DE102007047188A1 - Analytic measurement of sample material e.g. sturgeon-species for receiving images of the sample material through electromagnetic radiation by fluorescence microscope, comprises reducing concentration of sturgeon-species within the chamber - Google Patents
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- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer analytischen Messung von Probenmaterial, insbesondere zur Aufnahme eines Bildes des Probenmaterials mittels elektromagnetischer Strahlung, insbesondere mittels Fluoreszenzmikroskopie, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
- a) Anordnen von Probenmaterial innerhalb einer Probenkammer;
- b) Verringern der Konzentration einer Stör-Spezies innerhalb der Probenkammer;
- c) Erfassen von Messwerten.
- a) placing sample material within a sample chamber;
- b) reducing the concentration of a spurious species within the sample chamber;
- c) Acquisition of measured values.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Probenträger-System zur Durchführung einer analytischen Messung von Probenmaterial, insbesondere zur Aufnahme eines Bildes des Probenmaterials mittels elektromagnetischer Strahlung, insbesondere mittels Fluoreszenzmikroskopie, mit
- a) einer Probenkammer, innerhalb welcher das Probenmaterial anordenbar ist;
- b) Mitteln, durch welche die Konzentration wenigstens einer Stör-Spezies innerhalb der Probenkammer verringerbar ist.
- a) a sample chamber within which the sample material can be arranged;
- b) means by which the concentration of at least one spurious species within the sample chamber can be reduced.
Unter den Begriff Probenkammer soll hier auch eine Probenaufnahme fallen, welche in eine oder mehrere Richtungen offen ist, beispielsweise eine nach oben offene Küvette.Under the term sample chamber should also include a sample holder here, which is open in one or more directions, for example one upwardly open cuvette.
Vor der Erfassung analytischer Messwerte ist üblicherweise eine Präparation des zu vermessenden Probenmaterials notwendig. Wenn dazu Probenmaterial innerhalb einer Probenkammer angeordnet wird, kommt es häufig vor, dass dabei neben dem Probenmaterial auch Vertreter von Spezies in die Probenkammer gelangen können, welche die Durchführung der analytischen Messung stören oder zumindest die Qualität des Messergebnisses vermindern.In front the acquisition of analytical measurements is usually a preparation of the sample material to be measured is necessary. When doing so, sample material is placed inside a sample chamber It often happens that in addition to the sample material also representatives of species can get into the sample chamber, which disturb the performance of the analytical measurement or at least reduce the quality of the measurement result.
Wenn
zur Erfassung von Messwerten beispielsweise die an und für
sich bekannte Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden soll, kann
eine solche Stör-Spezies beispielsweise in Form von Triplett-Sauerstoff
vorliegen. Dieser ist aus folgenden Gründen für
die Messung bzw. das Messergebnis störend:
Bei der
Fluoreszenzmikroskopie werden als Hilfssubstanzen spezielle Fluorophore
als Fluoreszenzmarker eingesetzt, welche an dem zu untersuchenden Probenmaterial
ankoppeln. Bei biologischem Probenmaterial kann diese Ankopplung
heutzutage beispielsweise über Antikörper hochselektiv
erfolgen. Die Fluorophore absorbieren eine auf die Probenkammer
abgegebene Anregungsstrahlung und fluoreszieren eine Strahlung,
welche gegenüber der Anregungsstrahlung eine etwas größere
Wellenlänge hat. Diese Fluoreszenzstrahlung wird im obigen
Verfahrensschritt c) detektiert und daraus ein Fluoreszenzbild des
Probenmaterials berechnet.If, for example, the fluorescence microscopy known per se should be used to acquire measured values, such an interfering species can be in the form of triplet oxygen, for example. This is disturbing for the following reasons for the measurement or the measurement result:
In fluorescence microscopy, special fluorophores are used as auxiliary markers as fluorescence markers, which couple to the sample material to be examined. In the case of biological sample material, this coupling can now be carried out highly selectively, for example via antibodies. The fluorophores absorb an excitation radiation emitted onto the sample chamber and fluoresce a radiation which has a slightly larger wavelength than the excitation radiation. This fluorescence radiation is detected in method step c) above and from this a fluorescence image of the sample material is calculated.
Durch die Erfassung von Messwerten werden also für das gewählte analytische Verfahren spezifische Daten erhalten, welche zu einem Messergebnis ausgewertet werden können. Die Erfassung von Messwerten kann mehrere Male erfolgen, wobei unter Umständen zwischen zwei Erfassungen von Messwerten ein zeitlicher Abstand liegt. Für die Fluoreszenzmikroskopie bedeutet dies, dass mehrere Fluoreszenzbilder hintereinander aufgenommen werden und die erhaltenen Daten zu einem Gesamt-Fluoreszenzbild akkumuliert werden können.By the acquisition of measured values are thus for the selected Analytical procedures obtained specific data which to a Measurement result can be evaluated. The capture of Readings can be done multiple times, and under certain circumstances a time interval between two acquisitions of measurements lies. For fluorescence microscopy, this means that several fluorescence images are taken in succession and the data obtained accumulates to a total fluorescence image can be.
Bei der Fluoreszenzmikroskopie verwendete Fluorophore können jedoch empfindlich auf ihre Umgebung regieren, insbesondere auf anwesenden Sauerstoff.at fluorophores used in fluorescence microscopy can however, they are sensitive to their environment, especially on present oxygen.
Häufig kommt es durch die Anregungsenergie zu einer Spinumkehr der äußeren Elektronen der Fluorophore, welche dann mit Elektronen von in der Probenkammer anwesendem Sauerstoff im Grundzustand, d. h. von Triplett-Sauerstoff, ausgetauscht werden können. Auf diese Weise wird der Triplett-Sauerstoff in reaktiven Singulett-Sauerstoff umgewandelt. Anders ausgedrückt kann also ein angeregtes Fluorophor-Molekül mit Triplett-Sauerstoff reagieren, wobei das Fluorophor-Molekül in seinen Grundzustand übergeht und aus dem Triplett-Sauerstoff reaktiver Singulett-Sauerstoff entsteht. Der Singulett-Sauerstoff kann dann die Fluorophore irreversibel oxidieren. Dadurch kommt es zu einem Ausbleichen der Fluorophore, dem so genannten "Photobleaching", da die oxidierten Fluorophore keine detektierbare Fluoreszenzstrahlung mehr abgeben. Durch das Ausbleichen der Fluorophore nimmt die Qualität der aufgenommenen Bilder mit fortschreitender Zeit ab.Often it comes through the excitation energy to a spin reversal of the outer Electrons of the fluorophores, which then with electrons from in the sample chamber present oxygen in the ground state, d. H. of triplet oxygen, can be exchanged. In this way, the triplet oxygen converted into reactive singlet oxygen. In other words So can an excited fluorophore molecule with triplet oxygen react, whereby the fluorophore molecule changes into its ground state and from the triplet oxygen reactive singlet oxygen is formed. The singlet oxygen can then make the fluorophores irreversible oxidize. This leads to a fading of the fluorophores, the so-called "photobleaching", since the oxidized fluorophores no more detectable fluorescence radiation. By the Bleaching the fluorophore decreases the quality of the recorded Images as time progresses.
Andere Stör-Spezies sind beispielsweise NO und andere Radikale, welche während der Erfassung von Messwerten innerhalb der Probenkammer vorliegen.Other Sturgeon species are, for example, NO and other radicals, which during the acquisition of measured values within the Sample chamber present.
Es
ist bekannt, bei mikroskopischen Aufnahmen zeitlich vor der eigentlichen
Erfassung von Messwerten im Rahmen der Probenpräparation
die Konzentration der Stör-Spezies innerhalb der Probenkammer
derart zu verringern, dass deren Anwesenheit keinen negativen Einfluss
auf die Messung oder das Messergebnis mehr hat, oder die Stör-Spezies
ganz aus der Probenkammer zu beseitigen. Beides soll nachstehend
unter den Begriff "entfernen" fallen. Im Hinblick auf die Stör-Spezies
Sauerstoff gibt es dazu gemäß
Die Probenpräparation, d. h. insbesondere das Befüllen der Probenkammer und das Entfernen von Vertretern einer Stör-Spezies aus der Probenkammer, erfolgt üblicherweise zeitlich verhältnismäßig weit vor der eigentlichen Erfassung von Messwerten.The Sample preparation, d. H. in particular the filling the sample chamber and the removal of representatives of a Stör species from the sample chamber, usually takes place relatively in time far before the actual acquisition of measured values.
Es kann jedoch Nachteile haben, wenn eine Stör-Spezies bereits bei der Probenpräparation aus der Probenkammer entfernt wird. Dies ist beispielsweise bei biologischem Probenmaterial der Fall, wenn lebende Zellen untersucht werden sollen, da diese nach verhältnismäßig kurzer Zeit absterben, nachdem der Sauerstoff aus der Probenkammer entfernt wurde. Die Erfassung von Messwerten muss in diesem Fall unmittelbar nach dem Entfernen von Sauerstoff aus der Probenkammer durchgeführt werden und kann auch nur so lange durchgeführt werden, bis die Zellen abgestorben sind.It However, it can have disadvantages if a sturgeon species already removed during sample preparation from the sample chamber becomes. This is the case of biological sample material, for example Case, when living cells are to be examined, since these after die off after a relatively short time the oxygen was removed from the sample chamber. The capture In this case, readings must be taken immediately after removal be carried out by oxygen from the sample chamber and can only be done until the Cells have died.
Darüber hinaus muss sorgfältig darauf geachtet werden, dass die Probenkammer absolut dicht ist im Hinblick auf eine Diffusion von Vertretern einer Stör-Spezies in die Probenkammer hinein. Entsprechend ist die Herstellung einer geeigneten Probenkammer häufig verhältnismäßig aufwändig und kostenintensiv. Darüber hinaus muss eine derartige Probenkammer vorsichtig gehandhabt werden, um ein zufrieden stellendes Messergebnis zu erhalten.About that In addition, care must be taken to ensure that the Sample chamber is absolutely tight with respect to a diffusion of Representatives of an interfering species into the sample chamber. Accordingly, the production of a suitable sample chamber is common relatively expensive and expensive. In addition, such a sample chamber must be handled carefully to get a satisfactory result to obtain.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren und ein Probenträger-System der eingangs genannten Art derart auszugestalten, dass die Probenkammer baulich einfacher gehalten werden kann und dass die Lebensdauer von gegebenenfalls nötigen Hilfssubstanzen, die empfindlich auf die Anwesenheit von Stör-Spezies reagieren, und von umgebungsempfindlichem Probenmaterial verlängert werden kann.task The invention therefore provides a method and a sample carrier system of the type mentioned above in such a way that the sample chamber can be structurally simpler and that the life of possibly necessary auxiliary substances which are sensitive react to the presence of sturgeon species, and of be extended to environmentally sensitive sample material can.
Diese Aufgabe wird im Hinblick auf das Verfahren dadurch gelöst, dass dieses außerdem folgende Schritte umfasst:
- d) Bereitstellen eines aktivierbaren Materials, welches nach seiner Aktivierung derart mit Vertretern einer Stör-Spezies wechselwirkt, dass die Konzentration der Stör-Spezies innerhalb der Probenkammer abnimmt;
- e) Aktivieren des aktivierbaren Materials.
- d) providing an activatable material which, upon activation, interacts with species of a spurious species such that the concentration of spurious species within the sample chamber decreases;
- e) Activating the activatable material.
Das aktivierbare Material wird also zusammen mit dem Probenmaterial innerhalb der Probenkammer angeordnet, geht jedoch ohne Aktivierung keine oder zumindest keine unerwünschte Wechselwirkung oder Reaktion mit anderen Substanzen innerhalb der Probenkammer ein. Daher kann die Probe bereits weit im Voraus präpariert werden, ohne dass die Gefahr besteht, dass das Probenmaterial bis zum Zeitpunkt der Erfassung von Messwerten zerstört wird.The activatable material is thus together with the sample material arranged within the sample chamber, but goes without activation no or at least no unwanted interaction or reaction with other substances within the sample chamber. Therefore, can the sample can already be prepared far in advance, without that there is a risk that the sample material will remain until the time of the Detection of measured values is destroyed.
Aktiviertes Material allerdings reagiert mit Vertretern der Stör-Spezies und verändert diese so, dass die Konzentration der Stör-Spezies innerhalb der Probenkammer abnimmt und diese keinen Einfluss mehr auf die Messung oder das Messergebnis hat.activated Material, however, reacts with representatives of the Stör species and change them so that the concentration of the interfering species within the sample chamber decreases and these no longer influence on the measurement or the measurement result.
Es besteht somit die Möglichkeit, aktiviertes Material erst unmittelbar vor der Erfassung von Messwerten zur Verfügung zu stellen, indem das aktivierbare Material erst unmittelbar vor dem Verfahrensschritt c), dem Erfassen von Messwerten, aktiviert wird. Wenn Messwerte mehrere Male mit jeweils einem zeitlichen Abstand dazwischen erfasst werden, d. h. wenn der Verfahrensschritt c) mehrere Male durchgeführt wird, kann das aktivierbare Material auch zwischen zwei Schritten c) aktiviert werden. Darüber hinaus kann das aktivierbare Material auch während der Durchführung von Schritt c) aktiviert werden, sofern dies die Durchführung von Schritt c) nicht stört.It Thus, it is possible, activated material only immediately before the acquisition of measured values to put by the activatable material only immediately before the method step c), the detection of measured values activated becomes. If readings multiple times, each with a time interval caught in between, d. H. if method step c) several times is performed, the activatable material can also between two steps c) are activated. Furthermore The activatable material can also during the implementation of step c) are activated, if this is the implementation of step c) does not bother.
Im Hinblick auf Sauerstoff als Stör-Spezies bedeutet dies, dass der für lebende Zellen notwendige Sauerstoff tatsächlich nur für den Zeitraum der Erfassung von Messwerten aus der Probenkammer entfernt ist, wobei dieser Zeitraum ohne Sauerstoff von den Zellen überstanden werden kann, ohne dass sie absterben.in the With regard to oxygen as a spurious species this means that the necessary oxygen for living cells actually only for the period of acquisition of measured values from the Sample chamber is removed, this period without oxygen from Cells can be withstood without dying.
Es kann günstig sein, wenn die Probenkammer nicht absolut gasdicht ist, sondern die Diffusion von Vertretern der Stör- Spezies in die Probenkammer hinein wenigstens so lange verzögert, bis alle Messwerte erfasst worden sind, d. h. Schritt c) so häufig durchgeführt worden ist, wie es für ein gutes Messergebnis notwendig ist. Eine Diffusion von Sauerstoff in die Probenkammer hinein kann sogar erwünscht sein, wenn nur so ein Überleben von lebenden Zellen nach der Erfassung von Messwerten gewährleistet ist.It may be favorable if the sample chamber is not absolutely gastight, but delays the diffusion of representatives of the interfering species into the sample chamber at least until all measured values have been detected, ie step c) has been carried out as frequently as it is is necessary for a good measurement result. Diffusion of oxygen into the sample chamber may even be desirable if only to survive the cells is guaranteed after the acquisition of measured values.
Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 15 angegeben.advantageous Further developments of the method are in the claims. 2 to 15 indicated.
Es ist unter anderem günstig, wenn das aktivierbare Material verteilt in einem Trägermaterial bereitgestellt wird. Als Trägermaterial kommen vorzugsweise eine Flüssigkeit, ein Gel oder einzelne Trägerpartikel in Betracht; es kann sich bei dem Trägermaterial jedoch auch um eine Folie handeln, in welche das aktivierbare Material eingebettet ist.It is favorable among other things, if the activatable material distributed in a carrier material is provided. When Carrier material is preferably a liquid, a gel or individual carrier particles into consideration; it can however, the support material is also a foil, in which the activatable material is embedded.
Es kann vorteilhaft sein, wenn das aktivierbare Material innerhalb der Probenkammer bereitgestellt wird. Abhängig von den Versuchsbedingungen kann es vorteilhaft sein, wenn das aktivierbare Material oder bereits aktiviertes Material kurz vor und/oder während der Durchführung von Schritt c) in die Probenkammer eingebracht wird.It may be advantageous if the activatable material within the sample chamber is provided. Depending on the Experimental conditions, it may be advantageous if the activatable Material or already activated material shortly before and / or during the implementation of step c) introduced into the sample chamber becomes.
Es besteht somit die Möglichkeit, aktivierbares Material erst unmittelbar vor der Erfassung von Messwerten zur Verfügung zu stellen, indem das aktivierbare Material erst unmittelbar vor dem Verfahrensschritt c), dem Erfassen von Messwerten, in die Probenkammer eingebracht wird. Wenn Messwerte mehrere Male mit jeweils einem zeitlichen Abstand dazwischen erfasst werden, d. h. wenn der Verfahrensschritt c) mehrere Male durchgeführt wird, kann das aktivierbare Material auch zwischen zwei Schritten c) in die Probenkammer eingebracht werden. Darüber hinaus kann das aktivierbare Material auch während der Durchführung von Schritt c) in die Probenkammer eingebracht werden, sofern dies die Durchführung von Schritt c) nicht stört.It Thus there is the possibility, activatable material only immediately before the acquisition of measured values to put by the activatable material only immediately before the method step c), the acquisition of measured values, in the sample chamber is introduced. When readings multiple times with one each time interval between them are detected, d. H. if the process step c) is performed several times, the activatable Material also between two steps c) introduced into the sample chamber become. In addition, the activatable material can also during the implementation of step c) introduced into the sample chamber unless this is the implementation of step c) disturbs.
In dem Fall, dass das aktivierbare Material kurz vor und/oder während der Durchführung von Schritt c) in die Probenkammer eingebracht wird, kann auch ein aktivierbares Material verwendet werden, welches selbst bereits mit dem zu vermessenden Probenmaterial reagieren kann. In diesem Fall muss das in die Probenkammer eingebrachte aktivierbare Material unmittelbar nach dem Einbringen in die Probenkammer aktiviert werden.In In the event that the activatable material shortly before and / or during the implementation of step c) introduced into the sample chamber is also an activatable material can be used which already react with the sample material to be measured can. In this case, the activated in the sample chamber introduced Material activated immediately after insertion into the sample chamber become.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, das aktivierbare Material außerhalb der Probenkammer zu aktivieren und entsprechend als bereits aktiviertes Material in die Probenkammer einzubringen. Das bereits aktivierte Material sollte im Wesentlichen nur mit Vertretern der entsprechenden Stör-Spezies reagieren, nicht jedoch mit dem Probenmaterial.A Another possibility is the activatable material to activate outside the sample chamber and accordingly as already activated material into the sample chamber. The already activated material should essentially only with representatives the corresponding spur species react, but not with the sample material.
Dabei kann es vorteilhaft sein, wenn das aktivierbare oder das bereits aktiviertes Material im Durchfluss durch die Probenkammer gefördert wird. In diesem Fall kann auch ein Reaktionsprodukt aus aktiviertem Material und einem oder mehreren Vertretern der Stör-Spezies aus der Probenkammer abgeführt werden.there It may be advantageous if the activatable or the already Activated material conveyed through the sample chamber in the flow becomes. In this case, a reaction product of activated Material and one or more representatives of the Stör species be removed from the sample chamber.
Abhängig von dem ausgewählten aktivierbaren Material kann es günstig sein, wenn die Aktivierung des aktivierbaren Materials durch elektromagnetische Strahlung, durch Anlegen einer Spannung, durch Erzeugen eines Magnetfeldes, durch Einstellen einer Temperatur, durch Einstellen eines pH-Wertes oder durch Zuführen eines Aktivierungsreagenz zu dem aktivierbaren Material erfolgt.Dependent of the selected activatable material may be favorable be when the activation of the activatable material by electromagnetic Radiation, by applying a voltage, by generating a magnetic field, by adjusting a temperature, by adjusting a pH or by supplying an activating reagent to the activatable one Material takes place.
Dabei ist es insbesondere vorteilhaft, wenn die Aktivierung des aktivierbaren Materials durch UV-Licht, insbesondere durch UV-C-Licht, erfolgt. UV-Licht liegt in einem Wellenlängenbereich von 400 nm bis 100 nm, wobei UV-C-Licht Wellenlängen von 280 nm bis 100 nm umfasst.there it is particularly advantageous if the activation of the activatable Material by UV light, in particular by UV-C light occurs. UV light lies in a wavelength range from 400 nm to 100 nm, wherein UV-C light comprises wavelengths from 280 nm to 100 nm.
Im Hinblick auf molekularen Sauerstoff, welcher häufig als Stör-Spezies wirkt, ist es günstig, wenn das aktivierbare Material derart ausgewählt wird, dass es nach seiner Aktivierung als Sauerstoff-Fänger wirkt.in the With regard to molecular oxygen, which is often referred to as Sturgeon species acts, it is beneficial if the activatable Material is selected such that after its activation acts as an oxygen scavenger.
Dabei umfasst das aktivierbare Material vorzugsweise eine oder mehrere der nachfolgenden Substanzen: einen Übergangsmetallkatalysator; eine oxidierbare organische Verbindung; eine ungesättigte Kohlenwasserstoffverbindung; ein reduziertes Chinon; einen reduzierbaren Farbstoff; eine elektromagnetische Strahlung absorbierende Carbonylverbindung; ein Polymer mit einem Polymergerüst, einer freien olefinischen Seitengruppe und einer die Seitengruppe mit dem Polymergerüst verbindenden Gruppe; ein Polymer mit zyklischen ungesättigten Gruppen am Polymergerüst; ein Copolymer aus Ethylen und einem gespannten zyklischen Alken; ein Ethylen/Vinyl-Copolymer; Ascorbat; Isoascorbat; ein Sulfit; einen Übergangsmetall-Komplex oder ein -Chelat einer Polycarbonsäure, von Salicylsäure oder einem Polyamin; Tannin; ein reduziertes Metall wie insbesondere Eisen; ein photoaktives Halbleitermaterial, insbesondere TiO2, ZnO, WO3. Wenn eine oxidierbare organische Verbindung, ein ungesättigter Kohlenwasserstoff oder Ascorbat eingesetzt werden sollen, werden diese vorzugsweise zusammen mit einem Übergangsmetallkatalysator verwendet.In this case, the activatable material preferably comprises one or more of the following substances: a transition metal catalyst; an oxidizable organic compound; an unsaturated hydrocarbon compound; a reduced quinone; a reducible dye; an electromagnetic radiation absorbing carbonyl compound; a polymer having a polymer backbone, a pendant free olefinic group and a group linking the side group to the polymer backbone; a polymer having cyclic unsaturated groups on the polymer backbone; a copolymer of ethylene and a strained cyclic alkene; an ethylene / vinyl copolymer; ascorbate; isoascorbate; a sulfite; a transition metal complex or chelate of a polycarboxylic acid, salicylic acid or a polyamine; tannin; a reduced metal such as iron in particular; a photoactive semiconductor material, in particular TiO 2 , ZnO, WO 3 . When an oxidizable organic compound, an unsaturated hydrocarbon or ascorbate is to be used, they are preferably used together with a transition metal catalyst.
Vorzugsweise umfasst das aktivierbare Material Polyethylen/Methylacrylat/Cyclohexenylmethacrylat, welches unter der Abkürzung EMCM bekannt ist.Preferably comprises the activatable material polyethylene / methyl acrylate / cyclohexenyl methacrylate, which is known by the abbreviation EMCM.
Wenn ein Übergangsmetallkatalysator eingesetzt wird, ist es vorteilhaft, wenn dieser ein Cobaltkatalysator ist.If It is a transition metal catalyst is used advantageous if this is a cobalt catalyst.
Um die Einhaltung geeigneter Versuchsbedingungen überwachen zu können, ist es vorteilhaft, wenn wenigstens ein Parameter der in der Probenkammer herrschenden Bedingungen erfasst wird.In order to ensure compliance with suitable test conditions To be able to monitor conditions, it is advantageous if at least one parameter of the conditions prevailing in the sample chamber conditions is detected.
Im Hinblick auf die Stör-Spezies Sauerstoff ist es insbesondere vorteilhaft, wenn die Sauerstoffkonzentration innerhalb der Probenkammer erfasst wird.in the With regard to the interfering species oxygen it is particular advantageous if the oxygen concentration within the sample chamber is detected.
Eine gute Möglichkeit zur Erfassung eines Parameters der in der Probenkammer herrschenden Bedingungen besteht darin, ein Indikatormaterial zu verwenden.A good way to capture a parameter of in the sample chamber prevailing conditions is an indicator material to use.
Dieses kann z. B. einen oder mehrere Farbstoffe umfassen, welche durch Sauerstoff gequencht werden. Auch können Farbstoffe als Indikator dienen, die durch Umsetzung einer Ausgangsverbindung, beispielsweise eines Enzyms, mit Sauerstoff entstehen. Darüber hinaus können beispielsweise Farbstoffe verwendet werden, die durch Bindung oder Anlagerung von Sauerstoff ihre Farbe ändern, wie z. B. das Häm.This can z. B. comprise one or more dyes, which by Oxygen will be quenched. Also, dyes can be used as Indicator serve by reacting a starting compound, for example of an enzyme, arise with oxygen. Furthermore For example, dyes can be used which change their color by binding or adding oxygen, such as B. the heme.
Das Indikatormaterial umfasst vorzugsweise Ru(bpy-pyr)(bpy)2, Methylenblau und/oder einen Xanthen-Farbstoff.The indicator material preferably comprises Ru (bpy-pyr) (bpy) 2 , methylene blue and / or a xanthene dye.
Bei Ru(bpy-pyr)(bpy)2 handelt es sich um einen Farbstoff, welcher durch anwesenden molekularen Sauerstoff reversibel gequencht wird und welcher auch bei lebenden Zellen eingesetzt werden kann. In an und für sich bekannter Weise kann die Intensität der Fluoreszenzstrahlung dieses Farbstoffs mit der Sauerstoffkonzentration innerhalb der Probenkammer korreliert werden.Ru (bpy-pyr) (bpy) 2 is a dye which is reversibly quenched by the presence of molecular oxygen and which can also be used in living cells. In a manner known per se, the intensity of the fluorescence radiation of this dye can be correlated with the oxygen concentration within the sample chamber.
Methylenblau kann in Verbindung mit geeigneten Detergenzien ein Indikatormaterial bilden, welches bei einer Sauerstoffkonzentration von etwa 0,1 Vol% durchsichtig wird.methylene blue may be an indicator material in conjunction with suitable detergents form, which at an oxygen concentration of about 0.1 vol% becomes transparent.
Ein geeigneter Xanthen-Farbstoff wird beispielsweise von der Firma Merck als "Phloxin B für die Mikroskopie" unter der Marke Certistain® vertrieben. Ein Indikatormaterial auf der Basis von Phloxin B zeigt eine Sauerstoffkonzentration von vorzugsweise beispielsweise kleiner als 0,2 Vol% durch eine Pinkfärbung und eine Sauerstoffkonzentration von größer als 0,5 Vol% durch eine Blaufärbung an.A suitable xanthene dye is sold for example by Merck as "Phloxine B for microscopy" branded Certistain ®. An indicator material based on phloxine B indicates an oxygen concentration of preferably, for example, less than 0.2% by volume by a pink color and an oxygen concentration of greater than 0.5% by volume by a blue coloration.
Im Hinblick auf das Probenträger-System der eingangs genannten Art wird die oben angegebene Aufgabe dadurch gelöst, dass das Probenträger-System
- c) ein aktivierbares Material umfasst, welches nach seiner Aktivierung derart mit Vertretern der Stör-Spezies wechselwirkt, dass die Konzentration der Stör-Spezies innerhalb der Probenkammer abnimmt;
- d) Aktivierungsmittel umfasst, durch welche das aktivierbare Material aktivierbar ist.
- c) comprises an activatable material which interacts with representatives of the interfering species after its activation in such a way that the concentration of the interfering species within the sample chamber decreases;
- d) activating agent, by which the activatable material is activated.
Vorteilhafte Weiterbildungen des Probenträger-Systems sind in den abhängigen Ansprüchen 17 bis 33 angegeben. Die dadurch erzielten Vorteile entsprechen sinngemäß den oben zu den Verfahrensansprüchen erläuterten Vorteilen.advantageous Further developments of the sample carrier system are in the dependent Claims 17 to 33 specified. The advantages achieved thereby Correspond, mutatis mutandis, the above to the method claims explained advantages.
Im Hinblick auf das Indikatormaterial ist es günstig, wenn dieses in der Probenkammer angeordnet ist oder Indikator-Fördermittel vorgesehen sind, durch welche Indikator- Material aus einem Reservoir in die Probenkammer hinein förderbar ist. So kann von Beginn der Erfassung von Messwerten an oder auch während der Erfassung von Messwerten der gewünschte Parameter der in der Probenkammer herrschenden Bedingungen überwacht werden.in the With regard to the indicator material, it is beneficial if this is arranged in the sample chamber or indicator conveyor are provided by which indicator material from a reservoir in the sample chamber is conveyed into it. So can from the beginning the acquisition of measured values or during the acquisition of measured values, the desired parameters of the prevailing in the sample chamber Conditions are monitored.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachstehend anhand der Zeichnungen näher erläutert. In diesen zeigen:embodiments The invention will be described below with reference to the drawings explained. In these show:
In
Diese
weist einen plattenförmigen Objektträger
Unter
Einhaltung eines Abstandes von der Folie
Die
Folie
Das
Probenmaterial
In
den nicht von Probenmaterial
Wenn
die Sauerstoffkonzentration im Innenraum
Auch
andere eingangs genannte Substanzen kommen als aktivierbare Substanz
des aktivierbaren Materials
Neben
dem aktivierbaren Material
Das
Probenträger-System
Zur Durchführung einer analytischen Messung wird dieses Probenträger-System beispielsweise in ein Fluoreszenzmikroskop integriert, welches hier der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt ist.to Carrying out an analytical measurement becomes this sample carrier system For example, integrated into a fluorescence microscope, which here for the sake of clarity is not shown.
Die
unabhängig von einer Strahlungsquelle des Fluoreszenzmikroskops
ansteuerbare Strahlungsquelle
Die
Strahlung
Durch
diese Reaktion wird Sauerstoff verbraucht, weshalb die Sauerstoffkonzentration
innerhalb der Probenkammer
Das
bedeutet, dass die fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme nach der
Aktivierung des aktivierbaren Materials
Die
Reaktion des Indikatormaterials
Die
Aktivierung des aktivierbaren Materials
Es
ist vielmehr ausreichend, wenn die Strahlungsquelle
Über
im Wesentlichen den gesamten Zeitraum, der zur vollständigen
Erfassung von Messwerten erforderlich ist, kann somit eine derart
niedrige Sauerstoffkonzentration in der Probenkammer
Im
Hinblick auf die in den
Bei
dem in
Bei
der in
In
Insbesondere
wenn das aktivierbare Material
Die
Probenkammer
Dadurch,
dass hier die Flüssigkeit
Der
Abgabestutzen
Der
Zuführstutzen
Die
Pumpe
Der
Durchfluss durch die Probenkammer
In
Eine
andere Art der Aktivierung des aktivierbaren Materials
Die
Pumpe
Die
Aktivierung des aktivierbaren Materials
Soll
ein geeignetes aktivierbares Material
Die
Probenkammer
Auch eine an und für sich bekannte SPIM ("Selective Plane Illumination Microscopy")-Probenkammer ist geeignet. Eine solche kann während der Messung kontinuierlich mit einem Inertgas wie Stickstoff oder einem Edelgas durchspült werden. In eine SPIM-Probenkammer kann das Probenmaterial über Dichtungssysteme eingebracht werden; die SPIM-Probenkammer ist gasdicht, so dass über die Dauer der Messung hinweg eine Diffusion von Vertretern einer Stör-Spezies wie Sauerstoff unterbunden ist.Also a well-known SPIM ("Selective Plane Illumination Microscopy ") - sample chamber is suitable measuring continuously with an inert gas such as nitrogen or to be flushed through a noble gas. In a SPIM sample chamber The sample material can be introduced via sealing systems become; the SPIM sample chamber is gas tight, allowing over the duration of the measurement a diffusion of representatives of a Sturgeon species such as oxygen is prevented.
Als
Alternative oder Ergänzung zu dem Indikatormaterial
Sollen
die Bedingungen innerhalb der Probenkammer
Zur
besseren Reinigung kann die Probenkammer
Wenn
die Probenkammer
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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature
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