DE102015002205A1 - Microscopic device with a method for the improved analysis of photon data - Google Patents

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Abstract

Eine Probe wird wiederholt gepulst beleuchtet mit einem ersten Laserlichtpuls (1) zur Anregung und einem von dem ersten Laserlichtpuls verschiedenen zweiten Laserlichtpuls (2) zur Manipulation. Die Probe weist zumindest einen Fluorophor auf, wobei der mindestens eine Fluorophor in zumindest einem Zustand mit dem ersten und/oder dem zweiten Laserlichtpuls wechselwirken kann. Die Probe wird mit einer Pulssequenz (3) beleuchtet, die zumindest ein erstes Pulsmuster (4) und ein vom ersten Pulsmuster zeitlich disjunktes zweites Pulsmuster (5) aufweist, wobei das erste Pulsmuster (4) den ersten Laserlichtpuls (1) enthält, und wobei das zweite Pulsmuster (5) den ersten Laserlichtpuls (1) und den zweiten Laserlichtpuls (2) enthält. Die von der Probe stammenden Photonen, die aus dem Wechselwirken des ersten Laserlichtpulses (1) und/oder des zweiten Laserlichtpulses (2) mit der Probe erzeugt werden, werden zeitaufgelöst, und mit dem ersten Pulsmuster (4) und zweiten Pulsmuster (5) zeitkorreliert, erfasst.A sample is repeatedly pulsed illuminated with a first laser light pulse (1) for excitation and a second laser light pulse (2) for manipulation, which is different from the first laser light pulse. The sample has at least one fluorophore, wherein the at least one fluorophore can interact in at least one state with the first and / or the second laser light pulse. The sample is illuminated with a pulse sequence (3) having at least a first pulse pattern (4) and a second pulse pattern (5) disjoint in time from the first pulse pattern, the first pulse pattern (4) containing the first laser light pulse (1), and the second pulse pattern (5) contains the first laser light pulse (1) and the second laser light pulse (2). The photons originating from the sample, which are generated from the interaction of the first laser light pulse (1) and / or the second laser light pulse (2) with the sample, are time-resolved, and time-correlated with the first pulse pattern (4) and second pulse pattern (5) , detected.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein konfokales Mikroskop, insbesondere ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop. Dieses kann zum Abbilden einer fluoreszierenden Probe oder einer mit fluoreszierenden Einheiten (Fluorophoren) markierten Struktur in einer Probe oder zum Beobachten von Fluktuationen von Fluorophoren, welche in einer Probe enthalten sind, mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) verwendet werden. Die Fluorophore, d. h. die Teile, die mit Anregungslicht zur Fluoreszenz anregbar sind, können hierbei insbesondere als fluoreszierende Moleküle, fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Quantendots ausgebildet sein.The invention relates to a confocal microscope, in particular a confocal fluorescence light microscope. This can be used to image a fluorescent sample or fluorescent moieties (fluorophore) labeled structure in a sample or to monitor fluctuations of fluorophores contained in a sample by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). The fluorophores, d. H. the parts which can be excited by excitation light for fluorescence can in this case be designed, in particular, as fluorescent molecules, fluorescent proteins or fluorescent quantum dots.

Weiterhin können alle intrinsischen Bestandteile der Probe als Fluorophor wirksam werden.Furthermore, all intrinsic components of the sample can be effective as a fluorophore.

Im Rahmen der vorgestellten Erfindung erfolgt ein schneller Wechsel zwischen rein konfokaler Laseranregung und konfokaler Laseranregung mit gleichzeitiger optischer Manipulation einer fluoreszierenden Probe verbunden mit einer zeitlich aufgelösten Aufnahme des Fluoreszenzlichts sowie eine separate und/oder kombinierte Analyse des Verhaltens der Probe in getrennten Zeitfenstern.In the context of the present invention, there is a rapid change between purely confocal laser excitation and confocal laser excitation with simultaneous optical manipulation of a fluorescent sample associated with a temporally resolved recording of the fluorescent light and a separate and / or combined analysis of the behavior of the sample in separate time windows.

Damit können beispielsweise Prozesse, die langsamer als der genannte Wechsel in der Anregung ablaufen, quasi zeitgleich und unter gleichen Messbedingungen sowohl mit als auch ohne zusätzliche Manipulation verfolgt und analysiert werden. Dadurch kann insbesondere auch der Einfluss der Manipulation, der sich über Zeiträume, die mindestens eine Wechselperiode andauern, untersucht werden und unbeabsichtigte Verfälschungen durch die Manipulation identifiziert und berücksichtigt werden.Thus, for example, processes which proceed more slowly than the named change in the excitation can be tracked and analyzed virtually simultaneously and under the same measuring conditions both with and without additional manipulation. As a result, in particular, the influence of the manipulation, which can be examined over periods that last at least one change period, and unintentional distortions by the manipulation can be identified and taken into account.

Insbesondere im Bereich der konventionellen STED-Mikroskopie ist es ein Problem, dass man typischerweise nicht simultan den Zustand der Probe ohne STED-Laserlichts abfragen kann. Das STED-Laserlicht im Sinne einer zusätzlichen optischen Manipulation kann aber beispielsweise die Abbildung durch Photobleichen während der Aufnahme und Induzierung weiterer photophysikalischer Effekte wie zum Beispiel Blinking sowie direkte Anregung durch das STED-Laserlicht verfälschen.In particular, in the field of conventional STED microscopy, it is a problem that typically one can not simultaneously query the state of the sample without STED laser light. However, the STED laser light in the sense of additional optical manipulation can, for example, falsify the imaging by photobleaching during the recording and induction of further photophysical effects such as blinking as well as direct excitation by the STED laser light.

Die hier vorgestellte Erfindung löst dieses Problem und bewerkstelligt insbesondere die gleichzeitige Aufnahme eines Datensatzes ohne STED-Laserlicht und eines Datensatzes unter Beleuchtung mit STED-Laserlicht. Durch Vergleich der Datensätze kann so der verfälschende Einfluß des STED-Laserlichts beispielweise in der Bildgebung und bei Punktmessungen wie zum Beispiel bei Diffusionsmessungen identifiziert und berücksichtigt werden. Durch Verwendung weiterer Laserstrahlen anderer Wellenlänge und/oder Intensität können auch Fluorophore der Messung zugänglich gemacht werden, welche sonst keine Photonen emittieren.The invention presented here solves this problem and accomplishes in particular the simultaneous recording of a data set without STED laser light and a data set under illumination with STED laser light. By comparing the data sets, the distorting influence of the STED laser light can be identified and taken into account, for example, in imaging and in point measurements such as in diffusion measurements. By using further laser beams of different wavelength and / or intensity, it is also possible to make fluorophores accessible to the measurement, which otherwise emit no photons.

Stand der Technik:State of the art:

Ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop ermöglicht bereits eine hohe räumliche Auflösung beim Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur in einer Probe. Weiterhin wird hiermit das Beobachtungsvolumen bei FCS konkret begrenzt. Eine Möglichkeit zur weiteren Erhöhung der räumlichen Auflösung oder zur Verringerung des Beobachtungsvolumens bei FCS bietet die STED-Mikroskopie, welche eine Erweiterung der Konfokalmikroskopie darstellt. Bei der STED-Mikroskopie erfolgt die Anregung der Fluorophore in der Probe typischerweise in Form gepulsten Laserlichts. Das zur Anregung (engl. depletion) verwendete Licht kann entweder gepulst oder auch permanent eingestrahlt werden. Hierbei ist der Fokus des Abregungslichtes in Form eines Donuts, d. h. mit einer Nullstelle der Anregungsintensität im Zentrum des Anregungsspots ausgebildet. Hat der Abregungslaser eine sehr hohe Intensität, so werden alle Fluorophore welche vom Abregungslaser erfasst werden stimuliert aus dem angeregten Zustand abgeregt. Dies führt dazu, dass bei (nahezu) gleichzeitigem Einstrahlen des An- sowie des Abregungspulses nur die Fluorophore zum Messsignal beitragen, welche sich im Inneren des Donut befinden. Somit kann typischerweise eine um den Faktor 10–20 (in Einzelfällen auch Faktor 100) höhere räumliche Auflösung erzielt werden.A confocal fluorescence light microscope already allows a high spatial resolution when imaging a fluorophore-labeled structure in a sample. Furthermore, hereby the observation volume at FCS is concretely limited. One possibility for further increasing the spatial resolution or for reducing the observation volume in FCS is provided by STED microscopy, which is an extension of confocal microscopy. In STED microscopy, excitation of the fluorophores in the sample is typically in the form of pulsed laser light. The light used for excitation (English depletion) can be either pulsed or permanently irradiated. Here, the focus of the de-excitation light is in the form of a donut, i. H. formed with a zero of the excitation intensity in the center of the excitation spot. If the depletion laser has a very high intensity, then all the fluorophores which are detected by the depletion laser are stimulated from the excited state. This leads to the fact that with (almost) simultaneous irradiation of the on and off pulse only the fluorophores contribute to the measurement signal, which are located inside the donut. Thus, a spatial resolution higher by a factor of 10-20 (in some cases also by a factor of 100) can typically be achieved.

Beschreibung:Description:

In einer Ausführungsform der Erfindung ist ein Mikroskopieverfahren zum wiederholten gepulsten Anregen einer Probe mit einem ersten Laserlichtpuls und einem von dem ersten Laserlichtpuls verschiedenen zweiten Laserlichtpuls vorgesehen. Die Laserlichtpulse haben dabei eine Wellenlänge zwischen 250–5000 nm, bevorzugt zwischen 400–1200 nm. Die Laserlichtpulse sind insbesondere gekennzeichnet durch eine Wellenlänge in einem schmalen Wellenlängenbereich sowie eine bestimmte Intensität, Dauer und Polarisation. Die Dauer der Laserlichtpulse liegt im Bereich zwischen 10 fs–2000 ps.In one embodiment of the invention, a microscopy method is provided for repeatedly pulsing a sample with a first laser light pulse and a second laser light pulse different from the first laser light pulse. The laser light pulses have a wavelength between 250-5000 nm, preferably between 400-1200 nm. The laser light pulses are characterized in particular by a wavelength in a narrow wavelength range and a certain intensity, duration and polarization. The duration of the laser light pulses is in the range between 10 fs-2000 ps.

Das Mikroskopieverfahren weist folgende Schritte auf:
Zunächst wird eine Probe bereit gestellt, die mindestens einen Fluorophor aufweist der wiederum mindestens zwei photo-physikalische Zustände, beispielsweise einen elektronischen Grundzustand und einen ersten elektronisch angeregten Zustand aufweist. Der Fluorophor kann darüber hinaus weitere Zustände aufweisen, beispielsweise elektronische Triplet-zustände, geladene Zustände oder allgemein Dunkelzustände die entweder reversibel oder irreversibel erreicht werden. Diese Fluorophore können in zumindest einem dieser photo-physikalischen Zustände, wie beispielsweise dem Grundzustand, einem elektronischen Singulett- oder Triplet-Zustand, einem angeregten Zustand oder einem Dunkelzustand, mit dem ersten und/oder dem zweiten Laserlichtpuls wechselwirken. Diese Probe wird nun insbesondere im Sinne eines Konfokalmikroskops mit einer Pulssequenz beleuchtet. Diese besteht zumindest aus einem ersten Pulsmuster und einem vom ersten Pulsmuster zeitlich disjunkten zweiten Pulsmuster, wobei das erste Pulsmuster den ersten Laserlichtpuls enthält, und das zweite Pulsmuster den ersten und den zweiten Laserlichtpuls enthält. Die Laserlichtpulse führen zur Wechselwirkung mit der Probe die beispielsweise eine Absorption oder stimulierte Emission sein kann. Zeitlich disjunkt soll hier insbesondere nicht überlappend und/oder deutlich zeitlich versetzt bedeuten. Schließlich werden die von der Probe stammenden Photonen, die aus dem Wechselwirken des ersten Laserlichtpulses und/oder des zweiten Laserlichtpulses mit der Probe erzeugt werden, zeitaufgelöst und mit dem ersten und zweiten Pulsmuster zeitkorreliert erfasst. Die Erfassung erfolgt mit Detektoren die in der Lage sind einzelne Photonen zu detektieren, beispielweise bestimmte Kameras oder im Falle eines konfokalen Mikroskops beispielsweise Photomultiplier oder Avalanchephotodioden. Die Zeitauflösung für die Erfassung ist dabei insbesondere mindestens 1 ms, mindestens 100 μs, mindestens 1 μs, mindestens 1 ns oder mindestens 10 ps. Zeitkorreliert bedeutet, dass für jedes Photon dessen Ankunftszeit auf dem Detektor bestimmt wird und diese Ankunftszeit in Bezug gesetzt werden kann mit den Zeitpunkten zu denen die Laserlichtpulse generiert wurden. Da die Laufzeiten des Laserlichtpulses vom Laser zur Probe und die Laufzeit des Photons von der Probe zum Detektor berücksichtigt werden können, läßt sich auf diese Weise mindestens statistisch jedes Photon dem dazugehörigen Laserlichtpuls zuordnen und damit auch die Zeit zwischen Absorption eines Photons aus dem Laserlichtpuls in der Probe und Aussenden eines dadurch hervorgerufenen beispielsweise Fluoreszenzphotons zeitlich messen. Zudem lassen sich auch die Ankunftszeiten der Photonen untereinander zeitlich in Bezug setzen um daraus beispielsweise die Fluoreszenzintensitätskorrelation zu berechnen. Zum Erfassen der Photonen gehört neben der Ankunftszeit insbesondere auch die Aufzeichnung von assozierten Daten und weiteren Parametern wie beispielsweise der Scannerposition und der Detektornummer, die Informationen über die Wellenlänge und Polarisation des detektierten Photons enthalten und über den Ort des Fluorophors in der Probe, der dieses Photon ausgesendet hat.The microscopy method has the following steps:
First, a sample is provided which has at least one fluorophore which in turn has at least two photo-physical states, for example a ground electronic state and a first electronically excited state. The fluorophore may also have other states, such as electronic triplet states, charged states, or generally dark states, either reversible or be achieved irreversibly. These fluorophores may interact with the first and / or the second laser light pulse in at least one of these photo-physical states, such as the ground state, an electronic singlet or triplet state, an excited state, or a dark state. This sample is now illuminated in particular in the sense of a confocal microscope with a pulse sequence. This consists at least of a first pulse pattern and a pulse pattern temporally disjoint second pulse pattern, wherein the first pulse pattern contains the first laser light pulse, and the second pulse pattern includes the first and the second laser light pulse. The laser light pulses interact with the sample, which may be, for example, absorption or stimulated emission. Time disjoint shall mean here in particular not overlapping and / or significantly offset in time. Finally, the photons originating from the sample, which are generated from the interaction of the first laser light pulse and / or the second laser light pulse with the sample, are time-resolved and detected in a time-correlated manner with the first and second pulse patterns. The detection takes place with detectors which are able to detect individual photons, for example specific cameras or in the case of a confocal microscope, for example, photomultipliers or avalanche photodiodes. The time resolution for the detection is in particular at least 1 ms, at least 100 μs, at least 1 μs, at least 1 ns or at least 10 ps. Time correlated means that for each photon its arrival time is determined on the detector and this time of arrival can be related to the times when the laser light pulses were generated. Since the propagation times of the laser light pulse from the laser to the sample and the transit time of the photon from the sample to the detector can be taken into account, in this way at least statistically each photon can be assigned to the associated laser light pulse and thus also the time between absorption of a photon from the laser light pulse in the Time measuring the sample and emission of a fluorescence photon caused thereby. In addition, the arrival times of the photons can be temporally related to one another in order to calculate, for example, the fluorescence intensity correlation. In addition to the time of arrival, photons also include in particular the recording of associated data and other parameters such as the scanner position and the detector number, which contain information about the wavelength and polarization of the detected photon and about the location of the fluorophore in the sample containing that photon has sent out.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die Pulssequenz ein drittes Pulsmuster aufweist, wobei das dritte Pulsmuster vom ersten und vom zweiten Pulsmuster disjunkt ist, und wobei das dritte Pulsmuster den zweiten Laserlichtpuls enthält. Dadurch läßt sich der Einfluß des zweiten Laserlichtpulses, der typischerweise den Manipulationslaser darstellt, auf die Probe in Abwesenheit des Anregungslasers (erster Laserlichtpuls) ermitteln.In a further embodiment of the invention, it is provided that the pulse sequence has a third pulse pattern, wherein the third pulse pattern is disjoint from the first and the second pulse pattern, and wherein the third pulse pattern contains the second laser light pulse. As a result, the influence of the second laser light pulse, which typically represents the manipulation laser, on the sample in the absence of the excitation laser (first laser light pulse) can be determined.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das erste, zweite und/oder dritte Pulsmuster jeweils eine zeitliche Dauer von 1 ns bis 5000 ns aufweist, wobei insbesondere die zeitliche bevorzugte Dauer im Bereich von 10 ns bis 100 ns liegt. Die Pulssequenz, die sich aus den einzelnen Pulsmustern zusammensetzt wird mit einer Wiederholrate im Bereich von 10 kHz bis 100 MHz wiederholt.In a further embodiment of the invention it is provided that the first, second and / or third pulse pattern each have a time duration of 1 ns to 5000 ns, wherein in particular the temporally preferred duration is in the range of 10 ns to 100 ns. The pulse sequence, which is composed of the individual pulse patterns, is repeated at a repetition rate in the range from 10 kHz to 100 MHz.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass das erste, zweite und/oder dritte Pulsmuster einen vom ersten und zweiten Laserlichtpuls unterschiedlichen dritten Laserlichtpuls aufweist, oder wobei die Pulssequenz ein viertes Pulsmuster aufweist das den dritten Laserlichtpuls enthält wobei insbesondere die aus dem Wechselwirken des dritten Laserlichtpulses mit der Probe erzeugten Photonen zeitaufgelöst und mit der Pulssequenz zeitkorreliert erfasst werden. Die Zeitauflösung für die zeitkorrelierte Erfassung ist dabei insbesondere mindestens 1 ms, mindestens 100 μs, mindestens 1 μs, mindestens 1 ns oder mindestens 10 ps. Die Datenaufnahme hat so zu Erfolgen, dass die Photonen aufgrund der Zeitauflösung unterscheidbar sind und dem ersten, zweiten oder dritten Laserlichtpuls zumindest statistisch zugeordnet werden können. Der dritte Laserlichtpuls kann beispielsweise ein Aktivierungslaserlichtpuls sein, der Fluorophore aus einem langlebigen Dunkelzustand zurück in einen Zustand überführt aus dem der Fluorophor wieder angeregt werden kann und fluoreszieren kann und damit wieder in der oben beschriebenen Weise mit dem ersten und zweiten Laserlichtpuls Wechselwirken kann.In a further embodiment of the invention, it is provided that the first, second and / or third pulse pattern has a third laser light pulse different from the first and second laser light pulse, or wherein the pulse sequence has a fourth pulse pattern which contains the third laser light pulse, in particular that from the interaction of the third laser light pulse generated with the sample photons are time-resolved and recorded with the pulse sequence time-correlated. The time resolution for the time-correlated detection is in particular at least 1 ms, at least 100 μs, at least 1 μs, at least 1 ns or at least 10 ps. The data acquisition has such success that the photons are distinguishable due to the time resolution and the first, second or third laser light pulse can be assigned at least statistically. The third laser light pulse may, for example, be an activation laser light pulse, which transfers fluorophores from a long-lived dark state back to a state from which the fluorophore can be excited again and fluoresce, and thus again interact with the first and second laser light pulses in the manner described above.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen dass der erste Laserlichtpuls ein Anregungspuls ist, welcher so beschaffen ist, dass er von dem Fluorophor absorbierbar ist, wobei der erste Laserlichtpuls insbesondere weiterhin so beschaffen ist, dass er von einem Grundzustand des Fluorophors absorbierbar ist, wobei insbesondere der Fluorophor durch den Anregungspuls von dem Grundzustand des Fluorophors in einen ersten angeregten Zustand versetzbar ist.In a further embodiment of the invention, it is provided that the first laser light pulse is an excitation pulse which is absorbable by the fluorophore, the first laser light pulse in particular being further absorbable by a ground state of the fluorophore in particular, the fluorophore is displaceable by the excitation pulse from the ground state of the fluorophore to a first excited state.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der zweite Laserlichtpuls ein Abregungspuls ist, der so beschaffen ist, dass er den Fluorophor von einem energetisch höheren Zustand des Fluorophors in einen energetisch niedrigeren Zustand überführen kann, wobei insbesondere der energetisch höhere Zustand der erste angeregte Zustand des Fluorophors ist, und wobei insbesondere der energetisch niedrigere Zustand der Grundzustand des Fluorophors ist, und wobei insbesondere der Abregungspuls dazu geeignet ist, den Fluorophor über stimulierte Emission abzuregen. Der Abregungspuls kann damit zum Beispiel ein STED-Puls sein, der spektral in der langwelligen Flanke des Fluoreszenzspektrums des Fluorophors positioniert wird und damit etwa 50–330 nm (Farbstoffe mit großem Stokesversatz, engl. long stokesshift dyes), bevorzugt 80–150 nm langwellig verschoben zum ersten Laserlichtpuls, dem Anregungspuls, ist. Der spektrale Abstand beider Laser sollte so gewählt werden, dass ein Optimum zwischen effizienter stimulierter Abregung, minimaler direkter Anregung, maximaler spektralen Detektionsfenster für die Fluoreszenz sowie minimalen Photobleichen der Fluorophore erreicht wird.In a further embodiment of the invention it is provided that the second laser light pulse is a de-excitation pulse, which is arranged so that it can convert the fluorophore from an energetically higher state of the fluorophore into an energetically lower state in particular the energetically higher state is the first excited state of the fluorophore, and in particular the energetically lower state is the ground state of the fluorophore, and in particular the de-excitation pulse is suitable for de-excitation of the fluorophore via stimulated emission. The de-excitation pulse can thus be, for example, an STED pulse, which is positioned spectrally in the long-wave flank of the fluorescence spectrum of the fluorophore and thus about 50-330 nm (dyes with large Stokes offset, preferably long wavelength 80-150 nm) shifted to the first laser light pulse, the excitation pulse is. The spectral distance of both lasers should be chosen to achieve an optimum between efficient stimulated excitation, minimal direct excitation, maximum spectral detection window for the fluorescence, and minimal photobleaching of the fluorophores.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die erfassten Photonen demjenigen Pulsmuster zugeordnet werden, welches den Laserlichtpuls enthält, der das jeweilige erfasste Photon, insbesondere zumindest statistisch betrachtet, verursacht hat. Beispielsweise kann festgestellt werden ob das Photon im ersten, zweiten, dritten oder vierten Pulsmuster detektiert worden ist. Erfolgt die Auswertung der Photonenankunftszeiten beispielsweise statistisch so kann ein Photon mit entsprechenden Wahrscheinlichkeiten auch mehr als einem Laserlichtpuls und damit mehr als einem Pulsmuster zugeordnet werden.In a further embodiment of the invention it is provided that the detected photons are assigned to the pulse pattern which contains the laser light pulse which has caused the respective detected photon, in particular at least statistically. For example, it can be determined whether the photon has been detected in the first, second, third or fourth pulse pattern. If, for example, the evaluation of the photon arrival times is statistical, then a photon with corresponding probabilities can also be assigned more than one laser light pulse and thus more than one pulse pattern.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass die folgenden Datensätze erstellt werden: Ein erster Datensatz wird aus den Daten der dem ersten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt. Ein zweiter Datensatz wird aus den Daten der dem zweiten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt. Insbesondere wird ein dritter Datensatz aus den Daten der dem dritten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt. Die Daten der zugeordneten Photonen können beispielsweise je Photon die absolute Ankunftszeit des Photon am Detektor und/oder relativ zum zugeordneten Laserlichtpuls und/oder eine statistische Wichtung des Photons und/oder eine Scannerposition und/oder die Detektionskanalnummer und/oder eine Wellenlängeninformation und/oder eine Polarisationsinformation enthalten.In a further embodiment of the invention, it is provided that the following data records are created: A first data record is created from the data of the photons assigned to the first pulse pattern. A second data set is created from the data of the photons associated with the second pulse pattern. In particular, a third data set is created from the data of the photons associated with the third pulse pattern. The data of the assigned photons can, for example, per photon the absolute arrival time of the photon at the detector and / or relative to the associated laser light pulse and / or a statistical weighting of the photon and / or a scanner position and / or the detection channel number and / or wavelength information and / or a Contain polarization information.

Der erste Datensatz wird dazu verwendet, einen Einfluss des zweiten Pulsmusters, insbesondere des zweiten Laserlichtpulses, auf eine Verteilung der Photonen des zweiten Datensatzes zu ermitteln und insbesondere den zweiten Datensatz zu filtern, so dass bei einer weiteren Verarbeitung des zweiten Datensatzes nur die gefilterten Daten berücksichtigt werden. Durch die Auswertung des ersten Datensatzes wird eine Verfälschung des zweiten Datensatzes aufgrund eines durch den zweiten Laserlichtpulses hervorgerufenen, insbesondere irreversiblen, Photobleichens des Fluorophors ermittelt und ausgeschlossen. Die Verfälschung kann sich bei Diffusionsmessungen insbesondere in einer scheinbar verkürzten Verweildauer im konfokalen Untersuchungsvolumen manifestieren und dadurch zu falsch ermittelten Diffusionszeiten, typischerweise zu kleinen Diffusionszeiten, führen. Der Verfälschung kann sich weiterhin in der Bildgebung beispielsweise von einzelnen Fluorophoren als zu kleine und/oder unsymmetrische Abbildung manifestieren, die das räumliche Auflösungsvermögen des Mikroskops damit falsch, im Sinne von tendenziell besser als tatsächlich vorhanden, wiedergibt.The first data set is used to determine an influence of the second pulse pattern, in particular of the second laser light pulse, on a distribution of the photons of the second data record and, in particular, to filter the second data record, so that only the filtered data is taken into account in a further processing of the second data record become. By evaluating the first data set, a corruption of the second data set due to a photobleaching of the fluorophore caused by the second laser light pulse, in particular irreversible, is determined and excluded. The falsification can manifest itself in diffusion measurements, in particular in a seemingly shortened residence time in the confocal examination volume and thereby lead to incorrectly determined diffusion times, typically to small diffusion times. The falsification can continue to manifest in the imaging, for example, of individual fluorophores as too small and / or asymmetrical image that the spatial resolution of the microscope thus wrong, in the sense of tends to reflect better than actually present.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist vorgesehen, dass der erste Datensatz dazu verwendet wird, Fluorophore der Probe zu identifizieren, die während der Beleuchtung der Probe mit der Pulssequenz in einen Dunkelzustand übergegangen sind. Diese in einen Dunkelzustand übergegangenen Fluorophore können dann von einer nachfolgenden Analyse gezielt ausgeschlossen werden um diese Analyse nicht zu verfälschen. Die Analyse kann beispielsweise die Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögens des Mikroskops sein, bei der die Größe mit der einzelne Fluorophore abgebildet werden ausgewertet wird.In a further embodiment of the invention it is provided that the first data set is used to identify fluorophores of the sample which have changed to a dark state during the illumination of the sample with the pulse sequence. These fluorophores, which have passed into a dark state, can then be selectively excluded from a subsequent analysis so as not to falsify this analysis. The analysis can be, for example, the determination of the spatial resolution of the microscope, in which the size can be imaged with the individual fluorophores.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein Computerprogramm vorgesehen, dass einen Programmcode zur Durchführung des oben beschriebenen Mikroskopieverfahrens aufweist, wenn das Computerprogramm durch einen Computer ausgeführt wird. Die Probe wird dabei händisch oder mit einem automatisierten Verfahren bereitgestellt.In a further embodiment of the invention, a computer program is provided which has a program code for carrying out the microscopy method described above, when the computer program is executed by a computer. The sample is thereby provided manually or with an automated method.

Eine typisches Experiment im Sinne der beschriebenen Erfindung besteht beispielweise aus folgenden 3 Teilen:A typical experiment in the sense of the described invention consists, for example, of the following 3 parts:

(1) Anregung(1) suggestion

Die Probe wird mit unterschiedlichem, gepulsten Laserlicht zeitlich versetzt beleuchtet. Verschieden bedeutet hier z. B. mit Laserlicht unterschiedlicher Wellenlängen, Intensitäten oder Polarisationen. Mindestens eine Sorte der dabei verwendeten Laserlichtpulse wird als Manipulationspuls bezeichnet und diese wird zeitnah mit mindestens einer weiteren Sorte (Anregungspuls) zum Beleuchten der Probe verwendet. Die Manipulation kann z. B. eine zusätzlich eingestrahlte STED-Abregung sein. Typischerweise ist es Strahlung, die den Fluorophor oder einen der beteiligten Fluorophore in einen veränderten photophysikalischen Zustand versetzen kann.The sample is illuminated with different, pulsed laser light with a time lag. Different here means z. B. with laser light of different wavelengths, intensities or polarizations. At least one type of the laser light pulses used in the process is referred to as a manipulation pulse and this is used in a timely manner with at least one other type (excitation pulse) for illuminating the sample. The manipulation can z. B. be additionally irradiated STED-degeneration. Typically, it is radiation that can put the fluorophore or one of the involved fluorophores in an altered photophysical state.

Zeitnah bedeutet hier nicht unbedingt exakt simultan, aber in einer festen zeitlichen Beziehung die gegeben ist durch einen Prozess, der in der Probe durch einen der beiden Pulse ausgelöst wird. Der zweite Puls wird in die Probe eingestrahlt, solange der Prozeß in der Probe noch nicht vollständig abgeklungen ist. Einer der beiden Pulse beeinflusst diesen Prozess stark und wird als Manipulationspuls bezeichnet. Der Manipulationspuls kann also zeitlich vor, gleichzeitig oder auch nach dem Anregungspuls liegen.Timely means here not necessarily exactly simultaneously, but in a fixed temporal relationship which is given by a process that is triggered in the sample by one of the two pulses. The second pulse is injected into the sample as long as the process in the sample has not yet completely decayed. One of the two pulses strongly influences this process and is called a manipulation pulse. The manipulation pulse can thus be before, at the same time or after the excitation pulse.

Eine Pulssequenz ist hier definiert als eine sich regelmäßig wiederholende Folge von Pulsmustern (siehe 1). Die Pulsmuster einer Pulssequenz unterscheiden sich ihrerseits in ihrer unterschiedlichen Zusammensetzung aus verschiedenen Laserlichtpulsen. Eine Pulssequenz enthält mindestens ein Pulsmuster ohne zusätzliche Manipulation und ein Pulsmuster mit gleichzeitiger Laserlichtmanipulation.A pulse sequence is defined here as a regularly repeating sequence of pulse patterns (see 1 ). The pulse patterns of a pulse sequence differ in their different composition from different laser light pulses. A pulse sequence contains at least one pulse pattern without additional manipulation and a pulse pattern with simultaneous laser light manipulation.

Die hier beschriebene Erfindung ist zur Generierung der folgenden Pulssequenzen mit Hilfe eines Pulsmustergenerators (53) in der Lage (siehe 2 und 7):

  • 1. Den einfachsten Fall stellt eine regelmäßig gepulste Anregung (A) dar, bei der jeder zweite Anregungspuls zeitnah mit einem Manipulationpuls (M) kombiniert wird: A, A + M, A, A + M, A, A + M, ...
  • 2. Möglich ist auch ein regelmäßiger Wechsel von mehreren a (a = 1, 2, 3, 4, ...) Anregungspulsen A, gefolgt von mehreren m (m = 1, 2, 3, 4, ...) Anregungspulsen, die jeweils zeitnah mit einem Manipulationspuls M kombiniert sind: z. B. a = 2 und m = 4: A, A, A + M, A + M, A + M, A + M, A, A, A + M, A + M, A + M, A + M, ...
  • 3. Möglich sind auch Pulssequenzen, die die in 1. und 2. beschriebenen Pulsmuster enthalten, darüber hinaus aber weitere Pulsmuster enthalten, z. B. weitere Anregungspulse mit weiteren Wellenlängen und/oder Polarisationen sowie weitere Manipulationspulse mit weiteren Wellenlängen und/oder Polarisationen oder auch weitere Einzelpulse, z. B. lediglich den Manipulationspuls ohne zugeordneten Anregungspuls.
The invention described here is for generating the following pulse sequences with the aid of a pulse pattern generator ( 53 ) able (see 2 and 7 ):
  • 1. The simplest case is a regularly pulsed excitation (A), in which every second excitation pulse is promptly combined with a manipulation pulse (M): A, A + M, A, A + M, A, A + M, .. ,
  • 2. It is also possible a regular change of several a (a = 1, 2, 3, 4, ...) excitation pulses A, followed by several m (m = 1, 2, 3, 4, ...) excitation pulses, each timely combined with a manipulation pulse M: z. A = 2 and m = 4: A, A, A + M, A + M, A + M, A + M, A, A, A + M, A + M, A + M, A + M, ...
  • 3. Also possible are pulse sequences which contain the pulse patterns described in FIGS. 1 and 2, but moreover contain further pulse patterns, eg. As further excitation pulses with other wavelengths and / or polarizations and other manipulation pulses with other wavelengths and / or polarizations or other single pulses, z. B. only the manipulation pulse without associated excitation pulse.

Das räumliche Beleuchtungsprofil der Probe mit verschiedenen Pulsen muss nicht identisch sein. Ist der Manipulationspuls beispielsweise ein STED-Puls für die laterale Auflösungsverbesserung, wird hierzu in der Mikroskopie eine ringförmige Beleuchtung in der Fokalebene verwendet.The spatial illumination profile of the sample with different pulses need not be identical. If, for example, the manipulation pulse is an STED pulse for the lateral resolution enhancement, an annular illumination in the focal plane is used for this purpose in microscopy.

Unabhängig von den zu untersuchenden Prozessen kann der regelmäßige Wechsel des Pulsmusters auf der Nanosekunden-Zeitskala stattfinden, z. B. alle 1–500 ns. Ein in diesem Sinne langsamerer Prozess ist z. B. die Verweildauer eines diffundierenden Teilchens im Laserfokus von etwa 0,1 Millisekunden. Die beschriebene Erfindung und insbesondere der Pulsmustergenerator (53) ist nicht nur in der Lage verschiedene Pulssequenzen zu generieren sondern auch den zeitlichen Abstand der Pulse innerhalb der Pulsmusters im Bereich mehrerer 10 Pikosekunden bis in den Nanosekundenbereich hinein anzupassen.Regardless of the processes to be examined, the periodic change of the pulse pattern may take place on the nanosecond time scale, e.g. Every 1-500 ns. A slower process in this sense is z. Example, the residence time of a diffusing particle in the laser focus of about 0.1 milliseconds. The described invention and in particular the pulse pattern generator ( 53 ) is not only able to generate different pulse sequences but also to adjust the time interval of the pulses within the pulse pattern in the range of several 10 picoseconds up to the nanosecond range.

(2) Datenaufnahme(2) data acquisition

Die Datenaufnahme hat so zu erfolgen, dass die untersuchte Eigenschaft des Fluorophors zeitaufgelöst aufgezeichnet wird, damit zwischen der untersuchten Eigenschaft in An- und Abwesenheit der Manipulation unterschieden werden kann. Die Eigenschaft kann z. B. die Zahl der emittierten und detektierbaren Fluoreszenzphotonen, deren Wellenlänge und/oder auch deren Polarisation pro Zeiteinheit sein. Die Datenaufnahme kann z. B. als zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung realisiert sein.The data must be recorded in such a way that the investigated property of the fluorophore is recorded in a time-resolved manner so that a distinction can be made between the examined property in the presence and absence of the manipulation. The property can z. Example, the number of emitted and detectable fluorescence photons whose wavelength and / or their polarization per unit time. The data recording can z. B. be realized as time-correlated Einzelphotonenzählung.

(3) Auswertung(3) evaluation

Die zeitlich getrennten Pulsmuster in Verbindung mit der entsprechend zeitaufgelösten Datenaufnahme erlauben eine separate Analyse des Einflusses der Manipulationspulse auf die Fluoreszenz an denselben Molekülen bzw. am selben Molekülensemble (siehe 3). Die Auswertung erfolgt separat für die verschiedenen Pulsmuster, z. B. durch Nutzung von Zeitfenstern oder auch spektraler sowie zeitaufgelöster linearer Entmischung, bei denen die detektierten Fluoreszenzphotonen einem Puls(muster) zugeordnet werden.The temporally separated pulse patterns in conjunction with the corresponding time-resolved data acquisition allow a separate analysis of the influence of the manipulation pulses on the fluorescence on the same molecules or on the same molecular ensemble (see 3 ). The evaluation is done separately for the different pulse patterns, z. B. by using time windows or spectral and time-resolved linear demixing, in which the detected fluorescence photons are assigned to a pulse (pattern).

Durch Setzen bestimmter Zeitfenster (”time-gates”) in Bezug auf die Photonenankunftszeiten können die detektierten Photonen jeweils einem bestimmten Pulsmuster zugeordnet werden. Die Eigenschaften der Photonen (z. B. Anzahl, Ankunftszeit, Polarisation, Wellenlänge) können somit separat für Pulsmuster mit und ohne Manipulationspulse identifiziert und analysiert werden.By setting certain time windows ("time gates") with respect to the photon arrival times, the detected photons can each be assigned to a specific pulse pattern. The properties of the photons (eg number, time of arrival, polarization, wavelength) can thus be identified and analyzed separately for pulse patterns with and without manipulation pulses.

BegriffserläuterungenDefinitions

Mit STED (von engl. Stimulated Emission Depletion) wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere die stimulierte Emission zur Entvölkerung angeregter Zustände bezeichnet. Die ist ein Mikroskopieverfahren zur Verbesserung der Auflösung unter die klassische Beugungsgrenze, bei dem die angeregten Zustände von Fluorophoren in den Randbereichen des beugungsbegrenzten Anregungsvolumens durch Einstrahlung eines weiteren Laserlichts stimuliert entvölkert und damit Fluorophore in den Randbereichen der beugungsbegrenzten Anregung der Detektion entzogen werden. Detektiert wird lediglich die Fluoreszenz aus den verbliebenen, nicht stimuliert entvölkerten, Zuständen im Zentrum des konfokalen Fokusses.With STED (of English Stimulated Emission Depletion) in the context of this invention, in particular the stimulated emission for the depopulation of excited states is called. This is a microscopy method for improving the resolution below the classical diffraction limit, in which the excited states of fluorophores in the edge regions of the diffraction-limited excitation volume stimulated by irradiation of another laser light depopulated and thus fluorophores in the edge regions of the diffraction-limited excitation of the detection are removed. Only the fluorescence from the remaining, non-stimulated depopulated, states in the center of the confocal focus is detected.

Mit FCS (von engl. Fluorescence Correlation Spectroscopy) wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere ein Verfahren zur quantitativen Messung von Molekülbewegungen bezeichnet, bei dem u. a. Diffusionskoeffizient und Konzentration einer diffundierenden, fluoreszenzmarkierten Probe bestimmt werden können. For the purposes of this invention, FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) refers in particular to a method for the quantitative measurement of molecular movements, in which, inter alia, the diffusion coefficient and concentration of a diffusing, fluorescently labeled sample can be determined.

Mit PIE (von engl. Pulsed Interleaved Excitation) wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere eine alternierend gepulste Anregung bezeichnet, bei der z. B. abwechselnd nacheinander die einzelnen Farbstoffe eines FRET-Paares angeregt werden.With PIE (English Pulsed Interleaved Excitation) is referred to in the context of this invention, in particular an alternately pulsed excitation, in the z. B. alternately successively excited the individual dyes of a FRET pair.

Mit Blinking wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere ein photophysikalischer Effekt bezeichnet, bei dem ein einzelnes Molekül zwischen einem fluoreszierenden und einem nicht fluoreszierenden Zustand reversibel wechselt.In the context of this invention, blinking refers in particular to a photophysical effect in which a single molecule reversibly changes between a fluorescent state and a non-fluorescent state.

Mit Photobleichen wird im Rahmen dieser Erfindung insbesondere eine lichtinduzierte, irreversible Veränderung eines Fluorophors aus einem angeregten Zustand heraus bezeichnet, sodaß dieser typischerweise bei Beleuchtung mit der ursprünglichen Anregungswellenlänge nicht mehr fluoresziert.In the context of this invention, photo-bleaching refers in particular to a light-induced, irreversible change of a fluorophore from an excited state, so that it typically no longer fluoresces when illuminated with the original excitation wavelength.

Anwendungsbeispieleapplications

Einige mögliche Mess- und Auswerteverfahren sind im Folgenden beispielhaft aufgeführt. Es wird darauf hingewiesen, dass in den folgenden Beispielen der Begriff STED-Laser als Synomym für Manipulationslaser jeder Art verwendet wird.Some possible measurement and evaluation methods are listed below by way of example. It should be noted that in the following examples, the term STED laser is used as a synonym for manipulation lasers of any kind.

Anwendung 1: PIE-STED FCSApplication 1: PIE-STED FCS

  • • In FCS wird die Diffusion von Fluorophoren durch ein konfokales Untersuchungsvolumen untersucht. Durch STED lässt sich das konfokale Volumen verkleinern und damit die Diffusion in kleineren räumlichen Einheiten untersuchen. Die Manipulation besteht mindestens in einer ringförmigen Beleuchtung in der Fokalebene, welche das effektive Untersuchungsvolumen mittels stimulierter Emission verkleinert (STED) [ Ringemann et al., New J. of Physics, 11, 103054 (2009) ].• In FCS, the diffusion of fluorophores through a confocal volume is investigated. STED makes it possible to reduce the confocal volume and thus examine the diffusion in smaller spatial units. The manipulation consists at least in an annular illumination in the focal plane, which reduces the effective examination volume by means of stimulated emission (STED) [FIG. Ringemann et al., New J. of Physics, 11, 103054 (2009) ].
  • • Als unerwünschter Nebeneffekt kann die SIED-Abregung zu einem irreversiblen Photobleichen der Fluorophore während des Durchgangs durch das Untersuchungsvolumen führen und damit zu einer verringerten Anzahl detektierbarer Fluoreszenzphotonen und einer scheinbar kürzeren Verweildauer im effektiven Untersuchungsvolumen (siehe 4).As an undesirable side-effect, SED depletion can lead to irreversible photobleaching of the fluorophores during the passage through the examination volume and thus to a reduced number of detectable fluorescence photons and a seemingly shorter residence time in the effective examination volume (see US Pat 4 ).
  • • Das Ausmaß irreversiblen Bleichens bei einer definierten STED-Beleuchtungsleistung kann bestimmt werden, indem man z. B. die mittlere Anzahl der Moleküle im Untersuchungsvolumen N, oder die mittlere Diffusionszeit t(diff), [ Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829–837 (2001) , Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429–440 (2007) ] aus nacheinander erfolgten Messungen mit und ohne STED-Manipulation bestimmt und vergleicht (siehe 5).• The extent of irreversible bleaching at a defined STED lighting performance can be determined by, for. B. the average number of molecules in the examination volume N, or the average diffusion time t (diff), Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829-837 (2001) . Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429-440 (2007) ] from successive measurements with and without STED manipulation and compares (see 5 ).
  • • Eine typische Vorrichtung hierfür ist in 7. dargestellt und eine typische Pulssequenz für ein derartiges PIE-STED-FCS Experiment ist in 2, oben (1) dargestellt.• A typical device for this is in 7 , and a typical pulse sequence for such a PIE-STED-FCS experiment is shown in FIG 2 , shown above (1).
  • • Das Verfahren kann auch angewendet werden auf Varianten der FCS-Messung, bei der der gemessene Punkt nicht stationär ist, wie z. B. Scanning FCS [ Ries et al, Biophys. J. 96, 1999–2008 (2009) ] oder Raster Imaging Correlation Spectroscopy (RICS) [ Digman et al, Biophys. J. 88, 133–136 (2005) ].• The method can also be applied to variants of FCS measurement where the measured point is not stationary, such as: B. Scanning FCS [ Ries et al, Biophys. J. 96, 1999-2008 (2009) ] or Raster Imaging Correlation Spectroscopy (RICS) [ Digman et al, Biophys. J. 88, 133-136 (2005) ].
  • • Substanzen oder experimentelle Bedingungen, die einen Einfluss auf das STED-induzierte Photobleichen haben bzw. dieses partiell verhindern, können auf diese Weise mittels Diffusionsmessungen gezielt identifiziert werden.• Substances or experimental conditions that have an influence on or partially prevent the STED-induced photobleaching can thus be specifically identified by means of diffusion measurements.

Anwendung 2: PIE-STED-Imaging an einzelnen, immobilisierten MolekülenApplication 2: PIE-STED imaging on single, immobilized molecules

  • • Das Auflösungsvermögen eines optischen Mikroskops wird typischerweise über die Abbildung einer Punktlichtquelle bestimmt, wobei die Auflösung aus der räumlichen Ausdehnung des Abbilds der Punktlichtquelle bestimmt wird. In der klassischen Konfokalmikroskopie werden dazu oft fluoreszenzmarkierte Nanostrukturen (z. B. kleine Latexkugeln, sogenannte Beads) verwendet, deren Durchmesser mit kleiner 100 nm deutlich unterhalb des Auflösungsvermögens liegt.The resolving power of an optical microscope is typically determined by imaging a point light source, the resolution being determined from the spatial extent of the image of the point light source. In classical confocal microscopy, fluorescently labeled nanostructures (eg small latex spheres, so-called beads) are often used whose diameter of less than 100 nm is significantly below the resolution.
  • • In der SIED-Mikroskopie mit einer optischen Auflösungen im Bereich von unter 50 nm entspricht die Auflösung in etwa aber der räumlichen Ausdehnung dieser Strukturen, wodurch diese Strukturen nicht mehr als Punktlichtquelle sondern als räumlich ausgedehnte Lichtquelle betrachtet werden müssen.• In SIED microscopy with an optical resolution in the range of less than 50 nm, the resolution corresponds approximately to the spatial extent of these structures, which means that these structures no longer have to be regarded as a point light source but as a spatially extended light source.
  • • Um dies zu umgehen kann man in der SIED-Mikroskopie nun ein einzelnes fluoreszierendes Farbstoffmolekül abbilden, das mit einer räumliche Ausdehnung von ca. 1 nm wiederum eine hierfür nahezu ideale Punktlichtquelle darstellt.In order to avoid this, one can now image a single fluorescent dye molecule in the SIED microscopy, which in turn represents a nearly ideal point light source with a spatial extent of about 1 nm.
  • • Wenn das Molekül allerdings während der konfokalen Abbildung in einen Dunkelzustand übergeht (Blinken oder Bleichen) ist die Abbildung des Moleküls unvollständig und die anhand der Größe der Abbildung bestimmte mikroskopische Auflösung falsch.• However, if the molecule turns into a dark state during confocal imaging (blinking or bleaching), the image of the molecule is incomplete and the microscopic resolution determined by the size of the image is incorrect.
  • • Über PIE-STED-Imaging können diese für die Auflösungsbestimmung unerwünschten photophysikalische Prozesse wie Blinken und Bleichen der einzelnen Moleküle nun direkt identifiziert werden.• Using PIE-STED imaging, these unwanted photophysical processes such as flashing and bleaching of individual molecules can now be identified directly.
  • • Eine typische Vorrichtung hierfür ist in 7. und eine typische Pulssequenz für ein derartiges PIE-STED-Imaging Experiment ist in 2, oben (1) dargestellt.• A typical device for this is in 7 , and a typical pulse sequence for such a PIE STED imaging experiment is in 2 , shown above (1).
  • • Mit alternierender Anregung mit und ohne STED-Beleuchtung werden die Daten aufgenommen.• With alternating excitation with and without STED illumination, the data is recorded.
  • • Anschließend werden zunächst für die untersuchten Moleküle die Bilder für die Anregung mit dem Pulsmuster ohne STED-Puls dargestellt. Nur Moleküle, die während der Messung in diesen Bildern weder Blinken noch Bleichen aufweisen, werden zur folgenden Bestimmung der Auflösung unter STED-Bedingungen ausgewählt (siehe 6).• Subsequently, the images for excitation with the pulse pattern without STED pulse are first displayed for the investigated molecules. Only molecules that do not flash or bleach in these images during measurement are selected for the following determination of resolution under STED conditions (see 6 ).
  • • Für die genannten Moleküle werden dann die Abbildungen für die Anregung mit dem STED-Pulsmuster berechnet. In diesen Bildern wird dann die Auflösung unter STED-Bedingungen bestimmt.• The images for excitation with the STED pulse pattern are then calculated for the molecules mentioned. In these images, the resolution is then determined under STED conditions.

Anwendung 3: PIE-SIED-Imaging einzelner Moleküle mit gezielter VereinzelungApplication 3: PIE-SIED imaging of individual molecules with targeted separation

  • • Falls die Fluorophore in einer Probe zu dicht gepackt sind um Anwendung 2 durchzuführen kann die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle auch (temporär) reduziert werden.• If the fluorophores in a sample are too tightly packed to perform application 2, the number of fluorescent molecules can also be reduced (temporarily).
  • • Diese Vereinzelung kann z. B. durch Zugabe eines geeigneten ROXS-Puffers erreicht werden, der einen Großteil der Fluorophore in einem langlebigen Dunkelzustand hält.• This separation can z. B. be achieved by adding a suitable ROXS buffer that holds a majority of fluorophores in a long-lived dark state.
  • • Die Vereinzelung ist auch möglich in dem die Moleküle zuerst alle in einen Dunkelzustand überführt werden und aus diesem heraus dann nur einige wenige Moleküle durch Photoaktivierung wieder in einen fluoreszierenden Zustand überführt werden.• Separation is also possible in which the molecules are first transferred to a dark state and from this then only a few molecules are converted by photoactivation back into a fluorescent state.

Anwendung 4: PIE-STED-Imaging an Ansammlungen von wenigen, immobilisierten MolekülenApplication 4: PIE-STED imaging on accumulations of a few immobilized molecules

  • • Ziel dieser Anwendung ist es, eine Aussage über die Anzahl unabhängiger Fluorophore in einem STED-Bild zu treffen. Ist der Abstand zwischen mindestens 2 Fluorophoren kleiner als das Auflösungsvermögen im STED-Bild, können diese nicht mehr getrennt voneinander abgebildet werden.• The purpose of this application is to provide information about the number of independent fluorophores in a STED image. If the distance between at least 2 fluorophores is smaller than the resolution in the STED image, they can no longer be imaged separately.
  • • Durch Analyse des Fluoreszenz-Antibunchings läßt sich allerdings die Anzahl unabhängiger Emitter auch in diesem Fall noch genau ermitteln (bei < 5 Fluorophoren) bzw. abschätzen (bei 5–20 Fluorophoren).• However, by analyzing the fluorescence anti-punching, the number of independent emitters in this case can still be determined precisely (at <5 fluorophores) or estimated (at 5-20 fluorophores).
  • • Die Photonenausbeute und Stabilität der Fluorophore ist allerdings typischerweise unter STED-Bedingungen für eine aussagekräftige Antibunching-Analyse zu gering.However, the photon yield and stability of the fluorophores is typically too low under STED conditions for meaningful anti-punching analysis.
  • • Durch Wahl eines geeigneten alternierenden Pulsmusters kann man nun aber gleichzeitig unter konfokalen Bedingungen Photonen für die Antibunching-Analyse einsammeln und unter STED-Bedingungen für ein hochaufgelöstes Fluoreszenzbild.• By selecting a suitable alternating pulse pattern, photons can now be collected under confocal conditions for the anti-punching analysis and under STED conditions for a high-resolution fluorescence image.
  • • Mit der Information aus der Antibunching-Analyse lassen sich dann Rückschlüsse über die Anzahl der unabhängigen Fluorophore in den Strukturen im STED-Bild treffen.• The information from the anti-punching analysis then allows conclusions about the number of independent fluorophores in the structures in the STED image.
  • • Dabei werden typischerweise Pulssequenzen verwendet wie in in 2, Mitte (2) die in diesem Fall deutlich mehr Pulsmuster ohne STED-Puls enthalten um die notwendige Photonenstatistik für die Antibunching-Analyse zu erhalten.• Pulse sequences are typically used as in 2 , Center (2) which in this case contain significantly more pulse patterns without STED pulse to obtain the necessary photon statistics for the anti-punching analysis.

Anwendung 5: Kombination aus STED-Intensitätsbild und dem Mapping einer weiteren Eigenschaft ohne STED-PulsApplication 5: Combination of STED intensity image and the mapping of another property without STED pulse

  • • Ziel dieser Anwendung ist die Kombination der hochaufgelösten intensitäts-basierten Ortsinformation aus dem STED-Bild mit funktionaler Information aus einem Bild ohne Manipulations-STED-Pulse, da die STED-Pulse die Abfrage dieser Eigenschaft beeinflussen oder verhindern können.• The aim of this application is to combine the high-resolution intensity-based location information from the STED image with functional information from an image without manipulation STED pulses, since the STED pulses can influence or prevent the query of this property.
  • • Die Eigenschaft kann z. B. das Fluoreszenzabklingverhalten sein (→ FLIM) das im Zeitbereich der Beleuchtung mit dem STED-Puls von Effekten überlagert sein kann die durch diesen STED-Puls hervorgerufen werden. Oder es handelt sich um eine Eigenschaft deren Untersuchung eine hohe Photonenstatistik erfordert, die andernfalls durch STED induziertes Photobleichen verhindert wird.• The property can be z. B. be the fluorescence decay behavior (→ FLIM) which can be superimposed in the time range of illumination with the STED pulse of effects caused by this STED pulse. Or it is a property whose investigation requires high photon statistics, which is otherwise prevented by STED-induced photobleaching.
  • • Die bildliche Darstellung der Informationen aus dem Bild ohne und mit STED-Puls kann z. B. in einem Bild in der Art erfolgen, dass die Helligkeit aus der Intensitätsinformation aus dem STED-Bild kodiert wird und die Farbe aus dem Wert der Eigenschaft aus dem Bild ohne STED-Puls kodiert wird.• The pictorial representation of the information from the image without and with STED pulse can z. Example, in an image in the way that the brightness from the intensity information from the STED image is encoded and the color from the value of the property is encoded from the image without STED pulse.

Anwendung 6: STED-Bild kombiniert mit einem Bild, dass nur durch den Manipulationslaser (STED-Laser) erzeugt wird.Application 6: STED image combined with an image generated only by the manipulation laser (STED laser).

  • • Die Farbstoffe, die für einen STED-Laser bestimmter Wellenlänge zur Bildgebung herangezogen werden, müssen verschiedene Eigenschaften erfüllen.• The dyes used for imaging a STED laser of certain wavelengths must meet a variety of characteristics.
  • 1 Das Emissionsspektrum sollte möglichst gut mit der STED-Wellenlänge überlappen. Je höher der spektrale Überlapp, desto weniger STED-Leistung ist für eine hochauflösende Bildgebung notwendig.1 The emission spectrum should overlap as well as possible with the STED wavelength. The higher the spectral overlap, the less STED performance is needed for high-resolution imaging.
  • 2. Das Anregungsspektrum des Farbstoffs soll möglichst überhaupt nicht mit der STED-Wellenlänge überlappen. Je höher der Überlapp, desto stärker wird eine störende direkte Anregung sichtbar, die sich ein einem verwaschenen Bild bemerkbar macht, da auch im Bereich der ringförmigen STED-Beleuchtung Fluorophore angeregt werden.2. The excitation spectrum of the dye should as far as possible not overlap with the STED wavelength. The higher the overlap, the stronger a disturbing direct excitation becomes visible, which becomes noticeable in a blurred image, since fluorophores are also excited in the area of the annular STED illumination.
  • • Daher ist die Farbstoffwahl meist ein Kompromiss aus 1) und 2). Dies ist jedoch unbefriedigend, da dadurch • Therefore, the choice of dye is usually a compromise from 1) and 2). However, this is unsatisfactory, as a result
  • • dem gleichzeitigen Vermessen verschiedener Labels und Farbstoffe enge Grenzen gesetzt sind.• the simultaneous measurement of different labels and dyes narrow limits are set.
  • • die eingesetzte STED-Laserleistung z. T. sehr hoch gewählt werden muss, was zum Bleichen der Farbstoffe und damit zu einer Einschränkung der Beobachtungsdauer führt.• the used STED laser power z. T. very high, which leads to bleaching of the dyes and thus to a limitation of the observation period.
  • • Eine Lösung des Problems ist es, an die Pulssequenz für die Einzel- oder Mehrfarbenmessung am Ende ein oder mehrere zusätzliche Pulsmuster mit einem STED-Puls ohne dazugehörigen Anregungspuls anzuschließen. Dieses zusätzliche Pulsmuster erlaubt die Vermessung der direkten Anregung durch den STED Laser.• One solution to the problem is to connect one or more additional pulse patterns to the pulse sequence for single or multi-color measurement with a STED pulse without an associated excitation pulse. This additional pulse pattern allows the measurement of direct excitation by the STED laser.
  • • Mit Hilfe von Zeitfenstern und entsprechender Analyse (z. B. Intensitäts- als auch zeitaufgelöster linearer Entmischung) lässt sich das von direkter Anregung durch den STED-Puls ungestörte Bild berechnen.• Using time windows and appropriate analysis (eg intensity and time-resolved linear demixing), the image undisturbed by direct excitation by the STED pulse can be calculated.
  • • Dies führt zu einer Erhöhung der Anzahl von gleichzeitig mit einer STED-Wellenlänge zu vermessender Farbstoffe und verbessert damit die gleichzeitige Erfassung von verschiedenen Farbstofflabeln in der Probe.• This leads to an increase in the number of dyes to be measured simultaneously with one STED wavelength and thus improves the simultaneous detection of different dye labels in the sample.
  • • Es führt für ausgewählte Farbstoffe zu einer Reduktion der notwendigen STED-Laserleistung bei gleichbleibender Erhöhung der Auflösung.• It leads to a reduction of the necessary STED laser power for selected dyes with a constant increase in the resolution.

Anwendung 7: Zurückholen von Fluorophoren aus einem STED induzierten, intermediären DunkelzustandApplication 7: Retrieval of fluorophores from a STED-induced intermediate dark state

  • • Das Photobleichen während einer STED-Messung kann mittels Absorption mehrerer Photonen über mehrere Zustände hinweg erfolgen bis hin zu einem irreversiblen Zustand in dem der Fluorophor so verändert ist, dass er entweder das Anregungslicht nicht mehr absorbiert oder unabhängig davon zumindest nicht mehr fluoresziert.• Photobleaching during a STED measurement can be accomplished by absorbing multiple photons across multiple states to an irreversible state where the fluorophore is altered to either no longer absorb the excitation light or at least to no longer fluoresce independently.
  • • Mit einem dritten Laserlichtpuls (neben Anregung und Manipulation = STED) kann man den Fluorophor auf diesem Weg in Richtung des final irreversiblen Zustands auch aus einem der dazwischen liegenden Zustände optisch induziert wieder zurückholen sodaß er erneut mit dem Anregungslaser zur ursprünglichen Fluoreszenz angeregt werden kann.• With a third laser light pulse (next to excitation and manipulation = STED), the fluorophore can be optically induced to return to the final irreversible state from one of the intermediate states so that it can be excited again to the original fluorescence with the excitation laser.
  • • Auf diese Weise läß sich die Wahrscheinlichkeit des Photobleichens verringern und somit die Lichtausbeute erhöhen.• In this way, the likelihood of photobleaching can be reduced, thus increasing the luminous efficacy.
  • • Dazu wird eine Pulssequenz verwendet die neben einem Pulsmuster mit einem Anregungspuls, einem Pulsmuster mit Anregungs- und Manipulationspuls auch ein Pulsmuster mit einem dritten Laserlichtpuls enthält.• For this purpose, a pulse sequence is used which also contains a pulse pattern with a third laser light pulse in addition to a pulse pattern with an excitation pulse, a pulse pattern with excitation and manipulation pulse.

Figurenbeschreibungfigure description

1:
Beispiel von Pulsmuster und Pulssequenz. Die unterschiedlich schraffierten Anregungs-(1) und Manipulationspulse (2) können unterschiedlichen Wellenlängen aber auch Intensitäten oder Polarisationen der verwendeten Laser entsprechen. 1 :
Example of pulse pattern and pulse sequence. The different hatched excitation ( 1 ) and manipulation pulses ( 2 ) may correspond to different wavelengths but also intensities or polarizations of the lasers used.

2:
Beispiele verschiedener Pulssequenzen: Die dargestellen Sequenzen 1) bis 3) sind nur Beispiele für verschiedene Varianten und stellen nicht alle möglichen Pulssequenzen dar. 2 :
Examples of different pulse sequences: The dargestellen sequences 1) to 3) are only examples of different variants and do not represent all possible pulse sequences.

3:
Ablaufschema einer Messung 3 :
Flow chart of a measurement

4:
Normalisierte Diffusionszeiten t(diff) von fluoreszenzmarkierten Lipiden (in einer Membrandoppelschicht auf Glas) bei ansteigender STED-Beleuchtungsleistung. Die abnehmenden Diffusionszeiten in Anwesenheit der STED-Manipulation (16) sind ein direktes Resultat der Reduzierung des effektiven Untersuchungsvolumes durch die STED-Beleuchtung (25). Photobleichen, induziert durch die STED-Beleuchtung, kann hier ausgeschlossen werden, da die Diffusionszeiten in Abwesenheit der STED-Manipulation (15) gleichbleibend sind. 4 :
Normalized diffusion times t (diff) of fluorescently labeled lipids (in a membrane bilayer on glass) with increasing STED illumination performance. The decreasing diffusion times in the presence of the STED manipulation ( 16 ) are a direct result of the reduction of the effective examination volume by the STED illumination ( 25 ). Photobleaching, induced by the STED illumination, can be excluded here since the diffusion times in the absence of STED manipulation ( 15 ) are consistent.

5:

  • 1) Illustration der Anregungsvolumina für die alternierende Anregung ohne (links) und mit (rechts) gleichzeitigem STED-Puls: In Anwesenheit der STED-Beleuchtung (22) ergibt sich ein effektiv kleineres Volumen (25), in welchem die Moleküle (21) sichtbar sind.
  • 2) Fluoreszenzzerfälle bei alternierender Anregung: Im linken Zeitfenster (26) der Zerfall nach der Anregung ohne Manipulationslaser, im rechten Zeitfenster (27) der Zerfall nach der Anregung bei gleichzeitiger Einstrahlung eines Manipulationslasers mit unterschiedlichen Leistungen (28), (29), (30).
  • 3) Fluoreszenzintensitätskorrelationskurven: Links berechnet mit der Photoneninformation nach Anregung ohne Manipulationslaser (26). Rechts berechnet mit der Photoneninformation nach Anregung mit gleichzeitigem Manipulationslaser (27). Aus den Korrelationskurven kann durch Anpassung geeigneter Modellfunktionen die mittlere Anzahl der Moleküle (21) im Untersuchungsvolumen N, oder die mittlere Diffusionszeit t(diff) bestimmt werden.
5 :
  • 1) Illustration of the excitation volumes for the alternating excitation without (left) and with (right) simultaneous STED pulse: in the presence of the STED illumination ( 22 ) results in an effectively smaller volume ( 25 ) in which the molecules ( 21 ) are visible.
  • 2) Fluorescence decays with alternating excitation: in the left window ( 26 ) the decay after the excitation without manipulation laser, in the right time window ( 27 ) the decay after the excitation with simultaneous irradiation of a manipulation laser with different powers ( 28 ) 29 ) 30 ).
  • 3) Fluorescence intensity correlation curves: calculated on the left with the photon information after excitation without manipulation laser ( 26 ). Computed on the right with the photon information after excitation with simultaneous manipulation laser ( 27 ). From the correlation curves, by adapting suitable model functions, the mean number of molecules ( 21 ) in the examination volume N, or the mean diffusion time t (diff) can be determined.

6:
Prinzip der Auflösungsbestimmung an einem einzelnen Molekül:

  • 1) Links dargestellt ist das Bild bei Anregung ohne STED (Bildausschnitt 0,8 × 0,65 Mikrometer). Es sind zwei Moleküle sichtbar. Rechts dargestellt ist das Bild der gleichen Moleküle mit zusätzlicher STED-Beleuchtung.
  • 2) Intensitätsquerschnitte entlang der Linie (34) in den beiden Bildern in 1) mit angepassten Fitfunktionen zur Bestiummung der Halbwertsbreite als Maß für die Auflösung.
6 :
Principle of dissolution determination on a single molecule:
  • 1) The image is shown on the left when excited without STED (image section 0.8 × 0.65 micrometer). There are two molecules visible. On the right is the image of the same molecules with additional STED illumination.
  • 2) intensity cross sections along the line ( 34 ) in the two pictures in 1) with adapted fit functions to bestium the half width as a measure of the resolution.

7:
7. zeigt ein Fluoreszenzlichtmikroskop (58) gemäß einer möglichen Ausführung der vorliegenden Erfindung für jede Art von Fluoreszenzmikroskopie, inbesondere für STED Mikroskopie. Das Mikroskop (58) kann zur Bildaufnahme und zur FCS verwendet werden. Dabei wird die Probe (46) mit Anregungslicht (40) aus der Anregungslichtquelle (39) beleuchtet. Das Anregungslicht (40) wird über den dichroitischen Strahlteiler (47) zum Objektiv (45) geleitet und mit diesem auf die Probe (46) beugungsbegrenzt fokussiert. Zusätzlich wird die Probe (46) mit Manipulationslicht (42) aus der Manipulationslichtquelle (39) beleuchtet. Dabei fallen die Schwerpunkte der fokussierten Beleuchtungsmuster von Anregungslicht (40) und Manipulationslicht (42) in der Probe (46) in einem Punkt zusammen. Im vorliegenden Beispiel eines STED-Mikroskops wird das Manipulationslicht für STED verwendet und dazu mit einem optionalen Strukturierungselement (43) verändert. Für STED beispielsweise verändert das Strukturierungselement (43) die Wellenfronten des Manipulationslichts (42) derart, dass es bei Fokussierung mit dem Objektiv (45) das STED-typische ringförmige Beleuchtungsmuster in der Probe (46) ergibt. Mit dem Strukturierungselement (43) lassen sich die Wellenfronten des Manipulationslichtstrahls in Teilen unterschiedlich verändern, beispielsweise ausgeführt als Phasenplatte oder als räumlicher Lichtmodulator (englisch spatial light modulator SLM). Der dichroitische Strahlteiler (44) reflektiert das Manipulationslicht (42) zum Objektiv (45), ist aber für das Anregungslaserlicht (40) und das Fluoreszenzlicht (50) mindestens weitgehend transparent. Das optionale Strukturierungselement (43) kann entweder zwischen Manipulationslaser (41) und dem Strahlteiler (44) angeordnet sein, oder zwischen dem Strahlteiler (44) und dem Objektiv (45). Im letzteren Fall ist das Strukturierungslement (43) derart gestaltet, dass es nur das Manipulationslicht (42) verändert aber das Anregungslaserlicht (40) unverändert passieren läßt. Von der Probe (46) emittierte Photonen werden mit dem Objektiv (45) eingesammelt und passieren anschließend das Strukturierungselement (43), sowie die dichroitischen Strahlteiler (44) und (47). Im Falle eines STED-Mikroskops handelt es sich dabei um Fluoreszenzlicht (50) das nach räumlicher Filterung durch eine Lochblende (48) und spektraler Filterung durch entsprechende Filter (49) auf einen Detektor (51) fällt. Der Detektor (51) ist in der Lage einzelne Photonen zeitaufgelöst zu detektieren. Die Daten der detektierten Photonen werden von diesem an eine Datenerfassungselektronik mit Zeitauflösung (52) übergeben. Diese Datenerfassungselektronik (52) erhält auch in Form von Synchronisationssignalen (59) ein Ortsinformation vom Scanner sowie in Form von weiteren Synchronisationspulsen (56) eine Zeitinformation zu den Laserlichtpulsen der Pulssequenzen die durch den Pulsmustergenerator (53) ausgelöst werden. Der Pulsmustergenerator (53) erzeugt insbesondere die in 1 und 2 dargestellten Pulsmuster und Pulssequenzen mit hoher zeitlicher Präzision und führt diese als Triggerpulse (54) der Anregungslichtquelle (39) und als Triggerpulse (55) der Manipulationslichtquelle (41) zu. Der Pulsmustergenerator (53) kann entweder als eigenständige Einheit oder als Baugruppe einer Anregungslichtquelle (39) oder der Manipulationslichtquelle (41) ausgeführt werden. Zur Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes wird entweder die Probe (46) oder das Anregungs- und Manipulationslicht (40), (42) relativ zum Untersuchungsvolumen schrittweise bewegt und somit ein Bereich auf oder in der Probe abgerastert. Ein hierzu benötigter Scanner, der entweder die Probe bewegt oder beispielsweise mittels Objektiv-Scanning oder Strahl-Scanning das Untersuchungsvolumen in der Probe in den Richtungen x, y, z bewegt ist durch die Pfeile (57) schematisch angedeutet. 7 :
7 , shows a fluorescence light microscope ( 58 ) according to a possible embodiment of the present invention for any type of fluorescence microscopy, in particular for STED microscopy. The microscope ( 58 ) can be used for image capture and FCS. The sample ( 46 ) with excitation light ( 40 ) from the excitation light source ( 39 ) illuminated. The excitation light ( 40 ) is transmitted via the dichroic beam splitter ( 47 ) to the lens ( 45 ) and with this to the test ( 46 ) focused diffraction-limited. In addition, the sample ( 46 ) with manipulation light ( 42 ) from the manipulation light source ( 39 ) illuminated. The focal points of the focused illumination patterns of excitation light ( 40 ) and manipulation light ( 42 ) in the sample ( 46 ) in one point together. In the present example of a STED microscope, the manipulation light is used for STED and with an optional structuring element (FIG. 43 ) changed. For STED, for example, the structuring element ( 43 ) the wavefronts of the manipulation light ( 42 ) such that when focusing with the lens ( 45 ) the STED typical annular illumination pattern in the sample ( 46 ). With the structuring element ( 43 ), the wavefronts of the manipulation light beam can be changed differently in parts, for example, executed as a phase plate or as a spatial light modulator (SLM). The dichroic beam splitter ( 44 ) reflects the manipulation light ( 42 ) to the lens ( 45 ), but is for the excitation laser light ( 40 ) and the fluorescent light ( 50 ) at least substantially transparent. The optional structuring element ( 43 ) can either be between manipulation lasers ( 41 ) and the beam splitter ( 44 ), or between the beam splitter ( 44 ) and the lens ( 45 ). In the latter case, the structuring element ( 43 ) designed such that it only the manipulation light ( 42 ) but changes the excitation laser light ( 40 ) leaves unchanged. From the sample ( 46 ) emitted photons are with the lens ( 45 ) and then pass through the structuring element ( 43 ), as well as the dichroic beam splitters ( 44 ) and ( 47 ). In the case of a STED microscope, this is fluorescent light ( 50 ) after spatial filtering through a pinhole ( 48 ) and spectral filtering by appropriate filters ( 49 ) to a detector ( 51 ) falls. The detector ( 51 ) is able to detect individual photons with time resolution. The data of the detected photons are from this to a data acquisition electronics with time resolution ( 52 ) to hand over. This data acquisition electronics ( 52 ) also receives in the form of synchronization signals ( 59 ) location information from the scanner as well as in the form of further synchronization pulses ( 56 ) a time information to the laser light pulses of the pulse sequences by the pulse pattern generator ( 53 ) to be triggered. The pulse pattern generator ( 53 ) generates in particular the in 1 and 2 shown pulse pattern and pulse sequences with high temporal precision and leads them as trigger pulses ( 54 ) of the excitation light source ( 39 ) and as trigger pulses ( 55 ) of the manipulation light source ( 41 ) too. The pulse pattern generator ( 53 ) can either be used as a separate unit or as an assembly of an excitation light source ( 39 ) or the manipulation light source ( 41 ). To take a two-dimensional image, either the sample ( 46 ) or the excitation and manipulation light ( 40 ) 42 ) is moved stepwise relative to the examination volume, thus scanning an area on or in the sample. A scanner required for this purpose, which either moves the sample or, for example by means of lens scanning or beam scanning, moves the examination volume in the sample in the directions x, y, z through the arrows (FIG. 57 ) indicated schematically.

BezugszeichenlisteLIST OF REFERENCE NUMBERS

11
Anregungspulsexcitation pulse
22
Manipulationspulsmanipulation pulse
33
Pulssequenzpulse sequence
44
Pulsmuster 1Pulse pattern 1
55
Pulsmuster 2Pulse Pattern 2
66
Pulsmuster 3Pulse pattern 3
77
Lichteinkopplung einer generierten PulssequenzLight coupling of a generated pulse sequence
88th
konfokales Mikroskop mit Probe und zeitaufgelöster DatenerfassungConfocal microscope with sample and time-resolved data acquisition
99
Bildgebende Messung: Punktmessung oder andere Messung unter Bewegung der Probe, des Objektivs oder des eingekoppelten LichtesImaging Measurement: Point measurement or other measurement with movement of specimen, lens, or injected light
1010
zeitaufgelöste Datenspeicherung incl. Speicherung der Position der beleuchteten Probe an Referenz-positionenTime-resolved data storage including storage of the position of the illuminated sample at reference positions
1111
Zeitaufgelöste Rekonstruktion der DetektorantwortTime-resolved reconstruction of the detector response
1212
zeitaufgeldste Bilder, Fluoreszenzkorrelationskurven, Fluoreszenzzerfälle, Antibunching-Messungen, Anisotropie-Messungen, spektrale Messungen bezogen auf jedes PulsmusterTime-lapse images, fluorescence correlation curves, fluorescence decays, anti-punching measurements, anisotropy measurements, spectral measurements related to each pulse pattern
1313
Optional: Verrechnung des Detektorsignals nach einer Pulsfolge mit dem Signal nach einer anderen PulsfolgeOptional: offsetting of the detector signal after a pulse sequence with the signal after another pulse sequence
1414
z. B. STED-Bild mit verbesserter Auflösungz. B. STED image with improved resolution
15 15
Diffusionszeiten in Abwesenheit der STED-ManipulationDiffusion times in the absence of STED manipulation
1616
Diffusionszeiten in Anwesenheit der STED-ManipulationDiffusion times in the presence of STED manipulation
1717
axialer Schnitt durch die Strahltaille der fokussierten Anregungaxial section through the beam waist of the focused stimulation
1818
effektiver Anregungsbereicheffective excitation area
1919
Fluorophor außerhalb des AnregungsbereichsFluorophore outside the excitation range
2020
Diffusionspfad des FluorophorsDiffusion path of the fluorophore
2121
fluoreszierender Fluorophor im effektiven Anregungsbereichfluorescent fluorophore in the effective excitation range
2222
axialer Schnitt durch die in dieser Darstellung doppelte Strahltaille des Manipulationslasersaxial section through the double beam waist of the manipulation laser in this illustration
2323
Überlapp zwischen Anregungs- und ManipulationslaserOverlap between excitation and manipulation lasers
2424
Anregungslaser ohne überlappenden ManipulationslaserExcitation laser without overlapping manipulation laser
2525
verkleinertes effektives Anregungsvolumenreduced effective excitation volume
2626
Zeitfenster für die konfokale Auswertung (ohne STED Laser)Time window for the confocal evaluation (without STED laser)
2727
Zeitfenster für die STED-Auswertung (mit drei verschiedenen STED Laserleistungen)Time window for the STED evaluation (with three different STED laser powers)
2828
Fluoreszenzzerfall für STED-Laserleistung = 0 mWFluorescence decay for STED laser power = 0 mW
2929
Fluoreszenzzerfall für STED-Laserleistung = 1.3 mWFluorescence decay for STED laser power = 1.3 mW
3030
Fluoreszenzzerfall für STED-Laserleistung = 20 mWFluorescence decay for STED laser power = 20 mW
3131
Korrelationskurve für STED-Leistung = 0 mWCorrelation curve for STED power = 0 mW
3232
Korrelationskurve für STED-Leistung = 1.3 mWCorrelation curve for STED power = 1.3 mW
3333
Korrelationskurve für STED-Leistung = 20 mWCorrelation curve for STED power = 20 mW
3434
Lage des ausgewählten IntensitätsquerschnittsLocation of the selected intensity cross section
3535
Intensitätsquerschnitt bei Anregung ohne STEDIntensity cross section at excitation without STED
3636
Gaussfit an (35) (Halbwertsbreite = 270 nm)Gauss fit on ( 35 ) (Half width = 270 nm)
3737
Intensitätsquerschnitt mit zusätzlicher STED-BeleuchtungIntensity cross section with additional STED illumination
3838
Lorentzfit an (37) (Halbwertsbreite = 17 nm)Lorentzfit on 37 ) (Half width = 17 nm)
3939
AnregungslichtquelleExcitation light source
4040
Anregungslichtexcitation light
4141
ManipulationslichtquelleManipulating light source
4242
Manipulationslichtmanipulating light
4343
Strukturierungselementstructuring element
4444
dichroitischer Strahlteilerdichroic beam splitter
4545
Objektivlens
4646
Probesample
4747
dichroitischer Strahlteilerdichroic beam splitter
4848
Pinholepinhole
4949
Filterfilter
5050
Fluoreszenzlichtfluorescent light
5151
Detektordetector
5252
Datenerfassungselektronik mit ZeitauflösungData acquisition electronics with time resolution
5353
PulsmustergeneratorPulse pattern generator
5454
Triggerpulsetrigger Pulse
5555
Triggerpulsetrigger Pulse
5656
Synchronisationspulsesynchronization pulses
5757
Proben- oder StrahlscannerSample or beam scanner
5858
Mikroskopmicroscope
5959
räumliche Synchronisationssignale (x, y, z)spatial synchronization signals (x, y, z)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG QUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

  • Ringemann et al., New J. of Physics, 11, 103054 (2009) [0035] Ringemann et al., New J. of Physics, 11, 103054 (2009) [0035]
  • Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829–837 (2001) [0035] Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829-837 (2001) [0035]
  • Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429–440 (2007) [0035] Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429-440 (2007) [0035]
  • Ries et al, Biophys. J. 96, 1999–2008 (2009) [0035] Ries et al, Biophys. J. 96, 1999-2008 (2009) [0035]
  • Digman et al, Biophys. J. 88, 133–136 (2005) [0035] Digman et al, Biophys. J. 88, 133-136 (2005) [0035]

Claims (23)

Mikroskopieverfahren zum wiederholten gepulsten Anregen einer Probe mit einem ersten Laserlichtpuls und einem von dem ersten Laserlichtpuls verschiedenen zweiten Laserlichtpuls, aufweisend die folgenden Schritte: • Bereitstellen einer Probe, aufweisend zumindest einen Fluorophor, wobei der mindestens eine Fluorophor in zumindest einem Zustand mit dem ersten und/oder dem zweiten Laserlichtpuls wechselwirken kann, • Beleuchten der Probe mit einer Pulssequenz aufweisend zumindest ein erstes Pulsmuster und ein vom ersten Pulsmuster zeitlich disjunktes zweites Pulsmuster, wobei das erste Pulsmuster den ersten Laserlichtpuls enthält, und wobei das zweite Pulsmuster den ersten und den zweiten Laserlichtpuls enthält, • zeitaufgelöstes, und mit dem ersten und zweiten Pulsmuster zeitkorreliertes Erfassen der von der Probe stammenden Photonen, die aus dem Wechselwirken des ersten Laserlichtpulses und/oder des zweiten Laserlichtpulses mit der Probe erzeugt werden.A microscopy method for repetitively pulsing a sample with a first laser light pulse and a second laser light pulse different from the first laser light pulse, comprising the following steps: Providing a sample comprising at least one fluorophore, wherein the at least one fluorophore can interact in at least one state with the first and / or the second laser light pulse, Illuminating the sample with a pulse sequence having at least a first pulse pattern and a second pulse pattern temporally disjoint from the first pulse pattern, wherein the first pulse pattern contains the first laser light pulse, and wherein the second pulse pattern contains the first and the second laser light pulse, Time-resolved, and with the first and second pulse pattern time-correlated detection of the photon originating from the sample, which are generated from the interaction of the first laser light pulse and / or the second laser light pulse with the sample. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Pulssequenz ein drittes Pulsmuster aufweist, wobei das dritte Pulsmuster vom ersten und vom zweiten Pulsmuster disjunkt ist, und wobei das dritte Pulsmuster den zweiten Laserlichtpuls enthält.Microscopy method according to claim 1, characterized in that the pulse sequence has a third pulse pattern, wherein the third pulse pattern of the first and the second pulse pattern is disjoint, and wherein the third pulse pattern includes the second laser light pulse. Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste, zweite und/oder dritte Pulsmuster eine zeitliche Dauer von 1 ns bis 5000 ns aufweist, wobei insbesondere die zeitliche Dauer im Bereich von 10 ns bis 100 ns liegt.Microscopy method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the first, second and / or third pulse pattern has a time duration of 1 ns to 5000 ns, wherein in particular the time duration is in the range of 10 ns to 100 ns. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Pulssequenz mit einer Wiederholrate im Bereich von 10 kHz bis 100 MHz wiederholt wird.Microscopy method according to one of the preceding claims, characterized in that the pulse sequence is repeated at a repetition rate in the range of 10 kHz to 100 MHz. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste, zweite und/oder dritte Pulsmuster einen vom ersten und zweiten Laserlichtpuls unterschiedlichen dritten Laserlichtpuls aufweist, oder wobei die Pulssequenz ein viertes Pulsmuster aufweist das den dritten Laserlichtpuls enthält wobei insbesondere die aus dem Wechselwirken des dritten Laserlichtpulses mit der Probe erzeugten Photonen zeitaufgelöst und mit der Pulssequenz zeitkorreliert zusätzlich erfasst werden.Microscopy method according to one of the preceding claims, characterized in that the first, second and / or third pulse pattern has a different from the first and second laser light pulse third laser light pulse, or wherein the pulse sequence has a fourth pulse pattern containing the third laser light pulse in particular those from the interaction the third laser light pulse generated with the sample photons are time-resolved and additionally correlated with the pulse sequence time correlated. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Laserlichtpuls ein Anregungspuls ist, welcher so beschaffen ist, dass er von dem Fluorophor absorbierbar ist, wobei der erste Laserlichtpuls insbesondere weiterhin so beschaffen ist, dass er von einem Grundzustand des Fluorophors absorbierbar ist, wobei insbesondere der Fluorophor durch den Anregungspuls von dem Grundzustand des Fluorophors in einen ersten angeregten Zustand versetzbar ist.Microscopy method according to one of the preceding claims, characterized in that the first laser light pulse is an excitation pulse, which is adapted to be absorbed by the fluorophore, wherein the first laser light pulse, in particular, is further such that it is absorbable from a ground state of the fluorophore In particular, the fluorophore is displaceable by the excitation pulse from the ground state of the fluorophore to a first excited state. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Laserlichtpuls ein Anregungspuls ist, der so beschaffen ist, dass er den Fluorophor von einem energetisch höheren Zustand des Fluorophors in einen energetisch niedrigeren Zustand überführen kann, wobei insbesondere der energetisch höhere Zustand der erste angeregte Zustand des Fluorophors ist, und wobei insbesondere der energetisch niedrigere Zustand der Grundzustand des Fluorophors ist, und wobei insbesondere der Abregungspuls dazu geeignet ist, den Fluorophor über stimulierte Emission abzuregen.Microscopy method according to one of the preceding claims, characterized in that the second laser light pulse is an excitation pulse which is such that it can convert the fluorophore of an energetically higher state of the fluorophore in a lower energy state, in particular the higher energy state of the first excited state of the fluorophore, and in particular the energetically lower state is the ground state of the fluorophore, and in particular the de-excitation pulse is adapted to de-excite the fluorophore via stimulated emission. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erfassten Photonen demjenigen Pulsmuster zugeordnet werden, welches den Laserlichtpuls enthält, der das jeweilige erfasste Photon, insbesondere zumindest statistisch betrachtet, verursacht hat.Microscopy method according to one of the preceding claims, characterized in that the detected photons are assigned to that pulse pattern which contains the laser light pulse which has caused the respective detected photon, in particular at least statistically. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass • ein erster Datensatz aus den Daten der dem ersten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt wird, und/oder • ein zweiter Datensatz aus den Daten der dem zweiten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt wird, und/oder • insbesondere ein dritter Datensatz aus den Daten der dem dritten Pulsmuster zugeordneten Photonen erstellt wird.Microscopy method according to claim 8, characterized in that • a first data set is created from the data of the first pulse pattern associated photons, and / or • a second data set from the data of the second pulse pattern associated photons is created, and / or • in particular third data set is created from the data of the third pulse pattern associated photons. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Datensatz dazu verwendet wird, einen Einfluss des zweiten Pulsmusters, insbesondere des zweiten Laserlichtpulses, auf eine Verteilung der Photonen des zweiten Datensatzes zu ermitteln und insbesondere den zweiten Datensatz zu filtern, so dass bei einer weiteren Verarbeitung des zweiten Datensatzes nur die gefilterten Daten berücksichtigt werden.Microscopy method according to claim 9, characterized in that the first data set is used to determine an influence of the second pulse pattern, in particular of the second laser light pulse on a distribution of the photons of the second data set and in particular to filter the second data set, so that in another Processing of the second record only the filtered data are taken into account. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Auswertung des ersten Datensatzes eine Verfälschung des zweiten Datensatzes – aufgrund eines durch den zweite Laserlichtpuls hervorgerufenen, insbesondere irreversiblen, Photobleichens des Fluorophors – ermittelt und ausgeschlossen wird.Microscopy method according to claim 9 or 10, characterized in that by the evaluation of the first data set a falsification of the second data set - due to a caused by the second laser light pulse, in particular irreversible, photobleaching of the fluorophore - is determined and excluded. Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Datensatz dazu verwendet wird, Fluorophore der Probe zu identifizieren, die während der Beleuchtung der Probe mit der Pulssequenz in einen Dunkelzustand übergegangen sind.Microscopy method according to one of claims 9, 10 or 11, characterized in that the first set of data is used to identify fluorophores of the sample that have turned to a dark state during illumination of the sample with the pulse sequence. Computerprogramm, aufweisend einen Programmcode zur Durchführung des Mikroskopieverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wenn das Computerprogramm durch einen Computer ausgeführt wird.A computer program comprising a program code for performing the microscopy method according to any one of claims 1 to 12, when the computer program is executed by a computer. Ein konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) bestehend aus: a. einer gepulsten Anregungslichtquelle (39), die Pulse von Anregungslicht (40) auf eine Probe (46) aufbringt, wobei das Anregungslicht (40) auf mindestens einen Fokusbereich fokussiert wird und so die in der Probe (46) enthaltende Fluorophore zu einer Fluoreszenz anregt, b. einer weiteren Lichtquelle, der sogenannten Manipulationslichtquelle (41), die Manipulationslicht (42) auf die Probe (46) aufbringt, wobei das Manipulationslicht (42) die angeregten Fluorophore in deren photophysikalischen Zuständen verändert, c. einem Detektor (51), der von den angeregten Fluorophoren in der Probe (46) emittiertes Fluoreszenzlicht (50) nach jedem Puls des Anregungslichts (40) und/oder des Manipulationslichts (42) registriert; d. wobei die Anregungslichtquelle (39) bzw. die Manipulationslichtquelle (41) von dem Pulsmustergenerator (53) getriggert werden dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (51) das von den angeregten Fluorophoren emittierte Fluoreszerizlicht (50) mit zeitlicher Auflösung auch zu den Synchronisationspulsen (56) des Pulsmustergenerators (53) registriert.A Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) consisting of: a. a pulsed excitation light source ( 39 ), the pulses of excitation light ( 40 ) to a sample ( 46 ), the excitation light ( 40 ) is focused on at least one focus area and so in the sample ( 46 containing fluorophores to fluoresce, b. another light source, the so-called manipulation light source ( 41 ), the manipulation light ( 42 ) to the test ( 46 ), whereby the manipulation light ( 42 ) alters the excited fluorophores in their photophysical states, c. a detector ( 51 ), which depends on the excited fluorophores in the sample ( 46 ) emitted fluorescent light ( 50 ) after every pulse of the excitation light ( 40 ) and / or the manipulation light ( 42 ) registered; d. wherein the excitation light source ( 39 ) or the manipulation light source ( 41 ) from the pulse pattern generator ( 53 ) are characterized in that the detector ( 51 ) the fluorescent light emitted by the excited fluorophores ( 50 ) with temporal resolution also to the synchronization pulses ( 56 ) of the pulse pattern generator ( 53 ) registered. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (51) das von den angeregten Fluorophoren emittierte Fluoreszenzlicht (50) mit einer zeitlichen Auflösung registriert, die besser als 1000 ps, bevorzugt besser 500 ps, bevorzugt besser 250 ps, bevorzugt besser 150 ps ist und gleichzeitig eine Trennung der von den einzelnen Lichtquellen stammenden Signale ermöglicht.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to claim 14, characterized in that the detector ( 51 ) the fluorescent light emitted by the excited fluorophores ( 50 ) registers with a temporal resolution better than 1000 ps, preferably better 500 ps, preferably better 250 ps, preferably better 150 ps and at the same time allows a separation of the signals coming from the individual light sources. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) gemäß Anspruch 15, wobei die Datenerfassungselektronik (52) eine zeitliche Auflösung besitzt von besser 1000 ps, bevorzugt besser 500 ps, bevorzugt besser 250 ps, bevorzugt besser 100 ps, bevorzugt besser 50 ps, bevorzugt besser 25 ps, bevorzugt besser 5 ps, bevorzugt besser 0,5 ps.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to claim 15, wherein the data acquisition electronics ( 52 ) has a time resolution of better 1000 ps, preferably better 500 ps, preferably better 250 ps, preferably better 100 ps, preferably better 50 ps, preferably better 25 ps, preferably better 5 ps, preferably better 0.5 ps. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (51) einen Einzelphotonenzähler aufweist.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to one of claims 14 to 16, characterized in that the detector ( 51 ) has a single photon counter. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Datenerfassungselektronik (52) als zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung ausgebildet ist.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) According to one of claims 14 to 17, characterized in that the data acquisition electronics ( 52 ) is designed as time-correlated single photon counting. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung im sogenannten Time Tagged Time Resolved Regime oder List Mode oder BIFL Mode arbeitet.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to claim 18, characterized in that the time-correlated single photon counting works in the so-called Time Tagged Time Resolved Regime or List Mode or BIFL Mode. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als ein Detektor (51) verwendet wird.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to one of claims 14 to 19, characterized in that more than one detector ( 51 ) is used. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Scanner (57) zum Abtasten der Probe (46) mit dem fokussierten Anregungslicht (40) von der Anregungslichtquelle (39) und des damit überlappenden Manipulationslichts (42) von der Manipulationslichtquelle (41) aufweist.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to one of claims 14 to 20, characterized in that it has a scanner ( 57 ) for sampling the sample ( 46 ) with the focused excitation light ( 40 ) from the excitation light source ( 39 ) and the overlapping manipulation light ( 42 ) from the manipulation light source ( 41 ) having. Konfokales Fluoreszenzlichtmikroskop (58) nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass es als STED-Mikroskop ausgebildet ist.Confocal Fluorescence Light Microscope ( 58 ) according to one of claims 14 to 21, characterized in that it is designed as a STED microscope. Vorrichtung gemäß der Ansprüche 14 bis 22 die eine Datenauswertevorrichtung gemäß der Ansprüche 1–13 enthält.Device according to claims 14 to 22, containing a data evaluation device according to claims 1-13.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020113998A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Method, computer program and device for determining positions of molecules in a sample
CN116745678A (en) * 2021-01-13 2023-09-12 阿贝锐纳仪器有限公司 Method and apparatus for high resolution localization of single dye molecules in multiple spatial directions

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3159676B1 (en) * 2015-10-23 2018-04-04 Abberior Instruments GmbH Method and device for high precision imaging of a structure of a sample marked with fluorescence markers
DE102017108834A1 (en) 2017-04-25 2018-10-25 Leica Microsystems Cms Gmbh Microscope, in particular confocal or light-sheet microscope, with arbitrarily programmable laser pulse sequence and method thereof
DE102019110160B4 (en) * 2019-04-17 2023-07-27 Leica Microsystems Cms Gmbh Fluorescence microscope and method of imaging a sample
DE102020134797B3 (en) 2020-12-23 2022-06-09 Abberior Instruments Gmbh Method for imaging a structure of interest in a sample and a microscope with an array detector for carrying it out
DE102022112384B4 (en) 2022-05-17 2024-02-29 Abberior Instruments Gmbh METHOD, LIGHT MICROSCOPE AND COMPUTER PROGRAM FOR SETTING A TIME DELAY BETWEEN LIGHT PULSES

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Digman et al, Biophys. J. 88, 133–136 (2005)
Dittrich P, Schwille P, Appl. Phys. B, 73, 829–837 (2001)
Ries et al, Biophys. J. 96, 1999–2008 (2009)
Widengren et al., J. Phys. Chem. 111, 429–440 (2007)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020113998A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Abberior Instruments Gmbh Method, computer program and device for determining positions of molecules in a sample
CN116745678A (en) * 2021-01-13 2023-09-12 阿贝锐纳仪器有限公司 Method and apparatus for high resolution localization of single dye molecules in multiple spatial directions

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