DE102010024636A1

DE102010024636A1 - Antikörper, insbesondere für die Diagnostik

Info

Publication number: DE102010024636A1
Application number: DE102010024636A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Ergün Süleyman; Dr. Singer Bernhard B.
Original assignee: Universitaet Duisburg Essen
Current assignee: Universitaet Duisburg Essen
Priority date: 2010-06-22
Filing date: 2010-06-22
Publication date: 2011-12-22
Anticipated expiration: 2030-06-23
Also published as: DE102010024636B4

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Antikörper, insbesondere monoklonalen Antikörper, wobei der Antikörper selektiv und/oder spezifisch mit mindestens einem CEA CAM1-Protein zu interagieren, insbesondere hieran zu binden, imstande ist. Der erfindungsgemäße Antikörper zeichnet sich dadurch aus, dass die Interaktion, insbesondere Bindung, des Antikörpers im Bereich einer A-Domäne und/oder im Bereich einer B-Domäne des CEACAM1-Proteins, insbesondere an einer A-Domäne und/oder an einer B-Domäne des CEACAM1-Proteins, erfolgt und/oder dass die Interaktion, insbesondere Bindung, des Antikörpers nicht an einer N-Domäne des CEACAM1-Proteins erfolgt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung den Antikörper mAb B3 sowie den Antikörper mAb C5-1X.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der so genannten CEACAM1-Proteine, welche insbesondere auch im menschlichen Körper vorkommen und welche in Verbindung mit Erkrankungen, wie Krebserkrankungen, stehen können.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, welche in Bezug auf die in Rede stehenden CEACAM1-Proteine selektiv bzw. spezifisch sind und somit selektiv bzw. spezifisch mit einem CEACAM1-Protein zu interagieren imstande sind bzw. eine Wechselwirkung mit dem zugrundeliegenden Protein ausbilden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen Antikörper mit der Bezeichnung mAb B3 sowie einen neuen Antikörper mit der Bezeichnung mAb C5-1X, wobei die jeweiligen Antikörper gegenüber dem Stand der Technik signifikant verbesserte Eigenschaften aufweisen.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper-produzierende bzw. Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Bestimmung eines CEACAM1-Proteins in einer Probe.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung der Antikörper nach der Erfindung zur spezifischen bzw. selektiven Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung der Antikörper nach der Erfindung zur Diagnose bzw. Prognose von Krankheiten, insbesondere Krebserkrankungen.
Wiederum weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines trunkierten Adhäsionsmoleküls, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins, mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne zur Diagnose bzw. Prognose von Krankheiten, insbesondere Krebserkrankungen.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Verwendung eines Verhältnisses eines trunkierten Adhäsionsmoleküls, insbesondere eines CEACAM1-Proteins, mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne einerseits zu einem Adhäsionsmolekül gleicher Art, insbesondere CEACAM1-Protein, mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits in einer biologischen Probe zur Diagnose bzw. Prognose von Krankheiten, insbesondere Krebserkrankungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft gleichermaßen auch ein Verfahren zur Detektion bzw. Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne in einer Probe.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Zusammensetzung nach der Erfindung, welche den erfindungsgemäßen Antikörper aufweist.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kit, welches den erfindungsgemäßen Antikörper bzw. die erfindungsgemäße Zusammensetzung aufweist.
Wie im Nachfolgenden noch explizit angeführt, betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere zwei Antikörper bzw. zwei Antikörpertypen, welche als Antikörper mAb B3 und als Antikörper mAb C5-1X bezeichnet sind. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung zwei Hybridomzelllinien zur Produktion bzw. Freisetzung der Antikörper der vorgenannten Art, wobei die Antikörper jeweils in Form von monoklonalen Antikörper ausgebildet sind, die gegen insbesondere humanes CEACAM1 bzw. CEACAM1-Protein gerichtet sind. Die erfindungsgemäßen Antikörper beider Typen zeichnen sich dabei insbesondere dadurch aus, dass diese nicht an die im Hinblick auf CEACAM1-Proteine funktionsrelevante bzw. funktionsauslösende N-Domäne, sondern vielmehr im Bereich der nachfolgend noch näher spezifizierten A-Domäne, insbesondere A1-Domäne, und/oder an der B-Domäne, insbesondere B1-Domäne, von CEACAM1-Proteinen binden bzw. mit diesen Bereichen bzw. Regionen des Proteins zu Wechselwirken imstande sind.
Proteine der Klasse CEACAM gehören zur Familie der so genannten Carcinoembryonalen Antigene (CEA), welche wiederum im Allgemeinen in die Superfamilie der Immunglobuline eingeordnet werden können. In diesem Zusammenhang sind die die Proteine der CEA-Familie kodierenden Gene bzw. die Proteine als solche in zwei Gruppen eingeteilt, wobei die erste Gruppe durch Schwangerschafts-spezifische Glykoproteine (PSGs; Pregnancy-Specific Glycoproteins) gebildet wird, während die zweite Gruppe durch Zell-Adhäsions-Moleküle (CEA-Related Cell Adhesion Molecules; CEACAMs) gebildet wird. Im Allgemeinen handelt es sich bei den CEACAM-Proteinen um multifunktionale Adhäsions-Rezeptor-Moleküle, die unter anderem eine Rolle im Hinblick auf die Zelldifferenzierung, Zellproliferation und Zellmorphogenese, die Zelladhäsion, Zellaktivierung und Zellapoptose sowie im Hinblick auf die Angiogenese und Tumorsuppression spielen. Darüber hinaus können CEACAM-Proteine als Rezeptoren für Bakterien und Viren fungieren (vgl. 1).
Sämtliche Mitglieder der CEACAM-Familie weisen eine ähnliche Proteinstruktur auf. So verfügen CEACAM-Proteine im Allgemeinen über ein N-terminales Signalpeptid, welches in Bezug auf die jeweiligen CEACAM-Proteine variabel ausgebildet sein kann und auch als IgV-Domäne bzw. IgV-ähnliche Domäne bezeichnet wird. Auf die auch als N-Domäne bezeichnete IgV-Domäne folgt eine variable Anzahl von IgC-Domänen bzw. IgC-ähnlichen Domänen, welche im Allgemeinen durch A-Domänen mit den jeweiligen Subtypen A1, A2, A3 usw. und B-Domänen mit den jeweiligen Subtypen B1, B2 usw. gebildet werden. Ein Teil der CEACAM-Proteine, insbesondere Proteine vom Typ CEACAM1, CEACAM3 und CEACAM4, wird durch ein C-terminales Transmembransegment in der Zellmembran verankert, während CEACAM-Proteine vorn Typ CEACAM5 bis CEACAM8 über eine Glykosylphosphatidylinositol-Verankerung membranständig befestigt bzw. verankert sind, was in 2A veranschaulicht ist.
Durch alternatives Splicing (Spleißen) kann eine hohe Vielfalt der CEACAM-Proteine erzeugt werden, wobei sich die verschiedenen Isoformen hinsichtlich ihrer Domänenstruktur und der zytoplasmatischen Anteile voneinander unterscheiden. Die Funktionsweise von CEACAM-Proteinen liegt unter anderem in ihrer Fähigkeit begründet, mit der N-Domäne homo- und heterophile Bindungen mit unterschiedlichen Liganden einzugehen, wobei die Bindung von bzw. Interaktion mit Liganden zur Induktion von Signalkaskaden führen kann, welche wiederum individuelle physiologische Effekte auslösen. Die N-Domäne stellt somit gewissermaßen insbesondere auch eine adhäsive Domäne dar oder weist eine solche adhäsive Domäne auf. Im Gegensatz zu anderen Spezies wird beim Menschen eine Vielzahl von CEACAMs gebildet, wie CEACAM1, CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM16, CEACAM18, CEACAM19, CEACAM20 und CEACAM21.
Für weitere diesbezügliche Informationen kann verwiesen werden auf den Internet-Auszug gemäß http://www.carcino-embryonic-antigen.de/534676973c0950b01/index.html sowie auf Beauchemin N., "Redefined Nomenclature for Members of the Carcinoembryonic Antigen Family.", W. Exp. Cell Res., 1999, Nov 1, 252 (2): 243–249.
Korrespondierend zu den variablen Funktionen der CEACAM-Proteine wird CEACAM1 in zahlreichen Gewebe- bzw. Zelltypen exprimiert, wie z. B. Leukozyten und hämatopoetischen Zellen, sowie in dem Epithel und Endothel verschiedener Organe. CEACAM1 weist neben der N-Domäne die drei IgC-ähnlichen Domänen A1, A2 und B bzw. B1 auf und ist über eine Transmembrandomäne in der Zellmembran verankert.
Während die N-Domäne, A1-Domäne sowie die B-Domäne auch in anderen Mitgliedern der CEA-Familie vorkommen, beschränkt sich die A2-Domäne ausschließlich auf CEACAM1. In der Literatur ist bekannt, dass der Mensch zwölf Splice-Varianten von CEACAM1 coexprimieren kann, von denen bislang jedoch nur vier Varianten tatsächlich nachgewiesen werden konnten (vgl. 2B sowie 2C). Für weitere diesbezügliche Informationen kann verwiesen werden auf den Internet-Auszug gemäß http://www.carcinoembryonicantigen.de/534676973c0950b01/534676973f0f1b909.html.
Den insgesamt zwölf beim Menschen insbesondere mittels bioinformatischer Methoden ermittelten Splice-Varianten ist gemeinsam, dass sie über die zuvor beschriebene N-Domäne verfügen, während das Vorliegen der übrigen Domänen variabel ist. Wie zuvor angeführt, ist die N-Domäne die funktionsrelevante bzw. funktionsauslösende Komponente und dient im Fall von CEACAM1 beispielsweise der homophilen Bindung von trans- oder cis-lokalisiertem CEACAM1 oder heterophilen Interaktionen, beispielsweise mit CEACAM5 oder CEACAM6. Bei sämtlichen untersuchten Isoformen von CEACAM1 führt die Entfernung der N-Domäne zum Verlust der Proteinfunktionen (vgl. 3).
Eine insbesondere aus medizinischer Sicht besonders relevante Bedeutung von CEACAM1 betrifft dessen Involvierung in menschliche Krankheitsbilder, insbesondere im Hinblick auf maligne Tumorerkrankungen. Da die Expressionshöhe von CEACAM1 bei verschiedenen Krebserkrankungen im entarteten Gewebe selber oder im umliegenden Gewebebereich verändert sein kann, stellt CEACAM1 einen interessanten Tumormarker insbesondere zur frühzeitigen Erkennung, aber auch zur Abschätzung eines vorliegenden Erkrankungsgrades und der sich daraus ergebenden Prognose dar.
In diesem Zusammenhang betrifft die WO 2009/141679 A2 die Verwendung von CEACAM1 als Biomarker im Rahmen einer Point-of-Care-Diagnostik bei Melanompatienten, wobei aus diesem Dokument bekannt ist, dass mit dem Auftreten von Metastasen die Menge an löslichem CEACAM1 im Blut ansteigt. Das in diesem Dokument beschriebene System umfasst ein immunchromatographisches Verfahren, welches der Untersuchung von Blut auf seinen Gehalt an löslichem CEACAM1 dient. Die diesbezüglich eingesetzten polyklonalen Antikörper weisen jedoch den Nachteil auf, dass die hiermit durchgeführte Detektionsrnethode ungenau wird, da polyklonale Antikörper nicht gegen ein einzelnes Epitop, sondern gegen eine Vielzahl von Epitopen eines Antigens gerichtet sind. Folglich können aufgrund der stellenweise hohen Homologiegrade mitunter autoimmun-chromatographische Kreuzreaktionen mit anderen CEACAM-Proteinen stattfinden. Zudem weist der gemäß diesem Dokument eingesetzte monoklonale Antikörper mAb 4D1C2 den Nachteil auf, dass dieser nicht bzw. zumindest nicht ausreichend an das native Protein als solches binden kann.
Zudem konnte im Stand der Technik bei dem Vorliegen von Erkrankungen eine Veränderung der Expression von CEACAM1 dokumentiert werden. CEACAM1 wird im gesamten Gewebe ubiquitär in der luminalen Oberfläche des Urothels exprimiert. In Zellen von Blasenkarzinomen hingegen ist die Expression von CEACAM1 verändert, insbesondere deutlich herunterreguliert, während in Zellen des Endothels der an den Tumor angrenzenden Blutgefäße die Expression von CEACAM1 insbesondere im Zusammenhang mit einer verstärkten Angiogenese, welche eine Versorgung des Tumors mit Nährstoffen ermöglicht, heraufreguliert ist.
Was das Krankheitsbild des Blasenkarzinoms weiterhin anbelangt, so sind im Hinblick auf eine immunologische Untersuchung der entsprechenden Gewebe im Stand der Technik vorrangig invasive und kostenaufwändige Methoden, wie Biopsien bzw. Spiegelungen, vorgesehen. Insbesondere Blasenkrebs erfordert aufgrund der hohen Rezidivraten von bis zu 70% häufig zeitlebens kostenaufwändige und zudem invasive Nachsorgeuntersuchungen. Die im Stand der Technik beschriebenen zytologischen Untersuchungen von Urin zur Blasenkrebsdiagnose, welche nichtinvasive Verfahren darstellen, sind mit dem gravierenden Nachteil verbunden, dass diese lediglich für so genannte high-grade-Blasenkarzinome sensitiv sind. So genannte low-grade-Karzinome hingegen können mit diesem Verfahren nicht detektiert werden.
In der wissenschaftlichen Publikation gemäß Tilki et al.: "CEACAM1: A Novel Urinary Marker for Bladder Cancer Detection.", Eur. Urol., 28. Mai 2009, wird ein Verfahren zur Bestimmung von löslichen Formen von CEACAM1 im Urin beschrieben. Das geschilderte Verfahren ist jedoch mit dem Nachteil verbunden, dass die dort beschriebenen Antikörper nicht bzw. nicht im ausreichenden Maße an die native Form des korrelierenden Antigens binden können. Auf Basis der dort beschriebenen Antikörper sind Standardmethoden zur Immunotypisierung, wie beispielsweise das Verfahren der Durchflusszytometrie oder dergleichen, nicht möglich.
Weiterhin wurde im Stand der Technik bislang zudem angenommen, dass insbesondere im Fall der oben angeführten malignen Tumorerkrankungen die Bestimmung der absoluten Expressionshöhen von CEACAM1 im Vergleich zu gesunden Zellen ein relevanter Aspekt für den Einsatz von CEACAM1 als (Bio-)Marker ist, insbesondere im Zusammenhang mit der Proteinfunktion in Bezug auf den Tumor, wie im Fall einer Herunterregulation hinsichtlich der Funktion als Tumorsuppressor und wie im Fall einer Heraufregulation von CEACAM1 hinsichtlich der Verstärkung der Angiogenese, also einer verstärkten Blutgefäßbildung.
Demgegenüber konnte mittlerweile nachgewiesen werden, dass neben der absoluten Expressionshöhe von CEACAM1 auch das Verhältnis der durch alternatives Spleißen erzeugten kurzen und langen Varianten von CEACAM1 eine Schlüsselrolle insbesondere auch in Bezug auf Neoplasien spielt.
In diesem Zusammenhang sind im Stand der Technik zur immunologischen Detektion von CEACAM1 verschiedene Antikörper bekannt, welche gegen bestimmte Epitope von CEACAM1 gerichtet sind. Derartige Antikörper sind jedoch mit dem grundsätzlichen Nachteil verbunden, dass mit ihnen ein zuverlässiger Einsatz zur exakten Unterscheidung verschiedener CEACAM1-Varianten mitunter nicht gegeben ist. So weisen derartige Antikörper oftmals den Nachteil auf, dass eine Detektion des nativen Proteins als solches, insbesondere im Rahmen einer Durchflusszytometrie, nicht möglich ist. Ein Großteil der bislang beschriebenen Antikörper ist ausschließlich gegen die N-Domäne – also gegen die funktionsrelevante bzw. funktionsauslösende Domäne von CEACAM1, welche der Ligandenbindung dient – gerichtet, um auf diese Weise eine Bindung an das native Protein zu ermöglichen. Auf Basis derartiger Antikörper ist eine Unterscheidung von Isoformen nicht möglich, da alle bislang beschriebenen CEACAM1-Splice-Varianten über eine N-Domäne verfügen.
Zudem ist es mit den im Stand der Technik bekannten Antikörpern nicht bzw. nicht in zufriedenstellender Weise möglich, spezielle CEACAM1-Proteine zu detektieren, welche insbesondere im Hinblick auf die N-Domäne trunkiert sind bzw. die N-Domäne als solche nicht aufweisen. Zudem sind die im Stand der Technik bekannten, gegen die N-Domäne gerichteten Antikörper insofern nachteilig, als diese den funktionsrelevanten Bereich beeinflussen und damit zu einer mitunter unerwünschten Deaktivierung oder Aktivierung des Proteins führen können, was insbesondere für etwaige in-vivo-Anwendungen problematisch ist.
Vor dem Hintergrund der obigen Ausführungen besteht somit ein hoher Bedarf an der Entwicklung bzw. Bereitstellung von nichtinvasiven Methoden, welche eine effektive und aussagekräftige Detektion krankheitsbedingt veränderter Mengen von CEACAM1, insbesondere im Zusammenhang mit malignen Tumorerkrankungen, erlauben. Zudem besteht ein hoher Bedarf dahingehend, dass insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung der Expressionshöhen verschiedener CEACAM1-Varianten zur Krankheitsdiagnose, insbesondere zur Früherkennung maligner Tumorerkrankungen, vor allem solche Detektionsmöglichkeiten bereitzustellen, die einerseits die Untersuchung von Isoformen und andererseits die Bestimmung der Relation bzw. Verhältnisse der Isoformen zueinander ermöglichen.
Vor dem zuvor angeführten Hintergrund besteht somit eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, neue und effiziente Antikörpern bereitzustellen, welche gegenüber den im Stand der Technik bekannten Antikörpern verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der Detektion von CEACAM1-Proteinen aufweisen sollen, wobei diesbezüglich sowohl eine höhere Spezifität als auch Selektivität bereitgestellt werden soll, insbesondere was die Detektion spezieller Formen von CEACAM1 anbelangt.
Zudem kann eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin gesehen werden, solche Antikörper bereitzustellen, welche nicht an der N-Domäne von CEACAM1 binden bzw. auch an solche Formen bzw. Typen von CEACAM1-Proteinen binden bzw. hiermit eine Wechselwirkung eingehen können, welche nicht über die zuvor beschriebene N-Domäne verfügen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, solche Antikörper bereitzustellen, welche sich im Hinblick auf eine Prognose bzw. Diagnose einer Krebserkrankung eignen, wobei die mit der Verwendung der Antikörper einhergehende Anwendung einfach und mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden soll und zudem nicht mit einer nachhaltigen Beeinträchtigung des Probanden bzw. des Patienten einhergehen soll.
In diesem Zusammenhang besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, spezielle Antikörper bereitzustellen, welche die physiologische Funktion von CEACAM1-Proteinen insbesondere im Hinblick auf die N-Domäne, nicht beeinflussen bzw. welche nicht zu einer Inaktivierung nativer CEACAM1-Moleküle führen.
Schließlich besteht eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, Antikörper als solche, spezielle Verwendungen dieser Antikörper sowie damit im Zusammenhang stehende Verfahren, eine Zusammensetzung sowie ein Kit bereitzustellen, welche jeweils die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden bzw. diese zumindest zu verringern imstande sind.
Zur Lösung der zuvor geschilderten Aufgabenstellung schlägt die vorliegende Erfindung – gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung – einen Antikörper, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, welcher selektiv bzw. spezifisch mit mindestens einem CEACAM1-Protein zu interagieren bzw. hieran zu binden imstande ist, gemäß Anspruch 1 vor; weitere vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Erfindungsaspekts sind Gegenstand des betreffenden Unteranspruchs.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – sind Antikörper-produzierende bzw. Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche den erfindungsgemäßen Antikörper produzieren bzw. freisetzen können, nach den Ansprüchen 5, 6 sowie 7.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem wiederum weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche den erfindungsgemäßen Antikörper zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind, gemäß Anspruch 8.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist – gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – eine Verwendung des Antikörpers nach der Erfindung zur spezifischen bzw. selektiven Bestimmung bzw. Detektion von CEACAM1-Proteinen bzw. von trunkierten CEACAM1-Proteinen mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne nach Anspruch 9 bzw. 10.
Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist – gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – eine Verwendung des Antikörpers nach der Erfindung zur Diagnose bzw. Prognose von Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, gemäß Anspruch 11 sowie eine Verwendung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne zur Diagnose bzw. Prognose von Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, gemäß Anspruch 12.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem wiederum weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist eine Verwendung eines Verhältnisses eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne einerseits zu einem CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne zur Diagnose bzw. Prognose von Krebserkrankungen gemäß Anspruch 13.
Noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung eines inaktiven und/oder trunkierten Adhäsionsmoleküls mit zumindest teilweise fehlender Adhäsionsdomäne zur Diagnose bzw. Prognose von Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, gemäß Anspruch 14 sowie eine Verwendung eines Verhältnisses eines inaktiven und/oder trunkierten Adhäsionsmoleküls mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne einerseits zu einem Adhäsionsmolekül derselben Art mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits zur Diagnose bzw. Prognose von Krebserkrankungen gemäß Anspruch 15.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem wiederum weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist ein Verfahren zur Detektion bzw. Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne gemäß Anspruch 16.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist eine Zusammensetzung nach der Erfindung gemäß Anspruch 17, welche den Antikörper nach der Erfindung enthält.
Schließlich ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein erfindungsgemäßes Kit gemäß Anspruch 18, welches den Antikörper nach der Erfindung bzw. die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält.
Es versteht sich von selbst, dass im Folgenden besondere Ausgestaltungen, Ausführungsformen oder dergleichen, welche nur im Zusammenhang mit einem Erfindungsaspekt beschrieben sind, auch in Bezug auf die anderen Erfindungsaspekte entsprechend gelten, ohne dass dies einer ausdrücklichen Erwähnung bedarf.
Darüber hinaus gilt, dass alle im Folgenden angeführten experimentellen Untersuchungen bzw. Studien oder dergleichen grundsätzlich mit dem Fachmann an sich bekannten bzw. genormten bzw. explizit angegebenen Methoden bzw. Verfahren durchgeführt werden können.
Was die vorliegende Erfindung anbelangt, so ist diesbezüglich herauszustellen, dass es erstmalig gelungen ist, leistungsfähige und hochspezifische Antikörper bereitzustellen, welche an einem Bereich bzw. Epitop von CEACAM1-Proteinen zu binden imstande sind, welcher bzw. welches nicht durch die N-Domäne des Proteins gebildet wird. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Antikörper binden an einer Stelle von CEACAM1-Proteinen, welche sozusagen fernab der N-Domäne auf dem in Rede stehenden Protein lokalisiert ist. Insbesondere binden die erfindungsgemäßen Antikörper spezifisch im Bereich der A-Domäne, insbesondere A1-Domäne, bzw. an der B-Domäne, insbesondere der B1-Domäne, bzw. an der A1B- bzw. A1B1-Domäne von CEACAM1-Proteinen. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, welche sozusagen anti-CEACAM1-Antikörper darstellen, binden somit mit anderen Worten an ein Epitop im Bereich der A1-B-Domäne, welches somit nicht in der funktionsauslösenden N-Domäne liegt.
Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern ist der entscheidende Vorteil verbunden, dass diese im Rahmen ihrer Interaktion mit CEACAM1-Proteinen bzw. Bindung an CEACAM1-Proteine nicht mit der funktionsrelevanten bzw. funktionsauslösenden N-Domäne interagieren und somit das Protein als solches hinsichtlich seiner physiologischen Aktivität nicht beeinflussen. Zudem ist es durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Antikörper möglich, auch solche CEACAM1-Proteine zu detektieren, welche nicht über die zuvor beschriebene N-Domäne verfügen. Hierin ist ein weiterer entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Antikörper zu sehen.
Denn die Anmelderin konnte – wie nachfolgend noch angeführt – im Rahmen ihrer wissenschaftlichen Untersuchungen zeigen, dass CEACAM1-Proteine mit fehlender N-Domäne physiologisch auftreten und auch als spezielle Indikatoren bzw. Biomarker für bestimmte Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, wie Harnblasenkrebs, fungieren. Auf Basis der erfindungsgemäßen Antikörper wird somit ein hocheffizientes Werkzeug zur Detektion derartiger CEACAM1-Proteine bereitgestellt, welches sich auch zur Verwendung bzw. zum Einsatz im Rahmen von diagnostischen bzw. prognostischen Untersuchungen eignet. Darüber hinaus zeichnen sich die erfindungsgemäßen Antikörper auch dadurch aus, dass diese – im grundlegenden Unterschied zum Stand der Technik – in der Lage sind, an native Formen von CEACAM1-Proteinen – und zwar mit oder ohne N-Domäne – spezifisch zu binden, wobei es sich bei den CEACAM1-Proteinen insbesondere auch um humane Proteine handeln kann.
Weiterhin zeichnen sich die erfindungsgemäßen Antikörper dadurch aus, dass diese in zahlreichen Detektionsverfahren eingesetzt werden können. So eignen sich die erfindungsgemäßen Antikörper zur Verwendung in immunologischen Verfahren, wie ELISA-Verfahren (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), insbesondere Sandwich-ELISA-Verfahren, Westernblot- bzw. Immunoblotverfahren, Immunpräzipitationsverfahren, immunhistochemischen Verfahren, aber auch im Rahmen von Verfahren auf Basis von Durchflusszytometrie bzw. FACS-Verfahren (Fluorescence Activated Cell Sorting). Die erfindungsgemäßen Antikörper sind für Verfahren einsetzbar, die im Allgemeinen eine Bindung an die native Antigenstruktur erfordern. Die erfindungsgemäßen Antikörper überwinden somit im Ergebnis in eindrucksvoller Weise die Nachteile bzw. Beschränkungen der im Stand der Technik bekannten Antikörper und stellen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Detektion und Bestimmung spezieller CEACAM1-Proteine dar.
Wie im Nachfolgenden angeführt, eignen sich die erfindungsgemäßen Antikörper im besonderen Maße auch für diagnostische bzw. prognostische Verwendungen, insbesondere im Hinblick auf die Bestimmung von Krebserkrankungen, wie insbesondere Krebserkrankungen des Urogenitaltraktes, wie Harnblasenkrebs. In diesem Zusammenhang hat die Anmelderin zudem in völlig überraschender Weise herausgefunden, dass CEACAM1 – entgegen den bisherigen Annahmen – in menschlichen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Urin – in mitunter großen Mengen in einer modifizierten, insbesondere nicht-funktionalen Form vorliegt, wobei diesbezüglich gezeigt werden konnte, dass es sich hierbei um CEACAM1-Moleküle ohne N-Domäne und/oder mit einer verkürzten A2-Domäne handelt. Durch das Fehlen der N-Domäne ist die homo- bzw. heterophile Bindung von Liganden nicht mehr möglich, folglich kommt es so zum Funktionsverlust des Proteins. Weiterhin konnte die Anmelderin zeigen, dass derartig modifizierte CEACAM-Moleküle ein hochrelevanter Indikator bzw. (Bio-)Marker für die oben angeführten Erkrankungen sein können. Ohne sich auf diese Theorie beschränken zu wollen, handelt es sich bei den seitens der Anmelderin aufgefundenen CEACAM1-Varianten, welche insbesondere im Bereich der N-Domäne trunkiert sind bzw. die N-Domäne als solche nicht aufweisen, um enzymatisch gespaltene CEACAM1-Versionen. Wie zuvor angeführt, lösen CEACAM1 sowie weitere CEACAM-Proteine nach Bindung von Liganden, welche beispielsweise durch andere CEACAM-Proteine gebildet werden können, eine spezifische Signaltransduktionskaskade aus, die wiederum eine Vielzahl an verschiedenartigen Prozessen zur Folge hat. Eine Abspaltung der N-Domäne kommt einer Inaktivierung des CEACAM1-Moleküls gleich. Dies hat zur Folge, dass CEACAM1, welches im Bereich der N-Domäne trunkiert ist, nicht mehr imstande ist, insbesondere mit anderen CEACAM-Liganden zu interagieren bzw. pathogene Substanzen oder andere Moleküle zu binden. Somit können diese CEACAM1-Formen, welche keine N-Domäne aufweisen, weder Signaltransduktionsprozesse noch zelluläre Funktionen als solche induzieren bzw. auslösen. Ohne sich auf diese Theorie beschränken zu wollen, kann die physiologisch vorgesehene Abspaltung eines für die Ligandenbindung wichtigen Teils von CEACAM1-Proteinen eine sozusagen ausscheidbare Version des Moleküls schaffen, um beispielsweise im Rahmen des so genannten Turnover z. B. Proteine gezielt inaktivieren und ausscheiden zu können – z. B. auch im Zusammenhang mit pathogenen Zuständen, wie Krebserkrankungen. Auf Basis der erfindungsgemäßen Antikörper können auch derartige physiologisch relevante CEACAM1-Varianten, welche auf Basis der vorstehenden Ausführungen gleichermaßen auch als Indikatoren bzw. (Bio-)Marker für pathologische Zustände, wie Krebserkrankungen, herangezogen werden können, sicher detektiert werden.
Ein weiterer zentraler Vorteil der erfindungsgemäß bereitgestellten Antikörper ist darin zu sehen, dass diese weder mit anderen humanen CEACAMs noch mit CEACAM1 aus Mäusen, Ratten bzw. Rindern Kreuzreaktionen eingehen, so dass die erfindungsgemäßen Antikörper im Ergebnis hochspezifisch bzw. hochselektiv sind.
Aufgrund der Tatsache, dass die erfindungsgemäßen Antikörper nicht an der N-Domäne des CEACAM1-Proteins binden, führt eine Interaktion der erfindungsgemäßen Antikörper mit zu detektierenden CEACAM1-Proteinen nicht zu einer physiologischen Aktivierung der mit CEACAM1 in Verbindung stehenden Signalkaskaden, was insbesondere im Hinblick auf eine in-vivo-Detektion von CEACAM1 von Relevanz ist.
Darüber hinaus zeigen die Untersuchungen der Anmelderin, dass das für CEACAM1 dargestellte Prinzip der physiologisch relevanten Inaktivierung bzw. Trunkierung auch für andere Adhäsionsmoleküle bzw. -proteine, wie z. B. Ig-ähnlichen CAMs, Integrinen, Cadherinen oder dergleichen von Bedeutung ist, so dass auch solche Adhäsionsmoleküle erfindungsgemäß zur Verwendung im Bereich der Diagnostik, Prognostik bzw. im Rahmen therapeutischer Ansätze eingesetzt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist somit ein Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, wobei der Antikörper selektiv und/oder spezifisch mit mindestens einem CEACAM1-Protein zu interagieren, insbesondere hieran zu binden, imstande ist. Der erfindungsgemäße Antikörper zeichnet sich dadurch aus,

• dass die Interaktion, insbesondere Bindung, des Antikörpers im Bereich
• einer A-Domäne und/oder im Bereich einer B-Domäne des CEACAM1-Proteins, insbesondere an einer A-Domäne und/oder an einer B-Domäne des CEACAM1-Proteins, erfolgt, und/oder
• dass die Interaktion, insbesondere Bindung, des Antikörpers nicht an einer N-Domäne des CEACAM1-Proteins erfolgt.

Der Begriff ”Antikörper”, wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, betrifft im Allgemeinen insbesondere spezielle Immunglobuline, welche eine selektive Spezifität in Bezug auf die zuvor angeführten Epitope des CEACAM1-Proteins aufweisen. Der Begriff ”Antikörper”, wie er erfindungsgemäß verwendet wird, bezieht sich zudem nicht nur auf Antikörper als solche, sondern auch auf Fragmente des Antikörpers, wobei unter einem solchen Fragment ein solcher Abschnitt bzw. ein solches Fragment des Antikörpers verstanden wird, welcher bzw. welches die spezifische Antigenbindungsfunktion des Antikörpers an sich aufweist bzw. beibehält. Hierbei kann es sich beispielsweise um Fragmente vom Typ F_ab, F_(ab')2, F_v und um andere Fragmente, wie z. B. so genannte CDR-Fragmente (Complementary Determining Region) sowie um hypervariable Fragmente handeln. Die vorgenannten Fragmente können ebenfalls die Bindungsspezifität der erfindungsgemäßen Antikörper aufweisen und können beispielsweise mit dem Fachmann an sich bekannten Verfahren als rekombinante Proteine hergestellt werden. Weiterhin bezieht sich der erfindungsgemäß verwendete Begriff ”Antikörper” nicht nur auf einen einzelnen Antikörper an sich, sondern auch auf ein Ensemble bzw. eine Vielzahl von Antikörper desselben Typs, insbesondere wie nachfolgend definiert.
Weiterhin kann der Begriff ”selektive und/oder spezifische Interaktion bzw. Bindung”, wie er erfindungsgemäß verwendet wird, so verstanden werden, dass der erfindungsgemäße Antikörper eine signifikant höhere Bindungsaffinität gegenüber CEACAM1-Proteinen im Vergleich zu anderen Proteinen, insbesondere anderen CEACAM-Proteinen, aufweist. Gleichermaßen kann der Begriff auch so verstanden werden, dass der erfindungsgemäße Antikörper eine signifikant erhöhte Bindungsaffinität in Bezug auf die zuvor angeführten Epitope von CEACAM1 in Form der A-Domäne bzw. B-Domäne im Vergleich zu den anderen Epitopen von CEACAM1 aufweist.
Bei dem CEACAM1-Protein, gegenüber dem der erfindungsgemäße Antikörper selektiv bzw. spezifisch ist, handelt es sich vorzugsweise um ein humanes CEACAM1-Protein.
Weiterhin handelt es sich bei dem CEACAM1-Protein, gegenüber dem der erfindungsgemäße Antikörper selektiv bzw. spezifisch ist, um ein natives CEACAM1-Protein. Diesbezüglich ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung somit gelungen, einen Antikörper bereitzustellen, welcher das native Protein als solches zu detektieren imstande ist, was insbesondere in Bezug auf die nachfolgend noch angeführten Verwendungen bzw. Anwendungen von großem Vorteil ist.
Weiterhin kann es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei dem CEACAM1-Protein, gegenüber welchem der erfindungsgemäße Antikörper selektiv bzw. spezifisch ist, auch um eine Isoform, insbesondere Splice-Variante, von CEACAM1 handeln. In diesem Zusammenhang handelt es sich insbesondere in nichtbeschränkender Weise um Splice-Varianten, wie sie beispielsweise in 2b und 2c angeführt sind. Bei den Splice-Varianten kann es sich im Allgemeinen um durch Modifikationen insbesondere im Rahmen der Transkription resultierende Varianten von CEACAM1 handeln. Die zugrundeliegenden physiologischen Zusammenhänge sind dem Fachmann wohlbekannt, so dass es diesbezüglich keiner weiteren Ausführungen bedarf.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem CEACAM-Protein, gegenüber welchem der erfindungsgemäße Antikörper selektiv bzw. spezifisch ist, gleichermaßen um ein trunkiertes CEACAM1-Protein handeln.
Insbesondere kann es sich hierbei um ein am N-terminalen Ende trunkiertes CEACAM1-Protein handeln. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass es sich bei dem CEACAM1-Protein um ein trunkiertes CEACAM1-Protein mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, handelt. Das in Rede stehende CEACAM1-Protein mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne kann synonym auch als CEACAM-ΔN bzw. CEACAM1-deltaN bzw. CC1-ΔN bezeichnet werden. Insbesondere kann es sich bei dem CEACAM1-deltaN-Protein um das in 4 schematisch und mit der Bezeichnung ”trunkiertes CEACAM1” versehene Protein handeln.
In diesem Zusammenhang ist somit eine zentrale Konzeption der vorliegenden Erfindung darin zu sehen, dass auf Basis der erfindungsgemäßen Antikörper spezielle CEACAM1-Proteine detektiert werden können, welche nämlich nicht über eine N-Domäne verfügen und welche im Lichte der obigen Ausführungen auch als Marker für spezielle Krankheitsbilder, wie beispielsweise Krebserkrankungen, von Bedeutung sind.
Insbesondere kann es sich bei dem CEACAM1-deltaN-Protein um ein solches Protein handeln, welches von der in dem angehängten Sequenzprotokoll (Sequence Listing) angeführten Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 kodiert ist. Insbesondere kann es sich bei dem CEACAM1-deltaN-Protein auch um ein solches Protein handeln, dessen entsprechende und das Protein kodierende Nukleotidsequenz eine Übereinstimmung von mindestens 90%, insbesondere mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 98%, bevorzugt mindestens 99%, bezogen auf die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 aufweist. Die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 kann darüber hinaus insbesondere zu Zwecken der Klonierung mit dem Fachmann an sich bekannten Restriktionsschnittstellen ausgerüstet sein. So kann dem an Position 1 positionierten Nukleotid in nichtbeschränkender Weise die Nukleotidsequenz CTGCAG vorgeschaltet sein. Zudem kann in nichtbeschränkender Weise der in Rede stehenden Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 an deren Ende die Restriktionssequenz GAATTC nachgeschaltet sein. Die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO 1 bezieht sich gleichermaßen auf einen Abschnitt von CEACAM1 mit N-Domäne, und zwar insbesondere auf die diesbezügliche Aminosäurensäuresequenz von Position 143 bis 427, bezogen auf die Aminosäuresequenz von CEACAM1 mit N-Domäne, wobei im Übrigen der in Rede stehende Abschnitt von CEACAM1 mit N-Domäne mit dem entsprechenden Bereich von CEACAM1-deltaN korreliert.
Was die Spezifität des erfindungsgemäßen Antikörpers im Hinblick auf das CEACAM1-Protein anbelangt, so kann es sich bei der A-Domäne des CEACAM1-Proteins um eine A1-Domäne handeln. Zudem kann es sich bei der B-Domäne des CEACAM1-Proteins um eine B1-Domäne handeln. Der erfindungsgemäße Antikörper kann mit anderen Worten insbesondere spezifisch im A1B-Bereich bzw. im A1B1-Bereich von CEACAM1 binden.
In diesem Zusammenhang kann die A-Domäne, insbesondere die A1-Domäne, in einem Proteinabschnitt des CEACAM1-Proteins angeordnet sein bzw. diesen Proteinabschnitt bilden, wobei der Proteinabschnitt die Aminosäuresequenz von Position 158 bis 234 umfasst, vorzugsweise hieraus besteht, bezogen auf das vollständige CEACAM1-Protein und in der Zählweise bzw. Nummerierung beginnend am N-terminalen Ende des Proteins.
Gleichermaßen kann die B-Domäne, insbesondere die B1-Domäne, in einem Proteinabschnitt des CEACAM1-Proteins angeordnet sein bzw. diesen Proteinabschnitt bilden, wobei der Proteinabschnitt die Aminosäuresequenz von Position 250 bis 306 umfasst, vorzugsweise hieraus besteht, bezogen auf das vollständige CEACAM1-Protein (mit N-Domäne) und in der Zählweise bzw. Nummerierung beginnend am N-terminalen Ende des Proteins.
In Bezug auf die A- und B-Domäne von CEACAM1-deltaN handelt es sich insbesondere um die zu CEACAM1 mit N-Domäne korrelierenden Regionen bzw. Bereiche, wobei die konkrete Positionierung bzw. Nummerierung der Aminosäuresequenz um die entsprechend fehlende Anzahl an Aminosäuren in Bezug auf die fehlende N-Domäne zu korrigieren ist, was den Fachmann vor keine weiteren Schwierigkeiten stellt.
Was den erfindungsgemäßen Antikörper weiterhin anbelangt, so ist es bevorzugt, wenn der Antikörper nach der Erfindung murinen Ursprungs ist. Beispielsweise können die zugrundeliegenden Antigene in Mäuse vom Typ Balb/c zu Zwecken der Antikörperherstellung injiziert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es vorgesehen sein, dass der Antikörper von Hybridomzellen produziert ist. In diesem Zusammenhang können die Hybridomzellen aus der Fusion von (a) Zellen einer immortalisierten Zelllinie, vorzugsweise Myelomzellen, mit (b) den Antikörper-produzierenden Immunzellen, insbesondere Splenozyten, vorzugsweise Lymphozyten, bevorzugt B-Lymphozyten, stammen, wobei die Antikörper-produzierenden Immunzellen aus (Versuchs-)Tieren, insbesondere Mäusen, vorzugsweise Balb/c-Mäusen, isoliert sind und wobei die (Versuchs-)Tiere zuvor mit einem Immunogen auf Basis eines am N-terminalen Ende trunkierten CEACAM1-Proteins, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, behandelt bzw. immunisiert sind. Mit anderen Worten enthält das Immunogen vorrangig die entsprechenden Epitope, insbesondere die zuvor definierte A-Domäne und/oder B-Domäne, gegenüber denen der zu produzierende Antikörper spezifisch ist. Die diesbezüglich zugrundeliegenden Verfahren und Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt, so dass es diesbezüglich keiner weiteren Ausführungen bedarf.
In Bezug auf die Herstellung des erfindungsgemäßen Antikörpers kann beispielsweise zunächst eine Klonierung von CEACAM1-deltaN gegebenenfalls mit einem Fc-Peptid und/oder einem Signalpeptid, insbesondere Ratten-Signalpeptid, mit anschließender Antigen-Expression durchgeführt werden. Es kann eine Aufreinigung der Antigene beispielsweise über eine Affinitätschromatographie erfolgen, wobei sich im Allgemeinen eine Immunisierung insbesondere von Balb/c-Mäusen mit dem Antigen anschließen kann. Die Herstellung der den Antikörper produzierenden bzw. freisetzenden Hybridomzellen bzw. Hybridomzelllinien kann anhand von dem Fachmann an sich bekannten Hybridomtechniken erfolgen.
Wie zuvor angeführt, kann es sich bei dem erfindungsgemäßen Antikörper um einen Antikörper handeln, welcher eine Spezifität bzw. Reaktivität gegenüber humanem CEACAM1 aufweist, wobei gleichermaßen eine Spezifität gegenüber insbesondere humanen CEACAM1-deltaN-Proteinen vorliegt. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Antikörper monoklonal und/oder murinen Ursprungs.
Zusammenfassend ist herauszustellen, dass sich der erfindungsgemäße Antikörper für zahlreiche Applikationen eignet, wie Durchflusszytometrie/FACS, was mit der Fähigkeit des erfindungsgemäßen Antikörpers zur Bindung an das native Protein einhergeht. Zudem eignet sich der erfindungsgemäße Antikörper gleichermaßen zur Verwendung im Rahmen von ELISA-Verfahren, Westernblot- bzw. Immunoblot-Verfahren, im Rahmen der Immunhistochemie, Fluoreszenzmikroskopie, Affinitätsaufreinigung und dergleichen. Was das im Hinblick auf den erfindungsgemäßen Antikörper relevante Epitop anbelangt, so erfolgt die Interaktion des erfindungsgemäßen Antikörpers, wie zuvor angeführt, insbesondere in dem Bereich der A1B-Domäne bzw. A1B1-Domäne, wobei der erfindungsgemäße Antikörper zumindest im Wesentlichen nicht an die N-Domäne von CEACAM1 bindet. Was weiterhin die Spezifität des erfindungsgemäßen Antikörpers anbelangt, so bindet dieser zumindest im Wesentlichen ausschließlich an menschliche bzw. humane CEACAM1-Proteine, d. h. es treten zumindest im Wesentlichen keine Kreuzreaktionen mit entsprechenden CEACAM-Proteinen anderer Spezies auf. Auch liegt eine hohe Spezifität in Bezug auf CEACAM1 als solches vor, andere CEACAM-Proteine werden nicht detektiert. Zudem ist der erfindungsgemäße Antikörper in der Lage, sämtliche bislang im Menschen nachgewiesenen Isoformen von CEACAM1 zu erfassen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist ein Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, vorzugsweise wie zuvor definiert, wobei der erfindungsgemäße Antikörper die Bezeichnung mAb B3 aufweist. Zudem zeichnet sich der erfindungsgemäße Antikörper dadurch aus, dass dieser von einer Zellkultur, insbesondere von Hybridomzellen, produziert bzw. freigesetzt wird, welche unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3051 und mit dem Hinterlegungsdatum 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt ist bzw. sind.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist zudem ein Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, insbesondere wie zuvor definiert, wobei der Antikörper nach der Erfindung die Bezeichnung mAb C5-1X aufweist.
Zudem zeichnet sich der Antikörper nach der Erfindung gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt dadurch aus, dass der erfindungsgemäße Antikörper von einer Zellkultur, insbesondere von Hybridomzellen, produziert bzw. freigesetzt wird, welche unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3052 und mit dem Hinterlegungsdatum 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt ist bzw. sind.
Der erfindungsgemäße Antikörper vom Typ bzw. mit der Bezeichnung mAb B3 gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung und der erfindungsgemäße Antikörper vom Typ bzw. mit der Bezeichnung mAb C5-1X weisen, unabhängig voneinander, insbesondere die zuvor im Rahmen des ersten erfindungsgemäßen Aspekts angeführten Eigenschaften bzw. Vorteile auf.
Was den erfindungsgemäßen Antikörper gemäß den vorgenannten erfindungsgemäßen Aspekten weiterhin anbelangt, so kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung zudem vorgesehen sein, dass der Antikörper nach der Erfindung mit mindestens einem Molekül, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe von Markermolekülen, Enzymen, therapeutischen Wirkstoffen, radioaktiven Substanzen und dergleichen, ausgerüstet ist. In diesem Zusammenhang kann das Molekül an den Antikörper gekoppelt sein. Auf diese Weise ist es möglich, den erfindungsgemäßen Antikörper im Hinblick auf die jeweilige Anwendung sozusagen maßzuschneidern bzw. gezielt zu optimieren bzw. mit weiteren definierten Eigenschaften und Funktionen auszurüsten.
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung – Antikörper-produzierende bzw. Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass die Antikörper-produzierenden bzw. Antikörper-freisetzenden Zellen den zuvor definierten Antikörper zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind.
In diesem Zusammenhang sind auch Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einem fünften und sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung – Antikörper-produzierende bzw. Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind.
Dabei zeichnen sich die entsprechenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung dadurch aus,

• dass die Antikörper-produzierenden bzw. Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, einen Antikörper mit der Bezeichnung mAb B3 zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind und/oder
• dass die Antikörper-produzierenden bzw. Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3051 und mit dem Hinterlegungsdaturn 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt sind.

Zudem zeichnen sich die entsprechenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, gemäß dem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung insbesondere dadurch aus,

• dass die Antikörper-produzierenden bzw. die Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, einen Antikörper mit der Bezeichnung mAb C5-1X zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind und/oder
• dass die Antikörper-produzierenden und die Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3052 und mit dem Hinterlegungsdaturn 24. März 2010 bei der
• Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
• nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt sind.

Zudem ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche den zuvor definierten Antikörper zu produzieren bzw. freizusetzen imstande sind. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei die folgenden Schritte

(a) Bereitstellung eines Immunogens und/oder Antigens auf Basis eines am N-terminalen Ende trunkierten CEACAM1-Proteins, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne;
(b) Behandlung und/oder Immunisierung eines Tieres, insbesondere einer Maus, vorzugsweise einer Balb/c-Maus mit dem in Schritt (a) bereitgestellten Immunogen und/oder Antigen;
(c) Gewinnung und/oder Isolierung von den Antikörper produzierenden Immunzellen, insbesondere Splenocyten, vorzugsweise Lymphozyten, bevorzugt B-Lymphozyten, des in Schritt (b) behandelten und/oder immunisierten Tieres;
(d) Verschmelzung und/oder Fusionierung der in Schritt (c) gewonnenen Immunzellen mit Zellen einer immortalisierten Zelllinie, vorzugsweise Myelomzellen, zu Hybridomzellen;
(e) gegebenenfalls Vermehrung, insbesondere Klonierung, der in Schritt (d) gewonnenen Hybridomzellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise derart durchgeführt werden, dass zunächst ein Expressionsvektorsystem bereitgestellt wird, welches für CEACAM1-deltaN sowie gegebenenfalls für eine humane Fc-Domäne und/oder ein Signalpeptid, insbesondere ein von der Ratte stammendes Signalpeptid, kodiert. Der entsprechende Vektor kann in ein zur Expression fähiges Zellsystem überführt werden; beispielsweise kann eine Transfektion in HEK-Zellen, insbesondere HEK293-Zellen durchgeführt werden. Die resultierenden Proteine können gewonnen und akkumuliert sowie mittels Aufreinigungsverfahren, wie beispielsweise Affinitätschromatographieverfahren, behandelt werden und anschließend in ein Versuchstiersystem, beispielsweise auf Basis von Mäusen, injiziert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren basiert im Allgemeinen auf der Herstellung bzw. Generierung von monoklonalen Antikörpern nach dem Hybridoma-Prinzip, wobei einerseits entsprechende Myelomzellen kultiviert werden und andererseits aus dem vorgenannten Versuchstiersystem beispielsweise B-Zellen bzw. B-Lymphozyten gewonnen werden. Die Myelomzellen einerseits und B-Lymphozyten anderseits können mittels Zellfusion zu Hybridomzellen zusammengeführt werden. Es kann eine Selektion der erhaltenen Hybridomzellen, beispielsweise über eine so genannte HAT-Selektion, durchgeführt werden. Nachfolgend kann sich ein Screening nach kompetenten, d. h. Antikörper-sezernierenden Zellen, beispielsweise mittels ELISA-Verfahren, anschließen. Die zugrundeliegenden Verfahren und Techniken sind dem Fachmann dabei an sich wohlbekannt.
Insbesondere kann zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, wie sie erfindungsgemäß definiert sind, beispielsweise derart vorgegangen werden, dass einem Wirtsorganismus, insbesondere einer Maus, beispielsweise CEACAM1-Proteine als Antigene injiziert werden, wobei diesen Antigenen die in Rede stehende N-Domäne zumindest im wesentlichen vollständig fehlt. Weiterhin kann beispielsweise derart vorgegangen werden, dass im Rahmen der zugrundeliegenden Injektion des Antigens das zu injizierende Antigen durch solche Moleküle bereitgestellt bzw. gebildet wird, welche die in Rede stehenden Antigen-bildenden Regionen, insbesondere die A-Domäne und/oder die B-Domäne von CEACAM1, nachbilden.
Weiterhin ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem achten Aspekt der vorliegenden Erfindung – eine Verwendung des zuvor definierten Antikörpers zur spezifischen bzw. selektiven Bestimmung bzw. Detektion eines CEACAM1-Proteins insbesondere in einer Probe. In diesem Zusammenhang kann es sich bei dem CEACAM1-Protein insbesondere um ein trunkiertes CEACAM1-Protein mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, vorzugsweise wie zuvor definiert, handeln. Wie zuvor angeführt können aber auch CEACAM1-Proteine mit vorhandener N-Domäne sicher detektiert werden.
Dabei kann es im Rahmen der Detektion bzw. Erfassung vorgesehen sein, den Antikörper mit Markersubstanzen zu modifizieren bzw. weitere, sekundäre Antikörper mit entsprechenden Markern einzusetzen, welche an den erfindungsgemäßen Antikörper binden können. Die zugrundeliegenden Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt.
Des Weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung – eine Verwendung des zuvor definierten erfindungsgemäßen Antikörpers zur spezifischen bzw. selektiven Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, insbesondere in einer Probe und/oder zur Ermittlung eines Verhältnisses eines (1) trunkierten CEACAM-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, einerseits zu einem (2) CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits insbesondere in einer Probe. Gleichermaßen kann auch das Verhältnis von (2) zu (1) bestimmt werden.
Bei dem zuvor angeführten Verhältnis handelt es sich insbesondere um das Mengenverhältnis bzw. Konzentrationsverhältnis der in Rede stehenden Proteine in der zu untersuchenden Probe. Der Begriff ”Probe” wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich dabei insbesondere auf eine biologische Probe, insbesondere eine biologische Probe eines Probanden oder Patienten, welcher ein Tier oder ein Mensch sein kann. Bei der Probe kann es sich insbesondere um eine Körperflüssigkeit des Probanden bzw. Patienten, wie Blut und/oder Urin, vorzugsweise Urin, handeln. Insbesondere im Hinblick auf die Untersuchung von Krebserkrankungen des Urogenitaltraktes eignet sich Urin in besonderer Weise zur Verwendung als zugrundeliegende Probe. Grundsätzlich kommen auch Gewebeproben in Betracht.
Was die Bestimmung des zuvor definierten Verhältnisses anbelangt, so kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung zusätzlich ein für das CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne an der N-Domäne bindender oder hiermit in Wechselwirkung tretender zweiter Antikörper eingesetzt wird, so dass auf diese Weise eine Differenzierung der zuvor beschriebenen Typen von CEACAM1-Proteinen, nämlich einerseits mit N-Domäne und andererseits ohne N-Domäne, weiter verbessert bzw. ermöglicht wird. Die diesbezüglich verwendbaren Antikörper sind dem Fachmann bekannt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem zehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist eine Verwendung des Antikörpers nach der Erfindung, wie zuvor definiert, zur Diagnose bzw. Prognose von insbesondere in Verbindung mit dem Vorhandensein eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zummindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, und/oder in Verbindung mit einer Veränderung des Gehaltes und/oder der Menge eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, stehenden Erkrankungen. Bei den Erkrankungen handelt es sich insbesondere um Krebserkrankungen. Das Vorhandensein bzw. der Gehalt des trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, kann in einer insbesondere biologischen Probe gleichermaßen bestimmt werden.
In diesem Zusammenhang kann es sich bei der Erkrankung, insbesondere Krebserkrankung, um eine Neoplasie handeln. Gleichermaßen kann es sich bei der Erkrankung, insbesondere Krebserkrankung, um eine Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere um Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs, handeln.
Was die erfindungsgemäße Verwendung weiterhin anbelangt, so kann es sich bei der Probe um eine insbesondere humane Gewebeprobe oder um eine insbesondere humane Körperflüssigkeit, vorzugsweise um Urin, handeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem elften Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist zudem die Verwendung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
In diesem Zusammenhang kann das Verhältnis des (1) trunkierten CEACAM1-Proteins einerseits zu einem (2) CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits in einer Probe eines Probanden bestimmt werden.
In diesem Zusammenhang kann es vorgesehen sein, dass das Verhältnis mit hierzu entsprechenden Referenz-Verhältnissen verglichen bzw. korreliert wird und/oder dass das so erhaltene Verhältnis hierzu entsprechenden Referenz-Verhältnissen zugeordnet wird und wobei anschließend auf Basis des Vergleichs und/oder der Korrelation und/oder der Zuordnung die Wahrscheinlichkeit des Probanden bestimmt wird, an einer Krebserkrankung erkrankt zu sein und/oder zu erkranken. Bei den Referenz-Verhältnissen kann es sich beispielsweise um an einem Patientenkollektiv mit vorhandener Krebserkrankung ermittelte Daten handeln, die beispielsweise anhand von klinischen Studien an der statistisch relevanten Anzahl von Individuen gewonnen werden können.
Ein wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem zwölften Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist die Verwendung eines Verhältnisses eines (1) trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, einerseits zu einem (2) CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits in einer biologischen Probe zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
Was die zuvor beschriebenen Verwendungen insbesondere gemäß dem zehnten bis zwölften Aspekt der vorliegenden Erfindung anbelangt, so beruhen die in Rede stehenden Verwendungen auf der grundlegenden Erkenntnis der Anmelderin, dass in menschlichen Körperflüssigkeiten, wie z. B. Urin, CEACAM1-deltaN neben der nicht trunkierten Form von CEACAM1 vorhanden ist und zudem als Indikator bzw. Marker für Krebserkrankungen, wie Harnblasenkrebs, herangezogen werden kann. Auf dieser Basis kann somit die Bestimmung des Verhältnisses von CEACAM-deltaN zu CEACAM1 mit vorhandener N-Domäne als diagnostischer und/oder prognostischer Ansatz für verschiedene Krebsarten eingesetzt werden.
In Bezug auf die vorgenannten Verwendungen kann es sich bei der zu untersuchenden Krebsart grundsätzlich auch um andere Krebsarten, beispielsweise auf Basis eines kolorektalen Karzinoms, eines Prostatakarzinoms, eines Hepatoms und/oder Mammakarzinoms, handeln.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen fokussieren im Ergebnis auf eine insbesondere quantitative Bestimmung von CEACAM1 in Körperflüssigkeiten, wobei diesbezüglich beispielsweise und in nichtbeschränkender Weise ELISA- bzw. Sandwich-ELISA-Verfahren eingesetzt werden können. Die so ermittelten Daten weisen eine zusätzliche diagnostische Qualität auf, da der erfindungsgemäße Antikörper eine Diagnostik mit hoher Sensitivität und Spezifität erlaubt. Dabei kann derart vorgegangen werden, dass CEACAM1-positive Urinproben insbesondere gelelektrophoretisch aufgetrennt und nach erfolgtem Immunoblotting auf das Verhältnis von CEACAM1-deltaN zu CEACAM1 mit vorhandener N-Domäne analysiert wird. Das vermittelte Verhältnis kann, wie zuvor angeführt, beispielsweise in Relation zu Referenzwerten gesetzt werden.
Zur Bestimmung des Verhältnisses von CEACAM1-deltaN zu CEACAM1 mit N-Domäne in einer Probe kann somit der erfindungsgemäße Antikörper mAb B3 und/oder C51X zur Detektion von CECAM1 ohne N-Domäne beispielsweise mittels ELISA eingesetzt werden. Des Weiteren kann, wie zuvor aufgeführt, ein zusätzlicher Antikörper eingesetzt werden, welcher gegen die N-Domäne von CEACAM1 gerichtet ist, wobei diesbezüglich ein weiteres ELISA-Verfahren durchgeführt werden kann. Die Bestimmung des Verhältnisses von CEACAM1-deltaN zu CEACAM1 mit N-Domäne kann dann im Hinblick auf eine Prognose bzw. Aussage über das Vorliegen einer Krebserkrankung herangezogen werden.
Eine weitere diagnostische Anwendungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Antikörper ist zudem darin zu sehen, dass diese für die Magnet-Resonanz-Tomographie zugänglich gemacht werden können, wobei diesbezüglich beispielsweise eine Kopplung mit Eisen oder dergleichen vorgenommen werden kann. Zudem können die erfindungsgemäßen Antikörper auch der Röntgendiagnostik zugänglich gemacht werden, wobei diesbezüglich beispielsweise eine Kopplung mit radioaktiven Substanzen durchgeführt werden kann. Zudem sind die erfindungsgemäßen Antikörper auch im Hinblick auf deren Verwendung für therapeutische Anwendungsmöglichkeiten von Relevanz, wobei diesbezüglich beispielsweise eine Kopplung der Antikörper mit radioaktiven Substanzen oder speziellen Enzymen vorgesehen sein kann.
Wie zuvor angeführt, hat die Anmelderin in völlig überraschender Weise herausgefunden, dass nicht nur CEACAM1 als solches in seiner trunkierten Form bzw. im Rahmen der Ermittlung eines diesbezüglichen Verhältnisses zu der nicht trunkierten Form gewissermaßen als Biomarker bzw. Bioindikator im Rahmen einer entsprechenden Diagnostik bzw. Prognose insbesondere für Tumorerkrankungen, wie Harnblasenkarzinomen, verwendet werden kann, sondern dass vielmehr das zugrundeliegende Prinzip für eine Vielzahl weiterer Adhäsionsmoleküle, insbesondere Adhäsionsproteine, gültig ist.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem dreizehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung – die Verwendung eines trunkierten und/oder inaktivierten Adhäsionsmoleküls, insbesondere Adhäsionsproteins, insbesondere mit zumindest teilweise fehlender Adhäsionsdomäne und/oder insbesondere mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender Adhäsionsdomäne und/oder vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
In diesem Zusammenhang ist gleichermaßen Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem vierzehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung – die Verwendung eines Verhältnisses eines (1) trunkierten und/oder inaktivierten Adhasionsmoleküls, insbesondere Adhäsionsproteins, insbesondere mit zumindest teilweise fehlender Adhäsionsdomäne und/oder insbesondere mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender Adhäsionsdomäne und/oder vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, einerseits zu einem (2) insbesondere aktiven und/oder zumindest im Wesentlichen nicht trunkierten Adhäsionsmolekül derselben Art, insbesondere Adhäsionsprotein derselben Art, mit zumindest im Wesentlichen vollständiger Adhäsionsdomäne und/oder mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits in einer biologischen Probe zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
In diesem Zusammenhang kann es insbesondere vorgesehen sein, dass das Adhäsionsmolekül, insbesondere Adhäsionsprotein, ausgewählt wird aus der Gruppe von CEACAM1, Ig-ähnlichen CAMs (Immunglobulin-like Cell-Adhesion Molecule), Integrinen, Cadherinen, Selektinen, RPTPs (Receptor Protein Tyrosine Phosphatase), Hyaluronat-Rezeptoren und CD26/DPPIV (CD26/Dipeptidylpeptidase IV).
Was den zuvor angeführten Begriff ”derselben Art” anbelangt, so ist hierunter erfindungsgemäß insbesondere zu verstehen, dass zur Bestimmung des Verhältnisses jeweils identische Spezies bzw. Typen von Adhäsionsmolekülen herangezogen werden, wie – beispielhaft und in nichtbeschränkender Weise – (1) ein trunkiertes Integrin einerseits und (2) ein nichttrunkiertes Integrin andererseits.
In diesem Zusammenhang zeigen die seitens der Anmelderin ermittelten Daten, dass die inaktivierten bzw. trunkierten und somit insbesondere ausscheidbaren Formen der zuvor angeführten Adhäsionsmoleküle in veränderter Menge bzw. Konzentration, insbesondere in erhöhter Menge bzw. Konzentration, beispielsweise in Tumorgeweben auftreten können. Somit sind die zuvor spezifizierten Adhäsionsmoleküle von hoher diagnostischer bzw. prognostischer bzw. therapeutischer Relevanz.
In Bezug auf diesbezüglich weiterführende Ausführungen zu dem dreizehnten und vierzehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann, insbesondere auch im Hinblick auf die zur Detektion der in Rede stehenden Adhäsionsmoleküle einsetzbaren Verfahren, insbesondere auch auf die Ausführungen zu dem elften und zwölften Aspekt der vorliegenden Erfindung verwiesen werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem fünfzehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist ein Verfahren zur Detektion und/oder Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, in einer Probe, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellung der Probe;
(b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, wie zuvor definiert;
(c) Feststellung und/oder Detektion einer spezifischen und/oder selektiven Bindung und/oder Wechselwirkung des Antikörpers mit dem trunkierten CEACAM1-Protein;
(d) gegebenenfalls quantitative Bestimmung des Gehaltes und/oder der Menge des trunkierten CEACAM1-Proteins in der Probe insbesondere durch Korrelation der Menge und/oder des Gehaltes des trunkierten CEACAM1-Proteins mit der in Schritt (c) festgestellten. und/oder detektierten Bindung und/oder Wechselwirkung.

Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem sechzehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist eine Zusammensetzung, welche mindestens einen zuvor definierten Antikörper enthält. Dabei kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung den erfindungsgemäßen Antikörper vom Typ mAb B3, wie zuvor beschrieben, und/oder den erfindungsgemäßen Antikörper vom Typ mAb C5-1X, wie zuvor beschrieben, aufweisen. Zudem kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung weitere dem Fachmann an sich geläufige Inhaltsstoffe aufweisen, wie Puffersubstanzen, Stabilisatoren oder dergleichen.
Schließlich ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem siebzehnten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ein Kit, insbesondere zur spezifischen oder selektiven Bestimmung oder Detektion eines CEACAM1-Proteins, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, in einer Probe, wobei das Kit einen Antikörper, wie zuvor definiert, oder eine Zusammensetzung, wie zuvor definiert, enthalten kann.
Weitere Vorteile, Merkmale, Eigenschaften und Aspekte der vorliegenden Erfindung ergeben sich auch aus den beigefügten Figurendarstellungen, welche teilweise auch Bezug nehmen auf den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Hintergrund, insbesondere im Hinblick auf CEACAM-Proteine sowie auf erfindungsgemäß durchgeführte Ausführungsbeispiele als solche. Es zeigt:
1 eine Übersichtsdarstellung zu physiologischen Funktionen, welche im Zusammenhang mit CEACAM1 stehen bzw. durch CEACAM1 induziert werden;
2A Mitglieder der humanen CEA-Familie, wobei die Abkürzung GPI für Glykosylphosphatidylinositol steht. GPI stellt eine posttranslationale Proteinmodifikation dar;
2B eine Übersicht über Splice-Varianten bzw. Isoformen von humanem CEACAM1, welche bislang als coexprimierte Proteine im Menschen nachgewiesen wurden;
2C weitere Splice-Varianten bzw. Isoformen von humanem CEACAM1, deren tatsächliche Expression bislang nicht definitiv nachgewiesen wurde;
3 Funktionsbeispiele, welche durch die Bindung von Liganden an die N-Domäne von CEACAM-Proteinen ausgelöst werden. Physiologisch kann membrangebundenes CEACAM1 mit membrangebundenen oder löslichen CEACAMs interagieren und so Signaltransduktionskaskaden auslösen, welche dann wiederum in einer Zellfunktion resultieren. CEACAM-Moleküle, die keine N-Domäne aufweisen, können nicht miteinander interagieren und somit auch keine zellspezifische Funktion auslösen;
4 einen immunologischen Nachweis von CEACAM5 und CEACAM1 in einer Urinprobe. Die Probe wird mit Lämmli-Puffer verdünnt und bei 95°C für zehn Minuten gekocht. Anschließend wird die Probe auf eine 10% SDS-Page aufgetragen und gelelektrophoretisch nach der Proteingröße aufgetrennt. Die Proteine werden mittels Elektroblotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers Col-1, welcher CEACAM5 und CEACAM3 bindet, und mit dem erfindungsgemäßen Antikörper mAb C5-1X, welcher ausschließlich humanes CEACAM1 bindet, entwickelt. Üblicherweise besitzt CEACAM1 mit vorhandener N-Domäne ein Molekulargewicht von etwa 120 kD.
Als Ergebnis des seitens der Anmelderin in diesem Zusammenhang durchgeführten Experiments kann aufgezeigt werden, dass im Gegensatz zu CEA (CEACAM5) das Protein CEACAM1 nicht als komplettes Protein, sondern in abgespaltener Form ohne N-Domäne in der Probe vorliegt. Dabei fehlt in Bezug auf CEACAM1 sowohl die N-Domäne als auch ein Teil der A2-Domäne. Ein durchgeführtes Epitop-Mapping mit verschiedenen monospezifischen Antikörpern, welche bestimmte Epitope des humanen CEACAM1 erkennen (z. B. N-Domäne, A1B1-Domäne und A2-Domäne), kann zeigen, dass es sich bei dieser veränderten Variante von CEACAM1 nicht um eine deglykosylierte Variante handelt;
5 eine Charakterisierung der Bindung des erfindungsgemäßen Antikörpers mAb B3 an Zellen, welche jeweils eines der CEACAM-Mitglieder auf der Zelloberfläche exprimieren. In der oberen Zeile ist jeweils ein Antikörper gezeigt, welcher die CEACAM erkennenden Antikörper erkennt. Die untere Zeile veranschaulicht das Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers mAb B3 nach der Erfindung. Der erfindungsgemäße Antikörper erkennt ausschließlich CEACAM1. Ein vergleichbares Expressionsprofil zeigt, dass auch der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper mAb C5-1X gleichermaßen ausschließlich CEACAM1 erkennt (Daten nicht gezeigt);
6 eine Westernblot-Analyse zur Erkennung des erfindungsgemäßen Antikörpers mAb B3. Gelelektrophoretisch aufgetrenntes CEACAM1 (linke Spur) und CEACAM1-deltaN (rechte Spur) wurden auf Nitrocellulose geblottet und anschließend mit dem erfindungsgemäßen Antikörper mAb B3 entwickelt. Da jeweils eine Antigenerkennung erfolgt, kann geschlossen werden, dass mAb B3 nicht oder zumindest im Wesentlichen nicht an die N-Domäne von CEACAM1 bindet. Ein vergleichbares Profil zeigt auch der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper mAb C5-1X (Daten nicht gezeigt);
7 ein Sandwich-ELISA zur Charakterisierung von CEACAM1. Verschiedene CEACAM-Antigene werden auf einer ELISA-Platte immobilisiert und anschließend mit dem erfindungsgemäßen Antikörper mAb C5-1X inkubiert. Der gebundene Antikörper wird durch einen anti-Maus-HRP-Antikörper markiert und mit Hilfe eines Enzymsubstrats (DNBS) entwickelt. Die Absorption wurde gemessen. Je höher die Absorption, desto besser bindet der Antikörper an das jeweilige Antigen. Ein vergleichbares Expressionsprofil zeigt auch der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper mAb B3 (Daten nicht gezeigt);
8 ein Sandwich-ELISA zur Charakterisierung von CEACAM1-Antikörperbindungen. Verschiedene CEACAM1-Antigene aus Mensch, Ratte und Maus werden auf einer ELISA-Platte immobilisiert. Anschließend wird getestet, welcher der verwendeten Antikörper ein positives Signal liefert. Als positive Kontrolle werden jeweils Antikörper verwendet, die in bekannter Weise die jeweiligen CEACAM1-Antigene binden (#18/20 für humanes CEACAM1, Be9.2 für Ratten-CEACAM1 und Anti-CC1 für Maus-CEACAM1). Sowohl der erfindungsgemäße Antikörper mAb B3 als auch der erfindungsgemäße Antikörper C5-1X binden die beiden humanen Varianten CEACAM1-4 und CEACAM1-3. Folglich liegt die Bindungsdomäne im A1B1-Bereich von CEACAM1, jedoch nicht in der A2-Domäne von CEACAM1, welche in CEACAM1-3 nämlich nicht vorhanden ist. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass sowohl der erfindungsgemäße Antiköper mAb B3 als auch der erfindungsgemäße Antikörper C5-1X nicht mit CEACAM1 der Maus und der Ratte interagieren;
9 eine durchflusszytometrische Analyse der Bindung der erfindungsgemäßen Antikörper mAb B3 und C5-1X sowie des Antikörpers des Standes der Technik 4D1D2. Um die Bindung der verschiedenen Antikörper an das native, d. h. natürlicherweise auf Zellen exprimierte Protein zu charakterisieren, werden CEACAM1-exprimierende Zellen mit den entsprechenden Antikörpern markiert und mit einem FITC-gekoppelten anti-Maus-Antikörper markiert. Die Expressionsanalyse zeigt, dass im Gegensatz zu dem Antikörper 4D1C2 sowohl mAb B3 als auch mAb C51X an das native humane CEACAM1 binden.
Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne dass er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verlässt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken sollen.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE:
Methoden:
1. Herstellung monoklonaler Anti-huCEACAM1-Antikörper:
Zur Herstellung erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper, die gegen humanes CEACAM1 – aber ausdrücklich nicht gegen dessen N-Domäne gerichtet sind – werden zunächst DNA-Konstrukte generiert, die für ein chimäres CEACAM1-ΔN-Fc-Fusionsprotein (= humanes CEACAM1 ohne N-Domäne in Fusion mit dem Fc-Teil einer humanen IgG-gamma-Kette, im Folgenden auch als huCC1ΔN-Fc bezeichnet) kodieren.
Dazu werden zunächst ausgehend von den entsprechenden cDNA-Sequenzen mit Hilfe spezifischer Oligonukleotide (vgl. Tabelle 1) die entsprechenden DNA-Fragmente mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifiziert. Die Herstellung der chimären huCC1ΔN-Fc-DNA-Konstrukte erfolgt über eine Triele-Ligation der amplifizierten DNA-Fragmente. Dabei werden eine HindIII/PstI restringierte, für ein Ratten-Signalpeptid kodierende Sequenz sowie das SdaI/EcoRI restringierte huCC1ΔN-Amplifikat in den HindIII/EcoRI-restringierten Expressionsvektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert. In einem darauf folgenden Klonierungsschritt wird die Sequenz des Fc-Anteils über die EcoRI/XhoI Restriktionsschnittstellen an huCC1ΔN ligiert. Die Sequenzen und Leserahmen werden mittels Sequenzierung bestätigt.
Die rekombinanten Plasmide werden zum Zweck der Antigen-Expression stabil in HEK23-Zellen transfiziert. Durch das Ratten-Signal-Peptid wird dabei die Sezernierung der chimären Proteine in das Medium ermöglicht. Die löslichen huCC1ΔN-Fc-Proteine, bestehend aus dem Fc-Teil einer humanen IgG-gamma-Kette sowie dem humanen CEACAM1 mit vollständig trunkierter N-Domäne, akkumulieren dabei über einen Zeitraum von 10 Tagen im Serumfreien Pro293s-CDM-Medium (BioWhittaker, Walkersville, MD).
Die anschließende Aufreinigung der Proteine wird mittels Protein G-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie durchgeführt. Die Reinheit der aufgereinigten huCC1ΔN-Fc-Proteine wird im Western Blot mit Detektion der Proteine durch Silberfärbung getestet. Der Reinheitsgrad der aufgereinigten huCC1ΔN-Fc-Proteine liegt bei mindestens 95%.

Zur Generierung bzw. Herstellung erfindungsgemäßer monoklonaler Anti-huCEACAM1-Antikörper, die ausdrücklich nicht mit der N-Domäne von CEACAM1 interagieren, werden die aufgereinigten huCC1ΔN-Fc-Proteine als Antigene zur Immunisierung einer Balb/c-Maus verwendet. Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt mit Hilfe der denn Fachmann wohlbekannten Hybridom-Technik. Tabelle 1: Liste der verwendeten Primer

Gen (Acc. number)	Klon	Form	Bezeichnung Primer	Sequenz in 5'→3'-Richtung
huCC1ΔN (X16354)	88/1	Dimer	huCEACAM1-deltaN fw	5'-aagcttgagctgcccaagccctccatctcc-3'
			huCEACAM1-deltaN bw	5'-gaattcaggtgagaggccattttcttg-3'
human Fc (BC014258)	38/1	Dimer	human Fc fw	5'-gaattcatggagcccaaatcttgtgacaaaac-3'
			human Fc bw	5'-ctcgagtcatttacccggagacagggagaggc-3'

2. Sandwich-ELISA zur Charakterisierung der monoklonalen Antikörper:
Zur Charakterisierung der Spezifität monoklonaler Antikörper werden Immuno96-Microwell^TM-Maxi Sorp^TM-Platten (Thermo Elektron LED GmbH, Langenselbold, Deutschland) mit 0,5 μg/Well in PBS-verdünnten Anti-Human-CEA-Antikörpern aus Kaninchen (Dako, Glostrup, Dänemark) beschichtet und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS werden freie Bindestellen auf den Well-Platten mit 3% (w/v) BSA in PBS 1 Stunde lang geblockt. Die Zelllysate von HeLa-Wildtyp, HeLa-CEACAM1-4, HeLa-CEACAM1-3, Balb/c-CEACAM4, HeLa-CEACAM5, HeLa-CEACAM6, HeLa-CEACAM7 und HeLa-CEACAM8 werden in R1-PA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% Natriumdeoxycholat) unter Zugabe des Protease-Inhibitor-Cocktail Set III (Merck, Darmstadt, Deutschland) hergestellt. Zelllysate bzw. die CEACAM1-ΔN-Fc Proteine werden in PBS mit 1% (w/v) BSA verdünnt. Die Well-Platten werden mit 100 μl/Well der verdünnten Probe über Nacht bei 4°C inkubiert. Auf die Inkubationszeit folgen drei Waschschritte mit Waschpuffer (PBS mit 0,05% (v/v) Tween-20). Anschließend erfolgt eine 4-stündige Inkubationszeit mit denn zu charakterisierenden Antikörper bei Raumtemperatur, wobei 1 μg/100 μl/Well von mAb C5-1X bzw. des entsprechenden Kontrollantikörpers, verdünnt in PBS mit 1% (w/v) BSA, eingesetzt werden. Für HeLa-CEACAM1-4, HeLa-CEACAM1-3, HeLa-CEACAM3 und HeLa-CEACAM5 wird mAb 118/20 (Slevogt et al., 2008) verwendet. Für HeLa-CEACAM6 wird mAb 9A6 (Genovac, Freiburg, Deutschland), für HeLa-CEACAM8 mAb 80H3 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), für HeLa-CEACAM7 mAb BAC2 (Genovac, Freiburg, Deutschland), für Balb/c-CEACAM4 mAB D14HD11 (Genovac, Freiburg, Deutschland) und für CEACAM1-ΔN-Fc mAB 4D1C2 verwendet. Die Platten werden 4-Mal gewaschen und 1 Stunde lang mit Horse-Radish-Peroxidase-konjugierten Anti-Maus-AffiniPure F(ab')₂-Fragmenten aus Ziege (Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Groß-Britannien) inkubiert. Nach vollendeter Inkubationszeit wird die Platte gewaschen; danach erfolgt die Enzymreaktion zur Visualisierung der gebundenen Antikörper durch Zugabe von 150 μl des HRP-Substrats Tetramethylbenzidin (Signa-Aldrich, Hamburg, Deutschland). Nach 30 Minuten wird die Enzymreaktion durch Addition von 20 μl 2 M H₂SO₄ gestoppt. Die Absorption des bei der Enzymreaktion gebildeten Produkts wird bei 450 nm im Sunrise-ELISA-Reader (Tecan, Crailsheim, Deutschland) detektiert. Die Messung der Proben wird in dreifacher Bestimmung durchgeführt.
3. Immunoblot-Analyse zur Analyse der Spezifität der monoklonalen Anti körper:
Zunächst werden Proteinproben mit 10 ng/Spur CEACAM1-Fc oder CEACAM1-ΔN-Fc mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend erfolgt durch Blotting der Transfer der Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Zur Detektion der Antigene CEACAM1-Fc beziehungsweise CEACAM1-ΔN-Fc werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mAb B3 und C5-1X eingesetzt. Nach der erforderlichen Inkubationszeit wird der HRP-konjugierte sekundäre Antikörper (Jackson ImmunoResearch, Suffolk, Groß-Britannien) zugefügt. Anschließend werden die Membranen gewaschen. Die Visualisierung der gebundenen Antikörper erfolgt durch eine Chemilumineszenzreaktion, welche mit Hilfe einer Fujifilm-LAS-3000 min Geldokumentationsanlage detektiert wird.
Die Auswertung erfolgt mittels der LAS3000ImageQuant-Software und der ImageGauge-Software (Fuji, Düsseldorf, Deutschland).
4. Durchflusszytometrie zur Analyse der Bindungseigenschaften der monoklonalen Antikörper:
HeLa-Zellen und die mit verschiedenen CEACAMs transfizierten HeLa-Zellen werden 1 Stunde lang mit verschiedenen monoklonalen Antikörpern (20 μg/ml, verdünnt in 3% FCS/PBS) auf Eis inkubiert. Anschließend werden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen und mit FITC-konjugiertem Anti-Maus F(ab')₂ inkubiert. Die Hintergrund-Fluoreszenz wird unter Verwendung eines Isotyp-spezifischen Immunglobulins bestimmt. Die gefärbten Zellproben werden im FACScalibur Durchflusszytometer (BD Biosciences, San Diego, USA) untersucht. Zur Datenauswertung wird die Software CellQuest verwendet. Tote Zellen, identifiziert durch PI-Färbung, werden von der Bestimmung ausgeschlossen.
In Bezug auf weitere Ausführungsbeispiele sowie für weitere Ausführungen zu den erfindungsgemäßen Ausführungsbeispielen kann auf die Figuren, insbesondere 4 bis 9, sowie auf die diesbezüglichen Figurenbeschreibungen verwiesen werden.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2009/141679 A2 [0022]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

http://www.carcino-embryonic-antigen.de/534676973c0950b01/index.html [0017]
Beauchemin N., ”Redefined Nomenclature for Members of the Carcinoembryonic Antigen Family.”, W. Exp. Cell Res., 1999, Nov 1, 252 (2): 243–249 [0017]
http://www.carcinoembryonicantigen.de/534676973c0950b01/534676973f0f1b909.html [0019]
Tilki et al.: ”CEACAM1: A Novel Urinary Marker for Bladder Cancer Detection.”, Eur. Urol., 28. Mai 2009 [0025]
Slevogt et al., 2008 [0134]

Claims

Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, wobei der Antikörper selektiv und/oder spezifisch mit mindestens einem CEACAM1-Protein zu interagieren, insbesondere hieran zu binden, imstande ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion, insbesondere Bindung, des Antikörpers im Bereich einer A-Domäne und/oder im Bereich einer B-Domäne des CEACAM1-Proteins, insbesondere an einer A-Domäne und/oder an einer B-Domäne des CEACAM1-Proteins, erfolgt und/oder dass die Interaktion, insbesondere Bindung, des Antikörpers nicht an einer N-Domäne des CEACAM1-Proteins erfolgt.
Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei denn CEACAM1-Protein um ein humanes CEACAM1-Protein handelt und/oder dass es sich bei dem CEACAM1-Protein um ein natives CEACAM1-Protein handelt und/oder dass es sich bei dem CEACAM1-Protein um eine Isoform, insbesondere Splicevariante, handelt und/oder dass es sich bei dem CEACAM1-Protein um ein trunkiertes CEACAM1-Protein, insbesondere um ein am N-terminalen Ende trunkiertes CEACAM1-Protein, handelt und/oder dass es sich bei dem CEACAM1-Protein um ein trunkiertes CEACAM1-Protein mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, handelt und/oder dass es sich bei der A-Domäne des CEACAM1-Proteins um eine A1-Domäne handelt und/oder dass es sich bei der B-Domäne des CEACAM1-Proteins um eine B1-Domäne handelt und/oder dass die A-Domäne, insbesondere die Al-Domäne, in einem Proteinabschnitt des CEACAM1-Proteins angeordnet ist und/oder diesen bildet, wobei der Proteinabschnitt die Aminosäuresequenz von Position 158 bis 234 umfasst, vorzugsweise hieraus besteht, bezogen auf das vollständige CEACAM1-Protein und beginnend in der Zählweise am N-terminalen Ende des Proteins, und/oder dass die B-Domäne, insbesondere die B1-Domäne, in einem Proteinabschnitt des CEACAM1-Proteins angeordnet ist und/oder diesen bildet, wobei der Proteinabschnitt die Aminosäuresequenz von Position 250 bis 306 umfasst, vorzugsweise hieraus besteht, bezogen auf das vollständige CEACAM1-Protein und beginnend in der Zählweise am N-terminalen Ende des Proteins, und/oder dass der Antikörper murinen Ursprungs ist und/oder dass der Antikörper von Hybridomzellen produziert ist, wobei die Hybridomzellen aus der Fusion von (a) Zellen einer immortalisierten Zelllinie, vorzugsweise Myelomzellen, mit (b) den Antikörper produzierenden Immunzellen, insbesondere Splenozyten, vorzugsweise Lymphozyten, bevorzugt B-Lymphozyten, stammen, wobei die Antikörper-produzierenden Immunzellen aus (Versuchs-)Tieren, insbesondere Mäusen, vorzugsweise Balb/c-Mäusen, isoliert sind, wobei die (Versuchs-)Tiere zuvor mit einem Immunogen auf Basis eines am N-terminalen Ende trunkierten CEACAM1-Proteins, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, behandelt und/oder immunisiert sind.
Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, vorzugsweise nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper die Bezeichnung mAb B3 aufweist und/oder dass der Antikörper von einer Zellkultur, insbesondere von Hybridomzellen, produziert und/oder freigesetzt wird, welche unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3051 und mit dem Hinterlegungsdatum 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt ist bzw. sind.
Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, vorzugsweise nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper die Bezeichnung mAb C5-1X aufweist und/oder dass der Antikörper von einer Zellkultur, insbesondere von Hybridomzellen, produziert und/oder freigesetzt wird, welche unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3052 und mit dem Hinterlegungsdatum 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt ist bzw. sind.
Antikörper-produzierende und/oder Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper-produzierenden und/oder Antikörper-freisetzenden Zellen einen in den Ansprüchen 1 bis 4 definierten Antikörper zu produzieren und/oder freizusetzen imstande sind.
Antikörper-produzierende und/oder Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper-produzierenden und/oder Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, einen Antikörper mit der Bezeichnung mAb B3 zu produzieren und/oder freizusetzen imstande sind und/oder dass die Antikörper-produzierenden und/oder Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3051 und mit dem Hinterlegungsdatum 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt sind.
Antikörper-produzierende und/oder Antikörper-freisetzende Zellen, insbesondere Hybridomzellen, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper-produzierenden und/oder Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, einen Antikörper mit der Bezeichnung mAb C5-1X zu produzieren und/oder freizusetzen imstande sind und/oder dass die Antikörper-produzierenden und/oder Antikörper-freisetzenden Zellen, insbesondere Hybridomzellen, unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC3052 und mit dem Hinterlegungsdatum 24. März 2010 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) nach Maßgabe des Budapester Vertrags hinterlegt sind.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, insbesondere Hybridomzellen, welche einen in den Ansprüchen 1 bis 4 definierten Antikörper zu produzieren und/oder freizusetzen imstande sind, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellung eines Immunogens und/oder Antigens auf Basis eines am N-terminalen Ende trunkierten CEACAM1-Proteins, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne; (b) Behandlung und/oder Immunisierung eines Tieres, insbesondere einer Maus, vorzugsweise einer Balb/c-Maus mit dem in Schritt (a) bereitgestellten Immunogen und/oder Antigen; (c) Gewinnung und/oder Isolierung von den Antikörper produzierenden Immunzellen, insbesondere Splenocyten, vorzugsweise Lymphozyten, bevorzugt B-Lymphozyten, des in Schritt (b) behandelten und/oder immunisierten Tieres; (d) Verschmelzung und/oder Fusionierung der in Schritt (c) gewonnenen Immunzellen mit Zellen einer immortalisierten Zelllinie, vorzugsweise Myelomzellen, zu Hybridomzellen; (e) gegebenenfalls Vermehrung, insbesondere Klonierung, der in Schritt (d) gewonnenen Hybridomzellen.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur spezifischen und/oder selektiven Bestimmung und/oder Detektion eines CEACAM1-Proteins insbesondere in einer Probe.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur spezifischen und/oder selektiven Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, insbesondere in einer Probe und/oder zur Ermittlung eines Verhältnisses eines (1) trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, einerseits zu einem (2) CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits insbesondere in einer Probe.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Diagnose und/oder Prognose von insbesondere in Verbindung mit dem Vorhandensein eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, und/oder zur Diagnose und/oder Prognose von in Verbindung mit einer Veränderung des Gehaltes und/oder der Menge eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, stehenden Erkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, insbesondere wobei das Vorhandensein und/oder der Gehalt des trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, in einer Probe bestimmt wird.
Verwendung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
Verwendung eines Verhältnisses eines (1) trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, einerseits zu einem (2) CEACAM1-Protein mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits in einer biologischen Probe zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
Verwendung eines trunkierten und/oder inaktivierten Adhäsionsmoleküls, insbesondere Adhäsionsproteins, insbesondere mit zumindest teilweise fehlender Adhäsionsdomäne und/oder insbesondere mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender Adhäsionsdomäne und/oder vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
Verwendung eines Verhältnisses eines (1) trunkierten und/oder inaktivierten Adhäsionsmoleküls, insbesondere Adhäsionsproteins, insbesondere mit zumindest teilweise fehlender Adhäsionsdomäne und/oder insbesondere mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender Adhäsionsdomäne und/oder vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, einerseits zu einem (2) insbesondere aktiven und/oder zumindest im Wesentlichen nicht trunkierten Adhäsionsmolekül derselben Art, insbesondere Adhäsionsprotein derselben Art, mit zumindest im Wesentlichen vollständiger Adhäsionsdomäne und/oder mit zumindest im Wesentlichen vollständiger N-Domäne andererseits in einer biologischen Probe zur Diagnose und/oder Prognose von Krebserkrankungen, insbesondere Krebserkrankung des Urogenitaltraktes, insbesondere von Prostatakrebs und/oder Harnblasenkrebs.
Verfahren zu Detektion und/oder Bestimmung eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, in einer Probe, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellung der Probe; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, wie in den Ansprüchen 1 bis 4 definiert; (c) Feststellung und/oder Detektion einer spezifischen und/oder selektiven Bindung und/oder Wechselwirkung des Antikörpers mit dem trunkierten CEACAM1-Protein; (d) gegebenenfalls quantitative Bestimmung des Gehaltes und/oder der Menge des trunkierten CEACAM1-Proteins in der Probe insbesondere durch Korrelation der Menge und/oder des Gehaltes des trunkierten CEACAM1-Proteins mit der in Schritt (c) festgestellten und/oder detektierten Bindung und/oder Wechselwirkung.
Zusammensetzung, enthaltend mindestens einen in den Ansprüchen 1 bis 4 definierten Antikörper.
Kit, insbesondere zur spezifischen und/oder selektiven Bestimmung und/oder Detektion eines CEACAM1-Proteins, insbesondere eines trunkierten CEACAM1-Proteins mit zumindest teilweise fehlender N-Domäne, vorzugsweise mit zumindest im Wesentlichen vollständig fehlender N-Domäne, in einer Probe, wobei das Kit einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 17 enthält.