marker, for example a dye or a biotin molecule.

1.3.6. Enzyme (Polymerasen)1.3.6. Enzymes (polymerases)

In einer Ausführungsform können die Nuk-Makromoleküle als Substrate für Enzyme eingesetzt werden. Polymerasen stellen in Anwendungen oft eingesetzte Enzyme, die Nukleotide als Substrate verwerden. Sie werden im weiteren beispielhaft und stellvertretend für andere Nukleotid-umsetzende Enzyme betrachtet. Eine der zentralen Fähigkeit der Polymerasen besteht in kovalenten Kopplung von Nukleotid-Monomeren zu einem Polymer. Dabei kann die Synthese sowohl matrizen-abhängig (wie z.B. DNA-oder RNA-Synthese mit DNA- oder RNA-abhängigen Polymerasen) als auch matrizenunabhängig, z.B. durch Terminale Transferasen ("J Sambrook "Molecular Cloning" 3. Ed. CSHL Press 2001).In an embodiment can the nuc macromolecules as substrates for Enzymes are used. Polymerases are often used in applications used enzymes that use nucleotides as substrates. she will be further exemplified and representative of others Considering nucleotide-converting enzymes. One of the central ability The polymerases consist of covalent coupling of nucleotide monomers to a polymer. The synthesis can be both template-dependent (as e.g. DNA or RNA synthesis with DNA- or RNA-dependent polymerases) as well matrizenunabhängig, e.g. by terminal transferases ("J Sambrook" Molecular Cloning 3rd Ed. CSHL Press 2001).

Falls RNA als Substrat (z.B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z.B. AMV-Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), z.B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.If RNA is used as a substrate (e.g., mRNA) in the sequencing reaction will, can commercial RNA-dependent DNA polymerases are used, e.g. AMV reverse transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse transcriptase (Sigma), HIV reverse transcriptase without RNAse activity. For certain Applications, can Reverse transcriptases of RNAse activity to be largely free ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory), e.g. mRNA mRNA for hybridization experiments.

Falls DNA als Substrat (z.B. cDNA) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen mit oder ohne 3'-5' Exonuklease-Aktivität (DNA-Replication" 1992 Ed. A.Kornberg, Freeman and company NY), z.B. modifizierte T7-Polymerase vom Typ "Sequenase Version 2" (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I mit oder ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (Amersham Pharmacia Biotech), Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase (GibcoBRL), proHA-DNA-Polymerase (Eurogentec), Vent, Vent exo minus, Pfu, Thermosequenase, Pwo-Polymerase usw. (Promega).If DNA as a substrate (e.g., cDNA) are useful as polymerases in principle all DNA-dependent DNA polymerases with or without 3'-5 'exonuclease activity (DNA replication "1992 Ed A.Kornberg, Freeman and company NY), e.g. modified T7 polymerase type "Sequenase Version 2 "(Amersham Pharmacia Biotech), Klenow fragment of DNA polymerase I with or without 3'-5 'exonuclease activity (Amersham Pharmacia Biotech), polymerase beta of various origins (Animal Cell DNA Polymerases "1983, Fry M., CRC Press Inc., commercially available from Chimerx) thermostable Polymerases such as Taq polymerase (GibcoBRL), proHA DNA polymerase (Eurogentec), Vent, Vent exo minus, Pfu, Thermosequenase, Pwo polymerase etc. (Promega).

Auch DNA-abhängige RNA-Polymerasen können verwendet werden, z.B. E.coli RNA-Polymerase, T7-RNA-Polymerase, SP6 RNA Polymerase.Also DNA-dependent RNA polymerases can can be used, e.g. E. coli RNA polymerase, T7 RNA polymerase, SP6 RNA Polymerase.

Die Polymerasen können eine 3'- oder eine 5'-Exonuklease-Aktivität aufweisen und in bestimmten Anwendungen eingesetzt werden (z.B. bei real-time PCR).The Polymerases can a 3'- or a 5'-exonuclease activity and used in certain applications (e.g., real-time PCR).

In der Anmeldung werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen als Beispiele für Polymerasen betrachtet.

  • 1.3.7. Spaltbare Verbindung – Eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung. Diese Verbindung kann einen Abschnitt im Linker darstellen und kann an einer oder an mehreren Stellen spaltbar sein. Es kann sich um eine chemisch spaltbare Verbindung, wie z.B. eine Disulfid-, eine Ester-, eine Acetal-, eine Thioesterverbindung (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382) handeln. Es kann auch eine photochemisch spaltbare Verbindung, wie in (Rothschild WO 9531429) dargestellt sein. Es kann auch eine enzymatisch spaltbare Verbindung (beispielsweise eine Peptid- oder Polypeptide-Bindung, Odedra WO 0192284), spaltbar durch Peptidasen, eine Poly- oder Oligosaccharid-Bindung, spaltbar durch Disaccharidasen) sein, wobei die Spaltung durch ein spezifisches Enzym zwischen bestimmten Monomeren der spaltbaren Stellen stattfinden kann.
In the application, DNA-dependent DNA polymerases are considered as examples of polymerases.
  • 1.3.7. Cleavable Compound - A compound cleavable under mild conditions. This connection may be a section in the linker and may be cleavable at one or more locations. It may be a chemically cleavable compound, such as a disulfide, an ester, an acetal, a thioester (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382). It may also be a photochemically cleavable compound as shown in (Rothschild WO 9531429). It may also be an enzymatically cleavable compound (for example, a peptide or polypeptide linkage, Odedra WO 0192284), cleavable by peptidases, a poly- or oligosaccharide linkage, cleavable by disaccharidases), the cleavage by a specific enzyme between certain monomers the fissile sites can take place.

Mehrere Beispiele für spaltbare Verbindungen sind bekannt. Die Kopplung einer solchen Verbindung ist beispielsweise beschrieben in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al. Nucleic Acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642.). Eine Spaltbare Verbindung kann ein Teil des Linkers sein oder die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bilden, oder die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Makker-Komponente, oder die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern-Komponente.

  • 1.3.8 DNA – Deoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (z.B. Oligonukleotide, Polynukleotide, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
  • 1.3.9 RNA – Ribonukleinsäure
  • 1.3.10 dNTP – 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen, z.B. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.
  • 1.3.11 NTP – Ribonukleosid-Triphosphate, Substrate für RNA-Polymerasen, UTP, CTP, ATP, GTP.
  • 1.3.12 Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z.B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate. Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide.
  • 1.3.13 NSK – Nukleinsäurekette. DNA oder RNA
  • 1.3.14 Gesamtsequenz – Summe aller Sequenzen im Ansatz, sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder Äquivalente einer anderen Sequenz oder von Sequenz-Populationen darstellen (z.B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit Insert, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen.
  • 1.3.15 NSKF – Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs – Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein Äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.
  • 1.3.16 Primerbindungstelle (PBS) – Teil der Sequenz in der NSK oder NSKF, an den der Primer bindet.
  • 1.3.17 Referenzsequenz – eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen (z.B. Gesamtsequenz) ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z.B. aus der NCBI-Datenbank.
  • 1.3.18 Tm – Schmelztemperatur
  • 1.3.19 Sterisches Hindernis, sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand Sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand, die durch ihre chemische Struktur die Eigenschaften der mit dieser Gruppe gekoppelten Nukleotide so verändert, dass diese durch eine Polymerase in einer Extensionsreaktion nicht nacheinander eingebaut werden können. Eine oder mehrere an die Base gekoppelte sterisch anspruchsvolle Gruppen können zur Aufhenung der Synthese oder zu Behinderung der weiteren Synthese führen. Viele in der modernen Forschung eingesetzten Marker stellen ein sterisches Hindernis dar für die Enzyme dar. Biotin, Digoxigenin und Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoreszein, Tetramethylrhodamine, Cy3-Farbstoff stellen Beispiele einer solchen sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al. NAR 1994, v.22, S.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, S.4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v.234, S.166, Heer et al. BioTechniques 1994 v.16 S.54). Weitere sterisch anspruchsvollen Gruppen können beispielsweise lineare oder verzweigte Polymere mit einer kompakten drei-dimensionalen Struktur, wie z.B. Proteine oder Dendrimere darstellen.
  • 1.3.20 PNA – Peptide Nucleic Acid
Several examples of scissile compounds are known. The coupling of such a compound is described, for example, in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al Nucleic Acid Research 1994, V.22, page 4259, Canard et al., Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642.). A cleavable compound may be part of the linker or may form the linker site of the linker to the nucleotide, or the linkage between the linker moiety and the macer moiety, or the linkage between the label moieties and the core moiety.
  • 1.3.8 DNA - Deoxyribonucleic acid of different origin and length (eg oligonucleotides, polynucleotides, plasmids, genomic DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)
  • 1.3.9 RNA Ribonucleic Acid
  • 1.3.10 dNTP - 2'-deoxynucleoside triphosphates, substrates for DNA polymerases and reverse transcriptases, eg dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.
  • 1.3.11 NTP - ribonucleoside triphosphates, substrates for RNA polymerases, UTP, CTP, ATP, GTP.
  • 1.3.12 Abbreviation "NT" is also used for the length specification of a nucleic acid sequence, eg 1,000 NT. In this case, "NT" stands for nucleoside monophosphates. In the text, the majority of abbreviations are formed by using the suffix "s", "NT" stands for "nucleotide", for example, "NTs" stands for several nucleotides.
  • 1.3.13 NSK - Nucleic Acid Chain. DNA or RNA
  • 1.3.14 Total Sequence - Sum of all sequences in the beginning; it may originally consist of one or more NSKs. In this case, the entire sequence can represent parts or equivalents of another sequence or of sequence populations (eg mRNA, cDNA, plasmid DNA with insert, BAC, YAC) and originate from one or different species.
  • 1.3.15 NSKF nucleic acid chain fragment (DNA or RNA) corresponding to part of the total sequence, NSKFs - nucleic acid chain fragments. The sum of the NSKFs is equivalent to the total sequence. For example, the NSKFs may be fragments of total DNA or RNA sequence resulting from a fragmentation step.
  • 1.3.16 Primer binding site (PBS) - part of the sequence in the NSK or NSKF to which the primer binds.
  • 1.3.17 Reference sequence - an already known sequence for which the deviations in the sequence to be examined or in the sequences to be examined (eg total sequence) are determined. As reference sequences can be used in databases accessible sequences, such as from the NCBI database.
  • 1.3.18 Tm - melting temperature
  • 1.3.19 Steric hindrance, sterically demanding group or ligand Sterically demanding group or ligand which, by virtue of their chemical structure, alters the properties of the nucleotides coupled with this group in such a way that they can not be consecutively incorporated by a polymerase in an extension reaction. One or more sterically demanding groups coupled to the base can lead to the synthesis being halted or hindrance to further synthesis. Many markers used in modern research represent a steric hindrance to the enzymes. Biotin, digoxigenin and fluorescent dyes such as fluorescein, tetramethylrhodamine, Cy3 dye are examples of such a sterically demanding group (Zhu et al., Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al NAR 1994, v.22, p.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, p.4513, Wiemann et al., Analytical Biochemistry 1996, v.234, p.166 Heer et al., BioTechniques 1994 v.16 p.54). Other sterically demanding groups can be, for example, linear or branched polymers with a compact three-dimensional structure, such as proteins or dendrimers.
  • 1.3.20 PNA Peptides Nucleic Acid

2. Detaillierte Beschreibung:2. Detailed description:

Die Erfindung beschreibt eine neue Klasse an modifizierten Nukleotiden.

  • 1. Aspekt der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen mit der Struktur: (Nuk-Linker)n-Marker wobei:
Nuk
– ein Nukleotid oder ein Nukleosid ist (Nuk-Komponente)
Linker
– eine Linker-Komponente, die eine Nuk-Komponente und eine makromolekulare Marker-Komponente vebindet
Marker
– eine makromolekulare Marker-Komponente ist
n
– eine Zahl von 1 bis 1000 ist
The invention describes a new class of modified nucleotides.
  • 1. Aspect of the invention relates to macromolecular compounds having the structure: (Nuk-linker) n -marker wherein:
Nuk
Is a nucleotide or a nucleoside (nuc-component)
left
A linker component that binds a nuc-component and a macromolecular marker component
marker
- is a macromolecular marker component
n
- is a number from 1 to 1000

Ein weiterer Aspekt 2 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (3A):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist
R1 – ist H
R2 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO3, SH, N3, NH2, O-R3-1, P(O)m-R3-1 (m ist 1 oder 2 ist), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH2-O-Y, -CH2-S-Y, -CH2-N3, -CO-O-Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH2-CH=CH2, wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise (CH2)-CH3 wobei n zwischen 0 und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy-Gruppen).
R4 – ist H oder OH
R5 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.Another aspect 2 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 1, wherein the nuc-component includes the following structures ( 3A ):
In which:
Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications, where L is the link between the Nuk component and the linker component represents (coupling unit L) and X is the coupling point of the coupling unit L at the base
R 1 - is H
R 2 - is independently selected from the group H, OH, halogen, NH 2 , SH or protected OH group
R 3 - is independently selected from the group H, OH, halogen, PO 3 , SH, N 3 , NH 2 , OR 3-1 , P (O) m -R 3-1 (m is 1 or 2), NH-R 3-1 , SR 3-1 , Si-R 3-1 wherein R 3-1 is a chemically, photochemically or enzymatically cleavable group, or includes one of the following modifications: -CO-Y, -CH 2 -OY , -CH 2 -SY, -CH 2 -N 3 , -CO-OY, -CO-SY, -CO-NH-Y, -CH 2 -CH = CH 2 , wherein Y is an alkyl, for example (CH 2 ) -CH 3 where n is between 0 and 4, or is a substituted alkyl, for example with halogen, hydroxy, amino, carboxy groups).
R 4 - is H or OH
R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, a monophosphate group, or a diphosphate group, or a triphosphate group, or an alpha thiotriphosphate group.

Ein weiterer Aspekt 3 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (3B):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 – ist H
R2 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O-R3-2-L, P(O)m-R3-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R3-2-L, S-R3-2-L, Si-R3-2-L oder, wobei R3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L – die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.
R4 – ist H oder OH
R5 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.Another aspect 3 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 1, wherein the nuc-component includes the following structures ( 3B ):
In which:
Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions
R 1 - is H
R 2 - is independently selected from the group H, OH, Hal, NH 2 , SH or protected OH group
R 3 - is independently selected from the group OR 3-2 -L, P (O) m -R 3-2 -L, where m is 1 or 2, NH-R 3-2 -L, SR 3-2 - L, Si-R 3-2 -L or, wherein R 3-2 is the coupling site of the linker to the nucleotide and L - is the coupling unit of the linker (L).
R 4 - is H or OH
R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, a monophosphate group, or a diphosphate group, or a triphosphate group, or an alpha thiotriphosphate group.

Ein weiterer Aspekt 4 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (3B):
Wobei:
Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen
R1 – ist H
R2 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe
R3 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, PO3, SH, NH2, O-R3-1, P(O)m- R3-1, NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.
R4 – ist H oder OH
R5 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O-R5-1-L, oder P-(O)3-R5-1-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)3-P-(O)3-R5-1-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe)
oder P-(O)3-P-(O)3-P-(O)3- R5-1-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R5-1 die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente ist.Another aspect 4 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 1, wherein the nuc-component includes the following structures ( 3B ):
In which:
Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions
R 1 - is H
R 2 - is independently selected from the group H, OH, Hal, NH 2 , SH or protected OH group
R 3 - is independently selected from the group H, OH, Hal, PO 3 , SH, NH 2 , OR 3-1 , P (O) m -R 3-1 , NH-R 3-1 , SR 3-1 , Si-R 3-1 wherein R 3-1 is a chemically, photochemically or enzymatically cleavable group and m is 1 or 2.
R 4 - is H or OH
R 5 - is independently selected from the group OR 5-1 -L, or P- (O) 3 -R 5-1 -L (modified monophosphate group), or P- (O) 3 -P- (O) 3 -R 5-1 -L (modified diphosphate group)
or P- (O) 3 -P- (O) 3- P- (O) 3 -R 5-1- L (modified triphosphate group), wherein R 5-1 is the coupling site of the coupling moiety L to the nucleotide, and Coupling unit L is the connection between the nuc-component and the linker component.

Ein weiterer Aspekt 5 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 4, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:
R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7, R6-(CH2)-Rn, R6-A-(CH2)-R7, R6-(CH2)n-B-R7, R6-(CH=CH-)n-R7, R6-(A-CH=CH-)n-R7, R6-(CH=CH-B-)n-R7, R6-(CH=CH-CH2-B-)n-R7, R6-A-CH=CH-(CH2-)n-R7, R6-(-CH=CH-CH2)-B-R7, R6-(C≡C-)n-R7, R6-(A-C≡C-)n-R7, R6-(A-C≡C-CH2)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-(C≡C-CH2-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)-B-R7, R6-(-C≡C-CH2-CH2)n-B-R7
wobei R6 – die Nuk-Komponente ist, R7 – der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 istAnother aspect 5 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 4, wherein coupling unit L includes the following structural elements:
R 6 -NH-R 7 , R 6 -OR 7 , R 6 -SR 7 , R 6 -SS-R 7 , R 6 -CO-NH-R 7 , R 6 -NH-CO-R 7 , R 6 -CO-OR 7 , R 6 -O-CO-R 7 , R 6 -CO-SR 7 , R 6 -S-CO-R 7 , R 6 -P (O) 2 -R 7 , R 6 -Si -R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -R 7 , R 6 - (CH 2 ) -R n , R 6 -A- (CH 2 ) -R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (CH = CH-) n -R 7 , R 6 - (A-CH = CH-) n -R 7 , R 6 - (CH = CH-B-) n -R 7 , R 6 - (CH = CH-CH 2 -B-) n -R 7 , R 6 -A-CH = CH- (CH 2 -) n -R 7 , R 6 - (- CH = CH-CH 2 ) -BR 7 , R 6 - (C≡C-) n -R 7 , R 6 - (AC≡C-) n -R 7 , R 6 - (AC≡C-CH 2 ) n -R 7 , R 6 - ( C≡CB-) n -R 7 , R 6 - (C≡C-CH 2 -B-) n -R 7 , R 6 -AC≡C- (CH 2 -) n -R 7 , R 6 - ( -C≡C-CH 2 ) -BR 7 , R 6 - (- C≡C-CH 2 -CH 2 ) n -BR 7
wherein R 6 - is the nuc-component, R 7 - is the linker radical and A and B independently include the following structural elements: -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH -CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P (O) 2 -, -Si-, - (CH 2 ) n -, a photolabile Group, where n - is 1 to 5

Ein weiterer Aspekt 6 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 5, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.One Further aspect 6 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 5, wherein the linker component is a water-soluble Polymer includes.

Ein weiterer Aspekt 7 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 6, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:
Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).Another aspect 7 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 6, wherein the Linker component includes water-soluble polymers independently selected from the following group:
Polyethylene glycol (PEG), polysaccharides, dextran, polyamides, polypeptides, polyphosphates, polyacetates, poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (vinyl pyrrolidones), poly (hydroxyalkyl methacrylamides), poly (hydroxyalkyl methacrylates) , Poly (x-hydroxy acids), polyacrylic acid, polyacrylamide, poly (vinyl alcohol).

Ein weiterer Aspekt 8 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 7, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atomen hat.One Further aspect 8 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 7, wherein the linker component is an average Length between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10000, 10000 to 100,000, 100,000 to 500,000 atoms.

Ein weiterer Aspekt 9 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 8, wobei eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hatOne Further aspect 9 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 8, wherein a marker component is a signaling, has signal-transmitting, catalytic or affine function

Ein weiterer Aspekt 10 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus einer strukturellen Marker-Einheit bestehtOne Another aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, wherein a marker component of a structural Marker unit exists

Ein weiterer Aspekt 11 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus mehreren strukturellen Marker-Einheiten gebunden an eine Kern-Komponente bestehtOne Further aspect 11 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, wherein a marker component of several structural marker units bound to a core component consists

Ein weiterer Aspekt 12 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 10 oder 11, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden strukturellen Elemente einschließt: Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff.One Further aspect 12 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 10 or 11, wherein a structural marker unit independently includes one of the following structural elements: biotin, Hapten, radioactive isotope, rare earth element, dye, fluorescent dye.

Ein weiterer Aspekt 13 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 10 oder 11 , wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen, Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren Modifikationen.One Further aspect 13 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 10 or 11, wherein a structural marker unit independently one of the following elements: nanocrystals or their Modifications, proteins or their modifications, nucleic acid chains or their modifications, particles or their modifications.

Ein weiterer Aspekt 14 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:
Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen,
Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen,
Avidin oder seine Konjugate oder ModifikationenAnother aspect of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 13, wherein a structural marker unit includes one of the following proteins:
Enzymes or their conjugates or modifications,
Antibodies or their conjugates or modifications,
Streptavidin or its conjugates or modifications,
Avidin or its conjugates or modifications

Ein weiterer Aspekt 15 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eine der folgenden Arten Nukleinsäureketten einschließt: DNA, RNA, PNA, wobei die Länge von Nukleinsäureketten zwischen 10 und 10.000 Nukleotiden oder deren Äquivalente liegt.One Further aspect 15 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspect 13, wherein a structural marker unit is one of following types of nucleic acid chains includes: DNA, RNA, PNA, where the length of nucleic acid chains between 10 and 10,000 nucleotides or their equivalents.

Ein weiterer Aspekt 16 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 11 bis 15, wobei die Kern-Komponente der Marker-Komponente unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: wasserlöslichen Polymer unabhängig ausgewählt aus der Gruppe von: Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure und deren Derivate, Poly-Acrylamide und deren Derivate, Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Polysaccharide, Dextran und seine Derivate, Nukleinsäureketten und deren Derivate, Streptavidin oder Avidin und deren Derivate, Dendrimere, wobei einzelne Polymere linear oder verzweigt oder unter einander vernetzt sein können Ein weiterer Aspekt 17 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, 11 bis 16, wobei die Verbindung zwischen mehreren strukturellen Marker-Einheiten und der Kern-Komponte kovalent oder affine erfolgt.One Further aspect 16 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 11 to 15, wherein the core component of the marker component independently includes one of the following elements: water-soluble polymer independently selected from the group of: polyamides (e.g., polypeptides), polyacrylic acid and their derivatives, polyacrylamides and their derivatives, polyvinyl alcohols and their derivatives, polysaccharides, dextran and its derivatives, nucleic acid chains and their derivatives, streptavidin or avidin and their derivatives, Dendrimers, wherein individual polymers linear or branched or under can be networked Another aspect 17 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, 11 to 16, wherein the connection between covalently multiple structural marker units and the core component or affine occurs.

Ein weiterer Aspekt 18 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 10, wobei die Verbindung zwischen einer strukturellen Marker-Einheit und dem Linker kovalent oder affine erfolgt.One Further aspect 18 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 10, wherein the connection between a structural Marker unit and the linker is covalent or affine.

Ein weiterer Aspekt 19 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 9, 11 bis 17, wobei die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und dem Linker kovalent oder affine erfolgt One Further aspect 19 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 9, 11 to 17, wherein the connection between the core component and the linker is covalent or affine

Ein weiterer Aspekt 20 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt.Another aspect of the invention pertains to macromolecular compounds of aspects 1-19 wherein only one Nuk component having a coupled linker moiety is attached to the label component, the linker length being between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20 , 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms.

Ein weiterer Aspekt 21 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 20, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und die Linker-Komponente eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.One Further aspect 21 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 20, wherein only one nuc-component with a coupled linker component bound to the marker component is, where the linker length between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 up to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms and the linker component one or more compounds which can be cleaved under mild conditions includes.

Ein weiterer Aspekt 22 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 21, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang eingebaut werden kann.One Further aspect 22 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 21, wherein only one nuc-component with a coupled linker component bound to the marker component is, where the linker length between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 up to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms and one or more parts of the nuc macromolecule so modified are that just a nuk component built into a growing strand can be.

Ein weiterer Aspekt 23 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen eigenen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt sind, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt.One Further aspect 23 of the invention relates to macromolecular compounds according to aspects 1 to 19, wherein several Nuk components each have a own linker are coupled to a marker components, wherein the length the respective linker component between 2 and 5, 5 and 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 Atoms is.

Ein weiterer Aspekt 24 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, 23, wobei mehrere Nuk- Komponenten jeweils über einen eigenen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und der jeweilige Linker eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.One Further aspect 24 of the invention relates to macromolecular compounds Aspects 1 to 19, 23, wherein several Nuk components each have a own linker coupled to a marker components, wherein the Length of respective linker component between 2 and 5, 5 and 10, 10 bis 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms is and the respective linker one or more under mild conditions includes fissile compounds.

Ein weiterer Aspekt 25 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekten 1 bis 19, 23, 24, wobei mehrere Nuk- Komponenten jeweils über einen eigenen Linker an einer Marker- Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 und 5, 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Atome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in eine wachsende Nukleinsäurekette eingebaut werden kann.One Further aspect 25 of the invention relates to macromolecular compounds Aspects 1 to 19, 23, 24, wherein several Nuk components each have a own linker coupled to a marker components, wherein the Length of respective linker component between 2 and 5, 5 and 10, 10 bis 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 atoms is and one or more parts of the nuc macromolecule are so modified that only a nuc-component can be incorporated into a growing nucleic acid chain.

Ein weiterer Aspekt 26 der Erfindung betrifft Oligonucleotide oder Polynucleotide die mindestens ein Nuk-Makromolekül nach Aspekten 1 bis 25 pro eine Nukleinsäurekette einschließen.One Further aspect 26 of the invention relates to oligonucleotides or polynucleotides the at least one nuc-macromolecule according to aspects 1 to 25 per a nucleic acid chain lock in.

Ein weiterer Aspekt 27 der Erfindung betrifft Oligonucleotide oder Polynucleotide nach Aspekt 26, wobei Oligo- oder Polynucleotide RNA, DNA oder PNA sind, deren Länge zwischen 5 und 50.000 Nukleotide beträgt.One Further aspect 27 of the invention relates to oligonucleotides or polynucleotides according to aspect 26, wherein oligo- or polynucleotides are RNA, DNA or PNA are whose length between 5 and 50,000 nucleotides.

Ein weiterer Aspekt 28 der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäureketten, wobei für die Kopplung Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 verwendet werdenOne Further aspect 28 of the invention relates to a method for modification of nucleic acid chains, wherein for the Coupling nuc-macromolecules according to aspects 1 to 25 are used

Ein weiterer Aspekt 29 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:

  • – mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Aspekten 1 bis 25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt
  • – mindestens eine Population der Nukleinsäureketten,
  • – mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoleküle an die Nukleinsäureketten,
Another aspect 29 of the invention relates to a method according to aspect 28, wherein the modification is by an enzymatic coupling and the reaction mixture includes the following components:
  • At least one kind of the nuc-macromolecules or their intermediates according to aspects 1 to 25, wherein each kind of the nuc-macromolecules has a characteristic marking for them
  • At least one population of the nucleic acid chains,
  • At least one type of enzyme for coupling nuc macromolecules to the nucleic acid chains,

Ein weiterer Aspekt 30 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt:

  • – mindestans eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Aspekten 1-25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt
  • – mindestens eine Population der Nukleinsäureketten,
  • – mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoelküle an die Nukleeinsäureketten
  • – mindestens eine weitere Art von Nukleosidtriphosphaten
Another aspect of the invention relates to a method according to aspect 28, wherein the modification is by an enzymatic coupling and the reaction mixture includes the following components:
  • At least one type of nuc-macromolecule or its intermediates according to aspects 1-25, wherein each type of nuc-macromolecule possesses a characteristic marking for them
  • At least one population of the nucleic acid chains,
  • - At least one type of enzyme for the coupling of nuc-macromolecules to the nucleic acid chains
  • - At least one other type of nucleoside triphosphates

Ein weiterer Aspekt 31 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 29, 30, wobei die Enzymart unabhängig eine der folgenden Gruppen einschließt: DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Terminale Transferase, Ein weiterer Aspekt 32 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 30, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: Ribo-Nukleosidtriphosphaten (ATP, GTP, UTP, CTP), von 2'-Deoxyribonukleosid-Triphosphaten (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), von 2',3'-Dideoxynukleosidtriphosphaten (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).One Further aspect 31 of the invention relates to a method according to aspects 29, 30, the type of enzyme being independent includes one of the following groups: DNA polymerase, RNA polymerase, Terminal Transferase, Another aspect 32 of the invention is concerned a method according to aspect 30, wherein the "other species" of the nucleoside triphosphates is independently selected from the group of: ribo-nucleoside triphosphates (ATP, GTP, UTP, CTP), from 2'-deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP) of 2 ', 3'-dideoxynucleoside triphosphates (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).

Ein weiterer Aspekt 33 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 32, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten konventionell modifizierte Nukleotide mit einer Markierung sind, wobei diese Markierung unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Biotin, ein Hapten, ein radioakives Element.One Further aspect 33 of the invention relates to a method according to aspect 32, the "other Type of nucleoside triphosphates are conventionally modified nucleotides with a label, this label being independent selected is from the group of: a fluorescent dye, a biotin, a Hapten, a radioactive element.

Ein weiterer Aspekt 34 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 33, wobei mindestens zwei unterschiedliche Populationen an Nukleinsäureketten präsent sindOne Another aspect 34 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 33, with at least two different populations nucleic acid chains present are

Ein weiterer Aspekt 35 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 34, wobei mindestens eine der Populationen der Nukleinsäureketten eine Primer-Funktion hat und mindestens eine Population der Nukleinsäureketten eine Matrizen-Funktion.One Further aspect 35 of the invention relates to a method according to aspect 34, wherein at least one of the populations of nucleic acid chains a primer function and at least one population of nucleic acid chains has a template function.

Ein weiterer Aspekt 36 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 28, wobei die Modifizierung durch eine chemische Kopplung erfolgt, wobei die Kopplung der Nuk-Makromoleküle an Nukleinsäureketten durch Phosphoroamidit-Kopplung erfolgt.One Further aspect 36 of the invention relates to a method according to aspect 28, wherein the modification is effected by a chemical coupling, wherein the coupling of the nuc-macromolecules to nucleic acid chains by Phosphoroamidite coupling takes place.

Ein weiterer Aspekt 37 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die die Kopplung nur einer einzigen Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang zulassen und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker-Komponente verhindert wird.One Further aspect 37 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 36, wherein Nuk macromolecules used in the labeling process Be the coupling of only a single Nuk component in the growing nucleic acid strand allow multiple installation by modifications to the Nuk component, and / or the linker component and / or the marker component prevented becomes.

Ein weiterer Aspekt 38 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 37, wobei die weitere Kopplung reversibel verhindert wird.One Further aspect 38 of the invention relates to a method according to aspect 37, wherein the further coupling is reversibly prevented.

Ein weiterer Aspekt 39 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 37, wobei die weitere Kopplung irreversibel verhindert wird.One Further aspect 39 of the invention relates to a method according to aspect 37, wherein the further coupling is irreversibly prevented.

Ein weiterer Aspekt 40 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die eine Kopplung mehrer Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäurestrang zulassenOne Another aspect 40 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 36, wherein Nuk macromolecules used in the labeling process Becoming a coupling of several Nuk component in the growing nucleic acid strand allow

Ein weiterer Aspekt 41 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28-40, wobei die an der Reaktion teilnehmenden Nukleinsäureketten an eine feste Phase gekoppelt sind und adressierbare Positionen haben.One Another aspect 41 of the invention relates to a method according to aspects 28-40, wherein the participating in the reaction nucleic acid chains are coupled to a fixed phase and have addressable positions.

Ein weiterer Aspekt 42 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 41, wobei die Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellenOne Further aspect 42 of the invention relates to a method according to aspect 41, wherein the nucleic acid chains represent a uniform population

Ein weiterer Aspekt 43 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 41, wobei die Nukleinsäureketten zwei oder mehrere unterschiedliche Populationen darstellen und jede der Populationen eine adressierbare Position auf der festen Phase hat One Further aspect 43 of the invention relates to a method according to aspect 41, wherein the nucleic acid chains represent two or more different populations and each populations an addressable position on the solid phase Has

Ein weiterer Aspekt 44 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.One Another aspect 44 of the invention relates to a method according to aspects 41.42, where the coupling of nuc-macromolecules to a population is uniform, takes place on the solid phase of fixed nucleic acid molecules, wherein the marker component of the nuc-macromolecule after the coupling on the extended nucleic acid strand remains and is not separated.

Ein weiterer Aspekt 45 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der in den wachsenden Nukleinsäurestrang eingebauten Nuk-Komponente abgetrennt wird.One Another aspect 45 of the invention relates to a method according to aspects 41.42, where the coupling of nuc-macromolecules to a population is uniform, takes place on the solid phase of fixed nucleic acid molecules, wherein the marker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule during the Coupling or after the coupling of the growing in the nucleic acid strand built-in Nuk component is separated.

Ein weiterer Aspekt 46 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen jeweils unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.One Another aspect 46 of the invention relates to a method according to aspects 41.43, wherein the coupling of nuc macromolecules in a reaction mixture parallel to two or more different populations the solid phase of fixed nucleic acid molecules takes place, these populations each different addressable positions on the fixed Phase and the marker component of the nuc macromolecule the coupling on the extended nucleic acid strand remains and is not separated.

Ein weiterer Aspekt 47 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41,43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der Nuk-Komponente abgetrennt wird.One Another aspect 47 of the invention relates to a method according to aspects 41.43, wherein the coupling of nuc macromolecules in a reaction mixture parallel to two or more different populations the solid phase of fixed nucleic acid molecules takes place, these populations have different addressable positions at the solid phase and the marker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule during the Coupling or after the coupling of the nuc-component is separated.

Ein weiterer Aspekt 48 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen auf der festen Phase als Spots auf einer planen Oberfläche verteilt sind, wobei pro ein Spot Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.One Further aspect 48 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 47, wherein the addressable positions with nucleic acid molecules on the solid phase distributed as spots on a flat surface are, where per one spot nucleic acid molecules are uniform.

Ein weiterer Aspekt 49 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen an den Kügelchen bzw. Partikel befestigt sind, wobei pro ein Kügelchen Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.One Further aspect 49 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 47, wherein the addressable positions with nucleic acid molecules to the globule or particles are attached, wherein per a bead nucleic acid molecules uniformly are.

Ein weiterer Aspekt 50 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen in einem Multigefäßsystem, wie Mikrotiterplatte oder Nanotiterplatte oder Pikotiterplatte, verteilt sind, wobei in einem Gefäß des Multigefäßsystems die Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.One Another aspect 50 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 47, wherein the addressable positions with nucleic acid molecules in a Multi vascular system, like microtiter plate or nanotiter plate or picotiter plate, are distributed, wherein in a vessel of the multi-vascular system the nucleic acid molecules uniform are.

Ein weiterer Aspekt 51 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 35 und 37 bis 50, das folgende Schritte einschließt:

  • a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen Nukleinsäureketten
  • b) Hybridisierung von sequenzspezifischen Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen
  • c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Aspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
  • d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen
  • e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen
  • f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen
  • g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe
egebenenfalls Wiederholung der Schritte (c) bis (g),Another aspect 51 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 35 and 37 to 50, which includes the following steps:
  • a) Provision of at least one population of single-stranded nucleic acid chains
  • b) hybridization of sequence-specific primers to these nucleic acid chains, wherein NSK primer complexes capable of extension are produced
  • c) Incubation of at least one type of nuc-macromolecule according to aspects 1 to 25 together with a type of polymerase according to aspect 31 with the NSK-primer complexes provided in steps a and b under conditions which allow the incorporation of complementary nuc-macromolecules , wherein each type of nuc-macromolecule has a characteristic of their mark.
  • d) Removal of unincorporated nuc-macromolecules from the NSK primer complexes
  • e) detection of the signals of nuc-macromolecules incorporated into the NSK primer complexes
  • f) Removal of the linker moiety and the label component from the nuc-macromolecules incorporated into the NSK primer complexes
  • g) washing the NSK primer complexes
if necessary, repetition of steps (c) to (g),

Ein weiterer Aspekt 52 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28-40, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind.One Another aspect 52 of the invention relates to a method according to aspects 28-40, wherein the nucleic acid chains to a solid phase in random Arrangement are coupled.

Ein weiterer Aspekt 53 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 41, 52 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man
Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

  • a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk-Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Makromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man
  • b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man
  • c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man
  • d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man
  • e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man
  • f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den Nuk-Makromolekülen bestimmt.Another aspect 53 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 41, 52 for the parallel sequence analysis of nucleic acid sequences (nucleic acid chains, NSKs) in which
Generates fragments (NSKFs) of single-stranded NSKs of about 50 to 1000 nucleotides in length, which can be overlapping partial sequences of an overall sequence;
the NSKFs bind in a random array using a single or multiple different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface, the density of the surface-primed NSKF primer complexes providing optical detection of the signals from individual integrated nuclides. Macromolecules allows, one
Perform a cyclic assembly reaction of the complementary strand of NSKFs using one or more polymerases by
  • a) adding to the surface-bound NSKF-primer complexes a solution containing one or more polymerases and one to four nuc-macromolecules having a fluorescent dye-labeled marker component, wherein the simultaneous use of at least two nucl Macromolecules are each located on the marker component fluorescent dyes are selected so that the nuc-macromolecules used can be distinguished from one another by measuring different fluorescence signals, wherein the nuc-macromolecules are structurally modified such that the polymerase, after incorporation of such a nuc-macromolecule in a growing complementary strand, is unable to form another nuc-macromolecule incorporate the same strand, wherein the linker component with the marker component are cleavable, one
  • b) incubating the stationary phase obtained in step a) under conditions which are suitable for extending the complementary strands, wherein the complementary strands are each extended by one nuc-macromolecule;
  • c) washing the stationary phase obtained in step b) under conditions which are suitable for removing nuc-macromolecules not incorporated into a complementary strand;
  • d) the individual nucleated macromolecules incorporated into complementary strands are detected by measuring the signal characteristic of the respective fluorescent dye, while simultaneously determining the relative position of the individual fluorescence signals on the reaction surface
  • e) to generate unlabelled (NTs or) NSKFs, cleave the linker component and the label moiety from the nucleated components attached to the complementary strand;
  • f) washing the stationary phase obtained in step e) under conditions which are suitable for removing the marker component, if necessary repeating steps a) to f) several times,
whereby the relative position of individual NSKF primer complexes on the reaction surface and the sequence of these NSKFs are determined by specific assignment of the fluorescence signals to the nuc macromolecules detected in step d) in successive cycles at the respective positions.

Ein weiterer Aspekt 54 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der Nuk-Makromoleküle einsetzt.One Another aspect 54 of the invention relates to a method according to aspect 53, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic Construction reaction repeated several times, where in each cycle only each use a kind of nuc macromolecules.

Ein weiterer Aspekt 55 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.One Another aspect 55 of the invention relates to a method according to aspect 53, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic Construction reaction repeated several times, with each cycle in each case uses two different types of nuc-macromolecules.

Ein weiterer Aspekt 56 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.One Another aspect 56 of the invention relates to a method according to aspect 53, characterized in that the steps a) to f) of the cyclic Construction reaction repeated several times, with each cycle in each case uses four different types of nuc-macromolecules.

Ein weiterer Aspekt 57 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 53, dadurch gekennzeichnet, dass die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind und man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.One Another aspect 57 of the invention relates to a method according to aspect 53, characterized in that the NSKs variants of a known Reference sequence and are the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction repeated several times, alternating in each cycle two differently labeled types of nuc macromolecules and two Unmarked NTs are used and the overall sequences are compared determined with the reference sequence.

Ein weiterer Aspekt 58 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Aspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man in die NSKFs jeweils eine Primerbindungsstelle (PBS) einführt, wobei man bei doppelsträngigen NSKs an beiden komplementären Einzelsträngen jeweils eine PBS einführt und wobei die Primerbindungsstellen für alle NSKFs jeweils gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.One Another aspect 58 of the invention relates to a method according to Aspects 53 to 57, characterized in that one in the NSKFs in each case introduces a primer binding site (PBS), where in double-stranded NSKs at both complementary single strands each introduces a PBS and wherein the primer binding sites are the same for all NSKFs or have different sequences.

Ein weiterer Aspekt 59 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Aspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs mit Primern in einer Lösung unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen, und man die gebildeten NSKF-Primer-Komplexe anschließend auf der Reaktionsoberfläche bindet.One Another aspect 59 of the invention relates to a method according to Aspects 53 to 57, characterized in that the NSKFs with Primers in a solution under conditions that are favorable for the hybridization of Primers to the primer binding sites (PBSs) of the NSKFs are suitable, where the primers are mutually identical or different sequences and then the formed NSKF primer complexes on the reaction surface binds.

Ein weiterer Aspekt 60 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach den Aspekten 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs zunächst auf der Reaktionsoberfläche immobilisiert und erst anschließend mit Primern unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei NSKF-Primer-Komplexe gebildet werden, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.One Another aspect 60 of the invention relates to a method according to Aspects 53 to 57, characterized in that the NSKFs first on the reaction surface immobilized and then with Primers under conditions that bring about hybridization the primer to the primer binding sites (PBSs) of the NSKFs suitable wherein NSKF primer complexes are formed, wherein the primers have mutually identical or different sequences.

Ein weiterer Aspekt 61 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 53 bis 60, bei dem an 10 bis 100.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführtOne Another aspect 61 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 60, in which 10 to 100,000 different sequences populations the installation reaction carried out in parallel

Ein weiterer Aspekt 62 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 53 bis 60, bei dem an 100.000 bis 10.000.000.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt.One Another aspect 62 of the invention relates to a method according to aspects 53 to 60, in which at 100,000 to 10,000,000,000 different Sequence populations performed the incorporation reaction in parallel.

Ein weiterer Aspekt 63 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 62, wobei die Sequenzen der Nukleinsäureketten ermittelt werdenOne Further aspect 63 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 62, wherein the sequences of the nucleic acid chains are determined

Ein weiterer Aspekt 64 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 28 bis 63, wobei die Marker-Komponente fluoreszent markiert istOne Another aspect 64 of the invention relates to a method according to aspects 28 to 63, wherein the marker component is fluorescently labeled

Ein weiterer Aspekt 65 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekten 41 bis 64, wobei die feste Phase unabhängig aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Silicon, Glas, Keramik, Kunststoffe, Gele oder deren ModifikationenOne Another aspect 65 of the invention relates to a method according to aspects 41 to 64, wherein the solid phase is independent from the following group selected is: silicone, glass, ceramics, plastics, gels or their modifications

Gegenüberstellung von Eigenschaften konventionell modifizierter Nukleotide und Nuk-Makromoleküle:Comparison of properties Conventionally modified nucleotides and nuc macromolecules:

Substrateigenschaften der konventionell modifizierten Nukleotidesubstrate properties the conventionally modified nucleotides

Der Einfluß unterschiedlicher Linkergrößen, der chemischen Linkerzusammensetzung und die unterschiedlicher Größe und Beschaffenheit von niedermolekularen Markern auf die Substrat-Eigenschaften der Nukleotide (G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447, Klevan US Patent 4828979, Lee. et al. Nucleic Acid Research 1992, V. 20, 2471, J. Brandis Nucleic Acid Research, 1999, V.27, 1912 ) macht deutlich, dass bereits geringfügige Veränderungen an der Nukleotid- , Linker- und Marker-Struktur zu einer starken Veränderung der Substrateigenschaften der modifizierten Nukleotide führen können.Of the Influence of different Linker sizes, the chemical linker composition and the different size and texture of low molecular weight markers on the substrate properties of the nucleotides (Wright, Wright et al., Pharmac.Ther 1990, V. 47, p 447, Klevan US Patent 4828979, Lee. et al. Nucleic Acid Research 1992, V. 20, 2471, J. Brandis Nucleic Acid Research, 1999, V.27, 1912) makes it clear that already minor changes at the nucleotide, linker and marker structure to a strong change the substrate properties of the modified nucleotides can lead.

Folgerichtig läßt sich nachweisen, dass die Kopplung eines deutlich größeren Moleküls (z.B. eines Proteins) an ein konventionell modifiziertes Nukleotid zur Aufhebung von dessen Substrateigenschaften führt, s. Beispiel 34B.logically let yourself demonstrate that the coupling of a significantly larger molecule (e.g., a protein) a conventionally modified nucleotide for repealing its Substrate properties leads, s. Example 34B.

Aus diesem Grund konnten bis jetzt signalverstärkende Makromoleküle nur nach erfolgtem enzymatischem Einbau der Nukleotide in die Nukleinsäurekette mit dem Nukleotid gekoppelt werden, wie beispielsweise markiertes Streptavidin an biotinylierte Nukleotide.Out For this reason signal amplifying macromolecules could only be detected enzymatic incorporation of the nucleotides into the nucleic acid chain be coupled with the nucleotide, such as labeled Streptavidin to biotinylated nucleotides.

Ähnliches lässt sich feststellen, wenn Nukleotid-Monomere in einer Nukleinsäurekette betrachtet werden: nur niedermolekulare Stoffe können beispielsweise an ein Oligonukleotid in der Nähe der 3'-OH-Posiition gekoppelt werden, falls dieses Oligonukleotid als Primer in weiteren Reaktionen auftreten sollte. Zu große Moleküle, z.B. Streptavidin, gekoppelt an ein Nukleotid-Monomer am 3'-Ende oder in der Nähe des 3'-Endes eines Oligonukleotids führen zum Verlust der Primereigenschaften. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, kann dies beispielsweise durch sterische Einflusse der Makromoleküle erklärt werden. Die räumlichen Verhältnisse im aktiven Zentrum vieler Enzyme sind sehr anspruchsvoll und der katatalytische Mechanismus vieler Enzyme schließt komplexe konformationelle Änderungen der Enzym-Struktur selber sowie die der Substrate (Nukleotid-Monomere). In vielen Fällen führen auch nur geringfügige chemische Modifikationen an Nukleotid-Monomeren, die als Monomere einer Polymer-Kette auftreten, zu einer veränderten enzymatischen Akzeptanz der Nukleinsäureketten. Ein Beispiel dafür ist die alpha-thiophosphonat-Modifikation der Nukleotid-Monomere, die zur Exonuklease-Resistenz der Nukleinsäurekette führt.something similar let yourself determine if nucleotide monomers in a nucleic acid chain be considered: only low molecular weight substances, for example, to a Oligonucleotide nearby coupled to the 3'-OH position if this oligonucleotide is used as a primer in further reactions should occur. Too big Molecules, e.g. Streptavidin coupled to a nucleotide monomer at the 3 'end or in the Near the 3 'end of an oligonucleotide to lead to the loss of the primer properties. Without a specific theory To be bound, this can be done, for example, by steric Influence of macromolecules explained become. The spatial conditions in the active center of many enzymes are very demanding and the catatalytic mechanism of many enzymes concludes complex conformational changes the enzyme structure itself as well as the substrates (nucleotide monomers). In many cases to lead even minor chemical modifications to nucleotide monomers as monomers a polymer chain occur, to an altered enzymatic acceptance the nucleic acid chains. An example for is the alpha-thiophosphonate modification the nucleotide monomers responsible for the exonuclease resistance of the nucleic acid chain leads.

Auch wenn eine Markierung mit Fluoreszenzfarsbtoffen einen breiten Einsatz in der modernen Diagnostik und Forschung gefunden hat, besteht nach wie vor ein dringeder Bedarf nach Signalverstärkung der biologisch aktiven markierten Molekülen. Man bedient sich oft einer sekundären Signalverstärkung durch Enzymreaktionen.Also if a label with Fluoreszenzfarsbtoffen a wide use has been found in modern diagnostics and research as before an urgent need for signal amplification of the biologically active labeled molecules. One often uses a secondary signal amplification through Enzyme reactions.

Trotz der naheliegenden Überlegung, eine mehrfache Markierung in Form einer makromolekularen Marker-Komponente an Nukleotide zu koppeln, gelang es noch nicht, diesen Schritt durch einfache Kombination zwischen konventionellen Nukleotidstrukturen und einer makromolekularen Marker-Komponente unter Beibehaltung der Substrateigenschaft der Nukleotide zu realisieren.In spite of the obvious consideration, a multiple label in the form of a macromolecular marker component to couple to nucleotides, did not yet succeed in this step simple combination between conventional nucleotide structures and a macromolecular marker component while retaining to realize the substrate property of the nucleotides.

Die Masse der konventionell modifizierten Nukleotide liegt im Wesentlichen im selben Bereich wie bei nicht modifizierten Nukleotiden, und ist relativ gering verglichen mit der Masse von Proteinen, wie z.B. Streptavidin oder Polymerasen. Die Steigerung der Masse des Nukleotids durch Einführung makromolekularer Komponenten kann zu Veränderung von biochemischen und physikalsichen Eigenschaften von Nukleotiden führen.The mass of the conventionally modified nucleotides is substantially in the same range as unmodified nucleotides, and is relatively low compared to the mass of proteins such as streptavidin or polymerases. Increasing the mass of the nucleotide by introducing macromolecular components can alter the biochemical and physical properties of nucleotides to lead.

Die Überwindung dieses Nachteils des Standes der Technik gelang überraschenderweise durch die räumliche Trennung zwischen raumfordernden bzw. sterisch anspruchsvollen Bestandteilen der Nuk-Makromoleküle und der enzymatisch aktiven Nuk-Komponente. Diese räumliche Trennung kann beispielsweise durch die Einführung einer wesentlich längeren Linker-Komponente zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente, als es vom Stand der Technik bekannt war, erreicht werden.Overcoming This disadvantage of the prior art was surprisingly achieved by the spatial Separation between space-consuming or sterically demanding components the nuc macromolecules and the enzymatically active nuc-component. This spatial Separation can be achieved, for example, by the introduction of a much longer linker component between the nuk component and the marker component, as known in the art was to be achieved.

Überraschenderweise behalten die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle ihre Substrataktivität trotz der massiven Veränderungen in ihren Eigenschaften bei und können von Enzymen verwendet als Substrate werden. So bauen beispielsweise Polymerasen die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang ein. Terminale deoxy-Nucleotidyl-Transferase (TdT) können Nuk-Makromoleküle an ein 3'-Ende einer Nukleinsäure koppeln (Beispiel 34B,C und Beispiel 35).Surprisingly retain the nuc-macromolecules of the invention their Substrate activity despite the massive changes in their properties and can used by enzymes as substrates. For example, build Polymerases the nuc-macromolecules of the invention in the growing strand. Terminal deoxy-nucleotidyl transferase (TdT) can Nuc-macromolecules to a 3 'end of a nucleic acid couple (Example 34B, C and Example 35).

Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass die Masse der erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle ein vielfaches der natürlichen Nukleotide bildet und einen großen Einfluß auf die Nuk- Komponente ausübt.a It should be obvious to a person skilled in the art that the mass of the nuc macromolecules according to the invention is a multiple the natural one Nucleotides forms and a large Influence on exercises the Nuk component.

Einsatzgebiete der Nuk-Makromoleküle.Fields of application of nuc macromolecules.

Die Kopplung eines makromolekularen Markers an ein Substrat für Enzyme, an ein Nukleotid, bietet die Möglichkeit eines breiten Einsatzes dieser Nuk-Makromoleküle in unterschiedlichen Anwendungen in der Biotechnologie, Medizin und Wissenschaft.The Coupling a macromolecular marker to a substrate for enzymes, to a nucleotide, offers the possibility a broad use of these nuc-macromolecules in different applications in biotechnology, medicine and science.

Erfindungsgemäß können Nuk-Makromoleküle in Verfahren eingesetzt werden, bei denen Sie als Substrate für Enzyme dienen.According to the invention nuc-macromolecules in processes be used, where they serve as substrates for enzymes.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden Nuk-Makromoleküle in den Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren eingesetzt. Dabei erfolgt eine Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen nach allgemeinen Regeln der enzymatischen Verlängerungsreaktion von Nukleinsäureketten, ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001).In an embodiment Nuc-macromolecules are used in the methods of labeling of the invention nucleic acids used. In this case, a incorporation reaction of nuc-macromolecules takes place general rules of the enzymatic extension reaction of nucleic acid chains, ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001).

Der große Vorteil eines makromolekularen Markes pro ein eingebautes Nukleotid liegt in einer wesentlich höheren Signalstärke im Vergleich zu herkömmlichen modifizierten Nukleotiden.Of the size Advantage of a macromolecular label per one incorporated nucleotide lies in a much higher signal strength compared to conventional modified nucleotides.

Ein weiterer Vorteil ist die große Distanz des Markers zum Nukleinsäurestrang, so dass nur geringfügige Wechselwirkung zwischen dem Marker und dem Nukleinsäurestrang zu erwarten sind. Dies hat einen Einfluß beispielsweise auf die Fluoreszenzeigenschaften der Marker: Die Fluoreszenz der Marker wird von den Nukleobasen (Purine und Pyrimidine) nicht gequencht. Falls mehrere Nuk-Makromoleküle in einer Nukleinsäurekette eingebaut sind, führt eine größere Distanz zwischen dem Marker und der Nukleotid-Komponenten zu einer deutlichen Verminderung der Interaktion zwischen Markern von benachbarten Nukleotiden.One Another advantage is the big one Distance of the marker to the nucleic acid strand, so that only minor Interaction between the marker and the nucleic acid strand are to be expected. This has an influence, for example, on the fluorescence properties the marker: The fluorescence of the marker is from the nucleobases (Purines and pyrimidines) not quenched. If several nuc-macromolecules in one nucleic acid chain are installed leads a greater distance between the marker and the nucleotide components to a clear Reduction of the interaction between markers of adjacent nucleotides.

Erfolgt die Markierung einer Nukleinsäurekette beispielsweise während der enzymatischen Synthese dieser Kette durch den Einbau von Nuk-Makromolekülen, so sind unter Umständen keine weiteren mehrstufigen Signalamplifikationsschritte mehr notwendig. Viele der bekannten Signalamplifikationsschritte, z.B. Biotin-Strepavidin-Antikörper, oder Digoxigenin-Antikörper I -Antikörper II laufen mit nur mäßigen Ausbeuten ab, wie z.B. Signalamplifikationen bei FISH-Analysen. Schwankende und schwache Ausbeuten in der Markierung verursachen ebenfalls Schwankungen und Schwäche im Signal, was zu Fehlinterpretationen führen kann. Durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen kann die Schäche der Markierung beseitigt werden. Durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen mit konstanten Signalmengen können auch die Schwankungen weitgehend ausgeglichen werden.He follows the labeling of a nucleic acid chain for example during the enzymatic synthesis of this chain by the incorporation of nuc-macromolecules, so are under circumstances no further multi-step signal amplification steps necessary. Many of the known signal amplification steps, e.g. Biotin-strepavidin antibody, or Digoxigenin antibody I antibody II run with only moderate yields from, e.g. Signal amplifications in FISH analyzes. fluctuating and poor yields in the label also cause fluctuations and weakness in the signal, which can lead to misinterpretations. Because of the engagement of nuc macromolecules can the break the marking be eliminated. Through the use of nuc-macromolecules with constant signal quantities can also the fluctuations are largely compensated.

Die Markierung von Nukleinsäuren kann in unterschiedlichen Verfahren eingesetzt werden. Die konkreten Bedingungen der Nukleinsäurevorbereitung, die Reihenfolge der enzymatischen Schritte und Detektionsvorgänge hängen im einzelnen vom Verfahren ab, in dem die Markierung eingesetzt wird.The Labeling of nucleic acids can be used in different procedures. The concrete ones Conditions of nucleic acid preparation, the order of the enzymatic steps and detection processes are dependent on individual from the method in which the mark is used.

Insgesamt kann festgestellt werden, dass die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle eine überdurchschittliche Verbesserung der Markierungsstrategien der Nukleinsäureketten ermöglichen.All in all It can be stated that the nuc-macromolecules of the invention have an above-average Improvement of the labeling strategies of nucleic acid chains enable.

Modifizierte NukleinsäurekettenModified nucleic acid chains

In einer Ausführung der Erfindung schließen Nukleinsäureketten Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle als Einheiten der Kette ein. Die Nuk-Makromoleküle werden als Monomere einer Polymerkette, der Nukleinsäurekette, betrachtet. Solche Nukleinsäureketten mit integriereten Nuk-Makromolekülen können als Sonden und als Reaktionspartner in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden (z.B. Real-Time-PCR, Ligase-Ketten-Reaktion).In an execution to close the invention nucleic acid chains Nuc components of the nuc macromolecules as units of the chain one. The nuc macromolecules are used as monomers of a polymer chain, the nucleic acid chain, considered. Such nucleic acid chains with integrated nuc macromolecules can used as probes and as reactants in various fields (e.g., real-time PCR, ligase chain reaction).

In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 5'-Ende der Nukleinsäurekette integriert. In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 3'-Ende der Nukleinsäurekette integriert. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül im Inneren der Nukleinsäurekette integriert, wobei der Abstand vom am nächsten liegenden Kettenende in folgenden Bereichen liegt (Zahl der Monomeren der Kette bis zum nächsten Kettenende): 1 bis 2, 2 bis 4, 4 bis 8, 8 bis 15, 15 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 500.In an embodiment is a nuc macromolecule to the 5'-end of the nucleic acid chain integrated. In one embodiment is a nuc macromolecule to the 3'-end of the nucleic acid chain integrated. In another embodiment, a nuc-macromolecule is internal the nucleic acid chain integrated, with the distance from the nearest chain end in the following ranges (number of monomers of the chain up to next Chain end): 1 to 2, 2 to 4, 4 to 8, 8 to 15, 15 to 30, 30 to 100, 100 to 500.

Ein Nuk-Makromolekül kann mehrere Nuk-Komponente einschließen. In einer Ausführungsform wird nur eine Nuk-Komponente eines Nuk-Makromoleküls in eine Nukleinsäurekette integriert, die anderen Nuk-Komponenten liegen in Monomer-Form vor. In einer anderen Ausführungsform können mehrere Nuk-Komponenten eines Nuk-Makromoleküls in unterschiedliche Nukleinsäureketten intergriert werden, wobei die Nukleinsäureketten unter einander identische oder auch unterschiedliche Sequenzen aufweisen können.One Nuc-macromolecule may include several nuk components. In one embodiment becomes only a nuc-component of a nuc macromolecule in one nucleic acid chain integrated, the other Nuk components are in monomer form. In another embodiment can Several nuc-components of a nuc-macromolecule into different nucleic acid chains be integrated, wherein the nucleic acid chains identical to each other or may have different sequences.

Besonders vorteilhaft ist der Einsatz mit Nuk-Makromolekülen modifizierter Nukleinsäureketten dann, wenn Nuk-Makromolekül als Teil einer Polymer-Kette an einer enzymatischen Reaktion/Umwandlung teilnimmt oder sich in unmittelbaren Nähe vom an der Reaktion teilnehmenden Nukleotid befindet. Durch den langen Linker der Nuk-Makromolekülen wird der Einfluß einer makromolekularen Marker-Komponente auf das Enzym stark reduziert, so dass die modifizierten Nukleotid-Komponenten an den enzymatischen Reaktionen (z.B. Primer-Funktion bei einer matrizen-abhängigen, polymerase-gesteuerten Reaktion, bei einer Ligase-abängigen Reaktion (z.B. Ligase-Ketten-Reaktion), 3'-Exonuklease oder 5'-Exonuklease-Aktivitäten verschiedener Enzyme, Endonuklease-Spaltung,) teilnehmen können, bzw. die Reaktion an benachbarten Nukleotiden nicht beeinträchtigen (J. Wilhelm "Entwicklung Real-Time-PCR-basierter Methoden für die moderne DNA-Analytik" Dissertation, 2003, Gießen, S. Meuer "Rapid cycle real time PCR", Springer 2004, ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner "PCR-Technology: current innovations" CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5). Der Abstand zwischen der Position des Nuk-Makromoleküls in der Nukleinsäurekette und dem Nukleotid derselben Nukleinsäurekette, das als Substrat an der enzymatischen Reaktion teilnimmt, liegt beispielsweise in folgenden Bereichen (Zahl von Nukleotiden): 0 bis 3, 3 bis 6, 6 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 40. Zahl 0 bedeutet, dass das Nuk-Makromolekül direkt an das an der Reaktion teilnehmende Nukleotid gekoppelt ist.Especially advantageous is the use of nuc-macromolecules of modified nucleic acid chains then, if Nuk macromolecule as part of a polymer chain on an enzymatic reaction / conversion participate or in the immediate vicinity of the participant in the reaction Nucleotide is located. Through the long linker of nuc-macromolecules becomes the influence of one macromolecular marker component greatly reduced to the enzyme, so that the modified nucleotide components attached to the enzymatic reactions (e.g., primer function in a template-dependent, polymerase-driven reaction, in a ligase-dependent reaction (e.g., ligase chain reaction), 3'-exonuclease or 5 'exonuclease activities of various Enzymes, endonuclease cleavage,), or the reaction adjacent nucleotides do not interfere (J. Wilhelm "Development Real-Time PCR-based Methods for the modern DNA analysis "dissertation, 2003, casting, S. Meuer "Rapid cycle real time PCR ", Springer 2004, ISBN 3-540-66736-9, T. Weissensteiner "PCR Technology: current innovations "CRC Press 2004 ISBN 0-8493-1184-5). The distance between the position of the nuc macromolecule in the nucleic acid chain and the nucleotide of the same nucleic acid chain as the substrate participates in the enzymatic reaction is, for example, in following ranges (number of nucleotides): 0 to 3, 3 to 6, 6 to 10, 10 to 20, 20 to 40. Number 0 means that the nuc macromolecule is direct is coupled to the nucleotide participating in the reaction.

Im weiteren folgen einige Beispiele zum Einsatz der Nuk-Makromoleküle.in the others are followed by some examples of the use of nuc macromolecules.

Verfahren in der FlüssigphaseProcess in the liquid phase

In einer Ausführungsform der Markierungsverfahren befinden sich die zu markierenden Nukleinsäureketten in der Flüssigphase, s. Beispiel 34, 35.In an embodiment The labeling procedure contains the nucleic acid chains to be labeled in the liquid phase, s. Example 34, 35.

Viele andere Verfahren, z.B. PCR, Nick-Translation, Random-Primer-Reaktion, reverse Transkription mit Reversen Transkriptasen und Transkription mit RNA-Polymerasen ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001) können mit erfindungsgemäßen Nuk-Makromolekülen durchgeführt werden. Dabei werden Nuk-Makromoleküle ähnlich zu konventionell mit Farbstoff modifizierten Nukleotiden in die Reaktion zugegeben. Allgemeine Regeln der Verwendung konventionell modifizierter Nukletide, wie beispielsweise dCTP-Cy3 (Amersham Bioscience) oder dUTP-TMR (NEN) sind ausführlich in Literatur beschrieben ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001). Beispielsweise kann für die Kopplung eines einzelnen komplementären Nukleotids an den Primer eine Art der Nuk-Makromoleküle, z.B. dATP oder dCTP, verwendet werden. Bei den meisten Reaktionen werden allerdings Gemische aus modifizierte und nicht modifizierten Nukleotiden eingesetzt (H. Yu et al. Nucleic Acid Research 1994, v. 22 3226-, "Molecular Cloning", J. Sambrook, 3. Ed. 2001). Beispielsweise können nicht markierte und markierte Nukleotide für eine Markierung mit einem Nuk-Makromolekül, bei dem dUTP als Nuk-Komponente auftritt, in folgenden Verhältnissen gemischt werden:
dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,5:0,5
dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,7:0,3
dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,9:0,1
oder dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,7:0,3
oder dATP : dCTP : dGTP : dTTP : dUTP-Nuk-Makromolekül = 1:1:1:0,95:0,05
die genaue Mischverhältnisse können für einzelne Markierungsreaktionen optimiert werden.Many other methods, eg PCR, nick translation, random primer reaction, reverse transcription with reverse transcriptases and transcription with RNA polymerases ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3rd Ed., 2001) can be used with nuc macromolecules according to the invention be performed. Nuc-macromolecules are added to the reaction similarly to conventionally dye-modified nucleotides. General rules for the use of conventionally modified nuclides, such as dCTP-Cy3 (Amersham Bioscience) or dUTP-TMR (NEN), have been extensively described in literature ("Molecular Cloning", J. Sambrook, 3 Ed. 2001). For example, one type of nuc macromolecule, eg dATP or dCTP, can be used to couple a single complementary nucleotide to the primer. However, mixtures of modified and unmodified nucleotides are used in most reactions (H. Yu et al Nucleic Acid Research 1994, v. 22 3226, "Molecular Cloning", J. Sambrook, 3rd Ed., 2001). For example, unlabeled and labeled nucleotides for labeling with a nuc macromolecule in which dUTP occurs as a nuc-component may be mixed in the following proportions:
dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dUTP nuc macromolecule = 1: 1: 1: 0.5: 0.5
dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dUTP nuc macromolecule = 1: 1: 1: 0.7: 0.3
dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dUTP nuc macromolecule = 1: 1: 1: 0.9: 0.1
or dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dUTP nuc macromolecule = 1: 1: 1: 0.7: 0.3
or dATP: dCTP: dGTP: dTTP: dUTP nuc macromolecule = 1: 1: 1: 0.95: 0.05
the exact mixing ratios can be optimized for individual labeling reactions.

Auch mehrere Arten der Nuk-Makromoleküle können in einer Reaktion eingesetzt werden. Beispielsweise können Nuk-Makromoleküle unterschiedliche Markierung tragen. In einer Ausführungsform werden die Marker der Nuk-Makromoleküle so gewählt, dass sie ein FRET-Paar bilden (Faner, R et al. Hum Immunol 2004, v.65, 826-38, Lazowski, K. W et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2000, v.10, 97-103, Talavera, E. M., Appl Spectrosc 2003, v.57, 208-15, Tsourkas, A. et al. Anal Chem, 2003, v. 75, 3697-703, Singh, K. K., et al. Methods Mol Biol 2004, v.252, 33-48, Wang, L., Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc , 2004, v.60, 2741-50). Nach dem Einbau solcher Nuk-Makromoleküle in die wachsende Nukleinsäurekette verringert sich die durchschnittliche Distanz zwischen den Fluorophoren, so dass es bei der Anregung des Donors zu FRET an den Akzeptor kommt. Da die Nuk-Makromoleküle eine deutlich stärkere Markierung tragen als die konventionell modifizierten Nukleotide, kann die Signalintensität eines FRET-Signal deutlich größer sein. Die genauen Bedingung der Reaktion können im Hinblick auf die Wahl der Fluorophore, ihre Kopplung im Nuk-Makromolekül, die Konzentration der Nuk-Makromoleküle und Verhältnis zwischen, den Nuk-Makromolekülen und nicht markierten Nukleotiden optimiert werden. Als generelle Regel gilt dabei, dass die durchschnittliche Distanz zwischen den Fluorophoren eines FRET-Paars sollte unter 10 nm liegen.Also several types of nuc macromolecules can be used in a reaction. For example, nuc macromolecules may be different Wear marker. In one embodiment For example, the markers of nuc-macromolecules are chosen to be a FRET pair (Faner, R. et al., Hum Immunol 2004, v. 65, 826-38, Lazowski, K. W et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2000, v.10, 97-103, Talavera, E.M., Appl Spectrosc 2003, v. 57, 208-15, Tsourkas, A. et al. Anal Chem, 2003, v. 75, 3697-703, Singh, K.K., et al. Methods Mol Biol 2004, v.252, 33-48, Wang, L., Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2004, v. 60, 2741-50). After incorporation of such nuc-macromolecules in the growing nucleic acid chain the average distance between the fluorophores decreases, so that upon excitation of the donor to FRET, it comes to the acceptor. Since the nuc macromolecules a much stronger Bear label as the conventionally modified nucleotides, can the signal intensity a FRET signal will be significantly larger. The exact condition of the reaction may be in terms of choice the fluorophores, their coupling in the nuc macromolecule, the concentration of the nuc macromolecules, and the ratio between the nuc macromolecules and unlabeled nucleotides. As a general The rule is that the average distance between the Fluorophores of a FRET pair should be below 10 nm.

FestphasenverfahrenSolid phase method

In einer weiteren Ausführungsform der Markierungsverfahren sind die zu markierenden Nukleinsäureketten oder deren komplementären Stränge an einer festen Phase fixiert. Viele Verfahren zur Markierung von immobilisierten Nukleinsäureketten mit konventionell modifizierten Nukleotiden sind bekannt (Suomalainen A et al. Methods Mol Biol. 2003, Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Sep 17;11(18):2437-40). Beispiele für die feste Phase stellen Mikrokügelchen (Spherotech Inc, Streptavidin-polystyre Particle, 2.17μ). Im Beispiel 34C wird eine Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen an fester Phase beschrieben. Ein weiteres Beispiel für die feste Phase stellen planen Oberflächen, an die Nukleinsäuren gebunden sind.In a further embodiment the labeling method are the nucleic acid chains to be labeled or their complementary strands fixed on a solid phase. Many methods for labeling immobilized nucleic acid chains with conventionally modified nucleotides are known (Suomalainen A et al. Methods Mol Biol. 2003, Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Sep 17; 11 (18): 2437-40). Examples of the solid phase are microspheres (Spherotech Inc, Streptavidin-polystyrene Particle, 2.17μ). For example 34C, an incorporation reaction of nuc macromolecules on a solid phase is described. Another example of The solid phase surfaces plan to bind to the nucleic acids are.

Die Nuk-Makromoleküle eignen sich für Analysenverfahren mit einer Einbaureaktion an den an einer festen Phase gekoppelten Nukleinsäuren, sie können ähnlich zu konventionell modifizierten Nukleotiden in vielen Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise Minisequencing (Suomalainen A et al. Methods Mol Biol. 2003;226:361-6. Liljedahl U et al. Pharmacogenetics. 2003 Jan;13(1):7-17, Olsson C et al. Methods Mol Biol. 2003;212:167-76), Primer-Extension (Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett. 2001 Sep 17;11(18):2437-40, Cai H, et al. Genomics. 2000 Jun 1;66(2):135-43., Kurg A et al. Genet Test. 2000;4(1):1-7., Pastinen T et al. Genome Res. 1997 Jun;7(6):606-14). US pat. 6287766, US pat. 2003148284, US pat. 2003082613, EP 1256632 , WO0194639, WO 2004/076692, Ju et al. US Pat. 6664079. Fest-Phasen-PCR (WO 9626291, WO 9409156, US Pat. 6221635), Sequenzierung durch die Synthese (Ju et al US Pat. 6664079), Single-Molecular-Sequencing (Tcherkassov WO 02088382, Seeger WO 0018956, Kartalov WO 02072892). In vielen Fällen erfolgt dabei eine Synthese der komplementären Stränge an den fixierten Primer-Matrizen-Komplexen.The nuc macromolecules are suitable for analytical procedures involving a incorporation reaction on the nucleic acids coupled to a solid phase, and they can be used in many processes, similar to conventionally modified nucleotides, such as, for example, mini-sequencing (Suomalainen A et al., Methods Mol Biol. 2003; 361-6, Liljedahl U et al Pharmacogenetics 2003 Jan; 13 (1): 7-17, Olsson C et al., Methods Mol Biol. 2003; 212: 167-76), primer extension (Pirrung MC et al. Bioorg Med Chem Lett 2001 Sep 17; 11 (18): 2437-40, Cai H, et al., Genomics 2000 Jun 1; 66 (2): 135-43., Kurg A et al., Genet Test., 2000; 4 (1): 1-7., Pastinen T et al., Genome Res. 1997 Jun; 7 (6): 606-14). US pat. 6287766, US pat. 2003148284, US pat. 2003082613, EP 1256632 WO0194639, WO 2004/076692, Ju et al. US Pat. No. 6,664,079. Solid phase PCR (WO 9626291, WO 9409156, US Pat. No. 6,221,635), sequencing by synthesis (Ju et al. Pat. No. 666,409), single-molecule sequencing (Tcherkassov WO 02088382, Seeger WO 0018956 Kartalov WO 02072892). In many cases, a synthesis of the complementary strands takes place on the fixed primer-template complexes.

Viele Analyse-Verfahren bei denen Nukleinsäureketten fixiert sind, benötigen routinemäßig Vervielfältigungsschritte. In solchen Verfahren können Nuk-Makromoleküle einen besonders großen Vorteil bringen, da die Signal-Intensität überdurchschnittlich gesteigert wird. Die Zahl der signalgebenden Marker-Einheiten von Nuk-Makromolekülen kann eine noch während der Synthese festgelegte Größe aufweisen, so dass die Intensität des Signal von den eingebauten Nuk-Makromolekülen quantifiziert werden kann.Lots Methods of analysis in which nucleic acid chains are fixed routinely require amplification steps. In such procedures can Nuc-macromolecules one especially big Bring advantage, since the signal intensity increased above average becomes. The number of signaling marker units of nuc-macromolecules can one while still have the size specified in the synthesis, so the intensity of the signal from the incorporated nuc macromolecules can be quantified.

Bei solchen Verfahren können Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die fluoreszente, radioaktive oder Enzyme als Marker-Einheiten einschließen.at such methods can Nuc-macromolecules be used, the fluorescent, radioactive or enzymes as Include marker units.

Sehr vorteilhaft bei solchen Verfahren ist die Verwendung von Nuk-Makromolekülen mit Fluoreszenzsignalen, da die Fluoreszenz eine hohe Sensitivität aufweist.Very advantageous in such methods is the use of nuc macromolecules with Fluorescence signals, since the fluorescence has a high sensitivity.

In einer Ausführung solcher Verfahren erfolgt die Detektion der Fluoreszenz-Signale von den Markern der eingebauten Nuk-Makromoleküle. Dabei können auch FRET-Paare zwischen einzelnen Nuk-Makromolekülen verwendet werden. In einer weiteren Ausführung können bei der Markierung an einer festen Phase fixierten Nukleinsäureketten markierte Primer eingesetzt werden, wobei die Primer in einer Ausführungsform einen oder mehrere Nuk-Makromoleküle einschließen und in einer weiteren Ausführungsform eine konventionelle Markierung einschlißen.In an execution such methods, the detection of the fluorescence signals from the markers of the incorporated nuc-macromolecules. It also FRET pairs between each Nuc-macromolecules be used. In a further embodiment, at the mark on a solid phase fixed nucleic acid chains labeled primer can be used, wherein the primer in one embodiment include one or more nuc macromolecules and in a further embodiment include a conventional marker.

In diesen beiden Ausführungsformen kann die Markieung am Primer als ein Teil eines FRET-Paars auftreten. Der an Primer gekoppelte Partner eines FRET-Paars kann dabei als Donor als auch als Akzeptor während der Detektion auftreten. Die eingebauten Nuk-Makromoleküle mit einem entsprechenden Partner des FRET-Paars können dabei einen abspaltbaren oder auch einen nicht abspaltbaren Marker tragen.In these two embodiments, the primer labeling may occur as part of a FRET pair. The primer-coupled partner of a FRET pair can act as donor as well as acceptor occur during detection. The incorporated nuc-macromolecules with a corresponding partner of the FRET pair can carry a cleavable or a non-cleavable marker.

Durch den Einsatz des FRET zwischen den eingebauten Nuk-Makromolekülen oder der Primer-Markierung und den eingebauten Nuk-Makromolekülen kann eine große Steigerung der Signalspezifität erzielt werden. Die Detektion kann dabei in einer Ausführungsform während des Einbaus in einer anderen Ausführunnsform als separater Schritt des Verfahrend erfolgen.By the use of FRET between the incorporated nuc-macromolecules or the primer label and the incorporated nuc macromolecules a big Increase in signal specificity be achieved. The detection can in one embodiment while the installation in another embodiment as a separate step of the procedure.

In einer Ausführungsform tragen Nuk-Makromoleküle mit Nuk-Komponente einer Art (beispielsweise dTTP) vorzugsweise eine für sie spezifischen Marker-Komponente, so dass beispielsweise 4 Arten der Nuk-Makromoleküle (entsprechend dem dTTP, dCTP, dATP und dGTP) gleichzeitig eingesetzt und unterschieden werden können. Andere Markierungsschema sind in bekannt s. z.B. Tcherkassov WO 02088382. Je nach Verfahren werden auch nicht markierte, z.B. natürliche Nukleotide in das Reaktionsgemisch zusammen mit den Nuk-Makromolekülen zugegeben.In an embodiment wear nuc macromolecules with nuk component of one kind (for example, dTTP) preferably one for They specific marker component, so for example 4 kinds the nuc macromolecules (corresponding to the dTTP, dCTP, dATP and dGTP) used simultaneously and can be distinguished. Other marking schemes are known in the s. e.g. Tcherkassov WO 02088382. Depending on the method, unmarked, e.g. natural nucleotides into the reaction mixture along with the nuc macromolecules.

In einer Ausführungsform der Markierungsverfahrens werden Nuk-Makromoleküle eingesetzt, die den Einbau nur einer einzelnen Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang erlauben und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker-Komponente verhindert wird. Der weitere Einbau kann sowohl reversibel als auch irreversibel verhindert werden. Ein irreversibler Stopp kann beispielsweise durch den Einsatz von Nuk-Makromolekülen erreicht werden, die als Nuk-Komponente ein Dideoxi-Nukleosidtriphosphat einschließen. Ein reversibler Stops kann in einem weiteren Verfahrensschritt aufgehoben werden, so dass weitere Einbaureaktionen stattfinden können. Beispiele für eine reversible Blockade der Reaktion sind in Anmeldungen (Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Tcherkassov WO 02088382, Ju et al. US Pat. 6664079, Milton et al. WO 2004018497, Milton et al. WO 2004018493, Balasubramanian et al. WO 03048387) beschrieben.In an embodiment Nuc-macromolecules are used in the labeling process just a single nuc-component in the growing nucleic acid strand allow and multiple installation by modifications to the Nuk component, and / or the linker component and / or the marker component prevented becomes. Further incorporation can be both reversible and irreversible be prevented. An irreversible stop, for example, by the use of nuc macromolecules can be achieved, the Nuk component as a dideoxy nucleoside triphosphate lock in. A reversible stop can be canceled in a further process step so that further incorporation reactions can take place. Examples for one reversible blockade of the reaction are reported in applications (Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, p. 4259, Canard et al. genes 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Tcherkassov WO 02088382, Ju et al. US Pat. No. 6664079, Milton et al. WO 2004018497, Milton et al. WO 2004018493, Balasubramanian et al. WO 03048387).

In einer anderen Ausführungsform verhindern die bereits eingebauten Nuk-Makromoleküle den weiteren Einbau von Nukleotiden nicht. Falls ein Gemisch aus modifizierten und nicht modifizierten Nukleotiden eingesetzt wird, können nach dem Einbau von einem Nuk-Makromolekül auch weitere Nuk-Makromoleküle in den wachsenden Strang nacheinander eingebaut werden.In another embodiment prevent the built-in nuc-macromolecules further incorporation of Nucleotides not. If a mixture of modified and not modified nucleotides can be used after the incorporation of a Nuc-macromolecule also other nuc macromolecules be built into the growing strand one after the other.

Die feste Phase kann beispielsweise eine plane Oberfläche oder Kügelchen (Beads) oder eine Art von Multigefäßarrays (z.B. Microtiterplatte, Nanotiterplatte) darstellen. Dabei können Nukleinsäuren mit verschiedenen Methoden an die feste Phase gekoppelt werden (McGall et al. US Patent 5412087, Nikiforov et al. US Patent 5610287, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray Biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73, S.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679). Es sind Verfahren zur Vervielfältigung der Nukleinsäureketten ausgehend von einzelnen Molekülen beschrieben. Solche Verfahren können zur Ausbildung ortsspezifisch gebundener Populationen der Nukleinsäureketten mit identischer Sequenz eingesetzt werden, wobei sowohl plane Oberflächen als auch Beads verwendet werden können. Vorzugsweise sind die zu analysierenden Nukleinsäurestränge mit einem Primer versehen, so dass es ein Primer-Matrizen-Komplex ausgebildet ist und daran eine enzymatische Synthese eines komplementären Stranges stattfinden kann ("Molecular Cloning", Maniatis, 3. Ed. 2001).The solid phase, for example, a flat surface or globule (Beads) or a type of multi-vessel arrays (e.g., microtiter plate, Nanotiter plate). This nucleic acids with various methods can be coupled to the solid phase (McGall et al. U.S. Patent 5,411,087, Nikiforov et al. U.S. Patent 5,610,287, Barrett et al. U.S. Patent 5,482,867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray Biochip Technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays "1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, p.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73, p.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, p.279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v.72, p.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 p.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 p.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 p.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 p.1679). There are methods for duplication the nucleic acid chains starting from single molecules described. Such methods can be used for Formation of site-specific bound populations of the nucleic acid chains be used with identical sequence, with both planar surfaces as also beads can be used. Preferably, the nucleic acid strands to be analyzed are provided with a primer, making it a primer-template complex is formed and an enzymatic synthesis of a complementary strand take place ("Molecular Cloning ", Maniatis, 3rd ed. 2001).

Primer-Extension:Primer extension:

In einer Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen an einer einzigen Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach dem Einbau am verlängerten Primer verbleibt und nicht abgetrennt wird.In an embodiment of the process, the incorporation reaction of nuc-macromolecules takes place on a single Population of uniform solid phase-fixed nucleic acid molecules, wherein the marker component of the nuc macromolecule after installation on the extended Primer remains and is not separated.

Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:

  • 1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
  • 2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk-Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können.
  • 3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
  • 4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
Such methods essentially include the following steps:
  • 1) providing a solid phase with fixed primer-template complexes
  • 2) incubating the provided solid phase with a reaction solution containing one or more types of polymerases, one or more types of nuc macromolecules, whereby the nuc macromolecules can be uniquely identified by their labeling.
  • 3) Remove the reaction solution and wash the solid phase
  • 4) Detection of the signals of incorporated nuc macromolecules and the assignment of the type of incorporated nuc macromolecules due to their signal properties.

Sequenzierung:sequencing:

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen an einer einzigen Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion von der Nuk-Komponente abgetrennt wird.In a further embodiment of the process, the incorporation reaction of nuc-macromolecules takes place on a single population of uniform, fixed on the solid phase Nucleic acid molecules, wherein the marker component or its individual components with or without Linker component of the nuc macromolecule during the incorporation reaction or after the incorporation reaction is separated from the nuc-component.

Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:

  • 1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
  • 2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk-Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können.
  • 3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
  • 4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
  • 5) Entfernung der Marker-Komponente von den eingebauten Nuk-Makromolekülen
  • 6) Wiederholung der Schritte 2 bis 5
Such methods essentially include the following steps:
  • 1) providing a solid phase with fixed primer-template complexes
  • 2) incubating the provided solid phase with a reaction solution containing one or more types of polymerases, one or more types of nuc macromolecules, whereby the nuc macromolecules can be uniquely identified by their labeling.
  • 3) Remove the reaction solution and wash the solid phase
  • 4) Detection of the signals of incorporated nuc macromolecules and the assignment of the type of incorporated nuc macromolecules due to their signal properties.
  • 5) Removal of the marker component from the incorporated nuc macromolecules
  • 6) Repeat steps 2 to 5

Die Wiederholung kann beispielsweise 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30 mal durchgeführt werden.The Repetition may be, for example, 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to be performed 20, 20 to 30 times.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt der Einbau von Nuk-Makromolekülen in einer enzymatischen Reaktion parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Populationen adressierbare Positionen an der festen Phase haben, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach dem Einbau am verlängerten Primer verbleibt und nicht abgetrennt wird.In a further embodiment The method involves the incorporation of nuc-macromolecules in an enzymatic Reaction in parallel on two or more different populations uniform, fixed to the solid phase nucleic acid molecules, wherein these populations addressable positions on the solid phase with the marker component of the nuc macromolecule after the installation at the extended Primer remains and is not separated.

Die adressierbaren Positionen können beispielsweise die Form von Spots haben, im Falle einer planen Oberfläche. Bei der Verwendung von Kügelchen als feste Phase werden unterschiedliche Populationen von Nukleinsäuren an unterschiedlichen Kügelchen fixiert. Bei der Verwendung von Multigefäßarrays (z.B. Mikrotiter-Platte, oder Nanotiter-Platte) sind einzelne Nukleinsäurepopulationen in einzelnen Gefäßen getrennt fixiert.The addressable positions can for example, have the shape of spots, in the case of a flat surface. at the use of beads as a solid phase to different populations of nucleic acids different globules fixed. When using multi-vial arrays (e.g., microtiter plate, or nanotiter plate) are single nucleic acid populations in individual Fused separately.

Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:

  • 1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
  • 2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk-Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können.
  • 3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
  • 4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
Such methods essentially include the following steps:
  • 1) providing a solid phase with fixed primer-template complexes
  • 2) incubating the provided solid phase with a reaction solution containing one or more types of polymerases, one or more types of nuc macromolecules, whereby the nuc macromolecules can be uniquely identified by their labeling.
  • 3) Remove the reaction solution and wash the solid phase
  • 4) Detection of the signals of incorporated nuc macromolecules and the assignment of the type of incorporated nuc macromolecules due to their signal properties.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt der Einbau von Nuk-Makromolekülen in einer enzymatischen Reaktion parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Populationen adressierbare Positionen an der festen Phase haben. Die einheitlichen Nukleinsäurepopulationen können durch unterschidliche Verfahren an die Oberfläche fixiert werden (s.o.). Die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponentedes Nuk-Makromoleküls wird bei dieser Ausführungsform während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion vom der eingebauten Nuk-Komponente abgetrennt. Für solche Verfahren eignen sich Nuk-Makromoleküle mit spaltbaren Verbindungen im Linker. Die adressierbaren Positionen können beispielsweise die Form von Spots haben, im Falle einer planen Oberfläche. Bei der Verwendung von Kügelchen als feste Phase werden unterschiedliche Populationen von Nukleinsäuren an unterschiedlichen Kügelchen fixiert. Bei der Verwendung von Multigefäßarrays sind einzelne Nukleinsäurepopulationen in einzelnen Gefäßen getrennt fixiert.In a further embodiment The method involves the incorporation of nuc-macromolecules in an enzymatic Reaction in parallel on two or more different populations uniform, fixed to the solid phase nucleic acid molecules, wherein these populations addressable positions on the solid phase to have. The uniform nucleic acid populations can by different methods are fixed to the surface (see above). The marker component or their individual components with or without linker components Nuc-macromolecule is in this embodiment while the installation reaction or after the installation reaction of the built-in Nuc component separated. For such methods are nuc-macromolecules with cleavable compounds in the linker. The addressable positions can be, for example, the shape of spots, in case of a flat surface. When using Globules as solid phase become different populations of nucleic acids different globules fixed. When using multi-vessel arrays are single nucleic acid populations separated in individual vessels fixed.

Solche Verfahren schließen im wesentlichen folgende Schritte ein:

  • 1) Bereitstellung einer festen Phase mit fixierten Primer-Matrizen-Komplexen
  • 2) Inkubation der bereitgestellten festen Phase mit einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Arten der Polymerasen, eine oder mehrere Arten der Nuk-Makromoleküle enthält, wobei die Nuk-Makromoleküle durch ihre Markierung eindeutig identifiziert werden können.
  • 3) Enfernung der Reaktionslösung und waschen der festen Phase
  • 4) Detektion der Signale von eingebauten Nuk-Makromolekülen und die Zuordnung der Art der eingebauten Nuk-Makromoleküle aufgrund ihrer Signaleigenschaften.
  • 5) Entfernung der Marker-Komponente von den eingebauten Nuk-Makromolekülen
  • 6) Wiederholung der Schritte 2 bis 5
Such methods essentially include the following steps:
  • 1) providing a solid phase with fixed primer-template complexes
  • 2) incubating the provided solid phase with a reaction solution containing one or more types of polymerases, one or more types of nuc macromolecules, whereby the nuc macromolecules can be uniquely identified by their labeling.
  • 3) Remove the reaction solution and wash the solid phase
  • 4) Detection of the signals of incorporated nuc macromolecules and the assignment of the type of incorporated nuc macromolecules due to their signal properties.
  • 5) Removal of the marker component from the incorporated nuc macromolecules
  • 6) Repeat steps 2 to 5

Die Wiederholung kann beispielsweise 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200 mal durchgeführt werden.The Repetition may be, for example, 1 to 2, 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 30, 30 to 50, 50 to 100, 100 to 200 times.

Ein einer Ausführungsform eines solchen Verfahrens werden im Schritt (2) Nuk-Makromoleküle zusammen mit den anderen modifizierten Nukleotiden eingesetzt. Dabei erfolgt die Synthese des komplementären Stranges schrittweise: pro ein Syntheseschritt werden komplementäre Stränge maximal um ein Nukleotid verlängert. Die Kontrolle der enzymatischen Reaktion erfolgt dabei durch reversible Terminatoren. Vorzugsweise werden die an 3'-OH-Gruppe modifizierten Terminatoren eingesetzt, die keine weiteren Modifikationen an der Base tragen. Nach der Abspaltung der Modifikation vom eingebauten Nukleotid kann weitere Synthese an diesen Strängen stattfinden. Die Struktur der in dieser Ausführungsform eingesetzten Nuk-Makromoieküle kann unterschiedlich sein. Vorzugsweise sind es terminierende Nuk-Makromoleküle, d.h. nach ihren Einbau kann kein weiteres Nukleotid durch eine Polymerase eingebaut werden. Der Linker ist vorzugsweise an die Base der Nuk-Komponente gekoppelt und schließt eine spaltbare Verbindung ein. Das Zusammenmischen der Nuk-Makromoleküle mit terminierenden Eigenschaften und der reversiblen Terminatoren erlaubt an einer Population der Nukleinsäureketten die Markierung und die reversible Termination zu trennen. Da die Nuk-Makromoleküle in dieser Ausführungsform des Verfahrens terminierend wirken, steht in jedem weiteren Einbauschritt eine geringerere Anzahl an Strängen für weitere Sequenzierungsreaktion zur Verfügung. Damit eine Einbaureaktion in weiteren Schritten stattfinden kann, muß ein Teil der Stränge in jedem Schritt reversibel blockiert werden. Der Anteil der mit Nuk-Makromolekülen modifizierten Nukleinsäureketten kann sehr gering sein, da die Signalstärke der Nuk-Makromoleküle sehr groß sein kann. Das Verhältnis zwischen den Nuk-Makromolekülen und reversiblen Terminatoren in einem Reaktionsschritt kann beispielsweise in folgenden Bereichen liegen: zwischen 100:1 und 1:10, zwischen 10:1 und 1:1, 1:1 und 1:10, zwischen 1:10 und 1:100, zwischen 1:100 und 1:1000 (Konzentration von Nuk-Makromoleküle : Konzentration von reversiblen Terminatoren). Dieses Verhältnis kann während der gesamten Sequenzierunsreaktion konstant bleiben oder varisieren. Da Polymersen die Nuk-Makromoleküle und die reversible Terminatoren unterschiedlich gut akzeptieren können, können mehrere Polymerse-Arten während des Einbauschritts eingesetzt werden.One an embodiment In such a method, nuc-macromolecules are combined in step (2) used with the other modified nucleotides. This takes place the synthesis of the complementary Stranges step by step: complementary strands become maximal per one step of synthesis extended by one nucleotide. The control of the enzymatic reaction is carried out by reversible Terminators. Preferably, the 3'-OH group modified terminators used, which carry no further modifications to the base. After cleavage of the modification of the incorporated nucleotide can further synthesis of these strands occur. The structure of the nuc macromolecules used in this embodiment may be be different. Preferably, they are terminating nuc-macromolecules, i. after its incorporation, no further nucleotide can be produced by a polymerase to be built in. The linker is preferably coupled to the base of the nuc-component and close a fissile connection. The mixing together of nuc-macromolecules with terminating Properties and reversible terminators allowed at one Population of nucleic acid chains to separate the label and the reversible termination. Because the Nuc-macromolecules in this embodiment act terminating the process, is in each additional installation step one lesser number of strands for further Sequencing reaction available. So that an installation reaction can take place in further steps, has to be Part of the strands be reversibly blocked in each step. The proportion of with Nuc-macromolecules modified nucleic acid chains can be very low because the signal strength of nuc-macromolecules is very high be great can. The relationship between the nuc macromolecules and reversible terminators in a reaction step may, for example in the following ranges: between 100: 1 and 1:10, between 10: 1 and 1: 1, 1: 1 and 1:10, between 1:10 and 1: 100, between 1: 100 and 1: 1000 (concentration of nuc-macromolecules: concentration of reversible terminators). This ratio can while remain constant or variable throughout the sequencing reaction. As polymers, the nuc macromolecules and accept the reversible terminators differently can, can several Polymeric species during of the installation step are used.

Die Entfernung der Signale nach der Detektion führt zu einem besseren Signal-Rauschen-Verhältnis bei den nächsten Detektionen und ist typisch für die Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese. Die Aufhebung der reversiblen Terminierung kann in einem eigenen Schritt erfolgen oder beispielsweise mit dem Schritt der Entfernung der Markierung zusammenfallen.The Removing the signals after detection will result in a better signal-to-noise ratio the next Detections and is typical of the methods of sequencing through the synthesis. The repeal The reversible termination can be done in a separate step or for example, the step of removing the mark coincide.

Der Vorteil des Einsatzes der Nuk-Makromoleküle besteht darin, dass die Markierung eines geringen Anteils der Gesamtpopulation zur Detektion des Einbauereignisses ausreicht. Dies erlaubt mit wesentlich geringeren Mengen des Ausgangsmaterials die Sequezierungsreaktion durchzuführen. Die Verwendung von reversiblen Terminatoren mit einer Schutzgruppe an der 3'-Position und einer Base ohne Modifikation führt dazu, dass das nach der Entferung der blockierenden Gruppe in der Nukleinsäurekette verbleibende Nukleotid keine weiteren Modifikationen trägt und somit als natürliches Substrat von Polymersen gut akzeptiert wird.Of the The advantage of using the nuc macromolecules is that the Labeling of a small proportion of the total population for detection of the installation event is sufficient. This allows with much lower Quantities of the starting material to perform the Seqeqierungsreaktion. The Use of reversible terminators with a protecting group the 3'-position and a base without modification leads to that after the Removal of the blocking group in the nucleic acid chain remaining nucleotide carries no further modifications and thus as natural Substrate of polymers is well accepted.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahren, werden folgende Schritte durchgeführt:

  • a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen Nukleinsäureketten
  • b) Hybridisierung von sequenzspezifischen Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen
  • c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerse nach Aspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt.
  • d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen
  • e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen
  • f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen
  • g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (c) bis (g),
In a further embodiment of the method, the following steps are carried out:
  • a) Provision of at least one population of single-stranded nucleic acid chains
  • b) hybridization of sequence-specific primers to these nucleic acid chains, wherein NSK primer complexes capable of extension are produced
  • c) Incubation of at least one type of nuc-macromolecule according to aspects 1 to 25 together with a type of the polymer according to aspect 31 with the NSK-primer complexes provided in steps a and b under conditions which allow the incorporation of complementary nuc-macromolecules , wherein each type of nuc-macromolecule has a characteristic of their mark.
  • d) Removal of unincorporated nuc-macromolecules from the NSK primer complexes
  • e) detection of the signals of nuc-macromolecules incorporated into the NSK primer complexes
  • f) Removal of linker component and marker component from those into the NSK primer complexes built-in nuc macromolecules
  • g) washing the NSK primer complexes, optionally repeating steps (c) to (g),

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Einbaureaktion von NT-Makromolekülen gleichzeitig an einer Population unterschiedlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Nukleinsäuremoleküle in einer zufälligen Anordnung an die feste Phase gebunden sind (Tcherkassov WO 02088382). Bei diesem Verfahren werden Sequenzen von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen ermittelt. Die an der enzymatischen Reaktion teilnehmende Primer-Nukleinsäurekomplexe sind in einer Dichte fixiert, die die Detektion der Signale von einzelnen Nuk-Makromolekülen ermöglicht, die an ein einzelnes Nukleinsäure-Molekül gekoppelt sind, wobei die Dichte der fixierten Primer oder Nukleinsäuren wesentlich höher liegen kann. Beispielsweise beträgt die Dichte der an der Einbaureaktion teilnehmenden Primer-Nukleinsäurekomplexe von 1 Komplex auf 10μm2 bis 1 Komplex auf 100μm2, von 1 Komplex auf 100μm2 bis 1 Komplex auf 1000μm2, von 1 Komplex auf 1000μm2 bis 1 Komplex auf 10.000μm2.In a further embodiment of the method, the incorporation reaction of NT macromolecules takes place simultaneously on a population of different nucleic acid molecules fixed on the solid phase, these nucleic acid molecules being bound to the solid phase in a random arrangement (Tcherkassov WO 02088382). In this method, sequences of individual nucleic acid chain molecules are determined. The primer-nucleic acid complexes participating in the enzymatic reaction are fixed at a density that allows the detection of signals from single nuc-macromolecules coupled to a single nucleic acid molecule, wherein the density of the fixed primers or nucleic acids may be substantially higher. For example, the density of the primer nucleic acid complexes participating in the incorporation reaction is from 1 complex to 10 μm 2 to 1 complex per 100 μm 2 , from 1 complex to 100 μm 2 to 1 complex to 1000 μm 2 , from 1 complex to 1000 μm 2 to 1 complex to 10,000 μm 2 .

Beispiele der Fixierung der Nukleinsäuren an die feste Phase mit einer Auflösung, die Analysen an einzelnen Molekülen erlaubt sind in WO0157248, US Pat. 2003064398, US Pat.2003013101 und WO 02088382 dargestellt. Eine passende Detektionsapparatur ist in der Anmeldung WO 03031947 beschrieben.Examples the fixation of the nucleic acids to the solid phase with a resolution, the analyzes to individual molecules are allowed in WO0157248, US Pat. 2003064398, US Pat.2003013101 and WO 02088382. A suitable detection device is described in the application WO 03031947.

Die Zahl der parallel zu analysierenden einzelnen Nukleinsäuremoleküle liegt beispielsweise zwischen 1000 und 100.000, 10.000 bis 1.000.000, 100.000 bis 10.000.000 Moleküle. Wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker- Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion von der Nuk- Komponente abgetrennt wird..The Number of individual nucleic acid molecules to be analyzed in parallel for example, between 1000 and 100,000, 10,000 to 1,000,000, 100,000 to 10,000,000 molecules. Where the marker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule during the incorporation reaction or is separated from the nuc-component after the incorporation reaction.

Dieses Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) schließt folgende Schritte ein, man:

  • – Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man
  • – die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man
  • – eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk-Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Makromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,
wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den Nuk-Makromolekülen bestimmt.This method for parallel sequence analysis of nucleic acid sequences (nucleic acid chains, NSKs) includes the following steps:
  • Generates fragments (NSKFs) of single-stranded NSKs with a length of about 50 to 1000 nucleotides, which can represent overlapping partial sequences of an overall sequence;
  • The NSKFs bind in a random array using a single or multiple different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface, the density of the surface-built NSKF primer complexes providing optical detection of the signals from single incorporated nuclides -Macromolecules allows, one
  • - performs a cyclic assembly reaction of the complementary strand of NSKFs using one or more polymerases by a) adding to the surface bound NSKF primer complexes a solution containing one or more polymerases and one to four nuc macromolecules, which have a labeled with fluorescent dyes marker component, wherein the simultaneous use of at least two nuc-macromolecules each of the marker component fluorescent dyes are selected so that the nuc-macromolecules used can be distinguished by measuring different fluorescence signals from each other, the Nuc-macromolecules are structurally modified so that the polymerase after incorporation of such a nuc-macromolecule in a growing complementary strand is not able to incorporate another nuc-macromolecule in the same strand, wherein the linker component with the marker component cleavable are b) the stationary phase obtained in step a) is incubated under conditions suitable for extending the complementary strands, the complementary strands being each extended by one nuc-macromolecule, and c) the stationary phase obtained in step b) Washing conditions that are suitable for the removal of non-complementary nucleated macromolecules, d) the individual nucleated macromolecules incorporated in complementary strands by measuring the signal characteristic of each fluorescent dye while simultaneously determining the relative position of the individual Determining fluorescence signals on the reaction surface, one e) to generate unlabelled (NTs or) NSKFs, the linker component and the marker component of the attached to the complementary strand nuc-components cleaved, one f) the stationary phase obtained in step e) under conditions washes that to remove the marker component e are suitable, the steps a) to f) may be repeated several times,
whereby the relative position of individual NSKF primer complexes on the reaction surface and the sequence of these NSKFs are determined by specific assignment of the fluorescence signals to the nuc macromolecules detected in step d) in successive cycles at the respective positions.

Anwendung von Nukleinsäuereketten, die Nuk-Makromoleküle einschließen.Application of nucleic acid chains, the nuc macromolecules lock in.

Nach dem Einbau eines Nuk-Makromolekül an das 3'-Ende der Nukleinsäure behalten die nun ihrerseits modifizierten Nukleinsäureketten überraschenderweise die Fähigkeit zur Kopplung weiterer Nukleotide an die 3'-Hydroxylgruppe durch Polymerasen, s. Beispiel 34C. Dies bedeutet, dass nicht nur die Nuk-Komponente in den Nuk-Makromolekülen sondern auch die mit diesen Nuk-Makromolekülen modifizierten Nukleinsäureketten für die Enzyme zugängig bleiben können und in unterschiedlichen Bereichen der Biotechnologie eine Anwendung finden. Nicht nur am 3'-Ende mit Nuk-Makromolekülen modifizierte Nukleinsäureketten, sondern Nukleinsäureketten, die am 5'-Ende oder im inneren Bereich des Nukleinsäurepolymers eines oder mehrere Nuk-Makromoleküle als Monomere einschließen, behalten ihre Substrateigenschaften für Polymerasen, Exonukleasen und Ligasen. Beispiele für die Anwendungen von mit Nuk-Makromolekülen modifizierten Oligonucleotiden sind dem Fachmann bekannt, z.B. in den Primer-Extension-Reaktionen, Real Time PCR oder Ligase-Reaktionen.To the incorporation of a nuc macromolecule to the 3'-end of the nucleic acid surprisingly retain the now modified nucleic acid chains the ability for the coupling of further nucleotides to the 3'-hydroxyl group by polymerases, s. Example 34C. This means that not only the nuk component in the nuc macromolecules but also the nucleic acid chains modified with these nuc-macromolecules for the Enzymes accessible can stay and application in different areas of biotechnology Find. Not only at the 3'-end modified with nuc macromolecules Nucleic acid chains, but nucleic acid chains, at the 5'-end or in the inner region of the nucleic acid polymer one or more nuc macromolecules as monomers lock in, retain their substrate properties for polymerases, exonucleases and ligases. examples for the applications of modified with nuc-macromolecules Oligonucleotides are known to those skilled in the art, e.g. in the primer extension reactions, Real time PCR or ligase reactions.

Wahl der Enzyme:Choice of enzymes:

Nukleotide spielen als Monomere eine zentrale Rolle in unterschiedlichen Stoffwechselvorgängen, beispielsweise bei der Speicherung und Übertragung der genetischen Information in der Zelle ("Genes V" B. Lewin, 1994). Auch sind Nukleotide als Energieträger der Zelle bekannt (ATP, UTP), oder Signalvemittler (Messenger, GTP) der intrazellulären Signalvermittlung ("Biochemie und Pathobiochemie", G. Löffler, 2003). Aus diesem Grund werden Nukleotide und ihre Analoga als Therapeutika und Diagnostika eingesetzt.nucleotides play as monomers a central role in different metabolic processes, for example during storage and transmission genetic information in the cell ("Genes V" B. Lewin, 1994). They are also nucleotides as an energy source the cell known (ATP, UTP), or Signalvemittler (Messenger, GTP) the intracellular Signaling ("Biochemistry and Pathobiochemistry ", G. Löffler, 2003). Because of this, nucleotides and their analogs become therapeutics and diagnostics used.

Gekoppelt in Nukleinsäurepolymere (Nukleinsäureketten) stellen die Nukleotid-Monomere die Basis für die Informationsspeicherung in den lebenden Organismen dar.coupled in nucleic acid polymers (Nucleic acid chain) represent the nucleotide monomers the basis for the storage of information in living organisms.

Nuk-Makromoleküle haben das Potenzial, in unterschiedlichen Bereichen der Biotechnologie eine Anwendung zu finden.Have nuc-macromolecules the potential in different areas of biotechnology to find an application.

Die Möglichkeit einer Kopplung der Nukleotide an ein Makromolekül unter Beibehaltung der Substrateigenschaften der Nukleotide eröffnet viele Wege auch für eine gezielte Adressierung der modifizierten Nukleotiden innerhalb eines Organismus oder einer Zelle, so dass Nuk-Makromoleküle ein neues grundsätzliches Model für Nukleotid-Prodrugs darstellen.The possibility a coupling of the nucleotides to a macromolecule while maintaining the substrate properties the nucleotides opened many ways too Targeted addressing of the modified nucleotides within of an organism or a cell so that nuc macromolecules are a new one basic model for nucleotide prodrugs represent.

Als Enzyme können beispielsweise unterschiedliche Sorten von Polymerasen verwendet werden ("DNA Replication", Kornberg, 2. Ed. 1992), im einzelnen DNA-abhängige DNA-Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen, DNA-abhängige RNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen. Dabei können sowohl thermostabile als auch thermolabile Polymerasen verwendet werden, wie beispielsweise Klenow-Polymerase oder Taq-Polymerase. Andere Beispiele für mögliche Polymerasen findet ein Fachmann in der hier zitierten Literatur. Ein weiteres Beispiel für Enzyme stellen Transferasen, wie Terminale Deoxynucleotidyltransferase ("Molecular Cloning", Maniatis, 3. Ed. 2001), dar. Auch andere Enzyme und Proteine (beispielsweise Kinasen, Membranrezeptoren) die Nukleotide als Substrate), Energiequelle, Cofaktoren oder als Messenger-Substanzen akzeptieren können verwendet werden.When Enzymes can For example, different types of polymerases used ("DNA Replication", Kornberg, 2nd Ed. 1992), in particular DNA-dependent DNA polymerases, RNA-dependent DNA polymerases, DNA-dependent RNA polymerases and RNA-dependent RNA polymerases. It can used both thermostable and thermolabile polymerases be such as Klenow polymerase or Taq polymerase. Other examples of possible Polymerases will be understood by one of ordinary skill in the literature cited herein. Another example of Enzymes make transferases, such as terminal deoxynucleotidyltransferase ("Molecular Cloning", Maniatis, 3rd ed. 2001). Other enzymes and proteins (for example kinases, Membrane receptors) the nucleotides as substrates), energy source, Cofactors or accepting as messenger substances can be used become.

Enzyme unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, modifizierte Nukleotide als Substrate zu akzeptieren. Einem Fachmann sollte es naheliegend erscheinen, dass verschiedene funktionelle Tests eingesetzt werden müssen, um bestimmte Eigenschaften von Nukleotiden zu untersuchen und anzuwenden. Beispiele für unterschiedliche Testabläufe für die Markierung von Nukleinsäuren sind in H. Held et al. Nucleic Acid Research 2002, V. 30, S. 3857, M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, M. Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta 1994, V.77, S. 586 , B. Canard et al. PNAS 1995, V. 92, S. 10859 , Canard US Pat. 5798210, J. Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perkin 1994, 1994, 211 und auch in anderen hier zitierten Patenten und Publikationen angegeben.enzymes differ in their ability to accept modified nucleotides as substrates. A specialist It should be obvious that different functional Tests have to be used to study and apply certain properties of nucleotides. examples for different test procedures for the Labeling of nucleic acids are described in H. Held et al. Nucleic Acid Research 2002, V. 30, p. 3857, M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259, M. Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta 1994, V.77, p. 586, B. Canard et al. PNAS 1995, V. 92, p. 10859, Canard US Pat. 5798210, J. Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perkin 1994, 1994, 211 and also in others cited herein patents and publications.

Die passenden Kombinationen zwischen Polymerasen und modifizierten Nukleotiden können für den jeweiligen Zweck entsprechend gewählt werden. Beispiele für den Einbau von Nuk-Makromolekülen in die Primer sind in Beispiel 34 angegeben. Die angegebenen Beispiele dienen nicht zur Einschränkung der Verwendungsmöglichkeit von Nuk-Makromolekülen, sondern sollten dem Fachmann den Unterschied in Eigenschaften der Nuk-Makromoleküle zu den konventionellen modifizierten NT darstellen.The appropriate combinations between polymerases and modified nucleotides can for the respective Purpose selected accordingly become. examples for the incorporation of nuc macromolecules in the primers are given in Example 34. The examples given are not intended to be limiting the possibility of use of nuc macromolecules, but should give the expert the difference in properties of Nuc-macromolecules represent to the conventional modified NT.

Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenprodukte können auch in der konventionellen chemischen Oligonucleotidsynthese verwendet werden, beispielsweise in einer Festphasensynthese (Giegrich, "Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese", 1997, Beier, "Neue Strategien zum Aufbau von RNA- und DNA-Oligonucleotiden", 1996), dabei trägt die Nuk-Komponente der Nuk-Makromoleküle entsprechende Modifikationen, die eine chemische Kopplung an die Nukleinsäurekette erlaubt, wie beispielsweise in Herrlein, "Synthese von modifizierten Nukleotiden, Nukleotiden und Oligonukleotiden", 1993, Gugler, "Aufbau und Anwendung von Systemen zur vereinfachten chemo-enzymatischen Synthese von Oligonukletid-Hybridisierungssonden", 1993, Schmidt, "Neue Methoden zur Synthese und Isolierung langkettiger Oligonucleotide", 1991, Bühler, "Neue photolabile Schutzgruppen für die Oligonucleotidsynthese", 2000, Bretzger, "Wege zur präparativen Oligonucleotidsynthese" 1991, Stengele, "Automatisierte Oligonucleotidsynthese unter Verwendung [beta]-eliminierbare Schutzgruppen", 1991).Nuc-macromolecules or their intermediates can also be used in conventional chemical oligonucleotide synthesis, for example in solid-phase synthesis (Giegrich, "Neue pho Tolabile Protecting Groups for Light-Controlled Oligonucleotide Synthesis ", 1997, Beier," New Strategies for the Construction of RNA and DNA Oligonucleotides ", 1996), while the nuc-component of nuc-macromolecules carries appropriate modifications that allow chemical coupling to the nucleic acid chain as in, for example, Herrlein, "Synthesis of Modified Nucleotides, Nucleotides, and Oligonucleotides," 1993, Gugler, "Construction and Application of Systems for Simplified Chemo-enzymatic Synthesis of Oligonucleotide Hybridization Probes," 1993, Schmidt, "New Methods for Synthesis and Isolation long-chain oligonucleotides ", 1991, Buehler," New Photolabile Protecting Groups for Oligonucleotide Synthesis ", 2000, Bretzger," Pathways for Preparative Oligonucleotide Synthesis "1991, Stengele," Automated Oligonucleotide Synthesis Using [beta] -eliminable Protecting Groups ", 1991).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur schnellen Reinigung der von markierten Nukleotiden direkt vor ihrem Einsatz in die Markierungsreaktion.One Another aspect of the present invention is a method for fast purification of labeled nucleotides right in front of her Use in the labeling reaction.

Verfahren zur Sequenzierung einzelner Moleküle (z.B. Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Kartalov WO02072892) benötigen markierte Nukleotide in einem sehr sauberen Zustand, weil Verunreinigungen einer markierten Nukleotidpräparation mit nicht markierten Nukleotiden einen Sequenzfehler verursachen können. Aus diesem Grund ist es wichtig, dass die markierten Nukleotide möglichst frei von nicht markierten Nukleotiden sind. Viele Nukleotidmodifikationen, die in solchen Verfahren eingesetzt werden, haben eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382) method for sequencing single molecules (e.g., Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Kartalov WO02072892) require marked Nucleotides in a very clean condition because of impurities a labeled nucleotide preparation cause a sequence error with unlabeled nucleotides can. For this reason, it is important that the labeled nucleotides preferably are free of unlabeled nucleotides. Many nucleotide modifications, used in such processes have one or more under mild conditions cleavable group (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382)

Während der Lagerung können solche Nukeotide zu einem Teil zerfallen und stellen die Quelle für Nukleotidanaloga ohne Markierung dar, die beim Einbau in die Nukleinsäure zu einem Sequenzfehler führen würden.During the Storage can such nukeotides decay into a part and represent the source for nucleotide analogues without marking, which when incorporated into the nucleic acid to a Sequence error lead would.

Dieses Problem führt dazu, dass eine Reinigung direkt vor dem Einsatz markierter Nukletide durchgeführt werden muß. Eine Standardreinigung für modifizierten Nukleotide ist beispielsweise eine HPLC-Reinigung mit Wasser-Methanol-Gradient. Nach einer solchen Reinigung muß die Fraktion mit modifizierten Nukleotiden aufgearbeitet werden, beispielsweise durch Lyophilisation. Eine solche Reinigung stellt eine aufwendige Prozedur dar.This Problem leads To do that, clean it just before using labeled nuclides carried out must become. A standard cleaning for modified nucleotides is, for example, an HPLC purification with water-methanol gradient. After such cleaning, the fraction be worked up with modified nucleotides, for example by lyophilization. Such a cleaning is a complicated procedure represents.

Nuk-Makromoleküle können erfindungsgemäß direkt vor dem Gebrauch durch eine Ultrafiltration von geringsten Verunreinigungen befreit werden.Nuc-macromolecules can according to the invention directly before use by ultrafiltration of least contaminants be freed.

Es werden Filter mit einer Porengröße ausgewählt, die für Nukleotide ohne Marker-Anteile frei passierbar sind. Die mit einem makromolekularen Marker modifizierten Nukleotide können aber durch den Filter nicht durchgehen. Durch eine solche Reinigung gelingt es in kurzer Zeit Nuk-Makromoleküle in einem sehr sauberen Zustand zu erhalten.It are selected filters with a pore size, the for nucleotides without marker shares are freely passable. Those modified with a macromolecular marker Nucleotides can but do not go through the filter. By such a cleaning In a short time, it is possible to obtain nuk macromolecules in a very clean state to obtain.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von modifizierten Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase zusammen mit den Nuk-Makromolekülen in den enzymatischen Reaktionen, wobei die SH-Gruppe des Cysteins des Klenow-Fragments Exo-minus der DNA-Polymerase chemisch modifiziert ist.One Another aspect of the invention is the use of modified Klenow fragment Exo-minus the DNA polymerase together with the nuc macromolecules in the enzymatic reactions, wherein the SH group of the cysteine of the Klenow fragment exo-minus the DNA polymerase is chemically modified.

Diese Modifizierung ist vorzugsweise eine kovalente Modifizierung. Beispiele für eine solche Modifizierung stellt eine Alkylierung an der SH-Gruppe dar, z.B. mit alpha-Halogen-Acetyl-Derivate, wie beispielsweise Iodacetamid und seinen Derivaten, Iodacetat und seinen Derivaten, oder mit N-Maleimid-Derivaten, weitere selektive SH-Gruppen Reagenten sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc. beschrieben. Diese Modifizierung kann auch durch einen Fluoreszenzfarbstoff erfolgen. Aktivierte Fluoreszenzfarbstoffe, die selektiv mit SH-Gruppen reagieren, sind kommerziell erhältlich, z.B. von Molecular Probes Inc.These Modification is preferably a covalent modification. Examples for one such modification represents alkylation on the SH group, e.g. with alpha-halogen acetyl derivatives, such as iodoacetamide and its derivatives, iodoacetate and its derivatives, or with N-maleimide derivatives, more selective SH groups Reagents are in "Chemistry of protein conjugation and crosslinking "Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc. described. This modification can also be done by a fluorescent dye. activated Fluorescent dyes that react selectively with SH groups are commercial available, e.g. from Molecular Probes Inc.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine selektive Modifikation des Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase an SH-Gruppe des Cysteins. Beispiel für die Herstellung eines solchen Klenow-Fragments Exo-minus der DNA-Polymerase ist unter Beispiel 43 angegeben.In a preferred embodiment The invention provides a selective modification of the Klenow fragment Exo-minus of DNA polymerase on SH group of cysteine. example for the Preparation of such a Klenow fragment exo-minus the DNA polymerase is given under Example 43.

In einer anderen Ausführungsform können auch andere Modifikationen an der DNA-Polymerase vorgenommen werden, wie beispielsweise Kopplungen an Amino-Gruppen der DNA-Polymerase.In another embodiment can also other modifications to the DNA polymerase are made, such as Couplings to amino groups of the DNA polymerase.

Das an dem Cysten modifizierte Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase kann in einer Ausführungsform an stelle eines nicht modifizierten Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase zusammen mit Nuk-Makromolekülen in der enzymatischen Einbau-Reaktion eingesetzt werden.The cyst-modified Klenow fragment exo-minus of the DNA polymerase may, in one embodiment, be substituted with an unmodified Klenow fragment exo minus the DNA polymerase used with nuc macromolecules in the enzymatic incorporation reaction.

Allgemeine Hinweise für die Synthesen von Nuk-MakromolekülenGeneral notes for the syntheses of nuc macromolecules

Die erfindungsgemäßen Nuk-Makromoleküle können auf unterschiedliche Art und Weise synthetisiert werden. Die Reihenfolge der Kopplungsschritte kann variieren. Beispielsweise kann zunächst eine Linker-Komponente an die Nuk-Komponente gekoppelt werden, anschließend wird die Marker-Komponente gekoppelt.The Nuc-macromolecules according to the invention can be obtained different ways are synthesized. The chronological order The coupling steps can vary. For example, a first Linker component will be coupled to the Nuk component, then becomes coupled to the marker component.

Andererseits können ein oder mehrere Linker an die Marker-Komponente gekoppelt werden und anschließend der/die Nuk-Komponenten.on the other hand can one or more linkers are coupled to the marker component and subsequently the nuk component (s).

Die Kopplung zwischen einzelnen Komponenten der Nuk-Makromoleküle kann kovalent oder affin erfolgen. Wobei sowohl chemische als auch enzymatische Kopplung zur Verknüpfung einzelner Komponenten eingesetzt werden kann. Kopplungen an Amino- und Thiolgruppen dienen als Beispiele für kovalente Kopplungen (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, "The chemistry of the amino group" S. Patai, 1968, "The chemistry of the thiol group" S. Patai, 1974). Biotin-Streptavidin-Bindung oder Hybridisierung zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen stellen Beispiele für affine Kopplungen dar.The Coupling between individual components of nuc-macromolecules can covalent or affine. Both chemical and enzymatic Coupling to the link individual components can be used. Couplings to amino and thiol groups serve as examples of covalent couplings (Jameson, D., et al., Methods in Enzymology 1997, V. 278, p. 363-, "The chemistry of the amino group "S. Patai, 1968, "The chemistry of the thiol group "S. Patai, 1974). Biotin-streptavidin binding or hybridization between complementary Nucleic acid strands or Antigen-antibody interactions provide examples of affine couplings.

Die makromolekularen Marker bieten oft eine Vielfalt an Kopplungsmöglichkeiten. Ein makromolekularer Marker kann mehrere Kopplungsstellen für den Linker haben, beispielsweise mehrere Bindungsstellen für Biotin, wie es bei Streptavidin der Fall ist. Ein makromolekularer Marker kann auch mehrere Amino- bzw. Thiol-Gruppen aufweisen. Die Kern-Komponente des Markers kann mit unterschiedlicher Zahl von signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten modifiziert werden. Die genauen Verhältnisse zwischen Marker-Einheiten können variieren. Beispiele für die Modifikation von Polymeren mit Farbstoffen sind bekannt (Huff et al. US Pat. 5661040, D. Brigati US Pat. 4687732). Falls Nukleinsäuren als makromolekulare Marker eingesetzt werden, so können diese unterschiedliche Abschnitte zur Kopplung anderer Makromoleküle besitzen. An einen makromolekularen Marker können andere Makromoleküle gebunden werden, z.B. Enzyme.The Macromolecular markers often offer a variety of coupling possibilities. A macromolecular marker can have multiple coupling sites for the linker have, for example, multiple binding sites for biotin, as in streptavidin the case is. A macromolecular marker can also contain several amino or thiol groups. The core component of the marker can with different numbers of signaling or signal-transmitting Units are modified. The exact relationships between marker units can vary. examples for the modification of polymers with dyes are known (Huff et al. US Pat. No. 5,662,040, D. Brigati US Pat. No. 4687732). If nucleic acids than macromolecular markers are used, these may be different Possess sections for coupling other macromolecules. To a macromolecular Markers can other macromolecules be bound, e.g. Enzymes.

Ein Nuk-Makromolekül kann makromolekulare Marker mit unterschiedlichen Detektionseigenschaften tragen, beispielsweise kann ein Nuk-Makromolekül sowohl mehrere Farbstoffmoleküle als auch Stellen zur affinen Bindung (z.B. durch Hybridisierung) weiterer Makromoleküle tragen.One Nuc-macromolecule can carry macromolecular markers with different detection properties, For example, a nuc-macromolecule can have both multiple dye molecules as well Sites for affinity binding (e.g., by hybridization) to others macromolecules wear.

Die Kopplung zwischen der Nuk-Komponenten und der Linker-Komponenten erfolgt vorzugsweise kovalent. Viele Beispiele für eine kovalente Kopplung an Nukleotide oder deren Analoga sind bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Dabei kann die Kopplung beispielsweise an Phosphat, Amino-, Hydroxy- oder Mercaptogruppen erfolgen.The Coupling between the nuc-component and the linker components is preferably covalent. Many examples of covalent coupling Nucleotides or their analogs are known (Jameson et al., Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). there For example, the coupling may be to phosphate, amino, hydroxy or Mercapto groups take place.

Oft kann die Linker-Komponente in mehreren Schritten aufgebaut werden. Beispielsweise wird im ersten Schritt ein kurzer Linker mit einer reaktiven Gruppe an das Nukleotid oder Nucleosid angekoppelt, z.B. Propargylamin-Linker an Pyrimidine Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Ward et al. US Pat 4711955, Engelhardt et al. US Pat 5241060 Taing et al. US Pat 6811979, Odedra WO 0192284, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Phosphoroamidite (Glen Research Laboratories, http://www.glenres.com/, Trilink Biotechnologies, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990), Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002. Einige Verbindungen kann man käuflich erwerben, z.B. bei Trilink Biotechnologies, Eurogentec, Jena Bioscience.Often, the linker component can be built in several steps. For example, in the first step, a short linker having a reactive group is coupled to the nucleotide or nucleoside, eg, propargylamine linker to pyrimidines Hobbs et al. US Patent 5,047,519 or other linkers, eg, Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US Pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028 , Hanna M. Method in Enzymology 1996, v.274, p.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 p.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30, 3857, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, p. 391, Short US Pat. 6579704, Ward et al. US Pat. No. 4,711,955, Engelhardt et al. US Pat 5241060 Taing et al. US Pat 6811979, Odedra WO 0192284, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, p. 586, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691 , Phosphoroamidites (Glen Research Laboratories, http://www.glenres.com/, Trilink Biotechnologies, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990 ), Dissertation "Synthesis of base-modified nucleoside triphosphates and their enzymatic polymerization to functionalized DNA", Oliver Thum, Bonn 2002. Some compounds can be purchased, eg from Trilink Biotechnologies, Eurogentec, Jena Bioscience.

Diese kurzen Linker dienen als Kopplungseinheiten L oder deren Teile, und sind ein Bestandteil der Linker-Komponente im fertigen Nuk-Makromolekül.These short linkers serve as coupling units L or their parts, and are part of the linker component in the final nuc-macromolecule.

Im zweiten Schritt kann die Kopplung des Nukleotides oder Nucleosides mit einem kurzen Linker an das Linker-Polymer erfolgen. Polymere mit reaktiven funktionellen Gruppen können käuflich erworben werden (Fluka).In the second step, the coupling of the nucleotide or nucleoside with a short linker the linker polymer take place. Polymers with reactive functional groups can be purchased (Fluka).

Nach der Kopplung des Nukleotids an das Polymer kann nun die Marker-Komponente als letzter Schritt gekoppelt werden.To the coupling of the nucleotide to the polymer can now be the marker component be paired as a last step.

Oft ist es vorteilhaft an ein Nukleosid einen kurzen Linker zu koppeln, dann, falls erforderlich, dieses modifizierte Nucleosid in ein Nucleosid-Triphosphat umzuwandeln (Synthesen von Triphosphaten können beispielsweise in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Faulstich et al. DE 4418691 , T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol 29, 4525-4588 (1988) oder Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).It is often advantageous to couple a short linker to a nucleoside, then, if necessary, to convert this modified nucleoside into a nucleoside triphosphate (syntheses of triphosphates can be found, for example, in the following references: Held et al., Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, p. 391, Faulstich et al. DE 4418691 , T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol. 29, 4525-4588 (1988) or dissertation "Synthesis of base-modified nucleoside triphosphates and their enzymatic polymerization to functionalized DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).

Weitere Modifikationen können am Nukleosid-Triphosphat-Analog durchgeführt werden.Further Modifications can be performed on the nucleoside triphosphate analog.

Vorstufen für modifizierte Nukleoside können sind beispielsweise bei Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) oder bei Chembiotech (Münster, Deutschland) kommerziel erhältlich.precursors for modified Nucleosides can are for example available from Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) or at Chembiotech (Münster, Germany) commercial.

Die Kopplung zwischen der Linker-Komponente und der Marker-Komponente kann beispielsweise zwischen reaktiven Gruppen an der Linker-Komponente und der Marker-Komponente erfolgen. Reagenzien für solche Kopplungen sind in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, ausführlich dargestellt. Die Verfahren zur Handhabung und zur Kopplung von mehreren Makromolekülen sind für unterschiedliche Typen von Makromolekülen auch in oben genannten Patenten dargestellt. Weitere Beispiele für Kopplungen an die und zwischen den Makromolekülen sind für Proteine in "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive dyes in protein an enzyme technology", D. Clonis, 1987, ISBN 0-333-34500-2; "Biophysical labeling methods in molecular biology" G. Likhtenshtein, 1993, 1993, ISBN 0-521-43132-8; "Techniques in protein modification" R. Lundblad, 1995, ISBN 0-8493-2606-0; "Chemical reagents for protein modification" R. Lundblad, 1991, ISBN 0-8493-5097-2; für Nukleinsäuren in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5, für andere Polymerarten "Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X beschrieben.The Coupling between the linker component and the marker component for example, between reactive groups on the linker component and the marker component. Reagents for such couplings are described in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking ", Wang, 1993, ISBN 0-8493-5886-8, in detail. The proceedings for handling and coupling of several macromolecules for different Types of macromolecules also shown in the above-mentioned patents. Further examples of couplings to and between the macromolecules are for proteins in "bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2;" Reactive dyes in protein to enzyme technology ", D. Clonis, 1987, ISBN 0-333-34500-2; "Biophysical labeling methods in molecular biology "G. Likhtenshtein, 1993, 1993, ISBN 0-521-43132-8; "Techniques in protein modification "R. Lundblad, 1995, ISBN 0-8493-2606-0; "Chemical Reacts for Protein Modification" R. Lundblad, 1991, ISBN 0-8493-5097-2; For nucleic acids in "Molecular Cloning", J. Sambrook, vol 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5, for other types of polymers "Macromolecules, Chemical Structure and Synthesis ", Volume 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X.

Da die Marker-Komponente meistens viele Kopplungsstellen aufweist, können weitere Modifikationen an kompletten Nuk-Makromolekülen vorgenommen werden. Beispielsweise können überschüssige Amino-Gruppen abgeblockt werden oder durch weiterführende Modifikationen verändert werden.There the marker component usually has many coupling sites, can made further modifications to complete nuc-macromolecules become. For example, excess amino groups be blocked or modified by further modifications.

Je nach Einsatzgebiet und Reaktionsbedingungen, unter denen Nuk-Makromoleküle verwendet werden, können unterschiedliche chemische Bindungsarten zwischen einzelnen Teilen der Makromoleküle von Vorteil sein. So eignen sich beispielsweise bei Verfahren mit Schritten mit höheren Temperaturen, wie z.B. bei Hybridisierung oder PCR, Nuk-Makromoleküle, die kovalente, thermostabile Bindungen zwischen einzelnen Teilen haben.ever by field of application and reaction conditions under which nuc macromolecules are used can, can different chemical bonding modes between individual parts the macromolecules be beneficial. So are suitable for example in methods with Steps with higher Temperatures, e.g. in hybridization or PCR, nuc macromolecules, the have covalent, thermostable bonds between individual parts.

Nachfolgend sollen beispielhaft einige Möglichkeiten zur Synthese von Nuk-Makromolekülen dargestellt werden. Diese dienen nicht zur Einschränkung der möglichen Synthesewege und nicht zur Einschränkung der möglichen Nuk-Makromolekülstrukturen.following should exemplify some possibilities for the synthesis of nuc macromolecules being represented. These are not intended to limit the potential Synthetic pathways and not to limit the possible nuc-macromolecular structures.

In folgenden Beispielen werden Nuk-Makromoleküle mit Polyethylenglycol (PEG) als Linker-Komponente angegeben. Beispiele für die Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in "Poly(ethylene glycol) : chemistry and biological applications", 1997 beschrieben. Im einzelnen können sehr unterschiedliche reaktive Gruppen zur Kopplung eingesetzt werden: N-succinimidyl carbonate ( US Pat.. 5,281,698, US Pat. 5,468,478), Amine (Buckmann et al. Makromol. Chem. V.182, S.1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. 7. V.19, S. 1177 (1983)), succinimidyl propionate und succinimidyl butanoate (Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; U.S. Pat. No. 5,672,662), Succinimidyl succinate (Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. v. 7, S.175 (1984), Joppich et al., Makromol. Chem. 1v. 80, S.1381 (1979), Benzotriazole carbonate (U.S. Pat. No. 5,650,234), Glycidylether (Pitha et al. Eur. J. Biochem. v. 94, S.11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. v.13, S. 354 (1991), Oxycarbonylimidazole (Beauchamp, et al., Anal. Biochem. v.131, S. 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release v.1, S.251 (1985)), p-nitrophenyl carbonate (Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., v.11, S.141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., v.27, S.45 (1991)), Aldehyde (Harris et al.). Polym. Sci. Chem. Ed. v.22, S. 341 (1984), US. Pat. 5824784, US. Pat. 5252714), Maleimide (Goodson et al. Bio/Technology v.8, S. 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins v.2, S.29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. v.22, 5.2417 (1992)), Orthopyridyl-disulfide (Woghiren, et al. Bioconj. Chem. v. 4, S. 314 (1993)), Acrylol (Sawhney et al., Macromolecules, v. 26, S.581 (1993)), Vinylsulfone (U.S. Pat. No. 5,900,461). Weitere Beispiele für Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in Roberts et al. Adv. Drug Deliv. Reviews v. 54, S. 459 (2002), US Pat. 2003124086, US Pat. 2003143185, WO 03037385, US Pat. 6541543, US Pat. 2003158333, WO 0126692 zu finden.In the following examples nuc-macromolecules are given with polyethylene glycol (PEG) as the linker component. Examples of the coupling of PEG to other molecules are described in "Poly (ethylene glycol): chemistry and biological applications", 1997. In particular, very different reactive groups can be used for coupling: N-succinimidyl carbonate (US Pat. No. 5,281,698, US Pat. 5,468,478), amines (Buckmann et al., Makromol, Chem., V.182, p.1379 (1981), Zalipsky et al., Eur. Polym., V.19: 1177 (1983)), succinimidyl propionate and succinimidyl butanoate (Olson et al., Poly (ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, DC, 1997; U.S. Pat No. 5,672,662), succinimidyl succinate (Abuchowski et al., Cancer Biochem., Biophys., V. 7, p.175 (1984), Joppich et al., Makromol 1, 80, p.1381 (1979), Benzotriazole carbonate (US Pat. No. 5,650,234), glycidyl ether (Pitha et al., Eur. J. Biochem., V. 94, p.11 (1979), Elling et al. Biochem., V. 13, p.354 (1991), Oxycarbonylimidazoles (Beauchamp, et al., Anal. Biochem., V.131, p.25 (1983), Tondelli et al., J. Controlled Release, Vol .1, p.251 (1985)), p-nitrophenyl carbonate (Veronese, et al., Appl. Biochem Biotec h., v.11, p.141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., V.27, p.45 (1991)), aldehydes (Harris et al.). Polym. Sci. Chem. Ed. v.22, p. 341 (1984), US. Pat. 5824784, US. Pat. 5252714), maleimides (Goodson et al., Bio / Techno logy v. 8, p. 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins v.2, p.29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. v.22, 5.2417 (1992)), orthopyridyl disulfides (Woghiren, et al., Bioconj. Chem. v. 4, p.314 (1993)), acrylol (Sawhney et al., Macromolecules, v. 26, p. 581 (1993)), vinylsulfones (US Patent No. 5,900,461). Further examples of couplings of PEG to other molecules are described in Roberts et al. Adv. Drug Deliv. Reviews v. 54, p. 459 (2002), US Pat. No. 2003124086, US Pat. No. 2003143185, WO03037385, US Pat. No. 6541543, US Pat. No. 2003158333, WO0126692.

Andere ähnliche Polymere können in ähnlicher Art gekoppelt werden. Beispiele für solche Polymere stellen andere Poly(Alkylenglykole), Copolymere aus Ethylenglykol und Propyleneglykol, Poly(olefiniische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(saccharide), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly(Acrylsäure), Poly(Vinylalkohol).Other similar Polymers can in a similar way Art be coupled. Examples of such polymers are others Poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, Poly (olefinic alcohols), poly (vinylpyrrolidones), poly (hydroxyalkylmethacrylamides), Poly (hydroxyalkyl methacrylates), poly (saccharides), poly (x-hydroxy acids), poly (acrylic acid), poly (vinyl alcohol).

Die Aufreinigung der Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle erfolgt mit konventionellen Mitteln der Nukleotidchemie: beispielsweise mit Kieselgel-Chromatographie in einem Wasser-Ethanol-Gemisch, Ionenaustausch-Chromatographie in einem Salz-Gradienten und Reverse-Phase-Chromatographie in einem Wasser-Methanol-Gradienten. Für die Nukleotid-Aufreinigung optimierte Chromatographie-Säulen werden z.B. von der Firma Sigma-Aldrich angeboten.The Purification of the nuc-components of the nuc-macromolecules takes place by conventional means of nucleotide chemistry: for example with silica gel chromatography in a water-ethanol mixture, ion exchange chromatography in a salt gradient and reverse phase chromatography in a water-methanol gradient. For the Nucleotide purification optimized chromatography columns are e.g. offered by Sigma-Aldrich.

Die Aufreinigung von makromolekularen Linker-Komponenten und Marker-Komponenten kann durch Ultrafiltration, Gel-Elektrophorese, Gelfiltration und Dialyse erfolgen, siehe "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.The Purification of macromolecular linker components and marker components can be performed by ultrafiltration, gel electrophoresis, gel filtration and dialysis take place, see "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.

Die Masse der Nuk-Makromoleküle unterscheidet sich wesentlich von der Masse der Nukleotide. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, bei den Endreinigungsschritten die Ultrafiltration einzusetzen. Da für die Nuk-Makromoleküle nur eine durchschnittliche Masse bereichnet wird, eignet sich Ultrafiltration auch als analytische Methode zu Trennung von Syntheseprodukten.The Mass of nuc macromolecules differs significantly from the mass of nucleotides. For this Reason, it is advantageous in the final purification steps ultrafiltration use. Therefore the nuc macromolecules only an average mass is enriched, ultrafiltration is suitable also as an analytical method for the separation of synthesis products.

Zur Charakterisierung der Nuk-Makromoleküle können unterschiedliche Methoden der makromolekularen Chemie angewendet werden, z.B. UV-Vis-Spektroskopie, Fluoreszenzmessung, Massenspektroskopie, Fraktionierung, Größenausschlußchromatographie, Ultrazentrifugation und elektrophoretische Techniken, wie IEF, denaturierende und nicht denaturierende Gel-Elektrophorese ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).to Characterization of nuc macromolecules can be different methods macromolecular chemistry, e.g. UV-Vis spectroscopy, Fluorescence measurement, mass spectroscopy, fractionation, size exclusion chromatography, Ultracentrifugation and electrophoretic techniques, such as IEF, denaturing and non-denaturing gel electrophoresis ("Macromolecules, Chemical Structure and Syntheses", Vol. 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences ", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).

Die Messung von freien SH-Gruppen in einer Substanz erfolgte mit Ellmans Reagenz (5,5'-Dithiobis (2-Nitrobenzolsäure), Riddles et al. Method in Enzym. 1983, V.91, S. 49.The Measurement of free SH groups in a substance was done with Ellmans Reagent (5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid), Riddles et al. Method in enzyme. 1983, V.91, p. 49.

Modifizierte NukleinsäurekettenModified nucleic acid chains

In einer Ausführung der Erfindung schließen Nukleinsäureketten Nuk-Komponenten der Nuk-Makromoleküle als Einheiten der Kette ein.In an execution to close the invention nucleic acid chains Nuc components of the nuc macromolecules as units of the chain one.

Synthese modifizierter NukleinsäurekettenSynthesis of modified nucleic acid chains

Als Monomer einer Polymer-Kette können Nuk-Makromoleküle in unterschiedlicher Art und Weise in die Kette eingebaut bzw. integriert werden. Generell kann man zwischen den chemischen und enzymatischen Schritten unterscheiden. Im weiteren werden einige Beispiele der Synthese-Strategien vorgestellt.When Monomer of a polymer chain can Nuc-macromolecules installed or integrated into the chain in different ways become. Generally, one can choose between the chemical and enzymatic steps differ. Below are some examples of the synthesis strategies presented.

Chemischer Einbau:Chemical installation:

Beim chemischen Einbau kann ein komplettes Nuk-Makromolekül (d.h. Nul-Linker-Marker) oder auch seine Bestandteile, z.B. nur Nuk-Komponente, oder Nuk-Linker-Komponente, in die Reaktion eingesetzt werden. Beispielsweise wird zunächst die Nuk-Komponente in die Nukleinsäurekette nach Regeln der Oligonukleotid-Synthese (MWG-Biotech, TriLink Biotechnologies, Glen Research Laboratories,, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990) eingebaut, wobei ein Monomer der Kette eine zur Modifikation geeignete, geschützte reaktive Gruppe, beispielsweise eine geschützte Amino- oder Merkapto-Gruppe trägt. Nach der Entfernung der Schutzgruppe kann die Linker-Komponente und die Marker-Komponente an das Oligonukleotid gekoppelt werden.At the chemical incorporation may include a complete nuc-macromolecule (i.e. Nul-linker-marker) or also its constituents, e.g. only Nuk component, or Nuk linker component, in the Reaction can be used. For example, first the Nuk component in the nucleic acid chain according to the rules of oligonucleotide synthesis (MWG-Biotech, TriLink Biotechnologies, Glen Research Laboratories, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotides synthesis: a practical approach "IRL Press, 1990), with one monomer of the chain one for modification suitable, protected reactive group, for example a protected amino or mercapto group wearing. After removal of the protecting group, the linker component and the marker component coupled to the oligonucleotide.

Die Reinigung kann beispielsweise durch die Ultrafiltration oder durch Elektrophrese erfolgen.The Cleaning can be done, for example, by ultrafiltration or by Electrophresis done.

Enzymatischer Einbau:Enzymatic incorporation:

Ähnlich zum chemischen Einbau kann auch beim enzymatischen Einbau ein komplettes Nuk-Makromolekül (d.h. Nul-Linker-Marker) oder auch seine Bestandteile, z.B. nur Nuk-Komponente, oder Nuk-Linker-Komponente, in die Reaktion eingesetzt werden. Beispielsweise werden Nuk-Komponenten, die eine zur Kopplung einer Linker-Komponente geeignete reaktive Gruppe tragen, als Triphosphate in einer matrizenabhängigen polymerase-gesteuerten Reaktion in die Nukleinsäurekette eingebaut. Anschließen kann eine Linker- und Marker-Kopplung erfolgen.Similar to chemical incorporation may also be complete in enzymatic incorporation Nuc-macromolecule (i.e., nul-linker markers) or its components, e.g. just Nuk component, or nuc-linker component, used in the reaction become. For example, nuk components become one for coupling a linker component carry suitable reactive group, as triphosphates in a template-dependent polymerase-controlled Reaction in the nucleic acid chain built-in. Connect a linker and marker coupling can take place.

In einer anderen Ausführungsform kann ein komplettes Nuk-Makromolekül in die Nukleinsäurekette eingebaut werden (s. Beispiel 34).In another embodiment For example, a complete nuc-macromolecule can be incorporated into the nucleic acid chain (see example 34).

Modifizierte Nukleinsäureketten schließen Ribonucleinsäuren und auch Desoxy-Ribonukleinsäuren ein.modified nucleic acid chains shut down ribonucleic acids and also deoxy-ribonucleic acids.

Der Anteil der Nuk-Makromoleküle und der nicht modifizierten Monomeren der Nukleinsäurekette liegt vorzugsweise im Verhältnis zwischen 1:5 und 1:20, 1:20 und 1:100, 1:50 und 1:1000, 1:500 und 1:10000. Auch mehrere Nuk-Makromoleküle können pro eine Nukleinsäurekette eingebaut sein. In einer Ausführungsform schließt eine Nukleinsäurekette nur ein Nuk-Makromolekül ein, in einer weiteren Ausführungsform liegt die Zahl der Nuk-Makromoleküle pro eine Nukleinsäurekette in folgenden Bereichen: 2 bis 20, 5 bis 50, 10 bis 100.Of the Proportion of nuc macromolecules and the unmodified monomers of the nucleic acid chain is preferably in proportion between 1: 5 and 1:20, 1:20 and 1: 100, 1:50 and 1: 1000, 1: 500 and 1: 10,000. Several nuc macromolecules can also be used per one nucleic acid chain be installed. In one embodiment, a nucleic acid chain only one nuc macromolecule a, in a further embodiment is the number of nuc-macromolecules per one nucleic acid chain in the following ranges: 2 to 20, 5 to 50, 10 to 100.

In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 5'-Ende der Nukleinsäurekette integriert.In an embodiment is a nuc macromolecule to the 5'-end of the nucleic acid chain integrated.

In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül an das 3'-Ende der Nukleinsäurekette integriert.In an embodiment is a nuc macromolecule to the 3'-end of the nucleic acid chain integrated.

In einer Ausführungsform ist ein Nuk-Makromolekül im Inneren der Nukleinsäurekette integriert, wobei der Abstand vom am nächsten liegenden Kettenende in folgenden Bereichen liegt (Zahl der Monomeren der Kette bis zum nächsten Kettenende): 1 bis 2, 2 bis 4, 4 bis 8, 8 bis 15, 15 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 500.In an embodiment is a nuc macromolecule inside the nucleic acid chain integrated, with the distance from the nearest chain end in the following ranges (number of monomers of the chain up to next Chain end): 1 to 2, 2 to 4, 4 to 8, 8 to 15, 15 to 30, 30 to 100, 100 to 500.

3. Synthesen von modifizierten Nukleotiden3. Syntheses of modified nucleotides

Trennungsmethoden:Separation Methods:

  • Dünnschichtchromatographie, DC:thin layer chromatography, DC:
  • Analytisch: „DC-Alufolien 20 × 20 cm Kieselgel 60 F 254" (VWR), beschichtet mit Fluoreszenzindikator. Visualisierung erfolgt mittels UV-Licht. Laufmittel Ethanol-Wasser-Gemisch (70:30) (Laufmittel, LM 1) oder Ethanol-Wasser-Gemisch (90:10) (LM 2).Analytical: "DC aluminum foils 20 × 20 cm silica gel 60 F 254 "(VWR), coated with fluorescent indicator. Visualization is done by means of UV light. Eluent ethanol-water mixture (70:30) (eluent, LM 1) or ethanol-water mixture (90:10) (LM 2).
  • Präparativ: Kieselgel-Glasplatten mit Sammelschicht (VWR). LM 1 oder LM 2.synthetically: Silica gel glass plates with collecting layer (VWR). LM 1 or LM 2.

Umkehrphasen-Chromatographie (RP-Chromatographie), RP-18: C-18 Material (Fluka), Säulenvolumen 10ml, Wasser-Methanol-Gradient. Fraktionen je 1ml wurden gesammelt und mit UV-Vis-Spektrometer analysiert. Fraktionen mit ähnlichen Spektren wurden vereinigt und lyophilisiert.Reverse phase chromatography (RP-chromatography), RP-18: C-18 material (Fluka), column volume 10ml, water-methanol gradient. Fractions per 1ml were collected and analyzed with UV-Vis spectrometer. Fractions with similar Spectra were pooled and lyophilized.

HPLC-Säulen mit ähnlichem Material können verwendet werden (Sigma).HPLC columns with similar Material can be used (Sigma).

Ionenaustausch-ChromatographieIon exchange chromatography

DEAE-Zellulose (VWR), Gradient NH4HCO3 20mmol/l-1mmol/l, Fraktionen wurden unter UV/Vis-Kontrolle gesammelt und auf Grundlage gleicher Spektren vereinigt.DEAE-cellulose (VWR), gradient NH 4 HCO 3 20mmol / l-1mmol / l, fractions were collected under UV / Vis control and pooled on the same spectra.

Die Affinitätsisolierung von Nuk-Makromolekülen kann beispielsweise eingesetzt werden, wenn Nuk-Makromoleküle Oligonukleotide Bestandteil der Marker-Komponente sind. Durch die Hybridisierung an eine komplementäre, auf einer festen Phase fixierte Nukleinsäure können sie selektiv isoliert werden.The affinity isolation of nuc macromolecules can be used, for example, when nuc-macromolecules oligonucleotides Component of the marker component are. By hybridizing to a complementary, up A solid phase-fixed nucleic acid can be isolated selectively become.

Die Bestimmung der Ausbeuten für farbstoffmarkierte Produkte erfolgte an UV-Vis-Spektrometer.The Determination of the yields for Dye-labeled products were made on UV-Vis spectrometers.

Die Vollständigkeit der Kopplung an Strepavidin wurde durch eine Kontrolltitration mit einem Biotin-Farbstoff (Biotin-4-Fluoreszein, Sigma) 100μmol/l in 50mmol/l Borat, pH 8, 5 min bei RT durchgeführt. Bei einer kompletten Besetzung von Biotin-Bindungsstellen an Strepavidin während der Synthese erfolgt keine Markierung von Streptavidin. Bei einer nicht ausreichenden Reaktion erfolgt eine Bindung an SA. Analyse mit UV-Vis.The completeness of the coupling to strepavidin was carried out by a control titration with a biotin dye (biotin-4-fluorescein, Sigma) 100 μmol / l in 50 mmol / l borate, pH 8, 5 min at RT. In a complete occupation of biotin-binding sites on strepavidin during the synthesis is no labeling of streptavidin. If the reaction is insufficient, binding to SA occurs. Analysis with UV-Vis.

Material:Material:

Diamono PEG 10.000 (Diamino-Polyethylenglycol 10.000, Sigma), dUTP-AA (dUTP-Allylamine, Jena-Bioscience), dCTP-PA (dCTP-Propargyl-Amin, Jena Bioscience), dATP-PA (7-(3-Amino-1-propynyl)-2' deoxy-7-deazaadenosin-5'-Triphosphat) (Auftragssynthese von JenaBioscience), dGTP-PA (7-(3-Amino-1-propynyl)-2' deoxy-7-deazaguanosin-5'-Triphosphat, (Auftragssynthese von JenaBioscience), TTP (Thymidin-Triphosphat, kann auch als dTTP gekennzeichnet werden, Sigma), 3'-Amino-TTP (3'-Amino-3'-deoxy-Thymidin-Triphosphat, Trilink Biotechnologies), PDTP (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure, Fluka), 7-(3-Phthalimido-1-propynyl)-2'-desoxy-7-deazaguanosin und 7-(3-Phthalimido-1-propynyl)-2'-desoxy-7-deazaadenosin (Chembiotech), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyldithio)-propionsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), Cy3- NHS (Cy3- N-hydroxysuccinimidyl-ester, Amerscham Bioscience), MEA ( Mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-Dithio-DL-threit, Sigma), CA (Cystamine, Sigma), TCEP – (Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, Sigma), DTBP (3,3'-Dithio-Bis-Propionsäure, Fluka), Biotin-NHS (Biotin-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma). J-Ac (Iodoacetat, Sigma), Iodacetamid (Sigma), TEAE (Tris-(2-Aminoethyl)amine, Sigma), Maleimido-ES-NHS (Maleimido-Essigsäure-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), EDA (Ethylendiamin, Sigma), CDI (1,1'-Carbonyldiimidazol, Sigma), EDC N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylenecarbodiimide (Sigma), NH2-PEG-Biotin (30 Atome), Sigma), PAS 100 kDa (Polyacrylsäure, 100 kDa, Aldrich), NHS-PEG-Maleimid, 3.400 Da, Biotin-PEG-NHS, 5.000 Da, Fmoc-PEG-NHS, 3.400 Da, mPEG-SPA 5.000 Da, mPEG-SPA 20.000 Da (Nektar), Diamin-PEG, 6.000 Da (Fluka), Fmoc-NH-(PEG)2-COOH (20 Atome), (Novabiochem, Merck Biosciences, Darmstadt), Fmoc-Amino-PEG-acid (n=11) (BioVectra) Aminodextran 70000, Aminodextran 500000 (Molecular Probes), 3'-Biotin-dT31 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 31 Thymidinmonophosphaten, mit einem Biotin-Molekül am 3'-Ende (MWG-Biotech), 3'-SH-Oligo-dT30 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 30 Thymidinmonophosphaten, mit einer Merkaptogruppe am 3'-Ende (MWG-Biotech), 3'-Amino-Oligo-dT31-5'-Cy3 ein Oligonucleotid mit einer Sequenz aus 31 Thymidinmonophosphaten, mit einer über einen Linker aus 6 Atomen am 3'-Ende gekoppelten Amino-Gruppe und einem Cy3-Farbstoff, gekoppelt am 5'-Ende (MWG-Biotech,), SA ( Streptavidin, Roche,), SA-Cy2 ( mit Cy2-Farbstoff modifiziertes Streptavidin, Amersham Bioscience). QDot (Qdot 605 Streptavidin Conjugat, Quantum Dot). Poly-Lysin 1000-2000 (Poly-L-lysin-hydrobromid 1000-2000 Da, Fluka), Poly-Lysin 10.000-20.000 (Poly-L-lysin-hydrobromid 10.000-20.000 Da, Fluka). Lieferanten und Firmenverzeichnis: Aldrich – s. Sigma Amersham – Amerscham Bioscience, Freiburg, Deutschland Chembiotech – Chembiotech, Münster, Deutschland Fluka – s. Sigma Jena-Bioscience – Jena-Bioscience, Jena, Deutschland Molecular Probes – Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande MWG – MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland, Nektar – Nektar Molecular engineering, früher Shearwater Corporation, Huntsville, AL, USA Quantum Dot – Quantum Dot Hayward, CA, USA Roche – Roche, Mannheim, Deutschland Sigma – Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland, Trilink – Trilink Biotechnologies Inc. San Diego, CA, USA, Diamono PEG 10,000 (diamino-polyethylene glycol 10,000, Sigma), dUTP-AA (dUTP-allylamine, Jena-Bioscience), dCTP-PA (dCTP-propargyl-amine, Jena Bioscience), dATP-PA (7- (3-amino) 1-propynyl) -2 'deoxy-7-deazaadenosine-5'-triphosphate) (custom synthesis from Jena Bioscience), dGTP-PA (7- (3-amino-1-propynyl) -2' deoxy-7-deazaguanosine-5 ' Triphosphate, (custom synthesis of Jena Bioscience), TTP (thymidine triphosphate, may also be referred to as dTTP, Sigma), 3'-amino-TTP (3'-amino-3'-deoxy-thymidine triphosphate, Trilink Biotechnologies), PDTP (3- (2-pyridinyl-dithio) -propionic acid, Fluka), 7- (3-phthalimido-1-propynyl) -2'-deoxy-7-deazaguanosine and 7- (3-phthalimido-1-propynyl) - 2'-deoxy-7-deazaadenosine (Chembiotech), PDTP-NHS (3- (2-pyridinyldithio) -propionic acid N-hydroxysuccinimidyl ester, Sigma), Cy3-NHS (Cy3-N-hydroxysuccinimidyl ester, Amerscham Bioscience) , MEA (mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-dithio-DL-threit, Sigma), CA (cystamine, Sigma), TCEP - (tris (2-carboxyethyl) phosphines, Sigma), DTBP (3,3'-dithio-bis-propionic acid, Fluka), biotin-NHS (biotin-N-hydroxysuccinimidyl ester, Sigma). J-Ac (iodoacetate, Sigma), iodoacetamide (Sigma), TEAE (tris (2-aminoethyl) amine, Sigma), maleimido-ES-NHS (maleimido-acetic acid N-hydroxysuccinimidyl ester, Sigma), EDA (ethylene diamine , Sigma), CDI (1,1'-carbonyldiimidazole, Sigma), EDC N- (3-dimethylaminopropyl) -N-ethyleneecarbodiimide (Sigma), NH2-PEG-biotin (30 atoms), Sigma), PAS 100 kDa (polyacrylic acid , 100 kDa, Aldrich), NHS-PEG-maleimide, 3,400 Da, biotin-PEG-NHS, 5,000 Da, Fmoc-PEG-NHS, 3,400 Da, mPEG-SPA 5,000 Da, mPEG-SPA 20,000 Da (nectar), diamine -PEG, 6,000 Da (Fluka), Fmoc-NH- (PEG) 2 -COOH (20 atoms), (Novabiochem, Merck Biosciences, Darmstadt), Fmoc-amino-PEG-acid (n = 11) (BioVectra) aminodextran 70000 , Aminodextran 500000 (Molecular Probes), 3'-biotin-dT31 an oligonucleotide having a sequence of 31 thymidine monophosphates, with a biotin molecule at the 3'-end (MWG-Biotech), 3'-SH-oligo-dT30 an oligonucleotide with a sequence of 30 thymidine monophosphates, with a mercapto group at the 3'-end (MWG-Biotech), 3'-amino-oligo-dT31 -5'-Cy3 an oligonucleotide having a sequence of 31 thymidine monophosphates, with an amino group coupled via a linker of 6 atoms at the 3'-end and a Cy3 dye, coupled at the 5'-end (MWG-Biotech,), SA (streptavidin, Roche), SA-Cy2 (Cy2 dye-modified streptavidin, Amersham Bioscience). QDot (Qdot 605 streptavidin conjugate, quantum dot). Poly-lysine 1000-2000 (poly-L-lysine hydrobromide 1000-2000 Da, Fluka), poly-lysine 10,000-20,000 (poly-L-lysine hydrobromide 10,000-20,000 Da, Fluka). Suppliers and company directory: Aldrich - s. Sigma Amersham - Amerscham Bioscience, Freiburg, Germany Chembiotech - Chembiotech, Munster, Germany Fluka - s. Sigma Jena Bioscience - Jena-Bioscience, Jena, Germany Molecular probes - Molecular Probes Europe, Leiden, Netherlands MWG - MWG-Biotech, Ebersberg near Munich, Germany, nectar - Nectar Molecular Engineering, formerly Shearwater Corporation, Huntsville, AL, USA Quantum Dot - Quantum Dot Hayward, CA, USA Roche - Roche, Mannheim, Germany Sigma - Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Germany, Trilink Trilink Biotechnologies Inc. of San Diego, CA, USA

Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).solvent were, if necessary, Absolutely used (Fluka) or dried by standard methods. For solvent mixtures the specified mixing ratios refer to the used Volumes (v / v).

Synthese einzelner Komponenten:Synthesis of individual components:

Beispiel 1:Example 1:

dUTP-AA-PDTP, 10A.dUTP-AA PDTP, 10A ,

20 mg dUTP-AA wurden in 1ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 8.5 eingestellt. Zur dUTP-AA – Lösung wurde PDTP-NHS 60mg in 0.5 ml Methanol, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Reaktion wurde 2 h bei 40°C durchgeführt.
DC-Kontrolle: dUTP-AA-PDTP (in LM 1 Rf 0.45).20 mg of dUTP-AA were dissolved in 1 ml of water and the pH was adjusted to 8.5 with NaOH. To the dUTP-AA solution was added PDTP-NHS 60 mg in 0.5 ml of methanol, dropwise with stirring. Reaction was carried out at 40 ° C for 2 hours.
DC control: dUTP-AA-PDTP (in LM 1 Rf 0.45).

Die Trennung von überschüssigem PDTP-NHS und PDTP erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Das Produkt, dUTP-AA-PDTP, und dUTP-AA bleiben auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.The Separation of excess PDTP-NHS and PDTP was preparative Silica gel plates, LM 2. The product, dUTP-AA-PDTP, and dUTP-AA stay on the starting line. The nucleotides were from the plate eluted with water and concentrated.

Dieses dUTP-Analog trägt nun eine Disulfid-Bindung, die in einer Thiolaustauschreaktion mit anderen Thiolen reagieren kann und eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung darstellt.This dUTP analog carries now a disulfide bond, which in a Thiolaustauschreaktion with other thiols can react and one under mild conditions represents a fissile connection.

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 7-Deaza-Aminopropargyl-Desoxy-Guanosin-Triphosphat und 7-Deaza-Aminopropargyl Desoxy-Adenosin-triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino-Allyl-Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Cytidin-Triphosphate können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14.This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 7-deaza-aminopropargyl-deoxy-guanosine triphosphate and 7-deaza-aminopropargyl-deoxy-adenosine triphosphate, 5-amino-propargyl-deoxy-uridine triphosphates, 5-amino-allyl-deoxy-uridine Triphosphates, 5-amino-propargyl-deoxy-cytidine triphosphates can also be modified as indicated above. Both ribonucleotides, 2'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 ,

Beispiel 2:Example 2:

dCTP-PA-PDTP, 10B dCTP-PA PDTP, 10B

Die Synthese wurde wie für dUTP-AA-PDTP, Beispiel 1, beschrieben durchgeführt.The Synthesis was as for dUTP-AA-PDTP, Example 1 described.

Beispiel 3:Example 3:

dUTP-AA-Propionat-SH, 15 dUTP-AA-propionate-SH, 15

Zu 200μl 40mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP wurde 1ml TCEP-Lösung 250mmol/l, pH 8, eingestellt mit NaOH, zugegeben und 10 min bei RT gerührt.To 200μl 40mmol / l solution of dUTP-AA-PDTP was added 1ml TCEP solution 250mmol / l, pH 8, with NaOH, added and stirred for 10 min at RT.

Die Trennung der Nukleotide von anderen Reagenzien erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.The Separation of the nucleotides from other reagents was preparative Silica gel plates, LM 2nd product, dUTP-AA-propionate-SH, remains on the starting line. The nucleotides were eluted from the plate with water and concentrated.

Dieses dUTP-Analog trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.This dUTP analog carries a reactive SH group which can be easily modified, for example, under Training of disulfide bond.

Beispiel 4:Example 4:

Biotin-PEG-Ethyl-SH, 16 Biotin-PEG-ethyl-SH, 16

Zu 200μl wässriger CA-Lösung (100mmol/l), pH 8.5, eingestellt mit NaOH, wurden 10 mg Biotin-PEG-NHS zugegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde 200 μl TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 3.000 MWCO (Molecular weight cut off) von anderen Reagenzien getrennt. Ausbeute 35%.To 200μl aqueous CA solution (100mmol / L), pH 8.5, adjusted with NaOH, was added 10 mg biotin-PEG-NHS added and at 40 ° C Stirred for 18 hours. Subsequently was 200 μl TCEP-solution (0.5 mol / l), pH 8.0, added and stirred for a further 10 min at RT. The Product was purified by ultrafiltration to 3,000 MWCO (Molecular Weight cut off) from other reagents. Yield 35%.

Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.The Product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example under formation of disulfide bond.

Ein weiteres Beispiel für die Einführung von SS-Bindung bzw. Kopplung einer Mercaptogruppe an PEG ist hier angeführt:
10 mg Amino-PFG-Biotin (30 Atome) wurden in 280 μl 50 mM Borat-Puffer aufgelöst und pH auf 9 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden zwei Äquivalente von PDTP-NHS in 100 μl DMF zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde der Überschuß von PDTP-NHS mit Überschuß von NH4NCO3 abreagiert. Das Produkt stellt folgende Verbidung dar: Biotin-PEG-PDTP dar.Another example of the introduction of SS bond or coupling of a mercapto group PEG is listed here:
10 mg of amino-PFG-biotin (30 atoms) were dissolved in 280 μl of 50 mM borate buffer and adjusted to pH 9. To this solution was added two equivalents of PDTP-NHS in 100 μl of DMF. After 1 hour at RT, the excess of PDTP-NHS was reacted with excess NH 4 NCO 3 . The product represents the following compound: biotin-PEG-PDTP.

Dieses Produkt kann durch Thiolaustausch an ein weiteres Molekül gekoppelt werden. Durch Spaltung der SS-Bindung kann eine freie SH-Gruppe bereitgestellt werden.This Product can be coupled to another molecule by thiol exchange become. By cleavage of the SS bond can be a free SH group to be provided.

Beispiel 5:Example 5:

Bis-Dithio-(Ethyl-PEG-Biotin),Bis-dithio (Ethyl-PEG-biotin),

Zu 1ml wässriger CA-Lösung (2mmol/l), pH 8.5 mit NaOH eingestellt, wurden 100mg Biotin-PEG-NHS zugegeben und bei RT 18 Stunden gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 10.000 MWCO von anderen Reagenzien getrennt und lyophilisiert. Ausbeute 13%.To 1ml aqueous CA solution (2mmol / L), pH 8.5 adjusted with NaOH, 100mg biotin-PEG-NHS was added and stirred at RT for 18 hours. The product was ultrafiltered to 10,000 MWCO by others Reagents separated and lyophilized. Yield 13%.

Das Produkt besitzt eine Disulfid-Verbindung, die an Thiolaustauschreaktionen teilnehmen kann.The Product has a disulfide compound attached to thiol exchange reactions can participate.

Beispiel 6:Example 6:

MEA-Cy3, 17 MEA-Cy3, 17

Zu 1ml wässriger CA-Lösung, 200mmol/l, pH 8.5 eingestellt mit NaOH, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3-Farbstoffs 10 mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Anschließend wurde 1ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0 eingestellt mit NaOH, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient) und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 93%, UV-Vis.To 1ml aqueous CA solution, 200mmol / L, pH 8.5 adjusted with NaOH, Cy3-NHS was added until the concentration of the Cy3 dye was 10 mmol / l. The reaction was stirred at RT for 10 min. Subsequently was 1ml TCEP solution (0.5 mol / L), pH 8.0 adjusted with NaOH, added and more Stirred for 10 min at RT. The product was separated on RP-18 (water-methanol gradient) and concentrated to 0.5 ml, yield 93%, UV-Vis.

Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.The Product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example under formation of disulfide bond.

Beispiel 7:Example 7:

Cy3-TEAE, 18 Cy3 TEAE, 18

Zu 1ml wässriger TEAE-Lösung, 300mmol/l, pH 8.5 mit NaOH eingestellt, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3-Farbstoffs 5mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde auf RP-18 getrennt und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 82%, UV-Vis.To 1ml aqueous TEAE solution 300mmol / L, pH 8.5 adjusted with NaOH, Cy3-NHS was added until the concentration of the Cy3 dye was 5mmol / L. The reaction was stirred at RT for 10 min. The product was separated on RP-18 and concentrated to 0.5 ml, yield 82%, UV-Vis.

Das Produkt hat zwei Aminogruppen, die leicht mit anderen Reagentien modifiziert werden können und neue Funktionalitäten an den Farbstoff koppeln können.The Product has two amino groups that easily react with other reagents can be modified and new functionalities can couple to the dye.

Beispiel 8:Example 8:

Cy3-TEAE-Propionat-SH, 19 Cy3 TEAE propionate-SH, 19

Zu 300μl wässriger Cy3-TEAE, 2mmol/l, pH 7.5, wurden langsam 30μl einer frisch bereiteten methanolischen Lösung von PDTP-NHS, 30mmol/l, zugegeben. Der Ablauf der Reaktion wurde durch DC, LM 1, kontrolliert. Als Reaktionsprodukte erscheinen auf DC Substanzen (LM 1) mit Rf. 0.55 (Cy3-TEAE-PDTP) und 0.95 (Cy3-TEAE-(PDTP)2). Nach Ablauf von 1 h wurde die Reaktion gestoppt und die Produkte auf DC mit LM 1 getrennt. Die Substanz mit Rf. 0.55 wurde isoliert, eingeengt und in 200μl Wasser aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde 0.1ml TCEP-Lösung (0.5mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt, Cy3-TEAE-Propionat-SH, wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient) und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 26%, UV-Vis.To 300μl aqueous Cy3-TEAE, 2mmol / L, pH 7.5, was slowly added to 30μl of a freshly prepared methanolic solution of PDTP-NHS, 30mmol / L, added. The course of the reaction was controlled by TLC, LM 1. As reaction products appear on DC substances (LM 1) with Rf. 0.55 (Cy3-TEAE-PDTP) and 0.95 (Cy3-TEAE- (PDTP) 2). After 1 h, the reaction was stopped and the products on DC with LM 1 separated. The substance with Rf. 0.55 was isolated, concentrated and in 200μl Dissolved water. To this solution was 0.1ml TCEP solution (0.5 mol / l), pH 8.0, added and stirred for a further 10 min at RT. The Product, Cy3-TEAE-propionate-SH, was separated on RP-18 (water-methanol gradient) and concentrated to 0.5 ml, yield 26%, UV-Vis.

Das Produkt trägt einerseits eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung, andererseits eine Amino-Gruppe, die mit anderen Reagentien reagieren kann.The Product carries on the one hand, a reactive SH group, which are easily modified can, for example, to form disulfide bond, on the other hand an amino group, which can react with other reagents.

Beispiel 9:Example 9:

TEAE-(Cy3)2, 20 TEAE- (Cy3) 2, 20

Zu 1ml wässriger TEAE-Lösung, 2mmol/l, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3-Farbstoffs 4mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 10 min bei RT gerührt. Das Produkt (Rf. 0.45) wurde auf präparat. Kieselgel DC mit LM 1 von anderen Reaktionsprodukten getrennt, mit 50mM Borat-Puffer, pH 9, eluiert, danach auf RP-18 gesammelt und anschließend mit 50% Et-OH eluiert und auf 0.5ml eingeengt, Ausbeute 22%, UV-Vis.To 1ml aqueous TEAE solution 2mmol / L, Cy3-NHS was added until the concentration of the Cy3 dye 4mmol / l was. The reaction was stirred at RT for 10 min. The Product (Rf. 0.45) was on preparation. Silica gel DC with LM 1 separated from other reaction products, with 50mM borate buffer, pH 9, eluted, then collected on RP-18 and subsequently eluted with 50% Et-OH and concentrated to 0.5 ml, yield 22%, UV-Vis.

Beispiel 10, 21 Example 10 21

Poly-Lysin-(Cy3)n, n = 10-15, Poly-Lysin 10.000-20.000Poly-lysine (Cy3) n, n = 10-15, poly-lysine 10,000-20,000

Zu 1ml wässriger Poly-Lysin-Lösung, 1mmol/l, wurde Cy3-NHS zugegeben, bis die Konzentration des Cy3-Farbstoffs 18mmol/l betrug. Die Reaktion wurde 40 min bei RT gerührt. Die Trennung von modifiziertem Poly-lysin von Farbstoffresten erfolgte durch Ultrafiltration, 3000 MWCO. Bestimmung der durchschnittlichen Zahl Cy3-Moleküle erfolgte über UV-Vis-Spektrometer.To 1ml aqueous Poly-lysine solution, 1mmol / L, Cy3-NHS was added until the concentration of Cy3 dye 18mmol / l was. The reaction was stirred at RT for 40 min. The Separation of modified poly-lysine from dye residues took place by ultrafiltration, 3000 MWCO. Determination of the average number Cy3 molecules took place over UV-Vis spectrometer.

Poly-Lysin stellt ein Beispiel für ein Kern-Komponente dar, an die mehrere Marker-Einheiten, beispielsweise Farbsoffe gekoppelt werden können. In diesem Experiment wurde die Verteilung von Cy3-Molekülen in Poly-Lysin-Population rechnerisch ermittelt, aus den bekannten Größenunterschieden der Poly-Lysin-Moleküle und der mittleren ermittelten Zahl von Cy3-Moleküle.Poly-lysine provides an example for a core component to which several marker units, such as dyes can be coupled. In this experiment, the distribution of Cy3 molecules in poly-lysine population was calculated from the known size differences of the poly-lysine molecules and the mean determined number of Cy3 molecules.

Beispiel 11,Example 11

TEAE-(Cy3)2-PDTP und TEAE-(Cy3)2-Propionat-SH, 22:TEAE- (Cy3) 2-PDTP and TEAE- (Cy3) 2-propionate-SH, 22 :

Zu 200μl TEAE-(Cy3)2, 1mmol/l wurden 10mg, PDTP-NHS zugegeben und 1 Stunde bei RT gerührt. Der Reaktionsverlauf wurde durch DC, LM 1, kontrolliert. Nach 1 h wurde eine fast quantitative Umsetzung von TEAE-(Cy3)2 (Rf. 0.45) zu TEAE-(Cy3)2-PDTP, (Rf. 0.85) festgestellt. Der Ansatz wurde in zwei gleiche Teile geteilt.To 200 μl TEAE- (Cy3) 2, 1 mmol / l were added 10 mg, PDTP-NHS and stirred for 1 hour at RT. Of the Reaction course was controlled by TLC, LM 1. After 1 h was an almost quantitative conversion of TEAE- (Cy3) 2 (Rf. 0.45) to TEAE- (Cy3) 2-PDTP, (Rf. 0.85) detected. The batch was divided into two equal parts.

Das Produkt, TEAE-(Cy3)2-PDTP, aus dem ersten Teil wurde auf RP-18 getrennt und lyophilisiert. Ausbeute 82%, UV-Vis.The Product, TEAE- (Cy3) 2-PDTP, from the first part was separated on RP-18 and lyophilized. Yield 82%, UV Vis.

Das Produkt trägt eine Disulfidbindung, die leicht an einer Thiolaustauschreaktion teilnehmen kann und somit an andere Verbindungen gekoppelt werden kann.The Product carries a disulfide bond that is easily involved in a thiol exchange reaction participate and thus be linked to other connections can.

Zum zweiten Teil wurde 0.1ml TCEP-Lösung (0.5mol/l), pH 8.0, zum Ansatz zugegeben und noch 10 min bei RT gerührt. Das Produkt, TEAE-(Cy3)2-Propionat-SH, wurde auf RP-18 getrennt, Ausbeute 68%, UV-Vis.To the second part was 0.1ml TCEP solution (0.5 mol / l), pH 8.0, added to the batch and 10 min at RT touched. The product, TEAE- (Cy3) 2-propionate-SH, was separated on RP-18, Yield 68%, UV Vis.

Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.The Product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example under formation of disulfide bond.

Beispiel 12, 23 Example 12 23

(NS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, (n = 10-15, m 3-9, Poly-Lysin 10.000-20.000)(NS-propionate) m -polylysine- (Cy3) n, (n = 10-15, m 3-9, poly-lysine 10,000-20,000)

Zu 200μl Poly-Lysin-(Cy3)n, 1mmol/l wurden 10mg, PDTP-NHS zugegeben und 1 Stunde bei RT gerührt. Das Produkt, (PDTP)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, wurde durch Ultrafiltration von den PDTP-Resten abgetrennt und anschließend in 100μl Wasser gelöst. Danach wurde 0.1ml TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zum Ansatz zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt, (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, wurde mit 3.000 MWCO von den niedermolekularen Bestandteilen getrennt.To 200μl poly-lysine (Cy3) n, 1 mmol / l were added 10 mg, PDTP-NHS and stirred for 1 hour at RT. The Product, (PDTP) m-poly-lysine (Cy3) n, was purified by ultrafiltration separated from the PDTP residues and then dissolved in 100 .mu.l of water. Thereafter, 0.1 ml of TCEP solution (0.5 mol / l), pH 8.0, was added to the batch and stirred at RT for a further 10 min. The Product, (HS-propionate) m-poly-lysine (Cy3) n, was mixed with 3,000 MWCO separated from the low molecular weight components.

Das Produkt trägt mehrere reaktive SH-Gruppen, die leicht modifiziert werden können, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.The Product carries several reactive SH groups that can be easily modified, for example, below Training of disulfide bond.

Beispiel 13:Example 13:

TTP-3'-O-Propionat-SH, 24A,TTP-3'-O-propionate-SH, 24A .

Die Synthese von 3'-modifizierten Nukleotiden erfolgt nach Gottikh et al. Tetrahedron, 1970, v. 26, 4419-, Schäfer et al. Method in Enzymology, 1986, v. 126, S. 682-.The Synthesis of 3'-modified Nucleotides are according to Gottikh et al. Tetrahedron, 1970, v. 26, 4419-, shepherd et al. Method in Enzymology, 1986, v. 126, p. 682-.

DTBP, 210 mg, wurden in 1ml1 DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurde CDI 320mg zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 10μl Methanol zugegeben und nach weiteren 10 min wurden 100μl dieser Lösung, 1mol/l, zu 300μl wässriger 100mmol/l-Lösung von TTP, pH 8.5 eingestellt mit NaOH, zugegeben und ca. 4 h bei RT kräftig gerührt. Die Nukleotide wurden durch Präzipitation mit Ethanol isoliert und dann in 300μl Wasser gelöst. Anschließend wurde 200μl TCEP-Lösung (0.5mol/l), pH 8.0, zugegeben und nach 10 min bei RT erfolgt die wiederholte Präzipitation der Nukleotide. Die Trennung der modifizierten Nukleotide von den nicht modifizierten ist auf dieser Stufe nicht notwendig. Ausbeute 13%, UV-Vis.DTBP, 210 mg were dissolved in 1 ml of DMF. To this solution CDI was added 320 mg and stirred for 1 h at RT. Subsequently were 10μl of methanol After a further 10 minutes, 100 μl of this solution, 1 mol / l, were added to 300 μl of aqueous 100 mmol / l solution of TTP, pH 8.5 adjusted with NaOH, added and about 4 h at RT strong touched. The nucleotides were precipitated isolated with ethanol and then dissolved in 300μl of water. Subsequently was 200 μl TCEP solution (0.5 mol / l), pH 8.0, added and after 10 min at RT, the repeated precipitation the nucleotides. The separation of the modified nucleotides from the non modified is not necessary at this stage. Yield 13%, UV-Vis.

Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.The Product carries a reactive SH group that can be easily modified, for example under formation of disulfide bond.

Beispiel 14:Example 14:

TTP-3'-Amino-PDTP, 24B TTP-3'-amino-PDTP, 24B

Die Synthese erfolgte wie für dUTP-AA, Beispiel 1, beschrieben: Als Edukte wurden 3'-Amino-3'-Deoxy-TTP, 100μl, 10mmol/l Lösung, pH 8 und PDTP-NHS eingesetzt. Ausbeute 19%, UV-Vis.The Synthesis was as for dUTP-AA, Example 1 described: As starting materials were 3'-amino-3'-deoxy-TTP, 100μl, 10mmol / l Solution, pH 8 and PDTP-NHS used. Yield 19%, UV Vis.

Das Produkt trägt eine Disulfidbindung, die leicht an einer Thiolaustauschreaktion teilnehmen kann und somit an andere Verbindungen gekoppelt werden kann.The Product carries a disulfide bond that is easily involved in a thiol exchange reaction participate and thus be linked to other connections can.

Auch andere, am 3'-Ende mit einer Bindungsstelle, z.B. einem kurzen Linker, modifizierte Nukleotide können eingesetzt werden. Synthesen sind dargestellt beispielsweise in Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1994V.1, S. 211, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich DE 4418691 .Other, at the 3 'end with a binding site, such as a short linker, modified nucleotides can be used. Syntheses are shown, for example, in Metzker et al. Nucleic acid Research 1994, V.22, p. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Hovinen et al. J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1994V.1, p. 211, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, p. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, p. 363, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. No. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich DE 4418691 ,

Weitere Beispiele für basenmodifizierte Nukleotide, die als Nuk-Komponente verwendet werden können, sind in Balasubramanian WO 03048387 beschrieben. Noch weitere Beispiele für Nukleotid-Analoga sind in "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy", Cheson, 1997 angegeben. Ein Fachmann sollte erkennen, dass auch andere Nukleoside und Nukleotide verwendet werden können.Further examples for base-modified nucleotides used as nuc-component can, are described in Balasubramanian WO 03048387. Yet more examples for nucleotide analogs are in "nucleotides Analogous, "Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleosides and Nucleic Acid Chemistry ", Kısakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in cancer therapy ", Cheson, 1997. A professional should realize that too other nucleosides and nucleotides can be used.

Beispiele für Kopplung von Linker-Komponenten und Marker-Komponenten an Nuk-KomponentenExamples of coupling of linker components and marker components on nuc-components

Beispiel 15:Example 15:

dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, 25 dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, 25

Zu 100μl, 10mmol/l MEA-Cy3 in 50mM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50mM Borat, pH 9.5 zugegeben. Nach 1 Stunde wurde das dUTP-AA-SS-MEA-(Cy3) durch Dünnschicht-Chromatographie, LM 1, Rf. 0.6, von MEA-Cy3, Rf. 0.9, getrennt. Anschließend wurde dUTP-AA-SS-MEA-(Cy3) auf RP-18 von dUTP-AA-PDTP getrennt. Ausbeute 67%, UV-Vis.To 100μl, 10mmol / l MEA-Cy3 in 50mM borate, pH 9.5, was 50μl 30mmol / l dUTP-AA-PDTP in 50mM borate, pH 9.5 added. After 1 hour, the dUTP-AA-SS-MEA- (Cy3) was purified by thin layer chromatography, LM 1, Rf. 0.6, separated from MEA-Cy3, Rf. 0.9. Subsequently was dUTP-AA-SS-MEA- (Cy3) on RP-18 separated from dUTP-AA-PDTP. yield 67%, UV-Vis.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine niedermolekulare Marker-Funktionalität trägt. Es kann stellvertretend für konventionell modifizierte Nukleotide mit nur einem niedermolekularen Marker auftreten.It a compound was obtained which has a nucleotide functionality and a carries low molecular weight marker functionality. It can be representative for conventional modified nucleotides with only one small molecule marker occur.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase) als Substrat akzeptiert, s. Beispiel 34A.These Compound becomes polymerase (e.g., Klenow exo minus polymerase) accepted as substrate, s. Example 34A.

Beispiel 16:Example 16:

dUTP-AA-SS-TEAE-(Cy3)2, 26 dUTP-AA-SS-TEAE- (Cy3) 2, 26

dUTP-AA-SS-TEAE-(Cy3)2 wurde ähnlich wie dUTP-AA-SS-MEA-(Cy3), Beispiel 15, synthetisiert, dabei wurde TEAE-(Cy3)2-Propionat-SH anstatt von MEA-Cy3 verwendet. Ausbeuten 43%, UV-Vis.dUTP-AA-SS-TEAE- (Cy3) 2 became similar how dUTP-AA-SS-MEA- (Cy3), Example 15, was synthesized TEAE- (Cy3) 2-propionate-SH used instead of MEA-Cy3. Exploit 43%, UV-Vis.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und zwei niedermolekulare Marker-Funktionalitäten trägt. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation des Nukleotids führt zum Verlust der Substrateigenschaften.It a compound was obtained which has one nucleotide functionality and two low molecular weight marker functionalities. This connection is made by Polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase) as a substrate are not accepted. The modification of the nucleotide leads to the loss of the substrate properties.

Beispiel 17:Example 17:

dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3, 27 dUTP-AA-SS-propionate TEAE-Cy3, 27

dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3 wurde ähnlich wie dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, Beispiel 15, synthetisiert, dabei wurde Cy3-TEAE-Propionat-SH anstatt von MEA-Cy3 verwendet. Ausbeute 37%, UV-Vis.dUTP-AA-SS-propionate TEAE-Cy3 became similar how dUTP-AA-SS-MEA-Cy3, Example 15, was synthesized Cy3-TEAE propionate-SH used instead of MEA-Cy3. Yield 37%, UV-Vis.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und eine niedermolekulare Marker-Funktionalität. Der Linker an der Base hat eine freie Aminogruppe, die modifiziert werden kann. Das Nukleotid wird von Polymerasen als Substrat akzeptiert.These Carries connection a nucleotide functionality and a low molecular weight marker functionality. The linker at the base has a free amino group that can be modified. The nucleotide is accepted as a substrate by polymerases.

Beispiel 18:Example 18:

(dUTP-AA-SS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n(AA-dUTP-SS-propionate) m -polylysine- (Cy3) n

Edukte:starting materials:

dUTP-AA-PDTPdUTP-AA PDTP

(HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, n = 10-15, m 3-9, Poly-Lysin 10.000-20.000(HS-propionate) m -polylysine- (Cy3) n, n = 10-15, m 3-9, poly-lysine 10,000-20,000

Zu 50μl einer Lösung mit dUTP-AA-PDTP, 20mmol/l, in 50mM Borat-Puffer, pH 9.0, wurde 20μl (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, ca. Smmol/l, in Wasser, gegeben und 18 h bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration, 30.000 MWCO, gereinigt.To 50μl one solution with dUTP-AA-PDTP, 20mmol / L, in 50mM borate buffer, pH 9.0 20μl of (HS-propionate) m-poly-lysine (Cy3) n, about Smmol / l, in water, and stirred for 18 h at RT. The Product was purified by ultrafiltration, 30,000 MWCO.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten trägt.It a compound was obtained which has a nucleotide functionality and a carries macromolecular marker functionalities.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation des Nukleotids führt zum Verlust der Substrateigenschaften.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) are not accepted as a substrate. The modification of the nucleotide to the loss of substrate properties.

Beispiel 19:Example 19:

dUTP-AA-PEG-Biotin, 28 dUTP-AA-PEG-biotin, 28

Zu 100μl wässriger Lösung dUTP-AA, 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Biotin-PEG-NHS gegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-PEG-Biotin, mehrmals mit Wasser gewaschen.To 100μl aqueous solution dUTP-AA, 50mmol / L, pH 8.0, was given 10mg of Biotin-PEG-NHS and added 40 ° C 18 Hours stirred. Subsequently was the unreacted nucleotide by ultrafiltration, 3,000 MWCO, separated and the product of the reaction, the dUTP-AA-PEG-biotin, washed several times with water.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.These Carries connection a nucleotide functionality and a macromolecular linker. Biotin serves as a coupling unit T. To this coupling unit T can macromolecular structures are coupled, e.g. streptavidin without losing the substrate properties of these analogs. This nuc macromolecule serves as a substrate for Polymerases.

Biotin kann auch als eine niedermolekulare Marker-Einheit mit signalvermittelnden Funktion betrachtet werden, die an den langen Linker gekoppelt ist.biotin can also act as a low molecular weight marker unit with signal-mediating Function, which is coupled to the long linker.

Das Produkt der Reaktion ist eine Zwischenstufe eines Nuk-Makromoleküls. Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP (29) können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14.The product of the reaction is an intermediate of a nuc macromolecule. This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, 5-amino-propargyl-dUTP and 7-deaza-aminopropargyl-dATP ( 29 ) can also be modified as stated above. Both ribonucleotides, 2'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 ,

In einer ähnlichen Weise können auch andere Polymere, z.B. PEG-Derivate, als Linker gekoppelt werden. Ein Beispiel dafür stellt dATP-PA-PEG-NH2.In a similar manner, other polymers, eg, PEG derivatives, can also be coupled as linkers. An example of this is dATP-PA-PEG-NH 2 .

Zu 100μl wässriger Lösung 7-Deaza-7-Aminopropargyl-dATP (hergestellt aus 7-(3-Phthalimido-1-propynyl)-2'-desoxy-7-deazaadenosin von Jena Bioscience), 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Fmoc-PEG-NHS (Fmoc-geschützter NH2-PEG-NHS) gegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 11 erhöht und die Reaktionsmischung weitere 2 Stdunden bei RT gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das Produkt der Reaktion, das dATP-PA-PEG-NH2, mehrmals mit Wasser gewaschen.To 100 μl aqueous solution of 7-deaza-7-aminopropargyl-dATP (prepared from 7- (3-phthalimido-1-propynyl) -2'-deoxy-7-deazaadenosine from Jena Bioscience), 50 mmol / l, pH 8.0, was added 10 mg Fmoc-PEG-NHS (Fmoc-protected NH 2 -PEG-NHS) and stirred at 40 ° C for 18 hours. Subsequently, the pH was increased to 11 and the reaction mixture stirred for a further 2 hours at RT. Subsequently, the unreacted nucleotide was separated by ultrafiltration, 3,000 MWCO, and the product of the reaction, the dATP-PA-PEG-NH 2 , was washed several times with water.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. NH2-Gruppe dient als Kopplungseinheit T für die Marker-Komponente. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Polyacryl-säurederivate, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Nukleotid-Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.These Carries connection a nucleotide functionality and a macromolecular linker. NH2 group serves as a coupling unit T for the Marker component. To this coupling unit T macromolecular structures coupled, e.g. Polyacrylic acid derivatives, without the Substrate properties of these nucleotide analogs are lost. This nuc macromolecule serves as a substrate for Polymerases.

Beispiel 20:Example 20:

TTP-3'-Amino-PEG-Biotin,TTP-3'-amino-PEG-biotin,

Die Synthese erfolgte ähnlich wie für dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19. Als Edukte wurden 3'-Amino-3'-Deoxy-TTP und Biotin-PEG-NHS eingesetzt. Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker und eine niedermolekulare Marker-Einheit (Biotin), die eine signalvermittelnde Fuktion hat. An das Biotin können makromolekulare signaltragende Streptavidin-Moleküle gekoppelt werden.The Synthesis was similar as for dUTP-AA-PEG-Biotin, Example 19. The starting materials were 3'-amino-3'-deoxy-TTP and biotin-PEG-NHS used. This connection carries a nucleotide functionality and a macromolecular linker and a small molecule marker moiety (Biotin), which has a signal-transmitting function. To the biotin can coupled macromolecular signal-bearing streptavidin molecules become.

Auch andere Nukleotid-Analoga mit einer Amino-Gruppe in der 3' -Position können in ähnlicher Weise gekoppelt werden.Also other nucleotide analogues having an amino group in the 3 'position may be similar Be paired way.

Beispiel 21:Example 21:

dCTP-PA-PEG-Maleimid,dCTP-PA-PEG-maleimide,

Die Synthese erfolgte wie für dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19, beschrieben. Als Edukte wurden dCTP-PA und Maleimid-PEG-NHS eingesetzt.The Synthesis was as for dUTP-AA-PEG-biotin, Example 19. As starting materials were dCTP-PA and maleimide-PEG-NHS.

Diese Verbindung hat eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Kopplungseinheit T an diesem Linker ist die Maleimid-Gruppe. An Maleimid-Funktionalität können makromolekulare signaltragende Moleküle gekoppelt werden, die eine oder mehrere SH-Gruppen tragen.These Compound has a nucleotide functionality and a macromolecular Linker. Coupling unit T at this linker is the maleimide group. Maleimide functionality can be macromolecular signal carrying molecules coupled carrying one or more SH groups.

Maleimid-Gruppe kann auch als eine niedermolekulare Marker-Einheit mit signalvermittelnden Funktion betrachtet werden, die an den langen Linker gekoppelt ist. An diese Marker-Komponente können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen.Maleimide group can also act as a low molecular weight marker unit with signal-mediating Function, which is coupled to the long linker. To this marker component can macromolecular structures are coupled without affecting the substrate properties these analogs are lost.

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Allylamino-dUTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2' -Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14.This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 5-allylamino-dUTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as noted above. Both ribonucleotides, 2'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 ,

Beispiel 22:Example 22:

dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-(Cy3)-PEG-Biotin, 30 dUTP-AA-SS-propionate TEAE- (Cy3) -PEG-biotin, 30

Die Synthese erfolgte ähnlich wie für dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19 beschrieben. Als Edukte wurden dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3 und Biotin-PEG-NHS eingesetzt. Die Trennung vom nicht abreagierten dUTP-Analog erfolgte durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO.The Synthesis was similar as for dUTP-AA-PEG-biotin, Example 19 described. The starting materials were dUTP-AA-SS-propionate-TEAE-Cy3 and biotin-PEG-NHS. The separation from unreacted dUTP analog was made by ultrafiltration, 3,000 MWCO.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität, einen Farbstoff, einen makromolekularen Linker und eine niedermolekulare Marker-Funktionalität (Biotin), die eine signalvermittelnde Fuktion hat. Biotin kann auch als eine Kopplungseinheit T des Linkers betrachtet werden.These Carries connection a nucleotide functionality, a dye, a macromolecular linker and a low molecular weight Marker functionality (Biotin), which has a signal-transmitting function. Biotin can too be considered as a coupling unit T of the linker.

An die Kopplungseinheit T (in diesem Beispiel Biotin) können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen.At the coupling unit T (biotin in this example) may be macromolecular Structures are coupled without affecting the substrate properties these analogs are lost. This nuc macromolecule serves as Substrate for Polymerases.

Der Farbstoff dient als sterisch anspruchsvolle Gruppe, die den enzymatischen Einbau von nur einem Nuk-Makromolekül in den wachsenden Strang durch die Polymrase zuläßt. Die Eigenschaften solcher Nukleotide sind detailliert in Tcherkassov WO 02088382 beschrieben.Of the Dye serves as a sterically demanding group, which is the enzymatic Incorporation of only one nuc macromolecule in the growing strand allowed by the polymerase. The Properties of such nucleotides are detailed in Tcherkassov WO 02088382 describes.

Beispiel 23:Example 23:

dUTP-AA-SS-PEG-Biotin, 31A,dUTP-AA-SS-PEG-biotin, 31A .

Zu 100μl, 10mmol/l Biotin-PEG-Ethyl-SH in 50mM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50mM Borat, pH 9.5 zugegeben. Reaktion wurde 18 Stunden bei RT gerührt. Die Trennung erfolgt ähnlich wie für die Synthese von dUTP-AA-PEG-Biotin, Beispiel 19 beschrieben.To 100μl, 10mmol / l Biotin-PEG-ethyl-SH in 50mM borate, pH 9.5, was 50μl 30mmol / l dUTP-AA-PDTP in 50mM borate, pH 9.5. Reaction was at RT for 18 hours touched. The separation is similar as for the synthesis of dUTP-AA-PEG-biotin, Example 19 described.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin, ohne dass die Substrateigenschaften dieser Analoga verloren gehen. Dieses Nuk-Makromolekül dient als Substrat für Polymerasen. Über Streptavidin können auch weitere makromoleküle, beispielsweise Enzyme oder Nukleinsäurenge koppelt werden. Biotin kann auch als signalvermittelnde niedermolekulare Marker-Einheit bezeichnet werden.These Carries connection a nucleotide functionality and a macromolecular linker. Biotin serves as a coupling unit T. To this coupling unit T can macromolecular structures are coupled, e.g. streptavidin without losing the substrate properties of these analogs. This nuc macromolecule serves as a substrate for Polymerases. about Can streptavidin also other macromolecules, For example, enzymes or Nukleinsäurenge be coupled. biotin can also be used as signal-mediating low-molecular-weight marker unit be designated.

Die Linker-Komponente kann zusammen mit der Marker-Komponente von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden. Dies kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn eine Sequenzierung durch Synthese (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892) durchgeführt wird, wobei nach jedem Detektionsschritt eine Entfernung der Marker notwendig ist.The Linker component can be used together with the marker component of the Nuk component under mild Conditions are split off. This can be an advantage, for example when sequencing by synthesis (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892) carried out which requires removal of the markers after each detection step is.

Ein weiteres Beispiel für die Nuk-Makromoleküle mit einer unter milden Bedingungen spaltbaren Gruppe: dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin (31B).Another example of the nuc macromolecules with a cleavable group under mild conditions: dUTP-AA-propionate-S-CO-PEG-biotin ( 31B ).

Für diese Reaktion wurde das dUTP-AA-PDTP zunächst auf RP-HPLC in Wasser-Methanol-Gradient gereinigt.For this Reaction, the dUTP-AA-PDTP was first purified on RP-HPLC in water-methanol gradient.

Zu 10μl einer 50mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP in Wasser wurden 20μl einer 100mmol/l Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 10 min durchgeführt. Das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-Propioat-SH, wurde von anderen Reagenzien auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2, getrennt. Das Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Es wurde von der Platte mit Wasser eluiert, eingeengt und in 50μl 50mmol/l Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst.To 10μl one 50mmol / L solution of dUTP-AA-PDTP in water was 20μl of a 100mmol / L solution of TCEP, pH 8, added. The reaction was carried out at RT for 10 min. The Product of the reaction, the dUTP-AA-propioate-SH, was from others Reagents on preparative Silica gel plates, LM 2, separated. The product, dUTP-AA-Propionate-SH, stays on the starting line. It was eluted from the plate with water, concentrated and in 50μl 50mmol / L borate buffer, pH 8, dissolved.

Zu dieser Lösung wurden 50μl einer frisch angesetzten 2 % wässrigen Lösung von Biotin-PEG-NHS zugegeben. Die Reaktion erfolgte be RT 30 min lang. Anschließend wurde das Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin, durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 von niedermolekularen Reaktionskomponenten abgetrennt, fünf mal mit 0,5 ml Wasser gewaschen und in einem Volumen von 50μl aufgelöst.To this solution were 50μl a freshly prepared 2% aqueous solution of biotin-PEG-NHS added. The reaction was carried out at RT for 30 min long. Subsequently was the product of the reaction, dUTP-AA-propionate-S-CO-PEG-biotin, by ultrafiltration with MWCO 3000 of low molecular weight reaction components separated, five washed with 0.5 ml of water and dissolved in a volume of 50 ul.

Das auf diese Weise erhaltene das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin kann von DNA-Polymerasen, beispielsweise Klenow-Fragment Exo minus oder Taq-Polymerase, in den wachsenden Strang der Nukleinsäuren eingebaut werden.The dUTP-AA-propionate-S-CO-PEG-biotin thus obtained can be separated from DNA polymera For example, Klenow fragment Exo minus or Taq polymerase can be incorporated into the growing strand of nucleic acids.

An das Biotin können über das Straptavidin weitere Marker-Komponenten gekoppelt werden.At The biotin can be over that Straptavidin further marker components can be coupled.

Das das dUTP-AA-Propionat-S-CO-PEG-Biotin enthält eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe, so dass der Linker mit dem Farbstoff von dem Nukleotid abgespalten werden kann. Dies ist beispielsweise in Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese vom besonderen Interesse (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).The the dUTP-AA-propionate-S-CO-PEG-biotin contains one under mild conditions cleavable group, leaving the linker with the dye from the nucleotide can be split off. This is for example in method of Sequencing by the Synthesis of Particular Interest (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14.This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as noted above. Both ribonucleotides, 2'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 ,

Beispiel 24:Example 24:

TTP-O-Propionat-SS-PEG-Biotin,TTP-O-propionate-SS-PEG-biotin,

Zur 100μl Lösung von TTP-O-Propionat-SH, 10mmol/l, in 50mM Borat-Puffer, pH 9.5, wurden 100μl einer Lösung von Bis-Dithio-(Ethyl-PEG-Biotin), 0.5mmol/l, in Wasser gegebenund 24 Stunden bei RT gerührt. Die Aufreinigung erfolgte durch Ultrafiltration mit 3.000 MWCO ähnlich wie in Beispiel 19.to 100μl solution of TTP-O-propionate-SH, 10mmol / L, in 50mM borate buffer, pH 9.5 100μl one solution of bis-dithio (ethyl-PEG-biotin), 0.5 mmol / l, in water Stirred for 24 hours at RT. The Purification was done by ultrafiltration with 3,000 MWCO similar to in example 19.

Beispiele für die Kopplung von Aminogruppen an die Phosphatreste der Nukleotide sind in D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, 363 angegeben. An diese Amino-Gruppe kann eine Linker-Komponente gekoppelt werden. Beispiele für Kopplungen von Linkern an Phosphat-Gruppen von Nukleotiden sind in US Patent 5.981.507 dargestellt. An einen solchen Linker können weitere makromolekulare Linker gekoppelt werden, die einen niedermolekularen Marker oder eine niedermolekulare Kopplungseinheit oder einen markomolekularen Marker tragen.Examples for the Coupling of amino groups to the phosphate radicals of the nucleotides are in D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, v. 278, 363. To this amino group, a linker component can be coupled. examples for Couplings of linkers to phosphate groups of nucleotides are in U.S. Patent 5,981,507. To such a linker can more macromolecular linker coupled to a low molecular weight Marker or a low molecular weight coupling unit or a markomolecular Bear markers.

In einer Ausführungform wird markomolekularer Linker an die Phosphat-Gruppen angefügt, die an der 5'-Position der Ribose gekoppelt sind. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise an der Gamma-Phosphat-Gruppe der Nukleotide, wobei sowohl Ribonukleotide als auch 2'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Dideoxynukleotide eingesetzt werden können.In an execution form is added markomolekularer linker to the phosphate groups, the at the 5'-position the ribose are coupled. The coupling is preferably on the gamma-phosphate group of the nucleotides, wherein both ribonucleotides as well as 2'-deoxyribonucleotides as well as 2 ', 3'-Dideoxynukleotide used can be.

In einer anderen Ausführungsform erolgt die Kopplung des makromolekularen Linker an die 3'-Phosphat-Gruppe eines 5'-Nukieosid-Triphosphat.In another embodiment follows the coupling of the macromolecular linker to the 3'-phosphate group a 5'-nucleoside triphosphate.

Kopplungen an Marker-KomponentenCouplings to marker components

Beispiel 25,Example 25

(dUTP-16-Biotin)4-SA,(DUTP-16-biotin) 4-SA,

Zu 200μl einer Lösung von Biotin-l6-dUTP 200μmol/l in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, wurden 200μl einer Streptavidin-Lösung, 1mg/ml, in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde wurde das (dUTP-16-Biotin)4-SA vom nicht umgesezten Biotin-l6-dUTP durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, abgetrennt.To 200μl one solution of biotin-16-dUTP 200μmol / l in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 μl of a streptavidin solution, 1 mg / ml, in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0. After 1 hour at RT was was the (dUTP-16-biotin) 4-SA from unreacted biotin-16-dUTP separated by ultrafiltration, 50,000 MWCO.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten trägt.It a compound was obtained which has a nucleotide functionality and a carries macromolecular marker functionalities.

Es kann stellvertretend für konventionell modifizierte Nukleotide mit einem makromolekularen Markern betrachtet werden.It can be representative of conventionally modified nucleotides with a macromolecular Markers are considered.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation führt zum Verlust der Substrateigenschaften, s. Beispiel 34B.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) are not accepted as a substrate. The modification leads to Loss of substrate properties, s. Example 34B.

Eigenschaften der Biotin-Streptavidin-Bindung sind z.B. in Gonzalez et al. Journal Biolog. Chem. 1997, v. 272, S. 11288 beschrieben.Properties of biotin-streptavidin binding are described, for example, in Gonzalez et al. Journal Biolog. Chem. 1997, v. 272, p 11288 described.

Beispiel 26:Example 26:

(dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy2,(DUTP-16-biotin) 4-SA-Cy2,

Die Kopplung von dUTP-16-Biotin an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt.The Coupling of dUTP-16-biotin to SA-Cy2 was as for (dUTP-16-biotin) 4-SA described carried out.

Die Verbindung dient als Äquivalent zu Verbindung aus Beispiel 25, wobei zur Visualisierung Streptavidin fluoreszent markiert ist.The Connection serves as an equivalent to compound of Example 25, wherein for visualization streptavidin fluorescently labeled.

Beispiel 27:Example 27:

dCTP-PA-SS-Oligo-dT30,dCTP-PA-SS-oligo-dT30,

Die Synthese erfolgte wie bei dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 beschrieben. Zu dCTP-PA-PDTP, 100μl, 20mmol/l, wurde Oligo-dT30-3'-SH (MWG-Biotech) zugegeben, Endkonzentration 200μmol/l, und 18 Std bei RT, pH 9, gerührt. Die Aufreinigung erfolgte durch Ultrafiltration mit 3.000 MWCO.The Synthesis was as described for dUTP-AA-SS-MEA-Cy3. To dCTP-PA-PDTP, 100μl, 20mmol / l, became oligo-dT30-3'-SH (MWG Biotech) added, final concentration 200μmol / l, and 18 h at RT, pH 9, stirred. The purification was carried out by ultrafiltration with 3,000 MWCO.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation des Nukleotidteils führt zu Aufhebung der Substrateigenschaften.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) are not accepted as a substrate. The modification of the nucleotide portion leads to abolish the substrate properties.

Beispiel 28:Example 28:

(dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 und (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA, 32 (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA-Cy2 and (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA, 32

Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-Cy2 bzw. an SA wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Zu 200μl 1μg/μl Streptavidin wurden 10μl einer Lösung von dUTP-AA-PEG-Biotin, ca. 1mmol/l, gegeben, und bei RT 1 h gerührt. Danach wurde das Produkt durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, von dem nicht gekoppelten dUTP-AA-PEG-Biotin abgetrennt und das Produkt 2 mal mit Wasser gewaschen.The Coupling of dUTP-AA-PEG-biotin to SA-Cy2 or to SA was described as for (dUTP-16-biotin) 4-SA carried out. To 200μl 1 μg / μl streptavidin were 10μl a solution of dUTP-AA-PEG-biotin, ca. 1 mmol / l, and stirred at RT for 1 h. After that the product was not ultrafiltered by 50,000 MWCO of that coupled dUTP-AA-PEG-biotin separated and the product 2 times washed with water.

Ein Teil des gewonnenen (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 wurde mit Cy3-NHS modifiziert: 50μl (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2 wurden in 50mmol/l Borat, pH 8.5, aufgelöst, bis zur Konzentration von 1.4μg/μl, und anschließend mit Cy3-NHS versetzt. Endkonzentration von Cy3 betrug 10mmol/l. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Das Produkt, (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Cy2/Cy3, wurde durch Ultrafiltration mit 30.000 MWCO getrennt.One Part of the recovered (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA-Cy2 was digested with Cy3-NHS modified: 50 μl (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA-Cy2 were dissolved in 50 mmol / l borate, pH 8.5, up to the concentration of 1.4 μg / μl, and then with Cy3-NHS spiked. Final concentration of Cy3 was 10 mmol / l. The Reaction was carried out at RT for 1 h. The product, (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA-Cy2 / Cy3, was separated by ultrafiltration with 30,000 MWCO.

Dadurch wurde ein Nuk-Makromolekül hergestellt, dass sehr wenige freie Amino-Gruppen am Marker-Teil aufweist.Thereby became a nuc macromolecule prepared that has very few free amino groups on the marker part.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt.It a compound was obtained which has a nucleotide functionality, a long macromolecular linker and a macromolecular marker component wearing.

Das Produkt kann stellvertretend für Nuk-Makromoleküle betrachtet werden.The Product can be representative of Nuc-macromolecules to be viewed as.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert s. Beispiel 34,35.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as substrate s. example 34.35.

Auch andere Verbindungen, die einen langen Linker haben und ein Biotin-Molekül tragen, s. Beispiele 20, 22, 23, 24, können ähnlich in der Synthese eingesetzt werden.Also other compounds that have a long linker and carry a biotin molecule, s. Examples 20, 22, 23, 24 may be similar in the synthesis can be used.

Beispiel 29:Example 29:

(dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-Alkalische Phosphatase, 33, und (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA-QDot, 34,(dUTP-AA-PEG-Biotin) 4-SA-Alkaline Phosphatase, 33 , and (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA-QDot, 34 .

Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-AP bzw. QDot wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt.The Coupling of dUTP-AA-PEG-biotin to SA-AP and QDot, respectively, has been described as for (dUTP-16-biotin) 4-SA carried out.

Im Falle von QDot werden Nuk-Linker-Teile an der Oberfläche der QDots angeordnet. Es wurden Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente mit einem Enzym bzw. Q-Dots trägt.in the Traps of QDot become nuc-linker parts on the surface of the QDots arranged. There were obtained compounds which have a nucleotide functionality, a long macromolecular linker and a macromolecular marker component carries with an enzyme or Q-Dots.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as a substrate.

Auch andere Verbindungen, die einen langen Linker haben und ein Biotin-Molekül tragen, s. Beispiele 20, 22, 23, 24, können ähnlich in der Synthese eingesetzt werden.Also other compounds that have a long linker and carry a biotin molecule, s. Examples 20, 22, 23, 24 may be similar in the synthesis can be used.

Beispiel 30:Example 30:

(dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-TEG-Biotin)2-SA-Cy2,, 35A (DUTP-AA-PEG-biotin) 2 (dT31-TEG-biotin) 2-SA-Cy2 ,, 35A

Die Kopplung von dUTP-AA-PEG-Biotin an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-16-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt:
Zu 100μl einer Streptavidin-Cy2-Lösung, 20μmol/l (1.2mg/ml), in Tris-HCl, 50mmol/l, pH 8, wurden 80μl 80μmol/l dT31-3'-TEG-Biotin (MWG Biotech) zugegeben und 10 min bei RT inkubiert. (TEG ist ein kurzer Linker zwischen Biotin und dT31). Danach wurden 100μl einer Lösung dUTP-AA-PEG-Biotin 50μmol/l in 50mM Tris-HCl, pH 8.0, zugegeben. Nach 10 min bei RT wurde (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-TEG-Biotin)2-SA-Cy2 durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, gereinigt.The coupling of dUTP-AA-PEG-biotin to SA-Cy2 was performed as described for (dUTP-16-biotin) 4-SA:
To 100 μl of a streptavidin-Cy2 solution, 20 μmol / l (1.2 mg / ml), in Tris-HCl, 50 mmol / l, pH 8, 80 μl 80 μmol / l dT31-3'-TEG-biotin (MWG Biotech) was added and Incubated at RT for 10 min. (TEG is a short linker between biotin and dT31). Thereafter, 100 μl of a solution of dUTP-AA-PEG-biotin 50 μmol / l in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, was added. After 10 min at RT, (dUTP-AA-PEG-biotin) 2- (dT31-TEG-biotin) 2-SA-Cy2 was purified by ultrafiltration, 50,000 MWCO.

Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT31). Das Oligo-dT31 besteht aus Nukleosidmonophosphaten, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (35B). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999).The substance carries a nucleoside triphosphate functionality and a macromolecular marker functionalities (oligo-dT31). The oligo-dT31 consists of nucleoside monophosphates, which, however, do not participate in the enzymatic reaction and have only one signal-transmitting function. To such an oligonucleotide complementary nucleic acids can be hybridized, which have a signaling function ( 35B ). (general rules for the hybridization of nucleic acids are known in the art, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999).

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as a substrate.

Dieses Derivat kann beispielsweise an Poly-dA oder poly-A (z.B. mit durchschnittlicher Länge 260NT, Amersham Bioscience) durch Hybridisierung gekoppelt werden. Sowohl ein einziges als auch mehrere (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2- SA-Cy2 Moleküle können an ein Poly-dA-Molekül gekoppelt werden, s.auch 5. Das Verhältnis wird durch die Konzentrationsverhältnisse bestimmt. Auch andere Oligonukleotide, beispielsweise markiert mit Farbstoffen, können zusammen mit(dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2- SA-Cy2 an denselben Strang der Poly-dA oder poly-A gekoppelt werden, wobei die Verhältnisse zwischen einzelnen Molekülen variabel sind. Dadurch ist es möglich, ein polyfunktionales Nuk-Makromolekül herzustellen. Der große Vorteil eines solchen Nuk-Makromoleküls besteht in einer leicht spaltbaren makromolekularen Markierung: die an die poly-dA bzw. poly-A Stränge hybridisierten markierten Oligonukleotide können durch Denaturierung abgelöst werden. Durch die Wahl der Länge der markierten Oligonukleotide, kann die Tm dieser Oligonukleotide für die jeweiligen Anforderungen der reversiblen Markierung angepasst werden. Die Regeln zur Tm-Berechnung sind dem Fachmann bekannt ("Molecular-Cloning", 7. Sambrook, band 1-3, 2001). Beispielsweise können dT25-Oligonukleotide, markeirt mit einem Cy3-Molekül an Poly-dA gekoppelt werden. Durch den Einsatz von RNA, z.B. poly-A, zur Bindung mehrer (dUTP-AA-PEG-Biotin)2-(dT31-Biotin)2-SA Moleküle, kann die Spaltung durch eine RNase erfolgen.For example, this derivative can be coupled to poly-dA or poly-A (eg, 260NT average length, Amersham Bioscience) by hybridization. Both a single and several (dUTP-AA-PEG-biotin) 2- (dT31-biotin) 2-SA-Cy2 molecules can be coupled to a poly-dA molecule, s 5 , The ratio is determined by the concentration ratios. Other oligonucleotides, for example labeled with dyes, together with (dUTP-AA-PEG-biotin) 2- (dT31-biotin) 2-SA-Cy2 can be coupled to the same strand of the poly-dA or poly-A, the ratios between individual molecules are variable. This makes it possible to produce a polyfunctional nuc macromolecule. The great advantage of such a nuc-macromolecule consists in a readily cleavable macromolecular labeling: the labeled oligonucleotides hybridized to the poly-dA or poly-A strands can be removed by denaturation. By choosing the length of the labeled oligonucleotides, the Tm of these oligonucleotides can be adapted for the respective requirements of the reversible label. The rules for the Tm calculation are known to the person skilled in the art ("Molecular Cloning", 7th Sambrook, vol. 1-3, 2001). For example, dT 25 oligonucleotides labeled with a Cy3 molecule can be coupled to poly-dA. Through the use of RNA, eg poly-A, for the binding of several (dUTP-AA-PEG-biotin) 2- (dT31-biotin) 2-SA molecules, the cleavage can be carried out by an RNase.

Da Streptavidin 4 Bindungsstellen für Biotin hat, entsteht ein Gemisch von Nuk-Makromolekülen, bei dem 4 Bindungsstellen unterschiedlich besetzt sind. Dieses Gemisch kann mit unterschiedlichen Mitteln getrennt werden. Eine der Möglichkeit besteht in Isolierung von Nuk-Makromolekülen, die mindestens ein Oligo-dT31 tragen, beispielsweise durch eine Absorbtion an einem Anionaustauscher (z.B. einer DEAE-Cellulose-Säule). Auf Gel-Elektrophorese eignet sich zur Trennung einzelner Derivaten.There Streptavidin 4 binding sites for Biotin has a mixture of nuc macromolecules, forming 4 binding sites are occupied differently. This mixture can with different Funds are separated. One possibility is in isolation of nuc macromolecules, which carry at least one oligo-dT31, for example by a Absorbing on an anion exchanger (e.g., a DEAE-cellulose column). On Gel electrophoresis is suitable for the separation of individual derivatives.

Auch längere Nukleinsäureketten, die ein Biotin-Molekül tragen, beispielsweise poly-dA-Biotin, hergestellt beispielsweise durch eine terminale Kopplung von ddUTP-18-Biotin durch eine TdT-abhängige Reaktion ("Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1-3, 2001), können in ähnlicher Weise an das Streptavidin gekoppelt werden, so dass Moleküle mit einer durchschnittlichen Zusammensetzung von (dUTP-AA-PEG-Biotin)N-(Nukleinsäureketten-Biotin)M-SA entstehen. Sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäureketten können gekoppelt werden. Die Länge der gekoppelten Nukleinsäureketten kann zwischen 10 und 100, 100 und 1000 Nukleotiden liegen.Also, longer nucleic acid chains carrying a biotin molecule, for example poly-dA-biotin, prepared, for example, by a terminal coupling of ddUTP-18-biotin through a TdT-dependent reaction ("Molecular Cloning", J. Sambrook, Vol. 3, 2001) can be similarly coupled to the streptavidin to form molecules having an average composition of (dUTP-AA-PEG-biotin) N- (nucleic acid chain-biotin) M -SA. Both single-stranded and double-stranded nucleic acid chains can be coupled. The length of the coupled nucleic acid chains can be between 10 and 100, 100 and 1000 nucleotides lie.

Die hybridisierten Oligonukleotide, die einen Farbstoff tragen, können an den Poly-dA Strang auch kovalent durch Cross-Linker gebunden werden.The hybridized oligonucleotides carrying a dye may be attached The poly-dA strand can also be covalently bound by cross-linkers.

Auch andere Verbindungen, die einen langen Linker haben und ein Biotin-Molekül tragen, s.Beispiele 20, 22, 23, 24, können ähnlich in der Synthese eingesetzt werden.Also other compounds that have a long linker and carry a biotin molecule, Examples 20, 22, 23, 24 may be similar in FIG the synthesis can be used.

Beispiel 31A:Example 31A:

(dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA und (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA-Cy2, 36 (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA and (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA-Cy2, 36

Die Kopplung von dUTP-AA-SS-PEG-Biotin an SA bzw. an SA-Cy2 wurde wie für (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA beschrieben durchgeführt. Als Edukte wurden Streptavidin und dUTP-AA-SS-PEG-Biotin eingesetzt.The Coupling of dUTP-AA-SS-PEG-biotin to SA or to SA-Cy2 was like for (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA described carried out. The starting materials used were streptavidin and dUTP-AA-SS-PEG-biotin.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt. Die Linker-Komponente und die Marker-Komponente können von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden.It a compound was obtained which has a nucleotide functionality, a long macromolecular linker and a macromolecular marker component wearing. The linker component and the marker component can be of the nuk component are cleaved under mild conditions.

Das Produkt kann stellvertretend für Nuk-Makromoleküle betrachtet werden, die eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung in der Linker-Komponente tragen.The Product can be representative of Nuc-macromolecules considered a fissile under mild conditions compound in the linker component.

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert s. Beispiel 34.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as substrate s. example 34th

Beispiel 31BExample 31B

(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)4-SA(DGTP-PA-SS-PEG-biotin) 4-SA

200μl 50mM Lösung an Streptavidin in 50mM Borat-Puffer, pH 9, wurden mit 5 Äquivalenten von Biotin-PEG-PDTP (PEG-Linker 30 Atome; Synthese s. Beispiel 4) 10 Minuten inkubiert. Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)4 wurde durch Ultrafiltration an 30kDa MWCO von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt. Zu 200μl 50mM Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)4 Lösung in Borat-Puffer wurden mit 100μl 10mM Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Nach 30 min wurde Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH)4 erneut durch Ultrafiltration an 30kDa MWCO von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt.200μl 50mM solution Streptavidin in 50mM borate buffer, pH 9, was mixed with 5 equivalents of biotin-PEG-PDTP (PEG-linker 30 atoms, synthesis see example 4) Incubated for 10 minutes. Streptavidin (biotin-PEG-PDTP) 4 was analyzed by Ultrafiltration on 30kDa MWCO of low molecular weight components separated by repeated washing with borate buffer. To 200μl 50mM streptavidin (biotin-PEG-PDTP) 4 solution in borate buffer were mixed with 100μl 10mM solution from TCEP, pH 8. After 30 minutes streptavidin (biotin-PEG-R-SH) 4 again by ultrafiltration on 30kDa MWCO of low molecular weight Components separated by repeated washing with borate buffer.

dGTP-PA wurde mit PDTP-NHS modifiziert, ähnlich wie im Beispiel 1 dargestellt, das Produkt ist dGTP-PA-PDTP. 50μl einer 100 mM Lösung von dGTP-PA-PDTP in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, wurden zu 200μl 50μM Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH)4 in 50 mM Borat Puffer zugegeben. Nach 30 min RT wurden makromolekulare Produkte u.a. (dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)4-SA durch Ultrafiltration an 30kDa MWCO von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt.dGTP-PA was modified with PDTP-NHS, similar as shown in Example 1, the product is dGTP-PA-PDTP. 50μl of a 100 mM solution of dGTP-PA-PDTP in 50mM borate buffer, pH 9, was added to 200μl of 50μM streptavidin (biotin-PEG-R-SH) 4 in 50 mM borate buffer. After 30 min RT were macromolecular Products u.a. (dGTP-PA-SS-PEG-biotin) 4-SA by ultrafiltration at 30kDa MWCO of low molecular weight components by repeated Wash separated with borate buffer.

Das resultierende Produkt (dGTP-PA-SS-PEG-Biotin)4-SA hat einen Linker von 42 Atomen zwischen Nuk-Komponente und dem Biotin. Dieses Nuk-Makromolekül hat eine spaltbare SS-Bidung in seinem Linker und kann von Klenow Fragment in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden.The resulting product (dGTP-PA-SS-PEG-biotin) 4-SA has a linker of 42 atoms between nuc-component and biotin. This nuc macromolecule has one cleavable SS-Bidung in its linker and can fragment of Klenow into a nucleic acid chain to be built in.

Beispiel 32:Example 32:

dCTP-PA-PEG-Maleimid-S-Oligo-dT30, 37A dCTP-PA-PEG-maleimide S-oligo-dT30, 37A

Zu 100μl einer Lösung mit dCTP-PA-PEG-Maleimid, 5mmol/l, in 50mM Borat-Puffer, pH 9.5, wurde 100μl einer Lösung von 3'-SH-Oligo-dT30, 200μmol/l, in Wasser zugegeben und 48 Std. bei RT gerührt. Das Produkt wurde mittels präparativer Gel-Elektrophorese, 12% Polyacrylamid-Gel, gereinigt.To 100μl one solution with dCTP-PA-PEG-maleimide, 5mmol / L, in 50mM borate buffer, pH 9.5, was 100μl a solution of 3'-SH-oligo-dT30, 200μmol / l, added in water and stirred for 48 hrs. At RT. The product was using preparative Gel electrophoresis 12% polyacrylamide gel, cleaned.

Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT30). Das Oligo-dT30 besteht aus Nukleotiden, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (37B). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.) Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.The substance carries a nucleoside triphosphate functionality and a macromolecular marker functionalities (oligo-dT30). The oligo-dT30 consists of nucleotides, which, however, do not participate in the enzymatic reaction and have only one signal-transmitting function. To such an oligonucleotide complementary nucleic acids can be hybridized, which have a signaling function ( 37B ). (general rules for the hybridization of nucleic acids are known in the art, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.) This compound is accepted as a substrate by polymerases (eg, Klenow exo minus polymerase and terminal transferase).

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Allylamino-dUTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14.This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 5-allylamino-dUTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as noted above. Both ribonucleotides, 2'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 ,

Durch Zugabe von Poly-dA oder Poly-A können mehrere dCTP-PA-PEG-Maleimid-S-Oligo-dT30, z.B. 10-20, zu einem Nuk-Makromolekül gekoppelt werden. Dabei entsteht ein Nuk-Makromolekül mit linear angeordneten Nuk-Linker-Komponenten (37 C).By adding poly-dA or poly-A, several dCTP-PA-PEG-maleimide-S-oligo-dT30, eg 10-20, can be coupled to a nuc macromolecule. This results in a nuc macromolecule with linearly arranged nuc-linker components ( 37 C).

Beispiel 33Example 33

(dCTP-PA-PEG-Maleimid-S)n-Poly-Lysin-(Cy3)m,(DCTP-PA-PEG-maleimide-S) n-Poly-lysine (Cy3) m,

Edukte: dCTP-PA-PEG-MaleimidStarting materials: dCTP-PA-PEG-maleimide

(HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, n = 10-15, m 3-9, Poly-Lysin 10.000-20.000(HS-propionate) m -polylysine- (Cy3) n, n = 10-15, m 3-9, poly-lysine 10,000-20,000

Zu 100μl einer Lösung mit dCTP-PA-PEG-Maleimid, 5mmol/l, in 50mM Borat-Puffer, pH 9.5, wurde 20μl einer Lösung von (HS-Propionat)m-Poly-Lysin-(Cy3)n, ca. 1mmol/l, in Wasser, gegeben und 18 Std. bei 40°C gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration, 30.000 MWCO, gereinigt.To 100μl one solution with dCTP-PA-PEG-maleimide, 5mmol / L, in 50mM borate buffer, pH 9.5, was 20μl a solution of (HS-propionate) m-poly-lysine (Cy3) n, ca. 1mmol / L, in water and 18 hours at 40 ° C touched. The product was purified by ultrafiltration, 30,000 MWCO.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und eine makromolekulare Marker-Komponente trägt. Pro Nuk-Makromolekül sind mehrere Nuk-Komponenten gekoppelt. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.It a compound was obtained which has a nucleotide functionality, a long macromolecular linker and a macromolecular marker component wearing. Pro Nuc Macromolecule Several Nuk components are coupled. This connection is made by Polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) accepted as a substrate.

Weitere Kombinationen von Nuk-Komponenten, Linker-Komponenten und Marker-Komponenten sind dem Fachmann naheliegend.Further Combinations of nuc-components, linker components and marker components are the Skilled person.

Vergleich von Substrateigenschaften einiger Vertreter von Nuk-Makromolekülen mit konventionell modifizierten Nukleotiden.Comparison of substrate properties some representatives of nuc macromolecules with conventionally modified nucleotides.

Substrateigenschaften der Nuk-Makromoleküle gegenüber Polymersen und Terminale deoxy-Nucleotidyl-Transferase (TdT) wurden mit den Eigenschaften der konventionell modifizierten Nukleotide in einer Markierungsreaktion verglichen. Allgemeine Prinzipien von Markierungsreaktionen findet man in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, Band 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5.substrate properties the nuc macromolecules across from Polymersen and terminal deoxy-nucleotidyl transferase (TdT) were with the properties of the conventionally modified nucleotides compared in a labeling reaction. General principles of Labeling reactions can be found in "Molecular Cloning", J. Sambrook, vol. 1-3, 2001, ISBN 0-87969-576-5.

Beispiel 34: Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen oder konventionell modifizierten Nukleotiden gegenüber PolymersenExample 34: Substrate Properties of nuc macromolecules or conventionally modified nucleotides to polymers

Dieses Beispiel soll nicht zur Einschränkung der möglichen Markierungsreaktionen dienen, sondern lediglich Unterschiede in den Substrateigenschaften verdeutlichen.This Example is not intended to be limiting the possible Marking reactions serve, but only differences in illustrate the substrate properties.

In den Reaktionen wurden sowohl selbst synthetisierte als auch kommerziell erhältliche modifizierte Nukleotide dUTP-Cy3 (Amersham) und dUTP-16-Biotin (Roche) verwendet. Nicht modifizierte dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) wurden bei der Firma Roth erworben.In The reactions were both self-synthesized and commercial available modified nucleotides dUTP-Cy3 (Amersham) and dUTP-16-biotin (Roche) used. Unmodified dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) were added acquired from Roth.

Als Matrizen dienten sowohl kurze Oligonucleotide als auch poly-dA. Primer und Oligonukleotide wurden von MWG-Biotech synthetisiert.When Matrices served both short oligonucleotides and poly-dA. Primers and oligonucleotides were synthesized by MWG-Biotech.

Reaktionen wurden in 20mmol/l Tris-Puffer, pH 8.5, 5mmol/l MgCl2, 10% Glycerin, durchgeführt. Die Konzentrationen der Primer betrugen 1μmol/l, die der Oligonukleotide 1μmol/l und die Konzentration der poly-dA, 0.1μg/μl (für die Konzentrationsverhältnisse an der festen Phase s.u.). Als Polymerse wurde Klenow Exo minus 1Unit/100μl (Amersham) verwendet. Die Konzentrationen von Nukleotiden betrugen 20μmol/l für konventionell modifizierte Nukleotide und 5μmol/l für Nuk-Makromoleküle. Nicht modifizierte Nukleotide wurden in Konzentrationen von 50μmol/l eingesetzt.Reactions were performed in 20mmol / L Tris buffer, pH 8.5, 5mmol / L MgCl 2 , 10% glycerol. The concentrations of the primers were 1 μmol / l, those of the oligonucleotides 1 μmol / l and the concentration of the poly-dA, 0.1 μg / μl (for the concentration ratios of the solid phase see below). The polymer used was Klenow Exo minus 1 unit / 100 μl (Amersham). The concentrations of nucleotides were 20 μmol / L for conventionally modified nucleotides and 5 μmol / L for nuc macromolecules. Unmodified nucleotides were used in concentrations of 50 μmol / l.

Zunächst wurden Primer an die jeweilige Matrize hybridisiert: Das Reaktionsgemisch ohne Polymerse wurde auf 75°C erhitzt und über 5 min auf 37°C abgekühlt. Danach wurde die Polymerse zugegeben. Alle Reaktionen wurden über 1 h bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (Endkonzentration von 10mmol/l) gestoppt.At first were Primer hybridized to the respective template: The reaction mixture without polymer was at 75 ° C heated and over 5 min at 37 ° C cooled. Thereafter, the polymer was added. All reactions were over 1 h at 37 ° C carried out. The reactions were monitored by addition of EDTA (final concentration of 10mmol / l) stopped.

Zu einigen Ansätzen wurde nach dem Stop der Reaktion Streptavidin, bis zu Endkonzentration von 1mg/ml, zugegeben und der Ansatz weitere 10 min bei 37°C inkubiert. Dadurch können bereits eingebaute Nukleotide, die ein Biotin tragen, mit Streptavidin reagieren und somit Streptavidin und Oligonukleotid verbinden. Diese Experimente eignen sich als Kontrolle für die Laufeigenschaften von modifizierten Primern.To some approaches was after stopping the reaction streptavidin, up to final concentration of 1 mg / ml, and the mixture was incubated for a further 10 min at 37 ° C. Thereby can already incorporated nucleotides carrying a biotin with streptavidin react and thus connect streptavidin and oligonucleotide. These Experiments are suitable as a control for the running properties of modified primers.

Zu entsprechend gekennzeichneten Ansätzen wurde Mercaptoethanol (bis 20mmol/l Endkonzentration) zugegeben und der jeweilige Ansatz wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Mercaptoethanol wurde bei einigen Anstzen während, bei anderen Ansätzen auch nach der Reaktion zugegeben.To labeled accordingly was mercaptoethanol (to 20mmol / l final concentration) was added and the respective batch was 10 min at 37 ° C incubated. Mercaptoethanol was added during some attacks during other approaches also added after the reaction.

Die Analyse der Reaktion erfolgte mittels denaturierender Gel-Elektrophorese, 20% Polyacrylamid-Gel, 50mmol/l Tris-HCl, pH 8.7, wie in "Gel electrophoresis of nucleic Acids", Ed. D. Rickwood, 1990, dargestellt. Zur Denaturierung der Proben wurde anstatt von 7M Urea eine erhöhte Temperatur bei der Gelelektrophorese eingesetzt (60°C). Die Elektrophorese wurde in Biorad-Gelkammern (Protean 3) durchgeführt, 200V, ca. 1h. Die Visualisierung erfolgte auf einer UV-Vis Gel-Dokumentationsanlage (Biorad).The Analysis of the reaction was carried out by means of denaturing gel electrophoresis, 20% polyacrylamide gel, 50 mmol / l Tris-HCl, pH 8.7, as described in "Gel electrophoresis of nucleic acids ", Ed. D. Rickwood, 1990. For denaturing the samples instead of 7M urea increased gel-electrophoresis temperature used (60 ° C). Electrophoresis was carried out in Biorad gel chambers (Protean 3), 200V, about 1h. The visualization was carried out on a UV-Vis gel documentation system (Biorad).

Beispiel 34A, 38 Example 34A, 38

Darstellung des Einbaus und Spaltung von einem konventionell modifizierten Nukleotid (dUTP-AA-SS-MEA-Cy3)Presentation of the installation and cleavage of a conventionally modified nucleotide (dUTP-AA-SS-MEA-Cy3)

Sequenzen:sequences:

  • Primer: Primer-T7-20-5'-Cy3: 5'-Cy3-TAATACGACTCACTATAGGG-3'primer: Primer T7-20-5'-Cy3: 5'-Cy3-TAATACGACTCACTATAGGG-3 '
  • Matrize Oligonukleotid Oligo 1: 5'-AGTTTfAGTTTTACCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' Die Primer-Bindungsstelle ist unterstrichen
    Figure 00920001
    Template oligonucleotide oligo 1: 5'-AGTTffAGTTTTACCCTATAGTGAGTCGTATTA-3 'The primer binding site is underlined
    Figure 00920001

Legende:Legend:

Spuren 1-6:Lanes 1-6:

  • 1) nur PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 11) only primer T7-20-Cy3 + oligo 1
  • 2) PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1+ dCTP-Cy3 + dATP + dGTP + Polymerase2) primer T7-20-Cy3 + oligo 1+ dCTP-Cy3 + dATP + dGTP + polymerase
  • 3) PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1+ dCTP-Cy3 + dATP + dGTP + dTTP + Polymerase3) primer T7-20-Cy3 + oligo 1+ dCTP-Cy3 + dATP + dGTP + dTTP + Polymerase
  • 4) PrimerT7-20-Cy3 + Oligo 1+ dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 + Polymerase4) Primer T7-20-Cy3 + oligo 1+ dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 + polymerase
  • 5) nach 1 Std. wurde zu einem Aliquot von Ansatz 4 Mercaptoethanol zugegeben und weitere 10 min inkubiert, es erfolgt eine Abspaltung der Markierung5) after 1 hr, aliquot of Preparation 4 became mercaptoethanol added and incubated for a further 10 min, there is a cleavage the mark
  • 6) nach 10 min wurde zum Aliquot von Ansatz 5 dATP, dGTP zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert6) After 10 min, dATP, dGTP was added to the aliquot of Run 5 and at 37 ° C for 30 minutes incubated

Wie man sieht, wird dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 von der Polymerase eingebaut (Spur 4). Der Farbstoff kann vom Primer abgespalten werden (Spur 5) (man sieht eine Verschiebung der Bande, die durch die geringere Größe von Oigonukleotid zu begründen ist). Anschließend können weitere Nukleotide eingebaut werden (Spur 6).As As can be seen, dUTP-AA-SS-MEA-Cy3 is incorporated by the polymerase (Lane 4). The dye can be cleaved from the primer (lane 5) (One sees a shift of the band, by the lower Size of oligonucleotide to substantiate is). Subsequently can additional nucleotides are incorporated (lane 6).

Ein ähnlich durchgeführter Reaktionsansatz mit dUTP-AA-SS-TEAE-(Cy3)2 führte nicht zum Einbau des Nukleotid-Analogs in den Primer.A similarly carried out reaction with dUTP-AA-SS-TEAE- (Cy3) 2 resulted not for incorporation of the nucleotide analog into the primer.

Dieses Beispiel zeigt, dass sogar geringfügige Veränderungen in der Analog-Struktur, wie z.B. Verdopplung der Zahl der Farbstoffe, die an ein Nukleotid gekoppelt sind, zu Veränderung in Substrateigenschaften der Nukleotide führen können.This Example shows that even minor changes in the analog structure, such as. Doubling the number of dyes attached to a nucleotide coupled to change may result in substrate properties of the nucleotides.

Beispiel 34B, 39 Example 34B 39

Vergleich von Substrateigenschaften eines konventionell modifizierten Nukleotid mit einem makromolekularen Marker und einem Nuk-MakromolekülComparison of substrate properties a conventionally modified nucleotide with a macromolecular marker and a nuc macromolecule

Sequenzen:sequences:

  • Primer: Primer-dT35-5'-Cy3 (dT35-Cy3): 5'Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3Primer: primer dT 35 -5'-Cy3 (dT35-Cy3): 5'Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
  • Matrize: Poly-dA (Amersham), durchschnittlich 270 Nukleotide lang. Nukleotide: (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, (dUTP-16-Biotin)4-SA, dUTP-16-Biotin
    Figure 00930001
    Template: Poly-dA (Amersham), average 270 nucleotides long. Nucleotides: (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA, (dUTP-16-biotin) 4-SA, dUTP-16-biotin
    Figure 00930001

Legende:Legend:

Spuren 1-9:Tracks 1-9:

  • 1) Leiter: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy31) Conductors: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy3
  • 2) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA + Polymerase2) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase
  • 3) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA3) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA
  • 4) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA + Polymerase4) (dUTP-16-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase
  • 5) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA5) (dUTP-16-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA
  • 6) (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy3 + dT35-Cy3 + Poly-dA Im Kontroll-Ansatz, Spuren 7-9:6) (dUTP-16-biotin) 4-SA-Cy3 + dT35-Cy3 + poly-dA In the control approach, Lanes 7-9:
  • 7) dUTP-16-Biotin + dT35-Cy3 + Poly-dA + Polymerase, Inkubation 1 std. 37°C danach + EDTA bis 10mmol/l Endkonzeentration, danach + Streptavidin 10 min 37°C7) dUTP-16-biotin + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase, incubation 1 H. 37 ° C afterwards + EDTA up to 10mmol / l final concentration, then + streptavidin 10 min 37 ° C
  • 8) dUTP-16-Biotin + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 std. 37°C danach + EDTA bis 10mmol/l Endkonzeentration,8) dUTP-16-biotin + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase, incubation 1 H. 37 ° C afterwards + EDTA up to 10mmol / l final concentration,
  • 9) Leiter: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy39) Conductors: T-7-20-Cy3, dT35-Cy3, dT40-Cy3, dT50-Cy3

Ein Nuk-Makromolekül, (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, wird in den Primer eingebaut (Spur 2). Der markierte Primer hat nach dem Einbau eines Nuk-Makromoleküls eine stark veränderte elektrophoretische Beweglichkeit. Bloße Anwesenheit von Nuk-Makromolekülen hat keinen Einfluß auf den Primer (Spur 3).One Nuc-macromolecule (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA, is incorporated into the primer (lane 2). The labeled primer has one after incorporation of a nuc macromolecule strongly changed electrophoretic mobility. Has only the presence of nuc macromolecules no influence on the primer (lane 3).

Ein konventionell modifiziertes Nukleotid, (dUTP-16-Biotin)4-SA, mit einem makromolekularen Marker wird nicht in den Primer eingebaut (Spur 4). Trotz der Anwesenheit der Polymerase in Reaktion 4 (Spur 4) lassen sich keine Unterschiede zwischen Spur 4 und Spur 5 feststellen.One conventionally modified nucleotide, (dUTP-16-biotin) 4-SA, with a macromolecular marker is not incorporated into the primer (Lane 4). Despite the presence of the polymerase in reaction 4 (lane 4) no differences between lane 4 and lane 5 can be detected.

Spur 6 zeigt die Position des konventionell modifizierten Nukleotids mit einem makromolekularen Marker, (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy3, die obere Bande, und die Position des markierten Primers (die untere Bande).track Figure 6 shows the position of the conventionally modified nucleotide with a macromolecular marker, (dUTP-16-biotin) 4-SA-Cy3, the upper band, and the position of the labeled primer (the lower Band).

Spur 7 zeigt das Ergebnis des Einbaus von dUTP-16-Biotin mit einer nachfolgenden Reaktion mit dem Streptavidin: die mit Biotin makkierten Primer reagieren mit Streptavidin und verändern ihre Laufeigenschaften. Die nicht modifizierten Primer behalten ihre elektrophoretischen Eigenschaften bei.track Figure 7 shows the result of incorporation of dUTP-16 biotin with a subsequent one Reaction with streptavidin: the biotin-labeled primer react with streptavidin and change their running properties. The unmodified primers retain their electrophoretic properties at.

Spur 8 zeigt das Ergebnis der Einbaureaktion eines konventionell modifizierten Nukleotides, dUTP-16-Biotin. Man sieht eine verbreitete Primer-Bande, die durch den Einbau von dUTP-16-Biotin in den Primer zustande kommt. Die Verlängerung von Primer ist eingeschränkt, da dUTP-16-Biotin nicht unbegrenzt nacheinander eingebaut werden kann, durchschnittlich wird ca. 3 dUTP-Analoga eingebaut, so dass die Länge von Primer durchschnittlich auf 38 NT ansteigt. Erwartungsgemäß führt der Einbau von konventionell modifizierten Nukleotiden mit einem niedermolekularen Marker nicht zu einer starken Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität der Primer.track 8 shows the result of the incorporation reaction of a conventionally modified one Nucleotides, dUTP-16-biotin. You see a common primer band, which is due to the incorporation of dUTP-16-biotin into the primer. The extension Primer is restricted, because dUTP-16-biotin are not incorporated indefinitely one after the other On average, about 3 dUTP analogs are incorporated, so that the length of Average primer rises to 38 NT. As expected, the leads Incorporation of conventionally modified nucleotides with a low molecular weight Marker does not cause a strong change in the electrophoretic mobility the primer.

In diesem Experiment wurden Eigenschaften der Nuk-Makromoleküle, (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, mit denen der Konventionell modifizierten Nukleotide verglichen. Man sieht deutlich, dass die Kopplung eines makromolekularen Markers an ein kommerziell erworbenen dUTP-16-Biotin zum vollständigen Verlust der Substrateigenschaften der Nukleotide führt. Spuren 7 und 8 zeigen allerdings, dass die Polymerase sehr wohl in der Lage ist, dUTP-16-Biotin ohne makromolekularen Marker in den Primer einzubauen. Die Koppung von Streptavidin an das Biotin nach der Einbaureaktion führt zu genannten Veränderungen in Primer-Eigenaschaften.In properties of the nuc macromolecules (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA, compared with those of conventionally modified nucleotides. It can be clearly seen that the coupling of a macromolecular marker to a commercially purchased dUTP-16 biotin for complete loss the substrate properties of the nucleotides leads. Lanes 7 and 8 show however, that the polymerase is well able to dUTP-16-biotin Install without macromolecular marker in the primer. The coupling of streptavidin to the biotin after the incorporation reaction leads to said changes in primer properties.

Im Gegensatz dazu können Nuk-Makromoleküle (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA in den Primer ohne Schwierigkeiten durch die Polymerasen eingebaut werden. Das Auftreten von mehreren Banden im Gel führen die Erfinder auf einen mehrfachen Einbau von Nuk-Makromolekülen in den Primer (3 Banden) zurück.in the Contrary to this Nuc-macromolecules (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA in the primer without difficulty the polymerases are incorporated. The appearance of several gangs in the gel lead the Inventor of a multiple incorporation of nuc macromolecules in the Primer (3 bands) back.

Beispiel 34C, 40:Example 34C, 40 :

Vergleich von Substrateigenschaften von Nuk-Makromolekülen, Einbau- Reaktion in der Lösung und an einer festen PhaseComparison of substrate properties of nuc macromolecules, Built-in reaction in the solution and at a fixed phase

Sequenzen:sequences:

  • Primer: (dT35-Cy3) Primer-dT-35-5'-Cy3: 5'Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3Primer: (dT35-Cy3) Primer dT-35-5'-Cy3: 5'Cy3-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3
  • Matrize: Poly-dA (Amersham), durchschnittlich 270 Nukleotide lang. Oligo-dA50-3'-TEG-Biotin (MWG-Biotech)Die: Poly-dA (Amersham), an average of 270 nucleotides long. Oligo dA50-3'-TEG-biotin (MWG-Biotech)
  • Nukleotide: (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA, (dU-AA-PEG-Biotin)4-SA Streptavidin-polystyre Particle, 2.17μ, Spherotech Inc,Nucleotides: (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA, (dU-AA-PEG-biotin) 4-SA Streptavidin polystyre Particle, 2.17μ, Spherotech Inc,

Vorbereitung von Streptavidin-polystyren Kügelchen (feste Phase).Preparation of streptavidin-polystyrene globule (solid phase).

Drei Ansätze wurden in gleicher Weise vorbereitet.Three approaches were prepared in the same way.

Je 0.5ml der Lösung mit Kügelchen (im Hersteller-Puffer) wurde kurz zentrifugiert und Kügelchen-Pellet wurde in 100μl Einbaupuffer (20 mmol/l Tris, pH 8.5, 5mmol/l MgCl2) resuspendiert. Anschließend wurden 100μl Oligo-dA50-3'-TEG-Biotin Konz. 50μmol/l zugegeben und 1 h bei RT gerührt. In dieser Zeit binden die Oligo-dA-Moleküle an die Kügelchen. Anschließend wurden Kügelchen kurz abzentrifugiert und drei mal im Einbaupuffer gewaschen. Endvolumen der festen Phase betrugt je 100μl. Diese Menge an Oligo-dA50-feste-Phase kann Primer-dT-35-Cy3 in 2μmol/l hybridisieren.ever 0.5ml of the solution with beads (in manufacturer buffer) was centrifuged briefly and pellet pellet was in 100μl Incorporation buffer (20 mmol / l Tris, pH 8.5, 5 mmol / l MgCl2) resuspended. Subsequently were 100μl Oligo dA50-3'-TEG-biotin Conc. 50μmol / l added and stirred for 1 h at RT. During this time, the oligo-dA molecules bind to the beads. Subsequently were globule centrifuged briefly and washed three times in the built-in buffer. final volume the solid phase amounted to 100 μl each. This amount of oligo-dA50 solid phase can hybridize primer dT-35-Cy3 in 2 μmol / L.

Die Hybridisierung von Primer-dT-35-Cy3 erfolgte bei 40°C 10 min, mit anschließender Abkühlung auf RT innerhalb von 10 min. Alle anderen Schritte wurden gleich bei allen Ansätzen durchgeführt.The Hybridization of primer dT-35-Cy3 was carried out at 40 ° C for 10 min, with following Cooling to RT within 10 min. All other steps became the same in all approaches carried out.

Figure 00960001
Figure 00960001

Legende:Legend:

Spuren 1-10:Tracks 1-10:

  • 1) Leiter: dT35-Cy3, dT40-Cy3,1) conductors: dT35-Cy3, dT40-Cy3,

Reaktionen in der Flüssigphase:Reactions in the liquid phase:

  • 2) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase2) (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase
  • 3) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA3) (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA
  • 4) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA4) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase, Incubation for 1 h at 37 ° C, then + EDTA
  • 5) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA+ Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA, anschließend + Mercaptoethanol bis zu 200mmol/l (Endkonzentration), für 30 min.5) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA + polymerase, Incubation for 1 h at 37 ° C, then + EDTA, then + Mercaptoethanol up to 200mmol / L (final concentration), for 30 min.
  • 6) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Poly-dA + EDTA6) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + poly-dA + EDTA

Reaktionen an der Festphase:Reactions at the solid phase:

  • 7) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase + Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA7) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + oligo-dA50-solid phase + Polymerase, incubation for 1 h at 37 ° C, then + EDTA
  • 8) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase + Polymerase, Inkubation 1 h bei 37°C, dann + EDTA, anschließend + Mercaptoethanol bis zu 200mmol/l (Endkonzentration), für 30 min.8) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + oligo-dA50-solid phase + Polymerase, incubation for 1 h at 37 ° C, then + EDTA, then + mercaptoethanol up to 200mmol / L (final concentration), for 30 min.
  • 9) (dUTP-AA-SS-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + Oligo-dA50-feste-Phase, vor Elektrophorese + EDTA9) (dUTP-AA-SS-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + oligo-dA50 solid phase, before electrophoresis + EDTA
  • 10) Leiter: dT35-Cy3, dT40-Cy3, 10) conductors: dT35-Cy3, dT40-Cy3,

Man sieht deutlich das Ergebnis der Einbaureaktion von Nuk-Makromolekülen in Spuren 2,4,5,7,8. Sowohl in der Lösung, als auch an der festen Phase läuft die enzymatische Markierungsreaktion gut ab.you clearly sees the result of the incorporation reaction of nuc macromolecules in traces 2,4,5,7,8. Both in the solution, as well as running on the solid phase the enzymatic labeling reaction is good.

Nach Zugabe von Mercaptoethanol zu mit EDTA gestoppten Reaktionen erfolgt die Abspaltung von Linker-Komponenten mit dem gebundenen Streptavidin von den Primern. Dies fühhrt zu Wiederherstellung der elektrophoretischen Eigenschaften der Primer. Die Verschiebung der Primer-banden in Spuren 5 und 8 ist durch multiplen Einbau von Nuk-Makromolekülen in die Primer zu begründen. Tatsächlich, liegen die Primer-Banden nach der Spaltung in Höhe von dT40-Cy3 (s. Leiter). Dies bedeutet, dass bis zu 5 Nuk-Makromolekülen während der Reaktion in die Primer eingebaut wurden.To Add mercaptoethanol to EDTA stopped reactions the cleavage of linker components with the bound streptavidin from the primers. This leads to restore the electrophoretic properties of the primers. The shift of the primer bands in lanes 5 and 8 is by multiple Incorporation of nuc macromolecules to justify in the primer. Indeed, After cleavage, the primer bands are at the level of dT40-Cy3 (see ladder). This means that up to 5 nuc-macromolecules during the reaction in the primer were installed.

Beispiel 35, 41:Example 35 41 :

Substrateingenschaften der Nuk-Makromoleküle und konventionell modifizierter Nukleotide gegenüber Terminaler Transferase (TdT).Substrate Properties the nuc macromolecules and conventionally modified nucleotides versus terminal transferase (TdT).

Die Reaktion wurde nach Angaben des Kit-Herstellers (Roche) durchgeführt: Auf jeweils 50μl Volumen wurden zugegeben: 10μl 5x Reaktionspuffer, 1μl TdT (25Units), 5μl 25mmol/l CoCl2. Die Primer- und Nukleotid-Konzentrationen waren wie bei den Polymerase-Reaktionen. Die Reaktion wurde für 2 h bei 37°C durchgeführt.
Primer: Primer-dT35-5'-Cy3 (dT35-Cy3), Primer-dT35 (dT35)

Figure 00970001
The reaction was carried out according to the kit manufacturer (Roche): to each 50 .mu.l volume were added: 10 .mu.l 5x reaction buffer, 1 .mu.l TdT (25Units), 5 .mu.l 25mmol / l CoCl 2 . The primer and nucleotide concentrations were as in the polymerase reactions. The reaction was carried out for 2 h at 37 ° C.
Primer: primer dT 35 -5'-Cy3 (dT35-Cy3), primer dT 35 (dT35)
Figure 00970001

Legende:Legend:

  • 1) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + TdT1) (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + TdT
  • 2) (dUTP-AA-PEG-Biotin)4-SA + dT35-Cy32) (dUTP-AA-PEG-biotin) 4-SA + dT35-Cy3
  • 3) dUTP-Cy3 (Amersham)+ dT35 + TdT 3) dUTP-Cy3 (Amersham) + dT35 + TdT
  • 4) dUTP-Cy3 (Amersham)+ dT354) dUTP-Cy3 (Amersham) + dT35
  • 5) dUTP-16-Biotin (Roche) + dT35-Cy3 + TdT;5) dUTP-16-biotin (Roche) + dT35-Cy3 + TdT;
  • 6) Ansatz 5; nach dem Stop + Streptavidin6) approach 5; after stopping + streptavidin
  • 7) Streptavidin -Cy27) streptavidin -Cy2
  • 8) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy3 + TdT8) (dUTP-16-biotin) 4-SA + dT35-Cy3 + TdT
  • 9) (dUTP-16-Biotin)4-SA + dT35-Cy39) (dUTP-16-biotin) 4-SA + dT35-Cy3
  • 10) (dUTP-l6-Biotin)4-SA-cy210) (dUTP-16-biotin) 4-SA-cy2

In der Spur 1 sieht man deutlich 2 Banden, die Bande in der Mitte entspricht dem dT35-Cy3, die obere Bande entspricht dem Reaktionsprodukt: Nuk-Makromolekül wurde in dT35 durch TdT eingebaut. Spur 2 dient als Negativkontrolle. In Spur 3 sieht man das Ergebnis der Markierung des dT35 mit dem konventionellen Nukleotid dUTP-Cy3, Spur 4 ist die Nagativkontrolle. In Spur 5 ist das Ergebnis der Kopplung von dUTP-16-Biotin an die dT35-Cy3 schlecht zu erkennen. In Spur 6 sieht man allerdings eine schache Bande im oberen Bereich, die dem Ergebnis der Reaktion des mit dUTP-16-Biotin modifizierten Primers mit Streptavidin entspricht. Spur 7 zeigt die Position des modifizierten Streptavidins. In Spur 8 und 9 sieht man nur eine Bande in der Mitte des Gels, die dem dT35-Cy3 entspricht, im oberen Gel-bereich ist keine Bande zu sehen, was eindeutig darauf deutet, dass konventionell modifizierten Nukleotide mit einem makromolekularen Marker von TdT nicht eingebaut werden. Spur 10 zeigt die Position des (dUTP-16-Biotin)4-SA-Cy2 im Gel.In On track 1 you can clearly see 2 bands corresponding to the band in the middle the dT35-Cy3, the upper band corresponds to the reaction product: Nuk macromolecule was installed in dT35 by TdT. Lane 2 serves as a negative control. In lane 3 you can see the result of marking the dT35 with the conventional nucleotide dUTP-Cy3, Lane 4 is the nagative control. In track 5, the result is the Coupling of dUTP-16-biotin to the dT35-Cy3 difficult to detect. In track 6, however, you can see a shabby band in the upper area, the the result of the reaction of dUTP-16-biotin modified primer with Streptavidin corresponds. Lane 7 shows the position of the modified Streptavidin. In lanes 8 and 9 you only see one band in the middle of the gel corresponding to the dT35-Cy3 is in the upper gel region no gang to see, which clearly indicates that conventional modified nucleotides with a macromolecular marker of TdT not installed. Lane 10 shows the position of (dUTP-16-biotin) 4-SA-Cy2 in the gel.

Beispiel 36:Example 36:

dUTP-AA-SS-PEG-Cy3, 42A dUTP-AA-SS-PEG-Cy3, 42A

Zunächst wurde SH-PEG-Cy3 hergestellt. Zu 200μl einer 10mmol/l Lösung von Diamin-PEG (6kDa, Fluka) in 50mmol/l Borat-Puffer, pH 8, wurde Cy3-NHS (Amersham-Bioscience) bis zu Endkonzentration von 15mol/l zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 30 min lang durchgeführt. Anschließend wurde NH2-PEG-Cy3 (42B) von Farbstoffresten durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 abgetrennt, 3 mal mit 1ml 50mmol/l Borat-Puffer, pH 8, gewaschen und in einem Volumen von 200μl 50mmol/l Borat-Puffer, pH 8, aufgelöst.First, SH-PEG-Cy3 was prepared. To 200μl of a 10mmol / L solution of diamine PEG (6kDa, Fluka) in 50mmol / L borate buffer, pH 8, was added to Cy3-NHS (Amersham-Bioscience) to a final concentration of 15mol / L. The reaction was carried out at RT for 30 minutes. Subsequently, NH 2 -PEG-Cy 3 ( 42B ) of dye residues by ultrafiltration with MWCO 3000 separated, washed 3 times with 1ml 50mmol / l borate buffer, pH 8, and dissolved in a volume of 200μl 50mmol / l borate buffer, pH 8, dissolved.

Zu dieser Lösung wurde PDTP-NHS bis zu Endkonzentration von 50mmol/l zugegeben. Die Reaktion wurde bei RT 30 min lang durchgeführt. Anschließend wurden 50μl einer 1mmol/l Lösung von NH4HCO3, pH 8, zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde weitere 60 min inkubiert. Zur Reduktion der Disulfidbindungen wurden 100μl einer 1mmol/l TCEP-Lösung, pH 8, zum Reaktionsgemisch zugegeben. Nach 5 min bei RT wurde das Produkt der Reaktion, das SH-PEG-Cy3, von den niedermolekularen Komponenten durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 abgetrennt, 5mal mit 1ml 50 mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 7, gewaschen und in einem Volumen von 200μl 50mmol/l Tris-HCl, pH 7, aufgelöst. Unmittelbar vor Kopplung des Nukleotid-Teils wurde der pH-Wert auf 9.0 mit 1mol/l NaOH eingestellt.To this solution was added PDTP-NHS to a final concentration of 50 mmol / L. The reaction was carried out at RT for 30 minutes. Subsequently, 50 μl of a 1 mmol / l solution of NH 4 HCO 3 , pH 8, were added and the reaction mixture was incubated for a further 60 min. To reduce the disulfide bonds, 100 μl of a 1 mmol / l TCEP solution, pH 8, was added to the reaction mixture. After 5 min at RT, the product of the reaction, the SH-PEG-Cy3, was separated from the low molecular weight components by ultrafiltration with MWCO 3000, washed 5 times with 1 ml of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7, and in one volume of 200μl 50mmol / L Tris-HCl, pH 7, dissolved. Immediately before coupling the nucleotide portion, the pH was adjusted to 9.0 with 1 mol / l NaOH.

Kopplung des SH-PEG-Cy3 an den Nukleotid-Teil: Zu 100μl 20mmol/l dUTP-AA-PDTP in 50mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurden 100μl der Lösung mit SH-PEG-Cy3 in 50mmol/l Tris-HCl, pH 9.0, zugegeben. Reaktion wurde bei RT über 30 min durchgeführt. Das Produkt der Reaktion wurde durch Ultrafiltration mit MWCO 3000 von niedermolekularen Komponenten abgetrennt, 5 mal mit 1 ml 50mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 7, gewaschen und in einem Volumen von 200μl 50mmol/l Tris-HCl, pH 7, aufgelöst.coupling of the SH-PEG-Cy3 to the nucleotide part: To 100 μl 20 mmol / l dUTP-AA-PDTP in 50 mmol / l borate buffer, pH 9, were 100μl the solution with SH-PEG-Cy3 in 50mmol / L Tris-HCl, pH 9.0. reaction became over at RT 30 min. The product of the reaction was purified by ultrafiltration with MWCO 3000 separated from low molecular weight components, 5 times with 1 ml 50mmol / l Tris-HCl buffer, pH 7, washed and in a volume of 200μl 50mmol / l Tris-HCl, pH 7, dissolved.

Das auf diese Weise erhaltene dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 kann von DNA-Polymerasen, beispielsweise Klenow-Fragment Exo-minus oder Taq-Polymerase, in den wachsenden Strang der Nukleinsäuren eingebaut werden.The dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 obtained in this way can be incorporated into the growing strand of nucleic acids by DNA polymerases, for example Klenow fragment exo-minus or Taq polymerase become.

Das dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 enthält eine unter milden Bedingungen spaltbare Gruppe, so dass der Linker mit dem Farbstoff von dem Nukleotid abgespalten werden kann. Dies ist beispielsweise in Verfahren der Sequenzierung durch die Synthese vom besonderen Interesse (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).The contains dUTP-AA-SS-PEG-Cy3 a cleavable group under mild conditions, leaving the linker can be cleaved with the dye from the nucleotide. This is for example in methods of sequencing by the synthesis of special interest (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892).

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 5-Propargylamino-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2' -Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14.This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 5-propargylamino-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as indicated above. Both ribonucleotides, 2'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 ,

Beispiel 37:Example 37:

dUTP-R-CO-S-PEG-Biotin 43 dUTP-R-CO-S-PEG-Biotin 43

Das dUTP-R-COOCH3 (44) wurde analog zur Vorschrift (Heike A. Held, Abhijit Roychowdhury, and Steven A. Benner , Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, Vol 22,391-404 (2003)) synthetisiert. Die Triphosphatsynthese erfolgte nach T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol 29, 4525-4588 (1988)).The dUTP-R-COOCH 3 ( 44 ) was synthesized analogously to the protocol (Heike A. Held, Abhijit Roychowdhury, and Steven A. Benner, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, Vol 22, 391-404 (2003)). The triphosphate synthesis was carried out according to T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol 29, 4525-4588 (1988)).

500mg (1.41 mmol) 5-Iod-2'-Deoxyuridin wurden bei Raumtemperatur in 10ml wasserfreiem DMF unter Stickstoffatmosphäre suspendiert und 10 min. gerührt. Nun gibt man 160 mg ( 0.14 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)-palladium(0) zu: Nach weiteren 10 min gibt man nacheinander 400μl Triethylamin, 480 mg (4.28 mmol) Pent-1-insäuremethylester und 55 mg (0.29 mmol) Kupfer-(I)-iodid zu. Nach 15 h wird die Reaktionsmischung am Rotationsverdampfer eingeengt und das erhaltene rote Öl chromatographisch an Kieselgel gereinigt (Dichlormethan : Methanol = 20 : 1). Man erhält 400 mg (84%) Produkt. Nach Triphosphorylierung wurde dUTP-R-COOCH3.erhalten.500 mg (1.41 mmol) of 5-iodo-2'-deoxyuridine were suspended at room temperature in 10 ml of anhydrous DMF under a nitrogen atmosphere and stirred for 10 min. touched. 160 mg (0.14 mmol) of tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0) are then added. After a further 10 minutes, 400 μl of triethylamine, 480 mg (4.28 mmol) of pent-1-methylate and 55 mg (0.29 mmol) of copper are added in succession. (I) iodide too. After 15 h, the reaction mixture is concentrated on a rotary evaporator and the resulting red oil is purified by chromatography on silica gel (dichloromethane: methanol = 20: 1). 400 mg (84%) of product are obtained. After triphosphorylation, dUTP-R-COOCH 3. Was obtained.

In ähnlicher Weise können auch andere Basen wie Cytosin, Adenosin und Guanosin-Derivaten mit dem Pent-1-insäuremethylester modifiziert werden (Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002).In similar Way you can Other bases such as cytosine, adenosine and guanosine derivatives with the Pent-1-ynoate (Dissertation "Synthesis of base-modified nucleoside triphosphates and their enzymatic polymerization to functionalized DNA ", Oliver Thum, Bonn 2002).

Weitere Modifikation erfolgt am dUTP-R-COOCH3:
Zu 100μl einer 50mmol/l Lösung der dUTP-R-COOCH3 in 50mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wird 100μl einer 1mol/l Lösung des Merkaptoethanolamins, pH 9, zugegeben und bei 40°C 3 h gerührt. Das Produkt der Reaktion,
das dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH2 (45), wird vom überschüssigen Merkaptoethanolamin auf DEAE-Cellulose im Borat-Puffer 10mmol/l abgetrennt und mit 0,3mol/l NaCl von der Säule eluiert.Further modification takes place on dUTP-R-COOCH 3 :
To 100 μl of a 50 mmol / l solution of dUTP-R-COOCH 3 in 50 mmol / l borate buffer, pH 9, 100 μl of a 1 mol / l solution of the mercaptoethanolamine, pH 9, is added and stirred at 40 ° C. for 3 h. The product of the reaction,
the dUTP-R-CO-S-CH 2 -CH 2 -NH 2 ( 45 ), is separated from the excess mercaptoethanolamine on DEAE-cellulose in the borate buffer 10 mmol / l and eluted from the column with 0.3 mol / l NaCl.

Dieses Nukleotid hat eine unter milden Bedingungen spaltbare Thioester-Gruppe und kann an der Aminogruppe am Linker modifiziert werden.This Nucleotide has a thioester group cleavable under mild conditions and may be modified at the amino group on the linker.

An diese Amino-Gruppe können weitere Modifikationen vorgenommen werden. Beispielsweise kann an sie ein Farbstoff gekoppelt werden:
Synthese von dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH-R-Cy3 (46)Further modifications can be made to this amino group. For example, a dye can be coupled to it:
Synthesis of dUTP-R-CO-S-CH 2 -CH 2 -NH-R-Cy3 ( 46 )

Zu 100μl einer 10mmol/l Lösung des dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH2 in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurde Cy3-NHS bis zu Konzentration von 15 mmol/l zugegeben. Die Reaktion erfolgte bei RT über 30 min. Anschließend wurde das mit Cy3-modifiziertes Nukleotid auf Kieselgel-Platte und RP-18 Säule gereinigt, ähnlich wie in Beispiel 15 dargestellt.To 100 μl of a 10 mmol / l solution of dUTP-R-CO-S-CH 2 -CH 2 -NH 2 in 50 mmol / l borate buffer, pH 9, was added Cy3-NHS to a concentration of 15 mmol / l. The reaction was carried out at RT for 30 min. Subsequently, the Cy3-modified nucleotide on silica gel plate and RP-18 column was purified, similar to that shown in Example 15.

Ein solches Nukleotid kann als reversibler Terminator in einem Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden (Tcherkassov WO 02088382). Die Spaltung der Thioester-Verbindung kann beispielsweise durch Zugabe von 100 mmol/l Merkaptoethanol in 50mmol/l Borat-Puffer, pH 9, erfolgen.One such nucleotide can be used as a reversible terminator in a method for sequencing nucleic acids can be used (Tcherkassov WO 02088382). The cleavage of the thioester compound For example, by adding 100 mmol / l mercaptoethanol in 50mmol / l borate buffer, pH 9, take place.

An die Aminogruppe des dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH2 kann auch ein langer Linker mit einem niedermolekularen Marker gekoppelt werden, ähnlich wie im Beispiel 19. Das erhaltene dUTP-R-CO-S-CH2-CH2-NH-PEG-Biotin kann als Zwischenprodukt für ein Nuk-Makromolekül dienen.To the amino group of the dUTP-R-CO-S-CH 2 -CH 2 -NH 2 , a long linker can also be coupled with a low molecular weight marker, similar to Example 19. The obtained dUTP-R-CO-S-CH 2 -CH 2 -NH-PEG-biotin may serve as an intermediate for a nuc macromolecule.

Beispiel 38:Example 38:

dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3-PEG (47),dUTP-AA-SS-Propionate-TEAE-Cy3-PEG ( 47 )

Dieses Derivat kann aus dUTP-AA-SS-Propionat-TEAE-Cy3 (s. Beispiel 17) durch Modifikation der Aminogruppe im Linker mit einem mPEG-SPA, z.B. 5.000 Da, erhalten werden. Die Modifikationsbedingungen sind ähnlich wie im Beispiel 19. Dieses Molekül besitzt einen langen Linker und kann durch die erfindungsgemäße Methode zur schnellen Reinigung der modifizierten Nukleotide vor ihrem Einsatz in den Markierungsreaktionen eingesetzt werden. Für eine Trennung von markierten von unmarkierten Nukleotiden kann in diesem Beispiel ein Filter mit MWCO von 3000 verwendet werden.This Derivative can be prepared from dUTP-AA-SS-propionate-TEAE-Cy3 (see Example 17). by modification of the amino group in the linker with an mPEG-SPA, e.g. 5,000 Da, to be obtained. The modification conditions are similar in Example 19. This molecule has a long linker and can by the method of the invention for rapid purification of the modified nucleotides prior to their use used in the labeling reactions. For a breakup of labeled unlabeled nucleotides may be in this example a filter with MWCO of 3000 can be used.

Beispiel 39:Example 39:

Synthese von dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 (48)Synthesis of dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 ( 48 )

Hestellung von SH-R-PEG-OIigo-dT31-Cy3 (49): Zu 200μl einer 100μmol/l Lösung von 3'-Amino-Oligo-dT31-Cy3 im 50mmol/l Borat-Puffer, pH 9, wurde NHS-PEG-Maleimid zugegeben, bis die Konzetration von 20% (w/v) erreicht wurde. Das Gemisch wurde 2 h bei 40°C kräftig gerührt. Die Trennung des Maleimid-PEG-OIigo-dT31-Cy3 vom Überschuß an PEG-Derivat erfolgte aug DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie: Das Reaktionsgemisch wurde in 10mmol/l Borat, pH 9, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50mmol/l Borat, pH 9, gewaschen. Elution von Maleimid-PEG-Oligo-dT31-Cy3 von der Säule erfolgte mit 1 M NaCl in 50mmol/l Borat, pH 9. Das Eluat wurde durch Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt wurde in 20mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, umgepuffert. Das Maleimid-PEG-Oligo-dT31-Cy3 wurde vom Oligo-dT31-Cy3 auf präparativem 15% Polyacrylgel durch die Elektrophorese getrennt, aus dem Gel isoliert und in 50mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0, aufgelöst. Ausbeute: 55%.Preparation of SH-R-PEG-oligo-dT 31 -Cy3 ( 49 To 200 μl of a 100 μmol / l solution of 3'-amino-oligo-dT 31 -Cy 3 in 50 mmol / l borate buffer, pH 9, NHS-PEG-maleimide was added until the concentration of 20% (w / v ) has been achieved. The mixture was stirred vigorously at 40 ° C for 2 h. The separation of the maleimide-PEG-oligo-dT 31 -Cy3 from the excess of PEG derivative was carried out by DEAE-cellulose column chromatography: The reaction mixture was applied to the column in 10 mmol / l borate, pH 9, and with 20 column volumes 50 mmol / l borate, pH 9, washed. Elution of maleimide-PEG-oligo-dT 31 -Cy3 from the column was carried out with 1 M NaCl in 50 mmol / l borate, pH 9. The eluate was initially concentrated by ultrafiltration (MWCO 3000) and the product was dissolved in 20 mmol / l borate. Buffer, pH 9.0, buffered. The maleimide-PEG-oligo-dT 31 -Cy3 was separated from oligo-dT 31 -Cy3 on preparative 15% polyacrylic gel by electrophoresis, isolated from the gel and dissolved in 50 mmol / l borate buffer, pH 9.0. Yield: 55%.

Zu Lösung mit Maleimid-PEG-Oligo-dT31-Cy3 wurde DTT bis zu Konzentration 0,5mol/l zugegeben und das Gemisch wurde 16 h bei RT gerührt. Durch Reaktion von DTT mit Maleimid entsteht SH-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3. Diese Substanz wurde auf DEAE-Säule vom DTT-Überschuß abgetrennt: Das Reaktionsgemisch wurde in 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0 gewaschen. Elution von SH-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 von der Säule erfolgte mit 1mol/l NaCl in 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0. Das Eluat wurde mit Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt, SH-R-PEG-Oligo- dT31-Cy3, wurde in 50mmol/l Borat-Puffer, pH 9.0 umgepuffert. Die Konzentration von SH-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 betrug 100μmol/l.To solution with maleimide-PEG-oligo-dT 31 -Cy3, DTT was added to a concentration of 0.5 mol / L and the mixture was stirred at RT for 16 h. Reaction of DTT with maleimide gives rise to SH-R-PEG-oligo-dT 31 -Cy3. This material was separated on DTT excess DEAE column. The reaction mixture was applied to the column in 50mmol / L Na acetate, pH 6.0, and washed with 20 column volumes of 50mmol / L Na acetate, pH 6.0. Elution of SH-R-PEG-oligo-dT 31 -Cy3 from the column was carried out with 1 mol / l NaCl in 50 mmol / l Na-acetate, pH 6.0. The eluate was first concentrated by ultrafiltration (MWCO 3000) and the product, SH-R-PEG-Oligo dT 31 -Cy3, was rebuffered in 50 mmol / l borate buffer, pH 9.0. The concentration of SH-R-PEG-oligo-dT 31 -Cy3 was 100 μmol / l.

Zu dieser Lösung wurden 50 Äquivalente an dUTP-AA-PDTP (synthetisiert wie im Beispiel 1) zugegeben. Nach 3 h bei RT erfolgte Trennung auf DEAE-Cellulose: Das Gemisch wurde in 50mmol/l Na-Acetat-Puffer, pH 6.0, auf die Säule aufgetragen, und mit 20 Säulenvolumina 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, gewaschen. Elution von dUTP-AA-PDTP erfolgte mit 0,3mol/l NaCl in 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, Elution von dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3 erfolgte mit 0,8mol/l NaCl in 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0. Das Eluat wurde mit Ultrafiltration (MWCO 3000) zunächst eingeengt und das Produkt wurde in 50mmol/l Na-Acetat, pH 6.0, umgepuffert.To this solution were 50 equivalents to dUTP-AA-PDTP (synthesized as in Example 1). To Separation on DEAE-cellulose for 3 h at RT: The mixture was in 50mmol / L Na acetate buffer, pH 6.0, applied to the column, and with 20 column volumes 50mmol / l Na-acetate, pH 6.0, washed. Elution of dUTP-AA-PDTP was done with 0.3 mol / l NaCl in 50 mmol / l Na-acetate, pH 6.0, elution of dUTP-AA-SS-R-PEG-oligo-dT31-Cy3 carried out with 0.8 mol / l NaCl in 50 mmol / l Na-acetate, pH 6.0. The eluate was with Ultrafiltration (MWCO 3000) first concentrated and the product was rebuffered in 50mmol / l Na acetate, pH 6.0.

Die Substanz trägt eine Nukleosid-Triphosphat-Funktionalität und eine makromolekulare Marker-Funktionalitäten (Oligo-dT31). Das Oligo-dT31 besteht aus Nukleosid-Monophosphaten, die allerdings an der enzymatischen Reaktion nicht teilnehmen und nur eine signalvermittelnde Funktion haben. An ein solches Oligonukleotid können komplementäre Nukleinsäuren hybridisiert werden, die eine signalgebende Funktion haben (37B). (allgemeine Regeln zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind dem Fachmann bekannt, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.).The substance carries a nucleoside triphosphate functionality and a macromolecular marker functionalities (oligo-dT31). The oligo-dT31 consists of nucleoside monophosphates, which, however, do not participate in the enzymatic reaction and have only one signal-transmitting function. To such an oligonucleotide complementary nucleic acids can be hybridized, which have a signaling function ( 37B ). (general rules for the hybridization of nucleic acids are known in the art, Anderson "Nucleic Acid Hybridization", 1999.).

Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat akzeptiert.These Compound is derived from polymerases (e.g., Klenow exo minus polymerase and terminal transferase) as a substrate.

In ähnlicher Weise können auch andere Oligonukleotide an das dUTP-Derivat gekoppelt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung können andere Homopolymer-Oligonukleotide, wie z.B. Poly-dC, poly-dG oder poly-dU oder poly-dA. In einer anderen Ausführungsform können auch Oligonukleotide mit spezifischen Sequenzen eingesetzt werden. Durch die spezifische Sequenzen von Oligonukleotiden können Nukleinsäureketten sequenzspezifisch hybridisiert werden. Zur Synthese von Nuk-Makromolekülen können auch Oligonukleotide eingesetzt werden, die Haarnadel-Strukturen (Stemloops) beinhalten.In similar Way you can Also, other oligonucleotides are coupled to the dUTP derivative. In one embodiment of the invention other homopolymer oligonucleotides, e.g. Poly-dC, poly-dG or poly-dU or poly-dA. In another embodiment, too Oligonucleotides with specific sequences can be used. By the specific sequences of oligonucleotides may be nucleic acid chains be hybridized sequence specific. For the synthesis of nuc macromolecules also oligonucleotides are used, the hairpin structures (Stemloops).

In diesem Beispiel trägt das Oligonukleotid eine am 3'-Ende über einen Linker gekoppelte Amino-Gruppe, die als Kopplungsstelle für Maleimid-PEG-NHS auftritt, und den Cy3-Fluoreszenzfarbstoff. Auch andere Kopplungsgruppen, wie SH-, Carboxy -, Aldehyd-Gruppen können eingesetzt werden.In carries this example the oligonucleotide one at the 3 'end via a Left-coupled amino group serving as a coupling site for maleimide-PEG-NHS occurs, and the Cy3 fluorescent dye. Also other coupling groups, such as SH, carboxy, aldehyde groups can be used.

Die Position der Kopplungsgruppe kann an einem der Enden der Oligonukleotide sein, oder auch mitten in der Sequenz liegen. Solche Oligonukleotide können von der Firma MWG-Biotech, Deutschland, synthetisiert werden.The Position of the coupling group may be at one of the ends of the oligonucleotides be in the middle of the sequence. Such oligonucleotides can from the company MWG-Biotech, Germany.

Als Modifikationen können Oligonukleotide Fluoreszenzfarbstoffe oder andere Reporter-Gruppen, wie Biotin, Digaxygenin tragen. Auch mehrere Modifikationen pro ein Oligonukleotid sind möglich. Beispielsweise können FRET-Paare oder Fluoreszenzfarbstoff-Quanchermolekül-Paar in ein Oligonukleotid eingefügt werden.When Modifications can Oligonucleotides fluorescent dyes or other reporter groups, like biotin, carry digaxygenin. Also several modifications per an oligonucleotide are possible. For example, you can FRET pairs or fluorescent dye quanine molecule pair in an oligonucleotide inserted become.

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino-dCTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP und 7-Deaza-Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 20'-Deoxyribonukleotide als auch 2',3'-Deoxyribonukletide verwendet werden, 11 bis 14. Auch andere basenmodifizierte Nukleotide können in ähnlicher Weise eingesetzt werden.This example shows a general possibility to further modify nucleotides. Other base-modified nucleotide analogs such as 5-propargylamino-dCTP, 5-amino-propargyl-dUTP, 7-deaza-aminopropargyl-dGTP, and 7-deaza-aminopropargyl-dATP may also be modified as noted above. Both ribonucleotides, 20'-deoxyribonucleotides and 2 ', 3'-deoxyribonuclides can be used, 11 to 14 , Other base-modified nucleotides can be used in a similar manner.

Durch Zugabe von Poly-dA oder Poly-A können mehrere dUTP-AA-SS-R-PEG-Oligo-dT31-Cy3, z.B. 10-20, zu einem Nuk-Makromolekül gekoppelt werden. Dabei entsteht ein Nuk-Makromolekül mit linear angeordneten Nuk-Linker-Komponenten (37 C). Durch Zugabe von anderen modifizierten Oligonukleotiden, die an Poly-dA oder Poly-A binden können, können auch weitere Modifikationen eingeführt werden, z.B. Fluoreszenzmarkierung.By adding poly-dA or poly-A, several dUTP-AA-SS-R-PEG-oligo-dT31-Cy3, eg 10-20, can be coupled to a nuc macromolecule. This results in a nuc macromolecule with linearly arranged nuc-linker components ( 37 C). By adding other modified oligonucleotides which can bind to poly-dA or poly-A, other modifications can also be introduced, eg fluorescence labeling.

Beispiel 40:Example 40:

Synthese von (dATP-PA-PEG)n-PAS-(Cy3)m Synthesis of (dATP-PA-PEG) n -PAS- (Cy3) m

Die Herstellung von dATP-PA-PEG-NH2 wurde im Beispiel 19 beschrieben.The preparation of dATP-PA-PEG-NH 2 was described in Example 19.

EDA-Cy3 wurde wie folgt synthetisiert: Zu 1ml wässriger EDA-Lösung, 400mmol/l, pH 8.5 eingestellt mit HCl, wurden 0,1mg Cy3-NHS zugegeben. Die Reaktion wurde 30 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde auf RP-18 getrennt (Wasser-Methanol-Gradient) und auf 0.2ml eingeengt.EDA-Cy3 was synthesized as follows: To 1ml aqueous EDA solution, 400mmol / l, pH 8.5 adjusted with HCl, 0.1 mg of Cy3-NHS was added. The Reaction was stirred for 30 min at RT. The product was separated on RP-18 (water-methanol gradient) and on 0.2ml concentrated.

PAS 100 kDa (35% wässrige Lösung) wurde durch mehrmaliges Einrotieren mit DMF in eine wasserfreie DMF-Lösung überführt. Anschließend wurde zu 200 μl einer 0,1 mmol/l PAS (2mg in 200μl) in DMF 3 mg CDI zugegeben. Reaktion erfolgte und 30 min bei RT. Anschließend wurden zu dieser Lösung gleichzeitig 0,2 ml 0,7mmol/l Lösung EDA-Cy3 und 0,2ml 0,5mmol/l dATP-PA-PEG-NH2 zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Anschließend wurde Produkt (dATP-PA-PEG)n-PAS- (Cy3)m durch Ultrafiltration mit 100kDa MWCO von EDA-Cy3 und dATP-PA-PEG-NH2 getrennt.PAS 100 kDa (35% aqueous solution) was converted into an anhydrous DMF solution by repeated rotation with DMF. Subsequently, 3 mg of CDI was added to 200 μl of a 0.1 mmol / l PAS (2 mg in 200 μl) in DMF. Reaction took place and for 30 min at RT. Subsequently, 0.2 ml of 0.7 mmol / l EDA-Cy3 solution and 0.2 ml of 0.5 mmol / l dATP-PA-PEG-NH 2 were simultaneously added to this solution. The reaction was carried out at RT for 1 h. Subsequently, product (dATP-PA-PEG) n -PAS- (Cy3) m was separated by ultrafiltration with 100kDa MWCO of EDA-Cy3 and dATP-PA-PEG-NH 2 .

Die durchschnittliche Zahl der Cy3-derivaten beträgt 5 pro ein PAS-Molekül, die durchschnittliche Zahl der Nuk-Einheiten (dATP) pro ein PAS-Molekül beträgt 2. Auf diese Weise wurde ein Nuk-Makromolekül synthetisiert, das mehrere Marker-Einheiten und mehrere Nuk-Einheiten einschließt.The average number of Cy3 derivatives is 5 per one PAS molecule, the average The number of Nuk units (dATP) per one PAS molecule is 2. In this way a nuc macromolecule synthesized multiple marker units and several Nuk units includes.

(dATP-PA-PEG)n-PA5-(Cy3)m dient als Substrat für die DNA-Polymerasen und kann in den Markierungsreaktionen eingesetzt werden.(dATP-PA-PEG) n -PA5- (Cy3) m serves as a substrate for the DNA polymerases and can be used in the labeling reactions.

Beispiel 41:Example 41:

Nuk-Makromoleküle als Monomer-Bestandteile eines OligonukleotidesNuc-macromolecules as monomer components an oligonucleotide

Beispiele der enzymatischen Einbaus von Nuk-Makromolekülen in die Nukleinsäure s. Beispiel 34 und 35.Examples of enzymatic Incorporation of nuc macromolecules into the nucleic acid s. Example 34 and 35.

Oben wurden Kopplungen eines langen Linkers und eines Markers an Nukleotid-Monomere beschrieben, die eine reaktive Gruppe tragen. In analoger Weise kann auch ein Nukleotid-Monomer, das als Teil eines Polymeres auftritt, z.B. einer Nukleinsäurekette, und eine reaktive Gruppe trägt, ebenfalls modifiziert werden. Bevorzugt winde bei der Modifizierung ein langer, linearer, nicht verzweigter Linker, wie PEG. Nukleotid-Monomere mit einer reaktiven Gruppe, beispielsweise einer Amino- oder Merkapto-Gruppe, können mit den Mitteln der konventionellen Oligonukleotid-Synthese in eine Nukleinsäurekette gekoppelt werden. Viele Modifikationen können bei einer Auftragssynthse, beispielsweise durch MWG-Biotech, in ein Oligonukleotid eingeführt werden.Above, couplings of a long linker and a label to nucleotide monomers bearing a reactive group have been described. In an analogous manner, a nucleotide monomer which occurs as part of a polymer, eg a nucleic acid chain, and carries a reactive group can also be modified. In the modification, a long, linear, non-branched linker, such as PEG, is preferred. Nucleotide monophosphate With a reactive group, such as an amino or mercapto group, mers can be coupled with the means of conventional oligonucleotide synthesis in a nucleic acid chain. Many modifications can be introduced into an oligonucleotide in a custom synthesis, for example by MWG-Biotech.

Synthese eines modifizierten Oligonukleotids:Synthesis of a modified oligonucleotide:

Ein Oligonukleotid mit 31 dT-Monomeren und einer am 5'-Ende gekoppelten Amino-Gruppe wurde von der MWG-Biotech synthetisiert (5'-Amino-dT31). An ein solches Oligonukleotid kann beispielsweise ein Fmoc-PEG-NHS Linker gekoppelt werden:
Zu 100μl wässriger Lösung 5'-Amino-dT31, 0,5mmol/l, pH 8.0, wurden 1mg Fmoc-PEG-NHS (Fmoc-geschützter NH2-PEG-NHS) gegeben und bei 30°C 8 Stunden gerührt. Anschließend wurde der pH-Wert auf 11 erhöht und die Reaktionsmischung weitere 2 Stdunden bei RT gerührt. Anschließend wurde das modifizierte Oligonukleotid durch Elektrophorese in einem 15% Polyacrylgel vom nicht modifizierten getrennt und isoliert. Das Produkt der Reaktion ist NH2-PEG-dT31 wurde in 50μl 50mmol Hydrogencarbonat-Puffer, pH 8,0, aufgelöst (Konzentration 0,3mmol/l). An die endständige Aminogruppe kann ein makromolekularer Marker gekoppelt werden.An oligonucleotide with 31 dT monomers and a 5'-end-coupled amino group was synthesized by MWG Biotech (5'-amino-dT31). For example, an Fmoc-PEG-NHS linker can be coupled to such an oligonucleotide:
To 100 μl of aqueous solution of 5'-amino-dT31, 0.5 mmol / l, pH 8.0, was added 1 mg of Fmoc-PEG-NHS (Fmoc-protected NH 2 -PEG-NHS) and stirred at 30 ° C for 8 hours. Subsequently, the pH was increased to 11 and the reaction mixture stirred for a further 2 hours at RT. Subsequently, the modified oligonucleotide was separated from the unmodified by electrophoresis in a 15% polyacrylic gel and isolated. The product of the reaction is NH2-PEG-dT31 was dissolved in 50 μl of 50 mmol bicarbonate buffer, pH 8.0 (concentration 0.3 mmol / l). To the terminal amino group, a macromolecular marker can be coupled.

Durch eine ähnliche Reaktion wie im Beispiel 40 kann ein mit einem makromolekularen Marker modifizieriertes Oligonukleotid synthetisiert werden: EDA-Cy3 wurde wie im Beispiel 40 synthetisiert. PAS 100 kDa (35% wässrige Lösung) wurde durch mehrmaliges Einrotieren mit DMF in eine wasserfreie DMF-Lösung überführt. Anschließend wurde zu 50μl einer 0,1mmol/l PAS in DMF 1 mg CDI (als konzentrierte Lösung in DMF) zugegeben. Reaktion erfolgte und 30 min bei RT. Anschließend wurden zu dieser Lösung gleichzeitig 50μl 1,5mmol/l Lösung EDA-Cy3 und 50μl 0,3mmol/l NH2-PEG-dT31 zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Std. bei RT durchgeführt. Anschließend wurde Produkt (dT31-PEG)n-PAS-(Cy3)m durch Ultrafiltration mit 100 kDa MWCO von EDA-Cy3 und NH2-PEG-dT31 getrennt.By a similar reaction as in Example 40, a macromolecular marker-modified oligonucleotide can be synthesized: EDA-Cy3 was synthesized as in Example 40. PAS 100 kDa (35% aqueous solution) was converted into an anhydrous DMF solution by repeated rotation with DMF. Subsequently, to 50 μl of a 0.1 mmol / l PAS in DMF, 1 mg of CDI (as concentrated solution in DMF) was added. Reaction took place and for 30 min at RT. Subsequently, 50 μl of 1.5 mmol / l solution of EDA-Cy3 and 50 μl of 0.3 mmol / l NH 2 -PEG-dT31 were simultaneously added to this solution. The reaction was carried out at RT for 1 h. Subsequently, product (dT31-PEG) n -PAS- (Cy3) m was separated from EDA-Cy3 and NH 2 -PEG-dT31 by ultrafiltration with 100 kDa MWCO.

Die durchschnittliche Zahl der Cy3-derivaten beträgt 7 pro ein PAS-Molekül, die durchschnittliche Zahl der gekoppelten Oligonukleotide pro ein PAS-Molekül beträgt 1. Auf diese Weise wurde ein mit einem polymer mofidiziertes Oligonukleotid synthetisiert, das ein Nuk-Makromolekül einschließt.The average number of Cy3 derivatives is 7 per one PAS molecule, the average Number of coupled oligonucleotides per one PAS molecule is 1. Up this way became a polymer mofidiziertes oligonucleotide which includes a nuc macromolecule.

Beispiel 42Example 42

Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker an einer Phosphatgruppe.Synthesis of a nuc macromolecule with a Linker on a phosphate group.

Ein Linker kann auch an die Phosphatgruppen eines Nukleotids gekoppelt werden. Die Kopplung einer reaktiven Gruppe, beispielsweise einer Amino-Gruppe an die endständige Phosphatgruppe ist bereits bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V 278, S. 363, A. Draganescu et al. J. Biol. Chem. 2000, V 275, 4555, Sood A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, V.127, 2394). Analog zu Synthesen in anderen Beispielen kann die Linker-Komponente an das Nukleotid gekoppelt werden.One Linker may also be coupled to the phosphate groups of a nucleotide become. The coupling of a reactive group, such as a Amino group to the terminal Phosphate group is already known (Jameson et al., Method in Enzymology, 1997, V 278, p. 363, A. Draganescu et al. J. Biol. Chem. 2000, V 275, 4555, Sood A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, V.127, 2394). Analogous to syntheses in other examples, the linker component be coupled to the nucleotide.

Hier wird die Synthese eines Nukleotidanalogs mit einer modifizierten 3'-Phosphatgruppe beschrieben. An eine so modifizierte phosphatgruppe kann ein Linker gekoppelt werden.Here is the synthesis of a nucleotide analogue with a modified Described 3'-phosphate group. A linker can be coupled to such a modified phosphate group become.

Zunächst wird 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(4-N-Fmoc-aminobutoxy)phosphoryl]- 2'-deoxythymidin synthetisiert. Daraus erhält man anschließend durch Phosphorylierung das 5'-Triphosphat. Nach Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe kann ein Linker an die endständige Aminofunktion gekoppelt werden.First, will 3'-O - [(2-cyanoethoxy) - (4-N-Fmoc-aminobutoxy) phosphoryl] - 2'-deoxythymidine synthesized. This gives one subsequently by phosphorylation the 5'-triphosphate. After removal of the Fmoc-protecting group, a linker to the terminal amino function be coupled.

Synthese von 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(4-N-Fmoc-aminobutoxy)phosphoryl]-2'-deoxythymidin.

Figure 01060001
Synthesis of 3'-O - [(2-cyanoethoxy) - (4-N-Fmoc-aminobutoxy) phosphoryl] -2'-deoxythymidine.
Figure 01060001

530 mg 5'-O-DMT-deoxythymidin-3'-O-(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)-phosphoramidit und 633 mg 4-(Fmoc-amino)-1-butanol wurden bei Raumtemperatur in 8 ml wasserfreiem Acetonitril unter Schutzgas (Stickstoff) vorgelegt. Innerhalb von 5 min. wurden 4.0 ml einer 0.45M Tetrazol-Lösung in Acetonitril zugetropft. Nach 12 h wurde zur Oxidation des Phosphoramidits Cumol-Hydroperoxide (135 mg) zugegeben. Nach 30 min wurde mit 150μl Isopropanol überschüssiges Cumol-Hydroperoxid zersetzt. Anschließend wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt.530 mg 5'-O-DMT-deoxythymidine-3'-O- (2-cyanoethyl) - (N, N-diisopropyl) -phosphoramidite and 633 mg of 4- (Fmoc-amino) -1-butanol were added at room temperature in 8 ml anhydrous acetonitrile under protective gas (nitrogen) presented. Within 5 min. were added 4.0 ml of a 0.45M tetrazole solution Acetonitrile was added dropwise. After 12 h, oxidation of the phosphoramidite was initiated Cumene hydroperoxides (135 mg) were added. After 30 minutes, 150 μl of isopropanol gave excess cumene hydroperoxide decomposed. Subsequently became the solvent removed on a rotary evaporator.

Zur Abspaltung der DTM-Schutzgruppe wurde der Rückstand in 20 ml einer Mischung aus Essigäure/Wasser(8/2) gelöst und bei Raumtemperatur gerührt. Nach ca. 2h zeigte die Reaktionskontrolle ( DC KG 60; Dichlormethan/Methanol = 95/5) kein Edukt mehr und es wurden 20ml Toluol zugesetzt und das Gemisch am Rotationsverdampfer eingeengt. Zur vollständigen Entfernung von Essigsäure und Wasser wurde noch 5 mal mit je 20ml Toluol eingeengt. Das erhaltene schwachrote Öl wurde durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt (2 mm PSC-Platte Merck; Dichlormethan/Methanol = 9/1).to Cleavage of the DTM protecting group became the residue in 20 ml of a mixture from acetic acid / water (8/2) solved and stirred at room temperature. After about 2 h, the reaction control (DC KG 60, dichloromethane / methanol = 95/5) no starting material and 20ml of toluene were added and The mixture was concentrated on a rotary evaporator. For complete removal of acetic acid and water was concentrated 5 more times with 20 ml of toluene. The obtained pale red oil was purified by chromatography on silica gel (2 mm PSC plate Merck; Dichloromethane / methanol = 9/1).

Die Triphosphat-Synthese erfolgte nach T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol 29, 4525-4588 (1988).The Triphosphate synthesis was carried out according to T. Kovacs, L. Ötvös, Tetrahedron Letters, Vol. 29, 4525-4588 (1988).

150 mg 3'-O-[(2-Cyanoethoxy)-(4-N-Fmoc-aminobutoxy)phosphoryl]-2'-deoxythymidin und 74 mg Protonenschwam wurden in 0,8 ml Trimethylphosphat vorgelegt. Anschließend wurde POCl3 zugegeben (100mg) und 1 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 4°C abgekühlt und es wurden 2,5 ml 0,5 M Lösung von Pyrophosphat in DMF:Tributylamin, (8:1) zugegeben. Nach 20 min wurde zur Hydrolyse 10ml 0,2 M TEAB-Puffer, pH 8, zugesetzt.150 mg of 3'-O - [(2-cyanoethoxy) - (4-N-Fmoc-aminobutoxy) phosphoryl] -2'-deoxythymidine and 74 mg of proton sponge were initially charged in 0.8 ml of trimethyl phosphate. Subsequently, POCl 3 was added (100 mg) and stirred at RT for 1 h. The reaction mixture was cooled to 4 ° C and 2.5 ml of 0.5 M solution of pyrophosphate in DMF: tributylamine (8: 1) was added. After 20 minutes, 10 ml of 0.2 M TEAB buffer, pH 8, was added for hydrolysis.

Das Triphosphat-Nukleotid wurde mit Ethanol gefällt und auf DEAE-Cellulose und RP-18 gereinigt.The Triphosphate nucleotide was precipitated with ethanol and on DEAE-cellulose and RP-18 cleaned.

Für die Kopplung eines Linkers wurde anschließend die Fmoc-Schutzgruppe mit 0,1 M NaOH (30 min Raumtemperatur) entfernt.For the coupling a linker was subsequently added remove the Fmoc protecting group with 0.1 M NaOH (room temperature for 30 min).

Beispiel 43Example 43

Herstellung eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker von 4 Kettenatomen und einem wasserlöslichen linearen Polymer.Preparation of a nuc macromolecule with a Linker of 4 chain atoms and a water-soluble linear polymer.

Zu 50μl 5% PAS (100 kD) pH 6.0 wurde 5mg EDC zugegeben und direkt danach 20μl 100 mM AA-dUTP mM pH 8 zugegeben. Nach 30 min bei RT wurde das Produkt durch Ultrafiltraiton mit 50 kDa MWCO von niedrigmolekularen Substanzen getrennt. Es wurden durchschnittlich ca. 4 Nukleotide pro ein Polymer-Molekül gekoppelt. Diese Nukleotide werden durch Klenow Fragment in einer Primer-abhängigen Reaktion in die Nukleinsäureketten eingebaut.To 50μl 5% PAS (100kD) pH 6.0 was added to 5mg EDC followed immediately by 20μl of 100mM AA-dUTP mM pH 8 added. After 30 min at RT, the product was purified by ultrafiltraiton with 50 kDa MWCO separated from low molecular weight substances. There were an average of about 4 nucleotides per polymer molecule coupled. These nucleotides are cloned by Klenow fragment in a primer-dependent reaction into the nucleic acid chains built-in.

Der kurze Linker in diesem Beispiel kann auch als L-Kopplungseinheit des langen Linkers betrachtet werden, wobei PAS als Teil des Linkers auftritt.Of the short linker in this example can also be called L-coupling unit of the long linker, with PAS as part of the linker occurs.

Beispiel 44Example 44

Herstellung eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker von 25 Kettenatomen und einem wasserlöslichen linearen Polymer.Preparation of a nuc macromolecule with a Linker of 25 chain atoms and a water-soluble linear polymer.

Zunächst wurde dCTP-PA mit Fmoc-NH-(PEG)2-COOH modifiziert (dCTP-PA-(PEG)2-NH2).First, dCTP-PA was modified with Fmoc-NH- (PEG) 2 -COOH (dCTP-PA- (PEG) 2 -NH 2 ).

Fmoc-NH-(PEG)2-COOH wurde mit CDI aktiviert.Fmoc-NH- (PEG) 2 -COOH was activated with CDI.

Zu den 200μl 20 mM dCTP-PA in 100 mM Borat, pH 8.0, wurden 200μl 40 mM aktivierten Fmoc-NH-(PEG)2-COOH in DMF zugegeben. Nach 30 min bei RT wurde pH-Wert auf 12 mit NaOH eingestellt und das Gemisch weitere 30 min bei RT inkubiert. Nach einer anschließenden Trennung mit Kieselgel und RP-18 wurde das Produkt erhalten. Ausbeite 15%.To the 200 μl of 20 mM dCTP-PA in 100 mM borate, pH 8.0, was added 200 μl of 40 mM activated Fmoc-NH- (PEG) 2 -COOH in DMF. After 30 min at RT, the pH was adjusted to 12 with NaOH and the mixture was incubated for a further 30 min at RT. After subsequent separation with silica gel and RP-18, the product was obtained. Work out 15%.

Zu 50μl 5% PAS (100 kD) pH 6.0 wurde 5 mg EDC zugegeben und direkt danach 30μl 10mM (dCTP-PA-(PEG)2-NH2) pH 7 zugegeben. Nach 30 min bei RT wurde das Produkt durch Ultrafiltraiton mit 50 kDa MWCO von niedrigmolekularen Substanzen getrennt.To 50 μl of 5% PAS (100 kD) pH 6.0 was added 5 mg of EDC and immediately thereafter 30 μl of 10 mM (dCTP-PA- (PEG) 2 -NH 2 ) pH 7 were added. After 30 min at RT, the product was separated from low molecular weight substances by ultrafiltraiton with 50 kDa MWCO.

Diese Nukleotide werden durch Klenow Fragment in einer Primer-abhängigen Reaktion in die Nukleinsäureketten eingebaut.These Nucleotides are cloned by Klenow fragment in a primer-dependent reaction into the nucleic acid chains built-in.

An das Polymer können Marker-Einheiten, beispielsweise Farbstoffe gekoppelt werden.At the polymer can Marker units, for example, dyes are coupled.

Beispiel 45Example 45

Herstellung eines Nuk-Makromoleküls mit einem Linker von 34 Kettenatomen und einem wasserlöslichen linearen Polymer.Preparation of a nuc macromolecule with a Linker of 34 chain atoms and a water-soluble linear polymer.

Synthese von dCTP-PA-(PEG)2-NH2 s. Beispiel 44.Synthesis of dCTP-PA- (PEG) 2 -NH 2 s. Example 44.

Die Aminogruppe von PEG wurde mit PDTP-NHS wie im Beispiel 1 modifiziert, so dass dCTP-PA-(PEG)2-NH-PDTP resultierte.The amino group of PEG has been modified with PDTP-NHS as in Example 1 so that dCTP-PA (PEG) 2-NH-PDTP resulted.

Aminodextran 70.000 wurde durch die Reaktion mit PDTP-NHS modifiziert, wobei durchschnittlich ein Amino-Dextran-Molekül mit 1,4 PDTP-Gruppen modifiziert wurde. Durch eine anschließende Reduktion mit TCEP wurden freie SH-Gruppen erzeugt, so dass Amino-Dextran-SH resultierte. Die Reinigung erfolgte mit 10 kD WMCO.aminodextran 70,000 was modified by the reaction with PDTP-NHS, wherein modified on average one amino-dextran molecule with 1.4 PDTP groups has been. By a subsequent Reduction with TCEP produced free SH groups such that amino-dextran-SH resulted. The cleaning was carried out with 10 kD WMCO.

Zu 200μl 2,5% Amino-Dextran-SH (70 kD) in 50 mM Borat-Puffer, pH 9.0, wurden 10μl 10 mM (dCTP-PA-(PEG)2-NH-PDTP) zugegeben. Nach 120 min bei RT wurde das Produkt durch Ultrafiltration mit 10 kDa MWCO von niedrigmolekularen Substanzen getrennt. Es resultierte Aminodextran-SS-R-dCTP, wobei (R) 34 Kettenatome aufweist.To 200 μl of 2.5% amino dextran SH (70 kD) in 50 mM borate buffer, pH 9.0, was added 10 μl 10 mM (dCTP-PA- (PEG) 2 -NH-PDTP). After 120 min at RT, the product was separated from low molecular weight substances by ultrafiltration with 10 kDa MWCO. This resulted in aminodextran-SS-R-dCTP, where (R) has 34 chain atoms.

Diese Nukleotide werden durch Klenow Fragment in einer Primer-abhängigen Reaktion in die Nukleinsäureketten eingebaut.These Nucleotides are cloned by Klenow fragment in a primer-dependent reaction into the nucleic acid chains built-in.

An das Aminodextran können Marker-Einheiten, beispielsweise Farbstoffe gekoppelt werden.At the aminodextran can Marker units, for example, dyes are coupled.

Beispiel 46Example 46

Herstellung eines modifizierten Klenow-Fragments Exo minus der DNA-Polymerase I der E. coli (im weiteren Bezeichnet als Klenow-Fragments Exo minus).Production of a modified Klenow fragment Exo minus the DNA polymerase I of E. coli (im Further named as Klenow fragment Exo minus).

In einer Ausführungsform der Modifikation werden zu 70μl einer Puffer-Lösung mit Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase (750 Units-Vial von Amersham Bioscience, aufgelöst im Hersteller-Puffer: 50mmol/l Kalium-Phosphat-Puffer, pH7, 1,0mmol/l DTT, 50% Glycerol) 100μl einer Puffer-Lösung (200mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 10.0, 60% Glycerin) zugegeben, der pH-Wert der Lösung mit Polymerase beträgt nun 9.0. Anschließend werden 30μl einer 1mol/l wässrigen Iod-Acetamid-Lösung zugegeben. Die Reaktion wird 30 min bei RT durchgeführt. Auf diese Weise erfolgt eine selektive Modifizierung der Polymerase an der SH-Gruppe des Cysteins.In an embodiment of modification become 70μl a buffer solution with Klenow fragment exo minus the DNA polymerase (750 units vial from Amersham Bioscience, dissolved in the manufacturer buffer: 50mmol / l potassium phosphate buffer, pH7, 1.0mmol / l DTT, 50% glycerol) 100μl a buffer solution (200 mmol / l Tris-HCl buffer, pH 10.0, 60% glycerol) was added, the pH of the solution with Polymerase is now 9.0. Subsequently be 30μl a 1 mol / l aqueous Iodine acetamide solution added. The reaction is carried out at RT for 30 min. This is done in this way a selective modification of the polymerase on the SH group of the Cysteine.

In einer anderen Ausführungform der Modifikation erfolgt zunächst eine Zugabe von 10μl 50mmol/l TCEP-NaOH-Lösung, pH 8, zu 70μl einer Puffer-Lösung mit Klenow-Fragment Exo-minus der DNA-Polymerase (750 Units-Vial von Amersham Bioscience aufgelöst im Hersteller-Puffer, s.o.). Nach 10 min bei RT erfolgt dann die Zugabe von 100μl einer Puffer-Lösung (200mmol/l Tris-HCl-Puffer, pH 10.0, 60% Glycerin) zur Lösung mit Polymerase. Anschließend werden 30μl einer 1mol/l wässrigen Iod-Acetamid-Lösung zugegeben. Die Reaktion erfolgt 30 min bei RT. Auf diese erfolgt eine selektive Modifizierung der Polymerase an der SH-Gruppe.In another embodiment the modification takes place first an addition of 10μl 50mmol / l TCEP NaOH solution, pH 8, to 70μl a buffer solution with Klenow fragment Exo-minus of DNA polymerase (750 units vial from Amersham Bioscience disbanded in the manufacturer buffer, see above). After 10 min at RT then the Add 100μl a buffer solution (200 mmol / l Tris-HCl buffer, pH 10.0, 60% glycerol) to the solution with Polymerase. Subsequently be 30μl a 1 mol / l aqueous Iodine acetamide solution added. The reaction is carried out at RT for 30 min. This is a selective Modification of the polymerase on the SH group.

Die Reinigung der modifizierten Polymerase kann beispielsweise über Ultrafiltration oder über Ionenaustauscher oder Dialyse erfolgen.The Purification of the modified polymerase can be carried out, for example, by ultrafiltration or over Ion exchangers or dialysis done.

Die Aufbewahrung der modifizierten Polymerase erfolgt beispielsweise in einem glycerinhaltigen Puffer. Als Puffer eignen sich beispielsweise Tris-HCl, Borat, Phosphat-Puffer. Der pH-Wert dieser Puffer liegt beispielsweise zwischen 5 und 10. Die Konzentration des Glycerins kann beispielsweise zwischen 10 und 70% liegen.The Storage of the modified polymerase takes place, for example in a glycerol-containing buffer. Suitable buffers are, for example Tris-HCl, borate, phosphate buffer. The pH of these buffers is for example between 5 and 10. The concentration of glycerol, for example, between 10 and 70% lie.

Auch andere Reagenzien, wie bespielsweise PEG oder Salze wie NaCl, NH4Cl können zur Polymerase-Lösung zugegeben werden. Vorzugsweise wird kein Reduzierungsmittel, wie beispielsweise DTT, zur Lösung mit Polymerase zugegeben. In einer Ausführungform enthält der Aufbewahrungspuffer zusätzlich ein Reagenz, das mit SH-Gruppen selektiv reagieren kann, beispielsweise IodAcetamid in Konzentration zwischen 1mmol/l und 500mmol/l.Other reagents, such as PEG or salts such as NaCl, NH 4 Cl can be added to the polymerase solution. Preferably, no reducing agent, such as DTT, is added to the polymerase solution. In one embodiment, the storage buffer additionally contains a reagent capable of selectively reacting with SH groups, for example, iodoacetamide in concentrations between 1 mmol / l and 500 mmol / l.

Eine auf diese Weise modifizierte Polymerase kann anstelle von Klenow-Fragment Exominus der DNA-Polymerase in Reaktionen mit Nuk-Makromolekülen eingesetzt werden.A Polymerase modified in this way may be used instead of Klenow fragment Exominus of DNA polymerase used in reactions with nuc macromolecules become.

Claims (68)

Makromolekulare Verbindungen mit der Struktur: (Nuk-Linker)n-Marker wobei Nuk – ein Nukleotid oder ein Nukleosid ist Linker – eine Linker-Komponente, die Nuk-Komponente und die makromolekulare Marker-Komponente vebindet Marker – eine makromolekulare Marker-Komponente ist n – eine Zahl von 1 bis 1000 istMacromolecular compounds having the structure: (Nuc-linker) n marker wherein Nuk - a nucleotide or a nucleoside is a linker - a linker component, the nuc-component and the macromolecular marker component vebindet marker - a macromolecular marker component is n - is a number from 1 to 1000 Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt:
Figure 01100001
Wobei: Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen , wobei X die Kopplungsstelle des Linkers an der Base ist und L – die Kopplungseinheit des Linkers (L). R1 – ist H R2 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe R3 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO3, SH, N3, NH2, O-CH3, O-CH2-O-CH3, O-CH2-CH=CH2, O-R3-1, P(O)m-R3-1 (m ist gleich 1 oder 2), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist. R4 – ist H oder OH R5 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, oder eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Tetraphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.Macromolecular compounds according to claim 1, wherein the nuc-component includes the following structures:
Figure 01100001
Wherein: Base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications, where X is the coupling site of the linker to the base, and L - the coupling unit of the linker (L). R 1 - is HR 2 - is independently selected from the group H, OH, halogen, NH 2 , SH or protected OH group R 3 - is independently selected from the group H, OH, halogen, PO 3 , SH, N 3 , NH 2 , O-CH 3 , O-CH 2 -O-CH 3 , O-CH 2 -CH = CH 2 , OR 3-1 , P (O) m -R 3-1 (m is 1 or 2), NH-R 3-1 , SR 3-1 , Si-R 3-1 wherein R 3-1 is a chemically, photochemically or enzymatically cleavable group. R 4 - is H or OH R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, or a monophosphate group, or a diphosphate group, or a triphosphate group, or a tetraphosphate group, or is an alpha-thiotriphosphate group. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt:
Figure 01110001
Wobei: Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen R1 – ist H R2 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe R3 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R3-2-L, P(O)m-R3-2-L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R3-2-L, S-R3-2-L, Si-R3-2-L oder, wobei R3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L – die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist. R4 – ist H oder OH R5 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, oder eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Tetraphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.Macromolecular compounds according to claim 1, wherein the nuc-component includes the following structures:
Figure 01110001
Wherein: base - is independently selected from the group of adenine, or 7-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions R 1 - is HR 2 - independently selected from the group H, OH, halogen, NH 2 , SH or protected OH group R 3 - is independently selected from the group O-R 3-2 -L, P (O) m -R 3-2 -L where m is 1 or 2, NH-R 3-2 -L, SR 3-2 -L, Si-R 3-2 -L or, where R 3-2 is the coupling site of the linker to the nucleotide and L - is the coupling unit of the linker (L). R 4 - is H or OH R 5 - is independently selected from the group OH, or a protected OH group, or a monophosphate group, or a diphosphate group, or a triphosphate group, or a tetraphosphate group, or is an alpha-thiotriphosphate group. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt:
Figure 01120001
Wobei: Base – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder i-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen R1 – ist H R2 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Hal, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe R3 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe N, OH, Hal, PO3, SH, NH2, O- R3-1, P(O)m- R3-1 (m ist gleich 1 oder 2), NH-R3-1, S-R3-1, Si-R3-1 wobei R3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist. R4 – ist H oder OH R5 – ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R5-1-L, oder P-(O)3- R5-1-L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O)3-P-(O)3-R5-1-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe) oder P-(O)3-P-(O)3-P-(O)3- R5-1-L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R5-1 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid ist und L – die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.Macromolecular compounds according to claim 1, wherein the nuc-component includes the following structures:
Figure 01120001
Where: - is independently selected from the group of adenine, or i-deazaadenine, or guanine, or 7-deazaguanine, or thymine, or cytosine, or uracil, or their modifications capable of enzymatic reactions R 1 - is HR 2 - independently selected from the group H, OH, Hal, NH 2 , SH or protected OH group R 3 - is independently selected from the group consisting of N, OH, Hal, PO 3 , SH, NH 2 , O-R 3-1 , P (O) m-R 3-1 (m is equal to 1 or 2), NH-R 3-1 , SR 3-1 , Si-R 3-1 wherein R 3-1 is a chemically, photochemically or enzymatically cleavable group , R 4 - is H or OH R 5 - is independently selected from the group O-R 5-1 -L, or P- (O) 3 - R 5-1 -L (modified monophosphate group), or P- ( O) 3 -P- (O) 3 -R 5-1 -L (modified diphosphate group) or P- (O) 3 -P- (O) 3- P- (O) 3 - R 5-1 - L (modified triphosphate group), wherein R 5-1 is the coupling site of the linker to the nucleotide and L - is the coupling unit of the linker (L). Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Kopplungseinheit des Linkers (L) folgende strukturelle Elemente einschließt: R6-NH-R7, R6-O-R7, R6-S-R7, R6-SS-R7, R6-CO-NH-R7, R6-NH-CO-R7, R6-CO-O-R7, R6-O-CO-R7, R6-CO-S-R7, R6-S-CO-R7, R6-P(O)2-R7, R6-Si-R7, R6-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-R7, R6-A-(CH2)n-R7, R6-(CH2)n-B-R7, R6-(CH=CH-)n-R7, R6-(A-CH=CH-)n-R7, R6-(CH=CH-B-)n-R7, R6-A-CH=CH-(CH2-)n-R7, R6-(-CH=CH-CH2)n-B-R7, R6-(C≡C-)n-R7, R6-(A-C≡C-)n-R7, R6-(C≡C-B-)n-R7, R6-A-C≡C-(CH2-)n-R7, R6-(-C≡C-CH2)n-B-Rn, R6-(-C≡C-CH2-CH2-)n-B-R7, wobei R6 – die Nuk-Komponente ist, R7 – der Linkerrest ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -MH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O)2-, -Si-, -(CH2)n-, eine photolabile Gruppe, wobei n – gleich 1 bis 5 istMacromolecular compounds according to claims 1 to 4, wherein the coupling unit of the linker (L) includes the following structural elements: R 6 -NH-R 7 , R 6 -OR 7 , R 6 -SR 7 , R 6 -SS-R 7 , R 6 -CO-NH-R 7 , R 6 -NH-CO-R 7 , R 6 -CO-OR 7 , R 6 -O-CO-R 7 , R 6 -CO-SR 7 , R 6 -S- CO-R 7 , R 6 -P (O) 2 -R 7 , R 6 -Si-R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -R 7 , R 6 -A- (CH 2 ) n -R 7 , R 6 - (CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (CH = CH-) n -R 7 , R 6 - (A-CH = CH-) n -R 7 , R 6 - (CH = CH-B-) n -R 7 , R 6 -A-CH = CH- (CH 2 -) n -R 7 , R 6 - (- CH = CH-CH 2 ) n -BR 7 , R 6 - (C≡C-) n -R 7 , R 6 - (AC≡C-) n -R 7 , R 6 - (C≡CB-) n -R 7 , R 6 -AC≡C- (CH 2 -) n -R 7 , R 6 - (- C≡C-CH 2 ) n -BR n , R 6 - (- C≡C-CH 2 -CH 2 -) n -BR 7 , wherein R 6 - is the Nuk component, R 7 - is the linker radical and A and B include the following structural elements: -MH-, -O-, -S-, -SS-, -CO-NH- , -NH-CO-, -CO-O-, -O-CO-, -CO-S-, -S-CO-, -P (O) 2 -, -Si-, - (CH 2 ) n - . a photolabile group where n is 1 to 5 Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.Macromolecular compounds according to claims 1 to 5, wherein the linker component a water-soluble Polymer includes. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 6, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt: Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).Macromolecular compounds according to claim 6, wherein the linker component water-soluble Polymers independently selected includes from the following group: Polyethylene glycol (PEG), polysaccharides, dextran, polyamides, polypeptides, polyphosphates, Polyacetates, poly (alkylene glycols), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, poly (olefinic alcohols), poly (vinylpyrrolidones), Poly (hydroxyalkylmethacrylamides), poly (hydroxyalkylmethacrylates), Poly (x-hydroxy acids), polyacrylic acid, polyacrylamide, Poly (vinyl alcohol). Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 7, wobei ein Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 und 50000, 50000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atome (Kettenatome) hat.Macromolecular compounds according to claims 1 to 7, wherein a linker component an average length between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 up to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 10000, 10,000 and 50,000, 50,000 to 100,000, 100,000 to 500,000 atoms (chain atoms) Has. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 8, wobei eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hatMacromolecular compounds according to claims 1 to 8, wherein a marker component a signaling, signal-transmitting, catalytic or affine Function has Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente aus einer strukturellen Marker-Einheit bestehtMacromolecular compounds according to claims 1 to 9, being a marker component consists of a structural marker unit Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 9, wobei eine Marker-Komponente mehrere strukturelle Marker-Einheiten einschließtMacromolecular compounds according to claims 1 to 9, being a marker component includes several structural marker units Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 10 oder 11, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden strukturellen Elemente einschließt: Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltene Erdenatom, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff.Macromolecular compounds according to claims 10 or 11, wherein a structural marker unit is independent of one includes the following structural elements: Biotin, hapten, radioactive Isotope, rare earth atom, dye, fluorescent dye. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 10 oder 11 , wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen, Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren Modifikationen.Macromolecular compounds according to claims 10 or 11, wherein a structural marker unit is independent of one includes the following elements: Nanocrystals or their modifications, proteins or their modifications, nucleic acid chains or their modifications, particles or their modifications. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt: Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen, Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen, Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen, Avidin oder seine Konjugate oder ModifikationenMacromolecular compounds according to claim 13, wherein a structural marker unit includes one of the following proteins: enzymes or their conjugates or modifications, Antibody or their conjugates or modifications, Streptavidin or his Conjugates or modifications, Avidin or its conjugates or modifications Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 13, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eine der folgenden Arten Nukleinsäureketten einschließt: DMA, RNA, PNA, wobei die Länge von Nukleinsäureketten zwischen 10 und 10.000 Nukleotide liegtMacromolecular compounds according to claim 13, wherein a structural marker unit one of the following types nucleic acid chains includes: DMA, RNA, PNA, where the length of nucleic acid chains between 10 and 10,000 nucleotides Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 11 bis 15, wobei die Marker-Einheiten durch eine oder mehrere Kern-komponenten untereinander zu einer Marker-Komponente verbunden sind.Macromolecular compounds according to claims 11 to 15, where the marker units are represented by one or more core components interconnected to a marker component. Makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 16, wobei eine Kernkomponente unabhängig eines der folgenden Elemente einschließt: wasserlöslichen Polymer aus der Gruppe von: Polyamide (z.B. Polypeptide), Polysaccharide, Dextran, Poly-Acrylsäure und deren Derivate, Poly-Acrylamide und deren Derivate, Poiy-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäuren und deren Derivate, Streptavidin oder Avidin und deren Derivate, Dendrimere, wobei diese Elemente linear oder verzweigt oder unter einander vernetzt sein könnenMacromolecular compounds according to claim 16, wherein a core component independently one of the following elements includes: water-soluble polymer from the group of: polyamides (e.g., polypeptides), polysaccharides, dextran, polyacrylic acid, and their derivatives, polyacrylamides and their derivatives, polyvinyl alcohols and their derivatives, nucleic acids and their derivatives, streptavidin or avidin and their derivatives, Dendrimers, where these elements are linear or branched or under can be networked Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 10, wobei die Verbindung zwischen einer strukturellen Marker-Einheit und dem Linker kovalent oder affine erfolgtMacromolecular compounds according to claims 1 to 10, wherein the connection between a structural marker unit and the linker is covalent or affine Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 9, 11 bis 17, wobei die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und dem Linker kovalent oder affine erfolgtMacromolecular compounds according to claims 1 to 9, 11 to 17, wherein the compound between the core component and the linker are covalent or affine Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt.Macromolecular compounds according to claims 1 to 19, with only one nuc-component with a coupled linker component to the marker component is bound, where the linker length between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 up to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 chain atoms. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 20, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und die Linker-Komponente eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.Macromolecular compounds according to claims 1 to 20, wherein only one nuc-component with a coupled linker component to the marker component is bound, where the linker length between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 up to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 chain atoms and the Linker component one or more fissile under mild conditions Includes connections. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 21, wobei nur eine Nuk-Komponente mit einer gekoppelten Linker-Komponente an die Marker-Komponente gebunden ist, wobei die Linkerlänge zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bes 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in einen wachsenden Strang eingebaut werden kann.Macromolecular compounds according to claims 1 to 21, with only one nuc-component with a coupled linker component to the marker component is bound, where the linker length between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 bes 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 chain atoms and a or several parts of the nuc macromolecule are so modified that only one nuk component can be incorporated into a growing strand can. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19 wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt sind, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt.Macromolecular compounds according to claims 1 to 19 wherein several Nuk components each have a linker on a marker components coupled, the length the respective linker component between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 Chain atoms is. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19, 23, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und der jeweilige Linker eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Verbindungen beinhaltet.Macromolecular compounds according to claims 1 to 19, 23, where several nuc-components are each coupled via a linker to a marker component, being the length the respective linker component between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 Chain atoms is and the respective linker one or more under mild conditions includes fissile compounds. Makromolekulare Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 19, 23, 24, wobei mehrere Nuk-Komponenten jeweils über einen Linker an einer Marker-Komponenten gekoppelt, wobei die Länge der jeweiligen Linker- Komponente zwischen 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 5000, 5000 bis 20000, 20000 bis 100000 Kettenatome beträgt und ein oder mehrere Teile des Nuk-Makromoleküls dermaßen modifiziert sind, dass nur eine Nuk-Komponente in eine wachsende Nukleinsäurekette eingebaut werden kann.Macromolecular compounds according to claims 1 to 19, 23, 24, wherein several Nuk components each have a Linker to a marker component coupled, the length the respective linker component between 2 to 5, 5 to 10, 10 to 20, 20 to 50, 50 to 100, 100 to 200, 200 to 500, 500 to 1000, 1000 to 2000, 2000 to 5000, 5000 to 20,000, 20,000 to 100,000 chain atoms is and one or more portions of the nuc macromolecule are modified such that only one nuc-component in a growing nucleic acid chain can be installed. Oligonucleotide oder Polynucleotide die mindestens ein Nuk-Makromolekül nach Ansprüchen 1 bis 25 pro eine Nukleinsäurekette einschließen.Oligonucleotides or polynucleotides which are at least a nuc macromolecule according to claims 1 to 25 per one nucleic acid chain lock in. Oligonucleotide oder Polynucleotide nach Anspruch 26, wobei Oligo- oder Polynucleotide RNA, DNA oder PNA sind, deren Länge zwischen 5 und 50.000 Nukleotide beträgt.Oligonucleotides or polynucleotides according to claim 26, wherein oligo- or polynucleotides are RNA, DNA or PNA whose Length between 5 and 50,000 nucleotides. Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäureketten, wobei für die Kopplung Nuk-Makromoleküle nach Ansprüchen 1 bis 25 verwendet werdenMethod for modifying nucleic acid chains, being for the coupling nuc-macromolecules according to claims 1 to 25 are used Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt: – mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Ansprüchen 1 bis 25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt – mindestens eine Population der Nukleinsäureketten, – mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoleküle an die Nukleinsäureketten,The method of claim 28, wherein the modification by an enzymatic coupling and the reaction mixture includes the following components: - at least a type of nuc macromolecule or their intermediates according to claims 1 to 25, wherein each kind the nuc macromolecules one for she has characteristic markings - at least one population the nucleic acid chains, - at least an enzyme type for the coupling of nuc-macromolecules to the nucleic acid chains, Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung durch eine enzymatische Kopplung erfolgt und das Reaktionsgemisch folgende Komponenten einschließt: – mindestens eine Art der Nuk-Makromoleküle oder deren Zwischenstufen nach Ansprüchen 1-25, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt – mindestens eine Population der Nukleinsäureketten, – mindestens eine Enzymart zur Kopplung von Nuk-Makromoelküle an die Nukleeinsäureketten – mindestens eine weitere Art von NukleosidtriphosphatenA method according to claim 28, wherein the modification is by enzymatic coupling and the reaction mixture includes the following components: - at least one kind of the nuc macromolecule or its intermediates according to claims 1-25, wherein each kind of the nuc macromolecule has a characteristic mark for them At least one population of the nucleic acid chains, at least one type of enzyme for coupling nuc-macromolecules to the nucleic acid chains - At least one other type of nucleoside triphosphates Verfahren nach Ansprüchen 29, 30, wobei die Enzymart unabhängig eine der folgenden Gruppen einschließt: DNA-Polymerase, RNA-Polymerase, Terminate Transferase,The method of claims 29, 30, wherein the enzyme species independently includes one of the following groups: DNA polymerase, RNA polymerase, Terminate Transferase, Verfahren nach Anspruch 30, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: Ribo-Nukleosidtriphosphaten (ATP, GTP, UTP, CTP), von 2'-Deoxyribonukleosid-Triphosphaten (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), von 2',3'-Dideoxynukleosidtriphosphaten (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP).The method of claim 30, wherein the "other type" of the nucleoside triphosphates independently selected is from the group of: ribo-nucleoside triphosphates (ATP, GTP, UTP, CTP), of 2'-deoxyribonucleoside triphosphates (dATP, dUTP, dTTP, dCTP, dGTP), of 2 ', 3'-dideoxynucleoside triphosphates (ddATP, ddGTP, ddUTP, ddCTP, ddTTP). Verfahren nach Anspruch 32, wobei die "weitere Art" der Nukleosidtriphosphaten konventionell modifizierte Nukleotide mit einer Markierung sind, wobei diese Markierung unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe von: ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Biotin, ein Hapten, ein radioakives Element.The method of claim 32, wherein the "other type" of nucleoside triphosphates are conventionally modified nucleotides with a label, this label being independent selected is from the group of: a fluorescent dye, a biotin, a Hapten, a radioactive element. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 33, wobei mindestens zwei unterschiedliche Populationen an Nukleinsäureketten präsent sindProcess according to claims 28 to 33, wherein at least two different populations of nucleic acid chains are present Verfahren nach Anspruch 34, wobei mindestens eine der Populationen der Nukleinsäureketten eine Primer-Funktion hat und mindestens eine Pupulation der Nukleinsäureketten eine Matrizen-Funktion.The method of claim 34, wherein at least one of the populations of nucleic acid chains has a primer function and at least one pupulation of the nucleic acid chains a matrix function. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Modifizierung durch eine chemische Kopplung erfolgt, wobei die Kopplung der Nuk-Makromoleküle an Nukleinsäureketten durch Phosphoroamidit-Kopplung erfolgt.The method of claim 28, wherein the modification by a chemical coupling, wherein the coupling of nuc-macromolecules to nucleic acid chains by phosphoroamidite coupling takes place. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoleküle eingesetzt werden, die die Kopplung nur einer einzigen Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäure-Strang zulassen und der mehrfache Einbau durch Modifikationen an der Nuk-Komponente, und/oder der Linker-Komponente und/oder der Marker-Komponente verhindert wird.Process according to claims 28 to 36, wherein in the labeling process Nuc-macromolecules are used, which involves coupling only a single nuc-component in the growing nucleic acid strand allow multiple installation by modifications to the Nuk component, and / or the linker component and / or the marker component prevented becomes. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die weitere Kopplung reversibel verhindert wird.The method of claim 37, wherein the further coupling reversibly prevented. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die weitere Kopplung irreversibel verhindert wird.The method of claim 37, wherein the further coupling irreversibly prevented. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 36, wobei im Markierungsverfahren Nuk-Makromoieküle eingesetzt werden, die eine Kopplung mehrer Nuk-Komponente in den wachsenden Nukleinsäurestrang zulassenProcess according to claims 28 to 36, wherein in the labeling process Nuk macromolecules are used the coupling of several nuc-components into the growing nucleic acid strand allow Verfahren nach Ansprüchen 28-40, wobei die an der Reaktion teilnehmenden Nukleinsäureketten an eine feste Phase gekoppelt sind und adressierbare Positionen haben.The method of claims 28-40, wherein the at the Reaction participating nucleic acid chains coupled to a fixed phase and addressable positions to have. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Nukleinsäureketten eine einheitliche Population darstellenThe method of claim 41, wherein the nucleic acid chains represent a uniform population Verfahren nach Anspruch 41, wobei die Nukleinsäureketten zwei oder mehrere unterschiedliche Populationen darstellen und jede der Populationen eine adressierbare Position auf der festen Phase hatThe method of claim 41, wherein the nucleic acid chains represent two or more different populations and each populations an addressable position on the solid phase Has Verfahren nach Ansprüchen 41,42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.The method of claims 41.42, wherein the coupling of nuc macromolecules at one Population of uniform nucleic acid molecules fixed to the solid phase, wherein the marker component of the nuc macromolecule is elongated after coupling nucleic acid strand remains and is not separated. Verfahren nach Ansprüchen 41,42, wobei die Kopplung von Nuk-Makromoiekülen an einer Population einheitlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der in den wachsenden Nukleinsäurestrang eingebauten Nuk-Komponente abgetrennt wird.The method of claims 41.42, wherein the coupling of nuc macromolecules at one Population of uniform nucleic acid molecules fixed to the solid phase, wherein the marker component or its individual components with or without linker component of the nuc macromolecule during coupling or after the coupling is separated from the incorporated in the growing nucleic acid strand Nuk component becomes. Verfahren nach Ansprüchen 41,43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle erfolgt, wobei diese Populationen jeweils unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente des Nuk-Makromoleküls nach der Kopplung am verlängerten Nukleinsäurestrang verbleibt und nicht abgetrennt wird.The method of claims 41.43, wherein the coupling of nuc macromolecules in one Reaction batch parallel to two or more different Populations on the solid phase of fixed nucleic acid molecules take place, these populations each being differently addressable Have positions on the solid phase and the marker component of the Nuc-macromolecule after coupling to the extended nucleic acid strand remains and is not separated. Verfahren nach Ansprüchen 41,43, wobei die Kopplung von Nuk-Makromolekülen in einem Reaktionsansatz parallel an zwei oder mehreren unterschiedlichen Populationen an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoieküle erfolgt, wobei diese Populationen unterschiedliche adressierbare Positionen an der festen Phase haben und die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker-Komponente des Nuk-Makromoleküls während der Kopplung oder nach der Kopplung von der Nuk-Komponente abgetrennt wird.The method of claims 41.43, wherein the coupling of nuc macromolecules in one Reaction batch parallel to two or more different Populations on the solid phase of fixed nucleic acid molecules take place, these populations have different addressable positions at the solid phase and the marker component or its individual Components with or without linker component of the nuc macromolecule during the Coupling or after the coupling of the nuc-component is separated. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen auf der festen Phase als Spots auf einer planen Oberfläche verteilt sind, wobei pro ein Spot Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.The method of claims 41 to 47, wherein the addressable Positions with nucleic acid molecules on the solid phase distributed as spots on a flat surface are, where per one spot nucleic acid molecules are uniform. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremolekülen an den Kügelchen bzw. Partikel befestigt sind, wobei pro ein Kügelchen Nukleinsäuremoieküle einheitlich sind.The method of claims 41 to 47, wherein the addressable Positions with nucleic acid molecules to the globule or particles are attached, wherein for a bead nucleic acid molecules are uniform. Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 47, wobei die adressierbaren Positionen mit Nukleinsäuremoiekülen in einem Multigefäßsystem, wie Mikrotiterplatte oder Nanotiterplatte oder Pikotiterplatte, verteilt sind, wobei in einem Gefäß des Multigefäßsystems die Nukleinsäuremoleküle einheitlich sind.The method of claims 41 to 47, wherein the addressable Positions with nucleic acid molecules in one Multi vascular system, like microtiter plate or nanotiter plate or picotiter plate, are distributed, wherein in a vessel of the multi-vascular system the nucleic acid molecules uniform are. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 35 und 37 bis 50, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung mindestens einer Population an einzelsträngigen Nukleinsäureketten (NSK) b) Hybridisierung von Primern an diese Nukleinsäureketten, wobei extensionsfähige NSK-Primer-Komplexe entstehen c) Inkubation von mindestens einer Art der Nuk-Makromoleküle nach Ansprüchen 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Anspruch 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt. d) Entfernung der nicht eingebauten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen e) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen f) Entfernung der Linker-Komponente und der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten Nuk-Makromolekülen g) Waschen der NSK-Primer-Komplexe gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (c) bis (g).Process according to claims 28 to 35 and 37 to 50, which includes the following steps: a) Providing at least one population of single-stranded nucleic acid chains (NSK) b) hybridization of primers to these nucleic acid chains, being extensible NSK primer complexes are formed c) incubation of at least a kind of nuc macromolecules according to claims 1 to 25 together with a kind of the polymerase according to claim 31 with the NSK primer complexes provided in steps a and b under conditions the incorporation of complementary Allow nuc-macromolecules, wherein each type of nuc macromolecule has a characteristic mark for them has. d) Removal of unincorporated nuc macromolecules from the NAC primer complexes e) Detection of signals from incorporated into the NSK primer complexes Nuc-macromolecules f) Removal of Linker Component and Marker Component from the nuc-macromolecules incorporated into the NSK primer complexes G) Wash the NSK primer complexes if necessary repetition of steps (c) to (g). Verfahren nach Ansprüchen 28-40, wobei die Nukieinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind.Process according to claims 28-40, wherein the nucleic acid chains to a solid phase in random Arrangement are coupled. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 41, 52 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukieinsäureketten, NSKs), bei dem man Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, man eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier Nuk-Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Makromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente abspaltbar sind, man b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein Nuk-Makromolekül verlängert werden, man c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten Nuk-Komponenten abspaltet, man f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt, wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den Nuk-Makromolekülen bestimmt.The method according to claims 28 to 41, 52 for the parallel sequence analysis of nucleic acid sequences (nucleic acid chains, NSKs), wherein fragments (NSKFs) of single-stranded NSKs of about 50 to 1000 nucleotides in length, which may be overlapping partial sequences of an entire sequence, are the NSKFs using a single or multiple different primers in the form of NSKF primer complexes on a reaction surface in a random array, one carries out a cyclic assembly reaction of the complementary strand of the NSKFs using one or more polymerases by reacting a) to those described on the Surface-bound NSKF-primer complexes, a solution containing one or more polymerases and one to four nuc-macromolecules having a labeled with fluorescent dyes marker component, wherein the simultaneous use of at least two nuc-macromolecules to each of the markers Component bef inductive fluorescent dyes are selected so that the nuc-macromolecules used can be distinguished from one another by measuring different fluorescence signals, wherein the nuc-macromolecules are structurally modified so that the polymerase after incorporation of such a nuc-macromolecule in a growing complementary strand is not able is to incorporate another Nuk macromolecule in the same strand, wherein the linker component with the marker component are cleavable, b) the stationary phase obtained in step a) under conditions suitable for extending the complementary strands, wherein in each case, the complementary strands are extended by one nuc-macromolecule; c) the stationary phase obtained in stage b) is washed under conditions which are suitable for removing nuc-macromolecules not incorporated into a complementary strand, d) the individual, in complementary Strands of incorporated nuc-macromolecule e by measuring the for the ever fluorescence dye characteristic signal is detected, while simultaneously determining the relative position of the individual fluorescence signals on the reaction surface, e) to generate unlabeled (NTs or) NSKFs cleaves the linker component and the marker component of the attached to the complementary strand Nuk components f) the stationary phase obtained in step e) washes under conditions suitable for the removal of the marker component, the steps a) to f) being optionally repeated several times, the relative position of individual NSKF primer complexes being determined the reaction surface and the sequence of these NSKFs by specific assignment of the detected in step d) in successive cycles at the respective positions fluorescence signals to the nuc-macromolecules determined. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der Nuk-Makromoleküle einsetzt.A method according to claim 53, characterized that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction several times repeated, wherein in each cycle only one type of nuc-macromolecules used. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.A method according to claim 53, characterized that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction several times repeated, with two different ones in each cycle labeled types of nuc macromolecules. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle einsetzt.A method according to claim 53, characterized that the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction several times repeated, each with four different in each cycle labeled types of nuc macromolecules. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die NSKs Varianten einer bekannten Referenzsequenz sind und man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in den Zyklen abwechselnd jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der Nuk-Makromoleküle und zwei unmarkierte NTs einsetzt und man die Gesamtsequenzen durch Vergleich mit der Referenzsequenz ermittelt.A method according to claim 53, characterized that the NSKs are variants of a known reference sequence and one the steps a) to f) of the cyclic synthesis reaction several times repeated, where in the cycles alternately two different labeled types of nuc macromolecules and two unlabelled NTs and one uses the total sequences by comparison with the reference sequence determined. Verfahren nach den Ansprüchen 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man in die NSKFs jeweils eine Primerbindungsstelle (PBS) einführt, wobei man bei doppelsträngigen NSKs an beiden komplementären Einzelsträngen jeweils eine PBS einführt und wobei die Primerbindungsstellen für alle NSKFs jeweils gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.Process according to Claims 53 to 57, characterized that in each case a Primerbindungsstelle (PBS) is introduced into the NSKFs, where one with double-stranded one NSKs on both complementary single strands respectively introduce a PBS and wherein the primer binding sites are the same or the same for all NSKFs have different sequences. Verfahren nach den Ansprüchen 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs mit Primern in einer Lösung unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen, und man die gebildeten NSKF-Primer-Komplexe anschließend auf der Reaktionsoberfläche bindet.Process according to Claims 53 to 57, characterized that one contacts the NSKFs with primers in a solution under conditions which leads to the hybridization of the primer to the primer binding sites (PBSs) of the NSKFs are suitable, the primers being identical to one another or different sequences, and the NSKF primer complexes formed subsequently binds on the reaction surface. Verfahren nach den Ansprüchen 53 bis 57, dadurch gekennzeichnet, dass man die NSKFs zunächst auf der Reaktionsoberfläche immobilisiert und erst anschließend mit Primern unter Bedingungen in Kontakt bringt, die zur Hybridisierung der Primer an die Primerbindungsstellen (PBSs) der NSKFs geeignet sind, wobei NSKF-Primer-Komplexe gebildet werden, wobei die Primer untereinander gleiche oder verschiedene Sequenzen aufweisen.Process according to Claims 53 to 57, characterized that you first open the NSKFs the reaction surface immobilized and only afterwards with primers under conditions that bring about hybridization the primer to the primer binding sites (PBSs) of the NSKFs suitable wherein NSKF primer complexes are formed, wherein the primers have mutually identical or different sequences. Verfahren nach Ansprüchen 53 bis 60, bei dem an 10 bis 100.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführtProcess according to claims 53 to 60, wherein 10 to 100,000 different sequences populations the incorporation reaction carried out in parallel Verfahren nach Ansprüchen 53 bis 60, bei dem an 100.000 bis 100.000.000 unterschiedlichen Sequenzenpopulationen die Einbaureaktion parallel durchgeführt.Process according to claims 53 to 60, wherein 100,000 to 100,000,000 different sequence populations the installation reaction carried out in parallel. Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 62, wobei die Sequenzen der Nukleinsäureketten ermittelt werdenThe method of claims 28 to 62, wherein the sequences the nucleic acid chains be determined Verfahren nach Ansprüchen 28 bis 63, wobei die Marker-Komponente fluoreszent markiert istThe method of claims 28 to 63, wherein the marker component fluorescently labeled Verfahren nach Ansprüchen 41 bis 64, wobei die feste Phase unabhängig aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Silicon, Glas, Keramik, Kunststoffe, Gele oder deren ModifikationenProcess according to claims 41 to 64, wherein the solid Phase independent selected from the following group is: silicone, glass, ceramics, plastics, gels or their modifications Ein Kit, das die makromolekularen Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 25 einschließt.A kit that mimics the macromolecular compounds claims 1 to 25 includes. Verfahren, bei denen makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 1 bis 25 in enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden, wobei Enzyme folgende Gruppen einschließen: Polymerasen, Ligasen, Nukleasen (Endo oder Exonukleasen).Process in which macromolecular compounds used according to claim 1 to 25 in enzymatic reactions, wherein enzymes include the following groups: polymerases, ligases, Nucleases (endo or exonucleases). Verfahren, bei denen makromolekulare Verbindungen nach Anspruch 26 und 27 in enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden, wobei Enzyme folgende Gruppen einschließen: Polymerasen, Ligasen, Nukleasen (Endo oder Exonukleasen).Process in which macromolecular compounds according to claim 26 and 27 are used in enzymatic reactions, wherein enzymes include the following groups: polymerases, ligases, Nucleases (endo or exonucleases).
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