DE102008013623A1

DE102008013623A1 - Pharmazeutische Zusammensetzung zur Diagnose oder Behandlung von Zinkfinger Protein assoziierten Erkrankungen

Info

Publication number: DE102008013623A1
Application number: DE102008013623A
Authority: DE
Inventors: Volker Prof. Dr. Erdmann
Original assignee: Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2008-03-10
Publication date: 2009-09-24
Also published as: WO2009112022A2; WO2009112022A3

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuren, welche an Zinkfinger Proteine, beispielsweise das humane ZFY-Protein oder an das humane Glioblastom Oncogen Protein, binden, und deren Verwendungen.

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, welche zur Diagnose und/oder Behandlung des Glioblastoms geeignet sind, insbesondere Substanzen, welche an das humane Glioblastom Onkogen Protein binden.
Stand der Technik und Hintergrund der Erfindung
Das Glioblastom ist der häufigste Hirntumor. Etwa 12 bis 15% aller Hirntumore sind Glioblastome. Der Tumor tritt überwiegend bei Erwachsenen auf Die Inzidenz liegt in Europa und Nordamerika bei 2 bi 3 Neuerkrankungen auf 100.000 pro Jahr. Der Tumor ist rasch wachsend und Beschwerden stellen sich innerhalb weniger Wochen oder Monate ein. Hierzu zählen anhaltende Kopfschmerzen oder epileptische Anfälle. Auch können Lähmungen, Aphasien und Sehstörungen auftreten.
Die Diagnostik erfolgt meist mittels bildgebenden Verfahren, wie CT oder MRT.
Eine Therapie ist kaum möglich und ist im Wesentlichen auf die Linderung von Nebeneffekten, beispielsweise des vasogenen Ödems, beschränkt. Bestrahlungen und/oder neurochirurgische Operationen zur Entfernung des Tumorgewebes sind in aller Regel nicht erfolgreich, weil praktisch immer einzelne Tumorzellen das gesunde Gehirngewebe schon infiltrativ durchwandert haben und sich Rezidive bilden. Die 5-Jahres-Überlebensrate liegt unter 2%. Daher ist die Erkrankung als WHO Grad IV Erkrankung eingeteilt.
Mit der Bildung des Glioblastoms geht die Expression des humanen Glioblastom Onkogen Proteins einher. Dieses Molekül kann daher sowohl als Marker für diagnostische Zwecke, als auch als Target für eine Therapie, mit welcher zumindest das Wachstum verlangsamt werden kann, dienen.
Aptamere sind Nukleinsäurestrukturen (RNA oder DNA) welche an ein Targetmolekül beliebiger Art mit hoher Affinität und Selektivität bindet. Erhalten werden Aptamere aus Nukleinsäurebibliotheken mit meist randomisierten Sequenzen durch Kontaktierung der Nukleinsäuren einer solcher Bibliothek mit dem Targetmolekül und Selektion sowie selektive Amplifikation der mit hoher Affinität bindenden Nukleinsäuren.
Das Glioblastom Onkogen Protein ist ein sogenanntes Zinkfinger Protein. Zinkfinger Motive sind strukturelle Elemente der meisten Transkriptionsfaktoren und auch anderer regulatorischen Protein. Es wird vermutet, dass in menschlichen Zellen mehr als 2000 verschiedene Transkriptionsfaktoren mit Zinkfinger Motiven vorkommen. Zinkfinger Proteine können daher wichtige Zielmoleküle für Untersuchungen und Therapien von Erkrankungen sein, welche mit einer Störung der Transkription einhergehen.
Aus der Literaturstelle Zhai, G., et al, Biochemistry 40(7): 2032–2040 (2001) ist ein Aptamer bekannt, welches an das Wilm's Tumor Suppressor Protein WT1 bindet, welches ein Zinkfinger Protein ist. Ob und inwieweit eine Bindung auch an ein Zinkfinger Motiv des WT1 erfolgt ist nicht entnehmbar.
In der Literaturstelle US 2006-0128649 A1 ist der Einsatz von Aptameren zur Regulation der Genexpression beschrieben.
Das Zinkfinger Motiv des Human Male-Associated Protein (ZFY) eignet sich ausgezeichnet als Consensus Peptid, welches repräsentativ für Zinkfinger Motive vieler Zinkfinger Proteine ist.
In Bezug auf das Glioblastom wäre es einerseits wünschenswert, eine Diagnose sehr frühzeitig stellen zu können, und andererseits zumindest ein weiteres Wachstum oder die Bildung von Rezidiven zumindest zu reduzieren bzw. zu verlangsamen.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt daher das technische Problem zu Grunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, mit welchen das Glioblastom früh und mit hoher Empfindlichkeit diagnostiziert werden kann, sowie mit welchen das Tumorwachstum und die Bildung von Rezidiven zumindest reduziert werden kann. Der Erfindung liegt das weitere Problem zu Grunde, Aptamere zur Verfügung zu stellen, welche an ein Consensus Peptid eines Zinkfingers binden und sowohl für therapeutische Zwecke, als auch für diagnostische Zwecke eingesetzt werden können.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung oder diagnostische Zusammensetzung enthaltend eine isolierte Nukleinsäure oder mehrere verschiedene isolierte Nukleinsäuren, welche an ein Zink-Finger Motif einer ZF-Sequenz
X_a-(T oder F)-X-C-X_2-4-C-X₃-F-X₅-L-X₂-H-X_3-5-H-X_b
binden, wobei X jeweils und unabhängig voneinander eine beliebige natürliche Aminosäure ist, wobei untere Indizes eine Anzahl von aneinander gereihten Aminosäuren darstellen, wobei a = 0–20 und b = 0–20 ist, und wobei die Aminosäuren C, C, H und H der ZF-Sequenz an ein Zink-Ion gebunden sind.
Nukleinsäuren können als Nukleotidsequenz eine RNA, DNA, oder eine LNA enthalten, welche auch derivatisierte nicht-natürliche Nukleotide aufweisen kann. Von der Erfindung mit umfasst sind auch Nukleinsäuren mit zu in den vorliegenden Beschreibung offenbarten Sequenzen homologe Sequenzen, sowie zu solchen Sequenzen bzw. deren Homologe komplementäre Sequenzen. Homologe bezeichnet dabei Nukleinsäuresequenzen, welche mit einer der in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Sequenzen eine Homologie von zumindest 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNA LASERGENE, aufweist. Ein Homolog in der Terminologie der Erfindung ist zudem zwingend durch die Fähigkeit zur Bindung als Aptamer an Myeloma IgG Antikörper charakterisiert. Eine Komplementärnukleinsäure ist typischerweise eine Nukleinsäure deren Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz oder der Vollsequenz einer der hier beschriebenen Nukleinsäuren ist und an diese Teilsequenz bzw. Vollsequenz einen Nukleinsäure-Doppelstrang bildend bindet, also hieran hybridisiert.
Neben der Nukleotidsequenz kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure aber auch Moleküle enthalten, beispielsweise endständig der Nukleotidsequenz an das 5'- oder 3'-Ende oder an beide Enden, gebunden, welche keine Nukleotide enthalten. Beispiele hierfür sind Detektorsubstanzen, Antigene, welche vom Immunsystem des Patienten als körperfremd erkannt werden, oder auch Linkermoleküle, über welche eine Kopplung an andere Moleküle, beispielsweise fachübliche Moleküle zur Blockierung eines enzymatischen Abbaus der Nukleinsäure im Körper oder in Körperflüssigkeiten, wie Polyethylenglycol, ein Antigen oder eine Festphase stattfindet. Die Nukleinsäure kann aber natürlich auch direkt mit solchen anderen Molekülen gekoppelt sein, sofern die anderen Moleküle die Bindung an das Zinkfinger Motiv nicht blockieren.
Die Nukleinsäure selbst ist dabei stets ein Aptamer, bezogen auf eine spezifische zu bestimmende Substanz, hier ein Zinkfinger Motiv. In aller Regel wird es sich bei einer Koppelung einer erfindungsgemäßem Nukleinsäure an ein Linkermolekül um eine covalente Bindung handeln. Ein Linkermolekül ist beispielsweise ein organisches Molekül, welches bivalent ist und zur Verbindung der Nukleinsäure unter räumlichem Abstand zur festen Phase dient. Ein Linkermolekül kann dabei eine synthetisches organisches Molekül, beispielsweise Polymer, aber auch ein Biopolymer, beispielsweise ein Protein, Peptid oder eine Nukleinsäure sein. Der Begriff der Linkermoleküle umfasst dabei auch übliche Kopplungsreagenzien, wie die Molekülpaare Biotin/Streptavin bzw. Neutravidin. Dabei wird eines der Moleküle, beispielsweise Biotin, an die zu immobilisierende Substanz gebunden, im Falle der Nukleinsäure beispielsweise an das 5'-Ende, und das andere Molekül an die feste Phase. Zusätzlich zu solchen Kopplungsreagentien können aber auch noch die anderen vorstehend genannten Linkermoleküle zwischengeschaltet sein.
Ein Aptamer ist dabei eine (meist einzelsträngige) Nukleinsäure, welches analog einer Antikörper/Antigenaffinität (”Schlüssel/Schloss”) oder gemäß dem Bindungsmodell des induced fit eine Bindungsaffinität zu bestimmten Zielstrukturen auf molekularer Ebene aufweist. Es handelt sich folglich um nicht-kovalente Bindungen zur Zielstruktur, hier einem Zinkfinger Motiv.
Eine Detektorsubstanz ist eine beliebige Substanz, welche sich mittels physikalischer oder chemischer Nachweismethoden bestimmen lässt. Beispiele für physikalisch nachweisbare Detektorsubstanzen sind Stoffe, die Lumineszenz, i. e. Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, nach Exposition durch eine die Lumineszenz anregende Strahlung oder andere Energieform zeigen. Der Nachweis erfolgt durch Messung der Intensität der Lumineszenz bei deren Wellenlänge. Chemische Nachweismethoden umfassen die klassischen Färbemethoden der Biochemie, wozu auch beispielsweise direkte Markierungen einer Nukleinsäure, beispielsweise am 5'-Ende mit einem Farbstoff, zählen.
Als diagnostische Zusammensetzung werden alle üblichen Kombinationen (Mischungen, Koppelungen) einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit weiteren Substanzen, einschließlich Detektorsubstanzen, Linkersubstanzen oder Festphasen, wie im Folgenden beschrieben, bezeichnet, welche zur ex-vivo Bestimmung (qualitativ, halb-quantitativ oder quantitativ) von Proteinen mit Zinkfinger Motiven in entnommenen Körperflüssigkeiten oder Gewebeproben, wie entnommen oder fachüblich aufbereitet, geeignet sind.
Wesentlich für das Verständnis der Erfindung ist, dass nicht Aptamere gegen Zinkfinger Proteine als solche, sondern gegen Zinkfinger Motive zur Verfügung gestellt werden. Dadurch können erfindungsgemäße Aptamere wesentlich universeller eingesetzt werden, als Aptamere, welche gegen ein anderes Epitop eines Zinkfinger Proteins selektiert wurden.
Mit der Erfindung wird einerseits ein diagnostisches Mittel erreicht, welches mit hoher Empfindlichkeit sowie hoher Selektivität ein Protein mit Zinkfinger Motiv, beispielsweise das humane Glioblastom Oncogene Protein (GLI), durch Analyse eine Blutprobe bzw. Plasmaprobe, aber auch ggf. einer Gewebeprobe, detektiert werden kann. Falsch-negative ebenso wie falsch-positive Ergebnisse sind mit ungewöhnlich hoher Sicherheit ausgeschlossen, da die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit sehr hoher Selektivität und Affinität ausschließlich an das Zinkfinger Motiv, beispielsweise des GLI, binden.
Mit der Erfindung wird aber auch ein Mittel zur Verfügung gestellt, mit welchem selektiv Zinkfinger Proteine, beispielsweise GLI, inhibiert werden können. Dadurch wird die Erkrankung, insbesondere das Tumorwachstum und die Rezidivbildung, zumindest verlangsamt, insbesondere, wenn die Erkrankung frühzeitig, beispielsweise mit den erfindungsgemäßem diagnostischen Mitteln, detektiert werden kann. Es steht zu erwarten, dass die Lebenserwartung von erkrankten Patienten ganz erheblich verlängert wird, da die kurze Lebenserwartung auf dem schnellen Tumorwachstum bzw. der Rezidivbildung beruht.
Bevorzugt ist es in Bezug auf das Zinkfinger Motiv (ZF), wenn a = 0–5, insbesondere 2, und b = 0–5, insbesondere 1 oder 4, ist. Im Einzelnen kann die ZF-Sequenz
KTYQCQYCEKRFADSSNLKTHIKTKHSKEK (folgend auch ZFY oder CZF genannt), oder
KPYVCKLPGCTKRYTDPSSLRKHVKTVHG (folgend auch GLI genannt) sein.
Die eingesetzte Nukleinsäure kann eine der folgenden Nukleotidsequenzen aufweisen:

a) n_a-gg-n_b-(a oder g)-gg-n_c-ggg-n_d-gg-n_e wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–4, wobei c = 3, wobei d = 3, wobei e = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „acaactgccc, cgcaacac, ggcagcgact und cagc”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „gt, tc, ctt und ctat”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „cca, tca, und cta”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „gga, cta, cat und tat”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_e ausgewählt ist aus „aggcatttgtatactatgcggg, atgttgcgtcagacaggtcaagtg, agtcgtgcggtgcgtggacg und actggtatgcgactcagtgcccctca”, oder
b) n_a-g-(g oder c)-gggg-n_b-ggg-n_c-ggg-n_d wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–3, wobei c = 8, wobei d = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „tgtggcgaata und caac”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aa und cgt”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „aagtcgaa und ctccctca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „ttagtggcgtcctccc und tgatctgttgatccttagttccc”, oder
c) n_a-ggc-n_b-ctc-(t oder c)-acgca-n_c-tc-n_d-tggat-n_e-acggt-n_f wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–3, wobei c = 3, wobei d = 8, wobei e = 0–1 und wobei f = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „ccatc und cgca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aac und ct”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „cca und att”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „ttgagtgg und ctcgagaa”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_e ausgewählt ist aus „g oder kein Nukleotid”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_f ausgewählt ist aus „tcgcc und cccccttc”, oder
d) n_a-cgcc-n_b-ctgggacatgagca-n_c wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2, wobei c = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 0–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „aca, caccccaccgaccg und acacagcccctcgatg”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „ct und tc”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „aacgccctccactctctccactaaccc, atggcaccccacctgg und cacacagctctcc”, oder
e)
f) n_a-cctttaggacatgagcccc-n_b wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „aggcgggtacat, cggatgca und gtaaccggtaca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „gataactcccactcttctg, tttatcgacatcgactcccgcc und atccatagcagttgctgtc”, oder
g) n_a-(g oder kein Nukleotid)-ggacatgagc-n_b wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „acacgccctgt, cccgagcccccatcatat, gccaagatgcccccgtctacaccacgaccac, ccgatacagccggca, ccagcgcccatcccgaagggaaa, agacgcccatacgacttat, acaccctct, caccctgtggatctccccct, caccctgtggatctccccct und acacggaacgcgccccta”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aaacgccctccactctctccactaaccc, actgtattcgtccgctccctc, ccttctcg, tcatcaccactatcacagtacacccc, catcctcatagcattg, aaccgatctgccatcccgtg, gcatctaaatgtcaacggcctcctccggt, cttatgatgttatccgtgg, cttatgatgttatccgtgg und atctatcctcctcaccgattg”, oder
h)

Diese Sequenzen sind auch in den Figuren dargestellt, wobei im Falle von Abweichungen der vorstehenden Sequenzen von den Sequenzen der Figuren die Sequenzen der Figuren Vorrang haben. Dies gilt auch in bezug auf die Sequenzen der Zinkfinger Motive. Die Nukleinsäure kann insbesondere eine der Nukleotidsequenzen gemäß der Figuren enthalten oder hieraus bestehen, wobei t auch durch u ersetzt sein kann.
In der Variante als pharmazeutische Zusammensetzung zur Darreichung an einen erkrankten Patienten können erfindungsgemäß eingesetzte Nukleinsäuren auch mit weiteren Substanzen gekoppelt, insbesondere covalent gekoppelt sein. Die Kopplung wird dabei entweder direkt oder, bevorzugt, über ein Linkermolekül gegeben sein. Als weitere Substanzen kommen dabei beispielsweise körperfremde Antigene in Frage. Diese körperfremden Antigene werden von körpereigenen Immunsystem als körperfremd erkannt und angegriffen mit der Folge, dass das Antigen mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure sowie der daran gebundenen Glioblastom Onkogen Protein vom Körper selbst beseitig werden. Folglich wird das Tumorwachstum und/oder die Rezidivbildung gehemmt.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, ggf. in Verbindung mit sonstigen Molekülen, beispielsweise Linkermolekülen, Stabilisatoren gegen enzymatischen Abbau, und/oder körperfremden Antigenen, wird typischerweise in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und zur Darreichung an eine Person hergerichtet. Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäß eingesetzten pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise und grundsätzlich zur beliebigen Darreichung, beispielsweise oral oder zur Injektion, erfolgen. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i. v., i. p., i. m., s. c.), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Saccharide, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, oder Mischungen solcher Lösungsmittel genannt. Eine erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure, ggf. als Salz, in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter und vorgegebener Dosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist. Bevorzugt wird in der Regel die i. v. Injektion bzw. Infusion sein.
Die Erfindung lehrt auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Glioblastoms.
Die Erfindung lehrt des Weiteren ein Immobilisat enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche an die Oberfläche einer festen Phase gebunden, insbesondere covalent gebunden, ist, sowie ein Testkit enthaltend eine erfindungsgmäße Nukleinsäure nach oder ein erfindungsgemäßes Immobilisat. Solche Immobilisate bzw. Testkits können zur Untersuchung einer Körperflüssigkeit oder einer Gewebeprobe auf Vorhandensein oder Überexpression eine Proteins mit einem Zinkfinger Motiv, beispielsweise des Glioblastom Oncogen Proteins, verwendet werden, wobei ein solches Testkit dann als weitere Komponenten fachübliche Substanzen und Materialien zum qualitativen oder quantitativen Nachweis einer Bindung der Nukleinsäure an das Protein enthält. Erfindungsgemäße Immobilisate können im Übrigen auch zur Isolierung und Aufreinigung von Zinkfinger Proteinen aus Proben bzw. Lösungen mittels üblicher Chromatographiemethoden verwendet werden. Dann wird das Immobilisat in einer Säule oder dergleichen eingebracht und die Probe bzw. Lösung über die Säule geleitet. Dann wird, ggf. nach einer Waschverfahrensstufe, das Zinkfinger Protein eluiert und aufgefangen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung, wobei die Nukleinsäure entweder aus einer Nukleinsäurebibliothek isoliert und optional amplifiziert wird, oder wobei die Nukleinsäure synthetisiert und optional amplifiziert wird, und wobei die Nukleinsäure mit Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt oder hieran gebunden wird, welche in der Diagnostik oder der Pharmazie gebräuchlich sind.
In Hinblick auf Länder, in welchen therapeutische und diagnostische Verfahren patentierbar sind, betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung des Glioblastoms, wobei einer an dem Glioblastom erkrankten Person eine physiologisch wirksame Dosis einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung dargereicht wird.
Des Weiteren umfasst die Erfindung ein Verfahren zur ex vivo Untersuchung einer Körperflüssigkeit oder eine Gewebeprobe auf Vorhandensein und/oder Überexpression des humanen Glioblastom Onkogen Proteins, wobei die Körperflüssigkeit oder die Gewebeprobe mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kontaktiert und Bindungsereignisse detektiert, ggf. quantifiziert, werden.
Zu diagnostischen Zwecken lassen sich erfindungsgemäße Nukleinsäuren in den verschiedensten ex-vivo Assay-Formaten zur Detektion von Zinkfinger Proteinen, insbesondere des Glioblastom Onkogen Proteins, einsetzen, wovon einige folgend beispielhaft erläutert werden.
Zunächst ist es möglich, alle fachüblichen direkten Assays einzusetzen. Hierbei ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure typischerweise an einer Festphase immobilisiert. Mit dieser Festphase wird dann eine Probe, potentiell enthaltend das Zinkfinger Protein, beispielsweise eine Blut- oder Gewebeprobe, kontaktiert und inkubiert. Bindungsereignisse der Nukleinsäure mit dem Zinkfinger Protein werden dann in fachüblicher Weise detektiert und angezeigt. Solche Verfahren lassen sich qualitativ (ja/nein-Signal), halb-quantitativ, oder quantitativ ausführen.
Möglicherweise genauer, insbesondere, wenn eine quantitative Bestimmung des Zinkfinger Proteins gewünscht ist, bzw. empfindlicher sind kompetitive Verfahren, wovon einige Möglichkeiten folgend erläutert werden. Grundsätzlich sind aber auch alle anderen fachüblichen kompetitiven Verfahren einsetzbar.
Ein erstes kompetitives Verfahren umfasst die folgenden Verfahrensschritte: die Nukleinsäure wird in vorgegebener Menge durch Bindung an eine Festphase immobilisiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure wird mit einer Lösung, welche eine vorgegebene Menge an mit einer Detektorsubstanz verbundenem Zinkfinger Protein enthält, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundenem Zinkfinger Protein wird sodann einer Waschverfahrenstufe unterzogen, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundenen Detektorsubstanz-verbundenem Zinkfinger Protein wird sodann mit einer Lösung, beispielsweise einer Blut- oder Gewebeprobe eines Patienten, potentiell enthaltend zu bestimmendes Zinkfinger Protein, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, wobei das Detektorsubstanz-verbundenen Zinkfinger Protein und das zu bestimmende Zinkfinger Protein kompetitiv an die immobilisierte Nukleinsäure binden, entweder wird der Lösungsüberstand der Festphase mit Detektorsubstanz-verbundenem Zinkfinger Protein entnommen, und das Zinkfinger Protein in dem Überstand werden qualitativ oder quantitativ bestimmt, oder die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundenen Detektorsubstanz-verbundenem Zinkfinger Protein wird einer Waschverfahrenstufe unterzogen und die Detektorsubstanz des an die immobilisierte Nukleinsäure gebundenen Zinkfinger Proteins wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. Dabei kann die Zunahme der Detektorsubstanz in der Lösung oder die Abnahme der Detektorsubstanz an der Festphase gemessen werden.
Eine nochmals andere Variante eines erfindungsgemäßen Assays umfasst die folgenden Verfahrensschritten: die Nukleinsäure wird in vorgegebener Menge durch Bindung an eine Festphase immobilisiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure wird mit einer Lösung, welche eine vorgegebene Menge an mit einer Detektorsubstanz verbundener Komplementärnukleinsäure enthält, für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundener Komplementärnukleinsäure wird sodann einer Waschverfahrenstufe unterzogen, die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundener Komplementärnukleinsäure wird sodann mit einer Lösung enthaltend zu bestimmendes Zinkfinger Protein für eine vorgegebene Dauer kontaktiert, wobei die Komplementärnukleinsäure und das zu bestimmende Zinkfinger Protein kompetitiv an die immobilisierte Nukleinsäure binden, entweder wird der Lösungsüberstand der Festphase mit Komplementärnukleinsäure entnommen, und die Detektorsubstanz der Komplementärnukleinsäure in dem Überstand wird qualitativ oder quantitativ bestimmt, oder die Festphase mit immobilisierter Nukleinsäure und daran gebundener Komplementärnukleinsäure wird einer Waschverfahrenstufe unterzogen und die Detektorsubstanz der gebundenen Komplementärnukleinsäure wird qualitativ oder quantitativ bestimmt. In dieser Variante erfolgt die kompetitive Bindung zwischen der Nukleinsäure einerseits und dem Zinkfinger Protein sowie der Komplementärnukleinsäure andererseits.
Grundsätzlich kann eine Markierung der Nukleinsäure beliebig erfolgen, sei es mit anderen Farbstoffsubstraten, sei es durch eine direkte Markierung, beispielsweise am 5'-Ende.
Die Festphase kann bei vorstehend beschriebenen Varianten ein optischer Leiter sein, wobei die Detektorsubstanz zur spontanen oder angeregten Emission von Licht befähigt ist, wobei die Bestimmung der Detektorsubstanz mittels eines mit einem Ende des optischen Leiters verbundenen optischen Sensor erfolgt. Auf diesem Wege lassen sich auf einfache Weise Sensoren herstellen, welche elektrische Signale nach Maßgabe einer qualitativen oder quantitativen Detektion erzeugen. Mittels solcher Sensoren können Geräte zur Bestimmung von Zinkfinger Proteinen hergestellt werden, wobei lediglich eine Probe in eine Probenöffnung eingegeben werden muss und die Anwesenheit, ggf. quantitativ, der Zinkfinger Proteine auf einer Anzeigeeinheit angezeigt wird.
In einer weiteren Variante sind die folgenden Verfahrensschritte vorgesehen: die Nukleinsäure wird an einer negativen Elektrode einer elektrolytischen Zelle immobilisiert, die elektrolytische Zelle wird dann mit einer Lösung enthaltend die zu bestimmenden Zinkfinger Proteine versetzt und zugleich wird an die negative Elektrode für eine definierte Dauer ein negatives Potential, bezogen auf eine Gegenelektrode der elektrolytischen Zelle, gelegt, sodann wird der Gehalt an Wasserstoffperoxid in der Lösung der elektrolytischen Zelle bestimmt. Auf Grund der negativen Ladung an der negativen Elektrode werden bei Bindung zwischen Nukleinsäure und Zinkfinger Protein kovalente Addukte Protein/Nukleinsäure unter der Bildung von Wasserstoffperoxid gebildet. Dies kann wiederum elektrisch/elektronisch detektiert werden, so dass auch in dieser Variante ein Sensor geschaffen ist.
Die Erfindung betrifft daher des Weiteren auch ein Testsystem zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. zur Detektion von Zinkfinger Protein, beispielsweise des Glioblastom Onkogen Proteins, mit einer Festphase und/oder einer Lösung enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure. Die verschiedenen Varianten und weiteren Komponenten erfindungsgemäßer Testsysteme ergeben sich aus den vorstehenden Erläuterungen zu den erfindungsgemäßen Verfahren.
Schließlich betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure gemäß Anspruch 13.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1: Zwei Zinkfinger Peptide,
2: Dimerisierung eines Zinkfinger Peptids in Abhängigkeit der Zn Oxidation,
3: Circular Dichroismus (CD) Messungen an einem Zinkfinger Peptid in Abhängigkeit der Anwesenheit von Zn,
4: Nukleinsäuren, welche an den Gegenstand der 1a binden,
5: Nukleinsäuren, welche an den Gegenstand der 1b binden,
6: Messungen zur Affinität der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren,
7: Ergebnisse zur Abhängigkeit der Bindung von der Konformation der Zinkfinger Peptide,
8: Dissoziationskonstanten ausgewählter Nukleinsäuren,
9: Dissoziationskonstanten für eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Abhängig von der Länge,
10: Affinität einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Zn, und
11: Ergebnisse einer Abtrennung von Zinkfinger Protein aus einer Probe mittels erfindungsgemäßer Nukleinsäure.
In der 1 sind die beiden verwendeten Zinkfinger Peptide dargestellt. In der 1a ist ein Zinkfinger Peptid dargestellt, welches einem Zinkfinger Motiv des Human Male Associated Protein (CZF) entspricht und als Repräsentant einer Vielzahl von Zinkfinger Motiven dienen kann. Es handelt sich um eine klassische Konsensus Sequenz. Dieses Peptid wird folgend auch ZFY genannt. In der 1b ist das verwendete Zinkfinger Motiv des humanen Glioblastom Onkogen Proteins dargestellt. Gegen diese beiden Peptide wurden aus einer Nukleinsäurebibliothek bindende Nukleinsäuren auf fachübliche Weise selektiert.
Anhand der Ergebnisse der 2 und 3 erkennt man, dass die Sekundär- und/oder Tertiärstruktur des ZFY Peptids stark von dem Redox Zustand des Zinkatoms bzw. dessen Anwesenheit abhängt. In der 2 sieht man dass eine Oxidation des ZFY Peptids mit Zinkatom mittels Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) zu deutlich unterschiedlichen Retentionszeiten in einer HPLC Trennung führen. Das oxidierte Dimer hat eine Retentionszeit von 14.0 min., während die reduzierte Form eine Retentionszeit von 14,3 min. aufweist. Ausweislich der CD-Messungen der 3 weist das Metall-freie ZFY Peptid ein unstrukturiertes Polypeptid Gerüst auf, während mit der Zugabe von Zink sich Minima bei 208 nm und 220 nm ausbilden, welche indikative für eine alpha-Helix sind.
In der 4 sind erfindungsgemäße Nukleinsäuren eines Pools I dargestellt, welche an ZFY binden. Links sind den Klonen Bezeichnungen zugeordnet. Der rechte Klammerausdruck gibt die Anzahl der identischen Sequenzen im Pool an. Konservierte Nukleotide sind unter jeder Gruppe angegeben.
In der 5 sind erfindungsgemäße Nukleinsäuren eines Pools II dargestellt, welche an GLI binden. Links sind den Klonen Bezeichnungen zugeordnet. Der rechte Klammerausdruck gibt die Anzahl der identischen Sequenzen im Pool an. Konservierte Nukleotide sind unter jeder Gruppe angegeben.
Alle die genannten Nukleinsäuren binden an die jeweiligen Zinkfinger Protein in Anwesenheit von Zink.
In der 6a sieht man, dass erfindungsgemäße Nukleinsäuren an ZFY binden, nicht jedoch an ein Kontrollpeptid, BSA oder die Matrix. In der 6b erkennt man entsprechende Ergebnisse für Nukleinsäuren, die an GLI binden.
In der 7 sind Ergebnisse dargestellt, welche zeigen, dass eine Bindung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren (hier Pool I) an Zinkfinger Proteine (hier ZFY) recht stark von der Konformation des ZFY Peptids abhängt. Bei Anwesenheit von Zink im ZFY Peptid ist die Bindung am höchsten, während die Bindung bei Abwesenheit von Zink oder Ersatz des Zinks durch Kobalt oder Cadmium vergleichsweise geringer ist.
In der 8 sind einige Werte für Dissoziationskonstanten einiger Nukleinsäuren der 4 angegeben. In der 9 ist für eine der Nukleinsäuren aus der 4, nämlich R18, gezeigt, dass auch trunkierte Varianten binden. Dies belegt die Relevanz der Konservierten Bereiche der 4, wobei die Bereiche a einerseits und die am gegenüberliegenden Ende liegenden Bereiche für das Funktionieren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren relativ irrelevant sind. Der 9 sind des Weiteren die Sekundärstrukturen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren entnehmbar.
In der 10 ist die Affinität der Bindung der Nukleinsäure B15 aus der 4 an das ZFY Peptid entnehmbar, und zwar insbesondere auch in Hinblick auf die Anwesenheit von Zn, und folglich der natürlichen Konformation des Zinkfinger Proteins. Man erkennt, dass zum ZFY Peptid mit Zink eine hohe Affinität besteht, in Vergleich zum ZFY Peptidohne Zn. Des Weiteren ist dieser Figur auch die Sekundärstruktur der Nukleinsäure B15 entnehmbar.
Schließlich sind der 10 Ergebnisse zur Affinitäts-Bindung von Zinkfinger Proteinen aus einem nukleären Extrakt von Hela Zellen zu entnehmen. Als erfindungsgemäße Nukleinsäure wurde B15 (I) aus der 4 eingesetzt. Poly(dI-dC) wurde als unspezifischer Kompetitor eingesetzt. Spuren 1 bis 3 sind das erste, zweite und dritte Eluat des an B15 gebundenen Proteins, Spur 4 ist das nukleäre Extrakt der Hela Zellen und Spuren 5 bis 7 sind das erste, zweite und dritte Eluat gebundenen Proteins an die Negativkontrolle. Bei den Pfeilen A und B wurden die Banden ausgeschnitten und mittels MALDI-MS als die Zinkfinger Proteine RBP56 und FUS identifiziert. Banden an den gleichen Stellen in der Kontrolle (Pfeile C und D) wurde entsprechend gemessen. Die Bande C konnte nicht identifiziert werden, die Bande bei D ist Serum Albumin.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- US 2006-0128649 A1 [0009]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Zhai, G., et al, Biochemistry 40(7): 2032–2040 (2001) [0008]

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung oder diagnostische Zusammensetzung enthaltend eine isolierte Nukleinsäure oder mehrere verschiedene isolierte Nukleinsäuren, welche an ein Zink-Finger Motif einer ZF-Sequenz X_a-(T oder F)-X-C-X_2-4-C-X₃-F-X₅-L-X₂-H-X_3-5-H-X_b binden, wobei X jeweils und unabhängig voneinander eine beliebige natürliche Aminosäure ist, wobei untere Indizes eine Anzahl von aneinander gereihten Aminosäuren darstellen, wobei a = 0–20 und b = 0–20 ist, und wobei die Aminosäuren C, C, H und H der ZF-Sequenz an ein Zink-Ion gebunden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei a = 0–5, insbesondere 2, und b = 0–5, insbesondere 1 oder 4, ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die ZF-Sequenz
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäure eine der folgenden Nukleotidsequenzen aufweist: a) n_a-gg-n_b-(a oder g)-gg-n_c-ggg-n_d-gg-n_e wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–4, wobei c = 3, wobei d = 3, wobei e = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „acaactgccc, cgcaacac, ggcagcgact und cagc”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „gt, tc, ctt und ctat”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „cca, tca, und cta”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „gga, cta, cat und tat”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_e ausgewählt ist aus „aggcatttgtatactatgcggg, atgttgcgtcagacaggtcaagtg, agtcgtgcggtgcgtggacg und actggtatgcgactcagtgcccctca”, oder b) n_a-g-(g oder c)-gggg-n_b-ggg-n_c-ggg-n_d wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–3, wobei c = 8, wobei d = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „tgtggcgaata und caac”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aa und cgt”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „aagtcgaa und ctccctca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „ttagtggcgtcctccc und tgatctgttgatccttagttccc”, oder c) n_a-ggc-n_b-ctc-(t oder c)-acgca-n_c-tc-n_d-tggat-n_e-acggt-n_f wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–3, wobei c = 3, wobei d = 8, wobei e = 0–1 und wobei f = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „ccatc und cgca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aac und ct”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „cca und att”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „ttgagtgg und ctcgagaa”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_e ausgewählt ist aus „g oder kein Nukleotid”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_f ausgewählt ist aus „tcgcc und cccccttc”, oder d) n_a-cgcc-n_b-ctgggacatgagca-n_c wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2, wobei c = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 0–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „aca, caccccaccgaccg und acacagcccctcgatg”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „ct und tc”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „aacgccctccactctctccactaaccc, atggcaccccacctgg und cacacagctctcc”, oder e)
f) n_a-cctttaggacatgagcccc-n_b wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „aggcgggtacat, cggatgca und gtaaccggtaca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „gataactcccactcttctg, tttatcgacatcgactcccgcc und atccatagcagttgctgtc”, oder g) n_a-(g oder kein Nukleotid)-ggacatgagc-n_b wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „acacgccctgt, cccgagcccccatcatat, gccaagatgcccccgtctacaccacgaccac, ccgatacagccggca, ccagcgcccatcccgaagggaaa, agacgcccatacgacttat, acaccctct, caccctgtggatctccccct, caccctgtggatctccccct und acacggaacgcgccccta”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aaacgccctccactctctccactaaccc, actgtattcgtccgctccctc, ccttctcg, tcatcaccactatcacagtacacccc, catcctcatagcattg, aaccgatctgccatcccgtg, gcatctaaatgtcaacggcctcctccggt, cttatgatgttatccgtgg, cttatgatgttatccgtgg und atctatcctcctcaccgattg”, oder h)
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Nukleinsäure eine der Nukleotidsequenzen der Figuren enthält oder hieraus besteht, wobei t durch u ersetzt sein kann.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nukleinsäure in physiologisch wirksamer Dosis mit galenischen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und zur Darreichung an eine Person hergerichtet ist.
Verwendung einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 13 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung des Glioblastoms.
Immobilisat enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 13, welche an die Oberfläche einer festen Phase gebunden, insbesondere covalent gebunden, ist.
Testkit enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 13 oder ein Immobilisat nach Anspruch 8.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nukleinsäure entweder aus einer Nukleinsäurebibliothek isoliert und optional amplifiziert wird, oder wobei die Nukleinsäure synthetisiert und optional amplifiziert wird, und wobei die Nukleinsäure mit Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt oder hieran gebunden wird, welche in der Diagnostik oder der Pharmazie gebräuchlich sind.
Verfahren zur Behandlung des Glioblastoms, wobei einer an den Glioblastom erkrankten Person eine physiologisch wirksame Dosis einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dargereicht wird.
Verfahren zur ex vivo Untersuchung einer Körperflüssigkeit oder eine Gewebeprobe auf Vorhandensein und/oder Überexpression des humanen Glioblastom Oncogen Proteins, wobei die Körperflüssigkeit oder die Gewebeprobe mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 13 kontaktiert und Bindungsereignisse detektiert werden.
Isolierte Nukleinsäure mit einer der folgenden Nukleotidsequenzen: a) n_a-gg-n_b-(a oder g)-gg-n_c-ggg-n_d-gg-n_e wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–4, wobei c = 3, wobei d = 3, wobei e = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „acaactgccc, cgcaacac, ggcagcgact und cagc”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „gt, tc, ctt und ctat”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „cca, tca, und cta”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „gga, cta, cat und tat”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_e ausgewählt ist aus „aggcatttgtatactatgcggg, atgttgcgtcagacaggtcaagtg, agtcgtgcggtgcgtggacg und actggtatgcgactcagtgcccctca”, oder b) n_a-g-(g oder c)-gggg-n_b-ggg-n_c-ggg-n_d wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–3, wobei c = 8, wobei d = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „tgtggcgaata und caac”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aa und cgt”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „aagtcgaa und ctccctca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „ttagtggcgtcctccc und tgatctgttgatccttagttccc”, oder c) n_a-ggc-n_b-ctc-(t oder c)-acgca-n_c-tc-n_d-tggat-n_e-acggt-n_f wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2–3, wobei c = 3, wobei d = 8, wobei e = 0–1 und wobei f = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „ccatc und cgca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aac und ct”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „cca und att”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_d ausgewählt ist aus „ttgagtgg und ctcgagaa”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_e ausgewählt ist aus „g oder kein Nukleotid”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_f ausgewählt ist aus „tcgcc und cccccttc”, oder d) n_a-cgcc-n_b-ctgggacatgagca-n_c wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 2, wobei c = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 0–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „aca, caccccaccgaccg und acacagcccctcgatg”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „ct und tc”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_c ausgewählt ist aus „aacgccctccactctctccactaaccc, atggcaccccacctgg und cacacagctctcc”, oder e)
f) n_a-cctttaggacatgagcccc-n_b wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „aggcgggtacat, cggatgca und gtaaccggtaca”, und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „gataactcccactcttctg, tttatcgacatcgactcccgcc und atccatagcagttgctgtc”, oder g) n_a-(g oder kein Nukleotid)-ggacatgagc-n_b wobei n jeweils und unabhängig voneinander ein beliebiges Nukleotid sein kann, wobei a = 0–z, wobei b = 0–z ist, wobei z eine beliebige natürliche Zahl größer als 0 ist, und wobei t durch u ersetzt sein kann, wobei vorzugsweise z = 0–200, insbesondere 4–100, ist, wobei weiterhin vorzugsweise n_a ausgewählt ist aus „acacgccctgt, cccgagcccccatcatat, gccaagatgcccccgtctacaccacgaccac, ccgatacagccggca, ccagcgcccatcccgaagggaaa, agacgcccatacgacttat, acaccctct, caccctgtggatctccccct, caccctgtggatctccccct und acacggaacgcgccccta und/oder wobei weiterhin vorzugsweise n_b ausgewählt ist aus „aaacgccctccactctctccactaaccc, actgtattcgtccgctccctc, ccttctcg, tcatcaccactatcacagtacacccc, catcctcatagcattg, aaccgatctgccatcccgtg, gcatctaaatgtcaacggcctcctccggt, cttatgatgttatccgtgg, cttatgatgttatccgtgg und atctatcctcctcaccgattg”, oder h)