EP1042944B1 - Verfahren und vorrichtung zur vermessung, kalibrierung und verwendung von laser-pinzetten - Google Patents

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EP1042944B1
EP1042944B1 EP98966384A EP98966384A EP1042944B1 EP 1042944 B1 EP1042944 B1 EP 1042944B1 EP 98966384 A EP98966384 A EP 98966384A EP 98966384 A EP98966384 A EP 98966384A EP 1042944 B1 EP1042944 B1 EP 1042944B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
particle
focus
field
particles
forces
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
EP98966384A
Other languages
English (en)
French (fr)
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EP1042944A1 (de
Inventor
Günter FUHR
Thomas Schnelle
Torsten Müller
Hermine Hitzler
Karl-Otto Greulich
Shamci Monajembashi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evotec OAI AG
Original Assignee
Evotec OAI AG
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Publication date
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Publication of EP1042944A1 publication Critical patent/EP1042944A1/de
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Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H05—ELECTRIC TECHNIQUES NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • H05H—PLASMA TECHNIQUE; PRODUCTION OF ACCELERATED ELECTRICALLY-CHARGED PARTICLES OR OF NEUTRONS; PRODUCTION OR ACCELERATION OF NEUTRAL MOLECULAR OR ATOMIC BEAMS
    • H05H3/00—Production or acceleration of neutral particle beams, e.g. molecular or atomic beams
    • H05H3/04—Acceleration by electromagnetic wave pressure
    • G—PHYSICS
    • G21—NUCLEAR PHYSICS; NUCLEAR ENGINEERING
    • G21K—TECHNIQUES FOR HANDLING PARTICLES OR IONISING RADIATION NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; IRRADIATION DEVICES; GAMMA RAY OR X-RAY MICROSCOPES
    • G21K1/00—Arrangements for handling particles or ionising radiation, e.g. focusing or moderating
    • G21K1/006—Manipulation of neutral particles by using radiation pressure, e.g. optical levitation

Definitions

  • the invention relates to methods and devices for measurement and calibration of optical field traps and determination of optically induced forces in all three spatial directions, applied to micrometer-sized particles and for use optical field traps.
  • Optical field traps also "optical tweezers”, “laser tweezers” or “optical traps” have been around for about two Decades in the fields of biotechnology, medicine and Molecular biology and other technical fields for Positioning and manipulation of micrometer and submicron size Particles used [G. Weber et al. in “Int. Rev. Cytol. "Vol. 131, 1992, p. 1; S.M. Block in” Noninvasive Techniques in Cell Biology “, Wiley-Liss., New York 1990, P. 375]. The development of laser tweezers is particularly successful A. Ashkin back [A. Ashkin in "Phys. Rev. Lett.”, Vol. 24, 1970, p. 156].
  • the principle of particle capture through optical induced forces is based on the fact that in addition to the light pressure, the always pushes a particle away from the light source, gradient forces occur that lead a particle into a Focus arrives or is held steadily in it or with it is moved.
  • the prerequisite is that the absorption and Reflection of the particle is low, while the difference in Refractive index to the surrounding solution should be as large as possible.
  • Electromagnetic field cages go to W. Paul [W. Paul et al. in "Research reports from the Ministry of Economic Affairs of North Rhine-Westphalia", Nos. 415 and 450; W. Paul in “Phys. smooth", 46, 1990, p. 227]. They are used primarily in elementary particle physics for trapping and measuring atomic particles used at low gas pressure. 1993 were the first liquid-filled, three-dimensional microfield cages under Use of dielectrophoretic forces presented [T. speed et al. in "Biochim. Biophys. Acta", Vol. 1157, 1993, p. 127].
  • Variant II [CP Dennis in "Faraday Discuss. Chem. Soc.”, Vol. 90, 1990, p. 209]: The mean deflection of a particle in the laser focus is measured on the basis of Brownian collisions. In principle, measurement in all spatial directions is possible here, but it requires a very precise measurement of the particle movement with submicron accuracy and cannot be used for most Mie particles, since these are too large for a noticeable deflection. In addition, the measurements become more difficult and inaccurate with increasing laser power and that only in the very narrow focal area of the laser can work.
  • Variant III [CP Dennies et al. in "Applied Optics", 1993, p. 1629]: A tearing off of a particle is examined by means of laser tweezers, which is attached to a base in a defined manner. The scattering of an evanescent surface wave with total reflection is used to determine the movement of the object in the z direction (perpendicular to the surface) with an accuracy in the nm range. This method, too, cannot be applied in all spatial directions and, above all, cannot be used quickly, but rather requires a lot of calibration and equipment. In addition, the optical radiation field near the surface does not correspond to the conditions in free solution.
  • a method for setting predetermined adhesion phenomena between individual suspended microscopic particles or to determine the binding forces that occur is not yet available.
  • the invention has for its object improved methods for handling particles with laser tweezers, with which in particular the determination of optically induced Forces or binding forces and the exercise of predetermined ones Forces is made possible.
  • a method according to the invention is intended especially the determination of forces with an increased measuring speed and better reproducibility and accuracy guarantee. Determining forces on microscopic particles are said to work via an electrical Signal in a quickly repeatable and automatable form, the forces with an accuracy in the pN range and below it in any spatial direction should.
  • the object of the invention is also devices to specify the implementation of the procedures.
  • At least one microscopic particle in the focus of an optical cage in a microelectrode assembly and with respect to to position an electrical capture area (or capture point), by electrical field gradients in the microelectrode arrangement is formed.
  • the focus of the optical cage with the particle is initially separated from the capture area, i.e. at a distance from the electrical field minimum of the capture area, which represents an electrical field cage.
  • the field forces in the optical cage and / or in the electrical capture area and / or the distance between the optical cage and the electrical capture range varies until a transition movement of the particle from the focus to the capture area or vice versa.
  • the electric, the catch area has forming field gradients on the particle or particles acting forces, whose fields each have a minimum have.
  • the minimum corresponds to the electric field forces the catch area.
  • the minimum of optical induced forces is the focus of the optical cage. Is between two minima a field barrier exists, which depends on the amplitudes of the effective electric fields, the light output of the optical cage and the distance between the minima.
  • the particle or particles within the Microelectrode arrangement positioned in a predetermined manner or (in the case of several particles).
  • a particle in the focus of an optical cage to determine acting, optically induced forces.
  • only one particle is in focus or temporarily present in the capture area of the microelectrode arrangement.
  • the field properties i.e. the amplitude of the electrical Field, the light output and / or the distance of the minima, is varied until the transition movement of the particle between the minima, i.e. between the focus and the capture area or vice versa.
  • the transition movement is very accurate and can be determined reproducibly. From the to trigger the transition movement required amplitude of the electric fields in the microelectrode arrangement, the optically induced Determine forces in the optical cage.
  • the binding forces between several particles e.g. two particles.
  • this embodiment is a particle in the focus of the optical cage and a Particles arranged in the electrical capture area.
  • the field properties in the microelectrode arrangement vary to determine those field characteristics at which the transition movement of the particle from focus to particle in the catch area or vice versa. This principle is accordingly also with particle groups in the focus or in the capture area realizable.
  • a third important aspect of the invention provided microscopic particles in a microelectrode arrangement with the mentioned, simultaneously available at least two field minima relative to the setting of predetermined field forces to each other at least temporarily in groups or aggregates to position or merge or such groups or disassemble units into parts.
  • This invention Aggregate manipulation is again preferred with the Combined above aspects of the invention can but also regardless of the setting of predetermined (if also unknown) electrical and / or optical field forces be implemented.
  • the invention also relates to a microsystem which is used for Training of an opto-electric double cage set up is by the simultaneous generation of at least two Field minima of an electrical capture area and an optical one Cage is generated.
  • a microsystem which is used for Training of an opto-electric double cage set up is by the simultaneous generation of at least two Field minima of an electrical capture area and an optical one Cage is generated.
  • it has a fluidic microsystem a microelectrode arrangement for generating the electrical capture area and one for the training of the optical Transparent cage within the microelectrode assembly Structure.
  • the microsystem is preferably a fluid one Microsystem that is one-sided towards a light source Generation of the optical cage can be open.
  • “Laser trapping” can be a particle in a local Balance is maintained by an optical trap or an optical cage in the focus of at least one laser beam is formed.
  • a high-frequency microfield cage can a particle be kept in a local equilibrium, that by an electric catch area of the respective realized field distribution is formed.
  • the catch area can, depending on the field distribution, by a point, a line or a room area can be formed.
  • the invention can implemented accordingly with arbitrarily formed catch areas become.
  • the invention is based on the above first point of view in particular, the optically induced Forces in the optical trap (optical cage) the electrical forces on the particle at the transition between the equilibrium states, d. H.
  • the task becomes special solved in that the "laser trapping" in one electrical high-frequency microfield cage, its field forces and electrical field distribution are known and for Coupling the necessary to form the optical cage Laser light is set up.
  • the im Lasertrap (focus) caught particles from the capture point of the Field cage with low electrical catch power in a defined Position at a distance from the snap point can be determined by the following Increase in the amplitude of the electrical control signals the threshold of the field cage can be determined exactly where the electric field forces the particle from the optical Move focus back to the snap point, or vice versa.
  • the coupling of what is required to form the optical cage Laser light is made through various structural measures achieved on the micro field cage. These include in particular the Attaching at least a subset of the electrodes of the microfield cage on a substrate that is transparent and so thin is that a laser light source is sufficiently close to the microfield cage can be performed so that the focus is formed in this becomes.
  • laser tweezers includes the laser light source u. a. a coupling lens numerical aperture as high as possible. This is the Focal length usually in the range of a few hundred micrometers.
  • the transparent substrate thus preferably has one Thickness less than the focal length of the laser light source.
  • the invention allows the qualitative and / or quantitative parameters of the optically induced forces on a particle.
  • the quantitative determination the optically induced forces can come from a few sizes, the z. B. the locations of focus and capture point that Field distribution between the electrodes, the electrical Properties of the particle and its environmental solutions as also the shape, phase position, frequency and amplitude of all electrode signals include. All of these sizes can be independent from the actual measurement or in advance to a purely electrical one Ways or via a unique numerical simulation of the Determine the field distribution in the high-frequency cage.
  • the optically induced Forces that act on the particle can be released the amplitude of the electrical control signals of the electrical Field cage at the transition between equilibria Determine (transitional movement).
  • An advantage of the invention is that the force gradient of the optically induced forces is relatively steep, so that Transition between equilibrium thresholds or by leaps and bounds, making it particularly easy and precise can be registered.
  • this procedure can be automated and for calibration of the laser beam can be used. Let the measurements can be repeated as often as required in a few seconds execute and can also on one and the same particle performed in the environment that will be used later become.
  • absolute values of the optically induced forces can deviations in symmetry of the optical radiation and their Intensity profiles near and in the focal area, i.e. also relative Values to be determined.
  • the invention is with any particles such as synthetic Particles or biological cells or their components implementable.
  • the particle size is in the entire size range of particles that can be manipulated with laser tweezers, preferably with a size smaller than 200 microns.
  • FIG. 1 shows a section of a microsystem according to the invention schematically shown enlarged.
  • the representation shows only a microelectrode arrangement consisting of the microelectrodes 11 to 18 (without control lines) and a between the microelectrodes in a suspension liquid suspended microscopic particle 113.
  • the microelectrodes are in planar form on opposite walls of the Microsystem structure arranged, for example the x-y plane spans a substrate plane.
  • the microelectrodes 11 to 18 are set up with such electrical potentials to be charged that field gradients with a field minimum be formed.
  • the technology of electrode control for Generation of a predetermined minimum is known per se and is therefore not described in detail here.
  • the location of the Field minimum is of the phases and amplitudes of the control potentials dependent on the microelectrodes 11 to 18 and can in be set in a predetermined manner.
  • the catch area or the electric field cage is also called a high-frequency cage, since the microelectrodes preferably with high frequency Control potentials (frequency range see below) for manipulation of microscopic particles based on negative Dielectrophoresis can be applied.
  • optically induced field forces according to the invention on particle 113 takes place in such a way that particle 113 caught in the focus of the laser beam and by a focus shift in the designated position (e.g. at location 114) by the coordinates (x1, y1, z1)) becomes.
  • the focus is shifted by a mechanical change the relative positions of the microsystem and the source of the laser beam 19 by adjusting devices known per se and / or deflection devices of the laser beam.
  • Over a Increasing the amplitude of the high-frequency signals applied to the electrodes become the electrical polarizing forces of the field cage until the particle 113 from the Laser focus is pulled out and into the capture point 110b moved (transition movement between local equilibria in the field minima).
  • the transition between the local equilibria can alternatively can also be done by increasing the laser power and the particle from the catch area of the field cage in the focus is moved and / or by the locations of the snap points or shift the focus and determine the path or distance of the field minima at which the transition movement takes place takes place.
  • the electrical polarizing forces on the particle and the field distribution between the electrodes 11 to 18 are known, there is a direct proportionality between the measurable laser power in the focal area, the Amplitude of the electrical signals and those on the particle acting optically induced forces.
  • the Procedure and displacement of particle 113 in any spatial direction can the ones acting on the concrete particle Determine optically induced forces quantitatively. It deals consequently an electrical calibration of the optically induced opposing forces with little effort is to be provided and allows forces in the range of fN up to a few hundred pN.
  • the optically induced forces are thus in at least one Case from the field or location properties of the particle 113 determined during a transition movement, the electrical Polarizing forces on the particle 113 from the itself computable field distribution between the microelectrodes 11 to 18 and the given when executing the transitional movement
  • Locations of focus 110a and capture point 110b are determined. These locations can be measured with an observation microscope. In all other cases can be based on the above Proportionality a relative determination of the optical induced forces occur.
  • Figure 2 shows an expanded representation of a system to measure the optically induced forces on an im Focus on captured particles.
  • the microfield cage will formed by microelectrodes that face each other Surfaces of the substrates 27, 29 are attached.
  • the substrates 27, 29 are separated by a spacer 28 which forms a suspension room in which to be examined Particle is exposed to the field of the microfield cage.
  • This in Figure 2 upper substrate is thin enough so that the focus of the optical cage is adjustable in the suspension room.
  • Cells or other microparticles suspended in a solution are flushed into the channel 22 via an opening 21 and then enter the field cage 23, the output electrodes 24a-d of which have a high-frequency field (kHz or MHz range, any signal shape (e.g. rectangle -, sine, triangle or other signal forms), amplitude a few mV up to some 10 V)) can be applied.
  • This initially one-sided application of electrical potentials to the microelectrodes only forms an electrical field barrier for flushed-in microparticles in the channel 22. If there is a particle in the cage 23, the input electrodes 25a-d are also switched on and / or the flow is stopped.
  • phase shifts of the electrode signals typical of electrical trapping for two possible alternating field and two rotation field control types (2 * AC field or 2 * red field) are summarized in Table 1.
  • Phase controls of the electrode signals of an octopole Field type El. 25b El. 24b El. 24d El. 25d El. 25a El. 24a El. 24c El.
  • the red field is a torque exerted on the particle to form a rotation (last line of Tab. 1) leads to the determination of the force can be used.
  • the values of the penultimate Row of table 1 is torque compensation.
  • the electrodes are in planar form on two glass substrates 27, 29 with semiconductor technology Methods have been processed overhead using a spacer 28 are mounted liquid-tight so that they are in the sewer liquid 22 immerse. For high laser focusing it is necessary to use one of the glass substrates (here (27)) if possible run thin.
  • the substrate is 27 150 to 200 microns thick, and the substrate 29 consists of 0.5 to 1 mm thick glass or plastic.
  • a particular advantage of the invention is that the method quick and easy especially in the one to be used later Surrounding medium with those to be examined or manipulated Particles applied under comparable conditions can be. Furthermore, this method is not specific Particle and surface shapes limited, but with any Particle geometries can be realized. Even it can Forces on connected groups of particles (e.g. aggregates or the like.) Can be determined in any shape.
  • FIG. 6 shows a microelectrode arrangement in octopole form with the microelectrodes 61 to 68 analogous to FIG. 1.
  • the microelectrodes 61 to 64 or 65 to 68 are in one for implementation of the method according to the invention Microsystem in two spaced apart levels for training of an electric field cage with a capture area arranged or point forming field minimum.
  • the electric one Field cage is inside the microelectrode assembly formed by the cuboid shown in Figure 6 is outlined schematically.
  • Reference numeral 69 denotes one focused in the interior of the microelectrode arrangement Beam of light (preferably laser beam). A first particle in The focus is on the shape of a biological cell 611 of the light beam 69.
  • a second particle which is shown in the Example is also a biological cell 612, is located at the catch point of the electrical field cage. Analogous for the determination of the optically induced forces explained above by observing the transition movement of a particle from The focus in the capture area can now be a determination of the binding forces be carried out between the particles, such as this is explained below.
  • two cells 611, 612 are brought into the interior in succession introduced the microelectrode arrangement 61 to 81.
  • the first cell 611 is flushed into the microelectrode arrangement and after complete control of the octopole field kept in the electric catch area.
  • the first cell 611 with the optical cage through the laser beam 69 is formed, taken over and spaced from the catch area positioned.
  • the second is then rinsed in Cell 612 and its positioning in the capture area, e.g. in the Center of the microelectrode arrangement 61 to 68.
  • biological particles are the same or different Kind or biological cells or cell components on the one hand and / or synthetic particles with predetermined active substances on the other hand.
  • the cells 611, 612 are brought into contact, with an adhesive bond between the two cells is trained.
  • the adhesive bond is, for example brought about by one of the following techniques. First is it is possible to turn off the first cell 611 by turning off the laser beam 69 release and thereby under the effect of electrical Field forces towards the catch area of the electrical field cage to move where the touch of the second cell 612 and the formation of the adhesive bond takes place. Second, it is possible, the focus of the laser beam 69 with respect to the capture area to adjust so that the first cell 611 with the second cell 612 or even in contact with one predetermined force is pressed against this.
  • the mutual The force of pressing the cells together can be derived from the electrical field forces in the catch area and the example optical forces determined according to the technique explained above derive in the focus of the laser beam 69.
  • For quantitative Comparability of the determination of binding forces is the adhesive bonding for a predetermined time range (e.g. approx. 0.1 to 10 seconds). But there are also longer ones Times of e.g. up to 1000 seconds possible.
  • the binding forces (interaction forces, adhesive strength) determined between the cells as follows.
  • the determination of forces is carried out analogously to the determination of the optically induced forces on a single particle Variation of field characteristics and identification of those Field strengths in the electrical capture area and optical cage, in which there is a tear-off movement between the cells. For example, given electrical potential amplitudes repeats the one focused on the first cell 611 Laser beam 69 adjusted so that the focus is from the capture area removed, and if the first cell 611 is not aligned has moved the focus, deferred and with a gradual increased light output.
  • a particular advantage of this procedure is its Repeatability with a given pair of particles and in the Possibility of accurate contact times between cells pretend.
  • the surface receptors of the first cell become then with a test or active substance from a molecular Library in contact with the suspension solution in the microsystem brought. Then a second cell (or a synthetic particles with well binding surface molecules) brought up to the first cell.
  • the binding forces provide e.g. one of the following results. Are the binding sites of the first cell already saturated by the active substance, there is no or one weak binding of the test cell. Otherwise there is a strong one Binding the test cell. This allows biological cells evaluate and in relation to the response to certain active substances sort by.
  • FIG. 7 shows a microelectrode arrangement analogous to Figures 1 and 6 with the microelectrodes 71 to 78 and one in the interior of the microelectrode arrangement focused light beam 79.
  • a first cell 712 in the electrical capture area of the Microelectrode assembly 71 to 78 captured and positioned.
  • a second cell 711 or a synthetic particle with an active substance is captured with the light beam 79 and along a predetermined path 713 on the first cell 712 passed or with for a predetermined contact time brought this into contact.
  • the individual cells can also be cell groups or aggregates for mutual stimulation for a predetermined time Effect of predetermined forces brought together and separated again become.
  • FIG. 8 again shows a microelectrode arrangement with the Microelectrodes 81 to 88 and one in the interior of the microelectrode arrangement focused light beam 89.
  • FIG 811 to 814 shown in the electrical capture range, to which a fifth cell 815 in a predetermined position (corresponding the direction of the arrow) is added.
  • the fifth cell 815 for a predetermined time with a predetermined force pressed against the already formed cell group 811 to 814, to the formation of binding forces in this predetermined To enable relative position.
  • any cell aggregates can be predetermined Build aggregate shapes.
  • This procedure is also implementable with synthetic microparticles that are let it polarize negatively and in the electrical capture range are repelled by the microelectrodes (negative Dielectrophoresis).
  • a device consists of an arrangement a fluidic microsystem 91, an illumination device 92 for producing an optical cage in a microelectrode arrangement of the microsystem 91, where the microsystem 91 and the lighting device 92 with an adjustment device 93 are adjustable relative to each other, and one Observation and / or sensor device 94 (e.g. microscope), as shown schematically in Fig. 9.
  • the microsystem is provided with fluidic and potential control device 95, as is known in itself.
  • the lighting device 92 is, for example, laser tweezers known per se, the light source, for example, a diode laser or a semiconductor laser and one for focusing Includes microscope assembly.

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Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Vermessung und Kalibrierung optischer Feldfallen und der Bestimmung von optisch induzierten Kräften in allen drei Raumrichtungen, die auf mikrometergroße Teilchen ausgeübt werden, und zur Verwendung optischer Feldfallen.
Optische Feldfallen, auch "optical tweezers", "Laser-Pinzetten" oder "optical traps" genannt, werden seit etwa zwei Jahrzehnten auf den Gebieten der Biotechnologie, Medizin und Molekularbiologie sowie auf anderen technischen Gebieten zur Positionierung und Manipulation mikrometergroßer und submikrometergroßer Partikel eingesetzt [G. Weber et al. in "Int. Rev. Cytol." Bd. 131, 1992, S. 1; S.M. Block in "Noninvasive Techniques in Cell Biology", Wiley-Liss., New York 1990, S. 375]. Die Entwicklung der Laser-Pinzette geht vor allem auf A. Ashkin zurück [A. Ashkin in "Phys. Rev. Lett.", Bd. 24, 1970, S. 156]. Das Prinzip des Partikeleinfangs durch optisch induzierte Kräfte beruht darauf, daß neben dem Lichtdruck, der stets ein Teilchen von der Lichtquelle wegdrückt, Gradientenkräfte auftreten, die dazu führen, daß ein Teilchen in einen Fokus gelangt bzw. stabil in diesem gehalten oder mit diesem bewegt wird. Voraussetzung ist, daß die Absorption und Reflexion des Teilchens gering ist, während der Unterschied im Brechungsindex zur Umgebungslösung möglichst groß sein sollte.
Laser-Pinzetten haben in den letzten Jahren vor allem deshalb eine größere Verbreitung erlangt, weil bei gleicher, stets starker Fokussierung des Lichtstrahls sowohl Teilchen, die größer als die Wellenlänge (sogenannte Mie-Teilchen), als auch Teilchen, die kleiner als die Wellenlänge sind (sogenannte Rayleigh-Teilchen), gefangen werden können. Das sind vor allem biologische Objekte wie Zellen, Organellen und andere Zellbestandteile als auch große Moleküle (wie DNA) und künstliche Mikropartikel [S.M. Block et al. in "Nature", 1990, S. 348; E.M. Bonder et al. in "J. Cell Biol.", Bd. 11, 1990, S. 421].
Elektromagnetische Feldkäfige gehen auf W. Paul [W. Paul et al. in "Forschungsberichte des Wirtschaftsministeriums Nordrhein-Westfalen", Nr. 415 und 450; W. Paul in "Phys. Blätter", Bd. 46, 1990, S. 227] zurück. Sie werden vor allem in der Elementarteilchenphysik zum Fangen und Vermessen atomarer Teilchen bei niedrigem Gasdruck verwendet. 1993 wurden erstmals flüssigkeitsgefüllte, dreidimensionale Mikrofeldkäfige unter Nutzung dielektrophoretischer Kräfte vorgestellt [T. Schnelle et al. in "Biochim. Biophys. Acta", Bd. 1157, 1993, S. 127]. Wird die Leitfähigkeit einer Suspensionslösung höher gewählt, als die mittlere Leitfähigkeit des Teilchens, so sind die im E-Feld induzierten Oberflächenladungen an dem Partikel derart angeordnet und gepolt, daß auf das Partikel abstoßende Kräfte wirken [G. Fuhr et al. in "Biochim. Biophys. Acta" Bd. 1201, 1994 S. 353]. Auch dieses Prinzip kann zum Fangen, Positionieren und Bewegen von Teilchen benutzt werden [T. Schnelle et al. in "Biochim. Biophys. Acta", Bd. 1157, 1993, S. 127]. In diesen dielektrischen Feldkäfigen können ebenfalls den Mie- als auch Rayleigh-Teilchen entsprechende Objekte gehalten werden. Eine Kombination beider Prinzipien zum Zwecke einer höheren Fangkraft wurde mehrfach vorgeschlagen, da das optische und das elektrische Kraftfeld nahezu nicht miteinander interferieren [G. Fuhr et al. in "Topics in Current Chemistry", Bd. 194, 1998, S. 84].
Ein bisher ungelöstes Problem ist die Ermittlung der real im optischen Feld (Lasertrap) auf ein Teilchen wirkenden optisch induzierten Kräfte. Hierzu gibt es mehrere, außerordentlich zeit- und geräteaufwendige Methoden, die sich wie folgt zusammenfassen lassen:
Variante I [K. Svoboda et al. in "Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc.", 1994, S. 247]:
Auf ein im Laserfokus gefangenes Teilchen wirkt eine kalibrierbare Strömung. Gesucht wird die Strömungsgeschwindigkeit, bei der das Teilchen gerade aus dem Laserfokus gerissen wird oder gerade noch in diesem verbleibt. Aus dieser Strömungsgeschwindigkeit kann über die Stokes'sche Reibung eine Fangkraft berechnet werden. Nachteilig an diesem Verfahren ist vor allem, daß es schwer fällt, mit ein und demselben Teilchen wiederholt Messungen auszuführen, und daß nur sehr komplizierte Kanalaufbauten eine Vermessung in verschiedene Raumrichtungen erlauben. Eine wirklich räumliche (x-, y-, z-) Kraftvermessung ist nicht möglich. Dieses Verfahren ist ferner auf bestimmte Teilchenformen (Kugel, Ellipsoid) mit glatter Oberfläche beschränkt.
Variante II [C.P. Dennis in "Faraday Discuss. Chem. Soc.", Bd. 90, 1990, S. 209]:
Es erfolgt eine Messung der mittleren Auslenkung eines Teilchens im Laserfokus aufgrund der Brown'schen Stöße. Hier ist zwar prinzipiell eine Vermessung in alle Raumrichtungen möglich, sie erfordert jedoch eine sehr präzise Messung der Partikelbewegung mit Submikrometergenauigkeit und kann für die meisten Mie-Teilchen nicht verwendet werden, da diese zu groß für eine merkliche Auslenkung sind. Hinzu kommt, daß die Messungen mit steigender Laserleistung immer schwieriger und ungenauer werden und daß nur im sehr engen Fokalbereich des Lasers gearbeitet werden kann.
Variante III [C.P. Dennies et al. in "Applied Optics", 1993, S. 1629] :
Es wird ein Abreißen eines Teilchens mittels einer Laser-Pinzette untersucht, das in definierter Weise an einer Unterlage befestigt ist. Dabei wird die Streuung einer evaneszenten Oberflächenwelle bei Totalreflexion benutzt, um die Bewegung des Objektes in z-Richtung (senkrecht zur Oberfläche) mit einer Genauigkeit im nm-Bereich zu bestimmen. Auch dieses Verfahren kann nicht in alle Raumrichtungen und vor allem nicht rasch angewendet werden, sondern erfordert einen hohen Kalibrier- und Geräteaufwand. Außerdem entspricht das optische Strahlungsfeld in Oberflächennähe nicht den Verhaltnissen in freier Lösung.
Allgemein steht somit eine schnelle und leicht anzuwendende Methode zur Kraftmessung, die vor allem auch in dem später zu nutzenden Umgebungsmedium eines Teilchens, mit eben diesem Teilchen und unter vergleichbaren Bedingungen angewendet werden kann, noch aus.
Ein weiteres, bisher ungelöstes Problem bei der Handhabung mikroskopisch kleiner Teilchen ist die Ermittlung der zwischen Teilchen wirkenden zwischenmolekularen Anziehungskräfte (Adhäsionskräfte). Sowohl synthetische, als auch natürliche Partikel auf der Basis biologischer Materialien (insbesondere biologische Zellen oder Zellbestandteile) neigen dazu, bei gegenseitigem Kontakt aneinander zu haften. Adhäsionserscheinungen können je nach Art der Adhäsion in unspezifische und spezifische Adhäsionen oder nach Art der auftretenden Bindungen in Adhäsionen mit chemischen Bindungen oder Adhäsionen mit van-der-Waals-Bindungen unterschieden werden. Die Ermittlung der Spezifität, des Bindungstyps und damit der Bindungskräfte bei Adhäsionen zwischen mikroskopisch kleinen Partikeln sind von hohem Interesse im Bereich der Biologie, Medizin und Pharmakologie. So besteht ein Bedarf an quantifizierbaren, wiederholbaren und schonenden Verfahren zur Erfassung von Adhäsionserscheinungen an einzelnen Teilchen, z.B. zur Erfassung spezifischer Bindungen von Makromolekülen (die hier ebenfalls als mikroskopische Teilchen aufgefaßt werden) an biologischen Zellen für die Untersuchung der Immunantwort oder für die Erkennung von Infektions- oder anderen Krankheitszuständen von Zellen. Ein weiteres Beispiel sind Wechselwirkungen zwischen mikroskopischen Teilchen, bei denen spezifische Rezeptor-Ligand-Systeme auf den Teilchenoberflächen wirksam werden.
Ein Verfahren zur Einstellung vorbestimmter Adhäsionserscheinungen zwischen einzelnen suspendierten mikroskopischen Teilchen oder zur Bestimmung der dabei auftretenden Bindungskräfte ist bisher nicht verfügbar.
Aus der Publikation von K. Morishima et al. in "Proc. of IEEE", 1997, S. 155, ist der kombinierte Einsatz optisch induzierter Kräfte und elektrischer Feldkräfte zur Manipulierung von Bakterien bekannt. Dabei ist vorgesehen, in einem Mikrosystem unter mikroskopischer Beobachtung innerhalb einer Bakterienanhäufung eine vorbestimmte Bakterie mit einer Laser-Pinzette einzufangen und zu fixieren, während die übrigen Bakterien unter Wirkung der elektrischen Feldkräfte von der einzelnen, fixierten Bakterie weg bewegt werden. Die von K. Morishima et al. beschriebene Verfahrensweise ist in ihrer Anwendung auf die dort beschriebene Trennung einzelner Teilchen aus einer Gruppe von vielen Teilchen beschränkt. Es ist lediglich vorgesehen, die elektrischen Felder ein- oder auszuschalten, um eine trennende Teilchenbewegung zu bewirken. Eine Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Teilchen wird damit nicht ermöglicht. Des weiteren ist es ausgeschlossen, daß einzelne Teilchen zu einer vorhandenen Gruppe von Teilchen oder einem Teilchenaggregat zur Erzielung bestimmter Wechselwirkungen bewegt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren zur Handhabung von Teilchen mit Laser-Pinzetten anzugeben, mit denen insbesondere die Ermittlung von optisch induzierten Kräften oder Bindungskräften und die Ausübung vorbestimmter Kräfte ermöglicht wird. Ein erfindungsgemäßes Verfahren soll insbesondere die Kräfteermittlung mit einer erhöhten Meßgeschwindigkeit und einer besseren Reproduzierbarkeit und Genauigkeit gewährleisten. Die Ermittlung von Kräften, die auf mikroskopische Teilchen wirken, soll über ein elektrisches Signal in rasch wiederholbarer und automatisierbarer Form erfolgen, wobei die Kräfte mit einer Genauigkeit im pN-Bereich und darunter in beliebigen Raumrichtungen erfaßt werden sollen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Implementierung der Verfahren anzugeben.
Die genannten Aufgaben werden durch Verfahren bzw. Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1, 10 und 17 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Verwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Erfindungsgemäß ist insbesondere vorgesehen, mindestens ein mikroskopisches Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs in einer Mikroelektrodenanordnung einzufangen und in Bezug auf einen elektrischen Fangbereich (o. Fangpunkt) zu positionieren, der durch elektrische Feldgradienten in der Mikroelektrodenanordnung gebildet ist. Der Fokus des optischen Käfigs mit dem Teilchen wird zunächst mit Abstand vom Fangbereich, d.h. mit Abstand vom elektrischen Feldminimum des Fangbereiches, der einen elektrischen Feldkäfig darstellt, positioniert. Anschließend werden die Feldkräfte im optischen Käfig und/oder im elektrischen Fangbereich und/oder der Abstand zwischen dem optischen Käfig und dem elektrischen Fangbereich variiert, bis eine Übergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Fangbereich oder umgekehrt erfolgt. Je nach Anwendungsfall werden die beim Eintritt der Übergangsbewegung gegebenen Feldeigenschaften zur erfindungsgemäßen Kräftebestimmung oder die Übergangsbewegung an sich zur Ausübung vorbestimmter Kräfte verwendet.
Entsprechend der erfindungsgemäßen Verfahrensweise werden somit innerhalb einer Mikroelektrodenanordnung mit einem dreidimensionalen elektrischen Feld, das elektrische, den Fangbereich bildende Feldgradienten aufweist, auf das oder die Teilchen wirkende Kräfte erzeugt, deren Felder jeweils ein Minimum besitzen. Das Minimum der elektrischen Feldkräfte entspricht dem Fangbereich. Das Minimum der optischen induzierten Kräfte ist der Fokus des optischen Käfigs. Zwischen beiden Minima ist eine Feldbarriere vorhanden, die von den Amplituden der wirksamen elektrischen Felder, der Lichtleistung des optischen Käfigs und dem Abstand der Minima abhängt. Je nach Einstellung dieser Größen können nun das oder die Teilchen innerhalb der Mikroelektrodenanordnung in vorbestimmter Weise positioniert oder (bei mehreren Teilchen) voneinander getrennt werden.
Gemäß einem ersten wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung ist vorgesehen, die auf ein Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs wirkenden, optisch induzierten Kräfte zu bestimmen. Bei dieser Ausführungsform ist nur ein Teilchen im Fokus bzw. zeitweilig im Fangbereich der Mikroelektrodenanordnung vorhanden. Die Feldeigenschaften, d.h. die Amplitude des elektrischen Feldes, die Lichtleistung und/oder der Abstand der Minima, wird variiert, bis die Übergangsbewegung des Teilchens zwischen den Minima, d.h. zwischen dem Fokus und dem Fangbereich oder umgekehrt, erfolgt. Überraschenderweise konnte festgestellt werden, daß die Übergangsbewegung sehr genau und reproduzierbar ermittelbar ist. Aus der zum Auslösen der Übergangsbewegung erforderlichen Amplitude der elektrischen Felder in der Mikroelektrodenanordnung lassen sich die optisch induzierten Kräfte im optischen Käfig ermitteln.
Gemäß einem zweiten wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung ist vorgesehen, die Bindungskräfte zwischen mehreren Teilchen (z.B. zwei Teilchen) zu bestimmen. Bei dieser Ausführungsform ist jeweils ein Teilchen im Fokus des optischem Käfigs und ein Teilchen im elektrischen Fangbereich angeordnet. Wiederum lassen sich die Feldeigenschaften in der Mikroelektrodenanordnung variieren, um diejenigen Feldeigenschaften festzustellen, bei denen die Übergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Teilchen im Fangbereich oder umgekehrt erfolgt. Dieses Prinzip ist entsprechend auch mit Teilchengruppen im Fokus bzw. im Fangbereich realisierbar.
Aus den elektrischen Feldkräften und - bei Kombination der Bestimmung von Bindungskräften mit der Bestimmung optisch induzierter Kräfte gemäß dem ersten Gesichtspunkt - den optisch induzierten Kräften können durch Beobachtung der Übergangsbewegung oder einer Abreißbewegung-zwischen den Teilchen die zwischen den Teilchen wirkenden adhäsiven Bindungskräfte ermittelt werden. Ein besonderer Vorteil der Erfindung beteht darin, daß diese Vorgänge stoff-, teilchen- und bindungstypspezifisch beobachtet und ausgewertet werden können.
Gemäß einem dritten wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung ist vorgesehen, mikroskopische Teilchen in einer Mikroelektrodenanordnung mit den genannten, simultan vorhandenen mindestens zwei Feldminima unter Einstellung vorbestimmter Feldkräfte relativ zueinander zumindest zeitweilig in Gruppen oder Aggregaten zu positionieren oder zusammenzufügen oder derartige Gruppen oder Aggregate in Teile zu zerlegen. Diese erfindungsgemäße Aggregatmanipulierung wird wiederum vorzugsweise mit den obengenannten Gesichtspunkten der Erfindung kombiniert, kann aber auch davon unabhängig bei Einstellung vorbestimmter (wenn auch unbekannter) elektrischer und/oder optischer Feldkräfte implementiert werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Mikrosystem, das zur Ausbildung eines opto-elektrischen Doppelkäfigs eingerichtet ist, der durch die simultane Erzeugung von mindestens zwei Feldminima eines elektrischen Fangbereiches und eines optischen Käfigs erzeugt wird. Hierzu besitzt ein fluidisches Mikrosystem eine Mikroelektrodenanordnung zur Erzeugung des elektrischen Fangbereiches und eine für die Ausbildung des optischen Käfigs innerhalb der Mikroelektrodenanordnung transparente Struktur. Das Mikrosystem ist vorzugsweise ein fluidisches Mikrosystem, das einseitig, hin zu einer Lichtquelle zur Erzeugung des optischen Käfigs offen sein kann.
Es wird darauf hingewiesen, daß die zur Implementierung der Erfindung eingesetzten Techniken zum Aufbau des Mikrosystems, zur Erzeugung des elektrischen Feldkräfte und zur Erzeugung des optischen Käfigs an sich bekannt sind, so daß bei der folgenden Beschreibung hierzu auf Einzelheiten nicht eingegangen wird.
Im folgenden werden zunächst allgemeine Erläuterungen zu den der Erfindung zugrundeliegenden Prinzipien gegeben.
Beim "Laser-Trapping" kann ein Teilchen in einem lokalen Gleichgewicht gehalten werden, das durch eine optische Falle oder einen optischen Käfig im Fokus mindestens eines Laserstrahls gebildet wird. In einem Hochfrequenz-Mikrofeldkäfig kann ein Teilchen in einem lokalen Gleichgewicht gehalten werden, das durch einen elektrischen Fangbereich der jeweilig realisierten Feldverteilung gebildet wird. Der Fangbereich kann je nach Feldverteilung durch einen Punkt, eine Linie oder einen Raumbereich gebildet werden. In der folgenden Beschreibung wird ohne Beschränkung auf die Realisierung des Fangbereiches als Fangpunkt Bezug genommen, die Erfindung kann jedoch entsprechend mit beliebig gebildeten Fangbereichen implementiert werden. Die Erfindung beruht gemäß dem obengenannten ersten Gesichtspunkt insbesondere darauf, die optisch induzierten Kräfte in der optischen Falle (optischer Käfig) aus den elektrischen Kräften auf das Teilchen beim Übergang zwischen den Gleichgewichtszuständen, d. h. vom Fokus zum Fangpunkt oder umgekehrt, zu bestimmen. Die Aufgabe wird also insbesondere dadurch gelöst, daß das "Laser-Trapping" in einem elektrischen Hochfrequenz-Mikrofeldkäfig erfolgt, dessen Feldkräfte und elektrische Feldverteilung bekannt sind und der zur Einkopplung des zur Bildung des optischen Käfigs erforderlichen Laserlichts eingerichtet ist. Durch Verschieben des im Lasertrap (Fokus) gefangenen Teilchens aus dem Fangpunkt des Feldkäfigs bei niedriger elektrischer Fangleistung in eine definierte Position mit Abstand vom Fangpunkt kann durch nachfolgende Erhöhung der Amplitude der elektrischen Ansteuersignale des Feldkäfigs genau der Schwellwert bestimmt werden, bei dem die elektrischen Feldkräfte das Teilchen aus dem optischen Fokus zurück zum Fangpunkt bewegen, oder umgekehrt.
Die Einkopplung des zur Bildung des optischen Käfigs erforderlichen Laserlichts wird durch verschiedene bauliche Maßnahmen am Mikrofeldkäfig erzielt. Zu diesen zählt insbesondere die Anbringung mindestens einer Teilgruppe der Elektroden des Mikrofeldkäfigs auf einem Substrat, das transparent und so dünn ist, daß eine Laserlichtquelle genügend dicht an den Mikrofeldkäfig geführt werden kann, so daß in diesem der Fokus gebildet wird. Bei praktisch verfügbaren Gestaltungen von Laser-Pinzetten umfaßt die Laserlichtquelle u. a. ein Einkoppelobjektiv möglichst hoher numerischer Apertur. Dadurch ist die Brennweite üblicherweise im Bereich einiger hundert Mikrometer. Das transparente Substrat besitzt somit vorzugsweise eine Dicke kleiner als die Brennweite der Laserlichtquelle.
Die Erfindung erlaubt je nach Anwendung, die qualitativen und/oder quantitativen Parameter der optisch induzierten Kräfte an einem Teilchen zu erfassen. Die quantitative Bestimmung der optisch induzierten Kräfte kann aus wenigen Größen erfolgen, die z. B. die Orte des Fokus und des Fangpunktes, die Feldverteilung zwischen den Elektroden, die elektrischen Eigenschaften des Teilchens und seiner Umgebungslösungen als auch die Form, Phasenlage, Frequenz und Amplitude aller Elektrodensignale umfassen. Alle diese Größen lassen sich unabhängig von der eigentlichen Messung oder vorab auf rein elektrischem Wege oder über eine einmalige numerische Simulation der Feldverteilung im Hochfrequenzkäfig bestimmen. Die optisch induzierten Kräfte, die auf das Teilchen wirken, lassen sich aus der Amplitude der elektrischen Ansteuersignale des elektrischen Feldkäfigs beim Übergang zwischen den Gleichgewichten (Übergangsbewegung) bestimmen. Durch systematisches Verschieben eines in seinen passiven elektrischen Eigenschaften bekannten Partikels in x-, oder/und y-, oder/und z-Richtung können auf diese Weise die Kräfte, die der fokussierte Laserstrahl auf ein Teilchen dieser Größe ausüben kann, quantitativ und ortsaufgelöst bestimmt werden.
Ein Vorteil der Erfindung ist es, daß der Kräftegradient der optisch induzierten Kräfte relativ steil ist, so daß der genannte Übergang zwischen den Gleichgewichten schwellwertartig oder sprunghaft erfolgt und somit besonders leicht und genau registriert werden kann.
Erfindungsgemäß kann diese Prozedur automatisiert und zur Kalibrierung des Laserstrahls benutzt werden. Die Messungen lassen sich beliebig oft wiederholen, lassen sich in wenigen Sekunden ausführen und können zudem an ein und demselben Teilchen in der später weiter verwendeten Umgebung durchgeführt werden. Neben Absolutwerten der optisch induzierten Kräfte können Symmetrieabweichungen der optischen Strahlung und deren Intensitätsprofile nahe und im Fokalbereich, d.h auch relative Werte, bestimmt werden.
Die obigen Erläuterungen zur Bestimmung optischer induzierter Kräfte gelten entsprechend für die Bestimmung von Bindungskräften, da diese als zusätzlicher Beitrag zu den elektrischen Feldkräften im elektrischen Fangbereich aufgefaßt werden können.
Die Erfindung ist mit beliebigen Teilchen wie synthetischen Partikeln oder biologischen Zellen oder deren Bestandteilen implementierbar. Die Teilchengröße liegt im gesamten Größenbereich von Teilchen, die mit Laserpinzetten manipulierbar sind, vorzugsweise bei einer Größe kleiner als 200 µm.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1:
eine Prinzipdarstellung der Anordnung von Feldkäfigelektroden und eines optischen Käfigs gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2:
eine weitere Prinzipdarstellung der Anordnung von Feldkäfigelektroden und eines optischen Käfigs;
Fig. 3:
eine Kurvendarstellung zur Illustration experimenteller Ergebnisse;
Fig. 4:
beispielhafte Darstellungen der Feldverteilungen eines Oktopol-Feldkäfigs;
Fig. 5:
eine Kurvendarstellung zur Illustration der Fangkräfte des in Figur 4 gezeigten Feldkäfigs in z-Richtung;
Fig. 6:
eine Prinzipdarstellung der Anordnung von Zellen in einem optischen Käfig und einem Fangbereich gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 7:
eine Prinzipdarstellung der Anordnung von Zellen in einer Mikroelektrodenanordnung gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 8:
eine Prinzipdarstellung der Anordnung von Zellen in einer Mikroelektrodenanordnung gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung; und
Fig. 9:
eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezug auf die Kombination eines Oktopol-Feldkäfig zur Bildung des Fangsbereiches mit einem einzelnen Fang-Laserstrahl zur Bildung des optischen Käfigs beschrieben, ist jedoch entsprechend mit beliebigen Feldkäfigformen bzw. mehreren Laserstrahlen realisierbar.
In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßes Mikrosystem ausschnittsweise vergrößert schematisch dargestellt. Die Darstellung zeigt lediglich eine Mikroelektrodenanordnung, bestehend aus den Mikroelektroden 11 bis 18 (ohne Steuerleitungen) und ein zwischen den Mikroelektroden in einer Suspensionsflüssigkeit suspendiertes mikroskopisches Teilchen 113. Die Mikroelektroden sind in planarer Gestalt an gegenüberliegenden Wänden der Mikrosystemstruktur angeordnet, wobei beispielsweise die x-y-Ebene eine Substratebene aufspannt. Die Mikroelektroden 11 bis 18 sind dazu eingerichtet, mit elektrischen Potentialen derart beaufschlagt zu werden, daß Feldgradienten mit einem Feldminimum gebildet werden. Die Technik der Elektrodenansteuerung zur Erzeugung eines vorbestimmten Minimums ist an sich bekannt und wird deshalb hier im einzelnen nicht beschrieben. Die Lage des Feldminimums ist von den Phasen und Amplituden der Steuerpotentiale an den Mikroelektroden 11 bis 18 abhängig und kann in vorbestimmter Weise eingestellt werden. Der Fangbereich bzw. der elektrische Feldkäfig wird auch als Hochfrequenzkäfig bezeichnet, da die Mikroelektroden vorzugsweise mit hochfrequenten Steuerpotentialen (Frequenzbereich s. unten) zur Manipulierung der mikroskopischen Teilchen auf der Basis negativer Dielektrophorese beaufschlagt werden.
Gemäß Fig. 1 wird der durch die Mikroelektroden 11 bis 18 gebildete elektrische Hochfrequenzfeldkäfig mit dem fokussierten Lichtstrahl 19 so kombiniert, daß sich der Fokus 110a im elektrischen Feld der Mikroelektroden, d. h. entweder innerhalb des Feldkäfigraumes 111 oder in unmittelbarer Nähe 112 außerhalb des Käfigs befindet, während das Feldminimum, der Fangpunkt 110b des Hochfrequenzfeldkäfigs, an einem dazu beabstandeten Ort (z.B. einen Bruchteil bis zu mehrere Partikeldurchmessern entfernt) liegt.
Die erfindungsgemäße Bestimmung optisch induzierter Feldkräfte am Teilchen 113 erfolgt derart, daß zunächst das Teilchen 113 im Fokus des Laserstrahls gefangen und durch eine Fokusverschiebung in die bezeichnete Position (z.B. an der Stelle 114, charakterisiert durch die Koordinaten (x1,y1,z1)) gebracht wird. Die Fokusverschiebung erfolgt durch eine mechanische Änderung der Relativpositionen des Mikrosystems und der Quelle des Laserstrahls 19 durch an sich bekannte Verstelleinrichtungen und/oder Umlenkeinrichtungen des Laserstrahls. Über eine Erhöhung der Amplitude der an die Elektroden angelegten Hochfrequenzsignale werden die elektrischen Polarisationskräfte des Feldkäfigs solange erhöht, bis das Teilchen 113 aus dem Laserfokus herausgerissen wird und sich in den Fangpunkt 110b bewegt (Übergangsbewegung zwischen den lokalen Gleichgewichten in den Feldminima).
Der Übergang zwischen den lokalen Gleichgewichten kann alternativ auch ausgeführt werden, indem die Laserleistung erhöht wird und das Teilchen aus dem Fangbereich des Feldkäfigs in den Fokus bewegt wird und/oder indem die Orte der Fangpunkte oder des Fokus verschoben werden und eine Bestimmung des Weges oder Abstandes der Feldminima erfolgt, bei dem die Übergangsbewegung stattfindet. Da die elektrischen Polarisationskräfte auf das Teilchen und die Feldverteilung zwischen den Elektroden 11 bis 18 bekannt sind, besteht eine direkte Proportionalität zwischen der meßbaren Laserleistung im Fokalbereich, der Amplitude der elektrischen Signale und der auf das Partikel wirkenden optisch induzierten Kräfte. Durch Wiederholen der Prozedur und Verschieben des Teilchens 113 in beliebigen Raumrichtungen, lassen sich die auf das konkrete Teilchen wirkenden optisch induzierten Kräfte quantitativ bestimmen. Es handelt sich dabei folglich um eine elektrische Kalibrierung der optisch induzierten Gegenkräfte, die mit geringem Aufwand bereitzustellen ist, und es erlaubt, Kräfte im Bereich von fN bis zu einigen hundert pN zu erfassen.
Die optisch induzierten Kräfte werden somit in mindestens einem Fall aus den Feld- oder Ortseigenschaften des Teilchens 113 bei einer Übergangsbewegung ermittelt, wobei die elektrischen Polarisationskräfte auf das Teilchen 113 aus der an sich berechenbaren Feldverteilung zwischen den Mikroelektroden 11 bis 18 und der bei Ausführung der Übergangsbewegung gegebenen Orte des Fokus 110a und des Fangpunktes 110b ermittelt werden. Diese Orte lassen sich mit einem Beobachtungsmikroskop vermessen. In allen weiteren Fällen kann auf der Grundlage der genannten Proportionalität eine Relativbestimmung der optisch induzierten Kräfte erfolgen.
Figur 2 zeigt eine erweiterte Darstellung eines Systems zur Vermessung der optisch induzierten Kräfte, die auf ein im Fokus gefangenes Teilchen wirken. Der Mikrofeldkäfig wird durch Mikroelektroden gebildet, die an aufeinander zuweisenden Oberflächen der Substrate 27, 29 angebracht sind. Die Substrate 27, 29 werden durch einen Abstandshalter 28 getrennt, der einen Suspensionsraum bildet, in dem das zu untersuchende Teilchen dem Feld des Mikrofeldkäfigs ausgesetzt wird. Das in Figur 2 obere Substrat ist genügend dünn, so daß der Fokus des optischen Käfigs im Suspensionsraum einstellbar ist.
Über eine Öffnung 21 werden Zellen oder andere Mikropartikel suspendiert in einer Lösung in den Kanal 22 eingespült und gelangen dann in den Feldkäfig 23, dessen Ausgangselektroden 24a-d mit einem Hochfrequenzfeld (kHz- oder MHz-Bereich, beliebige Signalform (z. B. Rechteck-, Sinus-, Dreieck- oder andere Signalformen), Amplitude einige mV bis zu einigen 10 V)) beaufschlagt werden. Durch diese zunächst einseitige Beaufschlagung der Mikroelektroden mit elektrischen Potentialen wird im Kanal 22 lediglich eine elektrische Feldbarriere für eingespülte Mikroteilchen gebildet. Befindet sich ein Teilchen im Käfig 23, werden auch die Eingangselektroden 25a-d zugeschaltet und/oder die Strömung wird gestoppt. Mit dem Laserstrahl 26 wird wie oben beschrieben das Teilchen im Feldkäfigraum bewegt und die Vermessung der optisch induzierten Kräfte vorgenommen. Die für das elektrische Trapping typischen Phasenverschiebungen der Elektrodensignale für zwei mögliche Wechselfeld- und zwei Rotationsfeldansteuerungsarten (2* AC-Feld bzw. 2*Rot-Feld) sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Phasenansteuerungen der Elektrodensignale eines Oktopols
Feldart El. 25b El. 24b El. 24d El. 25d El. 25a El. 24a El. 24c El. 25c
AC-Feld 0° 180° 0° 180° 0° 180° 0° 180°
AC-Feld 0° 180° 0° 180° 180° 0° 180° 0°
Rot-Feld 0° 90° 180° 270° 180° 270° 0° 90°
Rot-Feld 0° 90° 180° 270° 90° 180° 270° 0°
Beim Rot-Feld wird im Unterschied zum AC-Feld ein Drehmoment auf das Teilchen ausgeübt, das zur Ausbildung einer Rotation (letzte Zeile von Tab.1) führt, die zusätzlich zur Kraftbestimmung genutzt werden kann. Mit den Werten der vorletzten Zeile von Tabelle 1 erfolgt eine Drehmomentkompensation.
Im vorliegenden Beispiel sind die Elektroden in planarer Form auf zwei Glassubstrate 27, 29 mit halbleitertechnologischen Methoden prozessiert worden, die über Kopf durch einen Spacer 28 flüssigkeitsdicht montiert sind, so daß sie in die Kanalflüssigkeit 22 eintauchen. Für eine hohe Laserfokussierung ist es erforderlich, eines der Glassubstrate (hier (27)) möglichst dünn auszuführen. Im vorliegenden Beispiel ist das Substrat 27 150 bis 200 µm dick, und das Substrat 29 besteht aus 0.5 bis 1 mm dickem Glas oder Kunststoff.
Bei steigender Laser-Ausgangsleistung wachsen die optisch induzierten Kräfte, so daß zum genannten Übergang zwischen den Feldminima entsprechend steigende elektrische Feldkräfte, d. h. Signalamplituden, erforderlich sind. Dies ist anhand eines experimentellen Ergebnisses in Figur 3 dargestellt. Diese Kurvendarstellung zeigt den Zusammenhang zwischen der Laserausgangsleistung, d. h. dem Betrag der optisch induzierten Kräfte und den Amplituden der Käfigspannungen, d. h. den Amplituden der elektrischen Potentiale, mit denen die Mikroelektroden beaufschlagt sind. Mit zunehmender Laserausgangsleistung sind auch größere Amplituden der Käfigspannungen erforderlich, um die Übergangsbewegung des jeweiligen Teilchens zwischen dem Fokus und dem Fangpunkt zu erzielen. Deutlich ist zu erkennen, daß die Fangleistung der optischen Falle in z-Richtung schwächer ist (obere Kurve) as in x- oder y-Richtung (untere Kurve).
Aus einer Feldverteilung gemäß Figur 4 (erhalten aus einer einmalig auszuführenden numerischen Berechnung unter Beachtung der realen Elektrodengeometrien gemäß Figur 1 und Abstände) und den passiven elektrischen Eigenschaften des Testpartikels (in diesem Fall eines Latex-Beads von 8 µm Durchmesser), ergeben sich die in Figur 5 dargestellten Fangkräfte der Laser-Pinzette in z-Richtung. Die dargestellte Kurve bezieht sich auf eine Signalamplitude der Käfigelektroden von 10 V. Experimentell konnten Amplituden bis zu 30 V appliziert werden. Bei einer quadratischen Abhängigkeit der Fangkraft des elektrischen Käfigs entspricht das einer maximal erfaßbaren Kraft von ca. 150 pN mit einer Auflösung im pN-Bereich und darunter. Dieses Meßergebnis steht in guter Übereinstimmung mit der Theorie der "Laser-Pinzetten" (vgl. A. Ashkin in "Biophys. J.", Bd. 61, 1992, S. 569). Feiner ausgeführte Elektroden erlauben es, noch weitaus höhere Signalamplituden und damit elektrisch induzierte Kräfte zu erzeugen, so daß auch wesentlich höhere Kräfte erfaßbar sind.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, daß die Methode schnell und leicht insbesondere auch in dem später zu nutzenden Umgebungsmedium mit den zu untersuchenden oder zu manipulierenden Teilchen unter vergleichbaren Bedingungen angewendet werden kann. Ferner ist dieses Verfahren nicht auf bestimmte Teilchen- und Oberflächenformen beschränkt, sondern mit beliebigen Teilchengeometrien realisierbar. Es können sogar die Kräfte an zusammenhängenden Teilchengruppen (z. B. Aggregate o. dgl.) beliebiger Form bestimmt werden.
Beispiele für die Bestimmung von Kräften an zusammenhängenden Teilchengruppen und die Ausübung vorbestimmter Kräfte auf Teilchen zur Manipulierung von Teilchengruppen werden im folgenden unter Bezug auf die Figuren 6 bis 8 beschrieben.
Figur 6 zeigt eine Mikroelektrodenanordnung in Oktopolgestalt mit den Mikroelektroden 61 bis 68 analog zu Figur 1. Die Mikroelektroden 61 bis 64 bzw. 65 bis 68 sind in einem zur Implementierung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichteten Mikrosystem in zwei voneinander beabstandeten Ebenen zur Ausbildung eines elektrischen Feldkäfigs mit einem den Fangbereich oder -punkt bildenden Feldminimum angeordnet. Der elektrische Feldkäfig wird im Inneren der Mikroelektrodenanordnung ausgebildet, das durch den in Figur 6 dargestellten Quader schematisch umrissen wird. Das Bezugszeichen 69 bezeichnet einen im Innenraum der Mikroelektrodenanordnung fokussierten Lichtstrahl (vorzugsweise Laserstrahl). Ein erstes Teilchen in Gestalt einer biologischen Zelle 611 befindet sich im Fokus des Lichtstrahls 69. Ein zweites Teilchen, das beim dargestellten Beispiel ebenfalls eine biologische Zelle 612 ist, befindet sich im Fangpunkt des elektrischen Feldkäfigs. Analog zur oben erläuterten Ermittlung der optisch induzierten Kräfte durch Beobachtung der Übergangsbewegung eines Teilchens vom Fokus in den Fangbereich kann nun eine Bestimmung der Bindungskräfte zwischen den Teilchen durchgeführt werden, wie dies im folgenden erläutert wird.
Zuerst werden zwei Zellen 611, 612 in Folge in den Innenraum der Mikroelektrodenanordnung 61 bis 81 eingebracht. Dies erfolgt vorzugsweise mit der unter Bezug auf Figur 2 erläuteten Einspültechnik, bei der die Mikroelektrodenanordnung mit einer Kanalstruktur eines fluidischen Mikrosystems verbunden ist. Die erste Zelle 611 wird in die Mikroelektrodenanordnung eingespült und nach vollständiger Ansteuerung des Oktopolfeldes im elektrischen Fangbereich gehalten. Dann wird die erste Zelle 611 mit dem optischen Käfig, der durch den Laserstrahl 69 gebildet wird, übernommen und vom Fangbereich beabstandet positioniert. Anschließend erfolgt das Einspülen der zweiten Zelle 612 und deren Positionierung im Fangbereich, z.B. in der Mitte der Mikroelektrodenanordnung 61 bis 68. Es ist aber auch jede andere Technik der Einbringung mikroskopischer Teilchen in die Mikroelektrodenanordnung möglich. Anwendungsabhängig sind beide Teilchen biologische Zellen gleicher oder verschiedener Art oder biologische Zellen oder Zellbestandteile einerseits und/oder synthetische Teilchen mit vorbestimmten Wirkstoffen andererseits.
Im weiteren Verlauf werden die Zellen 611, 612 in Kontakt gebracht, wobei zwischen beiden Zellen eine adhäsive Bindung ausgebildet wird. Die adhäsive Bindung wird beispielsweise durch eine der folgenden Techniken herbeigeführt. Erstens ist es möglich, die erste Zelle 611 durch Abschalten des Laserstrahls 69 freizugeben und dadurch unter Wirkung der elektrischen Feldkräfte hin zum Fangbereich des elektrischen Feldkäfigs zu bewegen, wo die Berührung der zweiten Zelle 612 und die Ausbildung der adhäsiven Bindung erfolgt. Zweitens ist es möglich, den Fokus des Laserstrahls 69 in Bezug auf den Fangbereich so zu verstellen, daß die erste Zelle 611 mit der zweiten Zelle 612 in Kontakt gebracht oder sogar mit einer vorbestimmten Kraft gegen diese gedrückt wird. Die gegenseitige Kraft des Aneinanderdrückens der Zellen läßt sich aus den elektrischen Feldkräften im Fangbereich und den beispielsweise gemäß der oben erläuterten Technik ermittelten optischen Kräfte im Fokus des Laserstrahls 69 ableiten. Zur quantitativen Vergleichbarkeit der Bestimmung von Bindungskräften wird die adhäsive Bindung für einen vorbestimmten Zeitbereich (z.B. rd. 0.1 bis 10 Sekunden) eingestellt. Es sind aber auch längere Zeiten von z.B. bis zu 1000 Sekunden möglich.
Nach Ablauf der anwendungsabhängig eingestellten Kontaktzeit werden die Bindungskräfte (Wechselwirkungskräfte, Adhäsionsstärke) zwischen den Zellen wie folgt bestimmt. Die Kräftebestimmung erfolgt analog zur oben erläuterten Bestimmung der optisch induzierten Kräfte auf ein einzelnes Teilchen durch Variation der Feldeigenschaften und Feststellung derjenigen Feldstärken im elektrischen Fangbereich und optischen Käfig, bei denen eine Abreißbewegung zwischen den Zellen erfolgt. Beispielsweise wird bei gegebenen elektrischen Potentialamplituden wiederholt der auf die erste Zelle 611 fokussierte Laserstrahl 69 verstellt, so daß sich der Fokus vom Fangbereich entfernt, und falls sich die erste Zelle 611 nicht mit dem Fokus bewegt hat, zurückgestellt und mit einer schrittweise erhöhten Lichtleistung beaufschlagt. Durch Kenntnis der in Abhängigkeit von der Lichtleistung induzierten optischen Kräfte läßt sich so aus der Lichtleistung, bei der die Mitführung der ersten Zelle 611 mit dem verstellten Fokus erfolgt, die Abreißkraft zwischen beiden Zellen und damit die gegenseitige Bindungskraft ermitteln. Andere Möglichkeiten dieser Kräftebestimmung ergeben sich aus der schrittweisen Variation der elektrischen Potentialamplituden und Verstellung des Ortes des Fangbereiches durch entsprechende Ansteuerung der Mikroelektroden 61 bis 68. Es sind auch Kombinationen aus beiden Techniken zur Variation der Feldeigenschaften einsetzbar.
Ein besonderer Vorteil dieser Verfahrensweise besteht in ihrer Wiederholbarkeit mit einem gegebenen Teilchenpaar und in der Möglichkeit, beliebige Kontaktzeiten zwischen den Zellen genau vorzugeben.
Bevorzugte Anwendungen der unter Bezug auf Fig. 6 beschriebenen Verfahrensweise, die bisher nicht oder nur unter unannehmbar hohem Aufwand zu verwirklichen war, sind die zeitlich exakt geregelte Berührung zweier oder auch mehrerer biologischer Zellen gleichen oder verschiedenen Typs. Somit ist eine Verwendung für pharmakologisch und medizinisch-diagnostisch interessierende Tests ermöglicht. Beispiele für dabei auftretende Vorgänge sind die Stimulation der zweiten Zelle 612 durch die zeitweilige Berührung durch die erste Zele 611, so daß sich das Bindungsverhalten der zweiten Zelle 612 ändert. Dieses veränderte Bindungsverhalten kann dann durch Ankopplung einer dritten Zelle (nicht dargestellt) getestet werden. Ein weiteres Beispiel ist das sogenannte Screening von Peptidoder anderen Molekularbibliotheken, indem zunächst eine erste Zelle eines ersten Typs in die Mikroelektrodenanordnung eingebracht wird. Die Oberflächenrezeptoren der ersten Zelle werden dann mit einer Test- oder Wirksubstanz aus einer molekularen Bibliothek über die Suspensionslösung im Mikrosystem in Kontakt gebracht. Anschließend wird eine zweite Zelle (oder ein synthetisches Teilchen mit gut bindenden Oberflächenmolekülen) an die erste Zelle herangeführt. Die oben erläuterte Bestimmung der Bindungskräfte liefert z.B. eines der folgenden Ergebnisse. Sind die Bindungsstellen der ersten Zelle bereits durch die Wirksubstanz abgesättigt, so erfolgt keine oder eine schwache Bindung der Testzelle. Andernfalls erfolgt eine starke Bindung der Testzelle. Damit lassen sich biologische Zellen bewerten und in Bezug auf die Reaktion auf bestimmte Wirksubstanzen sortieren.
Ein weiteres Beispiel für die Stimulierung biologischer Zellen wird im folgenden unter Bezug auf Figur 7 erläutert. Figur 7 zeigt analog zu den Figuren 1 und 6 eine Mikroelektrodenanordnung mit den Mikroelektroden 71 bis 78 und einen im Innenraum der Mikroelektrodenanordnung fokussierten Lichtstrahl 79.
Analog zum oben erläuterten Einspül- oder Durchstromprinzip wird eine erste Zelle 712 im elektrischen Fangbereich der Mikroelektrodenanordnung 71 bis 78 eingefangen und positioniert. Eine zweite Zelle 711 oder ein synthetisches Teilchen mit einem Wirkstoff wird mit dem Lichtstrahl 79 eingefangen und entlang eines vorbestimmten Weges 713 an der ersten Zelle 712 vorbeigeführt bzw. für eine vorbestimmte Kontaktzeit mit dieser in Berührung gebracht. Auch wenn es nicht zu einer festen Bindung oder Adhäsion zwischen den Zellen oder Teilchen kommt, kann über die Berührung der Oberflächen eine chemische Signalübertragung ertolgen, die eine anschließend analysierbare Veränderung einer oder beider Zellen zur Folge hat. Anstelle der Einzelzellen können auch Zeligruppen oder -aggregate zur gegenseitigen Stimulation für eine vorbestimmte Zeit unter Wirkung vorbestimmter Kräfte zusammengeführt und wieder getrennt werden.
Diese Verfahrensweise zur Stimulation biologischer Zellen oder Zellgruppen besitzt zahlreiche Verwendungen in der Medizin und Biotechnologie. Die Stimulation z.B. durch Applikation eines Medikaments aus der Umgebungslösung, die bisher für einzelne Zellen nur unter hohem Aufwand erreicht werden konnte, kann damit unter definierten und reproduzierbaren Bedingungen zellspezifisch erfolgen. In lebenden Organismen erfolgen derartige Stimulationen (oder Hemmungen) in der Regel auch meist durch Wechselwirkungen zwischen Zellen, wobei diese in enge Nachbarschaft kommen oder sich berühren müssen. Die in Organismen auftretenden Verhältnisse können mit der erfindungsgemäßen Verfahrensweise vorteilhaft simuliert werden.
Auch die in Figur 7 illustrierte Verfahrensweise kann vorteilhaft mit der oben erläuterten Bestimmung optisch induzierter Kräfte kombiniert, jedoch auch unabhängig von dieser unter Einstellung vorbestimmter Feldeigenschaften implementiert werden. Entsprechendes gilt auch für das unter Bezug auf Figur 8 erläuterte Verfahren zur Ausübung vorbestimmter Kräfte auf Zellen oder Zellgruppen zur Aggregatformierung.
Figur 8 zeigt wiederum eine Mikroelektrodenanordnung mit den Mikroelektroden 81 bis 88 und einem im Innenraum der Mikroelektrodenanordnung fokussierten Lichtstrahl 89.
Nach der oben erläuterten Einspül- oder Durchstromtechnik wird eine Vielzahl von biologischen Zellen in den Innenraum der Mikroelektrodenanordnung eingespült. Mit dem optischen Käfig des Lichtstrahls 89 werden Zellen gezielt in den Fangbereich geführt und dort gegebenenfalls relativ zu bereits vorhandenen Zellen positioniert. Beispielhaft sind in Figur 8 vier Zellen 811 bis 814 im elektrischen Fangbereich dargestellt, zu denen eine fünfte Zelle 815 in vorbestimmter Position (entsprechend der Pfeilrichtung) zugefügt wird. Dabei wird die fünfte Zelle 815 für eine vorbestimmte Zeit mit einer vorbestimmten Kraft gegen die bereits formierte Zellgruppe 811 bis 814 gedrückt, um die Ausbildung von Bindungskräften in dieser vorbestimmten Relativposition zu ermöglichen.
In dieser Weise lassen sich beliebige Zellaggregate mit vorbestimmten Aggregatformen aufbauen. Diese Verfahrensweise ist auch mit synthetischen Mikroteilchen implementierbar, die sich negativ polarisieren lassen und im elektrischen Fangbereich von den Mikroelektroden abgestoßen werden (negative Dielektrophorese).
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einer Anordnung eines fluidischen Mikrosystems 91, einer Beleuchtungseinrichtung 92 zur Erzeugung eines optischen Käfigs in einer Mikroelektrodenanordnung des Mikrosystems 91, wobei das Mikrosystem 91 und die Beleuchtungseinrichtung 92 mit einer Verstelleinrichtung 93 relativ zueinander verstellbar sind, und einer Beobachtungs- und/oder Sensoreinrichtung 94 (z.B. Mikroskop), wie dies schematisch in Fig. 9 dargestellt ist. Das Mikrosystem ist mit Fluidik- und Potentialsteuereinrichtung 95 versehen, wie dies an sich bekannt ist. Die Beleuchtungseinrichtung 92 ist beispielsweise eine an sich bekannter Laser-Pinzette, die als Lichtquelle beispielsweise einen Diodenlaser oder einen Halbleiterlaser und zur Fokussierung eine Mikroskopanordnung enthält.

Claims (27)

  1. Verfahren zur Bestimmung oder Ausübung optisch induzierter Kräfte auf mindestens ein Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs mit den Schritten:
    a) Positionieren des Fokus in einer Mikroelektrodenanordnung mit einem elektrischen Feld, das einen dreidimensionalen elektrischen Fangbereich bildende Feldgradienten aufweist, mit Abstand vom Fangbereich, und
    b) Variation der Amplitude des elektrischen Feldes, der Lichtleistung der den optischen Käfig bildenden Lichtstrahlung und/oder des Abstands des Fangbereiches vom Fokus, um zu erfassen, unter welchen dieser variierten Feldeigenschaften eine Übergangsbewegung des Teilchens.vom Fokus zum Fangbereich oder umgekehrt erfolgt oder um eine zumindest zeitweilige Anordnung des Teilchens im Fangbereich bereitzustellen.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem zur Bestimmung optisch induzierter Kräfte ein Teilchen entweder im Fokus oder im Fangbereich angeordnet wird und die optisch induzierten Kräfte aus der Amplitude des elektrischen Feldes und dem Abstand des Fangbereiches vom Fokus bestimmt wird, bei denen die Übergangsbewegung des Teilchens vom Fokus zum Fangbereich bzw. umgekehrt erfolgt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei dem die Bestimmung der optisch induzierten Kräfte für alle interessierenden Raumrichtungen entsprechend der gegenseitigen Ausrichtung der Position des Fokus zum Fangbereich wiederholt wird.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, bei dem eine Kalibrierung des optischen Käfigs durch Ermittlung des Zusammenhangs zwischen der Lichtleistung zur Erzeugung des optischen Käfigs und den jeweils an einem Teilchen im optischen Käfig induzierten Kräften erfolgt.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem der Abstand zwischen dem Fokus und dem Fangbereich mindestens ein Zehntel des Teilchendurchmessers beträgt.
  6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Fangbereich ein Fangpunkt ist, der innerhalb des Strahlungsfeldes des optischen Käfigs liegt, so daß das Teilchen bei Erniedrigung oder Erhöhung der Amplitude der Elektrodensignale bzw. der Lichtleistung zwischen dem Fangpunkt und dem Fokus hin- und herspringt und der zugehörige Wert der Amplituden zur Bestimmung der optisch induzierten Kräfte verwendet wird.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem aufeinanderfolgend im Fangbereich eine Vielzahl von Teilchen angeordnet werden, die jeweils mit dem optischen Käfig in den Fangbereich und in diesem in vorbestimmter Position relativ zu gegebenenfalls im Fangbereich bereits vorhandenen Teilchen positioniert werden.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem eine Justierung der Lichtstrahlung des optischen Käfigs und/oder eine Bestimmung der Fanggüte, Symmetrie oder weitere Kalibrierungseigenschaften des optischen Käfigs erfolgt.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem auf der Grundlage der bestimmten optisch induzierten Kräfte eine Charakterisierung der Teilchen erfolgt.
  10. Verfahren zur Bestimmung von Bindungskräften zwischen mikroskopischen Teilchen, bei dem mindestens ein erstes Teilchen im Fokus eines optischen Kafigs und mindestens ein zweites Teilchen im dreidimensionalen Fangbereich einer Mikroelektrodenanordnung angeordnet werden, wobei für eine vorbestimmte Kontaktzeit die ersten und zweiten Teilchen in Kontakt gebracht und anschließend eine Variation der Amplitude des elektrischen Feldes, der Lichtleistung und/oder des Abstandes des Fangbereiches vom Fokus erfolgt, bis als Übergangsbewegung festgestellt wird, daß das erste Teilchen mit dem Fokus vom Fangbereich und dem zweiten Teilchen entfernt werden kann, wobei die Bindungskräfte zwischen den Teilchen aus der Amplitude des elektrischen Feldes und der Lichtleistung bei der Übergangsbewegung ermittelt werden.
  11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Elektroden der Mikroelektrodenanordnung alternierend mit um 180° phasenverschobenen Signalen und/oder mit rotationserzeugenden Signalen vorbestimmter Phasenaufspaltung beaufschlagt werden.
  12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Fangbereich durch mindestens eine Feldbarriere vom optischen Käfig getrennt ist.
  13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchenbewegungen optisch und/oder elektrisch detektiert werden.
  14. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen synthetische oder natürliche Teilchen mit einer Größe unterhalb von 200 µm sind.
  15. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Teilchen biologische Zellen oder deren Bestandteile sind.
  16. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Übergangsbewegung des Teilchens vom Fangbereich zum Fokus bzw. umgekehrt zur Justage des optischen Käfigs verwendet wird.
  17. Vorrichtung zur Bestimmung oder Ausübung optisch induzierter Kräfte auf mindestens ein Teilchen im Fokus eines optischen Käfigs, die umfaßt:
    ein fluidisches Mikrosystem mit einer Mikroelektrodenanordnung, die zur Ausbildung eines elektrischen Feldes mit einem dreidimensionalen elektrischen Fangbereich eingerichtet ist,
    eine Beleuchtungseinrichtung, die zur Ausbildung eines optischen Kafigs innerhalb der Mikroelektrodenanordnung des Mikrosystems eingerichtet ist, und
    eine Beobachtungs- und/oder Detektionseinrichtung zur Erfassung der Bewegung von Teilchen innerhalb der Mikroelektrodenanordnung.
  18. Vorrichtung gemaß Anspruch 17, bei der die Mikroelektrodenanordnung planare Elektroden umfaßt, die in Gruppen auf zwei voneinander beabstandeten Substraten angebracht sind, von denen mindestens ein Substrat transparent ist.
  19. Vorrichtung gemäß Anspruch 18, bei der das transparente Substrat eine Dicke von weniger als 500 µm besitzt.
  20. Vorrichtung gemäß Anspruch 18, bei der die Elektroden an aufeinanderzuweisenden Oberflächen der Substrate angebracht und die Substrate voneinander durch einen Abstandshalter getrennt sind, der einen Suspensionsraum bildet, in dem der Fokus des optischen Käfigs von der Beleuchtungseinrichtung durch eines oder beide Substrate eingekoppelt werden kann.
  21. Vorrichtung gemäß Anspruch 20, bei der der Suspensionsraum Teil einer Kanalstruktur ist, durch die die Teilchen mittels einer Lösungsströmung in das Feld der Mikroelektrodenanordnung führbar sind.
  22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei der die Mikroelektrodenanordnung eine Vielzahl von Elektroden umfaßt, die zur Erzeugung eines Multipolfeldes mit einer in x-, y- und/oder z-Richtung symmetrischen elektrischen Feldverteilung eingerichtet ist.
  23. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 22, bei der die Elektroden mit einer isolierenden, dielektrischen Schicht überzogen sind oder aus gegenüber der Suspensionsflüssigkeit im Mikrosystem im wesentlichen inerten Metallen bestehen.
  24. Vorrichtung gemäß Anspruch 23, bei der die Elektroden aus Platin, Titan, Tantal oder Gold bestehen.
  25. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 24, bei der die Elektroden mit halbleitertechnologischen Methoden in dreidimensionaler Form oder in Hybridtechnik ausgebildet sind.
  26. Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Kalibrierung einer Laser-Pinzette.
  27. Verwendung eines Verfahrens oder einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur selektiven Stimulation biologischer Zellen.
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