DE19943704C1 - Affinity sensor for the detection of biological and / or chemical species and its use - Google Patents

Affinity sensor for the detection of biological and / or chemical species and its use

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Abstract

Dsie Erfindung betrifft einen Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies, welcher eine schnelle, quantitative und aufwandsgeringe Detektion der Anwesenheit von biologischen und/oder chemischen Spezies, insbesondere auf Flächen im unteren bis mittleren Mikrometerbereich, ermöglicht. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß der Sensor je nach Ausleseart aus einem optisch transparenten oder teilreflektierenden Substrat (1) besteht, das mit mehreren, voneinander beabstandeten mikrostrukturierten Bindeflächen (2) versehen ist, deren Fläche in Relation zum Durchmesser von Nanopartikeln (3) und oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits so groß festgelegt ist, daß die Nanopartikel (3), die mit Kopplungspartnern (4) versehen sind, welche zu den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) eine solche selektive Affinität aufweisen, daß sie eine anhaltende Bindung mit den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) derart eingehen, daß auf einer oder mehreren Bindeflächen (2) eine so große Anzahl von Nanopartikeln (3) unter Ausbildung von Nanopartikelbelegungen (31) anbindbar sind, daß die von der Nanopartikelbelegung (31) eingenommene Fläche bezogen auf die Fläche einer Bindefläche (2) mindestens 0,1% betragen kann, wobei alle Bindeflächen (2) zusammen in einem solchen aktiven Flächenbereich angeordnet sind, daß sie gemeinsam von einem Objektiv eines üblichen lichtoptischen Mikroskops mit einer Apertur zwischen ...The invention relates to an affinity sensor for the detection of biological and / or chemical species, which enables rapid, quantitative and low-cost detection of the presence of biological and / or chemical species, in particular on areas in the lower to medium micrometer range. The object is achieved in that, depending on the type of reading, the sensor consists of an optically transparent or partially reflecting substrate (1) which is provided with a plurality of spaced apart microstructured binding surfaces (2), the surface of which in relation to the diameter of nanoparticles (3) and is so large above the light-optical diffraction limit that the nanoparticles (3), which are provided with coupling partners (4), which have such a selective affinity for the binding surfaces (2) or sequences (DNA) bound thereon that they have a persistent Binding with the binding surfaces (2) or sequences specifically bound thereon (DNA) in such a way that on one or more binding surfaces (2) such a large number of nanoparticles (3) with the formation of nanoparticle coverings (31) can be connected such that the Nanoparticle occupancy (31) occupied area can be at least 0.1% based on the area of a binding surface (2) , All binding surfaces (2) being arranged together in such an active surface area that they are jointly held by an objective of a conventional light-optical microscope with an aperture between ...

Description

Die Erfindung betrifft einen Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies, der insbesondere für Aufgaben der kombinatorischen Chemie, für diagnostische Aufgaben, wie etwa in der Medizin oder zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, z. B. für Medikamente oder selektiv wirkende Pflanzenschutzmittel, Verwendung finden soll.The invention relates to an affinity sensor for the detection of biological and / or chemical species, which is particularly useful for tasks of combinatorial chemistry, for diagnostic tasks, such as in the Medicine or for the development of new active ingredients, e.g. B. for medication or selectively acting pesticides.

Zur Identifikation biologischer Spezies, Individuen und Krankheiten haben sich Nachweise durch Molekül-Molekül-Wechselwirkung als besonders zweckmäßig erwiesen. Die Messung von Bindungsereignissen auf Biochips erfolgt dabei in der Regel unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern. Diese Methode besitzt jedoch mehrere wesentliche Nachteile:
For the identification of biological species, individuals and diseases, evidence through molecule-molecule interaction has proven to be particularly useful. The binding events on biochips are usually measured using fluorescent markers. However, this method has several major disadvantages:

  • - für die Auslesung sind sehr empfindliche Detektoranordnungen erforderlich, die zudem Anregungs- und Fluoreszenzlicht streng voneinander trennen müssen,- For the reading are very sensitive detector arrangements required, which also strictly excitation and fluorescent light have to separate from each other
  • - die Quantifizierung ist problematisch, da die Quantenausbeuten der Fluoreszenz sehr stark umgebungsabhängig sind (Tanke, H. J.; Herman B. Fluorescence Microscopy, Springer Verlag (1998)). Deshalb sind quantitative analytische Aussagen oft gar nicht oder nur mit einem sehr hohen Meßaufwand erreichbar (Rost FWD Quantitative Fluorescence Microscopy, Cambridge University Press. (1991), so daß beispielsweise eine Auswertung nur unter Einbeziehung von Messungen an mehreren Chips möglich wird (Hacia, J. G.; Brody, L. C.; Chee, M. S., Fodor, S. C.; Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density olionucleotide arrays and two colour fluorescence analysis, Nature Genetics 14, 441-447 (1996)). Häufig scheitert jedoch selbst ein qualitativer Nachweis.- The quantification is problematic because the quantum yields of the Fluorescence is very strongly dependent on the environment (Tanke, H. J .; Herman B. Fluorescence Microscopy, Springer Verlag (1998)). That is why quantitative analytical statements often not at all or only with a very high measurement effort achievable (Rost FWD Quantitative Fluorescence Microscopy, Cambridge University Press. (1991), so that for example an evaluation only with the inclusion of measurements on several Chips becomes possible (Hacia, J.G .; Brody, L.C .; Chee, M.S., Fodor, S.C .; Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density olionucleotide arrays and two color fluorescence analysis, Nature Genetics 14, 441-447 (1996)). However, it often fails qualitative evidence.

Die Detektion von Bindungsereignissen insbesondere auf hochintegrierten Biochips mit kleinen Bindeflächen durch Fluoreszenzmessung ist zeitaufwendig und nur mit teuren optischen Einrichtungen für die Auslesung zu bewerkstelligen. Die für quantitative Messungen erforderlichen längeren Expositions- und Akkumulationszeiten bewirken zudem eine photochemische Degradation der Farbstoffe, die das Signal im Verlauf der Messung verschlechtert und die Quantifizierung erschwert. Die Intensität des Fluoreszenzlichtes pro Anregungslichtmenge und Bindeereignis hängt zudem von der spezifischen chemischen Umgebung der zum Markieren verwendeten Chromophore ab. Deshalb treten von Charge zu Charge und von Test zu Test und sogar innerhalb einer Probe erhebliche Abweichungen in den Meßsignalen auf, die die eigentlich erforderliche Quantifizierung der Meßsignale ganz erheblich beeinträchtigen. Ein langsamer photo- und thermochemischer Abbau der Chromophoren führt überdies dazu, daß Meßproben nicht über längere Zeiten lagerfähig sind, d. h. sie können nicht archiviert und etwa zu einem späteren Zeitpunkt für Vergleichsmessungen herangezogen werden.The detection of binding events, especially on highly integrated ones Biochips with small binding areas by fluorescence measurement time consuming and only with expensive optical equipment for the  Readout. The one for quantitative measurements longer exposure and accumulation times required also a photochemical degradation of the dyes, which the signal in The course of the measurement deteriorates and the quantification becomes more difficult. The intensity of the fluorescent light per quantity of excitation light and Binding event also depends on the specific chemical environment the chromophores used for labeling. Therefore kick off Batch to batch and from test to test and even within a sample significant deviations in the measurement signals, which the actually required quantification of the measurement signals quite considerably affect. A slow photo- and thermochemical degradation of the Chromophores also means that measurement samples do not are storable for longer periods, d. H. they cannot be archived and about used for comparative measurements at a later date become.

Bei der Auslesung von Bindeereignissen auf Biochips besteht zusätzlich das Problem, daß für Assays bei einer ausreichend großen Zahl von diskreten mikrostrukturierten Bindeflächen (typischerweise ca. 100-1000 Bindeflächen) oder für SBH-Chips (typischerweise 10000-106 Bindeflächen) die Gesamtfläche aller einzelnen Bindeflächen auf einem Chip nicht zu groß sein darf, um bei der Inkubation mit einer Testlösung nicht zu große Zeiten für die diffusive Ausbreitung von Konzentrationsfronten bzw. die spontane Einstellung von Anlagerungs- und Desorptionsgleichgewichten mit den gekoppelten molekularen Transportschritten zu benötigen.When reading binding events on biochips, there is also the problem that for assays with a sufficiently large number of discrete microstructured binding surfaces (typically approx. 100-1000 binding surfaces) or for SBH chips (typically 10000-10 6 binding surfaces), the total area of all of them Binding areas on a chip must not be too large, so that when incubating with a test solution it is not necessary to take too long times for the diffusive spreading of concentration fronts or the spontaneous adjustment of attachment and desorption equilibria with the coupled molecular transport steps.

Kleine Gesamtflächen wären auch für eine parallele optische Auslesung von Vorteil, um nicht mit zu großen Objektivdurchmessern für die Ausleseoptiken arbeiten zu müssen, die die Methode verteuern. Durch eine Verminderung der Gesamtfläche reduziert sich bei Fluoreszenzfarbstoffmarkierung bei gleicher Dichte bindender Gruppen die absolute Zahl die Fluorophoren, was die ohnehin komplizierte Fluoreszenzmessung bei kleinen Stoffmengen auf Festkörperoberflächen weiter erschwert. Deshalb kann bei den etablierten Fluoreszenzverfahren die Auflösungsgrenze der optischen Abbildung (ca. 0.4 . . . 1 µm) bei weitem nicht ausgeschöpft werden. Statt dessen wird überwiegend mit Einzelflächen von 100 µm und mehr gearbeitet (Chee, M. et al.; Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays, Science 274 (1996), 610-614). Bei dieser Flächengröße erreicht man (für gleich große Zwischenräume) schon bei 100 Bindeflächen einen Flächenbedarf von 4 mm2, was für schnelle Assays wegen der erforderlichen Diffusionszeiten schon erheblich zu hoch ist. Bei 106 Bindeflächen würde die benötigte Gesamtfläche ca. 200 mm.200 mm betragen, was weit oberhalb sinnvoller Dimensionen ist, wenn Biochips serienmäßig eingesetzt und ausgewertet werden sollen.Small total areas would also be advantageous for a parallel optical readout, so as not to have to work with lens diameters that are too large for the readout optics that make the method more expensive. By reducing the total area, the absolute number of fluorophores is reduced for fluorescent dye labeling with the same density of binding groups, which further complicates the already complicated fluorescence measurement with small amounts of substance on solid surfaces. For this reason, the resolution limit of the optical image (approx. 0.4... 1 µm) cannot be fully exhausted in the established fluorescence methods. Instead, predominantly single areas of 100 µm and more are used (Chee, M. et al .; Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays, Science 274 (1996), 610-614). With this area size (for equally large spaces), an area requirement of 4 mm 2 is achieved with 100 binding areas, which is already considerably too high for fast assays due to the required diffusion times. With 106 binding surfaces, the total area required would be approx. 200 mm. 200 mm, which is far above reasonable dimensions if biochips are to be used and evaluated as standard.

In US-PS 5,556,756 wird ein Gold-Sol beschrieben, das in analytischen Testkits eingesetzt werden kann. Da die Analytik auf einer Farbänderung der Oberfläche beruht, werden dabei vorzugsweise Partikel zwischen 1 nm und 5 nm eingesetzt. Das dort beschriebene Verfahren hat den Nachteil, daß zum einen relativ große Testflächen benutzt werden müssen und zum anderen permeable Membranen eingesetzt werden müssen, um Spülprozesse durchführen zu können. Diese Lösung ist nicht zur Markierung kleiner Bindeflächen im mittleren und unteren Mikrometerbereich geeignet.A gold sol is described in US Pat. No. 5,556,756, which is described in analytical Test kits can be used. Because the analytics are based on a color change based on the surface, particles are preferably between 1 nm and 5 nm used. The method described there has the Disadvantage that relatively large test areas are used and permeable membranes must be used to be able to carry out rinsing processes. This solution is not for marking small binding areas in the middle and lower Micrometer range suitable.

Weiterhin ist es grundsätzlich bekannt, daß funktionalisierte Nanopartikel spezifisch an Biomoleküle angelagert werden können (Nicholl, D., Genetische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg (1995), S. 24-27). Solche Bindeereignisse werden u. a. genutzt, um in der Grundlagenforschung mit Hilfe ultramikroskopischer Techniken wie z. B. Tunnel-, Kraft- und Transmissionselektronenmikroskopie sequenzspezifische Informationen auf der Skala von wenigen bis 1 nm aus auf Festkörperoberflächen immobilisierten biogenen Makromolekülen zu gewinnen. Dabei wird der Umstand genutzt, daß einzelne Partikel an diskrete Regionen eines einzelnen großen Moleküls angelagert werden. Zum Nachweis dieser einzelnen Partikel sind ultramikroskopische Verfahren unerläßlich. Diese sind aber zu aufwendig, d. h. sowohl in der Investition als auch in der Handhabung zu kompliziert und zu teuer, um für Serien- oder Routineanalysen eingesetzt zu werden. Furthermore, it is generally known that functionalized nanoparticles can be specifically attached to biomolecules (Nicholl, D., Genetic Methods, Spectrum Academic Publishing House Heidelberg (1995), pp. 24-27). Such binding events are u. a. used to in the Basic research using ultramicroscopic techniques such as B. Tunnel, force and transmission electron microscopy sequence-specific information on a scale from a few to 1 nm from biogenic macromolecules immobilized on solid surfaces to win. The fact that individual particles are attached is used here discrete regions of a single large molecule can be attached. To detect these individual particles are ultramicroscopic Procedure essential. But these are too expensive, d. H. both in the Investment as well as handling too complicated and too expensive to to be used for series or routine analyzes.  

Darüber hinaus ist es bekannt, daß grundsätzlich auch Submikrometerpartikel durch optische Methoden detektiert werden können. In WO 98/57148 A1 werden eine Methode und eine Anordnung beschrieben, bei der die durch die Anlagerung von solch kleinen Partikeln auf einen dünnen Metallfilm verbundene Änderungen des Winkels der Oberflächenplasmonenresonanz festgestellt werden kann. Dieses Verfahren setzt eine aufwendige SPR-Anordnung voraus und ist außerdem auf die Existenz einer, den Lichtdurchtritt hindernden Metallschicht auf einem ansonsten transparenten Substrat angewiesen.In addition, it is known that in principle Submicron particles can be detected by optical methods can. WO 98/57148 A1 describes a method and an arrangement described in which by the attachment of such small particles changes in the angle of the film connected to a thin metal film Surface plasmon resonance can be determined. This Process requires and is a complex SPR arrangement also on the existence of one that prevents the passage of light Metal layer on an otherwise transparent substrate.

Es besteht ein dringender Bedarf an Affinitätssensoren zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies, die vorstehend genannte Nachteile vermeiden und die für Serien- oder Routineanalysen einsetzbar sind.There is an urgent need for affinity sensors for detection biological and / or chemical species, the aforementioned Avoid disadvantages and use them for series or routine analyzes are.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Affinitätssensor anzugeben, welcher eine schnelle, quantitative und aufwandsgeringe Detektion der Anwesenheit von biologischen und/oder chemischen Spezies, insbesondere auf Flächen im unteren bis mittleren Mikrometerbereich, ermöglicht. The invention has for its object an affinity sensor to indicate which is a fast, quantitative and low effort Detection of the presence of biological and / or chemical Species, especially on areas in the lower to middle Micrometer range.  

Die Aufgabe wird durch die Merkmale des ersten Patentanspruchs gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind durch die nachgeordneten Ansprüche erfaßt.The object is achieved by the features of the first claim. Advantageous refinements are due to the subordinate claims detected.

Ein zuverlässiger Nachweis von Bindeereignissen auf Flächen im unteren bis mittleren µm-Bereich gelingt im Rahmen der Erfindung durch die Erzeugung von Nanopartikel-Schichten, die durch Marker gebildet sind, deren Dichte insbesondere durch Absorptions- aber auch durch Reflexions- oder Streulichtmessungen oder durch Plasmonenresonanz­ messungen quantifizierbar ist. Bei sehr kleinen, elektrisch leitfähigen Nanopartikeln kann vorteilhaft die größenspezifische Absorption von Licht herangezogen werden, wodurch unter Einsatz von mehreren monodispersen Gruppen von Nanopartikeln mit unterschiedlichem Durchmesser auch Mehrfachmarkierungen möglich sind. Die selektive Markierung von immobilisierten Biomolekülen hat sich als überraschend unproblematisch erwiesen. Als besonders günstig haben sich Goldpartikel zur Markierung herausgestellt. Bei dem Einsatz von Goldpartikeln ist ein solcher Affinitätssensor auch in einer Vorrichtung zur Bestimmung der Plasmonenresonanz einbindbar. Eine selektive Bindung ist auch bei relativ großen Partikeldurchmessern nachzuweisen, die bereits recht komfortable Streulichtsignale liefern.Reliable evidence of binding events on areas in the lower area to medium µm range succeeds in the context of the invention by the Generation of nanoparticle layers, which are formed by markers, their density, in particular by absorption but also by Reflection or scattered light measurements or by plasmon resonance measurements is quantifiable. For very small, electrically conductive Nanoparticles can be advantageous for the size-specific absorption of Light can be used, making use of several monodisperse groups of nanoparticles with different Multiple markings are also possible. The selective Labeling of immobilized biomolecules has been surprising proven unproblematic. Gold particles have proven to be particularly cheap exposed for marking. When using gold particles is a such affinity sensor also in a device for determining the Plasmon resonance can be integrated. A selective bond is also with to detect relatively large particle diameters that are already quite right Deliver comfortable stray light signals.

Besonders vorteilhaft kann durch die bei vorliegender Erfindung vorgesehene flächenhafte Markierung mit insbesondere metallischen Nanopartikeln die Auslesung von Bindeereignissen auf Biochips erfolgen.Can be particularly advantageous by the in the present invention intended areal marking with in particular metallic Nanoparticles the reading of binding events on biochips respectively.

Die Erfindung soll nachstehend anhand schematischer Ausführungs­ beispiele näher erläutert werden. Es zeigen:The invention is based on a schematic embodiment examples will be explained in more detail. Show it:

Fig. 1 schematisch in Draufsicht einen Affinitätssensor, Fig. 1 shows schematically in plan view an affinity sensor,

Fig. 2 einen Teilbereich des Affinitätssensors nach Fig. 1 in seitlicher Ansicht, Fig. 2 shows a portion of the affinity sensor of FIG. 1 in a side view,

Fig. 3 eine rasterkraftmikroskopische Aufnahme einer Nanopartilel- Schicht, die durch eine Belegung mit 30 nm Goldpartikeln gebildet ist und Fig. 3 is an atomic force micrograph of a Nanopartilel- layer which is formed by an occupancy of 30 nm gold particles and

Fig. 4 eine lichtmikroskopische Durchlichtaufnahme einer einzelnen Bindefläche nach Fig. 3, die die durch die Nanopartikel- Schicht bewirkte Absorption gegenüber dem sie tragenden Substrat veranschaulicht. FIG. 4 shows a light microscopic transmitted light image of an individual binding surface according to FIG. 3, which illustrates the absorption caused by the nanoparticle layer with respect to the substrate carrying it.

Fig. 1 zeigt beispielhaft einen Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies bestehend aus einem optisch transparenten Substrat 1, das mit mehreren, voneinander beabstandeten mikrostrukturierten Bindeflächen 2 versehen ist. Die Art und Ausbildung der Bindeflächen erfolgt je nach Vorgabe der zu ermittelnden Bindeereignisse und ist als solche durch übliches fachgemäßes Handeln realisierbar, weshalb hier dazu keine weiteren Ausführungen erforderlich sind. Die Beabstandung der Bindeflächen 2 erfolgt im Beispiel durch freistrukturierte Bereiche 11 des Substrats 1. Die Bemaßung der Seitenlängen der einzelnen hier quadratisch ausgeführten Bindeflächen 2 erfolgt derart, daß sie oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits festgelegt ist; im Beispiel 2 µm, jedenfalls ≧ 0,5 µm. Die Seitenlänge des optisch transparenten Substrats 1 soll im Beispiel 3 mm betragen, wobei der aktive Flächenbereich 22, nämlich die Fläche des Substrats 1, die mit den Bindeflächen 2 versehen ist, lediglich in der Größenordnung von 1 mm2 festgelegt ist, für bestimmte Anwendungen (z. B. eine schnelle Diagnostik) auch Flächen unterhalb 0.01 mm2 problemlos einnehmen kann, wesentlich ist lediglich, daß den einzelnen Bindeflächen 2 eine Fläche gegeben ist, die oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits liegt, wobei der durch alle Bindeflächen 2 eingenommene aktive Flächenbereich 22 von gängigen Objektiven mit einer numerischen Apertur zwischen 0,1 . . . . 0,9, vorzugsweise 0,2, lichtoptischer Mikroskope erfaßbar sein soll. Verzichtet man auf diesen durch die Erfindung geschaffenen Vorteil, ist es ebenso möglich teuere Objektive mit einer größeren Apertur einzusetzen, wobei dann auch größere aktive Flächenbereiche 22 zum Einsatz gelangen können. Fig. 1 shows an example of an affinity sensor for the detection of biological and / or chemical species consisting of an optically transparent substrate 1 which is provided with a plurality of spaced-apart micro-structured surfaces 2 binding. The type and design of the binding surfaces depends on the specification of the binding events to be determined and can be implemented as such by customary professional action, which is why no further explanations are required here. In the example, the bonding surfaces 2 are spaced apart by free-structured regions 11 of the substrate 1 . The dimensioning of the side lengths of the individual binding surfaces 2 , which are square here, takes place in such a way that it is defined above the light-optical diffraction limit; in the example 2 µm, in any case ≧ 0.5 µm. In the example, the side length of the optically transparent substrate 1 should be 3 mm, with the active surface area 22 , namely the surface of the substrate 1 , which is provided with the binding surfaces 2 , only being of the order of 1 mm 2 for certain applications ( e.g. rapid diagnostics) can also easily take up areas below 0.01 mm 2 , the only important thing is that the individual binding areas 2 are given an area which lies above the light-optical diffraction limit, the active area 22 occupied by all binding areas 2 from common lenses with a numerical aperture between 0.1. , , , 0.9, preferably 0.2, optical microscopes should be detectable. If one omits this advantage created by the invention, it is also possible to use expensive lenses with a larger aperture, in which case larger active surface areas 22 can also be used.

Fig. 2 zeigt einen Teilbereich des Affinitätssensors nach Fig. 1 in seitlicher Ansicht, wobei gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 1 bezeichnet sind. Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Nanopartikel 3 sind mit Kopplungspartnern 4 versehen, welche zu den Bindeflächen 2 oder, wie im Beispiel nach Fig. 2 dargestellt, darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) eine hohe selektive Affinität aufweisen. Zur näheren Erläuterung soll folgendes Beispiel dienen: FIG. 2 shows a partial area of the affinity sensor according to FIG. 1 in a side view, the same parts being designated with the same reference numerals as in FIG. 1. The nanoparticles 3 used in the context of the invention are provided with coupling partners 4 which have a high selective affinity for the binding surfaces 2 or, as shown in the example according to FIG. 2, sequences (DNA) specifically bound thereon. The following example is intended to explain:

Oligonukleotide mit bspw. 20 Basenpaaren sind auf den mikrostrukturierten Bereichen des Substrats 1 immobilisiert und bilden so die vorstehend bezeichneten Bindeflächen 2. Der so präparierte Affinitätssensor wird mit einer zu testenden Lösung versetzt, die DNA unbekannter Zusammensetzung enthält. Diese bindet nur auf den Bindeflächen 2, die zu Teilabschnitten der DNA komplementäre Oligonukleotide tragen. Nach dem Abspülen, zwecks Entfernung unspezifisch gebundener DNA, wird die Substratoberfläche einer kolloidalen Lösung die Nanopartikel, im Beispiel bestehend aus Gold mit einem Partikeldurchmesser von 30 nm, enthält, ausgesetzt. Die Oberfläche der Nanopartikel ist mit einem Kopplungspartner 4 versehen, im Beispiel einem Oligonukleotid, dessen Sequenz so beschaffen ist, daß es nicht komplementär zu einem der Bindeflächen 2 auf dem Substrat 1 aber komplementär zu einer konservativen Nukleotidabfolge der zu untersuchenden Targetmoleküle ist, die in allen in Frage kommenden Targetmolekülen (gebundene DNA) gleich vorkommt. Der nach einer Hybridisierung erhaltene Zustand des Affinitätssensors ist im Teilausschnitt in Fig. 2 veranschaulicht.Oligonucleotides with, for example, 20 base pairs are immobilized on the microstructured areas of the substrate 1 and thus form the binding surfaces 2 described above. The affinity sensor prepared in this way is mixed with a solution to be tested which contains DNA of unknown composition. This only binds to the binding surfaces 2 , which carry oligonucleotides complementary to sections of the DNA. After rinsing, in order to remove unspecifically bound DNA, the substrate surface of a colloidal solution which contains nanoparticles, in the example consisting of gold with a particle diameter of 30 nm, is exposed. The surface of the nanoparticles is provided with a coupling partner 4 , in the example an oligonucleotide, the sequence of which is such that it is not complementary to one of the binding surfaces 2 on the substrate 1, but is complementary to a conservative nucleotide sequence of the target molecules to be examined, all of which target molecules in question (bound DNA) occur immediately. The state of the affinity sensor obtained after hybridization is illustrated in the partial section in FIG. 2.

Nach der Hybridisierung ist im Beispiel eine Dichte von ca. 40 Partikeln/µm2 erhalten worden, wobei im Beispiel den eingesetzten Goldnanopartikeln 3 ein Durchmesser von 30 nm gegeben ist. Bei einer Querschnittsfläche der einzelnen Nanopartikel von ca. 700 nm2 erhält man Nanopartikel-Schichten mit einer Nanopartikelbelegung 31 von ca. 3%, welche im Lichtmikroskop sofort und deutlich sichtbar sind. Diese Strukturen entsprechen den vorstrukturierten Bindeflächen 2.After hybridization, a density of approximately 40 particles / μm 2 was obtained in the example, the diameter of 30 nm being given to the gold nanoparticles 3 used in the example. With a cross-sectional area of the individual nanoparticles of approx. 700 nm 2 , nanoparticle layers with a nanoparticle coverage 31 of approx. 3% are obtained, which are immediately and clearly visible in the light microscope. These structures correspond to the pre-structured binding surfaces 2 .

Die Durchmesserbereiche der Nanopartikel 3 sind in Abhängigkeit vom jeweils auszubildenen Testassay in weiten Grenzen festlegbar. So können die Durchmesser der Nanopartikel in der Größenordnung von 2 . . . 600 nm festgelegt sein. Vorzugsweise ist je nach dem für die Nanopartikel ausgewähltem Material ein Durchmesserbereich von 15 . . . 60 nm gewählt. Bevorzugt kommen im Rahmen der Erfindung metallische Nanopartikel zum Einsatz, da sie in sehr effektiver Weise Licht absorbieren, wodurch schon Nanopartikelbelegungen in der Größenordnung von 0,1% im Lichtmikroskop im Durchlicht detektierbar sind. Damit ist es möglich, auch bei Ausdehnungen der einzelnen Bindeflächen 2 knapp oberhalb der Beugungsgrenze (1 µm . . 10 µm) zu arbeiten. 100 Bindeflächen 2 lassen sich auf diese Weise auf aktiven Flächen 22 von deutlich weniger als 0.1 mm Seitenlänge plazieren, 10000 Bindeflächen 2 auf weniger als 1 mm2. Selbst für höchstintegrierte Affinitätssensoren mit 100000 Bindeflächen 2 erscheint eine Gesamtfläche von weniger als 1 mm2 gut realisierbar. Auf diese Weise sind sehr schnell arbeitende und für kleinste Probenmengen geeignete Assays aufbaubar, so daß für niederintegrierte Assays lediglich Probenmengen bis unter 1 nl und für höher integrierte bis zu ca. 1 µl benötigt werden.The diameter ranges of the nanoparticles 3 can be determined within wide limits depending on the test assay to be designed in each case. The diameters of the nanoparticles can be of the order of 2. , , 600 nm. Depending on the material selected for the nanoparticles, a diameter range of 15 is preferred. , , 60 nm selected. Metallic nanoparticles are preferably used in the context of the invention, since they absorb light in a very effective manner, as a result of which nanoparticle coatings of the order of magnitude of 0.1% can be detected in transmitted light in the light microscope. This makes it possible to work just above the diffraction limit (1 .mu.m... 10 .mu.m ) even when the individual binding surfaces 2 are extended. In this way, 100 binding surfaces 2 can be placed on active surfaces 22 of significantly less than 0.1 mm in side length, 10,000 binding surfaces 2 on less than 1 mm 2 . Even for highly integrated affinity sensors with 100,000 binding areas 2 , a total area of less than 1 mm 2 appears to be feasible. In this way, very fast-working assays suitable for very small amounts of sample can be set up, so that only small amounts of sample down to less than 1 nl and for more highly integrated up to about 1 µl are required for low-integrated assays.

Es liegt im Rahmen der Erfindung, für die vorgesehenen Nanopartikel 3 auch metallhaltige Kompositpartikel im genannten Größenbereich als auch Nanopartikel aus einem Halbleitermaterial, wie z. B. CdSe, InP, als auch beschichtete Nanopartikel, bspw. mit ZnSe, einzusetzen. Auch liegt es im Rahmen der Erfindung, Nanopartikel aus Kunststoff einzusetzen, die bevorzugt Einschlüsse aus einem absorbierenden Farbstoff, Metall oder Halbleitern beinhalten.It is within the scope of the invention for the intended nanoparticles 3 also metal-containing composite particles in the size range mentioned, as well as nanoparticles made of a semiconductor material, such as. B. CdSe, InP, as well as coated nanoparticles, for example with ZnSe. It is also within the scope of the invention to use nanoparticles made of plastic, which preferably contain inclusions made of an absorbent dye, metal or semiconductors.

Wesentlich bei der Auswahl genannter Nanopartikel 3 bzgl. ihrer materialmäßigen Zusammensetzung und Größe ist lediglich, daß die durch sie gebildeten Nanopartikelbelegungen 31 mit Objektiven üblicher lichtoptischer Mikroskope, zwecks Bestimmung der durch die Nanopartikelbelegung 31 hervorgerufenen optischen Absorption, Reflexion oder Streuung, auch bei den vorstehend beschriebenen niedrigen Dichten der Nanopartikel pro Bindefläche 2 bei Erfassung der gesamten aktiven Fläche 22 detektierbar sind. Ebenso kann die Anordnung der Bindeflächen 2, die genannte Nanopartikelbelegungen 31 aufnehmen, in vorstehend beschriebener Weise auf der Fläche eines Prismas vorgesehen sein, wodurch ein solcher Affinitätssensor einer Vorrichtung zur Erfassung der Plasmonenresonanz zugänglich ist.All that is important in the selection of the named nanoparticles 3 with regard to their material composition and size is that the nanoparticle coatings 31 formed by them with lenses of conventional light-optical microscopes, for the purpose of determining the optical absorption, reflection or scattering caused by the nanoparticle coating 31 , also in those described above low densities of the nanoparticles per binding surface 2 can be detected when the entire active surface 22 is recorded. Likewise, the arrangement of the binding surfaces 2 , which accommodate the named nanoparticle coatings 31, can be provided on the surface of a prism in the manner described above, as a result of which such an affinity sensor is accessible to a device for detecting the plasmon resonance.

Für die Auswahl der als Marker dienenden Nanopartikel 3 gilt, daß deren Größe so gewählt wird, daß sie einerseits auch bei wenigen bindenden Molekülen schon einen sehr effektiven Beitrag zur Signalentstehung leisten, wobei sie nicht zu klein sein dürfen, die andererseits aber, um spezifisch anzukoppeln, nicht zu groß sein dürfen, wobei durch die Ankopplung von mehreren Nanopartikeln 3 an einer einzelnen Bindefläche 2 ein kooperativer Meßeffekt erreicht wird. Bei abnehmender Partikelgröße wird das Meßsignal schlechter, bei zunehmender Partikelgröße geht die Spezifität der Bindung zurück. Ersteres führt zu einer Verringerung des Absolutsignals, letzteres zu einer Anhebung des Hintergrundsignals. Die jeweils konkrete Auswahl der betreffenden Partikel liegt in einem für den Fachmann zumutbaren Rahmen. Für den vorstehend beschriebenen Einsatz. Im beschriebenen Beispiel wurden Au- Partikel mit einem Durchmesserbereich zwischen 15 nm und 60 nm als besonders bevorzugt gefunden.For the selection of the nanoparticles 3 serving as markers, the size of the nanoparticles should be selected so that, on the one hand, they make a very effective contribution to signal generation even with a few binding molecules, whereby they must not be too small, but on the other hand, in order to specifically couple , must not be too large, a cooperative measurement effect being achieved by coupling several nanoparticles 3 to a single binding surface 2 . With decreasing particle size, the measurement signal becomes worse, with increasing particle size the specificity of the binding decreases. The former leads to a reduction in the absolute signal, the latter to an increase in the background signal. The specific selection of the particles in question lies within a reasonable range for the person skilled in the art. For the use described above. In the example described, Au particles with a diameter range between 15 nm and 60 nm were found to be particularly preferred.

Zur Verdeutlichung der erzielten Anbindungen zeigt Fig. 3 eine rasterkraftmikroskopische Aufnahme einer Nanopartikelbelegung 31 auf einem 5 . 5 µm großen Fläche, die durch eine Belegung mit 30 nm Goldpartikeln gebildet ist, wobei in Fig. 4 eine lichtmikroskopische Durchlichtaufnahme einer einzelnen Bindefläche, die die durch die Nanopartikelbelegung 31 bewirkte Absorption gegenüber dem sie tragenden Substrat 1 veranschaulicht.To clarify the connections achieved FIG. 3 shows an Atomic Force Microscopy image of a nanoparticle 31 sleeps on a 5-. 5 µm large area, which is formed by a coating with 30 nm gold particles, in FIG. 4 a light microscopic transmitted light image of a single binding surface, which illustrates the absorption brought about by the nanoparticle coating 31 with respect to the substrate 1 carrying it.

Der vorgeschlagene Affinitätssensor bietet zusammengefaßt gegenüber der nach dem Stand der Technik üblichen Fluoreszenzfarbstoff­ markierung und -auslesung folgende Vorteile:
In summary, the proposed affinity sensor offers the following advantages over the fluorescent dye marking and reading that is customary in the prior art:

  • 1. Eine einfache Handhabung des Affinitätssensors ist gewährleistet, da keine giftigen, cancerogenen und umweltschädlichen Farbstoffe zur Markierung zum Einsatz gelangen.1. Easy handling of the affinity sensor is guaranteed because no toxic, carcinogenic and environmentally harmful dyes Markings are used.
  • 2. Es ist eine Unabhängigkeit des Signals von der chemischen Umgebung gegeben, weshalb der Affinitätssensor für quantitative Messungen verwendet werden kann.2. It is an independence of the signal from the chemical environment given, which is why the affinity sensor for quantitative measurements can be used.
  • 3. Es erfolgen keine stofflichen Veränderungen (Ausbleichen o. ä.) während der Messung. Deshalb kann sogar bei einer scannenden Auslesung des aktiven Flächenbereichs 22 das ganze Assay beleuchtet bleiben, ohne daß Veränderungen in den Meßsignalen eintreten.3. There are no material changes (fading or similar) during the measurement. Therefore, even when the active area 22 is scanned, the entire assay can remain illuminated without changes in the measurement signals.
  • 4. Kurze Inkubationszeiten sind gewährleistet, da selbst für eine hohe Anzahl einzelner Bindungsflächen der aktive Flächenbereich sehr klein festlegbar ist. 4. Short incubation times are guaranteed, even for a high one Number of individual binding areas, the active area is very small is definable.  
  • 5. Durch den vorgeschlagenen Aufbau des Affinitätssensors ist ein günstiges Signal-Rausch-Verhältniss gegeben, wodurch kurze Meßzeiten realisierbar sind.5. Due to the proposed structure of the affinity sensor is a given a favorable signal-to-noise ratio, resulting in short Measuring times are realizable.
  • 6. Durch die Möglichkeit der Ausbildung einer hohen Anzahl einzelner Bindeflächen auf einer sehr kleinen aktiven Fläche 22 ist die Auslesung mittels einfacher mikroskopischer Apparaturen gegeben. Im Gegensatz zum Stand der Technik sind keine Fluoreszenzoptiken und keine großen Objektive erforderlich.6. The possibility of forming a large number of individual binding areas on a very small active area 22 enables reading by means of simple microscopic apparatus. In contrast to the prior art, no fluorescent optics and no large lenses are required.
  • 7. Die Affinitätssensoren, die mit den Nanopartikelbelegungen versehen sind weisen eine langfristige Lagerstabilität auf, da die Partikelbelegungen von sich aus keinerlei Veränderungen erfahren, wodurch ihre Archivierung ermöglicht wird, was in der Medizin, insbesondere Gerichtsmedizin, der Umwelttechnik, der Prozeßkontrolltechnik und der Forschung neue Möglichkeiten eröffnet.7. The affinity sensors that provide the nanoparticle coatings have a long-term storage stability because the Particle assignments do not experience any changes of their own accord, making it possible to archive what is in medicine, especially forensic medicine, environmental technology, the Process control technology and research opens up new opportunities.
  • 8. Durch die Quantifizierbarkeit und Lagerstabilität der Affinitätssensoren ist die Möglichkeit des Aufbaus von Kalibrier- oder sogar Eichnormalen gegeben.8. Through the quantifiability and storage stability of the affinity sensors is the possibility of building calibration or even Given calibration standards.

Bedingt durch das mit vorliegender Erfindung realisierbare Größenverhältnis des aktiven Flächenbereichs 22 zu den einzelnen Bindeflächen 2 ist eine hohe Parallelität gewährleistet, so daß der vorgeschlagene Affinitätssensor auch für schnelle Assays und für kleine Probenmengen geeignet ist und bis zu etwa 106 Bindeflächen 22 auf einem Flächenbereich von 1 mm2 aufweisen kann, was vor allem für Tests mit Molekül-Bibliotheken-Chips, wie Biochips, DNA-Chips u. a. erheblich von Vorteil ist. Somit kann der vorgeschlagene Affinitätssensor insbesondere für Aufgaben der kombinatorischen Chemie, für diagnostische Aufgaben in der Medizin, zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, zur Entwicklung neuer Arzneiwirkstoffe oder zur Entwicklung selektiv wirkender Pflanzenschutzmittel Verwendung finden.Due to the size ratio of the active area 22 to the individual binding areas 2 that can be achieved with the present invention, a high degree of parallelism is ensured, so that the proposed affinity sensor is also suitable for fast assays and for small sample quantities and up to approximately 10 6 binding areas 22 in an area of 1 mm 2 , which is particularly advantageous for tests with molecular library chips such as biochips, DNA chips, etc. The proposed affinity sensor can thus be used in particular for tasks in combinatorial chemistry, for diagnostic tasks in medicine, for the development of new active substances, for the development of new medicinal substances or for the development of selectively acting pesticides.

Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Ansprüchen und der Zeichnung dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.All in the description, the following claims and the Features shown in the drawing can be used both individually and in any combination with each other be essential to the invention.

Claims (13)

1. Affinitätssensor zum Nachweis biologischer und/oder chemischer Spezies bestehend aus einem, je nach Ausleseart optisch transparenten oder teilreflektierenden Substrat (1), das mit mehreren, voneinander beabstandeten mikrostrukturierten Bindeflächen (2) versehen ist, deren Fläche in Relation zum Durchmesser von Nanopartikeln (3) und oberhalb des lichtoptischen Beugungslimits so groß festgelegt ist, daß die Nanopartikel (3), die mit Kopplungspartnern (4) versehen sind, welche zu den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) eine solche selektive Affinität aufweisen, daß sie eine anhaltende Bindung mit den Bindeflächen (2) oder darauf spezifisch gebundener Sequenzen (DNA) derart eingehen, daß auf einer oder mehreren Bindeflächen (2) eine so große Anzahl von Nanopartikeln (3) unter Ausbildung von Nanopartikelbelegungen (31) anbindbar sind, daß die von der Nanopartikelbelegung (31) eingenommene Fläche bezogen auf die Fläche einer Bindefläche (2) mindestens 0,1% betragen kann, wobei alle Bindeflächen (2) zusammen in einem solchen aktiven Flächenbereich (22) angeordnet sind, daß sie gemeinsam von
  • - einem Objektiv eines üblichen lichtoptischen Mikroskops mit einer numerischen Apertur zwischen 0,1 bis 0,9, zwecks Bestimmung der durch die Nanopartikelbelegungen (31) erzeugten optischen Absorption, Reflexion oder Streuung oder
  • - durch eine Vorrichtung zur Bestimmung der Plasmonenresonanz erfaßbar sind.
1. Affinity sensor for the detection of biological and / or chemical species consisting of a substrate ( 1 ) that is optically transparent or partially reflective, depending on the type of reading, which is provided with a plurality of spaced apart microstructured binding surfaces ( 2 ), the surface of which in relation to the diameter of nanoparticles ( 3 ) and above the light-optical diffraction limit is so large that the nanoparticles ( 3 ), which are provided with coupling partners ( 4 ), which have such a selective affinity for the binding surfaces ( 2 ) or sequences (DNA) specifically bound thereon that they enter into a permanent bond with the binding surfaces ( 2 ) or sequences specifically bound thereon (DNA) in such a way that on one or more binding surfaces ( 2 ) such a large number of nanoparticles ( 3 ) can be bound to form nanoparticle coatings ( 31 ) that the area occupied by the nanoparticle coating ( 31 ) in relation to the area ei ner binding surface ( 2 ) can be at least 0.1%, wherein all binding surfaces ( 2 ) are arranged together in such an active surface area ( 22 ) that they together by
  • - A lens of a conventional light-optical microscope with a numerical aperture between 0.1 to 0.9, for the purpose of determining the optical absorption, reflection or scattering generated by the nanoparticle coatings ( 31 ) or
  • - Can be detected by a device for determining the plasmon resonance.
2. Affinitätssensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zum Einsatz gelangenden Nanopartikel (3) in der Größenordnung von 2 bis 600 nm festgelegt ist.2. Affinity sensor according to claim 1, characterized in that the diameter of the nanoparticles used ( 3 ) is of the order of 2 to 600 nm. 3. Affinitätssensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zum Einsatz gelangenden Nanopartikel (3) vorzugsweise in der Größenordnung von 15 bis 60 nm festgelegt ist. 3. Affinity sensor according to claim 2, characterized in that the diameter of the nanoparticles used ( 3 ) is preferably set in the order of 15 to 60 nm. 4. Affinitätssensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zum Einsatz gelangenden Nanopartikel (3) vorzugsweise in der Größenordnung von 2 bis 15 nm festgelegt ist.4. Affinity sensor according to claim 2, characterized in that the diameter of the nanoparticles used ( 3 ) is preferably set in the order of 2 to 15 nm. 5. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) Metalle, insbesondere Gold, eingesetzt sind.5. Affinity sensor according to claim 2, 3 or 4, characterized in that metals, in particular gold, are used for the nanoparticles ( 3 ). 6. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) metallhaltige Kompositpartikel eingesetzt sind.6. Affinity sensor according to claim 2, 3 or 4, characterized in that metal-containing composite particles are used for the nanoparticles ( 3 ). 7. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) solche aus einem Halbleitermaterial, insbesondere CdSe, InP, eingesetzt sind.7. Affinity sensor according to claim 2, 3 or 4, characterized in that those made of a semiconductor material, in particular CdSe, InP, are used for the nanoparticles ( 3 ). 8. Affinitätssensor nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Nanopartikel (3) solche aus einem Kunststoff, die bevorzugt Einschlüsse aus einem absorbierenden Farbstoff, Metall oder Halbleitern beinhalten, eingesetzt sind.8. Affinity sensor according to claim 2, 3 or 4, characterized in that for the nanoparticles ( 3 ) those made of a plastic, which preferably contain inclusions made of an absorbing dye, metal or semiconductors, are used. 9. Affinitätssensor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Nanopartikel (3) mehrerer unterschiedlicher Größenklassen oder unterschiedlicher Zusammensetzung eingesetzt sind, die in verschiedenen Spektralbereichen auslesbar sind.9. Affinity sensor according to claim 4, characterized in that nanoparticles ( 3 ) of several different size classes or different compositions are used, which can be read in different spectral ranges. 10. Affinitätssensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Bindeflächen (2) in der Größenordnung von 0,4 µm2 bis 1 mm2 festgelegt sind.10. Affinity sensor according to claim 1, characterized in that the individual binding surfaces ( 2 ) are set in the order of 0.4 µm 2 to 1 mm 2 . 11. Affinitätssensor nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen Bindeflächen (2) in der Größenordnung von 1 µm2 festgelegt sind. 11. Affinity sensor according to claim 10, characterized in that the individual binding surfaces ( 2 ) are fixed in the order of 1 µm 2 . 12. Affinitätssensor nach Anspruch 1 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu 106 einzelne Bindeflächen in der Größenordnung von 1 µm2 auf einem Flächenbereich (22) des transparenten Substrats in der Größenordnung von 1 mm2 vorgesehen sind.12. Affinity sensor according to claim 1 and 11, characterized in that up to 10 6 individual bonding areas in the order of 1 µm 2 are provided on a surface area ( 22 ) of the transparent substrate in the order of 1 mm 2 . 13. Verwendung eines Affinitätssensors nach den vorstehenden Ansprüchen für Aufgaben der kombinatorischen Chemie, für diagnostische Aufgaben in der Medizin, zur Entwicklung neuer Wirkstoffe, zur Entwicklung neuer Arzneiwirkstoffe oder zur Entwicklung selektiv wirkender Pflanzenschutzmittel.13. Use of an affinity sensor according to the above Requirements for tasks in combinatorial chemistry, for diagnostic tasks in medicine, to develop new ones Active ingredients, for the development of new active pharmaceutical ingredients or for Development of selective pesticides.
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