DE102010040391B4

DE102010040391B4 - Magnetische Durchflusszytometrie zur Einzelzelldetektion

Info

Publication number: DE102010040391B4
Application number: DE102010040391.1A
Authority: DE
Inventors: Oliver Hayden; Michael Johannes Helou; Sandro Francesco Tedde
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Earlybio De GmbH
Priority date: 2010-09-08
Filing date: 2010-09-08
Publication date: 2015-11-19
Anticipated expiration: 2030-09-09
Also published as: US9316575B2; CN103097873A; WO2012031918A1; JP2013542410A; JP5583278B2; CN103097873B; EP2614355A1; US20130164777A1; DE102010040391A1; CA2810542A1

Abstract

Verfahren zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10), wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Inbetriebnahme einer Sensoranordnung, wobei zur Inbetriebnahme mindestens ein erstes (R1, R2, R3) und ein zweites magnetoresistives Bauteil (R2, R3, R4) in einer Wheatstone-Brücke in Diagonalanordnung (40) oder Parallelanordnung (90) verschaltet und in einem Abstand (Δx) voneinander in Flussrichtung (20) angeordnet werden, – magnetische Markierung der Zellen (10), – Flusserzeugung der Zellen über die Sensoranordnung, wobei der Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (R1, R2, R3) und anschließend über das zweite magnetoresistive Bauteil (R2, R3, R4) geführt wird, – Einzelzellerfassung, wobei durch das magnetische Feld einer einzelnen magnetisch markierten Zelle (10), die über die Sensoranordnung fließt, ein Messsignal mit einem charakteristischen Messsignalmuster aus mindestens drei Messausschlägen erzeugt wird – Auswertung des Messsignals, in der anhand der Messausschlagrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzelldetektion identifiziert wird; dadurch gekennzeichnet, dass – aus dem charakteristischen Messsignalmuster ein Messausschlagabstand (Δt) ausgewertet wird und der Zelldurchmesser anhand des Messausschlagabstandes (Δt) berechnet wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Durchflusszytometrie. Im Bereich der Zellmessung und Zelldetektion sind Durchflussmessungen bekannt, bei denen magnetisch markierte Analyte über Magnetsensoren fließen. Positive Signale können dabei jedoch nicht eindeutig auf eine einzelne Zelle zurückgeführt werden. So können durch Querselektion der magnetischen Marker auch fälschlicherweise markierte Zellen ein positives Signal hervorrufen. Weiterhin können auch ungebundene Marker ein positives Signal verursachen. Zellagglomerate wiederum führen zu nur einem positiven Signal und sind nicht als solche erkennbar.
Die DE 10 2007 057 667 A1 zeigt eine Vorrichtung zur Detektion von Partikeln in einem Fluid.
Die WO 2003/054523 A2 zeigt einen Sensor zum Messen der Flächendichte von Nanopartikeln auf einem Mikroarray.
Die US 6 736 978 B1 zeigt einen Sensor zum Erfassen eines Analyts in einem Strom mittels Magnetoresistivität.
Die WO 2005/010542 A2 zeigt einen magnetischen Partikel-Sensor.
„Magnetic Sensor Bioassay: HTS SQUIDs or GMRs?”, CARR C. et. al., IEEE Transactions an applied Superconductivity Vol 17(2), June 2007 vergleicht SQUID Sensoren und GMR-Sensoren zum Erfassen von Nanopartikeln.
”Advances in Giant Magnetoresistance Biosensors With Magnetic Nanoparticle Tags: Review and Outlook” WANG S. X. et al., IEEE Transactions an Magnetics Vol 44(7), July 2008 zeigt eine Übersicht zu GMR-Sensoren zum Detektieren von magnetischen Nanopartikeln.
Die WO 2008/001261 A2 zeigt einen magnetischen Sensor zum Erfassen von magnetischen Partikeln.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Hintergrundsignal bei magnetischer Durchflusszytometrie zu verringern und falschpositive Signale zu vermeiden.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 und durch eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 8. Weiterbildungen des Verfahrens und vorteilhafte Ausgestaltungen der Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen und ermöglicht eine kalibrationsfreie Konzentrationsbestimmung des Analyten im Durchfluss. Dieses Verfahren hat weiter den Vorteil, dass neben der Verminderung des Hintergrundsignals falschpositive Signale vermieden werden.
Gleichzeitig kann eine Durchflussgeschwindigkeitsmessung erfolgen. Auch Rückschlüsse auf die Zellgröße sind möglich. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird dazu in dem Verfahren eine Auswertung des Messsignals vorgenommen, in der die Durchflussgeschwindigkeit der Zellen anhand des bekannten Abstandes der magnetoresistiven Bauteile berechnet wird. Die Durchflussgeschwindigkeit der Zellen zu kennen birgt einen weiteren Vorteil. Anhand der Durchflussgeschwindigkeit sind qualitative Rückschlüsse auf die Zellgröße möglich. Sehr viel kleinere Partikel als die Zelle, z. B. ungebundene magnetische Marker, bewegen sich sehr viel langsamer als die zu detektierenden Zellen. Größere Partikel oder Zellagglomerate bewegen sich mit sehr viel höherer Durchflussgeschwindigkeit als die zu detektierenden Zellen. Durch die Berechnung der Durchflussgeschwindigkeit wird also die Güte der Einzelzelldetektion noch erhöht.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren eine Auswertung des Messsignals vorgenommen, in der der Zelldurchmesser anhand des Messausschlagabstandes berechnet wird. Diese Berechnung kann beispielsweise anhand der berechneten Durchflussgeschwindigkeit und dem gemessenen Messausschlagabstandes erfolgen. Der Zelldurchmesser ist ein weiterer Parameter, der auf eine Einzelzelldetektion hinweist oder ein Indiz für ein falschpositives Signal ist.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren eine Auswertung des Messsignals vorgenommen, in der anhand der Messausschlagamplitude das Signalrauschverhältnis ermittelt wird. Insbesondere kann das Messsignalmuster mehrere Messausschläge mit unterschiedlichen Amplituden aufweisen. Beispielsweise kann ein oberer und/oder ein unterer Grenzwert für die Amplitude festgelegt sein. Die Messausschlagamplitude dient hier, nicht wie in bisherigen Messungen alleinig zur Identifikation eines Messereignisses, sondern als eine von mehreren Informationen aus dem charakteristischen Messsignalmuster.
Insbesondere können für alle Messwerte bzw. Informationen aus dem Messsignalmuster wie Messausschlaganzahl, Messausschlagabstand und Messausschlagamplitude Grenzwerte festgelegt werden. Insbesondere können Grenzintervalle festgelegt werden, in denen der entsprechende Messwert für ein positives Messsignal liegen muss. Derartige Grenzwerte, obere und/oder untere Grenzwerte oder Grenzwertintervalle, können auch für die berechneten Größen wie Durchflussgeschwindigkeit oder Zelldurchmesser oder Signalrauschverhältnis festgelegt werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird in dem Verfahren eine magnetische Markierung der Zellen mittels superparamagnetischer Marker vorgenommen. Die magnetoresistiven Bauteile sind beispielsweise GMR-Sensoren, TMR-Sensoren oder AMR-Sensoren.
Vorzugsweise wird in dem Verfahren bei der Inbetriebnahme der Sensoranordnung das erste und das zweite magnetoresistive Bauteil in einem Abstand in Flussrichtung von maximal einem Zelldurchmesser angeordnet. Dies hat den Vorteil, dass ein Messsignalmuster mit vier Messausschlägen erzeugt wird. Alternativ kann der Abstand auch eineinhalb Zelldurchmesser betragen. Zweckdienlich ist ein Abstand von maximal doppeltem Zelldurchmesser. Eine derartige Anpassung des Abstandes der magnetoresistiven Bauteile ist auf einen Zelltyp mit charakteristischem Zelldurchmesser ausgerichtet. Zur Erfassung unterschiedlicher Zelltypen oder Zellen unbekannten Durchmessers ist eine Sensor-Strecke mit mehreren Sensoranordnung unterschiedlichen Abstands ausführbar.
In einer zweckdienlichen Ausgestaltung der Erfindung werden in dem Verfahren zur Inbetriebnahme der Sensoranordnung vier magnetoresistive Bauteile zu einem ersten und einem zweiten Paar in einer Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung verschaltet und so in Reihe angeordnet, dass ein Fluss der Zellen zunächst über das erste, anschließend über das zweite, anschließend über das dritte und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil führbar ist. Der Fluss der Zellen wird zunächst über das erste, anschließend über das zweite, anschließend über das dritte und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil geführt. Vorzugsweise wird in der Auswertung die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Paar-Abstandes zwischen dem ersten und zweiten Paar magnetoresistiver Bauteile berechnet. Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass von beiden Paaren magnetoresistiver Bauteile ein charakteristisches Messsignalmuster für eine einzelne Zelle erzeugt wird.
Vorzugsweise wird eine Zelldetektion in komplexen Medien, wie beispielsweise Vollblut vorgenommen. Der Analyt, d. h. die Zellen weisen variierende Durchmesser auf. Typischerweise messen weiße Blutzellen 7 bis 12 μm im Durchmesser. Dementsprechend wird das Grenzintervall für den berechneten Zelldurchmesser beispielsweise (auf 7 bis 12 μm) gesetzt. Dies hat den Vorteil, dass eine Querselektivität, z. B. auf andere Zelltypen mit deutlich unterschiedlichem Zelldurchmesser vermieden werden kann. Eine derartige Querselektivität kann alleinig durch die magnetischen Marker nicht ausgeschlossen werden.
Zu dem variiert die Markerdichte auf einer Zelle. Dies äußert sich etwa in unterschiedlichen Messausschlagamplituden. Dementsprechend wird beispielsweise das Grenzintervall für die Messausschlagamplitude gewählt. Mit der Festsetzung einer Ober- und einer Untergrenze für die Messausschlagamplitude wird zweckdienlicherweise der Hintergrund unterdrückt sowie zu hohe Signale durch Aggregate unberücksichtigt gelassen. Zu dem Hintergrundsignal tragen beispielsweise ungebundene superparamagnetische Partikel mit Antikörper bei. Neben Aggregaten von Zellen, die z. B. über ungebundene Marker aneinander binden, kann es auch zu Aggregaten von superparamagnetischen Partikeln über die Antikörper kommen. Diese werden jedoch z. B. durch die Festsetzung einer Obergrenze für die Messausschlagamplitude ausgeschlossen.
Eine Variation des Abstands der Zelle zu den magnetoresistiven Bauteilen im Durchflusskanal bzw. zur Kanalwand, äußert sich in einer veränderten Durchflussgeschwindigkeit. Die Durchflussgeschwindigkeit in einer laminaren Strömung ändert sich, wenn es zur Haftung bzw. Wechselwirkung der Zellen mit der Kanaloberfläche kommt. Vorzugsweise werden die magnetisch markierten Zellen in einem externen Feld an den magnetoresistiven Bauteilen angereichert und das Streufeld der Zellen ausgerichtet. Insbesondere werden die Zellen so an der Kanalwand angereichert, dass sie im laminaren Fluss an der Kanalwand abrollen. Vorzugsweise verläuft das externe Feld senkrecht zu dem zu detektierenden Streufeld der Zellen.
Bei Überstreichen eines einzelnen magnetoresistiven Bauteils von einer einzelnen magnetisch markierten Zelle erfährt das magnetoresistive Bauteil eine Widerstandsänderung abhängig von der Position der Zelle bzw. deren Magnetfeld relativ zum magnetoresistiven Bauteil, also dem Sensorelement. Dieses Messsignal weist einen positiven und einen negativen Messausschlag auf. Abhängig von der Richtung des Streufeldes der Zelle, das ein magnetischer Dipol ist, erfolgt zuerst der positive und anschließend der negative Messausschlag oder umgekehrt.
Bei Überstreichen eines Paares von magnetoresistiven Bauteilen in Diagonalanordnung bilden sich zwei exakt identische Messsignale nacheinander aus. Das Signal kann durch den Abstand der magnetoresistiven Bauteile moduliert werden. Bei Verringerung des Bauteilabstandes erfolgt eine Überlagerung der Messsignale.
Bei Überstreichen einer einzelnen magnetisch markierten Zelle eines Paares magnetoresistiver Bauteile in Parallelanordnung kommt es zu zwei Einzelsignalen, wobei das zweite Signal eine Spiegelung des ersten Signals ist. Auch das Signal in Parallelanordnung ist durch den Abstand der magnetoresistiven Bauteile modulierbar. Mittels geeigneter Abstandswahl kann das Signal so überlagert werden, dass ein Signalausschlag mit doppelter Amplitude wie das Einzelsignal auftritt.
Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass unabhängig von einem variierenden Zelldurchmesser des Analyten und unabhängig von der Markerdichte auf einer Zelle ein charakteristisches Messsignalmuster erzeugt und so eine Einzelzelldetektion vorgenommen werden kann. Insbesondere liefert das Messsignalmuster einer einzelnen Zelle einen Informationsgehalt von vier Bit. Dies führt zu einem weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, nämlich dass der Signalverlauf bzw. das Signalmuster es erlaubt, falschpositive Signale und Hintergrundsignale so zu reduzieren, dass eine kalibrationsfreie Konzentrationsbestimmung der markierten Zellen vorgenommen werden kann. Eine derartige kalibrationsfreie Konzentrationsbestimmung ist mit reiner Amplitudenauswertung nicht möglich. Die Auswertemöglichkeiten mit Hilfe des Signalmusters erstrecken sich auf

1. einen charakteristischen Fingerabdruck für eine einzelne Zelle mittels der alternierenden Abfolge von positiven und negativen Messausschlägen unabhängig von dem Hintergrund, z. B. nicht gebundener Partikel,
2. eine Invitrodurchflussgeschwindigkeitsmessung, wodurch falschpositive Signale von Zellaggregaten oder aggregierten Markern ausgeschlossen werden können,
3. die Auswertung der Amplitude anhand von oberen und unteren Schwellwerten sowie
4. Rückschlüsse auf die Zellgröße über den Abstand der einzelnen Messausschläge innerhalb eines Messsignalmusters.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen. Die Vorrichtung umfasst eine Sensoranordnung, die mindestens eine Wheatstone-Brücke mit mindestens einem ersten und einem zweiten magnetoresistiven Bauteil umfasst. Die magnetoresistiven Bauteile sind in einer Diagonalanordnung oder in einer Parallelanordnung verschaltet. Die magnetoresistiven Bauteile sind in einem Abstand voneinander entlang eines Flusskanals so angeordnet, dass ein Fluss der Zellen zunächst über das erste und anschließend über das zweite magnetoresistive Bauteil führbar ist. Der Abstand der magnetoresistiven Bauteile in Flussrichtung ist vorzugsweise auf den zu detektierenden Zelltyp angepasst. Dabei sind die magnetoresistiven Bauteile so ausgestaltet, dass ein magnetisches Feld einer einzelnen magnetisch markierten Zelle erfassbar ist. Die Sensoranordnung ist so ausgestaltet, dass ein Messsignal erfassbar ist, welches ein charakteristisches Messsignalmuster mit mindestens drei Messausschlägen zeigt. Das Messsignalmuster enthält die Informationen Messausschlaganzahl, Messausschlagabstände, Messausschlagamplituden, Messausschlagrichtung und Messausschlagrichtungsabfolge. Des Weiteren ist eine Auswerteelektronik umfasst, die ausgestaltet ist anhand der Messausschlagsrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzelldetektion zu identifizieren. Die erfindungsgemäße Vorrichtung birgt den Vorteil, eine Einzelzelldetektion zu gewährleisten, während falschpositive Signale durch zusätzliche Informationen aus einem Messsignalmuster vermieden werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Abstand der magnetoresistiven Bauteile maximal ein Zelldurchmesser. Beispielsweise beträgt der Abstand maximal 50 μm. Vorzugweise beträgt der Abstand maximal 25 μm. Dieser Abstand hat den Vorteil, dass ein Messsignalmuster mit vier Messausschlägen in der Diagonalanordnung erzeugt wird und mit drei Messausschlägen in der Parallelanordnung erzeugt wird.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist aus dem Messsignalmuster die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Abstandes der magnetoresistiven Bauteile zu berechnen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist den Zelldurchmesser anhand des Messausschlagabstandes zu berechnen. Vorzugsweise dient die Auswerteelektronik gleichermaßen der Berechnung des Zelldurchmessers und der Durchflussgeschwindigkeit.
In einer zweckdienlichen Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung eine Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist anhand der Messausschlagamplitude das Signalrauschverhältnis zu ermitteln. Insbesondere wird mit der gleichen Auswerteelektronik, die auch Durchflussgeschwindigkeit und Zelldurchmesser berechnet, das Signalrauschverhältnis ermittelt.
Vorzugsweise sind die magnetoresistiven Bauteile in einer Parallelanordnung verschaltet und so in Reihe angeordnet, dass ein Fluss der Zellen zunächst über das erste, anschließend über das zweite, anschließend über das dritte und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil führbar ist. Dazu sind in der Sensoranordnung mindestens eine Wheatstone-Brücke mit einem ersten und einem zweiten Paar aus je zwei magnetoresistiven Bauteilen umfasst. Vorzugsweise beträgt der Abstand zwischen dem ersten und dem zweiten Paar magnetoresistiver Bauteile mehr als drei Zelldurchmesser. Eine derartige Ausführungsform der Vorrichtung hat den Vorteil, dass in einer Parallelanordnung die Durchflussgeschwindigkeit ermittelt wird und zwei Paare von magnetoresistiven Bauteilen auch zwei charakteristische Messsignalmuster erzeugen.
Insbesondere kann auch eine Aneinanderreihung mehrerer Vorrichtungen mit je einer Sensoranordnung erfolgen. Dabei können beispielsweise mehrere Sensorpaare mit je unterschiedlichem Abstand aneinandergereiht werden. Dies hätte den Vorteil, z. B. unterschiedliche Zellgrößen zu erfassen und zu unterscheiden.
Beispielsweise umfasst die Vorrichtung eine Durchflusskammer, durch die die Zellen geführt werden, und die zweckdienlicherweise über einen magnetoresistiven Sensor verläuft. Ein magnetoresistives Bauteil kann ein GMR-, TMR- oder AMR-Sensor sein. Derartige magnetoresistive Sensoren sind vorteilhafterweise als Magnetowiderstände in einer Wheatstone-Messbrücke verschaltet. Mit einer derartigen Wheatstone-Messbrücke kann das von einer Zelle generierte Streufeld detektiert werden, indem dadurch eine Widerstandsänderung hervorgerufen wird.
Vorzugsweise ist die Durchflusskammer so ausgestaltet, dass eine laminare Strömung des Analyten darin realisiert werden kann. Insbesondere dürfen Haftung bzw. Wechselwirkung der Zellen mit der Durchflusskammeroberfläche nicht zu stark sein. Vorzugsweise erlaubt die Beschaffenheit der Innenfläche des Durchflusskanals ein Abrollen der Zellen an der Kanalwand.
Vorzugsweise ist die Wheatstone-Messbrücke in folgendem Layout realisiert: Die magnetoresistiven Bauteile sind vorzugsweise streifenförmig, z. B. mit einer Sensorfläche von 2 × 30 μm. Zweckdienlicherweise liegt die Bauteilgröße im Bereich der Dimension eines zellulären Analyten. Die zu detektierenden Zellen haben beispielsweise Durchmesser zwischen 1 und 20 μm. Zweckdienlicherweise liegen die streifenförmigen magnetoresistiven Bauteile quer zur Flussrichtung der Zellen. Zweckdienlicherweise sind die Widerstände der Zuleitungen zu den vier Widerständen einer Wheatstone-Brücke möglichst abgeglichen, um Offsets im Signal und Temperatureinflüsse zu minimieren. Beispielsweise sind alle vier Widerstände der Wheatstone-Brücke magnetoresistive Bauteile. Insbesondere handelt es sich bei den magnetoresistiven Bauteilen um GMR-Elemente.
Zweckdienlicherweise ist die Sensoranordnung so ausgestaltet, dass die Diagonalwiderstände der Wheatstone-Brücke, d. h. die sich diagonal gegenüberliegenden Widerstände der Wheatstone-Brücke, zu räumlich voneinander getrennten Paaren angeordnet. Eines der Paare beispielsweise besteht aus magnetoresistiven Widerständen. Bei einem Messvorgang überquert dann der Zellfluss das diagonale Widerstandspaar aus magnetoresistiven Bauteilen. Die magnetoresistiven Bauteile sind beispielsweise GMR-Elemente. Bei dieser Konfiguration wird also nur die halbe Brücke ausgenutzt.
Das Messsignalmuster, vor allem der Abstand der Messausschläge, ist abhängig vom Abstand der magnetoresistiven Bauteile eines Paares von Diagonalwiderständen. Bei großem Abstand der magnetoresistiven Bauteile werden vier Messausschläge registriert. Bei Verkürzung des Abstandes zwischen den beiden magnetoresistiven Bauteilen entlang der Flussrichtung wandern die vier Messausschläge aufeinander zu und bilden ein Messsignalmuster mit vier Messausschlägen unterschiedlicher Amplitude und Richtung. Ab einem für den Zelldurchmesser charakteristischen Abstand überlagern sich die Einzelsignale der einzelnen magnetoresistiven Bauteile. Der charakteristische Abstand ist des Weiteren abhängig von der Ausdehnung des Streufeldes der Zelle. Bei ausreichender Verkürzung des Abstandes zwischen den magnetoresistiven Bauteilen in Diagonalanordnung kommt es zu einer Auslöschung der mittleren Messausschläge. Diese Signalüberlappung tritt ab einem Abstand kleiner als 2 Zelldurchmesser auf. Bei einem Zelldurchmesser von beispielsweise 10 μm kommt es ab einem Abstand von etwa 20 bis 30 μm der magnetoresistiven Bauteile zu einer Überlagerung der Sensorantworten.
Auch im parallelen Layout der Wheatstone-Brücke sind die Widerstände zu räumlich getrennten Paaren angeordnet. Dabei sind die Paare parallele Widerstände der Messbrücke. Bei parallelen magnetoresistiven Bauteilen in der Messbrücke ist das zweite Signal, d. h. das Signal, das bei Überstreichen des zweiten magnetoresistiven Bauteils entsteht, eine Spiegelung des ersten Signals. Analog zum Diagonallayout erfolgt auch im Parallellayout bei Annäherung der magnetoresistiven Bauteile in Flussrichtung eine Überlagerung der Sensorantworten. Bei Parallelwiderständen addieren sich die beiden überlagerten Signalhälften auf, woraus theoretisch ein Peak mit doppelter Amplitudenhöhe resultiert.
Zur Durchflussgeschwindigkeitsbestimmung mit einem Parallellayout werden vorzugsweise zwei Widerstandspaare der Wheatstone-Brücke verwendet. Dazu werden beide parallele Widerstandspaare in Reihe geschaltet. Der Abstand der Widerstandspaare beträgt zweckdienlicherweise mehr als drei Zelldurchmesser der zu detektierenden Zelle.
Mittels der charakteristischen Messsignalabfolge mit zwei Diagonalwiderständen wird die Ermittlung der Durchflussgeschwindigkeit der Zelle ermöglicht. Die Durchflussgeschwindigkeit kann bei bekannter Datenrate und bekanntem Abstand der magnetoresistiven Bauteile berechnet werden.
Das Messsignalmuster erlaubt es den Scheitelwerten der Messausschläge genaue Zellpositionen relativ zu den magnetoresistiven Bauteilen zuzuordnen. Der Weg, den die Zelle zwischen den beiden Scheitelwerten der Messausschläge zurücklegt, entspricht dem Abstand der beiden magnetoresistiven Bauteile.
Für eine Durchflussgeschwindigkeitsberechnung mit Parallelanordnung werden vorzugsweise zwei Paare magnetoresistiver Bauteile genutzt. Hier entspricht der zurückgelegte Weg der Zelle dem Abstand der Widerstandspaare zwischen den Scheitelwerten der Messausschläge.
Die Erfindung wird in exemplarischer Weise mit Bezug auf die 1 bis 18 der angehängten Zeichnung beschrieben. Die Figuren sind schematisch und stellen keine maßstabsgetreuen Abbildungen dar.
1 zeigt ein Messsignal einer Einzelwiderstandsanordnung.
2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Bewegung einer zu detektierenden Zelle über einen Einzelwiderstand.
3 zeigt eine Wheatstone-Brücke.
4 zeigt eine Wheatstone-Brücke in Diagonalanordnung.
5 zeigt das Messsignal in einer Diagonalanordnung in Abhängigkeit des Abstandes der Widerstände.
6 zeigt das Messsignal in einer Diagonalanordnung mit einem Abstand der Widerstände, der eine Überlagerung der beiden Messsignale der Einzelwiderstände erlaubt.
7 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden Zelle über zwei Widerstände.
8 zeigt eine Wheatstone-Brücke und den Zellflussverlauf über die Widerstände.
9 zeigt eine Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung.
10 zeigt das Messsignal in einer Parallelanordnung in Abhängigkeit des Abstandes der Widerstände.
11 zeigt das Messsignal in einer Parallelanordnung mit einem Abstand der Widerstände, der eine Überlagerung der beiden Messsignale der Einzelwiderstände erlaubt.
12 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden Zelle über zwei Widerstände in Parallelanordnung.
13 zeigt das Messsignal in einer Diagonalanordnung für eine Durchflussgeschwindigkeitsmessung.
14 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden Zelle über die Widerstände.
15 zeigt eine Wheatstone-Brücke und den Zellflussverlauf über die Widerstände.
16 zeigt eine Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung für eine Durchflussgeschwindigkeitsmessung.
17 zeigt zwei Messsignale von zwei Widerstandspaaren in einer Parallelanordnung zur Durchflussgeschwindigkeitsmessung.
18 zeigt den zeitlichen Verlauf einer zu detektierenden Zelle über die Messanordnung zur Durchflussgeschwindigkeitsmessung.
Der in 1 gezeigte Messsignalverlauf mit der Zeit t zeigt zunächst einen positiven Messausschlag und anschließend einen negativen Messausschlag gleicher Amplitude A. Dieses Signal entsteht, wenn sich eine einzelne Zelle 10 über einen einzelnen Messwiderstand bewegt. Der zeitliche Flussverlauf 20 ist in 2 verdeutlicht. Die 2 zeigt eine Zelle 10 zu drei Zeitpunkten t₁, t₂ und t₃. Die Zelle 10 überstreicht in dem Zeitintervall t₁ bis t₃ den Messwiderstand. Des Weiteren ist das Streufeld der Zelle 10 angezeigt. Dabei wird von dem Messwiderstand nur das Inplane-Feld registriert, d. h. das Feld parallel zur Bewegungsrichtung, die durch den Geschwindigkeitspfeil v angezeigt ist. Das Feld senkrecht zur Bewegungsrichtung und senkrecht zur Ebene in der der Widerstand liegt, wird nicht von dem Sensor erfasst. In eben dieser Richtung senkrecht zur Bewegungsrichtung ist das externe Feld zur Anreicherung der Zellen 10 an den Widerständen ausgerichtet.
3 zeigt eine Wheatstone-Messbrücke. Dabei bezeichnet U_cc die angelegte Spannung, U_b die Messspannung, R₁ bis R₄ die Widerstände der Messbrücke, wovon zumindest zwei, beispielsweise die sich gegenüberliegenden Diagonalelemente R₁ und R₄ magnetoresistive Widerstände sind. Des Weiteren sind Zellen 10 und deren Flussrichtung 20 angezeigt.
4 zeigt, wie die Wheatstone-Messbrücke vorzugweise anzuordnen ist, dass ein Fluss der Zellen 10 über die Diagonalelemente R₁, R₄ erfolgen kann. Dabei erfolgt die Messung anhand eines Diagonalpaares 40, wohingegen R₂ und R₃ beispielweise keine magnetoresistiven Bauteile sein müssen. Der Abstand Δx der magnetoresistiven Bauteile R₁, R₄ beeinflusst das Messsignal. Die Beeinflussung des Messsignals durch den Abstand Δx ist in 5 verdeutlicht. 5 zeigt den Messverlauf mit der Zeit für drei unterschiedliche Abstände Δx1, Δx2 und Δx3. Dabei ist Δx2 < Δx1 und Δx3 < Δx2. Bei Verringerung des Abstandes Δx kommt es zur Überlagerung der ansonsten identisch generierten Messsignale der zwei magnetoresistiven Bauteile R₁, R₄. Für den Abstand Δx3 ist ein charakteristisches Messsignal für eine Einzelzelldetektion in Diagonalanordnung 40 mit vier aufeinanderfolgenden Messausschlägen zunächst ein positiver, dann ein negativer, dann wiederum ein positiver und anschließend ein negativer Messausschlag gezeigt. Die Messausschläge weisen auch unterschiedliche Amplituden A auf.
Für eine kalibrationsfreie Einzelzelldetektion, also eine Quantifizierung einer Zellkonzentration in einem komplexen Medium wird sich diese Abstandsabhängigkeit zunutze gemacht. Es erfolgt eine Adaption dieses Abstands Δx an die jeweilige Zellgröße der zu detektierenden Zelle 10. Die Zellgröße kann zwischen 1 μm und 20 μm variieren. Für eine derartige Einzelzelldetektion interessant sind Zellgrößen um 3 μm und Zellgrößen im Bereich von 8 bis 12 μm. CD4+–Zellen z. B. haben einen Durchmesser von um die 7 μm. Auch innerhalb eines Zelltyps schwankt der Zelldurchmesser. Eine geringe Variation muss also miterfasst werden. Dementsprechend wird ein gewisses Intervall für die Messamplitude A gewählt. 6 zeigt einen charakteristischen Messverlauf für eine Einzelzelldetektion, einen sogenannten Fingerprint einer Einzelzelle 10. Dabei ist den Scheitelwerten der Messausschläge zu charakteristischen Zeiten t₆₁, t₆₂, t₆₄ und t₆₅ eine genaue Position relativ zum Widerstand (R₁, R₄) zuzuordnen, die in 7 verdeutlicht wird. Eine Einzelzelle 10 bewegt sich an dem Paar von magnetoresistiven Bauteilen R₁, R₄ vorbei. Diese gezeigte Halbbrückenanordnung ist in Diagonalanordnung 40 verschaltet. Es wird von den zwei magnetoresistiven Bauteilen R₁, R₄ wiederum nur das Inplane-Feld des Streufeldes der Zelle 10 registriert. Zum Zeitpunkt t₆₁ erreicht die Zelle 10 das erste Sensorelement R₁, zum Zeitpunkt t₆₂ hat die Zelle 10 gerade das erste Sensorelement R₁ überstrichen und erreicht mit ihrem Streufeld bereits das zweite Sensorelement R₄, wodurch der zweite Messausschlag zum Zeitpunkt t₆₂ eine geringere Amplitude A als der erste Messausschlag zum Zeitpunkt t₆₁ aufweist. Zum Zeitpunkt t₆₃ erfolgt ein Nulldurchgang des Messsignals, wenn sich die Zelle 10 exakt in der Mitte zwischen den Bauelementen R₁/R₄ befindet. Zum Zeitpunkt t₆₄ beginnt das Überstreichen des zweiten Sensorelements R₄. Zum Zeitpunkt t₆₅ beendet die Zelle 10 das Überstreichen des zweiten Sensorelements. Zum Zeitpunkt t₆₅ wird wieder ein Messausschlag mit voller Amplitudenhöhe A registriert.
8 zeigt wieder eine Wheatstone-Brücke im klassischen Schaltbild. Die Pfeile 20 zeigen die Flussrichtung der zu detektierenden Zellen 10 an. Die Flussrichtung 20 ist nun im Gegensatz zur 3 über die Parallelelemente R₁ und R₂ oder R₃ und R₄ gewählt. Parallelelemente heißt, dass sich die überstrichenen Widerstandspaare R₁/R₂ oder R₃/R₄ nebeneinander und nicht diagonal gegenüber befinden. 9 zeigt eine vorteilhafte Anordnung der Wheatstone-Brücke 90, so dass die Widerstände in einem definierten Abstand Δx zueinander entlang der Flussrichtung 20 angeordnet sind. Die Widerstände R₁–R₄ sind streifenförmig und quer zur Flussrichtung 20 angeordnet. Wie weiterhin in 9 zu sehen ist, können die Zellen 10 ein Widerstandspaar oder auch beide Widerstandspaare in getrennten Kanälen überstreichen. In 16 ist gezeigt, wie mit einer Parallelverschaltung 160 auch ein Fluss 20 über alle vier magnetoresistiven Bauteile R₁–R₄ realisiert werden kann, wobei diese in einer Reihe entlang des Flusskanals 20 angeordnet sind.
10 zeigt das Messsignal einer Parallelanordnung 90 von zwei Messwiderständen R₃, R₄ in Abhängigkeit vom Abstand Δx. Bei Verringerung des Abstandes Δx nähern sich die Messsignale an. Für einen Abstand Δx₁ liegen die Messsignale noch auseinander und überlagern sich nicht. Dabei ist gezeigt, dass im Gegensatz zur Diagonalanordnung 40 in der Parallelanordnung 90 die Messausschlagabfolge gespiegelt ist. Bei Überstreichen des ersten Widerstandes R₃ erfolgt zunächst ein positiver Messausschlag und anschließend ein negativer Ausschlag. Bei Überstreichen des zweiten Messwiderstandes R₄ erfolgt zunächst ein negativer und anschließend ein positiver Messausschlag. Bei weiterem Annähern der Messwiderstände R₃, R₄ erfolgt eine Überlagerung der Messsignale, bei einem Abstand Δx₄ sind die Messsignale so überlagert, dass nur noch drei Messausschläge registriert werden, wobei der zweite, mittlere Messausschlag die doppelte Amplitudenhöhe A aufweist. Die doppelte Amplitudenhöhe A kann für ein verbessertes Signalrauschverhältnis genutzt werden.
11 zeigt einen Messsignalverlauf über eine Parallelanordnung. Auch in diesem Fall sind den Scheitelwerten der Messausschläge exakte Zeitpunkte t₁₁–t₁₃, bzw. Positionen relativ zu den Widerständen zuzuordnen. Diese sind in dem zeitlichen Verlauf der Zelle 10 über die Messwiderstände R₃, R₄ in 12 gezeigt. Zum Zeitpunkt t₁₁ beginnt die Zelle 10 den ersten Messwiderstand R₃ zu überstreichen. Die Zelle 10 bewegt sich mit einer Geschwindigkeit v über die Messwiderstände. Registriert wird das Inplane-Feld des Streufeldes der Zelle 10. Zum Zeitpunkt t₁₂ mit der höchsten Amplitude A befindet sich die Zelle 10 exakt zwischen den zwei magnetoresistiven Bauteilen R₃, R₄ in Parallelanordnung 90. Zum Zeitpunkt t₃ beendet die Zelle 10 das Überstreichen des zweiten Sensors R₄. Die zwei Sensoren R₃, R₄ in Parallelanordnung 90 befinden sich in einem Abstand Δx.
13 zeigt wiederum den zeitlichen Verlauf eines Messsignals in Diagonalanordnung 40 mit einem Abstand Δx der magnetoresistiven Bauteile R₁, R₄, der einen Messsignalverlauf mit vier Messausschlägen unterschiedlicher Amplitude hervorruft. Die Zeitpunkte der Scheitelwerte der Messausschläge t₃₁ bis t₃₄ sind wiederum in 14 verdeutlicht und in Verbindung mit der Position der Zelle 10 über den Messwiderständen R₁, R₄ gebracht. Der Weg Δx, den die Zelle 10 Im Zeitintervall Δt zwischen den beiden Maxima, also den Scheitelwerten der Messausschläge zum Zeitpunkt t₃₁ und t₃₃ zurücklegt, entspricht genau dem Abstand Δx der beiden Sensorelemente R₁, R₄. Über die Anzahl der Messpunkte N, und eine bekannte Datenrate N / sec , kann so die Geschwindigkeit v ermittelt werden:
Für eine derartige Berechnung der Durchflussgeschwindigkeit mit Parallelanordnung 160 werden vorzugsweise alle vier Widerstände R₁–R₄ der Wheatstone-Brücke als magnetoresistive Bauteile verwendet und in Reihe angeordnet, so dass zunächst das erste Paar R₁, R₂ und in einem größeren Abstand Δx als der Bauteilabstand Δx das zweite Paar R₃, R₄ überstrichen wird. 15 verdeutlicht den Verlauf der Zellen 10 über die Messwiderstände R₁–R₄. 17 zeigt das Messsignal der zwei aufeinanderfolgenden Paare R₁, R₂ und R₃, R₄ in Parallelanordnung 160. 18 zeigt das dazu gehörige Überstreichen der Sensoranordnung von einer Zelle 10. Zum Zeitpunkt t₇₁ überstreicht die Zelle 10 das erste Sensorelement R₁ mit einer Geschwindigkeit v. Zum Zeitpunkt t₇₂ erreicht die Zelle 10 die Mitte zwischen den ersten beiden Bauelementen R₁/R₂. Diese Position entspricht dem höchsten Scheitelwert des ersten Messsignals t₇₂. Zum Zeitpunkt t₇₃ beendet die Zelle 10 den zweiten Sensor R₂. Zum Zeitpunkt t₇₄ hat die Zelle 10 die Mitte zwischen den Bauelementen des zweiten Paares erreicht, also wieder dem höchsten Scheitelwert des zweiten Messsignals. Der zeitliche Abstand ΔT dieser beiden Maxima zu den Zeitpunkten t₇₂ und t₇₄ wird mit ΔT gekennzeichnet. Diese Zeitdifferenz ΔT kann nun wiederum genutzt werden, um die Durchflussgeschwindigkeit v zu ermitteln.
Anhand der so ermittelten Durchflussgeschwindigkeiten v aus dem Zeitintervall ΔT/Δt und dem bekannten Abstand Δx der Bauelemente oder dem bekannten Paarabstand ΔX kann in allen Fällen auch der Zelldurchmesser ermittelt werden, in dem die Durchflussgeschwindigkeit v [μm/s] mit dem Zeitintervall Δt [sec] oder ΔT [sec] multipliziert wird.

Claims

Verfahren zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10), wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Inbetriebnahme einer Sensoranordnung, wobei zur Inbetriebnahme mindestens ein erstes (R1, R2, R3) und ein zweites magnetoresistives Bauteil (R2, R3, R4) in einer Wheatstone-Brücke in Diagonalanordnung (40) oder Parallelanordnung (90) verschaltet und in einem Abstand (Δx) voneinander in Flussrichtung (20) angeordnet werden, – magnetische Markierung der Zellen (10), – Flusserzeugung der Zellen über die Sensoranordnung, wobei der Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (R1, R2, R3) und anschließend über das zweite magnetoresistive Bauteil (R2, R3, R4) geführt wird, – Einzelzellerfassung, wobei durch das magnetische Feld einer einzelnen magnetisch markierten Zelle (10), die über die Sensoranordnung fließt, ein Messsignal mit einem charakteristischen Messsignalmuster aus mindestens drei Messausschlägen erzeugt wird – Auswertung des Messsignals, in der anhand der Messausschlagrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzelldetektion identifiziert wird; dadurch gekennzeichnet, dass – aus dem charakteristischen Messsignalmuster ein Messausschlagabstand (Δt) ausgewertet wird und der Zelldurchmesser anhand des Messausschlagabstandes (Δt) berechnet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens eine weitere Information aus dem charakteristischen Messsignalmuster wie Messausschlaganzahl oder Messausschlagamplituden (A) ausgewertet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei in der Auswertung die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Abstandes (Δx) der magnetoresistiven Bauteile (R1, R2, R3, R4) berechnet wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in der Auswertung anhand der Messausschlagamplitude (A) das Signal-Rausch-Verhältnis ermittelt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem zur magnetischen Markierung der Zellen superparamagnetische Marker verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10) eines vorgegebnen Typs mit charakteristischem Zelldurchmesser, wobei das erste (R1, R2, R3) und das zweite magnetoresistive Bauteil (R2, R3, R4) in einem Abstand (Δx) voneinander in Flussrichtung (20) angeordnet werden, der maximal den doppelten Zelldurchmesser beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei – zur Inbetriebnahme der Sensoranordnung vier magnetoresistive Bauteile (R1, R2, R3, R4) zu einem ersten (R1, R2) und einem zweiten Paar (R3, R4) in einer Wheatstone-Brücke in Parallelanordnung (160) verschaltet werden und so in Reihe angeordnet werden, dass ein Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (R1), anschließend über das zweite (R2), anschließend über das dritte (R3) und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil (R4) führbar ist und wobei – der Fluss (20) der Zellen (10) in eben dieser Reihenfolge über die vier magnetoresistiven Bauteile (R1, R2, R3, R4) geführt wird und wobei – in der Auswertung die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Paar-Abstandes (ΔX) zwischen dem ersten (R1, R2) und zweiten Paar (R3, R4) magnetoresistiver Bauteile (R1, R2, R3, R4) berechnet wird.
Vorrichtung zur magnetischen Durchflussmessung von Zellen (10) mit einer Sensoranordnung, die mindestens eine Wheatstone-Brücke mit mindestens einem ersten (R1, R2, R3) und einem zweiten magnetoresistiven Bauteil (R2, R3, R4) umfasst, wobei die magnetoresistiven Bauteile (R1, R2, R3, R4) in einer Diagonalanordnung (40) oder einer Parallelanordnung (90) verschaltet sind und in einem Abstand (Δx) voneinander entlang eines Flusskanal angeordnet sind, dass ein Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (R1, R2, R3) und anschließend über das zweite magnetoresistive Bauteil (R2, R3, R4) führbar ist, wobei die Sensoranordnung ausgestaltet ist, ein Messsignal zu erfassen und der Abstand (Δx) der magnetoresistiven Bauteile (R1, R2, R3, R4) einen Wert beträgt, der bewirkt, dass das Messsignal ein charakteristisches Messsignalmuster mit mindestens drei Messausschlägen zeigt und mit einer Auswerteelektronik, die ausgestaltet ist, anhand der Messausschlagrichtungsabfolge das Messsignal als Einzelzelldetektion zu identifizieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswerteelektronik ferner ausgestaltet ist, den Zelldurchmesser anhand eines Messausschlagabstandes (Δt) zu berechnen, welcher durch Auswertung des charakteristischen Messsignalmusters ermittelt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei der Abstand (Δx) der magnetoresistiven Bauteile (R1, R2, R3, R4) maximal 50 μm beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Auswerteelektronik ausgestaltet ist, aus dem Messsignalmuster die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Abstandes (Δx) der magnetoresistiven Bauteile (R1, R2, R3, R4) zu berechnen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Auswerteelektronik ausgestaltet ist, anhand der Messausschlagamplitude (A) das Signal-Rausch-Verhältnis zu ermitteln.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei die Sensoranordnung vier magnetoresistive Bauteile (R1, R2, R3, R4) einer Wheatstone-Brücke umfasst, die zu einem ersten (R1, R2) und einem zweiten Paar (R3, R4) aus magnetoresistiven Bauteilen in Parallelanordnung (160) verschaltet sind und so in Reihe angeordnet sind, dass ein Fluss (20) der Zellen (10) zunächst über das erste (R1), anschließend über das zweite (R2), anschließend über das dritte (R3) und anschließend über das vierte magnetoresistive Bauteil (R4) führbar ist und wobei die Auswerteelektronik ausgestaltet ist, die Durchflussgeschwindigkeit anhand des bekannten Paar-Abstandes (ΔX) zwischen dem ersten (R1, R2) und zweiten Paar (R3, R4) magnetoresistiver Bauteile (R1, R2, R3, R4) zu berechnen.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei der Paar-Abstand (ΔX) zwischen dem ersten (R1, R2) und zweiten Paar (R3, R4) magnetoresistiver Bauteile (R1, R2, R3, R4) größer als der Abstand (Δx) zwischen den einzelnen magnetoresistiven Bauteilen innerhalb eines Paares ist.