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Die
Erfindung betrifft ein einstufiges, enzymatisches Verfahren zur
regioselektiven Hydroxylierung von 2-Phenoxypropionsäure
zu 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure in einem einstufigen
Verfahren.
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2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure
ist ein häufig eingesetztes Zwischenprodukt bei der Herstellung
enantiomerenreiner Herbizide. Chemische Verfahren zur Herstellung
von racemischen, sowie von enantiomerenreinen Formen von 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure
sind bekannt. Der Nachteil dieser, auf der Umsetzung von Hydrochinon
basierenden Verfahren besteht in der aufwendigen Abtrennung unerwünschter
Nebenprodukte. Eine wirtschaftliche Produktion dieser Verbindungen
ist deshalb nicht möglich (
Cooper, B; Ladner, W;
Hauer, B; Siegel, H 1992: Process for fermentative production of
2-(4-Hydroxyphenoxy)propionic acid; European Patent
EP 0465494 ). Mikroorganismen
sind in der Lage, verschiedene aromatische Verbindungen zu hydroxylieren.
Dabei entstehen überwiegend bishydroxylierte Verbindungen
oder Gemische verschiedener Regioisomere (
Byrde, R, J, W;
Woodcook, D 1957: Fungal detoxication. 2. The metabolism of some
phenoxy-n-alkylcarboxylic acids by Aspergillus niger, Biochem. J.,
65, 682). Die regioselektive mikrobielle in-vivo Monohydroxylierung
von 2-Phenoxypropionsäure zu 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure durch
den insektenpathogenen Schimmelpilz Beauveria bassiana ist in einer
Arbeit beschrieben worden (
Dingler, C; Ladner, W; Krei,
G, A; Cooper, B und Hauer, B 1996: Preparation of (R)-2-(4-Hydroxyphenoxy)propionic
acid by Biotransformation; Pestic. Sci., 46, 33–35).
Auf dieser Grundlage werden in Deutschland derzeit etwa 1.000 Tonnen
(R)-2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure pro Jahr durch die
Firma BASF mittels Ganzzell-Biotransformation hergestellt (
Positionspapier
der Dechema e. V. 2004: Weiße Biotechnologie: Chancen für
Deutschland). Das dafür benötigte Substrat
(R)-2-Phenoxypropionsäure wird aus den umweltrelevanten
Chemikalien (S)-2-Chlorpropionsäureisobutylester und Phenol
synthetisiert (
Liese, A; Seelbach, K; Wandrey, C 2006: Industrial Biotransformation;
Wiley-VCH-Verlag, Weinheim).
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Intrazelluläre
Monooxygenasen vom P450- und Rieske-Typ sind in der Lage, Sauerstoff
in Substratmoleküle einzuführen (Bernhardt,
R 2004: Cytochrome P450: Versatile Enzymsysteme mit Anwendung in
der Biotechnologie und Medizin, Magazin Forschung 1; Ullrich,
R & Hofrichter
M 2007: Enzymatic hydroxylation of aromatic compounds. Cellular and
Molecular Life Sciences 64: 271–293). Der derzeitige
Einsatz von Monooxygenasen in industriellen Prozessen bleibt jedoch
wiederum auf Ganzzell-Biotransformationen beschränkt (Urlacher,
V, B; Lutz-Wahl, S; Schmid., R, D 2004: Microbial P450 enzymes in
biotechnology, Applied Microbiology and Biotechnnology, 64, 3, 317–325),
da eine Langzeitstabilität der Enzyme nicht gegeben ist
und teure Cofaktoren (NADH) eingesetzt werden müssen (Eiben,
S; Kaysser, L; Maurer, S; Kühnel, K; Urlacher, V, B; Schmid,
R, D; 2006: Preparative use of isolated CYP102 monoxygenases-A critical
appraisal, Journal of Biotechnology, 124, 662–669).
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Die
enantioselektive und regioselektive Monohydroxylierung von 2-Phenoxypropionsäure
zu 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure durch isolierte Biokatalysatoren
(in vitro) ist bisher nicht beschrieben worden. Es wurde jedoch
kürzlich gefunden, dass ein stabiles extrazelluläres
Pilzenzym, die Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaP), 2-Phenoxypropionsäure
hoch regioselektiv zu 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure
und bevorzugt zu dessen (R)-Enatiomer umzusetzen vermag.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung
von 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man 2-Phenoxypropionsäure oder deren Salze in
Gegenwart äquimolarer Konzentrationen an H2O2 und dem isolierten extrazellulären
Peroxygenase-Biokatalysator hydroxyliert. Die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist es, einen Prozess zur Hydroxylierung von 2-Phenoxypropionsäure
zu 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure mit möglichst
geringem verfahrenstechnischen und apparativen Aufwand und bei gleichzeitigem
Einsatz kostengünstiger Cosubstrate durchzuführen.
Die Umsetzung der Ausgangsverbindungen soll in kurzen Inkubationszeiten,
bei Raumtemperatur und -druck, im wässrigen Milieu sowie
ohne erhöhte Anforderungen an sterile bzw. semisterile
Reaktionsbedingungen in einem einstufigen Verfahren erfolgen. Die
Reaktionsprodukte sind dabei mit möglichst geringem Aufwand
zu isolieren, und eine aufwändige Abtrennung weiterer Reaktionsprodukte
soll entfallen.
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Das
vorliegende Verfahren löst diese Aufgabe und betrifft ein
Methode zur enzymatischen, Hydroxylierung von 2-Phenoxypropionsäure
(Formel I) zu 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure (Formel
II) durch Umsetzung von 2-Phenoxypropionsäure (Formel I)
mit einer pilzlichen Peroxygenase in Gegenwart mindestens einen
Oxidationsmittels in einem Einstufen-Reaktionsverfahren.
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Die
Ausgangsverbindungen der Formel (I) werden dabei vorzugsweise mit
der Peroxygenase des Lamellenpilzes Agrocybe aegerita (Agrocybe-aegerita-Peroxygenase
= AaP; Synonyme: Agrocybe-aegerita-Peroxidase, Haloperoxidase-Peroxygenase),
die eine besonders hohe Peroxygenase-Aktivität besitzt,
und zumindest einem Oxidationsmittel zur Reaktion gebracht, wobei
die Hydroxylierung von 2-Phenoxypropionsäure erfolgt.
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Als
Oxidationsmittel werden erfindungsgemäß vorzugsweise
H2O2, organische
Peroxide oder Hydroperoxide, wie z. B. tert-Butylhydroperoxid, Luft oder
Sauerstoff (O2) verwendet. Auf teure Elektronendonatoren,
wie z. B. NADH oder NADPH kann bei dem vorliegenden Verfahren verzichtet
werden (Konzentration des Oxidationsmittels: 0,01 bis 20 mmol/L, bevorzugt
0,1 bis 2 mmol/L H2O2).
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Dem
Reaktionsgemisch können zur weiteren Beschleunigung der
Umsetzung der Verbindung der Formel (I) mit dem Enzym AaP zusätzlich
H2O2-generierende
Enzyme, insbesondere Oxidasen, wie z. B. Glucose-Oxidase oder Arylalkohol-Oxidase
sowie deren Substrate (Glucose bzw. Arylalkohole) zugesetzt werden.
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Zur
Erhöhung der Regioselektivität der Hydroxylierung
kann erfindungsgemäß Ascorbinsäure oder
ein anderer Radikalfänger (0,1–20 mM) dem Reaktionsansatz
zugesetzt werden.
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Die
Grundlage des erfindungsgemäßen enzymatischen,
zellfreien Verfahrens ist eine spezielle extrazelluläre
Peroxygenase, die über P450-ähnliche Katalyseeigenschaften
verfügt und in Gegenwart eines geeigneten Oxidationsmittels
(z. B. Peroxiden), insbesondere in gepufferten wässrigen
Lösungen, 2-Phenoxypropionsäure zur 2-(4-Hydroxyphenoxypropionsäure)
hydroxyliert und dabei mit Zusatz eines Radikalfängers
(radical scavenger; z. B. Ascorbionsäure) eine hohe Sterio-(ee > 60%) und Regioselektivität
(> 98%) erreicht.
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Bei
dem eingesetzten Enzym handelt es sich um ein Häm-Thiolat-Protein
mit Peroxidase- und Peroxygenase-Funktionen. Es wird von Basidiomyceten der
Familien Bolbitiaceae (z. B. Agrocybe spp.) Agaricaceae, (z. B.
Coprinus coprinellus oder Coprinus coprinopsis) sowie Psatyrellaceae
gebildet und zeichnet sich durch besondere katalytische Eigenschaften
aus, die es von bisher beschriebenen Peroxidasen und Monooxygenasen
deutlich unterscheidet. Die Enzymherstellung erfolgt vorzugsweise
in Flüssigkultur, in Bioreaktoren und stickstoffreichen Medien
(Ullrich, R 2005: Dissertation, IHI Zittau; Kluge,
M 2006: Diplomarbeit, IHI Zittau).
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Die
von dem als AaP bezeichneten Enzym katalysierten Reaktionen benötigen
im Unterschied zu chemischen Synthesen keine hochkonzentrierten aggressiven
und umweltgefährdenden Reagenzien (< 1% H2O2) und bei der Produktgewinnung kann auf chemikalien-
und zeitintensive Reinigungsschritte zur Trennung der Isomerengemische
verzichtet werden. Üblicherweise wird das Enzym in einer
Konzentration von 0,01 U/mL bis 20 U/mL AaP, insbesondere von 0,09
bis 5 U/mL AaP, eingesetzt (1 Unit setzt 1 μmol Substrat
pro Minute um). Dies macht das dargestellte Reaktionsverfahren besonders
umweltfreundlich.
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Ein
weiterer Vorteil gegenüber rein chemischen Synthesen besteht
in der Prozessführung auf Grund der erfindungsgemäßen
AaP-katalysierten Umsetzung bei Raumtemperatur und normalem Luftdruck.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren
in wässrigen, gepufferten Lösungen durchgeführt.
Dem Reaktionsgemisch können hierbei zur Stabilisierung
der Reaktion im wässrigen Medium Puffer auf Basis organischer
Säuren, vorzugsweise Zitronensäure, sowie Phosphate,
vorzugsweise Kaliumhydrogenphosphate, zugesetzt werden (Pufferkonzentration:
5 mmol/L bis 500 mmol/L, vorzugsweise 20 bis 100 mmol/L). Weiterhin
ist es möglich, die Reaktion im pH-Staten ohne Puffer unter kontinuierlicher
Zudosierung von Säuren oder Basen durchzuführen.
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Zur
Verbesserung der Löslichkeit können dem Reaktionsgemisch
organische Lösungsmittel zugesetzt und in einem 2-Phasensystem
gearbeitet werden. Erfindungsgemäß einsetzbare
Lösungsmittel sind protische Lösungsmittel, wie
Methanol oder Ethanol oder aprotische polare Lösungsmittel
wie Ether (z. B. Diisopropylether), Aceton, Acetonitril, DMSO (Dimethylsulfoxid)
sowie DMF (N,N-Dimethylformamid).
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Die
Reaktion wird in einem Bereich von 5°C bis 40°C,
vorzugsweise bei 20–30°C und bei pH-Werten von
3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8, durchgeführt. Die Reaktionszeiten
liegen üblicherweise im Bereich von 0,5 bis 120 Minuten,
insbesondere im Bereich von 5 bis 30 Minuten. Die erzielten Ausbeuten
an 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäuren variieren zwischen
10% und 99%, vorzugsweise zwischen 20% und 90%.
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Die
Vorteile der AaP-katalysierten Hydroxylierung von 2-Phenoxypropionsäure
gegenüber der Biotransformation und anderen Enzymen die
zur selektiven Hydroxylierung befähigt sind, liegen:
- a) in einer höheren spezifischen Aktivität,
katalytischen Effizienz und Selektivität,
- b) im Einsatz preiswerter Peroxide als Cosubstrate anstelle
teurer Elektronendonatoren (NADH, NADPH),
- c) in der Unabhängigkeit des hydroxylierenden Enzyms
von Flavin-Reduktasen, Ferredoxin und regulatorischen Proteinen,
- d) in der einfachen Enzymgewinnung ohne Zellaufschluss (extrazelluläres
Protein) und
- e) in der hohen Stabilität der extrazellulären
AaP und ähnlicher Peroxygenasen im Vergleich zu intrazellulären,
löslichen oder membrangebundenen Oxygenasen.
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Mit
den AaP-katalysierten Reaktionen ist es erstmals möglich,
2-Phenoxypropionsäure mit Hilfe eines einzelnen extrazellulären
Biokatalysators, der lediglich Peroxide als Cosubstrat benötigt,
in einem einstufigen Prozess zur entsprechenden 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure
umzusetzen. Das Verfahren kann in verschiedensten Bereichen der
Synthesechemie eingesetzt werden. Die Erfindung soll nachstehend
anhand von dem in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiel
näher erläutert werden, wobei die Erfindung allerdings
nicht auf die genannten Beispiele beschränkt ist.
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Beispiele
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Es
zeigen:
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1:
Formelschema der Peroxygenase katalysierten Umsetzung von 2-Phenoxypropionsäure
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2:
HPLC-Elutionsprofil (aufgenommen bei einer Wellenlänge
von 220 nm) der Umsetzung von 2-Phenoxypropionsäure durch
die Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaP)
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3:
HPLC-Elutionsprofil (bei 270 nm) der enantioselektiven Umsetzung
von 2-Phenoxypropionsäure durch die AaP (chirale Trennung);
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Ausführungsbeispiele:
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500 μM
2-Phenoxypropionsäure wurden in wässriger Kaliumphosphat-Pufferlösung
(50 mM, pH = 7.0) gelöst und zusammen mit 4 mM Ascorbinsäure,
1 mM H2O2 und 1
U Agrocybe-aegerita-Peroxidase (Units bezogen auf die Oxidation
von Veratrylalkohol zu Veratrylaldehyd; Ullrich et al. 2004:
Novel haloperoxidase from the agaric basidiomycete Agrocybe aegerita
oxidizes aryl alcohols and aldehydes, Appl. Environ. Microbiol.,
70, 4575–81) in einem Gesamtvolumen von 1 ml bei
23°C in einem verschlossenen Glasgefäß gerührt.
Die Reaktionszeit betrug insgesamt 30 Sekunden. Als einziges Produkt
dieser Reaktion wurde 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionsäure
anhand eines authentischen Standards (Sigma) über die Retentionszeit
sowie UV-Spektrum detektiert. Die chromatographische Trennung und
Produkt-Identifizierung erfolgte unter Verwendung einer speziellen HPLC-Säule
(Phenomex synergi 4 μm Fusion-RP 80A, 150 × 2
mm,) und eines HPLC-DAD Systems der Firma AGILENT. Die chirale Trennung
erfolgte mit Hilfe einer Säulenkombination (Agilent Zorbax SB-C18
Rapid Resolution Cartridge 30 × 2.1 mm 3,5 μm;
ORpak CDBS-453 150 × 4,6 mm).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - Cooper, B;
Ladner, W; Hauer, B; Siegel, H 1992: Process for fermentative production
of 2-(4-Hydroxyphenoxy)propionic acid [0002]
- - Byrde, R, J, W; Woodcook, D 1957: Fungal detoxication. 2.
The metabolism of some phenoxy-n-alkylcarboxylic acids by Aspergillus
niger, Biochem. J., 65, 682 [0002]
- - Dingler, C; Ladner, W; Krei, G, A; Cooper, B und Hauer, B
1996: Preparation of (R)-2-(4-Hydroxyphenoxy)propionic acid by Biotransformation;
Pestic. Sci., 46, 33–35 [0002]
- - Positionspapier der Dechema e. V. 2004: Weiße Biotechnologie:
Chancen für Deutschland [0002]
- - Liese, A; Seelbach, K; Wandrey, C 2006: Industrial Biotransformation;
Wiley-VCH-Verlag, Weinheim [0002]
- - Bernhardt, R 2004: Cytochrome P450: Versatile Enzymsysteme
mit Anwendung in der Biotechnologie und Medizin, Magazin Forschung
1 [0003]
- - Ullrich, R & Hofrichter
M 2007: Enzymatic hydroxylation of aromatic compounds. Cellular
and Molecular Life Sciences 64: 271–293 [0003]
- - Urlacher, V, B; Lutz-Wahl, S; Schmid., R, D 2004: Microbial
P450 enzymes in biotechnology, Applied Microbiology and Biotechnnology,
64, 3, 317–325 [0003]
- - Eiben, S; Kaysser, L; Maurer, S; Kühnel, K; Urlacher,
V, B; Schmid, R, D; 2006: Preparative use of isolated CYP102 monoxygenases-A
critical appraisal, Journal of Biotechnology, 124, 662–669 [0003]
- - Ullrich, R 2005: Dissertation, IHI Zittau [0012]
- - Kluge, M 2006: Diplomarbeit, IHI Zittau [0012]
- - Ullrich et al. 2004: Novel haloperoxidase from the agaric
basidiomycete Agrocybe aegerita oxidizes aryl alcohols and aldehydes,
Appl. Environ. Microbiol., 70, 4575–81 [0023]