DE102010012580A1 - Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device - Google Patents

Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device Download PDF

Info

Publication number
DE102010012580A1
DE102010012580A1 DE102010012580A DE102010012580A DE102010012580A1 DE 102010012580 A1 DE102010012580 A1 DE 102010012580A1 DE 102010012580 A DE102010012580 A DE 102010012580A DE 102010012580 A DE102010012580 A DE 102010012580A DE 102010012580 A1 DE102010012580 A1 DE 102010012580A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cells
flow
cell
detector
time
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE102010012580A
Other languages
German (de)
Inventor
Andreas Joschko
Heinz Hess
Dr. Klauth Peter
Prof. Dr. Büddefeld Jürgen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hochschule Niederrhein
Original Assignee
Hochschule Niederrhein
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hochschule Niederrhein filed Critical Hochschule Niederrhein
Priority to DE102010012580A priority Critical patent/DE102010012580A1/en
Publication of DE102010012580A1 publication Critical patent/DE102010012580A1/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers
    • G01N15/1434—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers using an analyser being characterised by its optical arrangement

Abstract

The device has light sources e.g. hydrargyrum quartz iodide (HQI) lamps, provided with focal spots, where particle and/or cell current (9) with constant flow rate are introduced into a flow cell (8). A detector (18) is provided with a measuring point, where time resolution for measurement of fluorescence signals is producible in accordance with a relationship. The measuring point of the detector comprises local displacements relative to the focal spots of the light sources, where the local displacements are changed during operation of the device. An independent claim is also included for a method for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of cells and/or particles.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur zeitaufgelösten Messung von Fluoreszenzsignalen in der Durchflusszytometrie. Insbesondere betrifft die Anmeldung eine Vorrichtung zur zeitaufgelösten Messung von Fluoreszenzsignalen in durchflusszytometrischen Untersuchung von Zellen und/oder Partikeln, welche mit einem mittels elektromagnetischer Strahlung anregbaren Marker markiert sind, wobei die zeitliche Diskriminierung von Fluoreszenzsignalen durch einen örtlichen Versatz zwischen Anregungspunkt und Detektionspunkt dargestellt wird. Der örtliche Versatz ist im Betrieb der Vorrichtung änderbar.The present invention relates to a device and a method for the time-resolved measurement of fluorescence signals in flow cytometry. In particular, the application relates to a device for the time-resolved measurement of fluorescence signals in flow cytometric analysis of cells and / or particles which are marked with an excitable by electromagnetic radiation marker, the temporal discrimination of fluorescence signals is represented by a local offset between the excitation point and detection point. The local offset is changeable during operation of the device.

Die Durchflusszytometrie ist ein Verfahren zur Analyse der optischen Eigenschaften einzelner Partikel oder Zellen. Die einfachste Definition von Durchflusszytometrie ist die Detektion, Messung und Analyse von Signalen, die von einzelnen Zellen oder anderen Partikeln erhalten werden, wenn sie in einem Flüssigkeitsstrom, als einzelne Zellen oder Partikel in einzelnen Tropfen, durch einen Lichtstrahl treten. Die Durchflusszytometrie erlaubt es, gleichzeitig mehrere physikalische optische Parameter einer einzelnen Zelle oder eines Partikel in größeren Zell- oder Partikelpopulationen qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Hierbei misst ein Durchflusszytometer wie Zellen oder Partikel das Licht absorbieren, reflektieren und ob und wenn welche Fluoreszenz sie emittieren. Diese Daten können dann für jede einzelne Zelle oder jedes einzelne Partikel gespeichert und analysiert werden. Die Durchflusszytometrie erlaubt es, die relative Größe und optische Dichte einer Zelle oder eines Partikel zu berechnen. Durch Markierung von Zellen oder Partikeln mit fluoreszenten Markern, wie z. B. Nukleinsäurefarbstoffe, Gensonden, physiologische Farbstoffe wie Substratanaloga, immunologische Reagenzien wie z. B. Antikörper, ist es möglich, Zellen und Partikel mit unterschiedlichen Intensitäten der Anfärbung zu unterscheiden. Auch ist es möglich, die Expression bestimmter Biomoleküle auf und/oder in einer Zelle hierdurch nachzuweisen.Flow cytometry is a method of analyzing the optical properties of individual particles or cells. The simplest definition of flow cytometry is the detection, measurement, and analysis of signals received from single cells or other particles as they pass through a beam of light as single cells or particles in individual drops. Flow cytometry allows the simultaneous qualitative and quantitative determination of several physical optical parameters of a single cell or particle in larger cell or particle populations. Here, a flow cytometer measures how cells or particles absorb, reflect, and if and what fluorescence they emit. These data can then be stored and analyzed for each individual cell or particle. Flow cytometry allows the relative size and optical density of a cell or particle to be calculated. By labeling cells or particles with fluorescent markers, such. As nucleic acid dyes, gene probes, physiological dyes such as substrate analogues, immunological reagents such. As antibodies, it is possible to distinguish cells and particles with different intensities of staining. It is also possible to detect the expression of certain biomolecules on and / or in a cell thereby.

Als sehr vielfältig geeignete Fluoreszenzfarbstoffe haben sich dabei beispielsweise solche Organometallkomplexe von Elementen der seltenen Erden gezeigt, wie sie in der deutschen Offenlegungsschrift DE 10 2008 033 871 A1 beschrieben werden. Hierbei hat sich herausgestellt, dass die beschriebenen Komplexe eine um mehr als den Faktor 100 gegenüber der Autofluoreszenz von Zellen oder Partikeln verlängerte Strahlungsdauer der Emission bei einer Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge zeigen.In this case, for example, such organometallic complexes of rare earth elements have proven to be very versatile fluorescent dyes, as described in German Offenlegungsschrift DE 10 2008 033 871 A1 to be discribed. It has been found that the described complexes exhibit a radiation duration of the emission which is prolonged by more than a factor of 100 compared to the autofluorescence of cells or particles when excited with light of suitable wavelength.

Diese Komplexe bieten sich daher aufgrund ihrer langen Strahlungsdauer im ms-Bereich an, zeitaufgelöste Analysen durchzuführen. Hierdurch ist es möglich, störende Hintergrundemissionen, wie sie beispielsweise durch die kurzlebige Autofluoreszenz der Probe im ns- bis μs-Bereich auftreten, aufzublenden und dadurch eine höhere Auflösung bzw. Analysegenauigkeit zu erhalten.Due to their long radiation duration in the ms range, these complexes therefore offer time-resolved analyzes. This makes it possible, aufzublenden disturbing background emissions, as they occur for example by the short-lived autofluorescence of the sample in the ns to μs range, and thereby obtain a higher resolution or analysis accuracy.

Durchflusszytometer, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, bieten nicht die Möglichkeit einer entsprechend zeitaufgelösten Analyse einzelner Zellen oder Partikel, wie sie bei der Verwendung der zuvor genannten Fluoreszenzmarker mit langen Strahlungsdauer wünschenswert ist.Flow cytometers, as known in the art, do not offer the possibility of a correspondingly time-resolved analysis of individual cells or particles, as is desirable in the use of the aforementioned long-term fluorescent markers.

Dies berücksichtigend ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Durchflusszytometer anzugeben, mit welchem eine zeitaufgelöste Analyse der Strahlungsdauer und/oder des Abklingverhaltens der Emission einzelner Zellen oder Partikel ermöglicht wird. Des Weiteren ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein entsprechendes Verfahren zur zeitaufgelösten Durchflusszytometrie anzugeben.Taking this into account, it is the object of the present invention to provide a flow cytometer with which a time-resolved analysis of the radiation duration and / or the decay behavior of the emission of individual cells or particles is made possible. Furthermore, it is the object of the present invention to provide a corresponding method for time-resolved flow cytometry.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Vorrichtung gemäß Anspruch 1 sowie ein Verfahren zur zeitaufgelösten Untersuchung von Partikeln und/oder Zellen gemäß Anspruch 8.This object is achieved by a device according to claim 1 and a method for the time-resolved examination of particles and / or cells according to claim 8.

Es wird somit eine Vorrichtung zur zeitaufgelösten Messung von Fluorszenzsignalen in der Durchflusszytometrie vorgeschlagen, umfassend eine Durchflusszelle, in welcher ein Partikel- oder Zellstrom mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit v einleitbar ist, wobei die Zellen oder Partikel im Wesentlichen nacheinander und voneinander unabhängig transportiert werden, einer Anregungslichtquelle mit einem Brennpunkt im Partikel- bzw. Zellstrom und wenigstens einer Detektoreinheit mit einem Messpunkt im Partikel- bzw. Zellstrom, wobei die Zeitauflösung gemäß dem Zusammenhang T = s/v dadurch herstellbar ist, dass der Messpunkt der wenigstens einen Detektoreinheit relativ zum Brennpunkt der Anregungslichtquelle einen örtlichen Versatz s aufweist, wobei die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet ist, dass der örtliche Versatz s im Betrieb der Vorrichtung änderbar ist.Thus, an apparatus for the time-resolved measurement of fluorescence signals in flow cytometry is proposed, comprising a flow cell in which a particle or cell stream with constant flow velocity v can be introduced, wherein the cells or particles are transported substantially successively and independently of each other, an excitation light source a focal point in the particle or cell stream and at least one detector unit with a measuring point in the particle or cell stream, wherein the time resolution according to the relationship T = s / v can be produced by the measuring point of the at least one detector unit relative to the focal point of the excitation light source local offset s, wherein the device is characterized in that the local offset s in the operation of the device is changeable.

Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ist es möglich, den Brennpunkt der Anregungslichtquelle und den Messpunkt zur Detektion der durch die Anregungslichtquelle induzierten Emission derart voneinander zu trennen, dass eine Messung der Emission in der Weise erfolgen kann, dass etwaige Störungen, wie sie durch die Eigenemission der Zellen oder Partikel oder durch etwaige Streustrahlung hervorgerufen werden, in der Weise ausgeblendet werden können, dass eine deutlich höhere Messgenauigkeit und Auflösung der Emissionsmessung bzw. Fluoreszenzmessung erfolgen kann. Hierbei kann durch die Veränderung des örtlichen Versatzes s im Betrieb eine gezielte Anpassung der Zeitauflösung an die zu untersuchenden Partikel oder Zellen erfolgen.By means of the device according to the invention, it is possible to separate the focal point of the excitation light source and the measuring point for the detection of the emission induced by the excitation light source such that a measurement of the emission can take place in such a way that any disturbances, such as the self-emission of the cells or particles or caused by any scattered radiation can be hidden in such a way that a significantly higher accuracy and resolution of the emission measurement or fluorescence measurement can be done. This can be done by changing the local offset s in operation a targeted adaptation of the time resolution of the particles or cells to be examined done.

Kerngedanke der vorliegenden Erfindung ist eine Messzelle, in welcher Anregungsort und Messort der Fluoreszenz örtlich voneinander in einstellbarer Weise getrennt sind, um eine Auflösung der Fluoreszenzmessung hinsichtlich der Zeit zu erreichen.The central idea of the present invention is a measuring cell in which excitation locus and location of the fluorescence are spatially separated from each other in an adjustable manner in order to achieve a resolution of the fluorescence measurement with respect to time.

In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist diese eine Mehrzahl von Detektoreinheiten auf, die linear parallel zum Partikelstrom an der Durchflussmesszelle beabstandet zum Brennpunkt der Anregungslichtquelle angeordnet sind, so dass die Änderung des Versatzes s im Betrieb durch aufeinander folgende Abfrage einzelner Detektoreinheiten vornehmbar ist.In one embodiment of the device according to the invention, this has a plurality of detector units, which are arranged linearly parallel to the particle flow at the flow measuring cell spaced from the focal point of the excitation light source, so that the change of the offset s in operation by successive query individual detector units vornehmbar.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die Änderung des Versatzes s dadurch vornehmbar, dass der Messpunkt eines Detektors mittels eines Stellantriebes in Form eines Linearantriebes und/oder einer Kipp- oder Drehvorrichtung wie beispielsweise einer Spiegelvorrichtung veränderbar ist. Mittels eine Linearantriebes kann ein Detektor entlang der Durchflusszelle bzw. des Partikel- und/oder Zellstromes verschoben werden, um so den Versatz s einzustellen. Geeignete Kippspiegel können beispielsweise Piezokippspiegel, bei denen die Ausrichtung einer Spiegelfläche mittels Piezokeramiken erfolgt, Digital Micromirror Devices (DMD), wie sie beispielsweise in DLP-Projektoren zum Einsatz gelangen, oder Grating Light Valves, bei welchen ein Lichtstrahl an einem optischen Gitter abgelenkt wird, sein.In a further embodiment of the invention, the change in the offset s is vornehmbar that the measuring point of a detector by means of an actuator in the form of a linear drive and / or a tilting or rotating device such as a mirror device is changeable. By means of a linear drive, a detector along the flow cell or the particle and / or cell flow can be moved so as to adjust the offset s. Suitable tilting mirrors can be, for example, piezocopying mirrors, in which the alignment of a mirror surface takes place by means of piezoceramics, digital micromirror devices (DMD), as used, for example, in DLP projectors, or grating light valves, in which a light beam is deflected at an optical grating. be.

Durch die Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Mehrzahl aufeinander folgender Detektoreinheiten und/oder geeigneter Spiegelvorrichtungen ist es möglich, einzelne Partikel oder Zellen im Partikel-/Zellstrom zu verfolgen und so das Abklingverhalten der durch die Anregungslichtquelle angeregten Fluoreszenz zu beobachten.By configuring the device according to the invention with a plurality of successive detector units and / or suitable mirror devices, it is possible to track individual particles or cells in the particle / cell flow and thus observe the decay behavior of the fluorescence excited by the excitation light source.

In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Detektoreinheit eine Avalanche-Diode oder ein Array von Avalanche-Dioden, insbesondere ein lineares Array, auf. Solche Arrays sind auch als Multi-Pixel-Photon-Counter (MPPC) bekannt. Avalanche-Dioden nutzen den sogenannten Avalanche-Effekt aus. Beschleunigt durch eine hinreichend eingestellte äußerer Feldstärke besitzen durch das auftreffende Licht angeregten Elektronen eine so große Energie, dass sie nach einem Stoß mit einem Valanzelektron nicht nur dieses Elektronen-Lochpaar als Ladungsträger im Leitungsband verfügbar machen, sondern selbst nicht rekombinieren und weiterhin im Leitungsband verbleiben, wo sie nochmals freie Ladungsträger erzeugen können. Hierdurch wachst die Anzahl der freien Ladungsträger im Leitungsband lawinenartig und exponentiell an. Ein Vorteil bei der Verwendung von Avalanche-Dioden in den Detektoreinheiten einer erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass bereits geringe auf die Detektoreinheiten auftretende Lichtquanten zu einem gut detektierbaren Signal führen. Einzelne Avalanche-Dioden können nach dem auslösen einer Lawine (Geiger-Modus) kurze Zeit für weitere Ereignisse „blind” sein, so dass ggf. schnell aufeinander folgende Photonen nicht erkannt werden. Umgangen wird dies durch Arrays von Avalanche-Dioden, wie z. B. die die o. g MPPCs, die durch ein hohe Zahl einzelner Dioden-Pixel im Mikrometerraster die geringe Wahrscheinlichkeit von Multiphotonenereignissen, d. h. mehrere Photonen zur gleichen Zeit Am gleichen Ort, ausnutzen.In one embodiment of the device according to the invention, the detector unit has an avalanche diode or an array of avalanche diodes, in particular a linear array. Such arrays are also known as multi-pixel photon counters (MPPC). Avalanche diodes exploit the so-called avalanche effect. Accelerated by a sufficiently adjusted external field strength, electrons excited by the incident light have such a high energy that they not only make this electron hole pair available as a charge carrier in the conduction band after a collision with a valence electron, but also do not recombine and remain in the conduction band. where they can once again generate free charge carriers. As a result, the number of free charge carriers in the conduction band grows like an avalanche and exponentially. An advantage of using avalanche diodes in the detector units of a device according to the invention is that even small light quanta occurring on the detector units lead to a signal that is easily detectable. Individual avalanche diodes can be "blind" for a short time after the triggering of an avalanche (Geiger mode) for further events, so that if necessary fast consecutive photons are not recognized. This is circumvented by arrays of avalanche diodes, such as. For example, those using the o. G MPPCs, which are characterized by a high number of individual diode pixels in the micrometer grid, the low probability of multiphoton events, d. H. use several photons at the same time, in the same place.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist diese eine Kombination aus eine Kombination aus einem Avalanche-Dioden Array, wie z. B. einem Zeilendetektor, und eines Stellantriebes in Form eines Linearantriebes und/oder einer Kipp- oder Drehvorrichtung auf. Dabei kann im Fall eines starken Fluoreszenzsignals eine Detektion ausschließlich mittels des Avalanche-Dioden Arrays erfolgen, während bei einem schwachen zu detektierenden Signal das durch das Avalanche-Dioden Array detektierte Signal genutzt wird, um einen Linearantrieb und/oder ein Kipp- oder Drehvorrichtung auf das zu detektierende Signal, respektive die zu detektierende Fluoreszenz, auszurichten.In a further embodiment of the invention, this has a combination of a combination of an avalanche diode array such. B. a line detector, and an actuator in the form of a linear drive and / or a tilting or rotating device. In the case of a strong fluorescence signal, detection can take place exclusively by means of the avalanche diode array, while with a weak signal to be detected, the signal detected by the avalanche diode array is used to apply a linear drive and / or a tilting or rotating device to the signal to be detected signal, respectively, the fluorescence to be detected, to align.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird die Detektoreinheit mit einer Spannung betrieben, bei welcher sie unter die Regelungen der Kleinspannungsverordnung fällt, vorzugsweise mit einer Steuerspannung < 42 Volt. Dies ermöglicht insbesondere den Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung als mobiles Gerät.In a further embodiment of the invention, the detector unit is operated with a voltage at which it falls under the regulations of the low voltage regulation, preferably with a control voltage <42 volts. This allows in particular the use of the device according to the invention as a mobile device.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung dient als Anregungslichtquelle ein Laser. Die Verwendung eines Lasers bietet den Vorteil, einer hohen Strahlungsintensität und Kohärenz der Anregungslichtquelle. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Vorrichtung weist der als Anregungslichtquelle eingesetzte Laser eine Wellenlänge von 300 nm bis 415 nm, vorzugsweise 300 nm bis 390 nm auf.In a further embodiment of the invention serves as an excitation light source, a laser. The use of a laser offers the advantage of a high radiation intensity and coherence of the excitation light source. In a preferred embodiment of the device, the laser used as excitation light source has a wavelength of 300 nm to 415 nm, preferably 300 nm to 390 nm.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann auch eine Mehrzahl unterschiedlicher Anregungslichtquellen, wie beispielsweise Laser, vorgesehen sein, welche Licht unterschiedlicher Wellenlänge aussenden. Hierdurch ist es z. B. vorteilhafter Weise möglich, unterschiedliche Partikel oder Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern zu markieren und mit unterschiedlichen Frequenzen einer Anregungslichtquelle zu bestrahlen und so die unterschiedlichen Fluoreszenzmarker anzuregen. Dies ermöglicht eine gezieltere und genauere Detektion und Unterscheidung unterschiedlicher Zellen und/oder Partikel. So können beispielsweise bestimmte Zellen einer Probe mit klassischen Fluorophoren als Marker gekennzeichnet werden, welche ein Anregungsmaximum in einem Bereich von 405 nm besitzen, während andere Zellen der Probe mit Selten-Erd-Lumiforen, wie sie beispielsweise in der DE 10 2008 033 871 A1 beschrieben sind, markiert werden können, welche ein Anregungsmaximum in einem Bereich von 300 nm bis 390 nm besitzen.In a further embodiment of the invention, a plurality of different excitation light sources, such as lasers, for example, can be provided, which emit light of different wavelengths. This is z. B. Advantageously possible to mark different particles or cells with different fluorescent markers and to irradiate with different frequencies of an excitation light source and thus to stimulate the different fluorescent markers. This allows a more targeted and accurate detection and Differentiation of different cells and / or particles. For example, certain cells of a sample may be labeled with classical fluorophores as markers having an excitation maximum in a range of 405 nm, while other cells of the sample may be labeled with rare earth lumifors, as described, for example, in US Pat DE 10 2008 033 871 A1 can be marked, which have an excitation maximum in a range of 300 nm to 390 nm.

In einer Ausgestaltung der Erfindung weist die Vorrichtung im Strahlengang der Anregungslichtquelle, wie z. B. einer breitbandig emittierenden HQI-Lampe, zwischen Anregungslichtquelle und Brennpunkt einen Filter auf, mittels welchem die Wellenlänge des Anregungslichtes eingestellt werden kann. Hierdurch ist es möglich, die Wellenlänge des Anregungslichtes auf die Anregungswellenlänge des Fluoreszenzmarkers einzustellen.In one embodiment of the invention, the device in the beam path of the excitation light source, such. As a broadband emitting HQI lamp, between the excitation light source and focus on a filter by means of which the wavelength of the excitation light can be adjusted. This makes it possible to adjust the wavelength of the excitation light to the excitation wavelength of the fluorescent marker.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Filter im Strahlengang der Anregungslichtquelle austauschbar und/oder die Vorrichtung weist eine Mehrzahl von Filtern auf, welche durch geeignete Einrichtungen, wie z. B. Umlenkungsspiegel in den Strahlengang der Anregungslichtquelle geschaltet werden können.In an advantageous embodiment of the invention, the filter in the beam path of the excitation light source is interchangeable and / or the device has a plurality of filters, which by suitable means such. B. deflecting mirror can be switched in the beam path of the excitation light source.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist diese im Strahlengang des von der angeregten Zelle oder dem angeregten Partikel emittierten Lichtes zwischen Messpunkt und Detektoreinheit einen Filter auf. Hierdurch ist es vorteilhafter Weise möglich, etwaige Störstrahlung vor der Detektoreinheit auszublenden oder zumindest zu verringern, wodurch die Messgenauigkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erhöht werden kann. Auch hierbei kann es in einer Ausgestaltung vorgesehen sein, dass der Filter auswechselbar ist oder eine Mehrzahl von Filtern vorgesehen ist, welche durch geeignete Einrichtungen, wie z. B. Umlenkspiegel in den Strahlengang des emittierten Lichtes einkoppelbar sind. Dabei kann es auch vorgesehen sein, dass unterschiedliche Filter miteinander kombiniert werden.In a further embodiment of the invention, this has a filter between the measuring point and the detector unit in the beam path of the light emitted by the excited cell or the excited particle. As a result, it is advantageously possible to hide or at least reduce any interfering radiation in front of the detector unit, as a result of which the measuring accuracy of the device according to the invention can be increased. Again, it may be provided in one embodiment that the filter is interchangeable or a plurality of filters is provided which by suitable means such. B. deflecting mirror can be coupled into the beam path of the emitted light. It can also be provided that different filters are combined.

Neben den zuvor genannten Einrichtungen kann die erfindungsgemäße Vorrichtung darüber hinaus typische Einrichtungen eines Durchflusszytometers aufweisen, mittels welcher die Vorwärts- und Seitwärtsstreuung an der Zelle oder dem Partikel gemessen werden kann. Hierbei kann es vorgesehen sein, dass eine einzelne Lichtquelle sowohl als Anregungslichtquelle zur Anregung der Fluoreszenz, als auch als Lichtquelle zur Bestimmung der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung an der zu untersuchenden Zelle oder dem zu untersuchenden Partikel eingesetzt wird. Alternativ können unterschiedliche Lichtquellen, wie beispielsweise Laser unterschiedlicher Wellenlänge genutzt werden. Diese können beispielsweise durch geeignete optische Vorrichtungen zu einem gemeinsamen Strahlengang zusammengefasst werden.In addition to the aforementioned devices, the device according to the invention may further comprise typical flow cytometer means by which the forward and side scattering of the cell or particle can be measured. In this case, it can be provided that a single light source is used both as an excitation light source for exciting the fluorescence, and as a light source for determining the forward and side scattering on the cell or particle to be examined. Alternatively, different light sources, such as lasers of different wavelengths can be used. These can be combined, for example, by suitable optical devices to form a common beam path.

Die von der oder den Detektoreinheiten registrierten Fluoreszenzemissionen können als Messsignal an eine Einrichtung zur elektronischen Datenverarbeitung weitergeleitet werden. In dieser ist es möglich, das erhaltene Emissionssignal in geeigneter Weise zeitaufgelöst darzustellen und so Informationen über die vermessene Zelle bzw. das Partikel zu erhalten. Hierzu kann erfindungsgemäß auf geeignete bekannte Auswertesysteme für spektroskopische Vorrichtungen zurückgegriffen werden.The fluorescence emissions registered by the detector unit or units can be forwarded as a measuring signal to a device for electronic data processing. In this it is possible to represent the resulting emission signal in a time-resolved manner in a suitable manner and thus to obtain information about the measured cell or the particle. For this purpose, according to the invention, recourse may be had to suitable known evaluation systems for spectroscopic devices.

Hinsichtlich des Verfahrens wird die Aufgabe der Erfindung durch ein Verfahren gemäß Anspruch 8 gelöst. Es wird somit ein Verfahren zur zeitaufgelösten Untersuchung von Partikel und/oder Zellen mittels Durchflusszytometrie angegeben, umfassend die Schritte:

  • • Markieren der zu untersuchenden Partikel und/oder Zellen mit einem Fluoreszenzmarker;
  • • Zuführen der markierten Partikel und/oder Zellen zu einer Messzelle eines Durchflusszytometers;
  • • Anregen der markierten Partikel und/oder Zellen mittels einer geeigneten Anregungsquelle;
  • • Detektieren von physikalischen optischen Parametern der markierten Partikel und/oder Zellen, wobei die Detektion mit zeitlichem Versatz zur Anregung erfolgt,
dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Versatz zwischen Anregung und Detektion in Abhängigkeit des Strahlungsverhaltens der markierten Partikel und/oder Zellen eingestellt wird.With regard to the method, the object of the invention is achieved by a method according to claim 8. Thus, a method for time-resolved examination of particles and / or cells by flow cytometry is given, comprising the steps:
  • Marking the particles and / or cells to be examined with a fluorescence marker;
  • Feeding the labeled particles and / or cells to a measuring cell of a flow cytometer;
  • Stimulating the labeled particles and / or cells by means of a suitable excitation source;
  • Detecting physical optical parameters of the labeled particles and / or cells, the detection occurring with a time lag for the excitation,
characterized in that the time lag between excitation and detection depending on the radiation behavior of the labeled particles and / or cells is set.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es in vorteilhafter Weise möglich, Störemissionen durch Einstellung eines geeigneten örtlichen Versatzes zwischen Anregung und Detektion und der daraus resultierenden Zeitauflösung auszublenden oder zumindest zu verringern, und so die Messgenauigkeit zu erhöhen.By the method according to the invention, it is advantageously possible to hide or at least reduce interference emissions by setting a suitable local offset between excitation and detection and the resulting time resolution, and thus to increase the measurement accuracy.

In einer Ausgestaltung des Verfahrens werden die Partikel und/oder Zellen mit einem Selten-Erd-Chelatkomplex als Fluoreszenzmarker markiert. Eine herausragende Eigenschaft dieser Selten-Erd-Chelatkomplexe ist dabei ihre lange Strahlungslebensdauer nach einer Anregung. Sie liegt um den Faktor 1000 bis 1 000 000 höher als die natürliche Fluoreszenz. Hierdurch ist mittels zeitlicher Auflösung der Detektion von physikalischen optischen Parametern ein Ausblenden oder zumindest Vermindern natürlicher Störfluoreszenzen auf der Zeitdomäne möglich, wodurch störende Hintergrundstrahlung eliminiert oder zumindest vermindert werden kann.In one embodiment of the method, the particles and / or cells are labeled with a rare earth chelate complex as a fluorescent marker. An outstanding feature of these rare earth chelate complexes is their long radiation lifetime after excitation. It is higher by a factor of 1,000 to 1,000,000 than natural fluorescence. As a result, the temporal resolution of the detection of physical optical parameters makes it possible to hide or at least reduce natural interference fluorescence on the time domain, as a result of which disturbing background radiation can be eliminated or at least reduced.

Die Strahlungsdauer typischer Selten-Erd-Lumifore, wie sie beispielsweise in der DE 10 2008 033 871 A1 beschrieben sind, liegt in der Größenordnung von 10–3 Sekunden. Unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist so in vorteilhafter Weise die Trennung zwischen Anregung und Messung der physikalisch optischen Parameter möglich, ohne dass aufwändige Filter, wie beispielsweise Bandpassfilter, verwendet werden müssen. Die lange Strahlungsdauer erlaubt eine zeitlich aufgelöste Messung, mit der kurzlebige Störfluoreszenzen ausgeblendet werden können. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung durch Transformation der Zeitauflösung in eine Ortsauflösung erfolgen. Bei einer angenommenen Fluidgeschwindigkeit und einer daraus resultierenden Geschwindigkeit des Partikelstroms v = s/t wird bei bekannter Translation der Partikel in der Zeit t ein Ortsversatz um die Strecke s erhalten. Durch Anordnung eines Detektors im Abstand s zum Anregungspunkt, beispielsweise dem Brennpunkt der Anregungslichtquelle im Fluidstrom, wird somit eine Zeitauflösung t erhalten. Die Strecke s ist dabei so zu wählen, dass sie bei der gegebenen Fluidgeschwindigkeit v an die unterschiedlichen Abklingzeiten der jeweiligen Fluoreszenzmarker bzw. fluoreszierenden Systeme angepasst ist. Hieraus resultiert, dass je länger die Abklingzeit eines angeregten Komplexes ist, desto größer kann die Strecke s sein. Der Streckenversatz s kann erfindungsgemäß entweder durch Anordnung mehrerer Detektoreinheiten entlang der Wegstrecke des Partikelstromes nach Anregung erfolgen, wobei die einzelnen Detektoreinheiten nacheinander abgefragt werden können, wodurch sich zeitaufgelöste Messungen der Emission ergeben. Alternativ kann eine einzige Detektoreinheit vorgesehen sein, deren Messpunkt über einen geeigneten Spiegel entlang des Partikelstroms wandern kann und so in unterschiedlichen Abständen s zum Punkt der Anregungen Messungen der Emission vorgenommen werden können. In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung können auch mehrere Detektoreinheiten mit entsprechenden Spiegelablenkungen vorgesehen sein. The radiation duration of typical rare earth lumifors, as they are for example in the DE 10 2008 033 871 A1 are on the order of 10 -3 seconds. Using a device according to the invention and using the method according to the invention, the separation between excitation and measurement of the physically optical parameters is thus advantageously possible, without the need for complex filters, such as bandpass filters. The long radiation duration allows a time-resolved measurement, with which short-lived Störfluoreszenzen can be hidden. With the device according to the invention and the method according to the invention, a time-resolved fluorescence measurement can be carried out by transformation of the time resolution into a spatial resolution. With an assumed fluid velocity and a resulting velocity of the particle flow v = s / t, a displacement by the distance s is obtained in the time t when the particles are known to translate. By arranging a detector at a distance s from the excitation point, for example the focal point of the excitation light source in the fluid flow, a time resolution t is thus obtained. The distance s is to be chosen so that it is adapted to the different decay times of the respective fluorescence marker or fluorescent systems at the given fluid velocity v. As a result, the longer the cooldown of an excited complex, the greater the distance s can be. According to the invention, the path offset s can take place either by arranging several detector units along the path of the particle stream after excitation, wherein the individual detector units can be interrogated one after the other, resulting in time-resolved measurements of the emission. Alternatively, a single detector unit can be provided, the measuring point of which can travel along the particle stream via a suitable mirror and thus measurements of the emission can be made at different distances s to the point of the excitations. In a further embodiment of the invention, a plurality of detector units with corresponding mirror deflections can also be provided.

Entgegen des Aufbaus eines konventionellen Durchflusszytometers sind in der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Anregung und die Detektierung durch Ortsversatz voneinander getrennt und nicht mehr auf einer gemeinsamen Achse. Die Kopplung zwischen Anregungsquelle und Detektoreinheit erfolgt durch den Partikelstrom, der sich in der Durchflusszelle mit einer konstanten Fluidgeschwindigkeit bewegt.Contrary to the structure of a conventional flow cytometer, in the device according to the invention, the excitation and the detection are offset from one another by location offset and no longer on a common axis. The coupling between the excitation source and the detector unit is effected by the particle flow, which moves in the flow cell at a constant fluid velocity.

Es kann darüber hinaus vorgesehen sein, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung auch den Aufbau eines konventionellen Durchflusszytometers umfasst, bei welchem Anregung und Detektierung auf einer gemeinsamen Achse liegen. Dies erlaubt in vorteilhafter Weise die Bestimmung der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung durch die vermessenen Partikel und/oder Zellen sowie die exakte Messung der Fluoreszenz, wobei diese in zeitaufgelöster Weise erfolgen kann.In addition, it can be provided that the device according to the invention also comprises the construction of a conventional flow cytometer, in which excitation and detection lie on a common axis. This advantageously allows the determination of the forward and lateral scattering by the measured particles and / or cells as well as the exact measurement of the fluorescence, which can be done in a time-resolved manner.

Eine Aufzeichnung der Kinetik der Lichtemission kann erfindungsgemäß in ortsaufgelöster und zeitaufgelöster Weise durch Aufzeichnung einer bewegten Probe, wie beispielsweise einem Partikel oder einer Zelle in einer Durchflusszelle durch Zielverfolgung der Probe mittels optomechanischer Verfahren und/oder durch einen zeilenförmigen Multipixel-Detektor längs der Bewegungstrajektorie erfolgen. Hierdurch können auch mehrere Partikel und/oder Zellen unabhängig voneinander gleichzeitig in der Messstrecke verfolgt werden.A recording of the kinetics of the light emission according to the invention in spatially resolved and time-resolved manner by recording a moving sample, such as a particle or a cell in a flow cell by target tracking of the sample by optomechanical methods and / or by a line-shaped multipixel detector along the movement trajectory. As a result, several particles and / or cells can be tracked independently of one another simultaneously in the measuring section.

Die Auswertung der durch die Lichtemission in einer Detektoreinheit hervorgerufenen Signale kann durch deren Aufzeichnung in Kombination mit einer vorzugsweise digitalen Signalverarbeitung erfolgen. Hierbei kann auch eine Mustererkennung vorgesehen sein. Eine solche Mustererkennung kann beispielsweise mittels Operatoren zur Filterung, wie z. B. Fensterfunktionen, Auto-/Korrelation, oder Rauschunterdrückung zur Extraktion der Kinetik einzelner Partikel- und/oder Zelltrajektorien, zur Mustererkennung typischer Kinetiken der verwendeten Fluoreszenzmarker – auch unter Einbindung von Merkmalsdatenbanken –, zur Extraktion typischer milieu- und/oder matrixbeeinflusster Eigenschaften des verwendeten Fluoreszenzmarkers unter Anwendung entsprechender Algorithmen und Vergleich der erhaltenen Muster mit Daten in Datenbanken des bekannten Eigenschaftsraums erfolgen. Es lassen sich somit neben der Konzentration eines Markers in einer Probe auch Milieu- und/oder Matrixkorrekturen der gemessenen Konzentrationen berechnen. Auch ist die Ableitung milieu- und/oder matrixbedingter Prozessparameter und Steuergrößen für die Steuerung des Messprozesses, zur Prozessführung, wie z. B. Aufbereitungssprozess der Probe und/oder des Fluids und/oder zur Qualitätssicherung/Kontrolle möglich. So hat sich beispielsweise herausgestellt, dass die Abklingzeit Tau abhängig vom Milieu bzw. der Matrix ist, in welcher die Durchflusszytometrie durchgeführt wird.The evaluation of the signals caused by the light emission in a detector unit can be effected by recording them in combination with preferably digital signal processing. In this case, a pattern recognition can also be provided. Such pattern recognition, for example, by means of filtering operators, such. As window functions, auto / correlation, or noise reduction for the extraction of the kinetics of individual particle and / or cell trajectories, for pattern recognition of typical kinetics of fluorescent markers used - including the inclusion of feature databases - to extract typical milieu and / or matrix-influenced properties of the used Fluorescent marker using appropriate algorithms and comparing the obtained patterns with data in databases of the known property space done. Thus, in addition to the concentration of a marker in a sample, it is also possible to calculate environmental and / or matrix corrections of the measured concentrations. The derivative is also milieu- and / or matrix-related process parameters and control variables for the control of the measuring process, for process control, such. B. Preparation process of the sample and / or the fluid and / or for quality assurance / control possible. For example, it has been found that the cooldown Tau is dependent on the milieu or matrix in which the flow cytometry is performed.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ermöglicht diese auch den Einsatz eines Algorithmus zur exakten Bestimmung des Ortes einer Zelle und/oder eines Partikels innerhalb des Partikel/Zellstroms. Hierdurch wird eine Zielverfolgung ermöglicht. Dies erlaubt beispielsweise auch eine Selektion einzelner Partikel und/oder Zellen aus dem Partikel/Zellstrom mittels geeigneter Weichensysteme, wie z. B. FACS (fluorescence activated cell sorting), innerhalb des Partikel/Zellstroms, welche in Abhängigkeit der durch die erfindungsgemäße Vorrichtung oder das erfindungsgemäße Verfahren ermittelten Daten der Fluoreszenz gesteuert werden.In a further embodiment of the invention, this also allows the use of an algorithm for the exact determination of the location of a cell and / or a particle within the particle / cell stream. This allows for target tracking. This allows, for example, a selection of individual particles and / or cells from the particle / cell stream by means of suitable switch systems, such. B. FACS (fluorescence activated cell sorting), within the particle / cell stream, which in Depending on the determined by the inventive device or the inventive method data of fluorescence can be controlled.

So könnte die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in Kombination mit einer PCR-Anwendung eingesetzt werden, in welcher Erbsubstanz vervielfältigt wird. Durch Einsatz der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dann eine Selektion des replizierten Erbgutes anhand der durch die Durchflusszytometrie gewonnenen Daten möglich.Thus, the device according to the invention could also be used in combination with a PCR application in which genetic material is multiplied. By using the device according to the invention or the method according to the invention, it is then possible to select the replicated genetic material on the basis of the data obtained by flow cytometry.

In einer weiteren Ausgestaltung erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren die gleichzeitige Detektion von Partikel, sogenannten Beads, und markierten Zellen sowie deren Agglomeraten bei Verwendung eines einzigen Fluoreszenzfarbstoffes. Die milieu- und/oder matrixbedingten Veränderungen im Abklingverhalten der jeweiligen markierten Substrate sind zweifelsfrei voneinander unterscheidbar und ermöglichen die Quantifizierung der einzelnen Signale durch entsprechende Zeitauflösung.In a further embodiment, the device or the method according to the invention allows the simultaneous detection of particles, so-called beads, and labeled cells and their agglomerates when using a single fluorescent dye. The milieu and / or matrix-related changes in the decay behavior of the respective marked substrates are unequivocally distinguishable from each other and allow the quantification of the individual signals by appropriate time resolution.

Die Erfindung ist nachfolgend genauer anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen ausgeführt, ohne dass sich der erfindungsgemäße Gedanke jedoch auf diese Ausführungsbeispiele beschränken lässt.The invention is explained in more detail below with reference to figures and exemplary embodiments, but the idea according to the invention can not be limited to these exemplary embodiments.

1 zeigt den Aufbau eines Durchflusszytometers gemäß dem Stand der Technik. 1 shows the structure of a flow cytometer according to the prior art.

2 zeigt den Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur zeitaufgelösten Durchflusszytometrie mit einem Laser als Anregungslichtquelle. 2 shows the structure of a device according to the invention for time-resolved flow cytometry with a laser as an excitation light source.

3 zeigt den Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur zeitaufgelösten Durchflusszytometrie mit einer Breitbandlichtquelle als Anregungslichtquelle. 3 shows the structure of a device according to the invention for time-resolved flow cytometry with a broadband light source as an excitation light source.

1 zeigt den funktionellen Aufbau eines Durchflusszytometers gemäß Stand der Technik. Ein Laserstrahl 1 einer Anregungsquelle tritt in eine Durchflussküvette 2 durch welche ein Partikel- und/oder Zellstrom 3 mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit fließt. In der Achse des Lichtstrahls befindet sich ein Detektor 4, mit welchem die sogenannte Vorwärtsstreuung der durch die Durchflussküvette fließenden Zellen und/oder Partikel detektiert wird. Das vorwärts gerichtete Streulicht ist ein Maß für die Beugung des Lichtes im flachen Winkel und hängt vom Volumen der Zelle ab. Orthogonal zum anregenden Laserstrahl 1 wird die Seitwärtsstreuung detektiert, welche ein Maß für die Brechung des Lichtes im rechten Winkel ist und Auskunft über die Oberflächenbeschaffenheit der detektierten Zelle oder des detektierten Partikels gibt. Hierzu kann das seitwärts gestreute Licht mittels entsprechender Strahlteiler, wie beispielsweise halbdurchlässige Spiegel 5 derart aufgeteilt werden, dass zum Einen eine Detektion des Seitwärtsstreulichtes durch einen Detektor 6 möglich ist, zum Anderen durch Fluoreszenz emittiertes Licht über geeignete Detektoren 7, welche in der Regel Fotomultiplyer aufweisen, detektiert werden können. Dabei können mehrere Detektoren vorgesehen werden, welche über entsprechende Strahlungsteiler gespeist werden und jeweils Licht einer bestimmten Wellenlänge detektieren. 1 shows the functional structure of a flow cytometer according to the prior art. A laser beam 1 an excitation source enters a flow cell 2 through which a particle and / or cell flow 3 flows at a constant flow rate. In the axis of the light beam is a detector 4 with which the so-called forward scattering of the cells and / or particles flowing through the flow cell is detected. The forward scattered light is a measure of the diffraction of the light at a shallow angle and depends on the volume of the cell. Orthogonal to the stimulating laser beam 1 the sideward scattering is detected, which is a measure of the refraction of the light at right angles and gives information about the surface condition of the detected cell or the detected particle. For this purpose, the light scattered sideways by means of appropriate beam splitter, such as semi-transparent mirror 5 be divided so that, on the one hand, a detection of the side scattered light by a detector 6 on the other hand by fluorescence emitted light via suitable detectors 7 , which usually photomultiplyer, can be detected. In this case, a plurality of detectors can be provided, which are fed via corresponding beam splitters and each detect light of a specific wavelength.

2 zeigt den Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur zeitaufgelösten Durchflusszytometrie mit einem Laser als Anregungslichtquelle. Eine Durchflusszelle 8 wird mit einem konstanten Partikel- und/oder Zellstrom 9 beaufschlagt, in welchem sich zu detektierende Partikel 10 befinden. Ein Laserstrahl 11, welcher beispielsweise von einem UV-Laser 12 emittiert wird, tritt durch eine optische Öffnung 13 in die Zelle 8 ein und trifft dort auf die im Partikelstrom fließenden Partikel oder Zellen 10. In der Trajektorie des Partikelstroms weist die Durchflusszelle 8 eine optische Öffnung 15 auf, über welche das durch die Fluoreszenz der angeregten Zellen und/oder Partikel emittierte Licht 16 über einen Spiegel 17 auf einen Detektor 18 gelenkt wird. Hierbei ist der Spiegel 17 verstellbar, beispielsweise durch Anwendung eines Piezo-Kippspiegels oder eines DMD. Die im Detektor 18 detektierten Messsignale werden einer Signalverarbeitung 19 zugeführt, welche darüber hinaus in Abhängigkeit des gemessenen Signals den Spiegel 17 steuern kann. Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass die Zelle 8 in der Trajektorie des Partikelstroms einen APD-Zeilenfotodetektor 21 aufweist. Durch diesen kann das Abklingverhalten der Lichtemission ermittelt und dadurch die charakteristische Abklingzeit Tau der Emission bestimmt werden. Auf Basis der gewonnenen charakteristischen Zeitinformation kann die Einstellung des Spiegels so gewählt werden, dass dieser den Detektor zum Beispiel auf den Punkt fokussiert, an welchem eine etwaig störende Autofluoreszenz bereits abgeklungen ist, aber ein Fluoreszenzmarker noch eine Fluoreszenz zeigen. 2 shows the structure of a device according to the invention for time-resolved flow cytometry with a laser as an excitation light source. A flow cell 8th comes with a constant particle and / or cell flow 9 acted in which to be detected particles 10 are located. A laser beam 11 which is for example from a UV laser 12 is emitted, passes through an optical aperture 13 into the cell 8th and there meets the particles or cells flowing in the particle stream 10 , In the trajectory of the particle flow, the flow cell points 8th an optical opening 15 on which the light emitted by the fluorescence of the excited cells and / or particles 16 over a mirror 17 on a detector 18 is steered. Here is the mirror 17 adjustable, for example by using a piezo tilting mirror or a DMD. The one in the detector 18 detected measurement signals are signal processing 19 which, in addition, depending on the measured signal, the mirror 17 can control. Furthermore, it can be provided that the cell 8th in the trajectory of the particle flow, an APD line photodetector 21 having. Through this, the decay behavior of the light emission can be determined and thereby the characteristic decay time Tau of the emission can be determined. On the basis of the obtained characteristic time information, the setting of the mirror can be selected such that it focuses the detector, for example, to the point at which any interfering autofluorescence has already subsided, but a fluorescence marker still shows fluorescence.

3 zeigt den Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur zeitaufgelösten Durchflusszytometrie mit einer Breitbandlichtquelle, wie z. B. einer HQI-Lampe als Anregungslichtquelle. Eine Durchflusszelle 8 wird mit einem konstanten Partikel- und/oder Zellstrom 9 beaufschlagt, in welchem sich zu detektierende Partikel 10 befinden. Ein Lichtstrahl 22, welcher beispielsweise von einem HQI-Lampe 23 emittiert wird, tritt durch eine optische Öffnung 13 in die Zelle 8 ein und trifft dort auf die im Partikelstrom fließenden Partikel oder Zellen 10. Dabei kann es vorgesehen sein, dass im Strahlengang des Anregungslasers 11 gegenüber der optischen Eintrittsöffnung 13 ein Parabolspiegel 14 vorgesehen ist, um eine optimale Anregung der Zellen und/oder Partikel durch die HQI-Lampe 23 zu erhalten. Hierbei ist der Parabolspiegel so eingerichtet, dass sein Brennpunkt in der Mitte des Partikelstroms liegt. In der Trajektorie des Partikelstroms weist die Durchflusszelle 8 eine optische Öffnung 15 auf, über welche das durch die Fluoreszenz der angeregten Zellen und/oder Partikel emittierte Licht 16 über einen Spiegel 17 auf einen Detektor 18 gelenkt wird. Hierbei ist der Spiegel 17 verstellbar, beispielsweise durch Anwendung eines Piezo-Kippspiegels oder eines DMD. Die im Detektor 18 detektierten Messsignale werden einer Signalverarbeitung 19 zugeführt, welche darüber hinaus in Abhängigkeit des gemessenen Signals den Spiegel 17 steuern kann. Des Weiteren kann es vorgesehen sein, dass die Zelle 8 in der Trajektorie des Partikelstroms einen APD-Zeilenfotodetektor 21 aufweist. Durch diesen kann das Abklingverhalten der Lichtemission ermittelt und dadurch die charakteristische Abklingzeit Tau der Emission bestimmt werden. Auf Basis der gewonnenen charakteristischen Zeitinformation kann die Einstellung des Spiegels so gewählt werden, dass dieser den Detektor zum Beispiel auf den Punkt fokussiert, an welchem eine etwaig störende Autofluoreszenz bereits abgeklungen ist, aber ein Fluoreszenzmarker noch eine Fluoreszenz zeigen. 3 shows the structure of a device according to the invention for time-resolved flow cytometry with a broadband light source, such. B. a HQI lamp as an excitation light source. A flow cell 8th comes with a constant particle and / or cell flow 9 acted in which to be detected particles 10 are located. A ray of light 22 which, for example, from a HQI lamp 23 is emitted, passes through an optical aperture 13 into the cell 8th and there meets the particles or cells flowing in the particle stream 10 , It may be provided that in the beam path of the excitation laser 11 opposite the optical entrance opening 13 a parabolic mirror 14 is provided to one optimal excitation of the cells and / or particles by the HQI lamp 23 to obtain. Here, the parabolic mirror is set up so that its focus is in the middle of the particle flow. In the trajectory of the particle flow, the flow cell points 8th an optical opening 15 on which the light emitted by the fluorescence of the excited cells and / or particles 16 over a mirror 17 on a detector 18 is steered. Here is the mirror 17 adjustable, for example by using a piezo tilting mirror or a DMD. The one in the detector 18 detected measurement signals are signal processing 19 which, in addition, depending on the measured signal, the mirror 17 can control. Furthermore, it can be provided that the cell 8th in the trajectory of the particle flow, an APD line photodetector 21 having. Through this, the decay behavior of the light emission can be determined and thereby the characteristic decay time Tau of the emission can be determined. On the basis of the obtained characteristic time information, the setting of the mirror can be selected such that it focuses the detector, for example, to the point at which any interfering autofluorescence has already subsided, but a fluorescence marker still shows fluorescence.

Darüber hinaus kann ein zweiter APD-Zeilenfotodetektor 24 vorgesehen sein, welcher im Geigerzählermodus betrieben werden kann. Hierdurch ist es möglich, die Emission quantitativ zu bestimmen.In addition, a second APD line photo detector 24 be provided, which can be operated in Geigerzählermodus. This makes it possible to quantify the emission.

Die Erfindung ist nachfolgend anhand eines Beispiels näher ausgeführt, wobei sich die erfindungsgemäße Idee jedoch nicht auf dieses Beispiel beschränkt.The invention is explained in more detail below by way of example, but the idea according to the invention is not limited to this example.

Beispiel 1:Example 1:

Zellen in einer Zellsuspension wurden mittels geeigneter Antikörper mit einem Eu(ttfa)3-phen-epoxy Fluoreszenzmarker markiert, dessen Abklingzeit Tau zwischen 0,575 ms und 0,945 ms betrat. Die so präparierte Zellsuspension wurde in eine erfindungsgemäße Vorrichtung eingebracht, wobei das Volumen in der Durchflusszelle 0,025 μL betrug. Mittels eines Mikroscanspiegels mit eine Spielabmessung von 3 × 3 mm und einer Schwingungsfrequenz zwischen 150 Hz und 32 kHz wurde ein Ortsversatz von 5 mm zwischen Anregung und Detektion eingestellt und das Fluoreszenzsignal der mittels eines UV-Lasers angeregten fluoreszenzmarkierten Zellen über eine Messstrecke von 10 mm detektiert. Bei einem eingestellten Volumenstrom von 5 ml/s wurden die markierten und angeregten Zellen innerhalb von 0,25 ms bis zum Beginn der Detektionsstrecke transportiert und dann für 0,5 ms detektiert. Während des Zeitraums von 0,25 ms zwischen Anregung und Beginn der Fluoreszenzdetektion sind etwaige Störfluoreszenzen, wie sie beispielsweise durch Autofluoreszenz der Zellen oder andere Fluorophore auftreten konnten soweit abgeklungen, dass während der Detektionsphase von 0,5 ms ein Störfluoreszenz freies Signal des Eu(ttfa)3-phen-epoxy Fluoreszenzmarker detektiert werden konnte. Durch Variation des Startpunktes der Detektion konnte das System dabei derart eingestellt werden, dass eine Detektion des Zielsignals erst einsetzte, als etwaige Störfluoreszenzen abgeklungen waren.Cells in a cell suspension were labeled by appropriate antibodies with an Eu (ttfa) 3 -phen-epoxy fluorescent marker, the decay time of which entered Tau between 0.575 ms and 0.945 ms. The cell suspension thus prepared was introduced into a device according to the invention, the volume in the flow cell being 0.025 μL. By means of a micro-scan mirror with a game dimension of 3 × 3 mm and an oscillation frequency between 150 Hz and 32 kHz, a spatial offset of 5 mm between excitation and detection was set and the fluorescence signal of the fluorescence-marked cells excited by a UV laser was detected over a measurement distance of 10 mm , At a set volume flow of 5 ml / s, the labeled and excited cells were transported within 0.25 ms to the beginning of the detection path and then detected for 0.5 ms. During the period of 0.25 ms between excitation and start of the fluorescence detection, any interfering fluorescence, as could occur, for example, due to autofluorescence of the cells or other fluorophores, has decayed so far that during the detection period of 0.5 ms a disturbing fluorescence-free signal of the Eu (ttfa ) 3- phen-epoxy fluorescent marker could be detected. By varying the starting point of the detection, the system could be adjusted in such a way that detection of the target signal did not begin until any interfering fluorescence had subsided.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.This list of the documents listed by the applicant has been generated automatically and is included solely for the better information of the reader. The list is not part of the German patent or utility model application. The DPMA assumes no liability for any errors or omissions.

Zitierte PatentliteraturCited patent literature

  • DE 102008033871 A1 [0003, 0018, 0027] DE 102008033871 A1 [0003, 0018, 0027]

Claims (9)

Vorrichtung zur zeitaufgelösten Durchflusszytometrie, umfassend eine Durchflusszelle, in welche ein Partikel- und/oder Zellstrom mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit v einleitbar ist, eine Anregungslichtquelle mit einem Brennpunkt im Partikel- und/oder Zellstrom und wenigstens eine Detektoreinheit mit einem Messpunkt im Partikel- und/oder Zellstrom, wobei die Zeitauflösung gemäß dem Zusammenhang T = s/v dadurch herstellbar ist, dass der Messpunkt der wenigstens einen Detektoreinheit relativ zum Brennpunkt der Anregungslichtquelle einen örtlichen Versatz s aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der örtliche Versatz s im Betrieb änderbar ist.Apparatus for time-resolved flow cytometry, comprising a flow cell, into which a particle and / or cell flow with constant flow velocity v can be introduced, an excitation light source with a focal point in the particle and / or cell flow and at least one detector unit with a measurement point in the particle and / or Cell current, the time resolution according to the relationship T = s / v can be produced by the fact that the measuring point of the at least one detector unit relative to the focus of the excitation light source has a local offset s, characterized in that the local offset s in operation is changeable. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Mehrzahl von Detektoreinheiten umfasst, die linear parallel zum Partikel- und/oder Zellstrom an der Durchflussmesszelle beabstandet vom Brennpunkt der Anregungslichtquelle angeordnet sind, so dass die Änderung des Versatzes s im Betrieb durch aufeinander folgende Abfrage einzelner Detektoreinheiten vornehmbar ist.Apparatus according to claim 1, characterized in that it comprises a plurality of detector units, which are arranged linearly parallel to the particle and / or cell flow at the flow measuring cell spaced from the focal point of the excitation light source, so that the change of the offset s in operation by successive query individual detector units is vornehmbar. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung des Versatzes s dadurch vornehmbar ist, dass der Messpunkt wenigstens eines Detektors mittels eines Stellantriebes in Form eines Linearantriebes und/oder einer Kipp- oder Drehvorrichtung änderbar ist.Device according to one of the preceding claims, characterized in that the change in the offset s is vornehmbar that the measuring point of at least one detector by means of an actuator in the form of a linear drive and / or a tilting or rotating device is changeable. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektoreinheit eine Avalanche-Diode aufweist.Device according to one of the preceding claims, wherein the detector unit comprises an avalanche diode. Anordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detektoreinheit eine Steuerspannung aufweist, welche unter die Kleinspannungsverordnung fällt.Arrangement according to one of the preceding claims, wherein the detector unit has a control voltage which falls under the low voltage regulation. Anordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anregungslichtquelle eine Breitbandquelle oder einen Laser mit einer Wellenlänge von 300 nm bis 415 nm, vorzugsweise von 300 Nanometer bis 390 Nanometer aufweist.Arrangement according to one of the preceding claims, wherein the excitation light source comprises a broadband source or a laser having a wavelength of 300 nm to 415 nm, preferably from 300 nm to 390 nm. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei der Stellantrieb einen Piezo-Kippspiegel, eine DMD-Einrichtung oder ein Grating Light Valve zur Umlenkung des Emmissionslichtes auf den Detektor aufweist.Device according to one of claims 3 to 6, wherein the actuator has a piezo-tilting mirror, a DMD device or a grating light valve for deflecting the emission light to the detector. Verfahren zur zeitaufgelösten Untersuchung von Partikeln und/oder Zellen mittels Durchflusszytometrie, umfassend die Schritte: – Markieren der zu untersuchenden Partikel und/oder Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff; – Zuführen der markierten Partikel und/oder Zellen zu einer Messzelle eines Durchflusszytometers; – Anregen der markierten Partikel und/oder Zellen mittels einer geeigneten Anregungsquelle; – Detektieren von physikalischen optischen Parameter der markierten Partikel und/oder Zellen, wobei die Detektion mit zeitlichem Versatz zur Anregung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Versatz zwischen Anregung und Detektion in Abhängigkeit des Emissionsverhaltens der markierten Partikel und/oder Zellen eingestellt wird.Method for the time-resolved examination of particles and / or cells by flow cytometry, comprising the steps: - marking the particles to be examined and / or cells with a fluorescent dye; - supplying the labeled particles and / or cells to a measuring cell of a flow cytometer; - Stimulating the labeled particles and / or cells by means of a suitable excitation source; Detecting physical optical parameters of the labeled particles and / or cells, wherein the detection takes place with a time offset to the excitation, characterized in that the time lag between excitation and detection depending on the emission behavior of the labeled particles and / or cells is set. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die detektierten Signale gespeichert und mittels einer Mustererkennung analysiert werden.The method of claim 8, wherein the detected signals are stored and analyzed by pattern recognition.
DE102010012580A 2010-03-23 2010-03-23 Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device Withdrawn DE102010012580A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010012580A DE102010012580A1 (en) 2010-03-23 2010-03-23 Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010012580A DE102010012580A1 (en) 2010-03-23 2010-03-23 Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE102010012580A1 true DE102010012580A1 (en) 2011-09-29

Family

ID=44585897

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE102010012580A Withdrawn DE102010012580A1 (en) 2010-03-23 2010-03-23 Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device

Country Status (1)

Country Link
DE (1) DE102010012580A1 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828210B2 (en) 2007-10-16 2014-09-09 Cambridge Enterprise Limited Microfluidic systems
US9267918B2 (en) 2007-10-16 2016-02-23 Cambridge Enterprise Limited Microfluidic systems
US11346763B2 (en) * 2019-12-18 2022-05-31 Jiangnan University Apparatus and method for microbial cell counting

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994016313A2 (en) * 1993-01-18 1994-07-21 Evotec Biosystems Gmbh Method and device for assessing the suitability of biopolymers
WO1996015438A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Camedi Ab A device for detecting light fluorescence
US20060147901A1 (en) * 2003-07-02 2006-07-06 Greve Jan Devices and methods to image objects by time delay integration
WO2008094794A1 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Time resolved fluorescent imaging system
US20090053686A1 (en) * 2007-04-02 2009-02-26 Ward Michael D Particle Switching Systems and Methods Using Acoustic Radiation Pressure
WO2009137875A1 (en) * 2008-05-13 2009-11-19 Macquarie University Auto-synchronous fluorescence detection method and apparatus
DE102008033871A1 (en) 2008-06-26 2009-12-31 InBio Prof.Jürgen Büddefeld Dr.Peter Klauth Prof.Manfred Rietz GbR (vertretungsberechtigter Gesellschafter: Dr.Peter Klauth, 41189 Mönchengladbach) Use of two different fluorophores for configuring fluorescence resonance energy transfer pair, where the first fluorophore acts as donor fluorophore and the second fluorophore acts as acceptor fluorophore
US20100032584A1 (en) * 2006-08-18 2010-02-11 Macquarie University Tiime gated fluorescent flow cytometer

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994016313A2 (en) * 1993-01-18 1994-07-21 Evotec Biosystems Gmbh Method and device for assessing the suitability of biopolymers
WO1996015438A1 (en) * 1994-11-14 1996-05-23 Camedi Ab A device for detecting light fluorescence
US20060147901A1 (en) * 2003-07-02 2006-07-06 Greve Jan Devices and methods to image objects by time delay integration
US20100032584A1 (en) * 2006-08-18 2010-02-11 Macquarie University Tiime gated fluorescent flow cytometer
WO2008094794A1 (en) * 2007-01-30 2008-08-07 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Time resolved fluorescent imaging system
US20090053686A1 (en) * 2007-04-02 2009-02-26 Ward Michael D Particle Switching Systems and Methods Using Acoustic Radiation Pressure
WO2009137875A1 (en) * 2008-05-13 2009-11-19 Macquarie University Auto-synchronous fluorescence detection method and apparatus
DE102008033871A1 (en) 2008-06-26 2009-12-31 InBio Prof.Jürgen Büddefeld Dr.Peter Klauth Prof.Manfred Rietz GbR (vertretungsberechtigter Gesellschafter: Dr.Peter Klauth, 41189 Mönchengladbach) Use of two different fluorophores for configuring fluorescence resonance energy transfer pair, where the first fluorophore acts as donor fluorophore and the second fluorophore acts as acceptor fluorophore

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8828210B2 (en) 2007-10-16 2014-09-09 Cambridge Enterprise Limited Microfluidic systems
US9267918B2 (en) 2007-10-16 2016-02-23 Cambridge Enterprise Limited Microfluidic systems
US11346763B2 (en) * 2019-12-18 2022-05-31 Jiangnan University Apparatus and method for microbial cell counting

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE112009000698B4 (en) Method and device for the localization of individual dye molecules in fluorescence microscopy
JP5071995B2 (en) High purity sperm population with X and Y chromosomes
DE4416558C2 (en) Method for optically measuring a sample point of a sample and device for carrying out the method
DE2929170C2 (en) Measuring device for determining the fluorescence emission spectrum of particles
EP1584918B1 (en) Method and device for fluorescence lifetime imaging nanoscopy
DE19634873A1 (en) System for the differentiation of fluorescent groups of molecules by time-resolved fluorescence measurement
WO2003098313A2 (en) Method and arrangement for analyzing samples
DE3310665A1 (en) DEVICE FOR MEASURING LIGHT-OPTICAL PARAMETERS OF PARTICLES
EP2380008B1 (en) Method and system for characterizing a sample by means of imaging fluorescence microscopy
DE10151217A1 (en) Detection system, for the study of biological samples, comprises the breakdown of light emerging from sample points/point distributions to form an alpha stack for the spectral distribution to be measured by separate detection channels
EP0979402B1 (en) Method for optical detection of analyte molecules in a natural biological medium
DE2421501A1 (en) METHOD AND DEVICE FOR ANALYSIS OF LEUKOCYTE AND SIMILAR CELLS
EP2446314B1 (en) Method for evaluating fluorescence results in a microscope image
DE10223438B4 (en) Fluorescence-measuring system
DE102016119264A1 (en) A method for spatially high-resolution determination of the location of a singled, excitable light for the emission of luminescent light molecule in a sample
DE102015002205A1 (en) Microscopic device with a method for the improved analysis of photon data
DE2537098A1 (en) METHOD AND DEVICE FOR DISTINCTION BETWEEN TWO TYPES OF FLUORESCENT PARTICLES WITH DIFFERENT FLUORESCENCE DECAY TIMES
EP2167940A1 (en) Method for determining a measurement value based on single molecule events
WO2015092027A1 (en) Multi-color scanning microscope
DE102010012580A1 (en) Device for time-resolved measurement of fluorescence signals in flow-cytometric investigation of e.g. cells, has detector with measuring point comprising local displacements that are changed during operation of device
DE60214561T2 (en) Fluorimetric multi-parameter analysis in a parallel multi-focus arrangement
WO2011144208A2 (en) Arrangement for measuring the optical properties of particles of a dispersion
DE19822452C2 (en) Method for determining the density of luminescent molecules on a surface, use of the method for determining adsorption and binding kinetics and equilibrium and binding constants of molecules on a surface by luminescence measurements and device for carrying out the method
WO2019206476A1 (en) Method for examining a liquid which contains at least one cell and/or at least one particle
EP1311829B1 (en) Method and device for the measurement of chemical and/or biological samples

Legal Events

Date Code Title Description
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee
R119 Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee

Effective date: 20141001