DE10200865A1 - Device for referencing fluorescence signals - Google Patents

Abstract

The invention relates to a device for referencing fluorescence signals and/or calibration of fluorescence detection systems, whereby the device comprises an essentially non-fluorescing support, on which are applied polymer layers in several defined regions and with partly varying thicknesses and/or compositions. Said polymer layers are applied to the support such as to fluoresce after corresponding irradiation and the device may thus be used as a fluorescence standard. The invention further relates to a method for the production of said fluorescence standards.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die den Vergleich der Abbildungseigenschaften und Signalempfindlichkeit von Fluoreszenzdetektionssystemen und die testspezifische Referenzierung von Fluoreszenzsignalen ermöglicht, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.The invention relates to a device that allows the comparison of imaging properties and Signal sensitivity of fluorescence detection systems and the test specific Referencing of fluorescence signals enables, as well as methods for their preparation.

Biomedizinische Tests basieren häufig auf dem Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Molekül bzw. einer Affinitätsmatrix, dessen Identität bzw. deren Beschaffenheit bekannt ist (Sonde), und einem nachzuweisenden, unbekannten Molekül bzw. nachzuweisenden, unbekannten Molekülen (Ziel- bzw. Targetmolekül oder Target). Biomedical tests are often based on evidence of an interaction between a molecule or an affinity matrix, its identity or its nature is known (probe), and an unknown molecule or unknown molecules to be detected (target or target molecule).  

Bei modernen Tests sind die Sonden, so es sich bei ihnen um Moleküle handelt, häufig in Form einer Substanzbibliothek in bekannter Menge und Position auf Trägern immobilisiert. Solche Vorrichtungen werden auch Sonden-Arrays oder Chips genannt. Ein Sonden-Array umfasst charakteristischerweise mehrere so genannte Array-Elemente, bei denen es sich um die Bereiche eines Sonden-Arrays handelt, in denen eine bestimmte Molekularsonde häufig in mehrfacher Kopie immobilisiert ist. Die Summe aller belegten Array-Elemente bildet damit das Sonden-Array.In modern tests, the probes, if they are molecules, are often in Form of a substance library in known quantity and position immobilized on supports. Such devices are also called probe arrays or chips. A probe array characteristically comprises several so-called array elements, which are the areas of a probe array where a particular molecular probe is often in multiple copy is immobilized. The sum of all occupied array elements thus forms the probe array.

Die Immobilisierung von molekularen Sonden in Form einer Substanzbibliothek auf Sonden- Arrays ermöglicht es, eine Probe, die die nachzuweisenden Target-Moleküle enthält, parallel an mehreren Sonden gleichzeitig zu analysieren, was eine systematische Analyse mit hohem Durchsatz bei geringem Zeitaufwand ermöglicht (high throughput screening, D. J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, Gene Expression and DNA Arrays, Nature 2000, 405, 827-836). Für die Herstellung der Sonden-Arrays werden die Sonden üblicherweise in vorgegebener Art und Weise auf einer geeigneten, beispielsweise in WO 00/12575 beschriebenen Matrix immobilisiert (siehe z. B. US 5,412,087, WO 98/36827) bzw. synthetisch erzeugt (siehe z. B. US 5,143,854).The immobilization of molecular probes in the form of a substance library on probe Arrays make it possible to run a sample that contains the target molecules to be detected in parallel on several probes at the same time, which is a systematic analysis with high Throughput with little time required (high throughput screening, D. J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, Gene Expression and DNA Arrays, Nature 2000, 405, 827-836). For the manufacture of the probe arrays, the probes are usually made in a predetermined manner and manner on a suitable matrix, for example described in WO 00/12575 immobilized (see e.g. US 5,412,087, WO 98/36827) or synthetically produced (see e.g. US 5,143,854).

Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Targetmolekül erfolgt prinzipiell folgendermaßen:
Die Sonde bzw. die Sonden werden in vorgegebener Art und Weise an einer bestimmten Matrix in Form eines Sonden-Arrays fixiert. Die Targets werden dann in einer Lösung mit den Sonden in Kontakt gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert. Weisen die Sonde und das Targetmolekül aufgrund von komplementären Eigenschaften eine Affinität zueinander auf, so findet während der Inkubation zwischen der Sonde und dem Target eine spezifische Wechselwirkung statt. Die dabei auftretende Bindung ist deutlich stabiler als die Bindung von Targetmolekülen an Sonden, die für das Targetmolekül nicht spezifisch sind. In principle, an interaction between the probe and the target molecule is detected as follows:
The probe or the probes are fixed in a predetermined manner to a specific matrix in the form of a probe array. The targets are then brought into contact with the probes in a solution and incubated under defined conditions. If the probe and the target molecule have an affinity for one another due to complementary properties, a specific interaction takes place during the incubation between the probe and the target. The binding that occurs is significantly more stable than the binding of target molecules to probes that are not specific for the target molecule.

Zum Entfernen von unspezifisch gebundenen Targetmolekülen wird das System mit ent­ sprechenden Lösungen gewaschen oder erwärmt bzw. entsprechend restriktiv wirkenden Maßnahmen unterworfen.To remove non-specifically bound target molecules, the system is ent speaking solutions washed or warmed or correspondingly restrictive Measures subjected.

Der Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Target und seiner Sonde kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, die in der Regel von der Art des Markers abhängen, der je nach Aufbau des Experiments vor, während oder nach der Wechsel­ wirkung des Targetmoleküls mit dem Sonden-Array in die Targetmoleküle oder in die Son­ denmoleküle eingebracht worden ist. Bei solchen Markern kann es sich z. B. um fluores­ zierende Gruppen, um radioaktive Markierungen, um Enzyme oder chemolumineszierende Moleküle handeln, wobei die zu verwendende Nachweismethode sich nach der Art des Markers richtet (A. Marshall, J. Hodgson, DNA Chips: An Array of Possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).Evidence of the specific interaction between a target and its probe can then be done by a variety of methods, usually of the type of Markers depend, depending on the setup of the experiment, before, during or after the change Effect of the target molecule with the probe array in the target molecules or in the son has been introduced. Such markers may be e.g. B. fluores ornamental groups, around radioactive labels, around enzymes or chemiluminescent Act molecules, the detection method to be used depends on the type of Markers (A. Marshall, J. Hodgson, DNA Chips: An Array of Possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology 1998, 16, 40-44).

Abhängig von der auf dem Sonden-Array immobilisierten Substanzbibliothek und der chemischen Natur der Targetmoleküle können anhand dieses Testprinzips Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, zwischen Proteinen und Proteinen sowie zwischen Nukleinsäuren und Proteinen untersucht werden (zur Übersicht siehe F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin).Depending on the substance library immobilized on the probe array and the Using this test principle, the chemical nature of the target molecules can interact between nucleic acids and nucleic acids, between proteins and proteins as well between nucleic acids and proteins are investigated (for an overview see F. Lottspeicher, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg / Berlin).

Als Substanzbibliotheken, die auf Sonden-Arrays oder Chips immobilisiert werden können, kommen dabei Antikörper-Bibliotheken, Rezeptor-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken und Nukleinsäure-Bibliotheken in Frage. Die Nukleinsäure-Bibliotheken nehmen die mit Abstand wichtigste Rolle ein, wobei es sich besonders häufig um DNA-Molekül- oder RNA-Molekül- Bibliotheken handelt. Die Sonden-Array basierte Analyse von Nukleinsäure-Nukleinsäure- Wechselwirkungen folgt dabei den Prinzipien der Nukleinsäure-Hybridisierungstechnik (A. A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, In vitro-Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg/Berlin/Oxford).As substance libraries that can be immobilized on probe arrays or chips, come antibody libraries, receptor libraries, peptide libraries and Nucleic acid libraries in question. The nucleic acid libraries take this by far most important role, which is particularly often DNA molecule or RNA molecule Libraries. The probe array based analysis of nucleic acid nucleic acid Interactions follow the principles of nucleic acid hybridization technology (A.  A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I.J. Leitch, 1994, in vitro hybridization, spectrum Academic publisher, Heidelberg / Berlin / Oxford).

Üblicherweise erfolgt der Nachweis spezifischer Wechselwirkungen zwischen einer Sonde und einem Target durch fluoreszenzoptische Auswertung, da diese sich durch eine hohe Empfindlichkeit, durch Vielseitigkeit hinsichtlich der verwendbaren Marker und durch die Möglichkeit zur orts- und zeitaufgelösten Detektion der Wechselwirkung mit vergleichsweise geringem Aufwand (vor allem im Vergleich zu massenspektroskopischen Verfahren) sowie durch die Eliminierung der Strahlenbelastung, wie sie bei der Verwendung von radioaktiven Markierungsreagenzien auftritt, auszeichnen. Zusätzlich kann abhängig von den zur Markierung verwendeten Fluorophoren der Anregungs- und Detektionswellenlängenbereich eingestellt werden.Usually, specific interactions between a probe are detected and a target by fluorescence-optical evaluation, since these are characterized by a high Sensitivity, by versatility with regard to the markers that can be used and by the Possibility of location- and time-resolved detection of the interaction with comparative little effort (especially compared to mass spectroscopic methods) and by eliminating radiation exposure, as when using radioactive Labeling reagents occur. In addition, depending on the Labeling used fluorophores in the excitation and detection wavelength ranges can be set.

Allerdings werden qualitative und quantitative fluoreszenzoptische Auswertungen in der Praxis durch eine Reihe von Faktoren negativ beeinflusst, die in der Fluoreszenzspektroskopie an sich, in der Art der gewählten Fluoreszenzmarker und in der Art und dem Aufbau der verwendeten Detektionssysteme begründet sind. Zu diesen Faktoren zählen vor allem unspezifische Hintergrundsignale (Signalrauschen), die durch intrinsische optische Eigenschaften der Fluoreszenzmarker (z. B. Bleichen, Quenching bzw. Fluoreszenzlöschung der verwendeten Farbstoffe), durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Sonde bzw. Targets und deren Lösungen (z. B. Autofluoreszenz), durch Schwankungen im optischen System (z. B. Strahlungsintensität der Lichtquelle und Fremdlicht) und durch Aufbau und Art der verwendeten Detektionssysteme (z. B. Autofluoreszenz der Assemblierungselemente, Fähigkeit der Detektoren zur räumlichen und zeitlichen Auflösung, Streuungen, Reflexionen) zustande kommen.However, qualitative and quantitative fluorescence-optical evaluations are carried out in the Practice adversely affected by a number of factors in fluorescence spectroscopy in itself, in the type of fluorescent marker chosen and in the type and structure of the detection systems used are justified. These factors include above all unspecific background signals (signal noise) caused by intrinsic optical Properties of the fluorescence markers (e.g. bleaching, quenching or quenching of fluorescence of the dyes used), due to the physico-chemical properties of the probe or targets and their solutions (e.g. autofluorescence) due to fluctuations in the optical System (e.g. radiation intensity of the light source and extraneous light) and by structure and art the detection systems used (e.g. autofluorescence of the assembly elements, Ability of the detectors for spatial and temporal resolution, scattering, reflections) occurrence.

Zur Beurteilung, ob eine gemessene Fluoreszenzintensität ein Signal darstellt oder lediglich zum Signalrauschen gehört, müssen daher die Störeinflüsse beseitigt bzw. minimiert werden und Vorrichtungen und Methoden eingesetzt werden, die eine Referenzierung der gemessenen Fluoreszenzsignale erlauben. Solche Vorrichtungen werden auch als Fluoreszenzeichstandard bezeichnet.To assess whether a measured fluorescence intensity represents a signal or only part of the signal noise, the interference must therefore be eliminated or minimized  and devices and methods are used that reference the measured Allow fluorescence signals. Such devices are also known as the fluorescence drawing standard designated.

Aus dem Bemühen, das gerätebedingte Signalrauschen zu minimieren, resultiert der hohe technische Aufwand zum Aufbau hochsensitiver Detektoren, die eine qualitative und quantitative Auswertung von Fluoreszenzsignalen erlauben. Insbesondere für die Auswertung beim high throughput screening von Sonden-Arrays, das eines gewissen Automatisierungsgrads bedarf, sind speziell angepasste Detektionssysteme erforderlich.The high level results from the effort to minimize the device-related signal noise technical effort to build highly sensitive detectors, the qualitative and allow quantitative evaluation of fluorescence signals. Especially for the evaluation in high throughput screening of probe arrays, that of a certain amount Automation level, specially adapted detection systems are required.

Beim fluoreszenzoptischen Auslesen von molekularen Sonden-Arrays mittels Standardepifluoreszenzaufbauten werden z. B. CCD (Charge Coupled Device) basierte Detektoren verwendet, die zur qualitativen Unterscheidung von optischen Effekten (Streuung, Reflexion) die Anregung der Fluorophore im Dunkelfeld (durch Auflicht oder Durchlichtmikroskopie) realisieren (C. E. Hooper et al., Quantitive Photone Imaging in the Life Sciences using intensified CCD Cameras, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 1990, 337-344). Die Abbildung der Sonden-Arrays erfolgt dabei entweder in einer Belichtung oder durch Rastern unter Verwendung hochauflösender Optiken. Um auftretende Autofluoreszenz oder systembedingte optische Effekte wie die Beleuchtungshomogenität über den gesamten Sonden-Array zu minimieren bzw. zu gewähren, sind komplizierte Beleuchtungsoptiken und Filtersysteme notwendig.When reading molecular probe arrays using fluorescence optics Standard epifluorescence structures are e.g. B. CCD (Charge Coupled Device) based Detectors used for the qualitative differentiation of optical effects (scattering, Reflection) the excitation of the fluorophores in the dark field (by reflected light or Transmitted light microscopy) (C.E. Hooper et al., Quantitative Photone Imaging in the Life Sciences using intensified CCD Cameras, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence 1990, 337-344). The mapping of the probe arrays takes place either in an exposure or by rasterization using high resolution optics. About autofluorescence or system-related optical effects like that Minimize or reduce lighting homogeneity across the entire probe array grant, complex lighting optics and filter systems are necessary.

Konfokale Scanning-Systeme (beschrieben in US 5,304,810) erlauben die Auswertung von Fluoreszenzsignalen aus ausgewählten Ebenen einer Probe. Sie beruhen auf der Selektion der Fluoreszenzsignale entlang der optischen Achse mittels Lochblenden, woraus sich ein hoher Justageaufwand für die Proben sowie die Etablierung eines leistungsfähigen Autofokussystems ergibt. Solche Systeme sind in der technischen Lösung hochkomplex und die erforderlichen Komponenten, zu denen Laser, Lochblenden, (gekühlte) Detektoren (z. B. PMT, Avalanche-Dioden, CCD-Systeme), hochgenaue mechanische Translationselemente und Optiken gehören, müssen mit erheblichem Aufwand integriert und aufeinander optimiert werden (beschrieben in US 5,459,325, US 5,192,980, US 5,834,758).Confocal scanning systems (described in US 5,304,810) allow the evaluation of Fluorescence signals from selected levels of a sample. They are based on the selection of the Fluorescence signals along the optical axis using pinholes, resulting in a high Adjustment effort for the samples as well as the establishment of a powerful one Autofocus system results. Such systems are highly complex in the technical solution the necessary components, including lasers, pinhole diaphragms, (cooled) detectors (e.g.  PMT, avalanche diodes, CCD systems), high-precision mechanical translation elements and optics must be integrated and optimized for each other with considerable effort (described in US 5,459,325, US 5,192,980, US 5,834,758).

Es sind also Detektionssysteme bekannt, mit denen die molekulare Wechselwirkung eines mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Targets und einer spezifischen Sonde, wie sie z. B. bei Sonden-Array basierten Experimenten auftritt, nachgewiesen werden kann. Trotz des beschriebenen hohen technischen Aufwands, der je nach Art und Aufbau des verwendeten Detektionssystems für die Minimierung des Signalrauschens betrieben wird, kann dies nicht gänzlich beseitigt werden. Daher ist für die qualitative und quantitative Auswertung von gemessenen Fluoreszenzsignalen nach wie vor eine Referenzierung oder Kalibrierung der Experimente und der Detektionsgeräte mittels Fluoreszenzeichstandards notwendig. Eine Kalibrierung von Detektionssystemen mittels Fluoreszenzeichstandards wird durchgeführt, um u. a. Aussagen hinsichtlich der Sensitivität des räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens und der geometrischen Bildfehler, wie z. B. der Bildfeldwölbung des jeweiligen Systems vornehmen zu können.Detection systems are therefore known with which the molecular interaction with a a fluorescent marker provided targets and a specific probe, such as z. B. at Probe array based experiments can be detected. Despite the described high technical effort, depending on the type and structure of the used Detection system is operated to minimize signal noise, this can not be completely eliminated. Therefore, for the qualitative and quantitative evaluation of measured fluorescence signals still referencing or calibrating the Experiments and the detection devices using fluorescence standards required. A Calibration of detection systems using fluorescence standards is carried out, um u. a. Statements regarding the sensitivity of the spatial and temporal Resolving power and geometrical aberrations, such as. B. the field curvature of the system.

Die Kalibrierung von Detektionsgeräten hinsichtlich ihres zeitlichen Auflösungsvermögens ist notwendig, da zu Unterscheidung des eigentlichen (häufig langlebigen) Fluoreszenzsignals von (häufig kurzlebigen) Autofluoreszenzsignalen die Messung der Signale über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden muss.The calibration of detection devices with regard to their temporal resolving power is necessary because it is necessary to differentiate between the actual (often long-lived) fluorescence signal of (often short-lived) autofluorescence signals the measurement of the signals over a longer period must be carried out.

Bei der Verwendung von CCD-Detektoren müssen mit Hilfe von Standards z. B. die Linearität und Sensitivität des Detektors im verwendeten Fluoreszenzwellenlängenbereich, das räumliche und zeitliche Auflösungsvermögen sowie die Bildfeldwölbung (Flatfieldbestimmung) des Detektors bestimmt werden. Konfokale Detektionssysteme müssen hinsichtlich der Bereiche, die angeregt bzw. zur Gesamtintensität beitragen, kalibriert werden. When using CCD detectors with the help of standards such. B. linearity and sensitivity of the detector in the fluorescence wavelength range used spatial and temporal resolution as well as the field curvature (Flatfield determination) of the detector can be determined. Confocal detection systems must with regard to the areas that are stimulated or contribute to the overall intensity.  

Eine Kalibrierung von Experimenten mittels Fluoreszenzeichstandards ist notwendig, da die als Marker verwendeten Fluorophore hinsichtlich ihrer Fluoreszenzausbeuten aufgrund der Umgebungsbedingungen, denen sie ausgesetzt sind (z. B. Autofluoreszenz von Lösungskomponenten, pH-Wert, Temperatur, Bestrahlungszeit), beträchtlichen Schwankungen unterworfen sind und die absolute Quantifizierung von z. B. Hybridisierungsausbeuten auf Sonden-Arrays damit nur bedingt möglich ist.A calibration of experiments using fluorescence standards is necessary because the fluorophores used as markers with regard to their fluorescence yields due to the Environmental conditions to which they are exposed (e.g. autofluorescence from Solution components, pH, temperature, irradiation time), considerable Are subject to fluctuations and the absolute quantification of z. B. Hybridization yields on probe arrays are therefore only possible to a limited extent.

Das Kalibrieren von verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen mittels Fluoreszenzeichstandards ist auch deswegen sehr wichtig, da nur eine solche Kalibrierung einen Vergleich von Fluoreszenzsignalen von Experimenten, die mit unterschiedlichen Detektionssystemen aber auch Geräten eines Systems gemessen wurden, erlaubt (system- oder geräteübergreifender Vergleich).The calibration of different fluorescence detection systems using Fluorescence drawing standards are also very important because only such a calibration a comparison of fluorescence signals from experiments with different Detection systems but also devices of a system were measured allowed (system or cross-device comparison).

Im Stand der Technik sind unterschiedliche Lehren bekannt, die eine Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen bzw. Fluoreszenzsignalen ermöglichen sollen.Various teachings are known in the prior art that calibrate Fluorescence detection systems or fluorescence signals should enable.

Zur Kalibrierung von Fluroeszenzdetektionsgeräten können z. B. Chips, die aus einer fluoreszierenden Plastikschicht bestehen, verwendet werden. Diese Eichstandards haben den Nachteil, dass sie keine Kalibrierung der Detektionssysteme hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens oder hinsichtlich deren dynamischen Eigenschaften über einen weiten Fluoreszenzbereich erlauben. Auch eine Bestimmung der Bildfeldwölbung von z. B. CCD- Detektoren ist mit diesen Standards nicht möglich, da aufgrund der Dicke des Chips eine Homogenisierung des Fluoreszenzsignals durch den Chip stattfindet. Damit ist eine Kalibrierung des Einflusses der geometrischen Verhältnisse auf die Detektion von Fluoreszenzsignalen, der insbesondere bei unterschiedlichen Detektionssystemen und Prinzipien eine entscheidende Rolle haben kann, weder geräte- noch systemübergreifend einstellbar. For calibration of fluorescence detection devices, e.g. B. chips that from a fluorescent plastic layer are used. These calibration standards have the Disadvantage that they do not calibrate the detection systems with regard to their spatial Resolving power or in terms of their dynamic properties over a wide range Allow fluorescence range. A determination of the field curvature of z. B. CCD Detectors are not possible with these standards because of the thickness of the chip The chip homogenizes the fluorescence signal. So that's one Calibration of the influence of the geometric relationships on the detection of Fluorescence signals, especially in different detection systems and Principles can play a crucial role, neither across devices nor across systems adjustable.  

Bei der Verwendung von CCD-basierten Fluoreszenzdetektoren und insbesondere bei der Anregung durch aufgeweitete oder strahlgeformte Laser oder multispektrale Beleuchtungs­ systeme wie z. B. Kaltlichtquellen sind zum Abgleich der Beleuchtungshomogenität bei der Verwendung von z. B. bewegten Streuscheiben aufwändige Berechnungen und Bildmanipulationen zur Definition des Flatfields nötig. Fluoreszenzeichstandards, die eine Definition des Flatfields zur Korrektur der Beleuchtungshomogenität bei solchen direkt abbildenden Systemen ermöglichen, sind aus dem Stand der Technik nicht bekannt.When using CCD-based fluorescence detectors and especially when Excitation through expanded or beam-shaped lasers or multispectral lighting systems such as B. Cold light sources are used to adjust the lighting homogeneity Use of e.g. B. moving lenses complex calculations and Image manipulation necessary to define the flatfield. Fluorescent standards, the one Definition of the flat field for correcting the lighting homogeneity in such cases enable imaging systems are not known from the prior art.

Weiterhin gibt es Fluoreszenzeichstandards, die auf der Basis von dotierten Gläsern beruhen. Auch diese Standards haben den Nachteil, dass sie keine Kalibrierung der Detektionssysteme hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens bzw. hinsichtlich deren geometrischen Eigenschaften erlauben, da wegen der Dimensionen solcher Standards eine Homogenisierung der Signale durch das Volumen der Glases stattfindet. Konfokale Systeme, bei denen nur bestimmte Bereiche und Schichten entlang der optischen Achse angeregt werden bzw. zur Gesamtintensität beitragen und das Problem von Transmissionsverlusten durch darüberliegende Strukturschichten besteht, können mit solchen Standards ebenfalls nicht hinsichtlich ihrer geometrischen Eigenschaften kalibriert werden.There are also fluorescence drawing standards based on doped glasses. These standards also have the disadvantage that they do not calibrate the detection systems with regard to their spatial resolution or with regard to their geometric Properties allow a homogenization because of the dimensions of such standards the signals take place through the volume of the glass. Confocal systems where only certain areas and layers along the optical axis are excited or Contribute overall intensity and through the problem of transmission loss Structural layers lying on top cannot exist with such standards either be calibrated with regard to their geometric properties.

In WO 01/06227 ist die Herstellung eines Fluoreszenzeichstandards auf der Basis von Mikro- bzw. Nanopartikeln und deren Anwendung zur Kalibrierung sowohl von Fluoreszenzdetektionssystemen als auch zur Referenzierung von Fluoreszenzintensitäts­ signalen in fluorometrischen Assays beschrieben. Diese Standards eignen sich ebenfalls nicht zur Kalibrierung der Fluoreszenzdetektionssysteme hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens. Damit ist ein geräteübergreifender Vergleich von aus Sonden-Array basierten Experimenten gewonnenen Signalintensitätsdaten nur bedingt möglich. WO 01/06227 describes the production of a fluorescence drawing standard based on micro- or nanoparticles and their application for the calibration of both Fluorescence detection systems as well as for referencing fluorescence intensity signals described in fluorometric assays. These standards are also unsuitable for calibration of the fluorescence detection systems with regard to their spatial Resolving power. This is a cross-device comparison of the probe array signal intensity data obtained based on experiments is only possible to a limited extent.  

Um die kurzlebige Untergrundfluoreszenz (z. B. von autofluoreszierenden Lösungsmittelmolekülen) von dem eigentlichen Fluoreszenzsignal zu unterscheiden und das eigentliche Signal referenzieren zu können, können langlebig emittierende Markerstoffe als Standard verwendet werden, deren Signal durch zeitaufgelöste Detektionsmethoden nachgewiesen wird. Dabei handelt es sich häufig um phosphoreszierende Chelate der Seltenerdmetalle (insbesondere die des Europium oder Terpium). Diese Stoffe besitzen aber den Nachteil, dass sie nur mit UV-Lichtquellen angeregt werden können. Darüber hinaus sind die verwendeten Chelate in wässriger Form häufig instabil.The short-lived background fluorescence (e.g. from autofluorescent To distinguish solvent molecules) from the actual fluorescence signal and that To be able to reference the actual signal, long-term emitting marker substances can be used as Standard are used, their signal through time-resolved detection methods is proven. These are often phosphorescent chelates Rare earth metals (especially those of the Europium or Terpium). But these substances have the disadvantage that they can only be excited with UV light sources. Beyond that the chelates used in aqueous form are often unstable.

Um eine quantitative Auswertung von molekularen Wechselwirkungen bei Sonden-Array basierten Experimenten durch Fluoreszenzmessung und eine Normierung solcher Signale zu erreichen, werden zur Eichung bzw. Referenzierung die Experimente unter zweifacher Färbung der Sondenmoleküle, z. B. durch kompetative Hybridisierung, durchgeführt (M. Shena, D. Shalon, R. W. Davis, P. O. Brown, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science, 1995, 220,467-70 und D. Shalon, S. J. Smith, P. O. Brown, A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe for hybridization, Genome Res., 1996, 6, 639-45). Da bei solchen Eichstandards die durch die Referenzmoleküle erhaltenen Signale stets von den konkreten experimentellen Bedingungen abhängig sind, ist ein quantitativer, geräte- oder systemübergreifender Vergleich schwer möglich.For a quantitative evaluation of molecular interactions in probe array based experiments by fluorescence measurement and normalization of such signals reach, the experiments are carried out in duplicate for calibration or referencing Coloring of the probe molecules, e.g. B. carried out by competitive hybridization (M. Shena, D. Shalon, R. W. Davis, P. O. Brown, Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray, Science, 1995, 220,467-70 and D. Shalon, S.J. Smith, P.O. Brown, A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe for hybridization, Genome Res., 1996, 6, 639-45). There with such calibration standards, the signals obtained by the reference molecules always from the depending on concrete experimental conditions is a quantitative, equipment or cross-system comparison difficult.

Anhand der Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Fluoreszenzeichstandards wird deutlich, dass ein großer Bedarf an Vorrichtungen besteht, die eine Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens sowie hinsichtlich deren geometrischen und dynamischen Eigenschaften ermöglichen. Based on the disadvantages of the fluorescence drawing standards known from the prior art it becomes clear that there is a great need for devices that calibrate Fluorescence detection systems with regard to their spatial and temporal Resolving power as well as with regard to their geometric and dynamic Enable properties.  

Zusätzlich besteht ein großer Bedarf an Vorrichtungen zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen die den system- und geräteübergreifenden Vergleich und/oder den testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen von z. B. Sonden-Array basierten Experimenten ermöglichen.In addition, there is a great need for devices for referencing Fluorescence signals that the cross-system and cross-device comparison and / or the Cross-test comparison of fluorescence signals from e.g. B. Probe array based Enable experiments.

Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die eine Referenzierung von Fluoreszenzsignalen hinsichtlich der gemessenen Intensität und/oder eine Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren Sensitivität, deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens und/oder hinsichtlich deren geometrischen und dynamischen Eigenschaften erlauben. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die leicht einen geräte- und systemübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen aus Experimenten, wobei es sich z. B. um Sonden-Array basierte Experimente handeln kann, ermöglichen. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Fluoreszenzeichstandards zur Verfügung zu stellen, die einen testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignaldaten erlauben. Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Vorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die eine Referenzierung bzw. Normierung von Fluoreszenzsignalen unter Berücksichtigung von Bleich- und Fluoreszenzlöschungseffekten erlauben.The present invention has for its object to provide devices that a Referencing fluorescence signals with respect to the measured intensity and / or a Calibration of fluorescence detection systems with regard to their sensitivity, their spatial and temporal resolution and / or with regard to their geometric and allow dynamic properties. Another object of the present invention is to provide devices that are easy to use cross-system comparison of fluorescence signals from experiments, where it z. B. may be probe array based experiments. It is also a Object of the present invention to provide fluorescence drawing standards that allow cross-test comparison of fluorescence signal data. After all it is an object of the present invention to provide devices that provide a Referencing or normalization of fluorescence signals taking into account Allow bleaching and fluorescence quenching effects.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung von solchen Fluoreszenzeichstandards zur Verfügung zu stellen.Another object of the present invention is to provide processes for producing to provide such fluorescence drawing standards.

Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben, die sich aus der Beschreibung der Erfindung ergeben, dienen die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen definiert.To solve these and other problems arising from the description of the invention result, serve the features of the independent claim. advantageous Embodiments of the invention are defined in the subclaims.

Erfindungsgemäß werden die Aufgaben dadurch gelöst, dass auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger in definierten Bereichen mindestens eine Polymerschicht so aufgebracht ist, dass diese Bereiche nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, wobei einige der aufgebrachten Polymerschichten sich hinsichtlich ihrer Dicke und/oder Zusammensetzung unterscheiden.According to the invention, the tasks are solved by essentially not fluorescent carrier in defined areas at least one polymer layer  is applied that these areas fluoresce after appropriate irradiation, wherein some of the applied polymer layers differ in terms of their thickness and / or Differentiate composition.

Solche erfindungsgemäßen Vorrichtungen, die im Folgenden auch als Fluoreszenzeichstandard bzw. Standard bezeichnet werden, zeigen in den definierten Bereichen nach entsprechender Bestrahlung eine Fluoreszenz, deren Intensität vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar ist. Damit können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards zur Kalibrierung von verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens, hinsichtlich deren geometrischen und dynamischen Eigenschaften sowie hinsichtlich deren Sensitivität verwendet werden.Such devices according to the invention, which are also referred to below as Fluorescence standard or standard are shown in the defined Areas after corresponding irradiation have a fluorescence whose intensity can be predetermined and is reproducibly adjustable. Fluorescence drawing standards according to the invention can thus be used for the calibration of different fluorescence detection systems with regard to their spatial and temporal resolution, with regard to their geometric and dynamic properties and their sensitivity can be used.

Da der Wellenlängenbereich der in den definierten Bereichen eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch Änderung der Zusammensetzung der Polymerschichten vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar ist, können die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards zur Kalibrierung von verschiedenen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren dynamischen Eigenschaften verwendet werden.Since the wavelength range in the defined ranges of an inventive Fluorescence drawing standards after corresponding irradiation caused fluorescence predeterminable by changing the composition of the polymer layers and is reproducibly adjustable, the fluorescence standards according to the invention can Calibration of different fluorescence detection systems with regard to their dynamic properties can be used.

Die Polymerschichten von erfindungsgemäßen Vorrichtungen werden in definierten Bereichen aufgebracht, deren Form und Größe vorbestimmbar und reproduzierbar eingestellt werden kann. Solche Fluoreszenzeichstandards, die auch als strukturierte Fluoreszenzeichstandards bezeichnet werden, können zur Kalibrierung von unterschiedlichen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden.The polymer layers of devices according to the invention are defined in Areas applied, the shape and size of which can be predetermined and reproducibly set can be. Such fluorescent drawing standards, also called structured Fluorescence standards can be used to calibrate different ones Fluorescence detection systems with regard to their spatial resolution be used.

Da die Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards nur von der Dicke und/oder der Zusammensetzung der in den definierten Bereichen aufgebrachten Polymerschichten abhängen und z. B. nicht von Komponenten der Target-Lösungen beeinflusst werden, eignen sich die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards zur geräte- und detektionsübergreifenden und/oder zur testübergreifenden Bewertung und Referenzierung von Fluoreszenzsignalen, die z. B. bei Sonden-Array basierten Experimenten gemessen werden.Since the fluorescence properties of the fluorescence standards according to the invention only from the thickness and / or the composition of the applied in the defined areas  Depend polymer layers and z. B. not from components of the target solutions are influenced, the fluorescence standards according to the invention are suitable for device and cross-detection and / or cross-test evaluation and referencing of fluorescence signals, e.g. B. measured in probe array based experiments become.

Bei den in den definierten Bereichen von erfindungsgemäßen Vorrichtungen aufgebrachten Polymerschichten kann es sich um eine oder mehrere Polymerschichten handeln, die sich in ihrer Zusammensetzung und/oder Dicke unterscheiden. Die Polymerschichten bestehen aus mindestens einem fluoreszierenden Polymer oder aus einem Polymergemisch, wobei mindestens eine Polymerkomponente des Gemischs fluoreszierend ist. Bevorzugte fluoreszierende Polymere umfassen z. B. Positiv- und/oder Negativ-Photolacke auf Basis von Epoxidharzen wie z. B. SU8 und Novolacke und/oder PMMA und/oder photosensitives Polyimid und/oder Benzocyclobuten. Polymere, die für die Herstellung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards geeignet sind, d. h. die nach entsprechender Bestrahlung eine Fluoreszenz zeigen, sind auch aus US 6,091,488 oder US 4,482,424 bekannt.In the case of devices applied according to the invention in the defined areas Polymer layers can be one or more polymer layers that are in differ in their composition and / or thickness. The polymer layers consist of at least one fluorescent polymer or from a polymer mixture, wherein at least one polymer component of the mixture is fluorescent. preferred fluorescent polymers include e.g. B. positive and / or negative photoresists based on Epoxy resins such as B. SU8 and Novolacke and / or PMMA and / or photosensitive Polyimide and / or benzocyclobutene. Polymers used in the manufacture of fluorescence standards according to the invention are suitable, d. H. according to the corresponding Irradiation show fluorescence are also from US 6,091,488 or US 4,482,424 known.

Die Polymerschichten von erfindungsgemäßen Vorrichtungen können neben mindestens einem Polymer zusätzlich fluoreszierende Stoffe enthalten, bei denen es sich nicht um Polymere handelt. Da diese Stoffe in die Polymerschichten eingebettet sind, werden ihre Fluoreszenzeigenschaften von Umgebungsfaktoren (z. B. Komponenten der Target-Lösungen) nicht beeinflusst. Bevorzugt umfassen solche fluoreszierenden Stoffe Chromophore, organische Farbstoffe wie z. B. Azofarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Porphyninenfarbstoffe und/oder anorganische Farbstoffe wie z. B. metallische Farbstoffe und insbesondere Lanthanide. The polymer layers of devices according to the invention can in addition to at least a polymer also contain fluorescent substances that are not Polymers. Since these substances are embedded in the polymer layers, theirs Fluorescence properties of environmental factors (e.g. components of the target solutions) unaffected. Such fluorescent substances preferably comprise chromophores, organic dyes such as B. azo dyes, triphenylmethane dyes, Porphynin dyes and / or inorganic dyes such. B. metallic dyes and especially lanthanides.  

Bei erfindungsgemäßen Vorrichtungen kann der Wellenlängenbereich der in den definierten Bereichen nach entsprechender Bestrahlung auftretenden Fluoreszenz durch die Wahl der Zusammensetzung der Polymerschichten eingestellt werden. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die auf einem nicht fluoreszierenden Träger in definierten Bereichen aufgebrachten Polymerschichten durch eine breitbandige Eigenfluoreszenz gekennzeichnet, so dass sie im sichtbaren Spektralbereich sowie im nahen IR- und UV- Bereich nach schmalbandiger Anregung Fluoreszenzsignale in einem Wellenlängenbereich größerer Anregung zeigen. In einer anderen bevorzugten Ausführung der Erfindung zeigen die Polymerschichten in den definierten Bereichen eine schmalbandige Eigenfluoreszenz, deren Wellenlängenbereich von der Zusammensetzung der Polymerschichten abhängt.In devices according to the invention, the wavelength range defined in the Areas of fluorescence occurring after appropriate irradiation by the choice of Composition of the polymer layers can be adjusted. In a preferred one Implementation of the invention are those defined on a non-fluorescent support Areas applied to polymer layers by a broadband self-fluorescence marked so that they are in the visible spectral range as well as in the near IR and UV Area after narrow band excitation Fluorescence signals in a wavelength range show greater excitement. Show in another preferred embodiment of the invention the polymer layers have a narrow-band inherent fluorescence in the defined areas, whose wavelength range depends on the composition of the polymer layers.

Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bestehen die Polymerschichten nur aus einem Polymer, so dass der Wellenlängenbereich der Fluoreszenz nur von diesem Polymer abhängt. In weiteren bevorzugten Ausführungen der Erfindung bestehen die Polymerschichten aus einem oder mehreren nicht fluoreszierenden Polymeren und/oder einem oder mehreren zusätzlichen fluoreszierenden Stoffen, so dass der Wellenlängenbereich der Fluoreszenz dieser erfindungsgemäßen Vorrichtungen von der Art und der Kombination der Polymere und/oder der fluoreszierenden Stoffe abhängt.In a preferred embodiment of the invention, the polymer layers consist only of a polymer, so the wavelength range of fluorescence is only from this polymer depends. In further preferred embodiments of the invention, the Polymer layers made of one or more non-fluorescent polymers and / or one or several additional fluorescent substances, so that the wavelength range of the Fluorescence of these devices according to the invention of the type and the combination of Polymers and / or the fluorescent substances depends.

Erfindungsgemäß kann die Intensität der von einer Polymerschicht in einem definierten Bereich nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz auf vielfältige Weise vorbestimmbar eingestellt werden. Die Intensität der in den definierten Bereichen nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz ist erfindungsgemäß durch die Zusammensetzung der Polymerschichten und/oder die Dicke der Polymerschichten einstellbar. Erfindungsgemäß ist unter der Dicke einer Polymerschicht in einem definierten Bereich sowohl die Dicke der einzelnen Polymerschichten in einem Bereich, wenn in einem Bereich mehrere Polymerschichten aufgebracht sind, als auch die Dicke, die sich aus der Summe der Dicke der einzelnen Polymerschichten in einem Bereich ergibt, zu verstehen. According to the invention, the intensity of a polymer layer in a defined The area of fluorescence caused by appropriate irradiation in a variety of ways can be predetermined. The intensity of the in the defined areas Corresponding radiation-induced fluorescence is according to the invention through the Composition of the polymer layers and / or the thickness of the polymer layers adjustable. According to the invention, the thickness of a polymer layer is defined in a Area both the thickness of the individual polymer layers in one area when in one Multiple polymer layers are applied as well as the thickness resulting from the area Sum of the thickness of the individual polymer layers in an area is to be understood.  

Bei einer bevorzugten Ausführung der Erfindung erfolgt die Einstellung der Intensität in einem definierten Bereich durch das sukzessive Aufbringen von Polymerschichten einheitlicher Zusammensetzung in diesem Bereich. Die in diesem Bereich entstehende Polymerschicht zeigt eine einheitliche Zusammensetzung. Entsprechend können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, die in allen definierten Bereichen Polymerschichten einheitlicher Zusammensetzung, aber unterschiedlicher Schichtdicke tragen. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung können auf diese Weise Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, bei denen die Intensität der in einem Bereich nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz sich proportional zu der Dicke der in dem jeweiligen Bereich aufgebrachten Polymerschicht verhält.In a preferred embodiment of the invention, the intensity is set in a defined area through the successive application of polymer layers uniform composition in this area. The emerging in this area Polymer layer shows a uniform composition. Can accordingly Fluorescence standards according to the invention are produced which are defined in all Areas of polymer layers of uniform composition, but different Wear layer thickness. In a particularly preferred embodiment of the invention, this way fluorescent drawing standards are produced, in which the intensity of the in an area caused by corresponding fluorescence proportional to the thickness of the polymer layer applied in the respective area behaves.

Die Intensität der Fluoreszenz in den definierten Bereichen von erfindungsgemäßen Eichstandards ist auch durch Änderung der Zusammensetzung der Polymerschichten einstellbar. Unter Zusammensetzung der Polymerschichten wird dabei erfindungsgemäß die Art und Anzahl der Polymerkomponenten in einer Polymerschicht und/oder der zusätzlichen fluoreszierenden Stoffe sowie Menge der Polymerkomponenten und/oder zusätzlichen fluoreszierenden Stoffe pro Flächeneinheit verstanden.The intensity of the fluorescence in the defined areas of the invention Calibration standards is also changed by changing the composition of the polymer layers adjustable. According to the invention, the composition of the polymer layers is Type and number of polymer components in a polymer layer and / or the additional fluorescent substances and the amount of polymer components and / or additional understood fluorescent substances per unit area.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden Polymerschichten einheitlicher Dicke in verschiedenen definierten Bereichen aufgebracht, wobei die Polymerschichten sich nur hinsichtlich der Menge der zusätzlichen fluoreszierenden Teilchen pro Flächeneinheit unterscheiden. Auf diese Weise sind erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards herstellbar, bei denen die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz sich bei gleicher Schichtdicke proportional zu der Menge der fluoreszierenden Teilchen in den verschiedenen definierten Bereichen verhält. In einer anderen bevorzugten Ausführung der Erfindung kann damit bei konstanter Konzentration der fluoreszierenden Teilchen im Polymer durch Änderung der Schichtdicke quasi linear die resultierende Intensität eingestellt werden.In a preferred embodiment of the invention, polymer layers are of uniform thickness applied in different defined areas, the polymer layers only in terms of the amount of additional fluorescent particles per unit area differ. In this way, fluorescence standards according to the invention can be produced, where the intensity of those caused in the areas with appropriate radiation Fluorescence with the same layer thickness is proportional to the amount of fluorescent Particles behave in the different defined areas. In another preferred Execution of the invention can thus with a constant concentration of fluorescent  Particles in the polymer resulting from changing the layer thickness quasi linearly Intensity can be set.

Eine weitere Möglichkeit zur Einstellung der Intensität von erfindungsgemäß hergestellten Fluoreszenzeichstandards besteht darin, während des Herstellungsprozesses die erfindungsgemäßen Polymerschichten physikalischen Behandlungsmethoden wie Bestrahlung und Temperaturbehandlung (Tempern) zu unterwerfen. Ohne an eine Hypothese gebunden sein zu wollen, wird momentan davon ausgegangen, dass durch diese Behandlungsmethoden der Vernetzungs- bzw. Quervernetzungsgrad der Polymerschichten und entsprechend die Fluoreszenzeigenschaften der Polymerschichten verändert werden. Der Begriff Vernetzungs- bzw. Quervernetzungsgrad ist dem Fachmann geläufig. Für die Einstellung der Intensität von Polymerschichten durch Verfahren zur Veränderung des Vernetzungsgrads, eignen sich insbesondere Polymere, die eine duroplastische Vernetzung aufweisen wie z. B. die erwähnten Photolacke wie SU8.Another possibility for adjusting the intensity of those produced according to the invention Fluorescence drawing standards consist of the polymer layers according to the invention physical treatment methods such as radiation and subject to heat treatment (tempering). Without being tied to a hypothesis It is currently assumed that through these treatment methods the degree of crosslinking or crosslinking of the polymer layers and correspondingly the Fluorescence properties of the polymer layers can be changed. The term networking or degree of crosslinking is known to the person skilled in the art. For setting the intensity of Polymer layers by methods of changing the degree of crosslinking are suitable in particular polymers that have a thermosetting crosslinking such. B. the mentioned Photoresists like SU8.

Erfindungsgemäß können durch das sukzessive Aufbringen von Polymerschichten unter­ schiedlicher Dicke und/oder unterschiedlicher Zusammensetzung und/oder unterschiedlichen Quervernetzungsgrads in mehreren definierten Bereichen auf ein und dem selben Träger Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, die sich durch eine große Bandbreite sowohl hinsichtlich der Intensitäten als auch der Wellenlängenbereiche der nach entsprechender Bestrahlung auftretenden Fluoreszenz unterscheiden. Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards sind vielfältig zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen und zeitlichen Auflösungsvermögens sowie deren dynamischen und geometrischen Eigenschaften einsetzbar. Solche erfindungsgemäßen Vorrichtungen können auch als Fluoreszenzeichstandards verwendet werden, die leicht einen Vergleich von Fluoreszenzsignalen zwischen unterschiedlichen Detektionssystemen, aber auch Geräten eines Systems zulassen. According to the invention, the successive application of polymer layers under different thickness and / or different composition and / or different Degree of cross-linking in several defined areas on the same carrier Fluorescence drawing standards are produced that are characterized by a wide range of both with regard to the intensities as well as the wavelength ranges according to the corresponding Distinguish between radiation and fluorescence. Such according to the invention Fluorescence drawing standards are diverse for the calibration of fluorescence detection systems with regard to their spatial and temporal resolution as well as their dynamic and geometric properties can be used. Such devices according to the invention can also be used as fluorescent drawing standards that easily compare Fluorescence signals between different detection systems, but also devices allow a system.  

Die Fluoreszenzeigenschaften, wie z. B. die Quantenausbeute der fluoreszierenden Bereiche sind wegen der chemischen und physikalischen Eigenschaften der verwendeten Polymere und zusätzlichen fluoreszierenden Stoffe über die Bestrahlungszeit Änderungen unterworfen, so dass sich die resultierende Intensität nach einer gewissen Zeit der Nutzung verringert (Bleichen, siehe auch Miehler, 1992, Kunststoff-Mikromechanik: Morphologie, Deformations- und Bruchmechanismen., Hanser, München/Wien).The fluorescent properties, such as. B. the quantum yield of the fluorescent regions are because of the chemical and physical properties of the polymers and additional fluorescent substances are subject to changes over the irradiation time, so that the resulting intensity will decrease after a certain period of use (Bleaching, see also Miehler, 1992, plastic micromechanics: morphology, Deformation and fracture mechanisms., Hanser, Munich / Vienna).

Erfindungsgemäß können die in definierten Bereichen abgelegten Polymerschichten durch geeignete Herstellungsprotokolle (z. B. durch so genannte Temperprotokolle) hinsichtlich ihrer Intensitätsveränderungen über die Zeit derartig optimiert werden, dass diese Veränderungen linear sind und demzufolge die Intensitätsverhältnisse der resultierenden Fluoreszenz der einzelnen definierten Bereiche des strukturierten Standards konstant bleiben.According to the invention, the polymer layers deposited in defined areas can pass through suitable production protocols (e.g. through so-called tempering protocols) with regard to their intensity changes over time are optimized in such a way that they Changes are linear and consequently the intensity ratios of the resulting ones Fluorescence of the individual defined areas of the structured standard remain constant.

Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können für die Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionsgeräten hinsichtlich deren zeitlichen Auflösungsvermögens und zur Normierung von Experimenten hinsichtlich ihres zeitlichen Verlaufs verwendet werden. Da bei solchen erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards die Veränderungen der Intensität über die Zeit linear sind, können diese Standards auch für die Normierung von Experimenten auf Detektionsgeräten verwendet werden, deren optische Eigenschaften zeitlichen Änderungen (z. B. Laser- oder Lampenleistung) unterworfen sind.Such fluorescence drawing standards according to the invention can be used for the calibration of Fluorescence detection devices with regard to their temporal resolution and Standardization of experiments with regard to their temporal course can be used. There in such fluorescence drawing standards according to the invention, the changes in intensity Linear over time, these standards can also be used for the standardization of experiments be used on detection devices whose optical properties are temporal Changes (e.g. laser or lamp power) are subject to change.

Als bevorzugte Ausführungsformen können damit auch erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, deren Fluoreszenzausbeute über die Bestrahlungsdauer und den Alterungsprozess linear bzw. hinreichend vorbestimmbar beschrieben werden kann. Solche Fluoreszenzeichstandards können z. B. zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen von Experimenten, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt wurden, verwendet werden. Außerdem erlauben sie den geräte- und systemübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen. Thus, preferred embodiments of the invention can also be used Fluorescence drawing standards are produced, the fluorescence yield of which Irradiation duration and the aging process can be predetermined linearly or sufficiently can be described. Such fluorescence drawing standards can e.g. B. for referencing of fluorescence signals from experiments at different times were used. They also allow the device and cross-system comparison of fluorescence signals.  

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Polymerschichten in definierten Bereichen unterschiedlicher Form und/oder Größe auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger aufgebracht. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen haben diese definierten Bereiche eine quadratische, rechteckige und/oder kreisförmige Gestalt, deren Seitenlängen bzw. Durchmesser sich zwischen 500 nm und 5 mm bewegen.In a preferred embodiment of the invention, the polymer layers are defined in Areas of different shape and / or size on one essentially not fluorescent carrier applied. In particularly preferred embodiments these defined areas have a square, rectangular and / or circular shape, the Side lengths or diameters range between 500 nm and 5 mm.

Solche erfindungsgemäßen strukturierten Fluoreszenzeichstandards können zur Kalibrierung von unterschiedlichen Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden. Unter räumlichem Auflösungsvermögen ist dabei erfindungsgemäß die Separierbarkeit zweier abgebildeter fluoreszierender Punkte zu verstehen.Such structured fluorescence drawing standards according to the invention can be used for calibration of different fluorescence detection systems with regard to their spatial Resolving power can be used. Under spatial resolution is there according to the invention, the separability of two depicted fluorescent dots understand.

Da erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden können, deren definierte Bereiche Maßtoleranzen im 10 nm-Bereich aufweisen, können solche Fluoreszenzeichstandards bei mikroskopischen Techniken, wie z. B. der konfokalen 3-D- Mikroskopie als Normierungsinstrument für laterale und axiale Distanzen verwendet werden.Since fluorescence drawing standards according to the invention can be produced, their defined ones Ranges can have dimensional tolerances in the 10 nm range Fluorescence standards in microscopic techniques, such as. B. the confocal 3-D Microscopy can be used as a standardization tool for lateral and axial distances.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die definierten Bereiche in Array-Form auf dem Träger aufgebracht, d. h. dass mehrere definierte Bereiche gleicher Größe und Form zu einem Array-Element gruppiert sind, wohingegen Bereiche anderer Form und/oder Größe zu anderen Array-Elementen gruppiert sind.In a particularly preferred embodiment, the defined areas are in the form of an array applied to the carrier, d. H. that several defined areas of the same size and shape are grouped into an array element, whereas areas of different shape and / or size are grouped to other array elements.

In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards kann die Dicke der Polymerschichten so eingestellt werden, dass die maximale Dicke der verschiedenen Polymerschichten in einem Bereich deutlich geringer ist als die minimale Fokustiefe handelsüblicher konfokaler Detektionssysteme. Erfindungsgemäß sollten solche Fluoreszenzeichstandards eine bevorzugte Schichtdicke zwischen wenigen Nanometern und maximal 50 Mikrometern aufweisen, bevorzugt sollten die Schichtdicken zwischen einigen nm und 20 µm, zwischen 100 nm und 10 µm, besonders bevorzugt zwischen 200 nm und 5 µm liegen. Unter Fokustiefe ist erfindungsgemäß der Bereich entlang der optischen Achse zu verstehen, in dem eine Detektion von Fluoreszenzsignalen möglich ist. Dieser Bereich wird bei konventioneller Mikroskopie durch die numerische Apertur und bei konfokaler Scanningmikroskopie durch die Größe der Lochblenden (Pinholes) bestimmt. Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können zur Kalibrierung von physikalischen Aufbauten und Geräten, zur Erfassung von Fluoreszenzsignalen sowie zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen entsprechend markierte Substanzen und Substanzgruppen verwendet werden.In preferred embodiments of the fluorescence drawing standards according to the invention the thickness of the polymer layers can be adjusted so that the maximum thickness of the different polymer layers in one area is significantly less than the minimum Focus depth of commercially available confocal detection systems. According to the invention, such Fluorescence standards a preferred layer thickness between a few nanometers and  have a maximum of 50 micrometers, the layer thicknesses should preferably be between a few nm and 20 µm, between 100 nm and 10 µm, particularly preferably between 200 nm and 5 µm. According to the invention, the area along the optical axis is closed under focus depth understand, in which a detection of fluorescence signals is possible. This area will with conventional microscopy through the numerical aperture and with confocal Scanning microscopy determined by the size of the pinholes. Such Fluorescence standards according to the invention can be used for the calibration of physical Superstructures and devices for the detection of fluorescence signals and for referencing appropriately labeled substances and groups of substances used by fluorescence signals become.

Die Polymerschichten werden erfindungsgemäß auf im Wesentlichen nicht fluoreszierenden, bevorzugt optisch durchlässigen Trägern aufgebracht. Bei bevorzugten Ausführungen der Vorrichtung bestehen diese Träger aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas und Borofloatglas oder aus optisch durchlässigen, nicht fluoreszierenden polymeren Scheiben, besonders bevorzugt aus Polycarbonat, PMMA und/oder Folien. Als Träger eignen sich unter Umständen auch optisch nicht transparente Materialien, die im Wesentlichen keine Eigenfluoreszenz aufweisen.According to the invention, the polymer layers are coated on essentially non-fluorescent, preferably applied optically transparent carriers. In preferred versions of the These carriers are made of glass, particularly preferably of quartz glass and device Borofloat glass or from optically transparent, non-fluorescent polymeric panes, particularly preferably made of polycarbonate, PMMA and / or films. Are suitable as carriers under Under certain circumstances, optically non-transparent materials, which are essentially none Have inherent fluorescence.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Fluoreszenzeichstandards mit weiteren Trägersystemen verbunden. Diese Trägersysteme bestehen aus ebenfalls im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien. Bevorzugt handelt es sich dabei um optisch durchlässige Materialien wie Glas, besonders bevorzugt um Quarzglas, aber auch um optisch nicht transparente Materialien wie Plastik und/oder Metall, die im Wesentlichen keine Eigenfluoreszenz aufweisen.In a preferred embodiment of the invention, the fluorescence drawing standards are included connected to other carrier systems. These carrier systems also consist of Essential non-fluorescent materials. It is preferably optical transparent materials such as glass, particularly preferred around quartz glass, but also visually non-transparent materials such as plastic and / or metal, which are essentially none Have inherent fluorescence.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem Trägersystem um einen handelsüblichen Objektträger, wie er für z. B. für die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet wird. Auf solchen Trägern können z. B. Zellen oder Gewebeschnitte immobilisiert und durch Abgleich der Signale gegen den erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandard direkt ausgewertet werden.In a particularly preferred embodiment, this carrier system is concerned a commercially available slide, such as for z. B. for immunofluorescence microscopy  is used. On such carriers, for. B. cells or tissue sections immobilized and by comparing the signals against the fluorescence drawing standard according to the invention can be evaluated directly.

Eine Integration der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards kann z. B. auch direkt auf den Trägern erfolgen, auf denen Substanzbibliotheken in Form eines Sonden-Arrays abgelegt sind oder werden. Solche Fluoreszenzeichstandards erlauben eine unmittelbare Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und ermöglichen so die Bewertung von testspezifischen Untersuchungen. Zur Anbindung der Substanzbibliotheken kann die Oberfläche der Träger in mindestens den Bereichen, die die Substanzbibliothek enthalten sollen, durch Amino-, Carboxy-, Aldehyd- oder Epoxidgruppen funktionalisiert sein. Weitere funktionelle Gruppen zur Anbindung von Substanzbibliotheken sind dem Fachmann bekannt.An integration of the fluorescence drawing standards according to the invention can e.g. B. also directly on the carriers on which substance libraries are stored in the form of a probe array are or will be. Such fluorescent standards allow immediate Referencing fluorescence signals and thus enable the evaluation of test-specific examinations. To connect the substance libraries, the Surface of the carrier in at least the areas that contain the substance library should be functionalized by amino, carboxy, aldehyde or epoxy groups. Further Functional groups for linking substance libraries are known to the person skilled in the art.

Dabei sind erfindungsgemäß die Träger, auf denen die Fluoreszenzeichstandards bzw. die Substanzbibliotheken in Form von Sondenarrays abgelegt werden, so zu wählen, dass sie im Wesentlichen nicht fluoreszierend und, wenn benötigt, optisch durchlässig sind. Bevorzugte Materialien für die Herstellung von solchen Trägern sind Glas, besonders bevorzugt Quarzglas, Borofloatglas und/oder Polymere und/oder Silicium. Es können auch Materialien gewählt werden, die optisch nicht durchlässig sind, aber im Wesentlichen nicht fluoreszierend sind.According to the invention, the supports on which the fluorescence drawing standards or Substance libraries are stored in the form of probe arrays, so that they can be selected in the Are essentially non-fluorescent and, if required, optically transparent. preferred Materials for the production of such supports are glass, particularly preferred Quartz glass, borofloat glass and / or polymers and / or silicon. Materials can also be used can be selected which are not optically permeable, but essentially not fluorescent are.

Bei der Integration der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards in Sondenarrays können diese Sondenarrays durch Substanzbibliotheken auf Protein-, Peptid- oder Nukleinsäurebasis funktionalisiert sein. Bevorzugt handelt es sich bei den Proteinsubstanzbibliotheken, mit denen die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards funktionalisiert sind, um Antikörperbibliotheken, um Rezeptorbibliotheken, Rezeptor-Ligand-Bibliotheken und/oder Hormonbibliotheken. When integrating the fluorescence standards according to the invention into probe arrays these probe arrays through substance libraries based on proteins, peptides or nucleic acids be functionalized. The protein substance libraries, with which the fluorescence drawing standards according to the invention are functionalized to Antibody libraries to receptor libraries, receptor ligand libraries and / or Hormone libraries.  

Bei den Peptidbibliotheken, mit denen erfindungsgemäß Fluoreszenzeichstandards funktionalisiert sind, handelt es sich üblicherweise um pharmazeutisch oder biologisch aktive Peptide, um Antigenbibliotheken und/oder um Rezeptor-Ligand-Bibliotheken und/oder um Hormonbibliotheken.In the peptide libraries with which fluorescence drawing standards are used according to the invention are functionalized, it is usually pharmaceutically or biologically active Peptides, around antigen libraries and / or around receptor ligand libraries and / or around Hormone libraries.

Bei den Nukleinsäurebibliotheken, mit denen erfindungsgemäß Fluoreszenzeichstandards funktionalisiert sind, handelt es sich bevorzugt um DNA-Molekül-Bibliotheken und/oder RNA-Molekülbibliotheken. Besonders bevorzugt handelt es sich um mRNA-Bibliotheken, um rmA-Bibliotheken, um genomische DNA-Bibliotheken und/oder cDNA-Bibliotheken und/oder Plasmide.In the nucleic acid libraries with which fluorescence drawing standards are used according to the invention are functionalized, they are preferably DNA molecule libraries and / or RNA molecule libraries. These are particularly preferably mRNA libraries, for rmA libraries, for genomic DNA libraries and / or cDNA libraries and / or plasmids.

In einer bevorzugten Ausführungsform können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards direkt in die Fluoreszenzdetektionssysteme integriert werden, so dass eine online-Kalibrie­ rung der Geräte möglich ist. Da die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Fluoreszenzeich­ standards durch den Herstellungsprozess und durch die Zusammensetzung und Dicke der Polymerschicht sowie die Größe und Form der definierten Bereiche, in denen die Polymer­ schichten, die nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, aufgebracht sind, vorbestimmbar einstellbar sind, können die mit verschiedenen Detektionssystemen gemessenen Fluoreszenzintensitäten von Sonden-Array basierten Experimenten system- und geräteübergreifend direkt miteinander verglichen werden.In a preferred embodiment, fluorescence standards according to the invention can be integrated directly into the fluorescence detection systems, so that an online calibration device is possible. Since the properties of the fluorescent mark according to the invention standards through the manufacturing process and through the composition and thickness of the Polymer layer as well as the size and shape of the defined areas in which the polymer layers that fluoresce after appropriate irradiation are applied, can be predetermined, they can be set using different detection systems measured fluorescence intensities from probe array based experiments system and be compared directly with each other across devices.

Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können auch als universelles externes Werkzeug verwendet werden, um mehrere unterschiedliche Detektionssysteme in der beschriebenen Weise zu kalibrieren.The fluorescence drawing standards according to the invention can also be used as a universal external Used to make several different detection systems in the tool described way to calibrate.

Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards können auch in geschlossene Kammersysteme (z. B. PCR- und/oder Hybridisierungskammern) integriert sein. Fluorescence drawing standards according to the invention can also be used in closed chamber systems (e.g. PCR and / or hybridization chambers) can be integrated.  

Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards können nach Verfahren hergestellt werden, bei denen die nach Bestrahlung fluoreszierenden Schichten gezielt in definierten Bereichen auf erfindungsgemäßen Träger aufgebracht werden. Solche Verfahren sind z. B. aus der Halbleitertechnik bekannt (US 6,091,488). Die Polymerschichten von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können bevorzugt durch photolithographische Verfahren, durch Spotten, durch Trockenätzen, durch Ionenimplantation, durch drucktechnische Verfahren, durch Walzen, durch Spritzgießen oder durch Oberflächenprägung auf den Träger aufgebracht werden.Fluorescence standards according to the invention can be produced according to the process at which the fluorescent layers after irradiation in specific areas Carrier according to the invention are applied. Such methods are e.g. B. from the Semiconductor technology known (US 6,091,488). The polymer layers of the invention Fluorescence standards can preferably by photolithographic methods Spotting, by dry etching, by ion implantation, by printing technology, applied to the carrier by rolling, by injection molding or by surface embossing become.

Allgemein können die erfindungsgemäßen Polymerschichten, die auch als funktionelle Polymerschichten bzw. als Funktionsschichten bezeichnet werden, durch chemische und/oder physikalische Methoden zur Beschichtung auf dem Träger aufgebracht werden. Bei chemischen Methoden kann die Aufbringung der Polymerschichten dabei aus der Gasphase (z. B. durch CVD oder Oxidation), aus der Flüssigphase (z. B. durch elektrolytische, elektrochemische und andere nasschemische Verfahren) oder aus der Festphase (z. B. durch Oxidation) erfolgen. Bei physikalischen Methoden kann die Aufbringung aus der Gasphase oder aus dem Plasma (z. B. durch PVD, Sputtern oder Bedampfen), aus der Flüssigphase (z. B. durch Spin-On-Verfahren, durch Lackieren, Spritzen oder Tauchen) oder aus der Festphase (z. B. durch Lamination) erfolgen. Es können auch Kombinationen dieser Verfahren oder nachträgliche Modifikationen wie Ionenimplantation angewandt werden (z. B. PECVD). Die jeweiligen Methoden und entsprechende Ausgestaltungen sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. W. Menz, J. Mohr, Mikrosystemtechnik für Ingenieure, VCH, 1997).In general, the polymer layers according to the invention, which are also functional Polymer layers or functional layers are referred to by chemical and / or physical methods for coating are applied to the carrier. at Chemical methods can apply the polymer layers from the gas phase (e.g. by CVD or oxidation), from the liquid phase (e.g. by electrolytic, electrochemical and other wet chemical processes) or from the solid phase (e.g. by Oxidation). With physical methods, the application can be from the gas phase or from the plasma (e.g. by PVD, sputtering or vapor deposition), from the liquid phase (e.g. by spin-on processes, by painting, spraying or dipping) or from the solid phase (e.g. by lamination). Combinations of these methods or subsequent modifications such as ion implantation can be used (e.g. PECVD). The respective methods and corresponding configurations are known to the person skilled in the art (see z. B. W. Menz, J. Mohr, Microsystem Technology for Engineers, VCH, 1997).

Die erfindungsgemäßen Polymerschichten können durch verschiedene Verfahren strukturiert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Dabei kann es sich um biochemische Methoden handeln, wie z. B. die enzymatisch vermittelte selektive Strukturierung (in WO98/08086 beschrieben), aber auch um chemische und/oder mikrotechnische Verfahren. Zu diesen gehören selektives Ätzen der Funktionsschicht gegen eine Maskierung, die selbst gegen den Ätzer unempfindlich ist (z. B. Flüssig- oder Trockenätzen). Ebenfalls anwendbar sind Verfahren, die selektive Eigenschaftsveränderungen durch Strahlung, wie z. B. durch Bestrahlung mit UV oder Lasern bewirken. Dazu zählt die Photolithographie. Andere Methoden umfassen self-assembling layers. Diese Methoden können unter Verwendung einer Maskierung, aber auch durch "direkt schreibende" Vorrichtungen (Spotten) durchgeführt werden. Drucktechnische Verfahren wie Spotten oder Offsetdruck oder andere Verfahren wie Walzen, Stempeln, Spritzgießen oder Oberflächenpräge-Verfahren können ebenfalls verwendet werden. Unterschiedliche Ausführungsformen der Methoden sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. W. Menz, J. Mohr, Mikrosystemtechnik für Ingenieure, VCH, 1997).The polymer layers according to the invention can be structured by various methods become known to those skilled in the art. These can be biochemical methods act like B. the enzymatically mediated selective structuring (in WO98 / 08086 described), but also chemical and / or microtechnical processes. To this include selective etching of the functional layer against a mask, which itself against the  Etcher is insensitive (e.g. liquid or dry etching). Are also applicable Methods that selectively change properties by radiation, such as. B. by Effect radiation with UV or lasers. This includes photolithography. Other Methods include self-assembling layers. These methods can be done using a Masking, but also carried out by "direct writing" devices (spotting) become. Printing processes such as spotting or offset printing or other processes such as Rolling, stamping, injection molding or surface embossing processes can also be used be used. Different embodiments of the methods are known to the person skilled in the art known (see, for example, W. Menz, J. Mohr, Microsystem Technology for Engineers, VCH, 1997).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polymerschichten durch negative oder positive photolithographische Verfahren, besonders bevorzugt durch negative photolithographische Verfahren aufgebracht. Besonders bevorzugt sind negative photolithographische Verfahren, bei denen die Polymerschichten nach Bestrahlung im Entwickler unlöslich werden. Unbelichtete Bereiche bleiben dagegen im Entwickler löslich und können entfernt werden. Solche photolithographische Verfahren zur Strukturübertragung mittels eines Photoresists sind dem Fachmann bekannt. Dabei sind chemische und physikalische Verfahren, die das Aufbringen einer homogenen Funktionsschicht auf dem Träger erlauben, bevorzugt. Besonders bevorzugte Verfahren umfassen CVD-, PVD- und Spin-On-Verfahren.In a preferred embodiment, the polymer layers are replaced by negative or positive photolithographic processes, particularly preferably by negative applied photolithographic process. Negative ones are particularly preferred photolithographic processes in which the polymer layers after irradiation in Developers become insoluble. In contrast, unexposed areas remain soluble in the developer and can be removed. Such photolithographic processes for structure transfer by means of a photoresist are known to the person skilled in the art. Chemical and physical process that involves the application of a homogeneous functional layer on the Allow carriers, preferred. Particularly preferred methods include CVD, PVD and Spin-on process.

Die Parameter, durch deren Wahl bei photolithographischen Verfahren (aber auch anderen Verfahren) die Dicke der Polymerschichten eingestellt werden kann, umfassen die Bearbeitungsparameter (Verfahrensparameter) wie die Umlaufgeschwindigkeit, die Dauer des Herstellungsprozesses, die Viskosität des Polymers, die Temperatur und/oder die Luftfeuchtigkeit. Bei der Verwendung von Photopolymeren umfassen die Bearbeitungsparameter auch die Bestrahlungsdosis, die Parameter des Entwicklungsprozesses und den Temperprozess. The parameters by which they are selected in photolithographic processes (but also others Process) the thickness of the polymer layers can be adjusted include the Processing parameters (process parameters) such as the rotational speed, the duration of the Manufacturing process, the viscosity of the polymer, the temperature and / or the Humidity. When using photopolymers include Processing parameters including the radiation dose, the parameters of the development process and the annealing process.  

Bei photolithographischen Verfahren kann die Form und Größe der definierten Bereiche, in denen die Polymerschichten aufgebracht werden, durch Verwendung einer Maske und/oder Lochmasken, z. B. durch Verwendung einer Maske im 1 : 1 Maßstab festgelegt werden. Je nach Aussparung der Maske sind damit erfindungsgemäß verschiedene geometrische Formen und Größen für die definierten Bereiche einstellbar. Ebenfalls können nach diesem Verfahren erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, bei denen die in verschiedenen definierten Bereichen abgelegten Polymerschichten eine Array-Form aufweisen. Als Lochmasken wird bevorzugt strukturiertes Chrom auf Glas und/oder Quarz verwendet.In the case of photolithographic processes, the shape and size of the defined areas, in to which the polymer layers are applied, by using a mask and / or Shadow masks, e.g. B. by using a mask on a 1: 1 scale. Depending on According to the invention, the recess in the mask is therefore different geometric shapes and Sizes adjustable for the defined areas. You can also use this procedure Fluorescence standards according to the invention are produced, in which the in different defined areas of deposited polymer layers form an array exhibit. Structured chrome on glass and / or quartz is preferred as the shadow mask used.

Durch Wiederholen des photolithographischen Verfahrens können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards hergestellt werden, bei denen in verschiedenen Bereichen Polymerschichten mit unterschiedlicher Zusammensetzung und/oder Dicke aufgebracht sind. Durch Ändern der Temper- und/oder Bestrahlungsprotokolle, die bei photolithographischen Verfahren verwendet werden, kann zudem der Vernetzungsgrad (und damit die Intensität) der Polymerschichten in definierten Bereichen gezielt geändert werden. Durch Ändern der Temperprotokolle können ebenfalls das Bleichverhalten von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards gezielt eingestellt werden.By repeating the photolithographic process according to the invention Fluorescence drawing standards are being produced in different areas Polymer layers with different composition and / or thickness are applied. By changing the tempering and / or radiation protocols used in photolithographic The degree of crosslinking (and thus the intensity) of the Polymer layers can be changed in specific areas. By changing the Annealing protocols can also determine the bleaching behavior of the invention Fluorescence standards can be set specifically.

Um erfindungsgemäß hergestellte Fluoreszenzeichstandards mit einem z. B. optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem zu verbinden, können alle Verfahren verwendet werden, die den Eichstandard mit dem Trägersystem verbinden und die Eigenschaften des Fluoreszenzeichstandards nicht negativ beeinflussen. Zur Montage ist es notwendig, die Oberfläche der Standards durch geeignete Verfahren und Vorrichtungen in die Ebene von Probenträgern derart auszurichten, dass eine eindeutige Zuordnung der Lage der fluoreszierenden Schichten in Höhe und örtlicher Lage bezüglich definierter Bereiche des Trägers (z. B. Außenkanten) möglich ist. Dazu sind z. B. temporäres Aufkleben oder Vakuumeinrichtungen geeignet. Bevorzugt wird der Fluoreszenzeichstandard auf dem Trägersystem durch Kleben, durch Lagejustage oder durch ein Vakuumsystem aufgebracht.In order to produce fluorescence drawing standards according to the invention with a z. B. optically permeable, essentially non-fluorescent carrier system can connect all methods are used that connect the calibration standard to the carrier system and do not adversely affect the properties of the fluorescence drawing standard. For assembly is it is necessary to apply the surface of the standards by appropriate methods and devices Align the level of sample carriers in such a way that the location is clearly assigned of the fluorescent layers in height and location with respect to defined areas of the Carrier (e.g. outer edges) is possible. For this purpose, e.g. B. temporary sticking or  Vacuum devices suitable. The fluorescence standard is preferred on the Carrier system applied by gluing, by position adjustment or by a vacuum system.

Bei der Herstellung solcher erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandards ist zu berücksichti­ gen, dass die Methoden zur Assemblierung der Fluoreszenzeichstandards und der Sonden- Arrays die Funktion der Bauelemente nicht negativ beeinflussen. Dementsprechend ist zu gewährleisten, dass z. B. die verwendeten Klebstoffe keine Autofluoreszenz zeigen und durch die verwendeten Bauteile keine wesentlichen Streuungen oder Reflektionen auftreten.It is to be taken into account in the production of such fluorescence drawing standards according to the invention that the methods for assembling the fluorescence standards and the probe Arrays do not negatively affect the function of the components. Accordingly, too ensure that e.g. B. the adhesives used show no autofluorescence and through the components used no significant scatter or reflections occur.

Werden die Fluoreszenzeichstandards z. B. mit Substanzbibliotheken als Sonden-Arrays funktionalisiert, kann der Fluoreszenzeichstandard mit dem Trägersystem, auf dem sich die Substanzbibliotheken befinden, verbunden sein.Are the fluorescence standards z. B. with substance libraries as probe arrays functionalized, the fluorescence standard can be used with the carrier system on which the Substance libraries are connected.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Fluoreszenzeichstandards auf Trägern zunächst im Waver-Maßstab gefertigt werden und die entsprechend vereinzelten Fluoreszenzeichstandards dann durch Ablegen von Substanzbibliotheken in Array-Form funktionalisiert werden.In another preferred embodiment, the fluorescence standards can be based on Carriers are first manufactured on a waver scale and the correspondingly isolated Fluorescence standards then by storing substance libraries in array form be functionalized.

Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards lassen sich in unterschiedlicher Art und Weise zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen einsetzen. Durch die Verwendung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards für gerätespezifische Kalibrierungen lassen sich die Geräteeigenschaften definieren. Zum Beispiel kann die entsprechende Form und Größe der definierten Bereiche, in denen die nach entsprechender Bestrahlung fluoreszierenden Polymerschichten abgelegt sind, zur Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden. Erfindungsgemäße Fluoreszenz­ eichstandards, die in mehreren definierten geometrischen Bereichen Polymerschichten unter­ schiedlicher Dicke, aber einheitlicher Zusammensetzung aufweisen, wodurch die nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufene Intensität der Fluoreszenz in den verschiedenen Bereichen sich proportional zur Polymerschichtdicke verhält, erlauben eine Kalibrierung eines entsprechenden Detektionssystems hinsichtlich seiner dynamischen Eigenschaften. Erfindungsgemäß wird unter dynamischen Eigenschaften der Bereich auswertbarer Fluoreszenzintensitäten bei einer Messung verstanden. Z. B. lässt sich so der Intensitätsbereich festlegen, in dem ein CCD-Detektor linear arbeiten soll. Solche erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards können auch für die Einstellung der Sensitivität des Detektionssystems verwendet werden, d. h. der Festlegung, welche minimalen oder maximalen Fluoreszenzintensitäten ein Detektionssystem noch als Signal werten soll.The fluorescence drawing standards according to the invention can be of different types and Use way to calibrate fluorescence detection systems. Through the Use of fluorescence drawing standards according to the invention for device-specific Calibrations can be used to define the device properties. For example, the Corresponding shape and size of the defined areas, in which the corresponding Irradiation fluorescent polymer layers are deposited to determine the spatial resolution can be used. Fluorescence according to the invention Calibration standards that are based on polymer layers in several defined geometric areas have different thicknesses, but have a uniform composition, whereby the after corresponding radiation induced intensity of fluorescence in the different  Areas that are proportional to the polymer layer thickness allow calibration of a corresponding detection system with regard to its dynamic properties. According to the invention, the range can be evaluated under dynamic properties Understand fluorescence intensities during a measurement. For example, the intensity range can be determined in this way specify in which a CCD detector should work linearly. Such according to the invention Fluorescence standards can also be used to adjust the sensitivity of the Detection system can be used, d. H. determining which minimum or maximum fluorescence intensities a detection system should still evaluate as a signal.

Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards, bei denen die nach entsprechender Bestrahlung in verschiedenen geometrischen Bereichen mit Polymerschichten unterschiedlicher Dicken und/oder Zusammensetzung hervorgerufene Intensität der Fluoreszenz vorbestimmbar und regulierbar abklingt, können benutzt werden, um Rückschlüsse auf das gerätespezifische Bleichen von Fluoreszenzsignalen zu ziehen.Fluorescence drawing standards according to the invention, in which those after appropriate irradiation in different geometric areas with polymer layers of different thicknesses and / or composition-induced intensity of the fluorescence can be predetermined and adjustable decays can be used to draw conclusions about the device-specific To draw bleaching fluorescence signals.

Ferner können erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards zur Kalibrierung der geometrischen Eigenschaften von Detektionssystemen, insbesondere zur Korrektur der Bildfeldwölbung (Flatfieldbestimmung) bei CCD-Detektoren verwendet werden.Furthermore, fluorescence standards according to the invention for calibrating the geometric properties of detection systems, in particular for correcting the Field curvature (flat field determination) can be used with CCD detectors.

Erfindungsgemäß wird unter geometrischen Eigenschaften allgemein die örtliche Auflösung, der Abbildungsmaßstab, die Bildfeldwölbung und andere geometrische Fehler, die aus der optischen Konstruktion resultieren, verstanden.According to the invention, the local resolution, the image scale, the field curvature and other geometric errors resulting from the optical construction result, understood.

Da die Fluoreszenzeigenschaften von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards nicht von äußeren Faktoren abhängen und vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar sind, können sie verwendet werden, um verschiedene Geräte des gleichen Detektionsprinzips (geräteübergreifende Kalibrierung) oder Geräte unterschiedlichen Detektionprinzips (systemübergreifende Kalibrierung) zu kalibrieren. Die Kalibrierung kann dabei auf Normwerte, die z. B. in Arbeitsgruppen und Labors verwendet werden, erfolgen, auf die dann Fluoreszenzsignale aus experimentellen Messungen bezogen werden.Since the fluorescence properties of fluorescence standards according to the invention are not of depend on external factors and can be predetermined and reproducibly set they are used to make different devices of the same detection principle (cross-device calibration) or devices with different detection principles (cross-system calibration) to calibrate. The calibration can be on  Standard values, e.g. B. used in working groups and laboratories, then take place Fluorescence signals are obtained from experimental measurements.

Damit sind die Signale, die bei der Auswertung z. B. eines Sonden-Array basierten Experiments mit unterschiedlichen Detektionssystemen erhalten werden, direkt vergleichbar (testübergreifender Vergleich).So that the signals that are used in the evaluation z. B. based on a probe array Experiments with different detection systems can be obtained, directly comparable (cross-test comparison).

Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards, die eine große Bandbreite hinsichtlich der Wellenlänge und Intensität der nach Bestrahlung der Polymerschichten in den definierten Bereichen hervorgerufenen Fluoreszenz zeigen, können auch für testspezifische Referenzierung von Fluoreszenzsignalen verwendet werden. Dies ist möglich, weil die testspezifischen Signale z. B auf die Fluoreszenz eines definierten Bereichs bezogen werden können, deren Eigenschaften in dem Bereich des Testsignals liegen. Damit ist eine Normierung der Testsignale möglich. Die unter Verwendung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards erhaltenen normierten experimentellen Daten sind signifikant der Fehler, welche aus der Verwendung unterschiedlicher Detektoren bzw. verschiedener Einstellungen der Detektoren resultieren, behoben. Sie können daher direkt miteinander verglichen werden. Damit ermöglichen erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards den testübergreifenden und geräteübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalintensitäten, die bei der Durchführung von Sonden-Array basierten Experimenten und Tests erhalten worden sind.Fluorescence drawing standards according to the invention, which have a wide range in terms of Wavelength and intensity of after irradiation of the polymer layers in the defined Areas evoked to show fluorescence can also be used for test specific Referencing of fluorescence signals can be used. This is possible because of the test-specific signals e.g. B related to the fluorescence of a defined area can, whose properties are in the range of the test signal. So that's one Standardization of the test signals possible. The using of the invention The standardized experimental data obtained from fluorescence standards are significant Errors resulting from the use of different detectors or different ones Settings of the detectors result, fixed. You can therefore directly with each other be compared. Fluorescence drawing standards according to the invention thus enable the Cross-test and cross-device comparison of fluorescence signal intensities experiments and tests have been obtained in the execution of probe array are.

Üblicherweise werden die Einstellungen von Scannern den entsprechenden Messergebnissen angepasst. Sind bei einem Sonden-Array basierten Experiment die resultierenden Fluoreszenzsignale schwach, werden die Laserleistung oder die Sensitivität des Detektors (z. B. die Vorspannung bei Verwendung eines PMT-Systems oder die Integrationszeit bei Verwendung eines CCD-Systems) erhöht. Außerdem unterliegen die Geräte gerätespezifischen Schwanungen. Dies ist insbesondere kritisch, wenn Ergebnisse aus unterschiedlichen Zeiträumen verglichen werden sollen, da z. B. bei Laserscannern die Leistung der eingesetzten Laser sich dramatisch ändern kann. Ein Vergleich von Fluoreszenzintensitätssignalen, die zwar bei der Durchführung von gleichartigen Sondenarray-basierten Experimenten, aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen wurden, ist mit erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards problemlos möglich ("time to time"-Vergleich), da über das Bleichverhalten des Standards die altersbedingten Geräteschwankungen normiert werden können. Damit können mit Hilfe von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards Detektionssysteme auch hinsichtlich ihrer Alterungseigenschaften, wie z. B. der Änderung der Lampenleistungen kalibriert werden.Usually, the settings of scanners are the corresponding measurement results customized. In a probe array based experiment, the resulting are Fluorescence signals are weak, the laser power or the sensitivity of the detector (e.g. the preload when using a PMT system or the integration time with Use of a CCD system) increased. In addition, the devices are subject to device-specific fluctuations. This is particularly critical when results are out  different time periods should be compared, e.g. B. in laser scanners The power of the lasers used can change dramatically. A comparison of Fluorescence intensity signals, while performing similar Probe array based experiments, but measured at different times were possible with the fluorescence drawing standards according to the invention without any problems ("time to time "comparison), since the age-related effects on the bleaching behavior of the standard Device fluctuations can be standardized. With the help of Fluorescence detection systems according to the invention also with regard to their Aging properties, such as B. the change in lamp wattages can be calibrated.

Sollen die Fluoreszenzsignale, die bei der Durchführung von verschiedenen Sonden-Array basierten Experimenten gemessen wurden, miteinander verglichen werden, stellen für die Bewertung der Ergebnisse insbesondere die Inhomogenität der biochemischen und fluidi­ schen Prozesse in der Probe sowie die Schwierigkeiten bei der Spoterkennung während der Auswertung ein erhebliches Problem dar. Diese Probleme erschweren den qualitativen Vergleich verschiedener Sonden-Arrays. Erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards erlauben eine erhebliche Einschränkung der Fehler und qualitative Vergleiche von Ergebnissen, die bei der Durchführung von Experimenten mit verschiedenen Sonden-Arrays an demselben Gerät, durchgeführt wurden, werden möglich ("test to test"-Vergleich).Shown the fluorescent signals when performing different probe arrays based experiments were measured, compared with each other, represent for the Evaluation of the results in particular the inhomogeneity of the biochemical and fluidi processes in the sample and the difficulties with spot recognition during the Evaluation is a significant problem. These problems complicate the qualitative Comparison of different probe arrays. Fluorescence drawing standards according to the invention allow a significant limitation of errors and qualitative comparisons of Results when performing experiments with different probe arrays carried out on the same device are possible ("test to test" comparison).

Da mit dem dargestellten Fluoreszenzeichstandard auch unterschiedliche Detektionssysteme kalibriert werden können, können die Ergebnisse von Sonden-Array basierten Experimenten geräte- und system- und damit auch laborübergreifend analysiert werden.As with the fluorescence drawing standard shown, different detection systems The results of probe array based experiments can be calibrated be analyzed across devices and systems and thus across laboratories.

Vorrichtungen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger in einem oder mehreren definierten Bereichen Polymerschichten, die hinsichtlich ihrer Schichtdicke und Zusammensetzung einheitlich sind, aufgebracht sind, können ebenfalls zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen verwendet werden. Solche Vorrichtungen eignen sich insbesondere, wenn sie über mehrere definierte Bereiche verfügen, zur geräte- und systemübergreifenden Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens.Devices that are characterized in that essentially not fluorescent carrier in one or more defined areas of polymer layers are uniform with regard to their layer thickness and composition, are applied, can also be used to reference fluorescence signals. Such  Devices are particularly suitable if they have several defined areas, for cross-device and cross-system calibration of fluorescence detection systems in terms of their spatial resolution.

Die Polymerschichten solcher Vorrichtungen können erfindungsgemäß die gleiche Zusammensetzung wie oben ausgeführt aufweisen, d. h. sie können fluoreszierende Polymere, Polymergemische mit mindestens einem fluoreszierenden Polymer und/oder zusätzliche fluoreszierende Stoffe enthalten.The polymer layers of such devices can be the same according to the invention Composition as set out above, d. H. they can be fluorescent polymers, Polymer mixtures with at least one fluorescent polymer and / or additional ones contain fluorescent substances.

Bei diesen Vorrichtungen sind die Intensität und der Wellenlängenbereich der in den Bereichen nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz gleichermaßen durch die Wahl der Zusammensetzung der Polymerschichten, der Schichtdicke und durch Veränderungen des Quervernetzungsgrads vorbestimmbar und reproduzierbar einstellbar. Auch alle anderen Eigenschaften wie Bleichverhalten, Größe und Form der definierten Bereiche sind auf die oben beschriebene Art und Weise einstellbar. Ebenso können solche Vorrichtungen durch allen oben dargestellten Verfahren hergestellt werden.In these devices, the intensity and the wavelength range are those in the Areas of fluorescence caused by appropriate irradiation by the choice of the composition of the polymer layers, the layer thickness and by Changes in the degree of cross-linking can be predetermined and reproducibly adjusted. All other properties such as bleaching behavior, size and shape of the defined Areas can be set in the manner described above. Likewise, such Devices are made by all of the methods outlined above.

Solche Vorrichtungen können generell zur qualitativen und quantitativen Referenzierung von Fluoreszenzsignalen, besonders bevorzugt zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen aus Sonden-Array basierten Tests und/oder zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen verwendet werden.Such devices can generally be used for the qualitative and quantitative referencing of Fluorescence signals, particularly preferably for referencing fluorescence signals Probe array based tests and / or for calibration of fluorescence detection systems be used.

Besonders bevorzugt können sie zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren räumlichen Auflösungsvermögens verwendet werden. Da die in einem oder mehreren definierten Bereichen aufgebrachten Polymerschichten hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Schichtdicke einheitlich sind, eignen sie sich nicht zur Kalibrierung der dynamischen Eigenschaften von Fluoreszenzdetektionssystemen. Auch eine Kalibrierung von Detektionssystemen über den Vergleich der Verhältnisse von unterschiedlichen Intensitäten, die nach Bestrahlung von unterschiedlichen Bereichen auftreten, ist mit diesen Vorrichtungen nicht möglich.They can be used particularly preferably for the calibration of fluorescence detection systems be used with regard to their spatial resolution. Because that in one or several defined areas applied polymer layers with regard to their Composition and layer thickness are uniform, they are not suitable for calibration the dynamic properties of fluorescence detection systems. Also a calibration of detection systems by comparing the ratios of different ones  Intensities that occur after irradiation from different areas are with these Devices not possible.

Solche Vorrichtungen können aber z. B. zum Abgleich von experimentell ermittelten Fluoreszenzsignaldaten auf Normwerte verwendet werden und erlauben so, den geräte- und systemübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen. Diese Vorrichtungen erlauben auch die Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich deren Sensitivität und deren gerätespezifischen Bleichverhaltens bei denen durch die Zusammensetzung und Dicke der Polymerschichten festgelegten Intensitäten und Wellenlängenbereichen.Such devices can, however. B. to match experimentally determined Fluorescence signal data are used on standard values and thus allow the device and cross-system comparison of fluorescence signals. Allow these devices also the calibration of fluorescence detection systems with regard to their sensitivity and their device-specific bleaching behavior with those due to their composition and thickness the intensities and wavelength ranges defined in the polymer layers.

Im Folgenden sind Beispiele dargestellt, die besonders bevorzugte Ausführungsformen bzw. Verwendungen von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards darstellen. Die Beispiele sind in keiner Weise einschränkend zu deuten.In the following, examples are shown which show particularly preferred embodiments or Represent uses of fluorescence standards according to the invention. The examples are not to be interpreted in any way restrictive.

Beispiel 1example 1

Photolithographische Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards im Wafermaßstab (Abb. 1):
Im Beispiel wird gezeigt, wie ein erfindungsgemäßer universeller Fluoreszenzeichstandard auf polymerer Basis durch negative Photolithographie hergestellt wird. Dabei wird ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard hergestellt, der in unterschiedlichen Bereichen gleicher Form und Größe Polymerschichten unterschiedlicher Dicke, aber im Wesentlichen gleicher Zusammensetzung trägt. Damit sind die Intensitäten der in den Bereichen nach entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz proportional zur Schichtdicke. Photolithographic production of a fluorescence standard according to the invention on a wafer scale ( Fig. 1):
The example shows how a universal fluorescence drawing standard according to the invention is produced on a polymer basis by means of negative photolithography. A fluorescence drawing standard according to the invention is produced which has polymer layers of different thicknesses but essentially the same composition in different areas of the same shape and size. The intensities of the fluorescence caused in the areas after corresponding irradiation are thus proportional to the layer thickness.

Als Träger werden Materialien, die im gewünschten Fluoreszenzspektrum eine hohe Trans­ parenz und geringe Eigenfluoreszenz zeigen, benutzt. Im vorliegenden Fall wurde Borofloatglas40 der Firma Schott (BF 40, Durchmesser: 100 mm, Dicke: 0,7 mm) als Trägermaterial gewählt. Das eigentliche Funktionsmaterial (dies sind die Polymerschichten) sollte dagegen eine starke Eigenfluoreszenz aufweisen. Im gewählten Ausführungsbeispiel wurde als Polymer SU8-10, gelöst in PGMEA (organisches Lösungsmittel der Firma Sigma), gewählt, das die genannten Eigenschaften erfüllt. SU8-10 ist ein negatives, epoxy-basiertes Photopolymer, das bei UV-Bestrahlung unter 365 nm polymerisiert (US 4 882 245). Die Eigenfluoreszenz und die Photostrukturierbarkeit haben den großen Vorteil, dass das gewählte Polymer durch photolithographische Verfahren strukturiert werden kann.Materials that have a high trans in the desired fluorescence spectrum are used as carriers Show parenz and low self-fluorescence used. In the present case Borofloatglas40 from Schott (BF 40, diameter: 100 mm, thickness: 0.7 mm) as Carrier material selected. The actual functional material (these are the polymer layers) should have a strong intrinsic fluorescence. In the selected embodiment was polymer SU8-10, dissolved in PGMEA (organic solvent from Sigma), selected that meets the stated properties. SU8-10 is a negative, epoxy based Photopolymer that polymerizes under UV nm under 365 nm (US 4,882,245). The Self-fluorescence and the ability to be photostructured have the great advantage that this selected polymer can be structured by photolithographic processes.

Zu Beginn des Herstellungsprozesses wurde das Trägermaterial getempert (180°C, 20 min). Dadurch wurden etwaige Adsorbate (oft H₂O) entfernt, die eine gute Haftung der SU8 Polymerschicht auf dem Substrat behindern. Um dies zu verstärken, wurde die Oberfläche des Substrats mit 3-Glycydoxypropyltrimethoxysilan modifiziert.At the beginning of the manufacturing process, the carrier material was annealed (180 ° C, 20 min). This removed any adsorbates (often H ₂ O) that hinder the good adhesion of the SU8 polymer layer to the substrate. To reinforce this, the surface of the substrate was modified with 3-glycydoxypropyltrimethoxysilane.

Auf das Substrat wurde dann eine erste Schicht mit einer Dicke entsprechend der gewünschten Fluoreszenz bzw. der gesuchten Sensitivität aufgebracht (siehe Abb. 1). Dafür wurde das Spin-On-Verfahren verwendet, wobei durch Wahl der Parameter (Dauer: 305, Umdrehungsgeschwindigkeit: 5000 rpm, Beschleunigung: 100 rpm/s für 10 s und 1000 rpm/s für 20 s, Grad der Verdünnung mit PGMEA) die gewünschte Dicke bzw. die Fluoreszenz eingestellt wurde. Dadurch wurde das Polymer homogen auf dem Substrat verteilt und das Lösungsmittel ausgetrieben. Die nachfolgende Temperung oberhalb des Glaspunktes (95°C, 15 min. sogenanntes Pre-Bake) formiert und homogenisiert die Schicht.A first layer with a thickness corresponding to the desired fluorescence or the desired sensitivity was then applied to the substrate (see Fig. 1). The spin-on method was used for this, the parameters being selected (duration: 305, rotational speed: 5000 rpm, acceleration: 100 rpm / s for 10 s and 1000 rpm / s for 20 s, degree of dilution with PGMEA) desired thickness or the fluorescence was set. As a result, the polymer was distributed homogeneously on the substrate and the solvent was driven off. The subsequent tempering above the glass point (95 ° C, 15 min. So-called pre-bake) forms and homogenizes the layer.

Die Polymerschichten wurden danach mittels üblicher Mikrophotolithographie strukturiert. Dazu wurde durch Bestrahlung des Photopolymers mit UV-Licht (15 min bei ca. 300-450 nm mit 15 mW/cm², sogenanntes Exposure) seine Löslichkeit im Entwickler (in diesem Fall PGMEA) verändert. SU8-10 zeigt ein Tonwert-negatives Verhalten, d. h. die UV-belichteten Bereiche polymerisieren und unbelichtete Bereiche bleiben im Entwickler lösbar. Die Bestrahlung erfolgte durch Maskenprojektion mittels Lithographiemasken, die entsprechende dünne Chrom-Strukturen auf Quarz aufwiesen. Diese Quarz-Maske besaß die gewünschte laterale Geometrie des Standards, die im Maßstab 1 : 1 in das Polymer abgebildet wurde. Die kleinsten Strukturen in der Maske bestimmten daher auch die kleinsten Strukturen des Standards bzw. des zu detektierenden kleinsten Auflösungstests auf dem Standard.The polymer layers were then structured using conventional microphotolithography. For this purpose, the solubility in the developer (in this case PGMEA) was changed by irradiating the photopolymer with UV light (15 min at approx. 300-450 nm with 15 mW / cm ² , so-called exposure). SU8-10 shows a tone-negative behavior, ie the UV-exposed areas polymerize and unexposed areas remain soluble in the developer. Irradiation was carried out by mask projection using lithography masks, which had corresponding thin chrome structures on quartz. This quartz mask had the desired lateral geometry of the standard, which was imaged in the polymer on a 1: 1 scale. The smallest structures in the mask therefore also determine the smallest structures of the standard or of the smallest resolution test to be detected on the standard.

Nachfolgend wurde durch einen Temperschritt die Vernetzung der belichteten Bereiche vervollständigt (95°C, 15 min. so genanntes Post-Exposure-Bake). Die unbelichteten Bereiche blieben vom Entwickler noch unberührt. Diese o. g. Prozedur (Spin-On, Pre-Bake, Exposure, so genanntes Post-Exposure-Bake) wurde nun mehrfach wiederholt, wobei die zuvor belichteten (und somit vernetzten) Bereiche in nachfolgenden Belichtungsschritten durch entsprechenden Masken unbelichtet blieben. Im Beispiel wurden aufeinander folgend die Belackung, Belichtung und Temperung drei Mal durchgeführt (Abb. 1). Die drei Schichten hatten dabei bezüglich des Polymers die folgende Zusammensetzung:
Subsequently, the crosslinking of the exposed areas was completed by a tempering step (95 ° C, 15 min. So-called post-exposure beacon). The developer left the unexposed areas untouched. This above-mentioned procedure (spin-on, pre-bake, exposure, so-called post-exposure bake) was now repeated several times, the previously exposed (and thus cross-linked) areas remaining unexposed in subsequent exposure steps using appropriate masks. In the example, the painting, exposure and tempering were carried out three times in succession ( Fig. 1). The three layers had the following composition with regard to the polymer:

• 1. Schicht: SU8-10 (Fa. MicroChem Inc.) gelöst in PGMEA (Fa. Sigma) 50% w/w1st layer: SU8-10 (MicroChem Inc.) dissolved in PGMEA (Sigma) 50% w / w
• 2. Schicht: SU8-10 (Fa. MicroChem Inc.) gelöst in PGMEA (Fa. Sigma) 33% w/w2nd layer: SU8-10 (from MicroChem Inc.) dissolved in PGMEA (from Sigma) 33% w / w
• 3. Schicht: SU8-10 (Fa. MicroChem Inc.) gelöst in PGMEA (Fa. Sigma) 20% w/w3rd layer: SU8-10 (MicroChem Inc.) dissolved in PGMEA (Sigma) 20% w / w

Das Photopolymer SU8-10 wurde in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen in PGMEA gelöst. Dadurch haben die Lösungen unterschiedliche Viskositäten, wodurch Polymerschichten mit unterschiedlicher Dicke herstellbar sind. Das Lösungsmittel wird später weitestgehend ausgetrieben (zu mehr als 95%), so dass die Polymerschichten eine im Wesentlichen gleiche Zusammensetzung aufweisen. The photopolymer SU8-10 was made in different weight ratios in PGMEA solved. As a result, the solutions have different viscosities, which means Polymer layers with different thicknesses can be produced. The solvent will be used later largely expelled (more than 95%), so that the polymer layers in the Have essentially the same composition.  

Danach wurde die Polymerstruktur durch Eintauchen in PGMEA (Fa. Sigma) entwickelt und nochmals getempert (120°C, 30 min. sogenannter Hard-Bake). Infolgedessen entstanden stufenförmige geometrische Strukturen (Abb. 1). Die Stufenhöhen korrespondieren dann mit einer entsprechenden Fluoreszenz-Intensität, die lateralen Geometrien mit dem Auflösungsvermögen.The polymer structure was then developed by immersion in PGMEA (Sigma) and annealed again (120 ° C., 30 min. So-called hard bake). As a result, step-like geometric structures emerged ( Fig. 1). The step heights then correspond to a corresponding fluorescence intensity, the lateral geometries to the resolving power.

Beispiel 2Example 2 Beispiele für erfindungsgemäße FluoreszenzeichstandardsExamples of fluorescence drawing standards according to the invention

In Abb. 2A ist ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard in Array-Form gezeigt, der auf Borofloatglas (Firma Schott) mikrolithographisch gemäß des Verfahrens aus Beispiel 1 hergestellt wurde. Der Standard besteht aus 9 Array-Elementen, die alle fluoreszierende Polymerschichten in quadratischer Form enthalten. Die Quadrate der 9 Array-Elemente verfügen über 3 Intensitätsstufen, welche aus 3 verschiedenen Dicken resultieren. Durch verschiedene Strukturgrößen und Abstände werden verschiedene Integrationsdichten von molekularen Arrays simuliert. Die Standards wurden im Wafermaßstab erzeugt und in Chips vereinzelt. FIG. 2A shows a fluorescence standard according to the invention in array form, which was produced microlithographically on borofloat glass (Schott) in accordance with the method from Example 1. The standard consists of 9 array elements, all of which contain fluorescent polymer layers in a square shape. The squares of the 9 array elements have 3 intensity levels, which result from 3 different thicknesses. Different integration densities of molecular arrays are simulated by different structure sizes and distances. The standards were produced on a wafer scale and separated into chips.

Der Standard eignet sich, um eine Bestimmung des räumlichen Auflösungsvermögens, der geometrischen Fehler, der abbildenden optischen sowie elektromechanischen und informationstechnischen Systeme als auch der Sensitivität des jeweiligen Geräts zum Zeitpunkt der Messung vorzunehmen. Zusätzlich kann der Standard zur geräteübergreifenden Bewertung der Fluoreszenzsignale von Sonden-Array basierten Experimenten verwendet werden. Dazu wurde der beschriebene Fluoreszenzstandard in verschiedenen Readersystemen ausgelesen, als 16 bit-*.tif Bilder exportiert und mittels einer speziellen Software (IconoClust der Firma Clondiag) analysiert. Die unterschiedlich großen fluoreszierenden Strukturen auf dem Fluoreszenzeichstandard können verwendet werden, um geometrische Abweichungen der verschiedenen Detektionssysteme zu korrigieren. So lässt sich beispielsweise die Bildfeldwölbung eines optischen Systems zur Fluoreszenzdetektion anhand des dargestellten Fluoreszenzeichstandards durch geeignete Bildverarbeitungsprozesse analysieren und durch entsprechende Einstellung der optischen oder informationstechnischen Elemente beheben.The standard is suitable for determining the spatial resolving power geometric errors, the imaging optical as well as electromechanical and information technology systems and the sensitivity of the respective device for Time of measurement. In addition, the standard for cross-device Evaluation of the fluorescence signals used by probe array based experiments become. For this purpose, the described fluorescence standard was used in various reader systems read out, exported as 16 bit - *. tif images and using special software (IconoClust from Clondiag) analyzed. The different sizes of fluorescent structures  The fluorescence standard can be used to detect geometric deviations of the various detection systems. For example, the Field curvature of an optical system for fluorescence detection based on the shown Analyze fluorescence drawing standards through suitable image processing processes and through Correct the corresponding setting of the optical or information technology elements.

Es ist fernerhin möglich, die Einstellungen der Detektionssysteme z. B. hinsichtlich der Laser- oder Lampenleistung, der Integrationszeit pro Spot/Subarray oder der Signalverstärkung/Einstellung des Detektors auf einen bestimmten Wert der resultierenden Fluoreszenz des Standards abzustimmen. Damit kann z. B. der Langzeitdrift eines Detektionsapparats, welcher durch Alterungsprozesse der verwendeten Laser, Lampen oder Detektoren hervorgerufen werden kann, bestimmt werden.It is also possible to change the settings of the detection systems e.g. B. in terms of laser or lamp power, the integration time per spot / subarray or the Signal amplification / adjustment of the detector to a certain value of the resulting Match fluorescence of the standard. So z. B. the long-term drift one Detection apparatus, which by aging processes of the lasers, lamps or Detectors can be caused to be determined.

Unterschiedliche Fluoreszenzsysteme können also mittels des Fluoreszenzeichstandards hin­ sichtlich ihrer leistungsbestimmenden Parameter kalibriert werden. Entsprechend können die Fluoreszenzsignale, die bei der Auswertung eines Sonden-Array basierten Experiments mit verschiedenen Detektionssystemen gemessen werden, direkt miteinander verglichen werden.Different fluorescence systems can therefore use the fluorescence drawing standard visibly their performance-determining parameters are calibrated. Accordingly, the Fluorescence signals used in the evaluation of a probe array based experiment different detection systems can be measured, compared directly with each other.

In Abb. 2B ist ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard in Array-Form gezeigt, der auf Borofloatglas (Firma Schott) durch Spotten hergestellt wurde. Zunächst wurden fluoreszierende Standards auf verschiedenen Trägern erzeugt, indem Polymergemische SU8 (MCC Inc.) und Novolack (AZ 1514 Clariant) im Massenverhältnis 1 : 2, 1 : 3, 1 : 5 hergestellt und auf die Glassubstrate aufgebracht wurden. Dazu wurden Objektträger gereinigt und mittels eines Nadelspotters (Microgrid 2 /Biorobotics) mit den Polymergemischen unter Benutzung einer ungeschlitzten Spotternadel (Solidpins/Biorobotics) bespottet. Alternativ wurden die Polymergemische mit einem piezogetriebenen Dispenserkopf (Durchmesser 100 µm, beheizte Düse der Firma microdrop) aufgebracht. Dabei wurde die Dispenserdüse geheizt (55°C). Fig. 2B shows an inventive fluorescence drawing standard in array form, which was produced on borofloat glass (Schott) by spotting. First, fluorescent standards were produced on various supports by producing polymer mixtures SU8 (MCC Inc.) and Novolack (AZ 1514 Clariant) in a mass ratio of 1: 2, 1: 3, 1: 5 and applying them to the glass substrates. For this purpose, slides were cleaned and spotted with the polymer mixtures using a needle spotter (Microgrid 2 / Biorobotics) using an unslotted spotting needle (Solidpins / Biorobotics). Alternatively, the polymer mixtures were applied using a piezo-driven dispenser head (diameter 100 μm, heated nozzle from microdrop). The dispenser nozzle was heated (55 ° C).

Anschließend wurde folgende Behandlung der Proben vorgenommen.
The following treatment of the samples was then carried out.

Pre-Bake: 95°C, 15 min
Exposure: 1 min, 15 mW/cm², Flutbelichtung
Post-Bake: 95°C, 15 min
Hard-Bake: 120°C, 60 minPre-beacon: 95 ° C, 15 min
Exposure: 1 min, 15 mW / cm ² , flood exposure
Post-beacon: 95 ° C, 15 min
Hard bake: 120 ° C, 60 min

Der so hergestellte Standard besteht aus kreisförmigen Bereichen (Spots) einheitlicher Dimensionen, deren Polymerschichten sich sowohl hinsichtlich der Dicke als auch der Zusammensetzung unterscheiden. Daher verfügt der Standard über ein breites Spektrum an Intensitäten und Wellenlängenbereichen der in den Spots hervorrufbaren Fluoreszenz. Der Standard kann in gleicher Weise wie der in Abb. 4A eingesetzt werden.The standard produced in this way consists of circular areas (spots) of uniform dimensions, the polymer layers of which differ both in terms of their thickness and their composition. The standard therefore has a wide spectrum of intensities and wavelength ranges of the fluorescence that can be produced in the spots. The standard can be used in the same way as that in Fig. 4A.

Beispiel 3Example 3 Integration von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards in TrägersystemeIntegration of fluorescence drawing standards according to the invention in carrier systems

In Abb. 3 ist gezeigt, wie ein erfindungsgemäßer Fluoreszenzeichstandard auf einem Objektträger durch Kleben aufgebracht ist. Als Kleber wurde Polydimethylsiloxan (Sylgard® der Firma Dow) verwendet. Solche Standards können als externes Werkzeug zur Kalibrierung von unterschiedlichen Detektionssystemen verwendet werden. Fig. 3 shows how a fluorescence drawing standard according to the invention is applied to a slide by gluing. Polydimethylsiloxane (Sylgard® from Dow) was used as the adhesive. Such standards can be used as an external tool for the calibration of different detection systems.

Beispiel 4Example 4

Einstellung der Intensität und des Bleichverhaltens bei erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards - Verwendung von erfindungsgemäßen Fluoreszenzeichstandards über mehrere Messungen hinweg. Adjustment of the intensity and the bleaching behavior in the case of the invention Fluorescence standards - Use of fluorescence standards according to the invention across multiple measurements.  

Im Beispiel ist gezeigt, dass bei der mikrolithographischen Herstellung von Fluoreszenzeichstandards mit Polymerschichten in drei unterschiedlichen Dicken (d1, d2, d3) ein Temperprotokoll so gewählt werden kann, dass die Intensität der in den definierten Bereichen nach mehrfacher Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz linear abklingt.The example shows that microlithographic production of Fluorescence drawing standards with polymer layers in three different thicknesses (d1, d2, d3) a tempering protocol can be selected so that the intensity of those defined in the Areas of fluorescence caused by multiple irradiations decay linearly.

Abb. 4A zeigt das Bleichverhalten der drei Schichten ohne thermische Behandlung. Es handelt sich um ein nicht-lineares Bleichverhalten. Abb. 4B zeigt das Bleichverhalten der drei Schichten nach thermischer Behandlung. Es handelt sich um ein lineares Bleichverhalten. Zu Linearisierung des zeitlichen Verlaufs der Änderung der resultierenden Fluoreszenzintensitäten wurden die Proben während des Herstellungsprozesses einer thermischen Behandlung von zwei Stunden bei 180°C im Ofen unterzogen und anschließend für ca. 40 Minuten bei einer Wellenlänge zwischen 520 und 600 nm mit 40 mW/cm² bestrahlt. Dabei ändert sich das Intensitätsverhalten dergestalt, dass sich das Dickenverhältnis nicht mehr direkt proportional dem resultierenden Intensitätsverhältnis verhält, allerdings sind die Intensitätsverhältnisse der verschieden dicken Strukturen nun bei Bestrahlung konstant (siehe Abb. 4C). Fig. 4A shows the bleaching behavior of the three layers without thermal treatment. It is a non-linear bleaching behavior. Fig. 4B shows the bleaching behavior of the three layers after thermal treatment. It is a linear bleaching behavior. In order to linearize the time course of the change in the resulting fluorescence intensities, the samples were subjected to a thermal treatment in the oven for two hours at 180 ° C. during the manufacturing process and then for 40 minutes at a wavelength between 520 and 600 nm with 40 mW / cm ² irradiated. The intensity behavior changes in such a way that the thickness ratio is no longer directly proportional to the resulting intensity ratio, but the intensity ratios of the structures of different thicknesses are now constant when irradiated (see Fig. 4C).

Man erkennt, dass durch Ändern des Temperprotokolls Fluoreszenzeichstandards herstellbar sind, die über ein wesentlich weniger ausgeprägtes und wesentlich konstanteres Bleichverhalten verfügen. Die Messungen erfolgten mit einem konfokalen Biochip-Sanner Scanarray 4000 (Packard) bei 100% Laserleistung und 85% PMT-gain.It can be seen that by changing the tempering protocol, fluorescence drawing standards can be produced are that have a much less pronounced and much more constant Bleaching behavior. The measurements were carried out with a confocal biochip scanner Scanarray 4000 (Packard) with 100% laser power and 85% PMT gain.

Solche langzeitstabilen Fluoreszenzeichstandards können hervorragend zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich ihrer alterungsbedingten Eigenschaften verwendet werden, da die Intensitäten der drei Schichtdicken sich gleichermaßen verändern und damit das Verhältnis der Intensitäten der verschieden dicken Schichten konstant bleibt (siehe Abb. 4C). Such long-term stable fluorescence standards can be used excellently for the calibration of fluorescence detection systems with regard to their aging-related properties, since the intensities of the three layer thicknesses change equally and the ratio of the intensities of the different thickness layers remains constant (see Fig. 4C).

Beispiel 5Example 5 Referenzierung von FluoreszenzsignalenReferencing fluorescence signals

Es wurden Fluoreszenzeichstandards wie in Beispiel 1 hergestellt, bei denen in den definierten Bereichen, Polymerschichten mit unterschiedlicher Dicke aufgebracht sind.Fluorescence standards were prepared as in Example 1, in which in the defined areas, polymer layers with different thickness are applied.

Aus Abb. 5 wird deutlich, dass mit diesen Standards die Referenzierung von Messungen in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen möglich sind (Cy3 und Cy5 absorbieren bei unterschiedlichen Wellenlängen) und die gemessenen Intensitäten sich proportional zur Schichtdicke (d1, d2, d3) verhalten. Dieser Fluoreszenzstandard kann daher wegen seines breitbandigen Fluoreszenzverhaltens in verschiedenen Wellenlängenbereichen zur Kalibrierung von Readersystemen verwendet werden kann. Mit solchen Fluoreszenzeichstandards, die über eine breitbandige Eigenfluoreszenz verfügen, ist zudem eine Referenzierung von Fluoreszenzsignalen in verschiedenen Wellenlängenbereichen möglich. Darüber hinaus können mit solchen Standards Laserscanner hinsichtlich ihrer Sensitivität kalibriert werden. Die Messungen erfolgten mit einem konfokalen Biochip-Sanner Scanarray 4000 (Packard) bei 100% Laserleistung und 85% PMT-gain.It is clear from Fig. 5 that with these standards the referencing of measurements in different wavelength ranges is possible (Cy3 and Cy5 absorb at different wavelengths) and the measured intensities are proportional to the layer thickness (d1, d2, d3). Because of its broadband fluorescence behavior, this fluorescence standard can therefore be used in different wavelength ranges for the calibration of reader systems. With such fluorescence drawing standards, which have a broadband intrinsic fluorescence, it is also possible to reference fluorescence signals in different wavelength ranges. In addition, such standards can be used to calibrate laser scanners with regard to their sensitivity. The measurements were carried out with a confocal biochip scanner Scanarray 4000 (Packard) with 100% laser power and 85% PMT gain.

Beispiel 6Example 6 Standardisierung von Sonden-Array basierten ExperimentenStandardization of probe array based experiments

Zur Standardisierung von Sonden-Array basierten Experimenten wurden erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards verwendet, die ebenfalls ein Sonden-Array aufwiesen. Der Fluoreszenzeichstandard kann dann beim Auslesevorgang vor oder nach der Durchführung der biochemischen Wechselwirkungsreaktion jeweils mitberücksichtigt werden (siehe Abb. 6A).Fluorescence drawing standards according to the invention, which likewise had a probe array, were used to standardize probe array-based experiments. The fluorescence drawing standard can then be taken into account in the readout process before or after the biochemical interaction reaction is carried out (see Fig. 6A).

Es wurden erfindungsgemäße Fluoreszenzeichstandards auf epoxidierten Objektträgern (Firma QMT) durch Ultraschallbohrung und Einkleben aufgebracht, die in den definierten Bereichen Polymerschichten mit gleicher Polymerdicke aber unterschiedlichem Gehalt bezüglich der Polymerkomponenten aufwiesen. Damit zeigen diese Bereiche nach entsprechender Bestrahlung unterschiedliche Intensitäten. Auf den Träger wurde dann eine Reihe von PCR-Produkten (aceA, acs, amiß, ampG, argC, atpA, creß, icdA, napH, rpoA, rpoH, rpoS) durch Spotting (Firma BioRobotics Microgrid II) aufgebracht. Speziell aufgereinigte und mit Fluoreszenzfarbstoffen (Cy3 oder Cy5 der Firma Amersham) markierte spezifsche cDNA wurde durch Hybridisierung an den PCR-Spots immobilisiert. Anschließend wurden die Proben mittels eines konfokalen Laserscanners (Affymetrix, Packard) ausgelesen und die Ergebnisse mittels einer speziellen Software (IconoClust der Firma Clondiag) analysiert. Dabei erfolgte die Bewertung der Ergebnisse unter Referenzierung auf die verschiedenen Intensitäten der unterschiedlichen Bereiche des Fluoreszenzeichstandards.Fluorescence standards according to the invention were used on epoxidized slides (Company QMT) applied by ultrasonic drilling and gluing, which are defined in the Areas of polymer layers with the same polymer thickness but different content regarding the polymer components. This shows these areas corresponding intensities. One was then placed on the carrier Range of PCR products (aceA, acs, amiß, ampG, argC, atpA, kross, icdA, napH, rpoA, rpoH, rpoS) applied by spotting (BioRobotics Microgrid II). specially purified and labeled with fluorescent dyes (Cy3 or Cy5 from Amersham) specific cDNA was immobilized on the PCR spots by hybridization. The samples were then examined using a confocal laser scanner (Affymetrix, Packard) and read out the results using special software (IconoClust from Clondiag) analyzed. The results were evaluated under Referencing the different intensities of the different areas of the Fluorescence calibration standards.

Die drei Balken einer cDNA stehen für die Referenzierung der Signaldaten der Hybridisierung auf drei verschiedene Bereiche des Standards, die unterschiedliche Intensitäten aufweisen. Dazu wurden die Ergebnisse auf die verschiedenen Intensitätsstufen normiert und unter Berücksichtigung des Gehalts der Polymerschichten auf eine Stufe gerechnet. Die Graphik (Abb. 6B) zeigt, dass eine solche Rückrechnung zulässig ist, da für jede cDNA gleiche Ergebnisse erhalten werden, unabhängig davon, auf welchen Bereich die Messung der cDNA bezogen wird. Somit ist es bei bekanntem Gehalt der Polymerschichten zulässig, jeden Bereich zur Referenzierung zu verwenden, was die Universalität des Standards erhört. Die Messungen erfolgten mit einem konfokalen Biochip- Sanner Scanarray 4000 (Packard) bei 100% Laserleistung und 85% PMT-gain. The three bars of a cDNA stand for referencing the signal data of the hybridization to three different areas of the standard, which have different intensities. For this purpose, the results were standardized to the different intensity levels and calculated on one level, taking into account the content of the polymer layers. The graph ( Fig. 6B) shows that such a back calculation is permissible since the same results are obtained for each cDNA, regardless of the area to which the measurement of the cDNA is based. If the content of the polymer layers is known, it is therefore permissible to use each area for referencing, which increases the universality of the standard. The measurements were carried out using a confocal biochip scanner Scanarray 4000 (Packard) with 100% laser power and 85% PMT gain.

Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures

Abb. 1 Herstellung eines erfindungsgemäßen Fluoreszenzstandards durch mehrstufige Photolithographie (Negativprozess). Fig. 1 Production of a fluorescence standard according to the invention by multi-stage photolithography (negative process).

Abb. 2A Erfindungsgemäßer Fluoreszenzstandard in Array-Form, mikrolithographisch hergestellt auf Borofloatglas. Fig. 2A Fluorescence standard according to the invention in the form of an array, produced microlithographically on borofloat glass.

Abb. 2B Erfindungsgemäßer Fluoreszenzstandard in Array-Form, hergestellt durch Spotten auf Borofloatglas. Fig. 2B Fluorescence standard according to the invention in the form of an array, produced by spotting on borofloat glass.

Abb. 3 Fluoreszenzeichstandard auf Objektträger. Fig. 3 Fluorescence drawing standard on slide.

Abb. 4A Veränderungen der resultierenden Luminiszenzintensitäten durch Einwirkung von Strahlung im sichtbaren Bereich (Bleichen oder Bleaching). Die Intensität ist als Grauwert angegeben. Fig. 4A Changes in the resulting luminance intensities due to exposure to radiation in the visible range (bleaching or bleaching). The intensity is given as a gray value.

Abb. 4B Änderung der Fluoreszenzintensität über die Anzahl der Messungen in einem Weißlicht/CCD System nach Durchführung eines angepassten Temperprotokolls. Die Intensität ist als Grauwert angegeben. Fig. 4B Change in the fluorescence intensity over the number of measurements in a white light / CCD system after carrying out an adapted tempering protocol. The intensity is given as a gray value.

Abb. 4C Durch angepasste Temperprotokolle ist es möglich, das Bleichverhalten der polymeren Schichten so anzugleichen, dass Veränderungen der Fluoreszenzausbeute über die Anzahl durchgeführter Messungen keinen Einfluss auf die resultierenden Intensitätsverhältnisse hat. Die obere Linie gibt das d3/d2-Verhältnis, die untere Linie das d2/d1-Verhältnis aus Abb. 4A an. Fig. 4C It is possible to adjust the bleaching behavior of the polymeric layers by means of adapted tempering protocols so that changes in the fluorescence yield over the number of measurements carried out have no influence on the resulting intensity ratios. The upper line shows the d3 / d2 ratio, the lower line the d2 / d1 ratio from Fig. 4A.

Abb. 5 Messergebnisse eines Scans für verschiedene Farbstoffe. Die Intensität ist als Grauwert angegeben. Diese Standards sind geeignet zur Normierung von Ergebnissen in verschiedenen Wellenlängenbereichen. Fig. 5 Measurement results of a scan for different dyes. The intensity is given as a gray value. These standards are suitable for standardizing results in different wavelength ranges.

Abb. 6A Inverser Scan eines gespotteten Sonden-Arrays. Im oberen Teil erkennt man den Fluoreszenzeichstandard (1). Darunter befindet sich der Sonden-Array (2). Es handelt sich um gespottete PCR-Produkte nach Hybridisierung mit Cy3/Cy5 markierter cDNA. Fig. 6A Inverse scan of a spotted probe array. In the upper part you can see the fluorescence drawing standard (1). Below this is the probe array (2). These are spotted PCR products after hybridization with Cy3 / Cy5-labeled cDNA.

Abb. 6B Es wurden verschiedene PCR-Produkte gespottet und mit cDNA hybridisiert. Die Ergebnisse wurden auf die verschiedenen Intensitätsstufen von verschiedenen Bereichen normiert (jeweils die drei Balken) und unter Berücksichtigung des Gehalts der Stoffe in den Polymerschichten auf eine Stufe gerechnet. Die Grafik zeigt, dass eine solche Rückrechnung zulässig ist. Es ist also bei bekanntem Gehalt egal, welcher Bereich zur Normierung benutzt wird. Fig. 6B Different PCR products were spotted and hybridized with cDNA. The results were standardized to the different intensity levels of different areas (the three bars in each case) and calculated on one level, taking into account the content of the substances in the polymer layers. The graphic shows that such retroactive accounting is permitted. If the content is known, it does not matter which area is used for standardization.

Claims (72)

1. Vorrichtung zur Referenzierung von Fluoreszenz-Signalen, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger in definierten Bereichen mindestens eine nach entsprechender Bestrahlung fluoreszierende Polymerschicht aufgebracht ist und dass mindestens zwei der Polymerschichten sich hinsichtlich ihrer Dicke und/oder Zusammensetzung unterscheiden.1. Device for referencing fluorescence signals, characterized in that at least one polymer layer which fluoresces after corresponding irradiation is applied to a substantially non-fluorescent carrier in defined areas and that at least two of the polymer layers differ in terms of their thickness and / or composition. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten ein oder mehrere Polymere enthalten, wobei mindestens eines der Polymere nach entsprechender Bestrahlung fluoresziert.2. Device according to claim 1, characterized in that the polymer layers contain one or more polymers, wherein at least one of the polymers fluoresces after appropriate irradiation. 3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere Postiv- und/oder Negativ-Photolacke, insbesondere auf Basis von Epoxidharzen wie SU8 und/oder Novolacke und/oder PMMA und/oder photosensitives Polyimid und/oder Benzocyclobuten umfassen.3. Device according to claim 2, characterized in that the polymers positive and / or negative photoresists, in particular based on epoxy resins such as SU8 and / or novolacs and / or PMMA and / or photosensitive polyimide and / or benzocyclobutene. 4. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten neben mindestens einem Polymer zusätzlich fluoreszierende Stoffe enthalten.4. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the polymer layers in addition to at least one polymer additionally contain fluorescent substances. 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszierenden Stoffe organische Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Porphyninenfarbstoffe und/oder anorganische Farbstoffe, insbesondere metallische Farbstoffe und/oder Lanthanide umfassen. 5. The device according to claim 4, characterized in that the fluorescent substances are organic dyes, in particular azo dyes, triphenylmethane dyes, porphynine dyes and / or include inorganic dyes, especially metallic dyes and / or lanthanides.   6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Schichtdicke und/oder der Zusammensetzung der Polymerschichten einstellbar ist.6. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the intensity of the areas with appropriate Irradiation-induced fluorescence through the choice of the layer thickness and / or the Composition of the polymer layers is adjustable. 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz proportional zu der Dicke der in den Bereichen aufgebrachten Polymerschichten einstellbar ist.7. The device according to claim 6, characterized in that the intensity of the areas with appropriate Irradiation caused fluorescence proportional to the thickness of those in the areas applied polymer layers is adjustable. 8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.8. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the intensity of the areas with appropriate Irradiation-induced fluorescence through physical treatment methods during production, preferably by irradiation and / or temperature treatment is adjustable. 9. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungswellenlängenbereich der Polymerschichten durch die Wahl der Polymere und/oder der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.9. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the excitation wavelength range of the polymer layers adjustable by the choice of the polymers and / or the added fluorescent substances is. 10. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der Polymere und/oder durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist. 10. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the bleaching behavior according to the areas corresponding longer exposure to fluorescence caused by the choice of species and / or amount and / or composition of the polymers and / or by the choice of the type and / or the amount and / or composition of the fluorescent substances added is adjustable.   11. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.11. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the bleaching behavior according to the areas corresponding longer exposure to fluorescence caused by physical Treatment methods during manufacture, preferably by radiation and / or Temperature treatment is adjustable. 12. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Dicke der Polymerschichten in mindestens einem der Bereiche deutlich kleiner als die minimale Fokustiefe der zur Fluoreszenz-Messung verwendeten Detektionssysteme ist.12. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the maximum thickness of the polymer layers in at least one of the areas significantly smaller than the minimum depth of focus for fluorescence measurement detection systems used. 13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die maximale Dicke der Polymerschichten zwischen wenigen Nanometern und maximal 50 µm liegt, bevorzugt zwischen 100 nm und 10 µm, besonders bevorzugt zwischen 200 nm und 5 µm liegt.13. The apparatus according to claim 12, characterized in that the maximum thickness of the polymer layers is between a few Nanometers and a maximum of 50 microns, preferably between 100 nm and 10 microns, particularly is preferably between 200 nm and 5 μm. 14. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche sich in Form und/oder Größe unterscheiden.14. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the defined areas differ in shape and / or size differ. 15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche die Form von Quadraten und/oder Rechtecken mit Seitenlängen zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.15. The apparatus according to claim 14, characterized in that the defined areas have the shape of squares and / or Rectangles with side lengths between a few nanometers and 5 mm, particularly preferred have between 100 nm and 1 mm. 16. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche die Form von Kreisen mit Durchmessern zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.16. The apparatus of claim 14, characterized in that the defined areas with the shape of circles  Diameters between a few nanometers and 5 mm, particularly preferably between 100 nm and 1 mm. 17. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die definierten Bereiche in Array-Form auf dem Träger aufgebracht sind.17. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the defined areas in array form on the carrier are upset. 18. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, metallisiertes Glas, Silizium, Metall und/oder Kunststoffe handelt.18. Device according to one of the preceding claims, characterized in that the carrier consists of essentially non-fluorescent Materials exist, which are preferably glass, metallized glass, silicon, metal and / or plastics. 19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, besonders bevorzugt um Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder Kunststoffe, besonders bevorzugt um PMMA und/oder um Polycarbonat handelt.19. The apparatus of claim 18, characterized in that the carrier is optically transparent, essentially not fluorescent materials, which are preferably glass, especially preferably quartz glass and / or borofloat glass and / or plastics, particularly preferred is PMMA and / or polycarbonate. 20. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fluoreszenzeichstandard mit einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, metallisiertem Glas, Silizium, Metall, und/oder Kunststoffe besteht.20. Device according to one of the preceding claims, characterized in that at least one fluorescence standard with an im Substantially non-fluorescent carrier system is connected, the carrier system preferably consists of glass, metallized glass, silicon, metal, and / or plastics. 21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Fluoreszenzeichstandard mit einem optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder aus Kunststoffen, besonders bevorzugt aus PMMA und/oder aus Polycarbonat besteht.21. The apparatus according to claim 20, characterized in that at least one fluorescent drawing standard with an optical permeable, essentially non-fluorescent carrier system, wherein the carrier system preferably made of glass, particularly preferably made of quartz glass and / or  Borofloat glass and / or from plastics, particularly preferably from PMMA and / or from Polycarbonate exists. 22. Vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägersystem um einen üblichen Objektträger handelt.22. The apparatus according to claim 21, characterized in that the carrier system is a conventional slide is. 23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Träger oder Trägersystem um einen Sonden- Array handelt, auf dem bevorzugt mindestens eine Substanzbibliothek immobilisiert ist.23. The device according to one of claims 1 to 22, characterized in that the carrier or carrier system is a probe Array acts on which preferably at least one substance library is immobilized. 24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Peptiden und/oder Proteinen, bevorzugt in Form von Antikörpern, Rezeptoren, Rezeptor- Ligand-Molekülen, Hormonen oder biologisch aktiven Peptiden immobilisiert sind.24. The device according to claim 23, characterized in that on the probe array substance libraries in the form of Peptides and / or proteins, preferably in the form of antibodies, receptors, receptor Ligand molecules, hormones or biologically active peptides are immobilized. 25. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Nukleinsäuremolekülen, bevorzugt in Form von DNA-Molekülen und/oder RNA-Molekülen, besonders bevorzugt in Form von genomischer DNA, mRNA, cDNA und/oder rmA immobilisiert sind.25. The device according to claim 23, characterized in that on the probe array substance libraries in the form of Nucleic acid molecules, preferably in the form of DNA molecules and / or RNA molecules, particularly preferred in the form of genomic DNA, mRNA, cDNA and / or rmA are immobilized. 26. Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger-System oder Objektträger Zellen, Gewebeschnitte, pharmazeutisch wirksame Verbindungen und/oder Plasmide immobilisiert sind. 26. The apparatus of claim 21 or 22, characterized in that on the carrier system or slide cells, Tissue sections, pharmaceutically active compounds and / or plasmids immobilized are.   27. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten durch mikrotechnische Verfahren, bevorzugt durch photolitographische Verfahren, durch Trockenätzen und/oder durch Ionenimplantation, und/oder durch drucktechnische Verfahren, bevorzugt durch Spotten, durch Offsetdruck und/oder durch Walzen, durch Spritzgießen oder durch Oberflächenprägung auf den Träger aufgebracht und/oder strukturiert werden.27. A method for producing a device according to one of claims 1 to 26 characterized in that the polymer layers by microtechnical processes, preferably by photolithographic processes, by dry etching and / or by Ion implantation, and / or by printing processes, preferably by spotting, by offset printing and / or by rolling, by injection molding or by Surface embossing can be applied and / or structured on the carrier. 28. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten durch positive oder negative photolithographische Verfahren auf den Träger aufgebracht und/oder strukturiert werden.28. A method for producing a device according to claim 27, characterized in that the polymer layers by positive or negative photolithographic processes are applied to the support and / or structured. 29. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerschichten als homogene Schichten durch mikrotechnische Verfahren, bevorzugt durch CVD-, PVD,-, besonders bevorzugt durch Spin- On-Verfahren auf den Träger aufgebracht werden.29. A method of manufacturing a device according to claim 27, characterized in that the polymer layers through as homogeneous layers microtechnical processes, preferably by CVD, PVD, -, particularly preferably by spin On-process can be applied to the carrier. 30. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der Polymerschichten in Abhängigkeit von den Verfahrensparametern, besonders bevorzugt in Abhängigkeit von der Viskosität des Polymers, von der Temperatur, von der Luftfeuchtigkeit oder von der Umlaufgeschwindigkeit, bei photolithographischen Verfahren besonders bevorzugt in Abhängigkeit von der Bestrahlungs-Dosis, dem Entwicklungsprozess und dem Temperverfahren eingestellt werden kann. 30. A method of manufacturing a device according to any one of claims 27 to 29 characterized in that the thickness of the polymer layers depending on the Process parameters, particularly preferably depending on the viscosity of the Polymers, on temperature, on humidity or on the Rotational speed, particularly preferred in photolithographic processes in Dependence on the radiation dose, the development process and the Annealing process can be set.   31. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die geometrische Form der bei entsprechender Bestrahlung fluoreszierenden Bereiche durch entsprechende Aussparungen in einer Maske, bevorzugt in einer Lochmaske auf Basis von strukturiertem Chrom auf Quarz definiert wird.31. A method of manufacturing a device according to any one of claims 27 to 30 characterized in that the geometric shape of the appropriate irradiation fluorescent areas through corresponding cutouts in a mask, preferably in a shadow mask based on structured chrome on quartz is defined. 32. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass das Vernetzungsverhalten der Polymerschichten durch Temper- und/oder Bestrahlungsprotokolle einstellbar ist.32. Method for producing a device according to one of claims 27 to 31. characterized in that the crosslinking behavior of the polymer layers by Tempering and / or radiation protocols can be set. 33. Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung mit einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden, bevorzugt optisch durchlässigen Trägersystem durch Kleben, durch Lagejustage und/oder durch ein Vakuumsystem verbunden wird.33. A method for producing a device according to one of claims 27 up to 32, characterized in that the device with a substantially not fluorescent, preferably optically transparent carrier system by gluing, by Position adjustment and / or is connected by a vacuum system. 34. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Kalibrierung, bevorzugt zur on-line Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen hinsichtlich ihrer Sensitivität, ihres räumlichen und/oder zeitlichen Auflösungsvermögens und/oder hinsichtlich ihrer geometrischen und/oder dynamischen und/oder alterungsbedingten Eigenschaften.34. Use of a device according to one of claims 1 to 26 for Calibration, preferably for on-line calibration of fluorescence detection systems with regard to their sensitivity, their spatial and / or temporal resolution and / or with regard to their geometric and / or dynamic and / or aging-related Characteristics. 35. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 34 zur Laserleistungsmessung und/oder -steuerung und/oder zur Lampenleistungsmessung und/oder zum Integrationszeitabgleich und/oder zur Auflösungsanpassung. 35. Use of a device according to claim 34 for laser power measurement and / or control and / or for lamp power measurement and / or for Integration time adjustment and / or for resolution adjustment.   36. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 34 zur Flatfieldbestimmung und/oder zur Linearisierung von CCD-Readersystemen.36. Use of a device according to claim 34 for flat field determination and / or for linearization of CCD reader systems. 37. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Referenzierung und/oder zum system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen, wobei es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Sonden-Array basierten Interaktionsstudien handelt.37. Use of a device according to one of claims 1 to 26 for Referencing and / or cross-system and cross-device and / or cross-test Comparison of fluorescence signals, preferably fluorescence signals from Probe array-based interaction studies. 38. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 37 zum system- und/oder geräteübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen durch Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten.38. Use of a device according to claim 37 for system and / or cross-device comparison of fluorescence signals by normalizing the experimental results on resulting intensities of the polymer layers. 39. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 37 zur Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen durch Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten zur Definition absoluter Ergebnisse oder zur Definition relativer, auf die Fluoreszenz polymerer Schichten bezogener Ergebnisse.39. Use of a device according to claim 37 for the quantification of Fluorescence signals by normalizing the experimental results to resulting ones Intensities of the polymer layers for the definition of absolute results or for the definition relative results related to the fluorescence of polymer layers. 40. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Protein-Protein-Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von Antikörper-Antigen- und/oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstudien, und/oder von Nukleinsäure-Nukleinsäure-Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von DNA-RNA- und/oder DNA-DNA- und/oder RNA-RNA- Interaktionsstudien und/oder von Protein- Nukleinsäure-Interaktionsstudien handelt.40. Use of a device according to one of claims 37 to 39, wherein it prefers fluorescence signals from protein-protein interaction studies, especially preferably from antibody-antigen and / or receptor-ligand interaction studies, and / or of nucleic acid-nucleic acid interaction studies, particularly preferably of DNA-RNA and / or DNA-DNA and / or RNA-RNA interaction studies and / or of protein Nucleic acid interaction studies. 41. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 26 zum system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von zellulären Lokalisationsexperimenten und Gewebeschnitten, die durch Fluoreszenz-Mikroskopie auswertbar sind. 41. Use of a device according to one of claims 1 to 26 for Cross-system and cross-device and / or cross-test comparison of cellular Localization experiments and tissue sections by fluorescence microscopy are evaluable.   42. Verwendung einer Vorrichtung, umfassend einen im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Träger, auf dem in einem oder mehreren definierten Bereichen eine hinsichtlich ihrer Zusammensetzung und Dicke einheitliche Polymerschicht so aufgebracht ist, dass dieser Bereich oder diese Bereiche nach entsprechender Bestrahlung fluoreszieren, zur Referenzierung von Fluoreszenzsignalen und/oder Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen und/oder zum system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen.42. Use of an apparatus comprising essentially none fluorescent carrier, on which one or more defined areas uniform polymer layer applied in terms of their composition and thickness is that this area or areas fluoresce after appropriate exposure, for referencing fluorescence signals and / or calibration of Fluorescence detection systems and / or for cross-system and cross-device and / or Cross-test comparison of fluorescence signals. 43. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 42, wobei die Polymerschichten ein oder mehrere Polymere, von denen mindestens ein Polymer nach entsprechender Bestrahlung fluoresziert, bevorzugt Postiv- und/oder Negativ-Photolacke, insbesondere auf Basis von Epoxidharzen wie SU8 und/oder Novolacke und/oder PMMA und/oder photosensitives Polyimid und/oder Benzocyclobuten umfassen.43. Use of a device according to claim 42, wherein the Polymer layers one or more polymers, of which at least one polymer after corresponding irradiation fluoresces, preferably positive and / or negative photoresists, in particular based on epoxy resins such as SU8 and / or novolacs and / or PMMA and / or photosensitive polyimide and / or benzocyclobutene. 44. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 oder 43, wobei die Polymerschichten mindestens ein Polymer und zusätzliche fluoreszierende Stoffe, bei denen es sich nicht um Polymere handelt, bevorzugt organische Farbstoffe, insbesondere Azofarbstoffe, Triphenylmethanfarbstoffe, Porphyninenfarbstoffe und/oder anorganische Farbstoffe, insbesondere metallische Farbstoffe und/oder Lanthanide enthalten.44. Use of a device according to one of claims 42 or 43, wherein the polymer layers at least one polymer and additional fluorescent substances which are not polymers, preferably organic dyes, in particular Azo dyes, triphenylmethane dyes, porphynine dyes and / or inorganic Dyes, especially metallic dyes and / or lanthanides contain. 45. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 44, wobei die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Schichtdicke und/oder der Zusammensetzung der Polymerschichten einstellbar ist.45. Use of a device according to one of claims 42 to 44, wherein the Intensity of the fluorescence caused in the areas with appropriate irradiation through the choice of the layer thickness and / or the composition of the polymer layers is adjustable. 46. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 45, wobei die Intensität der in den Bereichen bei entsprechender Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.46. Use of a device according to one of claims 42 to 45, wherein the Intensity of the fluorescence caused in the areas with appropriate irradiation  by physical treatment methods during manufacture, preferably by Irradiation and / or temperature treatment is adjustable. 47. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 46, wobei der Anregungswellenlängenbereich der Polymerschichten durch die Wahl der Polymere und/oder der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.47. Use of a device according to one of claims 42 to 46, wherein the Excitation wavelength range of the polymer layers through the choice of polymers and / or the added fluorescent substances is adjustable. 48. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 47, wobei das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der Polymere und/oder durch die Wahl der Art und/oder Menge und/oder Zusammensetzung der zugegebenen fluoreszierenden Stoffe einstellbar ist.48. Use of a device according to one of claims 42 to 47, wherein the bleaching behavior of those in the areas after corresponding longer exposure caused fluorescence by the choice of the type and / or amount and / or Composition of the polymers and / or by the choice of the type and / or amount and / or The composition of the added fluorescent substances is adjustable. 49. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 48, wobei das Bleichverhalten der in den Bereichen nach entsprechender längerer Bestrahlung hervorgerufenen Fluoreszenz durch physikalische Behandlungsmethoden während der Herstellung, bevorzugt durch Bestrahlung und/oder Temperaturbehandlung einstellbar ist.49. Use of a device according to one of claims 42 to 48, wherein the bleaching behavior of those in the areas after corresponding longer exposure caused fluorescence by physical treatment methods during the Production, preferably adjustable by radiation and / or temperature treatment. 50. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 49, wobei die maximale Dicke der Polymerschicht deutlich kleiner als die minimale Fokustiefe der zur Fluoreszenz-Messung verwendeten Detektionssysteme ist.50. Use of a device according to one of claims 42 to 49, wherein the maximum thickness of the polymer layer is significantly smaller than the minimum depth of focus of the Fluorescence measurement is used detection systems. 51. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 50, wobei die maximale Dicke der Polymerschicht zwischen wenigen Nanometern und maximal 50 µm liegt, bevorzugt zwischen 100 nm und 10 µm, besonders bevorzugt zwischen 200 nm und 5 µm liegt.51. Use of a device according to claim 50, wherein the maximum thickness the polymer layer is between a few nanometers and a maximum of 50 μm, is preferred is between 100 nm and 10 μm, particularly preferably between 200 nm and 5 μm. 52. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 51, wobei die definierten Bereiche sich in Form und/oder Größe unterscheiden. 52. Use of a device according to one of claims 42 to 51, wherein the defined areas differ in shape and / or size.   53. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 52, wobei die definierten Bereiche die Form von Quadraten und/oder Rechtecken mit Seitenlängen zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.53. Use of a device according to claim 52, wherein the defined Areas in the form of squares and / or rectangles with side lengths between some Nanometers and 5 mm, particularly preferably between 100 nm and 1 mm. 54. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 52, wobei die definierten Bereiche die Form von Kreisen mit Durchmessern zwischen einigen Nanometern und 5 mm, besonders bevorzugt zwischen 100 nm und 1 mm aufweisen.54. Use of a device according to claim 52, wherein the defined Areas in the form of circles with diameters between a few nanometers and 5 mm, particularly preferably have between 100 nm and 1 mm. 55. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 54, wobei die definierten Bereiche in Array-Form auf den Träger aufgebracht sind.55. Use of a device according to one of claims 42 to 54, wherein the defined areas in array form are applied to the carrier. 56. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 55, wobei der Träger aus im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, metallisiertes Glas, Silizium, Metall, und/oder Kunststoffe handelt.56. Use of a device according to one of claims 42 to 55, wherein the Carrier consists of essentially non-fluorescent materials, which are preferably glass, metallized glass, silicon, metal, and / or plastics. 57. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 56, wobei der Träger aus optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Materialien besteht, bei denen es sich bevorzugt um Glas, besonders bevorzugt um Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder Kunststoffe, besonders bevorzugt um PMMA und/oder um Polycarbonat handelt.57. Use of a device according to claim 56, wherein the carrier optically transparent, essentially non-fluorescent materials in which it is preferably glass, particularly preferably quartz glass and / or borofloat glass and / or plastics, particularly preferably PMMA and / or polycarbonate. 58. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 57, wobei der Fluoreszenzeichstandard mit einem im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, metallisiertem Glas, Silizium, Metall, und/oder Kunststoffe besteht.58. Use of a device according to one of claims 42 to 57, wherein the Fluorescence drawing standard with an essentially non-fluorescent carrier system is connected, the carrier system preferably made of glass, metallized glass, silicon, Metal, and / or plastics. 59. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 58, wobei der Fluoreszenz­ eichstandard mit einem optisch durchlässigen, im Wesentlichen nicht fluoreszierenden Trägersystem verbunden ist, wobei das Trägersystem bevorzugt aus Glas, besonders bevorzugt aus Quarzglas und/oder Borofloat-Glas und/oder aus Kunststoffen, besonders bevorzugt aus PMMA und/oder aus Polycarbonat besteht.59. Use of a device according to claim 58, wherein the fluorescence Calibration standard with an optically transparent, essentially non-fluorescent  Carrier system is connected, the carrier system preferably made of glass, particularly preferably made of quartz glass and / or borofloat glass and / or of plastics, in particular preferably consists of PMMA and / or polycarbonate. 60. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägersystem um einen üblichen Objektträger handelt.60. Use of a device according to claim 59, characterized in that the carrier system is a conventional slide is. 61. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 60, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Träger oder Trägersystem um einen Sonden- Array handelt, auf dem bevorzugt mindestens eine Substanzbibliothek immobilisiert ist.61. Use of a device according to one of claims 42 to 60, characterized in that the carrier or carrier system is a probe Array acts on which preferably at least one substance library is immobilized. 62. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Peptiden und/oder Proteinen, bevorzugt in Form von Antikörpern, Rezeptoren, Rezeptor- Ligand-Molekülen, Hormonen oder biologisch aktiven Peptiden immobilisiert sind.62. Use of a device according to claim 61, characterized in that on the probe array substance libraries in the form of Peptides and / or proteins, preferably in the form of antibodies, receptors, receptor Ligand molecules, hormones or biologically active peptides are immobilized. 63. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Sonden-Array Substanzbibliotheken in Form von Nukleinsäuremolekülen, bevorzugt in Form von DNA-Molekülen und/oder RNA-Molekülen, besonders bevorzugt in Form von genomischer DNA, mRNA, cDNA und/oder rRNA immobilisiert sind.63. Use of a device according to claim 61, characterized in that on the probe array substance libraries in the form of Nucleic acid molecules, preferably in the form of DNA molecules and / or RNA molecules, particularly preferably in the form of genomic DNA, mRNA, cDNA and / or rRNA are immobilized. 64. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 59 oder 60, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Träger-System oder Objektträger Zellen, Gewebeschnitte, pharmazeutisch wirksame Verbindungen und/oder Plasmide immobilisiert sind. 64. Use of a device according to one of claims 59 or 60, characterized in that on the carrier system or slide cells, Tissue sections, pharmaceutically active compounds and / or plasmids immobilized are.   65. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64 zur Kalibrierung von Fluoreszenzdetektionssystemen, wobei die Detektionssysteme hinsichtlich ihres räumlichen Auflösungsvermögens, ihrer Sensitivität, ihrer geometrischen und/oder ihrer alterungsbedingten Eigenschaften kalibriert werden.65. Use of a device according to one of claims 42 to 64 for Calibration of fluorescence detection systems, the detection systems with respect their spatial resolution, their sensitivity, their geometric and / or their aging-related properties are calibrated. 66. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64, wobei die Detektionssysteme hinsichtlich der Laserleistung und/oder -steuerung und/oder Lampenleistung und/oder Auflösungsanpassung kalibriert werden.66. Use of a device according to one of claims 42 to 64, wherein the Detection systems with regard to laser power and / or control and / or Lamp power and / or resolution adjustment are calibrated. 67. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 65 oder 66, wobei die Kalibrierung der Fluoreszenzdetektionssysteme on-line erfolgt.67. Use of a device according to one of claims 65 or 66, wherein the fluorescence detection systems are calibrated on-line. 68. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64, wobei die Referenzierung den system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen, bei denen es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Sonden- Array basierten Interaktionsstudien handelt, umfasst.68. Use of a device according to one of claims 42 to 64, wherein the Referencing the cross-system and cross-device and / or cross-test comparison fluorescence signals, which are preferably fluorescence signals from probe Array-based interaction studies. 69. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 68, wobei der system- und/oder geräteübergreifenden Vergleich von Fluoreszenzsignalen durch Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten erfolgt.69. Use of a device according to claim 68, wherein the system and / or cross-device comparison of fluorescence signals by normalizing the experimental results on resulting intensities of the polymer layers. 70. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 68, wobei die Referenzierung die Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen durch Normierung der experimentellen Ergebnisse auf resultierende Intensitäten der Polymerschichten zur Definition absoluter Ergebnisse oder zur Definition relativer, auf die Fluoreszenz polymerer Schichten bezogener Ergebnisse umfasst. 70. Use of a device according to claim 68, wherein the referencing the quantification of fluorescence signals by normalizing the experimental Results on resulting intensities of the polymer layers to define absolute Results or for the definition of relative, based on the fluorescence of polymer layers Results includes.   71. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 68 bis 70, wobei es sich bevorzugt um Fluoreszenzsignale von Protein-Protein-Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von Antikörper-Antigen- und/oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstudien, und/oder von Nukleinsäure-Nukleinsäure-Interaktionsstudien, besonders bevorzugt von DNA-RNA- und/oder DNA-DNA- und/oder RNA-RNA- Interaktionsstudien und/oder von Protein- Nukleinsäure-Interaktionsstudien handelt.71. Use of a device according to one of claims 68 to 70, wherein it prefers fluorescence signals from protein-protein interaction studies, especially preferably from antibody-antigen and / or receptor-ligand interaction studies, and / or of nucleic acid-nucleic acid interaction studies, particularly preferably of DNA-RNA and / or DNA-DNA and / or RNA-RNA interaction studies and / or of protein Nucleic acid interaction studies. 72. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 42 bis 64, wobei es sich um einen system- und geräteübergreifenden und/oder testübergreifenden Vergleich von zellulären Lokalisationsexperimenten und Gewebeschnitten, die durch Fluoreszenz- Mikroskopie auswertbar sind, handelt.72. Use of a device according to one of claims 42 to 64, wherein it a cross-system and cross-device and / or cross-test comparison of cellular localization experiments and tissue sections, which are characterized by fluorescence Microscopy can be evaluated.