DE102009056468A1

DE102009056468A1 - Rührorgan für Milliliter-Bioreaktoren

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Publication number: DE102009056468A1
Application number: DE102009056468A
Authority: DE
Inventors: Ralf Dipl.-Ing. Hortsch; Dirk Prof. Dr.-Ing. Weuster-Botz
Original assignee: Technische Universitaet Muenchen
Current assignee: Technische Universitaet Muenchen
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2009-12-01
Publication date: 2011-06-09

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Rührorgan für einen Milliliter-Bioreaktor, einen mit einem solchen Rührorgan ausgestatteten Milliliter-Bioreaktor sowie ein Verfahren zum Kultivieren eines Kulturmediums unter Verwendung des erfindungsgemäßen Rührorgans. Die Erfindung ermöglicht besonders vorteilhaft einen sehr guten Eintrag von Gas in ein Kulturmedium.

Description

Die Erfindung betrifft ein Rührorgan für einen Milliliter-Bioreaktor, einen mit einem solchen Rührorgan ausgestatteten Milliliter-Bioreaktor sowie ein Verfahren zum Kultivieren eines Kulturmediums unter Verwendung des erfindungsgemäßen Rührorgans. Die Erfindung ermöglicht besonders vorteilhaft einen sehr guten Eintrag von Gas in ein Kulturmedium.
Der klassische Parallelreaktor zur Kultivierung von Zellen im Millilitermaßstab ist der Schüttelkolben, mit dem seit dem letzten Jahrhundert Versuche im Parallelansatz durchgeführt werden. Hierbei werden Schüttelkolben auf Schütteltablaren untergebracht und mit einer bestimmten Schüttelfrequenz in eine Rotationsbewegung mit gegebener Exzentrizität versetzt. Durch die Bewegung der Reaktionsgefäße erfolgt eine Durchmischung der in den Reaktionsgefäßen enthaltenen Flüssigkeit. Nachteilig bei derartigen Schüttelrecktoren ist jedoch, dass, wenn die biochemische Reaktion den Eintrag von Sauerstoff aus der Gasphase in die Flüssigphase erfordert, die Reaktionsgefäße für sehr kleine Flüssigkeitsvolumina von beispielsweise 10 bis 20 ml sehr groß gewählt werden müssen (beispielsweise 1 bis 2 l Volumen).
Die WO 2004/058935 beschreibt einen Bioreaktor, bei welchem eine Vielzahl von Flüssigkeitsvolumina parallel verarbeitet werden können und bei welchem ein relativ hoher Gaseintrag in die Flüssigphase bei kleinen Abmessungen des Reaktionsgefäßes möglich ist. Es kommt hier ein magnetisch angetriebenes Gas-induziertes Rührorgan zum Einsatz. Der Einsatz optischer Sensoren für pH und pO₂, sowie die Möglichkeit der pH-Regulierung, Substratdosierung und Probennahme mit einem Pipettierroboter ermöglicht die Durchführung von Kultivierungen unter Betriebsbedingungen vergleichbar mit klassischen Rührreaktoren.
Insbesondere bei der Kultivierung morphologisch veränderbarer Mikroorganismen ergeben sich in diesem System jedoch zahlreiche Probleme. Der in der genannten Veröffentlichung beschriebene Rührer verursacht relativ hohe Leistungseinträge von ca. 22 WL^–1 und große lokale maximale Energiedissipationen. Dies ist jedoch bei der Kultivierung morphologisch veränderlicher Mikroorganismen problematisch, da deren Produktbildung stark von der Morphologie abhängt. Zu große lokale Kräfte können daher die Mikroorganismen schädigen und u. U. sogar zu deren Absterben führen. Ein weiteres Problem der in der genannten Veröffentlichung beschriebenen Reaktorsysteme ist das dort auftretende starke Wandwachstum. Durch das ungünstige Verhältnis von Oberflächen zu Volumen (das Verhältnis Höhe zu Durchmesser ist größer als 4), sowie durch die turbulente aber ebenmäßige Flüssigkeitsoberfläche kommt es zum Wachstum erheblicher Teile der Biomasse an der Reaktorwand. Da derartige Biomasse nicht unter definierten Bedingungen submers kultiviert wird, verfälscht sie das Prozessergebnis sehr stark.
Weitere Probleme ergeben sich bei dem in der genannten Veröffentlichung beschriebenen Rührorgan bezüglich des Sauerstoffeintrages, da bei der Kultivierung beispielsweise von mycelbildenden Mikroorganismen fast immer eine starke Erhöhung der Viskosität des Kulturmediums auftritt, wobei strukturviskoses Verhalten vorliegt. Hierdurch kommt es zur Limitation des Stofftransportes von der Gas- in die Flüssigphase und außerdem zu Problemen bei der Homogenisierung. Der Gasblaseneintrag nimmt mit steigender Viskosität des Kulturmediums stark ab. Dadurch kommt es zu einem starken Abfall des k_La-Wertes und daher zu einer Sauerstofflimitierung der Mikroorganismen. Das in der WO 2004/058935 beschriebene Bioreaktorsystem eignet sich daher nicht zur Kultivierung morphologisch veränderlicher Mikroorganismen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Rührorgan für Milliliter-Bioreaktoren, einen hiermit ausgestatteten Milliliter-Bioreaktor sowie ein Verfahren zum Kultivieren von Kulturmedien anzugeben, welche die oben genannten Probleme überwinden und insbesondere erlauben, auch morphologisch veränderbare Mikroorganismen im Milliliter-Maßstab zu kultivieren, wobei vorteilhaft ein guter Gaseintrag in das Kulturmedium erzielt wird.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Rührorgan nach Anspruch 1, den Milliliter-Bioreaktor nach Anspruch 10, das Milliliter-Bioreaktorsystem nach Anspruch 15, das Verfahren zum Kultivieren eines Kulturmediums nach Anspruch 16, sowie durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Milliliter-Bioreaktors nach Anspruch 22. Die jeweiligen abhängigen Ansprüche geben vorteilhafte Weiterbildungen des Rührorgans, des Milliliter-Bioreaktors und des Verfahrens an.
Erfindungsgemäß wird ein Rührorgan für einen Milliliter-Bioreaktor angegeben, das zumindest ein flächiges Rührpaddel sowie zumindest eine Achsenanordnungsvorrichtung aufweist. Das Rührorgan ist für Milliliter-Bioreaktoren geeignet. Die Achsenanordnungsvorrichtung, an welcher eine Drehachse anordenbar ist, um welche das Rührorgan gedreht werden kann, ist so ausgebildet, dass die Drehachse parallel zur Fläche des Rührpaddels angeordnet werden kann. Das Rührorgan ist relativ zu dem Bioreaktor so ausgebildet, dass mit ihm in einem Bioreaktor eine Flüssigkeitslamelle erzeugbar ist.
Eine Flüssigkeitslamelle entsteht, wenn durch das Rührorgan ein Teil des zu rührenden Flüssigkeitsvolumens oder das gesamte Flüssigkeitsvolumen vor dem Paddel hergeschoben wird. Bei hinreichend hohen Rührerdrehzahlen bildet sich eine Flüssigkeitsoberfläche aus, die näherungsweise die Form eines Ausschnittes aus einem Rotationsparaboloid hat. Eine Flüssigkeitslamelle im Sinne der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass sie zu einem Betrachtungszeitpunkt nicht symmetrisch zur Rührachse ist. Normalerweise verstärkt sich die Asymmetrie mit zunehmender Rührerdrehzahl. Es wird also ein unsymmetrisches Flüssigkeitsvolumen im Bioreaktor zum größten Teil vor dem Rührer her geschoben. Lediglich durch die Trägheit bleibt an der dem Rührer gegenüberliegenden Wandseite ein Teil der Flüssigkeit haften, bis diese wieder vom Rührer erfasst wird.
Die Flüssigkeitslamelle ermöglicht unter anderem deshalb einen besseren Gaseintrag, weil hier ein deutlich größeres Oberflächen/Volumen-Verhältnis erzeugt wird und daher auch mehr Gas über die Flüssigkeits Oberfläche eingetragen wird. Der Grund hierfür ist, dass bei der Lamelle die gesamte Flüssigkeit asymmetrisch in Rotation versetzt wird und daher eine große Stoffaustauschfläche gas-flüssig entsteht. Bei einer Trombe ist diese Stoffaustauschfläche viel kleiner, da durch ein vollständig eintauchendes Rührorgan die Flüssigkeitsoberfläche bei zunehmender Rührgeschwindigkeit in Richtung des Rührorgans „gezogen” wird und damit immer nur ein geringer Teil der Flüssigkeit mit der Gasphase in Kontakt steht.
Die Flüssigkeitslamelle im Sinne der Erfindung ist von einer Trombe zu unterscheiden, wie er in herkömmlichen Bioreaktoren erzeugt wird. Eine Trombe ist im Normalfall achsensymmetrisch zur Rotationsachse. Seine Form entspricht in etwa einem Rotationsparaboloiden, dessen Symmetrieachse im Wesentlichen mit der Drehachse übereinstimmt. Entscheidender Vorteil der Flüssigkeitslamelle gegenüber einer Trombe ist, dass bei einer Flüssigkeitslamelle deutlich mehr Gas über die Flüssigkeitsoberfläche in das Kulturmedium eingetragen werden kann als bei der Trombe.
Erfindungsgemäß kann die Flüssigkeitslamelle auf verschiedene Weise erzeugt werden. Zum einen ist das Rührpaddel so auszustalten, dass mit ihm eine Flüssigkeitslamelle erzeugbar ist. Hierbei kommt es vor allem auf die Ausgestaltung relativ zum Reaktionsgefäß des Bioreaktors an. So ist beispielsweise eine zur Form des Reaktionsgefäßes korrespondierende Form des Rührorgans vorteilhaft. Weiter ist das Rührorgan in Abmessungen und Geometrie vorzugsweise so ausgestaltet, dass seine Außenkante nahe an der Wand des Reaktionsgefäßes umläuft. Wie die genaue Ausgestaltung des Rührpaddels aussieht, hängt von der Form des verwendeten Reaktionsgefäßes des Bioreaktors ab. Im einfachsten Fall kann der Bioreaktor ein herkömmlicher Bioreaktor sein. Es braucht dann nur ein entsprechend ausgestaltetes Rührorgan in diesem Reaktor eingebracht zu werden, um eine Flüssigkeitslamelle erzeugen zu können.
Vorteilhaft kann aber auch ein Rührpaddel mit einem geeignet ausgestalteten Bioreaktor eingesetzt werden, die aufeinander abgestimmt sind.
Grundsätzlich ist es bekannt, in klassischen Bioreaktoren ein zu kultivierendes Medium mit Schaufeln zu rühren. Die vorgeschlagenen Formen, Geometrien und Abmessungen waren jedoch durchgehend nicht geeignet, um eine Flüssigkeitslamelle zu erzeugen.
Ein Rühren dergestalt, dass sich eine Flüssigkeitslamelle ausbildet, hat sich überraschenderweise vor allem in Milliliter-Bioreaktoren als äußerst vorteilhaft erwiesen. Wie bereits oben beschrieben, besteht in Milliliter-Bioreaktoren in besonderem Ausmaß das Problem, einen hinreichenden Gasaustausch über die Flüssigkeitsoberfläche zu gewährleisten. Es wurden daher bisher für Milliliter-Bioreaktoren mit Volumen von weniger als 1000 ml stets besonders ausgestaltete Rührorgane eingesetzt, die den Gaseintrag ins Kulturmedium unterstützen konnte.
Paddelförmige Rührorgane sind für Milliliter-Bioreaktoren grundsätzlich ungeeignet, wenn sie nicht wie entsprechend der vorliegenden Erfindung so ausgestaltet sind, dass sie eine Flüssigkeitslamelle erzeugen. Da paddelförmige Rührorgane bisher stets zur Erzeugung von thrombusförmigen Flüssigkeitsoberflächen verwendet wurden, die nur bei hinreichend großen Bioreaktoren mit Volumina von mehreren Litern sinnvoll sind, wurden paddelförmige Rührorgane im Bereich von Milliliter-Bioreaktoren bisher nicht eingesetzt.
Nachteilig an einer Trombenbegasung ist unter anderem, dass sie deutlich geringere Sauerstoffübergangswerte als das erfindungsgemäße Rührorgan erreicht. Darüberhinaus bildet sich eine Trombe nur bei hohen Rührgeschwindigkeiten, was bedeutet, dass ein hoher Leistungseintrag stattfindet. Dieser sollte jedoch vorzugsweise vermieden werden.
Im Folgenden soll dargelegt werden, wie durch Ausgestaltung des Rührorgans bzw. des Bioreaktors die erfindungsgemäßen Vorteile besonders vorteilhaft verwirklicht werden können.
Die Fläche des zumindest einen flächigen Rührpaddels ist vorzugsweise eben und es ist besonders bevorzugt, wenn die Achse in der durch die Fläche des Rührpaddels definierten Ebene liegt.
Besonders vorteilhaft ist ein Rührpaddel des Rührorgans, das eine der Drehachse zugewandte Innenkante und eine der Achse abgewandte Außenkante seiner Fläche aufweist, wobei die beiden Kanten parallel zueinander verlaufen. Bevorzugt verlaufen die Innenkante und die Außenkante von einer Oberkante der Fläche des Rührpaddels zu einer Unterkante dieser Fläche, wobei die Oberkante beim in einem Bioreaktor angeordneten Rührorgan einer Öffnung des Reaktionsgefäßes und die Unterkante des Rührpaddels einem Boden des Reaktionsgefäßes zugewandt ist.
Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn Außenkante und Innenkante des Rührpaddels eine unterschiedliche Länge haben. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Oberkante und/oder die Unterkante gerade sind. Bevorzugt sind auch die Innenkante und/oder die Außenkante gerade. Sind alle genannten Kanten gerade, hat also das Rührpaddel eine viereckige Form. Vorzugsweise sind gerade Kanten durchgehend gerade, also nicht unterbrochen und nicht mit Einkerbungen oder dergleichen versehen, da hierdurch ein inhomogener Energieeintrag entsteht.
Vorzugsweise verläuft die Innenkante und/oder die Außenkante parallel zur Drehachse, wie sie in der Achsenaufnehmungsvorrichtung anordenbar ist. Insbesondere wenn das Rührorgan in zylindrischen Reaktionsgefäßen zum Einsatz kommen soll, ist diese Ausgestaltung von Vorteil.
Es ist außerdem bevorzugt, wenn die Unterkante des Paddels mit der Innenkante einen Winkel einschließt, der ungleich 90° ist. Vorteilhaft ist es hierbei, wenn dieser Winkel zwischen Unterkante und Innenkante, gemessen im Inneren der Fläche des Rührpaddels, kleiner ist als 90°, besonders bevorzugt kleiner als 70°, besonders bevorzugt kleiner als 60°, besonders bevorzugt ungefähr gleich 40°. Dieser Winkel ergibt sich als günstig, da somit ein achsensymmetrischer Einbau von, vorzugsweise sechs, Magneten möglich ist, so dass diese z. B. im Bioreaktor der WO 2004/058935 auf Höhe des Magnetantriebs sitzen können.
Vorteilhafterweise ist das Rührorgan so ausgestaltet, dass die Achse in der Achsenanordnungsvorrichtung außerhalb der Paddelfläche anordenbar ist. In diesem Fall dreht sich das Rührpaddel als ganzes um die Drehachse.
Das erfindungsgemäße Rührorgan kann ein, zwei oder mehrere Rührpaddel wie oben beschrieben aufweisen. Dabei ist es insbesondere möglich, dass mehrere Rührpaddel zusammen eine gemeinsame Achsenanordnungsvor richtung aufweisen.
Ist zu einem Rührpaddel kein um die Achse um 180° versetztes zweites Rührpaddel vorgesehen, so ist es vorteilhaft, wenn ein Gegengewicht vorgesehen wird, das auf jener dem Rührpaddel gegenüber liegenden Seite der Achse so angeordnet ist, dass das Rührorgan beim Drehen um die Drehachse nicht nutiert. Es kann hierdurch vermieden werden, dass auf die Drehachse Kräfte wirken, die senkrecht zur Drehachse stehen. Es kann also ein besonders gleichmäßiger Lauf erreicht werden.
Das Rührorgan kann über die Achse angetrieben werden. Vorteilhaft ist es aber auch, das Rührorgan magnetisch anzutreiben, beispielsweise mit jeweils drei auf einer Seite eingebrachten Magneten. Es können hierdurch auch herkömmliche Reaktorblöcke wie jener in der WO 2004/058935 beschriebene genutzt werden.
Bei dem verwendeten magnetischen Antrieb handelt es sich vorzugsweise um einen rotierenden magnetisch induktiven Magnetantrieb, wie er z. B. im Bioreaktorblock des Patentes WO 2004/058935 beschrieben ist; um die einzelnen Reaktoren herum angeordnete Spulen erzeugen hier ein rotierendes Magnetfeld, wobei durch vorzugsweise im Rührorgan eingebrachte Dauermagnete (z. B. Samarium-Cobalt Sm₂Co₁₇) dieses in Rotation versetzt wird.
Für die Abmessungen des Rührorgans ergeben sich folgende vorteilhafte Werte. Es ist bevorzugt, wenn die Außenkante der Fläche des Rührpaddels ≥ 1 cm, vorzugsweise ≥ 2 cm, besonders bevorzugt ≥ 3 cm lang ist und/oder ≤ 8 cm, bevorzugt ≤ 7 cm, besonders bevorzugt ≤ 6 cm, besonders bevorzugt ≤ 5 cm lang ist. Eine Breite des Rührpaddels zwischen dessen Innenkante und dessen Außenkante, vorzugsweise gemessen senkrecht auf Innenkante und Außenkante, wie auch ein Abstand zwischen Drehachse und Außenkante, kann vorzugsweise ≥ 0,2 cm, bevorzugt ≥ 0,3 cm, besonders bevorzugt ≥ 0,4 cm und/oder ≤ 2 cm, bevorzugt ≤ 1 cm, besonders bevorzugt ≤ 0,8 cm, besonders bevorzugt ≤ 0,6 cm und besonders bevorzugt ≤ 0,5 cm sein.
Erfindungsgemäß wird außerdem ein Milliliter-Bioreaktor angegeben, der zum einen zumindest ein Reaktionsgefäß aufweist, welches ein Volumen im Milliliter-Bereich hat, sowie zum anderen zumindest ein Rührorgan, wie es oben beschrieben wurde.
Reaktionsgefäße von Bioreaktoren, wie sie gemäß der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen, haben vorzugsweise Volumina ≤ 1000 ml, vorzugsweise ≤ 500 ml, vorzugsweise von ≤ 200 ml, besonders bevorzugt ≤ 100 ml, besonders bevorzugt ≤ 50, besonders bevorzugt ≤ 30 ml, besonders bevorzugt ≤ 20 ml, besonders bevorzugt ≤ 10 und/oder ≥ ml, besonders bevorzugt ≥ 5 ml. Derartige Bioreaktoren können als Milliliter-Bioreaktoren im Sinne der Erfindung angesehen werden.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn auch der Bioreaktor oder das Reaktionsgefäß so angepasst ist, dass es die Ausbildung der Flüssigkeitslamelle unterstützt. Die Geometrie herkömmlicher Bioreaktoren ist meistens so ausgelegt, dass das Verhältnis von Reaktorhöhe zu Reaktordurchmesser zwischen 2 und 3 liegt. In derartigen Reaktoren ist eine Flüssigkeitslamelle schwierig zu realisieren. Die Reaktoren sind im Normalfall zu niedrig für eine Flüssigkeitslamelle. Im erfindungsgemäßen Milliliter-Bioreaktor liegt das Verhältnis der Reaktorhöhe zum Reaktordurchmesser bzw. das Verhältnis der Höhe des Reaktionsgefäßes zum Durchmesser des Reaktionsgefäßes vorzugsweise bei > 3, besonders bevorzugt > 4 und/oder < 15, bevorzugt < 10. Derartige Bioreaktoren sind auch als Einwegartikel günstig produzierbar.
Vorteilhafterweise sind das Rührorgan und/oder das Reaktionsgefäß des Bioreaktors so ausgestaltet und aufeinander abgestimmt, dass ein Wandwachstum, Schaumbildung und/oder eine Ablagerung von Stoffen an der Reaktorwand vermieden werden. Dies wird vorteilhaft durch das erfindungsgemäße Rührorgan erreicht, wobei insbesondere günstig ist, wenn sich das Rührpaddel des Rührorgans nahe an der Wand des Reaktionsgefäßes bewegt. Auch die anderen vorteilhaften Ausgestaltungen des Rührorgans unterstützen die Vermeidung von Wandwachstum, Schaumbildung und Ablagerung.
Das Reaktionsgefäß ist vorzugsweise unbewehrt. Unbewehrte Reaktionsgefäße sind solche, die keine Strömungsbrecher aufweisen. Solche Strömungsbrecher würden die Ausbildung der Flüssigkeitslamelle erheblich erschweren. Bevorzugterweise weist also im erfindungsgemäßen Bioreaktor das Reaktionsgefäß keine Strömungsbrecher auf.
Der Einsatz von Reaktionsgefäßen ohne Strömungsbrecher ist für das Wirkprinzip des vorliegenden Rührorgans vorteilhaft, da in anderen Reaktionsgefäßen wahrscheinlich keine oder zumindest nur eine sehr eingeschränkte rotierende Flüssigkeitslamelle entstehen würde.
Es ist weiter bevorzugt, wenn die Außenkante der Fläche des Rührpaddels des Rührorgans parallel zu einer Wand des Reaktionsgefäßes verläuft. Hierdurch wird die Bildung der Flüssigkeitslamelle unterstützt und kann besonders effektiv verhindert werden, dass ein Anwachsen an der Wand des Reaktionsgefäßes stattfindet. Der Abstand zwischen der Außenkante des Rührpaddels und der Wand des Reaktionsgefäßes ist dabei vorzugsweise ≤ 6 mm, vorzugsweise ≤ 4 mm, besonders bevorzugt ≤ 2 mm, besonders bevorzugt ≤ 1 mm und/oder ≥ 0,1 mm, vorzugsweise ≥ 0,3 mm, besonders bevorzugt gleich 0,65 mm.
Durch das wandnahe Rühren kann einerseits eine Anlagerung von Stoffen bzw. Biomasse verhindert werden. Bei einem zu großen Abstand (der genaue Wert kann für einen gegebenen Bioreaktor durch Experimente bestimmt werden) könnte die Flüssigkeitslamelle nur unzureichend oder gar nicht ausgeprägt sein und damit würde zu wenig Sauerstoff in das Medium eingetragen werden.
Es ist bevorzugt, wenn das Rührorgan so in dem Reaktionsgefäß des erfindungsgemäßen Milliliter-Bioreaktors angeordnet ist, dass es, wenn das Reaktionsgefäß mit Reaktionsmedium bis zur Sollhöhe gefüllt ist, nur teilweise und nicht vollständig in das Reaktionsmedium eintaucht. Mit seiner Unterseite grenzt das zumindest eine Rührpaddel vorzugsweise mit jener dem Boden nächsten Stelle an den Boden des Reaktionsgefäßes.
Bei dem nur teilweise in das Reaktionsmedium eintauchenden Rührpaddel kann in dem Bioreaktor Kulturflüssigkeit durch schnelle Rotation des Rührorgans in Bewegung gesetzt werden. Es bildet sich hier besonders vorteilhaft die an der Wand des Reaktionsgefäßes ausgebreitete Flüssigkeitslamelle. Mit steigender Rührgeschwindigkeit erhöht sich die Höhe der Flüssigkeitslamelle und vergrößert dadurch das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen.
Bisherige Paddelrührer werden nur vollkommen in die Flüssigkeit getaucht eingesetzt und besitzen normalerweise mehrere Paddel übereinander, weswegen sich keine rotierende Lamelle bildet, sondern allenfalls eine Trombe, die jedoch nur in Sonderfällen genügend Sauerstoff einträgt.
Wie bereits oben beschrieben, erfolgt der Gaseintrag über Oberflächenbegasung. Durch die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugte Flüssigkeitslamelle wird die Stoffaustauschfläche Gas zu Flüssigkeit maximiert. Die gemessenen Sauerstoffübergangswerte (k_La-Werte) in 4 beweisen und quantifizieren diesen Sachverhalt.
Um einen möglichst gleichmäßigen Lauf zu gewährleisten, ist das Rührorgan vorzugsweise doppelt gelagert und/oder mit verschleißarmen Laufbuchsen im Milliliter-Bioreaktor angeordnet. Es wird hierdurch auch eine Langzeitlaufstabilität erreicht. Es ist bevorzugt, wenn die Abmessungen des Milliliter-Bioreaktors die folgenden Bedingungen erfüllen. Vorzugsweise ist das Verhältnis von Reaktordurchmesser zu Durchmesser des Rührorgans ≤ 1,5, besonders bevorzugt ≤ 1,3, besonders bevorzugt ≤ 1,1 und außerdem bevorzugt ≥ 0,3, besonders bevorzugt > 0,7. Das Verhältnis von Abstand des Rührorgans vom Boden des Reaktionsgefäßes zum Durchmesser des Rührers ist vorzugsweise ≤ 0,8, besonders bevorzugt ≤ 0,5 und/oder ≥ 0,1, besonders bevorzugt ungefähr 0,3. Das Verhältnis der Höhe des Rührorgans bzw. dessen Rührpaddels zum Durchmesser des Rührorgans, wobei die Achse im Mittelpunkt liegt, ist vorzugsweise ≤ 7, besonders bevorzugt ≤ 5 und/oder ≥ 1, besonders bevorzugt ≥ 2, besonders bevorzugt ungefähr 3. Das Verhältnis der Höhe der Flüssigkeitssäule im ungerührten Zustand zur Höhe des Rührers oder dessen Paddel ist vorzugsweise ≥ 0,1, vorzugsweise ≥ 0,3, und/oder ≤ 1, vorzugsweise ≤ 0,8, besonders bevorzugt ungefähr oder genau 0,5.
Erfindungsgemäß wird außerdem ein paralleles Milliliter-Bioreaktorensystem mit zumindest zwei Milliliter-Bioreaktoren wie oben beschrieben angegeben. Wie bereits eingangs erläutert, erlaubt der erfindungsgemäße Bioreaktor eine deutliche Verkleinerung der Abmessungen, so dass er für parallele Milliliter-Bioreaktorensysteme besonders geeignet ist.
Gemäß der Erfindung wird außerdem ein Verfahren zum Kultivieren eines Kulturmediums angegeben, wobei das Kulturmedium in zumindest ein Reaktionsgefäß eines Milliliter-Bioreaktors eingebracht wird und das Kulturmedium in dem Reaktionsgefäß mit zumindest einem Rührorgan, wie es oben beschrieben wurde, gerührt wird.
Es ist bevorzugt, wenn das Rührorgan bei der Durchführung des Verfahrens schnell rotiert, um die oben beschriebene Vergrößerung des Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen und des damit verbundenen Sauerstoffeintrages zu ermöglichen. Vorzugsweise ist die Umdrehungsgeschwindigkeit des oder der Rührorgane ≥ 200 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≥ 300 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≥ 500 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≥ 600 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≥ 800 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≥ 1000 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≥ 1400 Umdrehungen pro Minute und/oder ≤ 4000 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≤ 3000 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≤ 2000 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≤ 1500 Umdrehungen pro Minute.
Das Rührorgan ist vorzugsweise so in dem zu kultivierenden Medium angeordnet, dass es nicht vollständig in dieses eintaucht, solange nicht gerührt wird.
Um den Sauerstoffeintrag gegebenenfalls erhöhen zu können, kann oberhalb des Kulturmediums im Reaktionsgefäß eine Sauerstoffatmosphäre erzeugt werden.
Besonders bevorzugt ist das genannte Verfahren mit einem Milliliter-Bioreaktor wie oben beschrieben durchführbar.
Die Erfindung kann z. B. bei Kulturmedien, die morphologisch veränderliche Mikroorganismen enthalten, insbesondere Pilze, filamentöse Pilze, Actinomyceten, Bakterien, Hefen, tierische Zellen und/oder Enzyme, zur Anwendung kommen. Insbesondere tierische Zellen sind scherempfindlich, können aber durch das erfindungsgemäße Rührorgan gerührt werden.
Die Erfindung bietet zahlreiche Vorteile gegenüber Bioreaktoren nach dem Stand der Technik. Neben den bereits genannten Vorteilen sei nochmals herausgestellt, dass das erfindungsgemäße Rührorgan und der erfindungsgemäße Bioreaktor ein besonders großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen zur Oberflächenbegasung erzeugt. In herkömmlichen Bioreaktoren werden die Rührer aktiv durch einen Motor angetrieben, der auch viskose Medien rühren kann. Dies ist mit einer hohen Belastung der Rührachse verbunden. Mit herkömmlichen Rührorganen ist ein Magnetantrieb bei viskosen Medien schwierig, da der Rührer im Medium stehen bleiben kann. Auch würde in herkömmlichen Bioreaktoren ein Antrieb nicht magnetisch erfolgen, da hierdurch eine große Belastung der Rührachse erzeugt würde und große Stahlrührer nicht nutationsfrei laufen würden. Außerdem wäre eine sehr hohe Motorleistung notwendig. Der erfindungsgemäße Rührer ermöglicht es jedoch, auch hoch viskose Medien mittels eines Magnetantriebs zu rühren. Auch kann durch das erfindungsgemäße Rührorgan gerade bei viskosen Medien ein besonders hoher Gaseintrag in die Flüssigkeit erzielt werden. Gerade für Milliliter-Bioreaktoren hat sich die Kombination des erfindungsgemäßen Rührorgans mit einem Magnetantrieb als vorteilhaft erwiesen.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand einiger Figuren beispielhaft erläutert werden. Gleiche Bezugszeichen entsprechen hierbei gleichen oder analogen Merkmalen.
Es zeigt
1 eine perspektivische Ansicht des erfindungsgemäßen Rührorgans,
2 einen Schnitt durch das erfindungsgemäße Rührorgan mit einer Schnittebene parallel zur Fläche des Rührpaddels,
3 ein Reaktionsgefäß mit einem erfindungsgemäßen Rührorgan in einem Milliliter-Bioreaktor,
4 k_La-Werte in Abhängigkeit von einer Drehzahl eines erfindungsgemäßen Rührorgans,
5 den Verlauf des Sauerstoffpartialdrucks in Abhängigkeit von einer Kultivierungsdauer in einem erfindungsgemäßen Milliliter-Bioreaktor, und
6 den zeitlichen Verlauf von Biotrockenmasse und die gemessene Nikkomycin-Z-Bildung in einem erfindungsgemäßen Milliliter-Bioreaktor.
1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rührorgan. Dieses weist ein Rührpaddel 1 auf, das eine Innenkante 2 und eine hierzu parallele Außenkante 3 hat. Eine Oberkante 4 begrenzt die Rührpaddelfläche nach oben. Eine Unterkante 5 des Rührpaddels 1 ist angeschrägt, steht also in einem Winkel von weniger als 90° zur Innenkante 2. Alle gezeigten Kanten 2, 3, 4 und 5 sind gerade.
Das gezeigte Rührorgan weist außerdem eine Achsenanordnungsvorrichtung 6a, 6b, auf, die so ausgebildet ist, dass das Rührorgan über diese Achsenanordnungsvorrichtung 6a, 6b an einer nicht gezeigten Achse so angeordnet werden kann, dass die Achse parallel zur Fläche des Rührpaddels 1 verläuft. Im gezeigten Beispiel kann die Achse hier in die Öffnungen 7a, 7b eingeführt werden. Die Achse verläuft hier außerdem parallel zur Innenkante 2 und zur Außenkante 3.
2 zeigt einen Schnitt durch das in 1 gezeigte Rührorgan mit einer Schnittebene, welche parallel zur Fläche des Rührpaddels 1 liegt.
Im Schnitt sind Öffnungen 8a, 8b und 8c sowie 9a, 9b und 9c in der Achsenanordnungsvorrichtung 6b bzw. der Fläche 1 zu erkennen. Diese Öffnungen 8a, 8b, 8c und 9a, 9b, 9c dienen zum Einbau von beispielsweise sechs Dauermagneten, die beispielsweise zylindrische Samarium-Cobalt-Magnete mit einer Abmessung von 3 mm × 3 mm sein können. Diese Magnete ermöglichen einen Antrieb des Rührorgans mittels einer Magnetrührervorrichtung.
3 zeigt ein erfindungsgemäßes Rührorgan, das in einem Reaktionsgefäß 31 eines Milliliter-Bioreaktors angeordnet ist. Das Rührorgan dreht sich mit seiner Paddelfläche 1 in Richtung des Pfeiles 32 um eine in der Achsenanordnungsvorrichtung 6a, 6b angeordnete Achse 33. Die Außenkante 3 der Fläche des Rührpaddels verläuft im gezeigten Beispiel parallel zur Wand des Reaktionsgefäßes 31. Die Unterkante 5 grenzt an ihrem dem Boden 34 des Reaktionsgefäßes 31 nächstliegenden Punkt 36 an den Boden 34.
Auf jener dem Paddel 1 gegenüber liegenden Seite der Achse 33 kann ein Gegengewicht angeordnet sein, welches eine nutationsfreie Drehung des Rührorgans um die Achse 33 erlaubt.
Bei Rotation des Rührorgans im Reaktionsgefäß 31 um die Achse 33 wird Flüssigkeit 35 durch die Zentrifugalkraft gegen die Wand des Reaktionsgefäßes 31 gedrückt, so dass die Flüssigkeitsoberfläche 37 eine näherungsweise parabolische Gestalt annimmt.
Die Flüssigkeitsoberfläche 37 bildet hierbei einen Ausschnitt aus einem Paraboloid, der jedoch nicht symmetrisch zur Symmetrieachse des Paraboloiden bzw. der Drehachse 33 ist. Es wird je nach Rotationsgeschwindigkeit das gesamte oder ein Teil des Flüssigkeitsvolumens 35 vor dem Paddel 1 hergeschoben.
Durch die ständig rotierende Lamelle wird eine Anlagerung von Feststoffen oder Biomasse oberhalb der Flüssigkeit 35, wie sie in klassischen Rührreaktoren in starken Maß auftritt, signifikant verringert.
Der sich beim Rühren ausbildende Paraboloid hat eine größere Oberfläche als das Medium im ruhenden Zustand. Dadurch kann mehr Sauerstoff bzw. Luft aus der Gasphase in das Medium übergehen.
4 zeigt den Sauerstoffübergangskoeffizienten k_La in Abhängigkeit von einer Drehzahl des erfindungsgemäßen Rührers in einem erfindungsgemäßen Bioreaktor. Die Werte wurden hier mittels der dynamischen Sulfitmethode gemessen. Das Medium war 0,5 M Na₂SO₄ bei Raumtemperatur. Es sind hierbei k_La-Werte von > 0,13 s^–1 messbar.
Dieser Wert liegt deutlich über den häufig in der Biotechnologie eingesetzten Reaktorsystemen, wie Schüttelkolben oder Mikrotiterplatte. Die erreichbaren k_La-Werte liegen in der für morphologisch veränderbare Mikroorganismen üblichen Größenordnung, da diese meist weniger Sauerstoff zum Wachstum benötigen als dies bei einzelligen Bakterien und Hefen der Fall ist. Damit ist eine Kultivierung der Mikroorganismen unter vergleichbaren Bedingungen wie im Laborrührreaktor gewährleistet.
Der Einsatz von Oberflächenbegasung zum Sauerstoffeintrag ist vor allen Dingen für viskose Medien sehr gut geeignet, da sich die Stoffaustauschfläche gas-/ flüssig nur geringfügig mit zunehmender Viskosität ändert und deshalb nur zu einem schwach absinkenden k_La-Wert führt. Bei blasenbegasten Prozessen ist hingegen eine starke Abnahme des k_La-Wertes über die Viskosität zu beobachten, da im viskosen Medium keine ausreichende Dissipation der Gasblasen durch den Rührer mehr erfolgen kann.
Ein weiterer Vorteil der reinen Oberflächenbegasung ist die Vermeidung von Schaumbildung, die in blasenbegasten Bioprozessen, vor allem im Milliliter-Maßstab, den Kultivierungsverlauf stört und deshalb in klassischen Rührreaktoren durch eine zusätzliche Dosierung von Antischaummitteln behoben werden muss.
Flüssigkeitslamellen, wie sie in der Erfindung erzeugt werden, unterscheiden sich von Tromben, wie sie in herkömmlichen Bioreaktoren erzeugt werden. Herkömmliche Tromben werden durch Rührorgane erzeugt, die vollständig in die Flüssigkeit eintauchen und die Flüssigkeit durch ihre Rotation in Bewegung versetzen. Die Flüssigkeitslamelle wird in der vorliegenden Erfindung hingegen durch ein Rührorgan erzeugt, das nicht vollständig in die Flüssigkeit eintaucht. Durch die Flüssigkeitslamelle wird ein deutlich besserer Sauerstoffübergangswert und Oberflächen- zu Volumenverhältnis erreicht als bei Tromben.
5 zeigt den Verlauf des Sauerstoffpartialdruckes in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer im Bioreaktor. Es wurde hier eine Kultivierung des mycelbildenden Mikroorganismus Streptomyces tendae W42-0 im Milliliter-System vorgenommen. Dabei kam ein modifiziertes Medium zum Einsatz mit 12 g/L löslicher Stärke, 43 g/L Mannitol, 20 g/L Soja-Pepton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 mg/L FeSO₄, 1 mL/L Sojaöl, 1 mL/L Antischaummittel, 100 mM MES. Der pH wurde auf 5,5 eingestellt. Die Kultivierungstemperatur betrug 29°C und die Rührerdrehzahl 1200 min^–1. Streptomyces tendae ist als Modellmikroorganismus interessant, da das pharmazeutisch relevante Nikkomycin Z durch diesen Mikroorganismus gebildet wird. Nikkomycin Z wurde über eine HPLC mit Diodenarray nach der Methode von Fiedler (Fiedler, H.-P., 1981, „Quantitation of nikkomycins in biological fluids by ion-pair rever-sed-phase high-performance liquid chromatography", J. Chromat. 204: S. 313–318) quantifiziert.
Es lassen sich in 5 drei für morphologisch veränderbare Mikroorganismen charakteristische Phasen erkennen. Es ist dies zunächst eine exponentielle Wachstumsphase, gefolgt von einer stationären Phase und einer anschließenden Absterbephase. Die Phasen sind in 5 durch vertikale Linien getrennt. Es ist zu erkennen, dass zu jedem Zeitpunkt der Kultivierung genügend Sauerstoff in das Reaktionsmedium eingetragen wird, so dass keine Limitation vorliegt. Dies ist vor allem zu den Zeitpunkten hoher Biomasse und damit stark erhöhter Viskosität entscheidend und zeigt die Vorteile des Rührprinzips. Weiterhin ist durch die Auslegung des Rührorgans für den in WO 2004/058935 beschriebenen Bioreaktorblock eine definierte überwachte Prozessführung möglich.
6 zeigt während einer Kultivierung offline gemessene Biotrockenmassen und Nikkoymcin-Z-Konzentrationen. Es sind wieder, wie bereits in 5, drei Phasen der Kultivierung (Biomasseanstieg, stationäre Phase mit konstanter Biomasse und Absterbephase) zu erkennen. Die Daten stimmen dabei sehr gut mit bekannten Daten überein, die mit einem fast gleichen Kultivierungsmedium ebenfalls ca. 20 g/l maximale Biotrockenmasse enthielten. Weiterhin ist in 6 eine deutliche Bildung von bis zu 300 mg/l (Nikkoymcin-Z) zu erkennen.
Während der gesamten Kultivierung wurde kein Wandwachstum in den Milliliter-Reaktoren beobachtet. Dies zeigt, dass durch die ständig rotierende Flüssigkeitslamelle eine Ablagerung von Biomasse effektiv vermieden wird. Ebenfalls konnte zu keinem Zeitpunkt des Prozesses Schaumbildung beobachtet werden.
Die Daten zeigen, dass mit dem erfindungsgemäßen Rührorgan die Kultivierung morphologisch veränderlicher Mikroorganismen erfolgreich durchgeführt werden kann und dass die im Milliliter-Maßstab gewonnenen Daten mit den aus der Literatur erhältlichen Daten gut übereinstimmen. Weiterhin sind die Rührcharakteristik und folglich die Kultivierungsbedingungen mit Rührreaktoren im. Labor- und Technikumsmaßstab vergleichbar und ermöglichen damit eine einfache und reproduzierbare Maßstabsübertragung. Das System ist zukünftig für die „Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung” morphologisch veränderlicher Mikroorganismen einsetzbar.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2004/058935 [0003, 0005, 0023, 0027, 0028, 0075]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Fiedler, H.-P., 1981, „Quantitation of nikkomycins in biological fluids by ion-pair rever-sed-phase high-performance liquid chromatography”, J. Chromat. 204: S. 313–318 [0074]

Claims

Rührorgan für einen Milliliter-Bioreaktor mit zumindest einem flächigen Rührpaddel (1), sowie mit einer Achsenanordnungsvorrichtung (6a, 6b), die so ausgebildet ist, dass das Rührorgan über die Achsenanordnungsvorrichtung (6a, 6b) an einer Drehachse (33) so angeordnet werden kann, dass die Drehachse (33) parallel zur Fläche des Rührpaddels (1) verläuft, wobei das Rührorgan relativ zu dem Milliliter-Bioreaktor so ausgebildet ist, dass mit ihm in dem Milliliter-Bioreaktor eine Flüssigkeitslamelle erzeugbar ist.
Rührorgan nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Fläche des Rührpaddels (1) eine der Drehachse (33) zugewandte Innenkante (2) und eine der Drehachse abgewandte Außenkante (3) aufweist, die parallel zueinander verlaufen, wobei sich die Kanten vorzugsweise von einer Oberkante (4) zu einer Unterkante (5) der Fläche des Rührpaddels (1) erstrecken, wobei besonders bevorzugt Innenkante (2) und/oder Außenkante (3) und/oder Oberkante (4) und/oder Unterkante (5) gerade ist.
Rührorgan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ausdehnung des Rührpaddels parallel zur Drehachse (33) größer ist als in zur Drehachse (33) radialer Richtung.
Rührorgan nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine der Kanten des Rührpaddels parallel zur Drehachse (33) verläuft.
Rührorgan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rührpaddel eine Unterkante (5) seiner Fläche aufweist, die sich von einer der Drehachse (33) zugewandten Innenkante (2) des Rührpaddels zu einer der Drehachse (33) abgewandten Außenkante (3) des Rührpaddels erstreckt, wobei die Außenkante (3) kürzer oder länger ist als die Innenkante (2) und/oder wobei die Unterkante (5) mit der Drehachse (33) einen Winkel einschließt, der ungleich, vorzugsweise kleiner als 90°, besonders bevorzugt ungefähr 40° ist.
Rührorgan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Drehachse (33) außerhalb der Fläche des Rührpaddels (1) anordenbar ist.
Rührorgan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch zumindest ein Gegengewicht, das auf jener dem Rührpaddel (1) gegenüber liegenden Seite der Drehachse (33) angeordnet ist und so ausgestaltet ist, dass das Rührorgan nutationsfrei um die Drehachse (33) drehbar ist.
Rührorgan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rührorgan magnetisch antreibbar ist.
Rührorgan nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Außenkante (3) ≥ 1 cm, vorzugsweise ≥ 2 cm, besonders bevorzugt ≥ 3 cm lang ist und/oder ≤ 8 cm, bevorzugt ≤ 7 cm, besonders bevorzugt ≤ 6 cm, besonders bevorzugt ≤ 5 cm lang ist und/oder dass eine Breite zwischen der Innenkante (2) und der Außenkante (3) und/oder ein Abstand zwischen der Drehachse (33) und der Außenkante (3) ≥ 0,2 cm, bevorzugt ≥ 0,3 cm, besonders bevorzugt ≥ 0,4 cm und/oder ≤ 2 cm, bevorzugt ≤ 1 cm, besonders bevorzugt ≤ 0,8 cm, besonders bevorzugt ≤ 0,6 cm und besonders bevorzugt ≤ 0,5 cm ist.
Milliliter-Bioreaktor zum Kultivieren eines Kulturmediums mit zumindest einem Reaktionsgefäß (31) sowie mit zumindest einem Rührorgan nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches innerhalb des zumindest einen Reaktionsgefäßes (31) an einer Drehachse (33) angeordnet ist.
Milliliter-Bioreaktor nachdem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass eine Außenkante (3) der Fläche des Rührpaddels (1) parallel zu einer Wand des Reaktionsgefäßes verläuft.
Milliliter-Bioreaktor nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass ein Abstand zwischen der Außenkante (3) des Rührpaddels (1) und der Wand des Reaktionsgefäßes ≤ 3 mm, vorzugsweise ≤ 2 mm, vorzugsweise ≤ 1 mm, besonders bevorzugt ≈ 0,65 mm und/oder ≥ 0,1 mm, vorzugsweise ≥ 0,3 mm, besonders bevorzugt ≥ 0,5 mm ist.
Milliliter-Bioreaktor nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rührorgan so in dem Reaktionsgefäß (31) angeordnet ist, dass das Rührpaddel (1) nicht vollständig oder nur auf einem Teil der Länge der Innenkante (2) und/oder Außenkante (3) des Rührpaddels in ein zur Kultivierung in das Reaktionsgefäß (31) eingebrachtes Medium eintaucht und/oder dass es an einen Boden (34) des Reaktionsgefäßes (31) grenzt.
Milliliter-Bioreaktor nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das zumindest eine Reaktionsgefäß (31) keinen Strömungsbrecher aufweist.
Paralleles Milliliter-Bioreaktorensystem mit zumindest zwei Milliliter-Bioreaktoren nach einem der Ansprüche 10 bis 14.
Verfahren zum Kultivieren eines Kulturmediums, wobei das Kulturmedium in zumindest ein Reaktionsgefäß eines Milliliter-Bioreaktors eingebracht wird und das Kulturmedium mit zumindest einem Rührorgan nach einem der Ansprüche 1 bis 9 so gerührt wird, dass sich im Reaktionsgefäß eine Flüssigkeitslamelle ausbildet.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass eine Umdrehungsgeschwindigkeit des Rührorgans ≥ 200 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≥ 300 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≥ 500 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≥ 600 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≥ 800 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≥ 1000 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≥ 1400 Umdrehungen pro Minute und/oder ≤ 4000 Umdrehungen pro Minute, vorzugsweise ≤ 3000 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≤ 2000 Umdrehungen pro Minute, besonders bevorzugt ≤ 1500 Umdrehungen pro Minute beträgt.
Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Rührorgan nur zum Teil in das Kulturmedium eintaucht, wenn dieses nicht gerührt wird.
Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass oberhalb des Kulturmediums im Reaktionsgefäß eine Sauerstoffatmosphäre erzeugt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Milliliter-Bioreaktor nach einem der Ansprüche 10 bis 14 verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium morphologisch veränderliche Mikroorganismen, Pilze, filamentöse Pilze, Actinomyceten, Bakterien, Hefen, tierische Zellen und/oder Enzyme enthält.
Verwendung eines Milliliter-Bioreaktors nach einem der Ansprüche 10 bis 14 oder eines parallelen Milliliter-Bioreaktorsystems nach Anspruch 15 zur Kultivierung von morphologisch veränderlichen Mikroorganismen, Pilzen, filamentösen Pilzen, Actinomyceten, Bakterien, Hefen, tierischen Zellen und/oder Enzymen.