DE102009035019A1

DE102009035019A1 - Histologisches Einbettmedium

Info

Publication number: DE102009035019A1
Application number: DE200910035019
Authority: DE
Inventors: Hans-Werner Schmidt; Andreas Bernet
Original assignee: Leica Biosystems Nussloch GmbH
Current assignee: Leica Biosystems Nussloch GmbH
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2011-02-10
Also published as: WO2011012337A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein histologisches Einbettmedium, das eine Mischung aus PEGs mit mindestens zwei verschiedenen mittleren Molekulargewichten aufweist, wobei ein erstes PEG fest ist und ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 4000 Gramm pro Mol (g/mol) aufweist und ein zweites PEG wachsartig ist.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft ein histologisches Einbettmedium auf der Basis von Polyethylenglykolen (PEG).
Die Histologie befasst sich mit der morphologischen Diagnostik von Gewebeproben. Dazu werden mikrometerdünne, gefärbte Gewebeschnitte hergestellt und am Mikroskop beurteilt. Zu den üblicherweise untersuchten Gewebeschnitten gehören unter anderem Operationspräparate, Probenexzisionen und Biopsien. Bevor diese Gewebeschnitte jedoch untersucht werden können, muss das Gewebe einer ausführlichen Bearbeitung unterzogen werden.
Zunächst muss das Gewebe zur Stabilisierung beispielsweise in Formaldehydlösung fixiert werden. Dann wird das Gewebe entwässert, was üblicherweise in einer aufsteigenden Alkoholreihe erfolgt. Schließlich wird das entwässerte Gewebe in ein schneidbares Medium, beispielsweise Paraffin, eingebettet. Das so eingebettete Gewebe kann dann zugeschnitten und gefärbt werden und ist bereit für eine Untersuchung auf dem Mikroskop.
In den meisten Fällen wird eine Einbettung mit Paraffinwachs durchgeführt. Paraffin ist eine polykristalline Mischung aus Alkanen (gesättigten Kohlenwasserstoffen), die weder mit Wasser noch mit Alkohol mischbar ist. Da Paraffin ein hydrophobes Verhalten zeigt, muss vor der Einbettung des Gewebes in das Paraffin eine Entwässerung durchgeführt werden. Hierbei wird üblicherweise eine Reihe von Ethanol in aufsteigender Konzentration verwendet, wobei die Probe jeweils zwischen 1 und 4 Stunden in jedem Ethanolbad verbleibt. Anschließend wird das Gewebe 1 bis 3 Stunden in ein Intermedium gegeben, welches sowohl mit Ethanol als auch mit Paraffin gut mischbar ist. Hierfür werden meistens Xylol oder Xylolersatzmittel verwendet.
Aufgrund der aufwändigen Entwässerung und dem anschließenden ebenfalls zeitaufwändigen Transfer in dem Intermedium kann die Probenpräparation einen Tag in Anspruch nehmen, bevor ein gefärbter Schnitt auf dem Mikroskop untersucht werden kann. Dadurch wird das Verfahren teuer. Darüber hinaus ist es insbesondere bei vielen medizinischen Anwendungen auch notwendig, schnelle Resultate zu erzielen, da von diesen zukünftige Eingriffe abhängen können. Daher wurde und wird nach alternativen Einbettmedien gesucht, mit Hilfe derer sich die Probenpräparation beschleunigen lassen könnte.
Eine Möglichkeit besteht darin, das Paraffin durch Polyethylenglykol (PEG) zu ersetzen. Polyethylenglykol entsteht durch ringöffnende Polymerisation von Ethylenoxid und ist je nach Kettenlänge flüssig, salben- bzw. wachsartig oder fest. Da es in allen Polymerstufen wasserlöslich ist, kann es sowohl zum Entwässern als auch zum Einbetten verwendet werden, wodurch die Dauer des Prozesses erheblich verkürzt werden kann. Ferner kann bei der Verwendung von Polyethylenglykol zum Entwässern und zum Einbetten auf das Intermedium z. B. Xylol verzichtet werden, das im Verdacht steht, krebserregend zu sein.
Bereits in den 80er Jahren gab es mehrere Versuche, ein Einbettmedium auf PEG-Basis zu gewinnen. So beschreiben beispielsweise Bart et al. ("The Journal of Histochemistry and Cytochemistry", 34, 1237 (1986)) den Einsatz von PEG 1000 (PEG mit Molekulargewicht von etwa 1000) als Einbettmedium. Lang ("Histotechnik: Praxislehrbuch für die biomedizinische Analytik", Springer, 2006) sowie Holubowicz et al. (Stain Techrtology 63, 33 (1988)) verwendeten Mischungen von Polyethylenglykolen verschiedener Kettenlänge. Die US 3 634 197 beschreibt als wasserlösliches Einbettmedium eine Mischung aus 50–60% Polyethylenglykol eines Molekulargewichts von etwa 3700 und weniger als 50% einer Mischung aus nicht-ionischen oberflächenaktiven Reagenzien. Bosman et al. (Histochemistry 73, 195 (1981)) beschreiben eine Mischung aus PEG 1500 und 3% Wasser.
Allerdings konnte sich keines dieser Einbettmedien auf Basis von Polyethylenglykol durchsetzen, da sie insbesondere nicht die notwendigen Schnitteigenschaften aufwiesen. Da in der Histologie zunehmend dünnere Schnitte, vielfach mit einer Schnittdicke unter 3 μm, hergestellt werden, ist es wichtig, dass das Einbettmedium zum einen nicht zu hart und spröde ist, da sonst die Schnitte leicht zerbrechen bzw. zerbröseln können, und andererseits nicht zu weich ist, da die Schnitte sonst während des Schneideprozesses eine zu große Stauchung erfahren. Es ist demnach eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes histologisches Einbettmedium bereitzustellen. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. In den abhängigen Ansprüchen werden bevorzugte Ausführungsformen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein histologisches Einbettmedium bereit, das eine Mischung aus PEGs mit mindestens zwei verschiedenen Molekulargewichten aufweist, wobei ein erstes PEG fest ist und ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 4000 g/mol aufweist und ein zweites PEG wachsartig ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter ”PEG” nicht nur Polyethylenglykol, sondern auch Polyethylenglykol-Monoalkylether und Polyethylenglykol-Dialkylether verstanden. Es können jedoch auch weitere Endgruppen zum Einsatz kommen, ohne vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Insbesondere können die Endgruppen OH-Gruppen, Alkoxygruppen oder eine Kombination davon aufweisen. Ferner können die Polymere ein oder mehrere Verzweigungen aufweisen oder copolimerisiert sein.
Das mittlere Molekulargewicht in g/mol kann erfindungsgemäß mittels Gelpermeationschromatographie (Säulenausschlusschromatographie) ermittelt werden. Unter dem mittleren Molekulargewicht wird dabei das Gewichtsmittel verstanden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das erste PEG ein mittleres Molekulargewicht zwischen 1600 g/mol und 3000 g/mol, vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht zwischen 1800 g/mol und 2500 g/mol und besonders bevorzugt von etwa 2400 g/mol auf. Das zweite PEG weist bevorzugt ein mittleres Molekulargewicht zwischen 1000 g/mol und 2000 g/mol, vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht von 3300 g/mol oder etwa 1900 g/mol auf.
Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, dass die Eigenschaften des histologischen Einbettmediums, insbesondere dessen Schnitteigenschaften, nicht nur von den mittleren Molekulargewichten der beiden Komponenten, sondern insbesondere auch von deren Mischungsverhältnis stark abhängt. Erfindungsgemäß liegt das Mischungsverhältnis zwischen erstem und zweitem PEG zwischen 80:20 und 95:5, bevorzugt zwischen 85:15 und 93:7, besonders bevorzugt bei etwa 90:10. Diese Mischungsanteile werden dabei über das Gewichtsverhältnis bestimmt.
Vorzugsweise weist die Mischung ferner ein drittes flüssiges PEG auf. Das mittlere Molekulargewicht des dritten PEGs liegt zwischen 200 g/mol und 1000 g/mol, bevorzugt zwischen 300 g/mol und 700 g/mol und besonders bevorzugt bei etwa 600 g/mol. Der Anteil des ersten PEG an der PEG-Mischung liegt in einer dreikomponentigen Ausführungsform zwischen 80% und 85%, vorzugsweise zwischen 83% und 90%, besonders bevorzugt bei etwa 85%. Der Anteil des zweiten PEG an der dreikomponentigen PEG-Mischung beträgt zwischen 2% und 20%, vorzugsweise zwischen 7% und 13%, besonders bevorzugt etwa 10%. Der Anteil des dritten PEG an der PEG-Mischung liegt zwischen 1% und 10%, vorzugsweise zwischen 3% und 7%, besonders bevorzugt bei etwa 5%. Das Mischungsverhältnis von erstem PEG zu zweitem PEG zu drittem PEG an der PEG-Mischung liegt bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform bei etwa 85:10:5.
Es ist ferner bevorzugt, dass der Tropfpunkt des erfindungsgemäßen Einbettmediums zwischen 52°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 55°C und 57°C liegt. Das Einbettmedium kann ferner ein oder mehrere Adjektive aus der folgenden Gruppe aufweisen: Wasser, Tenside, Wachse, Antioxidantien, Alkohole.
Die vorliegende Erfindung richtet sich ferner auf die Verwendung eines Einbettmediums wie oben beschrieben bei der Herstellung histologischer Schnitte. Dabei haben die histologischen Schnitte eine Dicke von unter 20 μm, bevorzugt unter 5 μm und besonders bevorzugt von etwa 1–3 μm. Es ist ferner bevorzugt, dass die histologischen Schnitte nach der erfindungsgemäßen Verwendung während des Schneideprozesses eine Stauchung des Einbettmediums von weniger als 15%, bevorzugt von weniger als 10% und besonders bevorzugt von weniger als 5% erfahren.
Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, dass das oben beschriebene Zweikomponentensystem und insbesondere das bevorzugte Dreikomponentensystem aus PEGs verschiedener Molekulargewichte ein histologisches Einbettmedium mit besonders guten Schnitteigenschaften liefert. Dabei wird offensichtlich durch die längerkettigen Komponenten eine hinreichende Stabilität während des Schnittes gewährleistet, wohingegen die kürzerkettigen Komponenten sicherstellen, dass das Einbettmedium nicht zu spröde wird. So können dünne Schnitte zum einen nicht zerbrechen bzw. zerbröseln, zum anderen erfahren diese während des Schneideprozesses eine geringe Stauchung. Die Stauchung während des Schneideprozesses ist ein bei der Erstellung histologischer Schnitte bedeutsamer Parameter, da bei zu großer Stauchung die Gewebeproben nicht mehr vernünftig analysiert werden können.
Das erfindungsgemäße PEG-System weist darüber hinaus einige weitere Vorteile auf. So ist PEG wasserlöslich, was wie oben beschrieben zu deutlich reduzierten Bearbeitungszeiten bei der Erstellung von Gewebeproben führt. Die Kosten von PEG sind vergleichbar mit denen von Paraffin, was herkömmlich als Einbettmedium verwendet wird. PEGs sind ferner biologisch verträglich und leicht verarbeitbar.
Im folgenden sollen anhand der Figuren besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben werden. Es zeigen:
1: Die Molmassenverteilung eines PEG 1000;
2: Die Molmassenverteilung eines PEG 2000; und
3: Die Molmassenverteilung eines erfindungsgemäßen Einbettmediums.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde eine Dreikomponentenmischung aus PEG 2000 (aldrich 29, 590-6 polyethylenglykol 2000 average mw 2000 mp ca. 50–53°C), PEG 1000 (sigma-aldrich P3515-250G average mn 950–1050 typical mn 1000 mp ca. 37–40°C) und PEG 400 (fluka 81172 polyethylene glycol 400 ph eur 5 ppm formaldehyde mr 380–420 mp ca. 4–8°C) bereitgestellt. Das Gewichtsverhältnis von PEG 2000 zu PEG 1000 zu PEG 400 war 85:10:5. Die Mischung der drei Komponenten wurde aufgeschmolzen, bis eine klare Flüssigkeit entstand (bei ca. 65–70°C). Die Schmelze wurde dann in eine Metallform gegossen. Diese wurde zum Abkühlen auf einen Aluminiumblock gestellt, der in einem Eisbad stand, und mit einer Glashaube abgedeckt. Die Zeit bis zum vollständigen Erstarren betrug etwa 5–10 Minuten. Der erstarrte Block dieser Dreikomponentenmischung (im folgenden Schnittmischung M) wurde verschiedenen Messungen unterzogen. Insbesondere ließen sich mit diesem Block exzellente Schnitte einer Schnittdicke von 1–5 μm erzielen.
Da die PEGs teilweise erheblich untereinander variieren, wurde versucht mittels Gelpermeationschromatographie eine objektive Bestimmung der Molmassenverteilung zu erzielen. Hierzu wurde eine Oligo-Gelpermeationschromatographie (Säulenausschlusschromatographie) durchgeführt. Die folgenden Säulen kamen dabei zum Einsatz: Mesopor-Gel (Varian) als ”guard column” mit einer Länge von 5 cm und einem Durchmesser von 0,8 cm (3 μm Teilchengröße) und PL-Gel (PL) als ”analytical column” mit einer Länge von 2 × 60 cm und einem Durchmesser von 0,8 cm (3 μm Teilchengröße). Als Detektoren dienten die Modelle 486 und 410 (Infrarot) von Waters. Als Eluens diente stabilisiertes THF bei einer Flussrate von 0,5 ml/min. Die Kalibrierung wurde mit einem Polystyrolstandard (bis zu 30000 g/mol) durchgeführt (interner Standard: o-Dichlorobenzen).

Zur Probenpräparation wurde das zu vermessende Polyethylenglykol bzw. die entsprechende PEG-Mischung in THF gelöst (Konzentration von 2–3 mg/ml). Die Lösung wurde durch einen PTFE Spritzenfilter (0,2 im) filtriert und anschließend mit Ortho-Dichlorbenzol versetzt (ein Tropfen auf 2 ml Lösung). Für die Auswertung wurde das Signal des Infrarotdetektors verwendet. Die ermittelte Molmassenverteilung für PEG 1000, PEG 2000 und die erfindungsgemäße Dreikomponentenmischung sind jeweils in den 1, 2 und 3 dargestellt. Die genaueren Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst, wobei M_peak diejenige Molmasse bezeichnet, bei der das Maximum der Verteilung auftritt, M_n, M_w und M_z das Zahlenmittel, Gewichtsmittel und Z-Mittel bezeichnen und PDI die Polydispersität (= M_w/M_n) ist.

PEG	M_peak	M_n	M_w	M_z	PDI	Anteil [%]

PEG-400	602	565	599	631	1,06	100

PEG-1000	1468	1353	1399	1445	1,03	98,7
PEG-1000	518	490	495	499	1,01	1,3

PEG-2000	2649	2405	2470	2529	1,03	99,0
PEG-2000	511	499	503	506	1,01	1,0

Dem Fachmann wird klar sein, dass das erfindungsgemäße Einbettmedium im wesentlichen durch die in 3 dargestellte Molmassenverteilung charakterisiert werden kann. Dabei kommt es im wesentlichen nicht auf die Verwendung von genau PEG 400, PEG 1000 und PEG 2000 an, sondern darauf, dass – eventuell auch mit anderen Komponenten – eine Molmassenverteilung erzielt wird, die im wesentlichen der in 3 dargestellten entspricht.
Ein Merkmal ist dabei unter anderem, dass bei einer Molmasse von etwa 2400 g/mol bis 2600 g/mol ein langkettiger Peak eines festen PEG auftritt, und ein zweiter Peak eines wachsartigen PEG, hier mit einer Molmasse unterhalb von 1500 g/mol, vorhanden ist. Diese beiden Peaks sorgen zum einen für die hinreichende Stabilität während des Schneideprozesses und verhindern zum anderen, dass die Mischung zu spröde wird. Im wesentlichen weist das erfindungsgemäße PEG also eine bimodale Verteilung von Polymeren auf. Durch ein drittes, flüssiges PEG mit einem Peak von etwa 500 bis 600 g/mol kann gegebenenfalls die Schneidbarkeit durch weitere Verbesserung der Sprödigkeit noch erhöht werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 3634197 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Bart et al. (”The Journal of Histochemistry and Cytochemistry”, 34, 1237 (1986) [0007]
- ”Histotechnik: Praxislehrbuch für die biomedizinische Analytik”, Springer, 2006 [0007]
- Stain Techrtology 63, 33 (1988) [0007]
- Bosman et al. (Histochemistry 73, 195 (1981) [0007]

Claims

Histologisches Einbettmedium, das eine Mischung aus PEGs mit mindestens zwei verschiedenen mittleren Molekulargewichten aufweist, wobei ein erstes PEG fest ist und ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 4000 Gramm pro Mol (g/mol) aufweist und ein zweites PEG wachsartig ist.
Einbettmedium nach Anspruch 1, wobei das erste PEG ein mittleres Molekulargewicht zwischen 1600 g/mol und 3000 g/mol, vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht zwischen 1800 g/mol und 2600 g/mol und besonders bevorzugt von etwa 2400 g/mol, aufweist.
Einbettmedium nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zweite PEG eine mittleres Molekulargewicht zwischen 1000 g/mol und 2000 g/mol, vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht zwischen 1300 g/mol und 1900 g/mol, aufweist.
Einbettmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mischungsverhältnis zwischen erstem und zweitem PEG zwischen 80:20 und 95:5, bevorzugt zwischen 85:15 und 93:7, besonders bevorzugt bei etwa 90:10 liegt.
Einbettmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mischung ferner ein drittes flüssiges PEG aufweist.
Einbettmedium nach Anspruch 5, wobei das dritte PEG ein mittleres Molekulargewicht zwischen 200 g/mol und 1000 g/mol, bevorzugt zwischen 300 g/mol und 700 g/mol, besonders bevorzugt von etwa 600 g/mol aufweist.
Einbettmedium nach Anspruch 6, wobei der Anteil des ersten PEG an der PEG-Mischung zwischen 80% und 95%, vorzugsweise zwischen 83% und 90%, besonders bevorzugt bei etwa 85% liegt.
Einbettmedium nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Anteil des zweiten PEG an der PEG-Mischung zwischen 2% und 20%, vorzugsweise zwischen 7% und 13%, besonders bevorzugt bei etwa 10% liegt.
Einbettmedium nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Anteil des dritten PEG an der PEG-Mischung zwischen 1% und 10%, vorzugsweise zwischen 3% und 7%, besonders bevorzugt bei etwa 5% liegt.
Einbettmedium nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei das Mischungsverhältnis von erstem PEG zu zweitem PEG zu drittem PEG an der PEG-Mischung bei etwa 85:10:5 liegt.
Einbettmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Tropfpunkt des Einbettmediums zwischen 52°C und 58°C, vorzugsweise zwischen 55°C und 57°C liegt.
Einbettmedium nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Einbettmedium ein oder mehrere weitere Additive aus der folgenden Gruppe aufweist: Wasser, Tenside, Wachse, Antioxidantien, Alkohole.
Verwendung eines Einbettmediums nach einem der vorhergehenden Ansprüche bei der Herstellung histologischer Schnitte.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die histologischen Schnitte eine Dicke von unter 20 μm, bevorzugt unter 5 μm und besonders bevorzugt von etwa 1–3 μm haben.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei die histologischen Schnitte während des Schneideprozesses eine Stauchung des Einbettmediums von weniger als 15%, bevorzugt von weniger als 10% und besonders bevorzugt von weniger als 5% erfahren.