DE102005048187B4 - Apparatus and method for measuring parameters for determining paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures - Google Patents

Abstract

Einrichtung zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen mit folgenden apparativen Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes (6):
– mindestens einer die Zellkultur (16) enthaltende Filtereinrichtung (2) zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur (16) mittels einer Messung der jeweiligen Eingangskonzentration K_E und des Eingangsvolumens V_E mindestens eines fluoreszierenden Markers (23) in einer, die Zellkultur (16) mit hydrostatischem Druck belastenden Flüssigkeitssäule (17) sowie mit einem ersten Drucksensor (27) zur Regelung der Flüssigkeitssäule (17),
– mindestens einem Fluoreszenzphotometer (3) zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration K_A des durch die Zellkultur (16) der Filtereinrichtung (2) diffundierenden Markers (23) und
– einem Impedanzspektrometer (7) zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur (16),
– mindestens einem Füllstandsmesser (4) mit einem zweiten Drucksensor (26) zur Messung von durch die Zellkultur (16) hindurch tretender Flüssigkeitsmenge mittels einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens...Device for measuring parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures with the following apparatus components within an open fluid circuit (6):
At least one filter device (2) containing the cell culture (16) for analyzing transcytosis processes in the cell culture (16) by means of a measurement of the respective input concentration K _E and the input volume V _{E of} at least one fluorescent marker (23) in one, the cell culture (16 ) fluid column (17) loading with hydrostatic pressure and with a first pressure sensor (27) for regulating the fluid column (17),
- At least one fluorescence photometer (3) for detecting a respective initial concentration K _A of the cell culture (16) of the filter device (2) diffusing marker (23) and
An impedance spectrometer (7) for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture (16),
- At least one level gauge (4) with a second pressure sensor (26) for measuring through the cell culture (16) passing through liquid amount by means of a second liquid column (31) and for determining an initial volume ...

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung und ein Verfahren zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen.The The invention relates to a device and a method for measuring of parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of Cell cultures.

Das Gesamtphänomen des Durchtritts von Substanzen durch flächenmäßig zusammenhängende Zellen hindurch wird durch Permeabilitäten definiert. Prinzipiell können zwei Formen von Permeabilitätsänderungen unterschieden werden. Einmal der transzelluläre Transport von Substanzen oder Wasser durch eine Zelle hindurch mit Hilfe einer zellulären Maschinerie oder der parazelluläre Tranport zwischen angrenzenden Zellen hindurch.The total phenomenon the passage of substances through coalesced cells passing through permeabilities Are defined. In principle, you can two forms of permeability changes be differentiated. Once the transcellular transport of substances or water through a cell with the help of a cellular machinery or the paracellular Tranport between adjacent cells.

Endothelzellen bilden als Grenzschicht zwischen intra- und extravasalem Raum eine semipermeable Barriere, die zudem unterschiedlichen physikalischen Einflüssen – Schubspannung, Blutdruck, Dehnung – ausgesetzt ist und sowohl den Austausch von im Blut gelösten Substanzen als auch die Passage korpuskulärer Elemente (Zellen) kontrolliert. Diese prinzipiellen Verhältnisse treffen ebenso für andere Grenzflächen bildende Zellschichten, zu denen z. B. Epithelien der Lunge, des Magens, des Darms, der Niere und Mesothelien von Hohlräumen und Lymphendothelien gehören, zu.endothelial form a boundary layer between intra- and extravasal space semipermeable barrier, which also has different physical Influences - shear stress, Blood pressure, stretching - exposed is and both the exchange of substances dissolved in the blood as well as the Passage corpuscular Controls elements (cells). These basic conditions meet as well other interfaces forming cell layers to which z. B. epithelia of the lung, the Stomach, intestine, kidney and mesothelia of cavities and Lymphendothelia belong, to.

Als Grenzflächen können Epithelzellen und Endothelzellen Ziel unterschiedlicher Stimuli werden, die auf verschiedenen Signalwegen unterschiedlichen Wegen zu einer Permeabilitäts-Zunahme führen. Solche Störungen kommen im Rahmen zahlreicher Erkrankungen vor, wie z. B. bei akuten und chronischen Entzündungsaktionen, Autoimmunerkrankungen u. a. Die Aufklärung der Mechanismen ist von generellem Interesse um die Pathogenese und gegebenenfalls als Basis zur Konzeptionierung therapeutischer Ansätze zu verstehen.When interfaces can Epithelial cells and endothelial cells target different stimuli be different ways on different signaling paths lead to a permeability increase. Such disorders occur in the context of numerous diseases such. In acute and chronic inflammatory actions, Autoimmune diseases u. a. The explanation of the mechanisms is general Interest in the pathogenesis and possibly as a basis for conception therapeutic approaches to understand.

Ein Verfahren zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER einer Zellkultur zwischen zwei Elektroden ist in der Druckschrift von Wahl-Jensen, V. M. u. a.: Effects of Ebola virus glycoproteins an endothelial cell activation and barrier function, J. Virol., Aug. 2005, 79, 16, p. 10442–50 beschrieben. Dabei wird die Konzentration des durch eine Filtereinrichtung mit der Flüssigkeit transportierten Markers in einem unteren Kompartiment der Filtereinrichtung mittels eines Fluoreszenzphotometers gemessen. Als Vergleichsflüssigkeit wird Wasser verwendet. Von beiden Flüssigkeiten werden Leitfähigkeitsmessungen durchgeführt. Aus den ermittelten Kurven werden Schlüsse auf die Permeabilität gezogen.One Method for measuring the electrical transendothelial resistance TER of a cell culture between two electrodes is in the publication of Wahl-Jensen, V.M. a .: Effects of Ebola virus glycoproteins endothelial cell activation and barrier function, J. Virol., Aug. 2005, 79, 16, p. 10442-50. In this case, the concentration of the by a filter device with the liquid transported marker in a lower compartment of the filter device measured by means of a fluorescence photometer. As comparison liquid water is used. Both liquids become conductivity measurements carried out. From the determined curves conclusions are drawn on the permeability.

Es werden die Messungen in Form von Einzelmessungen durchgeführt, wobei die Schlussfolgerungen auf die vorhandene Permeabilität mit einem großen Fehler behaftet sind.It the measurements are carried out in the form of individual measurements, where the conclusions on the existing permeability with a big mistake are affected.

Ein Verfahren zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER einer Zellkultur ist in der Druckschrift Gaillard P. J. & De Boer A. G: Relationship between permeability status of the blond-brain barrier and in vitro permeability coefficient of a drug, Eur. J. Pharm. Sci., 2000, 12, 2, p. 95–102 beschrieben, wobei der Widerstand zwischen zwei Elektroden aus Leitfähigkeitsmessungen ermittelt und daraus eine Berechnung eines Permeabilitätskoeffizienten durchgeführt wird. Es wird der Zusammenhang zwischen parazellulärer Permeabilität und Leitfähigkeitsmessungen für zwei verschiedene Marker in Kurven dargestellt. Der Permeabilitätskoeffizient wird durch eine Formel mit Größen angegeben, die den Markerdurchsatz, die Fläche der Filterzellkultur sowie die Marker-Eingangskonzentration darstellen. Aus dem Markerdurchsatz wird auf eine parazelluläre Permeabilität geschlossen.One Method for measuring the electrical transendothelial resistance TER of a cell culture is in the publication Gaillard P.J. & De Boer A. G: Relationship between permeability status of the blond-brain barrier and in vitro permeability coefficient of a drug, Eur. J. Pharm. Sci., 2000, 12, 2, p. 95-102 described, wherein the resistance between two electrodes from conductivity measurements determined and from this a calculation of a permeability coefficient is performed. It becomes the connection between paracellular permeability and conductivity measurements for two various markers shown in curves. The permeability coefficient is indicated by a formula with sizes, the marker throughput, the area represent the filter cell culture and the marker input concentration. From the marker throughput is concluded that paracellular permeability.

Auch hier werden die Messungen nur in Form von Einzelmessungen durchgeführt, die zu einem mit einem größeren Fehler behafteten Permeabilitätskoeffizienten führen.Also Here, the measurements are carried out only in the form of individual measurements, the to one with a bigger mistake affected permeability coefficients to lead.

Eine Fortführung des vorgenannten Verfahrens zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER einer Zellkultur ist in der Druckschrift Gaillard P. J. u. a.: Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blond-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes, Eur. J. Pharm. Sci., 2001, 12, 3, p. 215–222 beschrieben, wobei im Wesentlichen die gleichen Messungen durchgeführt werden und im Vordergrund die Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER unter Einsatz der gleichen Marker wie in dem vorgenannten Verfahren steht. Auch hier wird anhand der jeweiligen Markerdurchsätze auf eine Permeabilität der Zellkultur geschlossen.A continuation of the aforementioned method for measuring the electrical transendothelial Resistance TER of a cell culture is in the publication Gaillard P.J. a .: Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blond-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes, Eur. J. Pharm. Sci., 2001, 12, 3, p. 215-222 described, wherein essentially the same measurements are performed and in the foreground the measurement of the electrical transendothelial Resistant TER using the same markers as in the above Procedure is. Again, based on the respective marker throughputs a permeability the cell culture closed.

Es werden die Messungen in Form von Einzelmessungen durchgeführt, so dass aus nur wenigen Parametern eine Einschätzung der eigentlich von vielen Faktoren und Parametern beeinflussten und abhängigen Permeabilität erfolgt, die dadurch aber mit relativ großem Fehler behaftet ist.It the measurements are carried out in the form of individual measurements, so that from just a few parameters an assessment of actually many Factors and parameters influenced and dependent permeability occurs, but this is fraught with a relatively large error.

Eine Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER sowie des parazellulären Flusses einer Flüssigkeit mit dem unterschiedliche Eingangskonzentrationen aufweisenden Marker Fluorescein-isothiocyanat(FITC)-Dextran durch eine Monoschicht einer Zellkultur ist in der Druckschrift Roux, K. J. u. a.: Modulation of epithelial morphology, monolayer permeability, and cell migration by growth arrest specific 3/peripheral myelin Protein 22, Mol. Biol. Cell, März 2005, 16, 3, S. 1142–1151 beschrieben, wobei die Zellkultur sich in einer Filtereinrichtung befindet.A measurement of the electrical transendothelial resistance TER as well as the paracellular flow of a liquid with the different input marker fluorescein isothiocyanate (FITC) - dextran by a monolayer of a cell culture is in the document Roux, KJ et al.: Modulation of epithelial morphology, monolayer permeability, and cell migration by growth arrest specific 3 / peripheral myelin protein 22, Mol. Biol. Cell, March 2005, 16, 3, pp. 1142-1151, wherein the cell culture is in a filter device.

Es werden die Messungen in Form von Einzelmessungen durchgeführt, wobei bei der Komplexität der Permeabilität die Durchführung von nur Leitfähigkeitsmessungen bzw. von Widerstands ermittlungen eine Aussage über die Permeabilität ermöglicht, die mit großen Fehlern behaftet ist.It the measurements are carried out in the form of individual measurements, where in the complexity the permeability the implementation of only conductivity measurements or by resistance investigations allows a statement about the permeability, the with big Is flawed.

Mit den Einzelmessungen in allen angegebenen Verfahren ist keine Differenzierung in die verschiedenen Permeabilitäten, in die parazelluläre und die transzelluläre Permeabilität, und deren Bestimmung möglich. Die ermittelten Permeabilitäten basieren auf einer anteilsverschiedenen und damit auf einer große Fehler aufweisenden Überlagerung der beiden Permeabilitäten.With the individual measurements in all specified methods is no differentiation into the different permeabilities, in the paracellular and the transcellular Permeability, and their determination possible. The determined permeabilities are based on a proportionate and thus on a big mistake having overlay the two permeabilities.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung und ein Verfahren zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen (engl. paracellular-transcellular permeability analyses system) anzugeben, die derart geeignet ausgebildet sind, dass die transzelluläre (transzytotische) Permeabilität und die parazelluläre Permeabilität von Zellen mittels Marker (engl. tracer) schnell, präzise und kostengünstig ermittelt werden können. Es soll insbesondere auch ein Nachweis von geringen Konzentrationen der Marker bei einer Markierungsrate von 1% gewährleistet werden.Of the Invention is based on the object, a device and a method for measuring parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of Cell cultures (paracellular-transcellular permeability analyzes System), which are designed so suitable that the transcellular (transcytotic) permeability and the paracellular permeability of cells by means of markers (English tracer) fast, precise and economical can be determined. In particular, it should also be a proof of low concentrations the markers are guaranteed at a labeling rate of 1%.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale der Patentansprüche 1 und 22 gelöst.The The object is solved by the features of claims 1 and 22.

Die Einrichtung zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen ist gemäß Patentanspruch 1 mit folgenden apparativen Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes versehen:

• – mindestens einer die Zellkultur enthaltenden Filtereinrichtung zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur mittels einer Messung der jeweiligen Eingangskonzentration K_E und des Eingangsvolumens V_E min destens eines fluoreszierenden Markers in einer, die Zellkultur mit hydrostatischem Druck belastenden Flüssigkeitssäule sowie mit einem ersten Drucksensor zur Regelung der Flüssigkeitssäule,
• – mindestens einem Fluoreszenzphotometer zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration K_A des durch die Zellkultur der Filtereinrichtung diffundierenden Markers und
• – einem Impedanzspektrometer zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur,
• – mindestens einem Füllstandsmesser mit einem zweiten Drucksensor zur Messung von durch die Zellkultur hindurch tretender Flüssigkeitsmenge mittels einer zweiten Flüssigkeitssäule und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens V_A der Flüssigkeit mit dem darin befindlichen Marker,
• – mindestens einer Pumpe zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes, die mit der Filtereinrichtung in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung, das Fluoreszenzphotometer, der Füllstandsmesser und die Pumpe sich im Flüssigkeitskreislauf befinden, sowie
• – einem Computersystem zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten P_p, P_t als Funktionen der Parameter K_E, K_A, TER, V_E, V_A mittels einer programmtechnischen Massenbilanzierung.

The device for measuring parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures is provided according to claim 1 with the following apparatus components within an open fluid circuit:

• - At least one cell culture containing filter device for analysis of transcytosis processes in the cell culture by means of a measurement of the respective input concentration K _E and the input volume V _{E at} least one fluorescent marker in a, the cell culture with hydrostatic pressure burdening liquid column and a first pressure sensor for controlling the liquid column,
• - At least one fluorescence photometer for detecting a respective initial concentration K _A of diffusing through the cell culture of the filter device marker and
• An impedance spectrometer for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture,
• At least one level gauge with a second pressure sensor for measuring the quantity of liquid passing through the cell culture by means of a second liquid column and for determining an initial volume V _{A of} the liquid with the marker therein;
• - At least one pump for maintaining the liquid circuit, which is in communication with the filter device, wherein the filter device, the fluorescence photometer, the level gauge and the pump are in the liquid circuit, and
• - A computer system for measurement control and evaluation and to display the permeabilities P _p , P _t as functions of the parameters K _E , K _A , TER, V _E , V _A by means of a program-technical mass balancing.

Die Filtereinrichtung weist ein oberes Kompartiment und ein unteres Kompartiment auf, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer mit einem darin einsetzbaren Filtereinsatz befindet, in dem zumindest die Zellkultur in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist.The Filter device has an upper compartment and a lower compartment Compartment on, between both compartments a down porous small-volume chamber with a filter insert insertable therein in which at least the cell culture is in the form of a layer from coherent Cells is present.

In der nach oben freien Kammer auf der Zellkultur lastet eine erste Flüssigkeitssäule von vorzugsweise 10 cm, wobei die Kammer zur ersten Flüssigkeitssäule gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment zugeordneten Ringelektrode sowie von der ersten Flüssigkeitssäule abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment zugeordneten Elektrodenplatte zur Messung des transendothelialen Widerstandes TER mit Hilfe des Impedanzspektrometer in Verbindung steht und die Kammer in das obere Kompartiment einsetzbar ist und mit dem unteren Kompartiment über den Flüssigkeitskreislauf in Verbindung steht.In the upper free chamber on the cell culture has a first Liquid column of preferably 10 cm, the chamber being directed to the first liquid column with a ring electrode associated with the upper compartment as well averted from the first liquid column with an electrode plate assigned to the lower compartment for the measurement of transendothelial resistance TER with the help of Impedance spectrometer is in communication and the chamber in the upper Compartment is used and with the lower compartment over the Liquid circuit communicates.

Das obere Kompartiment kann im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule mindestens eine Zuführungsleitung zur gesteuerten Zugabe des Markers besitzen, der gemischt mit Wasser auf der Zellkultur lastet und oberhalb der Zellkultur und des Filtereinsatzes der Flüssigkeit des Kreislaufs zuführbar ist.The upper compartment can at least one supply line in the region of the first liquid column for the controlled addition of the marker mixed with water on the cell culture and above the cell culture and the filter cartridge the liquid the circulation fed is.

Der erste Drucksensor steht über eine fünfte Leitung mit dem Computersystem in Verbindung, mit dem die erste Flüssigkeitssäule ständig höhenmäßig und signaltechnisch überprüft wird.Of the first pressure sensor is over a fifth line in communication with the computer system, with which the first liquid column is always in height and is checked by signal technology.

Das Fluoreszenzphotometer kann als Detektionseinheit folgende Bauelemente/Baugruppen aufweisen:

• – eine Energieversorgungseinheit, an die
• – eine Lichtquelle angeschlossen ist,
• – eine erste Optik, der
• – ein Anregungsfilter nachgeordnet ist, wobei die Energieversorgungseinheit (36), die Lichtquelle (37), die erste Optik (38) und das Anregungsfilter (39) eine Anregungsanordnung bilden,
• – eine auf einer Haltevorrichtung angeordnete Durchflussküvette mit einem Küvettenzufluss und einem Küvettenabfluss, wobei sich in der Durchflussküvette die Flüssigkeit mit einem vorgesehenen Marker befindet,
• – eine zweite Optik,
• – ein Detektionsfilter,
• – eine dritte Optik sowie
• – ein Detektor,
• – eine Auswerteeinrichtung, die in das Computersystem integriert ist, wobei die zweite Optik, das Detektionsfilter, die dritte Optik und der Detektor mit Auswerteeinerichtung eine Detektoranordnung darstellen.

The fluorescence photometer can have the following components / assemblies as a detection unit:

• A power supply unit to which
• - a light source is connected,
• - a first optics, the
• - An excitation filter is arranged downstream, wherein the power supply unit ( 36 ), the light source ( 37 ), the first appearance ( 38 ) and the excitation filter ( 39 ) form an excitation arrangement,
• A flow cell arranged on a holding device with a cuvette inlet and a cuvette outlet, the liquid having a designated marker being located in the flow cell,
• A second look,
• A detection filter,
• - a third optic as well
• A detector,
• - An evaluation device, which is integrated into the computer system, wherein the second optics, the detection filter, the third optics and the detector with Ausweineinichtung represent a detector arrangement.

Dabei können Anschlusskabel, die Versorgungs- und Signalempfangsleitungen darstellen, für den Anschluss der Lichtquelle und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung das Fluoreszenzphotometer vervollständigen.there can Connecting cables, which represent supply and signal receiving lines, for the Connection of the light source and for Completing the connection of the evaluation the fluorescence photometer.

Das Fluoreszenzphotometer kann mit mehreren Detektionseinheiten und einer Haltevorrichtung für mehrere Durchflussküvetten in zentralsymmetrischer Anordnung versehen sein, wobei zur Haltevorrichtung ein Boden zur Halterung der Durchflussküvetten sowie zugehörige Trennwände gehören, wobei die Detektionseinheiten, jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung und Detektionsanordnung, einer Drehhalterungseinrichtung zugeordnet sind, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem verbunden ist, das vom Computersystem aus steuerbar ist.The Fluorescence photometer can with multiple detection units and a holding device for several flow cells be provided in a centrally symmetrical arrangement, wherein the holding device a bottom for holding the flow cells and associated partitions include, wherein the detection units, each consisting of an excitation arrangement and detection arrangement associated with a rotary support device, connected to a direction of rotation switchable drive system which is controllable by the computer system.

Trennwände und eine dazwischen befindliche Durchflussküvette können zu einem Messsektor gehören.Partitions and an intermediate flow cell may belong to a measuring sector.

Das Fluoreszenzphotometer kann auch mit einer Halterungsvorrichtung für die Durchflussküvetten in Verbindung stehen, wobei die Durchflussküvetten ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sind und das Fluoreszenzphotometer relativ linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durch flussküvetten verschiebbar angeordnet ist und die Halterungsvorrichtung fest platziert ist.The Fluorescence photometer can also be equipped with a mounting device for the flow-through connected, wherein the flow cells held stationary and aligned in series next to each other and the fluorescence photometer relative linear and parallel to the row arrangement of the flow cuvettes displaced is arranged and the mounting device is firmly placed.

In einem vorgegebenen Strahlengang können sich die Lichtquelle, die erste Optik, das Anregungsfilter, die zweite Optik, das Detektionsfilter, die dritte Optik und der Detektor, der über das Anschlusskabel mit der Auswerteeinrichtung verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel, der sich zwischen dem Anregungsfilter und der zweiten Optik befindet und der die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette zur dritten Optik und zu dem Detektor gerichtet umlenkt, befinden.In a predetermined beam path, the light source, the first optics, the excitation filter, the second optics, the detection filter, the third optic and the detector connected via the connection cable the evaluation device is connected, and a semipermeabler Mirror, located between the excitation filter and the second optics located and the the retroreflective, to be detected fluorescence in the flow cell to the third optics and directed to the detector deflects are located.

In den Fluoreszenzphotometern können Blenden in die Strahlengänge eingefügt und die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie die Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses sein.In The fluorescence photometers can aperture in the beam paths added and the deflection angles are optimally adjusted and the flow cells are black colored for substantial reduction of the scattered light or for improvement the wavelength dependent fluorescence signal to noise ratio be.

Die Durchflussküvetten können aus Quarzglas sein, mit denen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreichbar ist.The flow-through can made of quartz glass with which a high signal-to-noise ratio can be achieved is.

Dem Füllstandsmesser kann eine Volumenmesskapillare mit einer zweiten Flüssigkeitssäule zugeordnet sein, wobei die Volumenmesskapillare mit einem Abfluss verbunden ist, der ventilmäßig betätigbar ist, wobei das abfließende Volumen V_A als Messgröße an das Computersystem übermittelt wird.The level meter may be assigned a volume measuring capillary with a second liquid column, wherein the volume measuring capillary is connected to a drain, which is operable valve, wherein the outflowing volume V _{A is} transmitted as a measured variable to the computer system.

Die Volumenmesskapillare dient der Quantifizierung des durch die Zellkultur hindurch diffundierenden Flüssigkeitsvolumens V_A.The volume measuring capillary serves to quantify the volume of liquid V _A which diffuses through the cell culture.

Die Volumenquantifizierung kann über den zweiten Drucksensor erfolgen, der mit der Volumenmesskapillare gekoppelt ist.The Volume quantification can be over the second pressure sensor, which is connected to the volume measuring capillary is coupled.

Das Impedanzspektrometer ist an die Filtereinrichtung über elektrische Verbindungsleitungen angeschlossen.The Impedance spectrometer is connected to the filter device via electrical Connecting cables connected.

Das Computersystem kann über erste Leitungen mit dem Impedanzspektrometer, über zweite Leitungen mit dem Fluoreszenzphotometer, über dritte Leitungen mit dem Füllstandsmesser einschließlich des zweiten Drucksensors und über vierte Leitungen mit einer Pumpe in elektrischer und signaltechnischer Verbindung stehen.The Computer system can over first lines with the impedance spectrometer, via second lines with the Fluorescence photometer, over third lines with the level gauge including of the second pressure sensor and over fourth lines with a pump in electrical and signaling technology Connection stand.

Das Computersystem kann derart ausgebildet sein, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist.The Computer system may be configured such that it itself Control represents or integrated into such a main component is.

Mehrfachvorgänge können in parallelen Flüssigkeitskreisläufen durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden, wobei

• – die Filtereinrichtung mehrfach,
• – das Fluoreszenzphotometer für mehrere Detektionseinheiten,
• – der Füllstandsmesser mehrfach,

die jeweils in einzelne Flüssigkeitskreisläufe integriert sind,
während die Pumpe als Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache Messkammern ausgebildet ist, wobei jede Messkammer einem der Flüssigkeitskreisläufe zugeordnet ist, und das Impedanzspektrometer und das Computersystem in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.Multiple operations can be performed in parallel fluid circuits by a corresponding number of the apparatus components, wherein

• The filter device several times,
• The fluorescence photometer for several detection units,
• - the level gauge several times,

each integrated into individual fluid circuits,
while the pump is designed as a multi-channel roller pump for multiple measuring chambers, each measuring chamber is associated with one of the fluid circuits, and the impedance spectrometer and the computer system are provided in a simple design.

Die vorgesehenen, durch die Zellkultur diffundierenden fluoreszierenden Marker können ein Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-Albumin oder ein Tetramethylrhodamin isothiocyanat(TRITC)-Dextran sein, wobei sich die zuführbaren Marker im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.The provided by the cell culture diffusing fluorescent Markers can a fluorescein isothiocyanate (FITC) albumin or a tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) dextran, being the feedable Differentiate markers in molecular weight or in quality.

Das Verfahren zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen wird mittels einer Einrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21 durchgeführt, wobei

• – ein Messen des Eingangsvolumens V_E der Flüssigkeit einschließlich des Markers und dessen Eingangskonzentration K_E mittels einer Filtereinrichtung,
• – ein Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers und
• – ein Messen der Ausgangskonzentration K_A des vorgegebenen Markers mittels eines Fluoreszenzphotometers erfolgen und wobei folgende Schritte durchgeführt werden:
• – Durchlauf der Flüssigkeit durch eine Filtereinrichtung, ein Fluoreszenzphotometer und einen Füllstandsmesser, die miteinander verbunden in einem Kreislauf mit einer die Flüssigkeit im Kreislauf bewegenden Pumpe angeordnet sind,
• – Messen des Ausgangsvolumens V_A der Flüssigkeit einschließlich des Markers mittels eines Füllstandsmessers,
• – Speichern der gemessenen Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A im Speicher des Computersystems,
• – Berechnung der parazellulären Permeabilität P_p und der transzellulären Permeabilität P_t als Funktionen der Messwerte der Parameter K_E, K_A, TER, V_E, V_A mit P_p, P_t = f(K_E, K_A, TER, V_E, V_A),
• – Darstellung der Permeabilitäten P_p, P_t in Kurvenform und
• – Vergleichen der Permeabilitäts-Kurven zwischen der Flüssigkeit mit Marker und der Flüssigkeit ohne Marker.

The method for measuring parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures is carried out by means of a device according to claims 1 to 21, wherein

• Measuring the input volume V _{E of} the liquid including the marker and its input concentration K _E by means of a filter device,
• - Measuring the electric transendothelial resistance TER by means of an impedance spectrometer and
• - Measure the initial concentration K _{A of} the predetermined marker by means of a fluorescence photometer and wherein the following steps are carried out:
• Passage of the liquid through a filter device, a fluorescence photometer and a level gauge, which are arranged connected together in a circuit with a pump which circulates the liquid,
• Measuring the initial volume V _{A of} the liquid including the marker by means of a level gauge,
• Storing the measured quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A in the memory of the computer system,
• Calculation of the paracellular permeability P _p and the transcellular permeability P _t as functions of the measured values of the parameters K _E , K _A , TER, V _E , V _A with P _p , P _t = f (K _E , K _A , TER, V _E , V _A ),
• - Representation of the permeabilities P _p , P _t in waveform and
• - Compare the permeability curves between the liquid with marker and the liquid without marker.

Dabei werden im Detail folgende Schritte durchgeführt:

• – die Zellkultur wird auf Filtereinsätzen von 6,5 mm, 12 mm, 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer der Filtereinrichtung eingesetzt,
• – danach wird durch die beiden Elektroden der transendotheliale Widerstand TER mit dem Impedanzspektrometer gemessen,
• – die im unteren Kompartiment strömende Flüssigkeit wird mit Hilfe der Pumpe ständig in den Flüssigkeitskreislauf, der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen halboffen ist, gepumpt und
• – in den Flüssigkeitskreislauf werden das Fluoreszenzphotometer eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare mit der zweiten Flüssigkeitssäule des Füllstandsmessers angeordnet.

The following steps are carried out in detail:

• The cell culture is cultivated on filter inserts of 6.5 mm, 12 mm, 24 mm or other diameters and inserted into the small-volume chamber of the filter device,
• Thereafter the transendothelial resistance TER is measured by the two electrodes with the impedance spectrometer,
• - The liquid flowing in the lower compartment is constantly pumped by means of the pump in the liquid circuit, which is semi-open due to the two open liquid columns, and
• - In the liquid circuit, the fluorescence photometer are involved and arranged in order the volume measuring capillary with the second liquid column of the level meter.

Mit der die zweite Flüssigkeitssäule enthaltenden Volumenmesskapillare wird das durch die Zellkultur diffundierte, mindestens einen Marker enthaltende Flüssigkeitsvolumen V_A über den zweiten Drucksensor gemessen und überwacht.With the volume measuring capillary containing the second liquid column, the liquid volume V _A diffused by the cell culture and containing at least one marker is measured and monitored via the second pressure sensor.

Als Vergleichswerte für die Permeabilitäten P_p, P_t im Bereich der Zellkultur wird die Permeabilität P_w des als Flüssigkeit verwendeten Wassers ermittelt.The permeability P _{w of} the water used as the liquid is determined as comparison values for the permeabilities P _p , P _t in the region of the cell culture.

Mit der mehrkanaligen Einrichtung können mehrere in Molekulardewicht und Qualität verschiedene Marker angeboten und im unteren Kompartiment detektiert werden.With The multi-channel device can have several in molecular weight and quality offered different markers and detected in the lower compartment become.

Die Zellen der Zellkultur werden während des Messvorgangs in der Filtereinrichtung einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeitssäule ausgesetzt.The Cell culture cells are used during the Measuring process in the filter device a hydrostatic pressure exposed by 10 cm liquid column.

Mit den drei aufgenommenen Messgrößen – dem Widerstand TER, den Konzentrationen K_E, K_A des Markers und den Volumen V_E, V_A – unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften des Markers und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm können sowohl die transzelluläre Permeabilität P_t und parazelluläre Permeabilität P_p als auch Transportkinetiken erstellt werden.With the three measured variables recorded - the resistance TER, the concentrations K _E , K _{A of} the marker and the volumes V _E , V _A - both the biophysical and biochemical properties of the marker and a mass balancing program available in the programmer means both the transcellular permeability P _t and paracellular permeability P _p and transport kinetics are created.

Veränderungen, wie z. B. Verstoffwechselung und Spaltung, der Marker während des Messvorgangs können durch Proteinfällung oder mittels der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie – HPLC – bestimmt werden, wobei für die Proteinfällung bekannte Verfahren eingesetzt werden und wobei das abgespaltene Tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC) oder das abgespaltene Fluorescein-isothiocyanat (FITC) nicht gefällt werden und dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich gemessen werden.changes, such as B. metabolism and cleavage, the marker during the Measuring process can by protein precipitation or by high performance liquid chromatography - HPLC be, where for the protein precipitation known methods are used and wherein the cleaved Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) or the cleaved Fluorescein isothiocyanate (FITC) will not be precipitated and then in the supernatant after centrifuging off the precipitated Protein and a pH balance can be measured.

Die gemessenen Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A können mittels eines Gesamtprogramms im Computersystem aufgenommen, gespeichert, ausgewertet und angezeigt werden, wobei die Werte aus den einzelnen Messgrößen K_E, K_A, TER, V_E, V_A gemäß eines Auswerteprogramms zu zugehörigen Permeabilitätsdiagrammen ausgewertet werden.The measured quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A can be recorded, stored, evaluated and displayed by means of an overall program in the computer system, the values from the individual measured quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A are evaluated according to an evaluation program to associated permeability diagrams.

Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen mittels mehrerer Zeichnungen näher erläutert.The Invention is based on embodiments closer by means of several drawings explained.

Es zeigen:It demonstrate:

1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Einrichtung zur Messung von Parametern zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität und der transzellulären Permeabilität einer Zellkultur über die zeitgleiche Messung verschiedener Parameter, 1 1 is a schematic representation of a device according to the invention for measuring parameters for determining the paracellular permeability and the transcellular permeability of a cell culture via the simultaneous measurement of various parameters;

2 eine schematische Darstellung einer Zellkultur und von zugehörigen Diffusions-Vorgängen, 2 a schematic representation of a cell culture and associated diffusion processes,

3 ein Fluoreszenzphotometer als Detektionseinheit in einer perspektivischen Darstellung mit einer Durchflussküvette sowie einer Anregungsanordnung und einer Detektionsanordnung, 3 a fluorescence photometer as a detection unit in a perspective view with a flow cell and an excitation arrangement and a detection arrangement,

4 ein Fluoreszenzphotometer in einer perspektivischen Darstellung mit einer Drehhalterungseinrichtung für mehrere Detektionseinheiten in zentralsymmetrischer Anordnung, 4 a fluorescence photometer in a perspective view with a rotary support device for a plurality of detection units in a centrally symmetrical arrangement,

5 ein Fluoreszenzphotometer in einer schematischen Darstellung mit einer Verschiebehalterungseinrichtung und mehreren stationären Durchflussküvetten für eine Detektionseinheit, 5 a fluorescence photometer in a schematic representation with a displacement holding device and a plurality of stationary flow cells for a detection unit,

6 eine Darstellung einer Transmissions-Wellenlängen-Kurve von Anregungsfilter und Detektionsfilter für eine Probe FITC-Dextran als Marker, 6 a representation of a transmission-wavelength curve of excitation filter and detection filter for a sample FITC-dextran as a marker,

7 eine Darstellung einer Fluoreszenzintensität(Detektorstromsignal)-Zeit-Kurve mit Eichkurve in Abhängigkeit von Konzentrationen des FITC-Dextrans, und 7 a representation of a fluorescence intensity (detector current signal) -time curve with calibration curve as a function of concentrations of FITC-dextran, and

8 eine Darstellung eines Diagramms der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran. 8th a representation of a diagram of the relative fluorescence to the concentration of FITC-dextran.

In 1 ist eine erfindungsgemäße Einrichtung 1 zur Messung von Parametern zur Bestimmung der parazellulären Permeabilität und der transzellulären Permeabilität einer rasenartigen Zellkultur 16 mit mindestens einem Marker 23 dargestellt, der folgende apparative Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes 6 mit einer Flüssigkeit 25 zugeordnet sind:

• – mindestens eine der Zellkultur 16 enthaltende Filtereinrichtung 2 zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur 16 mittels jeweils einer Eingangskonzentration K_E und eines Eingangsvolumens V_E mindestens eines fluoreszierenden, der Flüssigkeit 25 beigefügten Markers 23 in einer, die Zellkultur 16 mit einem hydrostatischen Druck belastenden Flüssigkeitssäule 17 sowie mit einem ersten Drucksensor 27 zur Regelung der Höhe der Flüssigkeitssäule 17,
• – ein Fluoreszenzphotometer 3 zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration K_A des durch die Zellkultur 16 diffundierenden Markers 23,
• – mindestens einen Füllstandsmesser 4 mit einem zweiten Drucksensor 26 zur Regelung der Höhe einer zweiten Flüssigkeitssäule 31 und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens V_A der Flüssigkeit 25 mit dem darin befindlichen Marker 23,
• – eine Pumpe 5 zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes 6, die mit der Filtereinrichtung 2 in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung 2, das Fluoreszenzphotometer 3, der Füllstandsmesser 4 und die Pumpe 5 sich im Flüssigkeitskreislauf 6 befinden, sowie
• – ein Impedanzspektrometer 7 zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur 16 und
• – ein Computersystem 9 mit programmtechnischen Mitteln zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten P_p, P_t als Funktionen von K_E, K_A, TER, V_E, V_A.

In 1 is a device according to the invention 1 for measuring parameters for determining the paracellular permeability and the transcellular permeability of a lawn-like cell culture 16 with at least one marker 23 shown, the following apparatus components within an open fluid circuit 6 with a liquid 25 assigned:

• - at least one of the cell culture 16 containing filter device 2 for the analysis of transcytosis processes in cell culture 16 in each case by means of an input concentration K _E and an input volume V _{E of} at least one fluorescent, the liquid 25 attached marker 23 in one, the cell culture 16 with a hydrostatic pressure-polluting liquid column 17 as well as with a first pressure sensor 27 for regulating the height of the liquid column 17 .
• - a fluorescence photometer 3 for detecting a respective initial concentration K _A of the cell culture 16 diffusing marker 23 .
• - At least one level gauge 4 with a second pressure sensor 26 for regulating the height of a second liquid column 31 and for determining an initial volume V _{A of} the liquid 25 with the marker in it 23 .
• - a pump 5 to maintain the fluid circuit 6 that with the filter device 2 communicates with the filter device 2 , the fluorescence photometer 3 , the level gauge 4 and the pump 5 in the fluid circuit 6 are located as well
• - An impedance spectrometer 7 for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture 16 and
• - a computer system 9 with program-technical means for measuring control and evaluation and for displaying the permeabilities P _p , P _t as functions of K _E , K _A , TER, V _E , V _A.

Das Impedanzspektrometer 7 ist an die Filtereinrichtung 2 über elektrische Verbindungsleitungen 8, 32 angeschlossen.The impedance spectrometer 7 is to the filter device 2 via electrical connection lines 8th . 32 connected.

Das Computersystem 9 steht über erste Leitungen 10 mit dem Impedanzspektrometer 7, über zweite Leitungen 11 mit dem Fluoreszenzphotometer 3, über dritte Leitungen 12 mit dem Füllstandsmesser 4 einschließlich des zweiten Drucksensors 26 und über vierte Leitungen 13 mit der Pumpe 5 in elektrischer und signaltechnischer Verbindung, wobei die Pumpe 5 eine Rollerpumpe darstellen kann.The computer system 9 stands over first lines 10 with the impedance spectrometer 7 , over second lines 11 with the fluorescence photometer 3 , via third lines 12 with the level gauge 4 including the second pressure sensor 26 and over fourth lines 13 with the pump 5 in electrical and signaling connection, the pump 5 can represent a roller pump.

Das Computersystem 9 kann derart ausgebildet sein, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist.The computer system 9 can be designed such that it itself represents a control / regulating device or is integrated into such a main component.

Die Filtereinrichtung 2 weist im Wesentlichen ein oberes Kompartiment 20 und ein unteres Kompartiment 21 auf, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten 20, 21 eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer 14 mit einem darin einsetzbaren Filtereinsatz 15 befindet, in dem die Zellkultur 16 in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist.The filter device 2 essentially has an upper compartment 20 and a lower compartment 21 on, being between the two compartments 20 . 21 a downwardly porous small-volume chamber 14 with a filter insert usable therein 15 in which the cell culture 16 is present in the form of a layer of contiguous cells.

In 2 ist in einer schematischen Darstellung die auf dem Filtereinsatz 15 aufgebrachte Zellkultur 16 – Zellrasen – perspektivisch vergrößert gezeigt, wobei die parazellulären Diffusions-Vorgänge 29 und die transzellulären (tranzytotischen) Diffusions-Vorgänge 30 durch Pfeile richtungsbezogen angegeben sind.In 2 is a schematic representation of the on the filter cartridge 15 applied cell culture 16 - Cellular lawn - shown enlarged in perspective, with the paracellular diffusion processes 29 and the transcellular (trancytotic) diffusion processes 30 are indicated by arrows directional.

In der nach oben freien Kammer 14 lastet auf der Zellkultur 16, wie in 1 gezeigt ist, die erste Flüssigkeitssäule 17 von vorzugsweise exakt 10 cm, wobei als Flüssigkeit 25 Kulturmedium eingebracht ist. Die Kammer 14 steht zur ersten Flüssigkeitssäule 17 gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment 20 zugeordneten Ringelektrode 18 sowie von der ersten Flüssigkeitssäule 17 abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment 21 zugeordneten Elektrodenplatte 19 zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER in Verbindung, der mit Hilfe des Impedanzspektrometers 7 ermittelt wird. Die Ringelektrode 18 ist über eine erste Verbindungsleitung 8 an das Impedanzspektrometer 7 angeschlossen. Die Elektrodenplatte 19 steht über eine zweite Verbindungsleitung 32 mit dem Impedanzspektrometer 7 in Verbindung.In the upstairs free chamber 14 weighs on the cell culture 16 , as in 1 is shown, the first liquid column 17 of preferably exactly 10 cm, being used as a liquid 25 Culture medium introduced is. The chamber 14 stands to the first liquid column 17 directed with one of the upper compartment 20 associated ring electrode 18 as well as from the first liquid column 17 averted with a lower compartment 21 associated electrode plate 19 for measuring the electrical transendothelial resistance TER in conjunction with the help of the impedance spectrometer 7 is determined. The ring electrode 18 is via a first connection line 8th to the impedance spectrometer 7 connected. The electrode plate 19 is via a second connection line 32 with the impedance spectrometer 7 in connection.

Die Kammer 14 ist in das obere Kompartiment 20 einsetzbar und steht über das untere Kompartiment 21 mit dem Flüssigkeitskreislauf 6 in Verbindung. Das von den Elektroden 18, 19 aufgebaute elektrische Feld greift durch den porösen Teil der Kammer 14 und den zugehörigen Bereich des Flüssigkeitskreislaufs 6 hindurch. Die Flüssigkeit wird zwischen dem Filtereinsatz 15 und der Elektrodenplatte 19 quer zur Flüssigkeitssäule 17 mittels der Pumpe 5 bewegt.The chamber 14 is in the upper compartment 20 can be used and is above the lower compartment 21 with the fluid circuit 6 in connection. That of the electrodes 18 . 19 built-up electric field reaches through the porous part of the chamber 14 and the associated area of the fluid circuit 6 therethrough. The liquid is between the filter element 15 and the electrode plate 19 transverse to the liquid column 17 by means of the pump 5 emotional.

Das obere Kompartiment 20 besitzt im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule 17 mindestens eine Zuführungsleitung 22 zur gesteuerten Zugabe des mit der Flüssigkeit 25 gemischten Markers 23 aus einem Vorratsbehälter heraus, wobei die Flüssigkeit 25 der Flüssigkeitssäule 17 über die Zellkultur 16 und den Filtereinsatz 15 der Flüssigkeit 25 des Kreislaufs 6 zuführbar ist. Die Flüssigkeit 25 kann vorzugsweise Wasser sein.The upper compartment 20 owns in the area of the first liquid column 17 at least one supply line 22 for the controlled addition of the liquid 25 mixed marker 23 from a reservoir, the liquid 25 the liquid column 17 about the cell culture 16 and the filter cartridge 15 the liquid 25 of the cycle 6 can be fed. The liquid 25 may preferably be water.

Der ersten Flüssigkeitssäule 17 ist im Bereich zur Kammer 14 der erste Drucksensor 27 zugeordnet, der über eine fünfte Leitung 28 mit dem Computersystem 9 in Verbindung steht und mit dem die erste Flüssigkeitssäule 17 ständig höhenmäßig signaltechnisch überprüft wird.The first liquid column 17 is in the area to the chamber 14 the first pressure sensor 27 assigned to a fifth line 28 with the computer system 9 communicates and with which the first liquid column 17 is always checked in terms of signal level.

In 3 ist ein miniaturisiertes Fluoreszenzphotometer 3 zur Erfassung der Konzentration K_A des durch die dimensionierungsminimierte Zellkultur 16 hindurchgelangten fluoreszierenden Marker 23 gezeigt.In 3 is a miniaturized fluorescence photometer 3 for detecting the concentration K _A of the dimensioning-minimized cell culture 16 passed through fluorescent markers 23 shown.

Dafür ist in der 3 das Fluoreszenzphotometer 3 in einer einfachen schematischen Form mit einer Durchflussküvette 34 auf einer Haltevorrichtung 35 gezeigt.That is in the 3 the fluorescence photometer 3 in a simple schematic form with a flow cell 34 on a holding device 35 shown.

Das Fluoreszenzphotometer 3 kann als Detektionseinheit im Wesentlichen folgende Bauelemente/Baugruppen aufweisen:

• – eine Energieversorgungseinheit 36, an die
• – eine Lichtquelle 37, z. B. eine Leucht- oder Laserdiode angeschlossen ist,
• – eine erste Optik 38, der
• – ein Anregungsfilter 39 nachgeordnet ist, wobei die Energieversorgungseinheit 36, die Lichtquelle 37, die erste Optik 38 und das Anregungsfilter 39 eine Anregungsanordnung 40 bilden,
• – eine auf der Haltevorrichtung 35 angeordnete Durchflussküvette 34 mit einem Küvettenzufluss 41 und einem Küvettenabfluss 42, wobei sich in der Durchflussküvette 34 die zugeführte Flüssigkeit 25 mit mindestens einem vorgesehenen Marker 23 befindet,
• – eine zweite Optik 44,
• – einen Detektionsfilter 45,
• – eine dritte Optik 46 sowie
• – einen Detektor 47,
• – eine Auswerteeinrichtung 48, die in das Computersystem 9 integriert ist, wobei die zweite Optik 44, das Detektionsfilter 45, die dritte Optik 46 und der Detektor 47 mit Auswerteeinerichtung 48 eine Detektoranordnung 43 bilden.

The fluorescence photometer 3 may comprise as detection unit essentially the following components / assemblies:

• - a power supply unit 36 , to the
• - a light source 37 , z. B. a light emitting diode or laser diode is connected,
• - a first appearance 38 , of the
• - an excitation filter 39 is downstream, the power supply unit 36 , the light source 37 , the first look 38 and the excitation filter 39 an excitation order 40 form,
• - one on the holding device 35 arranged flow cell 34 with a cuvette influx 41 and a cuvette drain 42 , being in the flow cell 34 the supplied liquid 25 with at least one designated marker 23 is,
• - a second optic 44 .
• - a detection filter 45 .
• - a third optics 46 such as
• - a detector 47 .
• - An evaluation 48 that are in the computer system 9 is integrated, with the second optics 44 , the detection filter 45 , the third optics 46 and the detector 47 with evaluation device 48 a detector arrangement 43 form.

Anschlusskabel 49, 50, die Versorgungs- und Signalempfangsleitungen darstellen, für den Anschluss der Laserdiode 37 und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung 48 vervollständigen das Fluoreszenzphotometer 3.connection cable 49 . 50 , which represent supply and signal receiving lines, for the connection of the laser diode 37 and for the connection of the evaluation device 48 complete the fluorescence photometer 3 ,

Der Küvettenzufluss 41, die Durchflussküvette 34 und der Küvettenabfluss 42 sind ein Teil des Flüssigkeitskreislaufes 6.The cuvette influx 41 , the flow cell 34 and the cuvette drain 42 are part of the fluid circuit 6 ,

Das Fluoreszenzphotometer 3 und die Haltevorrichtung 35 mit den wahlweise darauf befestigten Durchflussküvetten können relativ zueinander bewegbar angeordnet sein.The fluorescence photometer 3 and the holding device 35 with the optionally attached flow cuvettes can be arranged to be movable relative to each other.

Dem in 1 gezeigten Füllstandsmesser 4 ist eine Volumenmesskapillare 24 mit einer zweiten Flüssigkeitssäule 31 zugeordnet, wobei der Volumenmesskapillare 24 ein Abfluss 33 zugeordnet ist, der ventilmäßig betätigbar ist.The in 1 shown level gauge 4 is a volume measuring capillary 24 with a second liquid column 31 assigned, wherein the volume measuring capillary 24 a drain 33 is assigned, which is valve-actuated.

Die Volumenmesskapillare 24 dient der Quantifizierung des durch die Zellkultur 16 hindurchtretenden Flüssigkeitsvolumens V_A. Die Volumenquantifizierung von V_A erfolgt über den zweiten Drucksensor 26, der mit der Volumenmesskapillare 24 gekoppelt ist. Das abfließende Volumen V_A wird als Messgröße über die Leitung 12 an das Computersystem 9 übermittelt.The volume measuring capillary 24 serves the quantification of the through the cell culture 16 passing through the liquid volume V _A. The volume quantification of V _A is done via the second pressure sensor 26 that with the volume measuring capillary 24 is coupled. The effluent volume V _A is measured over the line 12 to the computer system 9 transmitted.

Vorzugsweise können Mehrfachvorgänge in mehreren parallel angeordneten und aufeinander abgestimmten Flüssigkeitskreisläufen durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden. Z. B. können

• – die Filtereinrichtung 2 mehrfach, vorzugsweise sechsfach,
• – das Fluoreszenzphotometer 3 für mehrfache, vorzugsweise sechs Detektionseinheiten,
• – der Füllstandsmesser 4 mehrfach, insbesondere sechsfach und
• – die Pumpe 5 in Form einer Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache, vorzugsweise sechs Flüssigkeitskreislauf-Kanäle

ausgebildet sein,
während das Impedanzspektrometer 7 und das Computersystem 9 aus Gründen des vorhandenen Empfangs über mehrere signalelektrische Ein- und Ausgangs-Kanäle in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.Preferably, multiple operations may be performed in a plurality of parallel and matched liquid circuits by a corresponding number of the apparatus components. For example, you can

• - The filter device 2 several times, preferably six times,
• - the fluorescence photometer 3 for multiple, preferably six detection units,
• - the level gauge 4 multiple, especially sixfold and
• - the pump 5 in the form of a multi-channel roller pump for multiple, preferably six fluid circulation channels

be educated
while the impedance spectrometer 7 and the computer system 9 for reasons of the existing reception via a plurality of signal-electrical input and output channels are provided in a simple design.

In der 4 ist ein zweites Fluoreszenzphotometer 51 in einer perspektivischen Darstellung mit einer Haltevorrichtung 351 für mehrere Durchflussküvetten 341, 342, 343, 344 (vier von sechs möglichen) in zentralsymmetrischer Anordnung gezeigt, wobei zur Haltevorrichtung 351 ein Boden 52 zur Halterung der Durchflussküvetten 341, 342, 343, 344 sowie zugehörige Trennwände 531, 532, 533, 534, 535, 536 gehören. Die drei Detektionseinheiten 56, 57, 58, jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung 401, 402, 403 und einer Detektionsanordnung 431, 432, 433, sind einer schematisch dargestellten Drehhalterungseinrichtung 54 zugeordnet, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem (nicht eingezeichnet) verbunden ist, das vom Computersystem 9 aus gesteuert werden kann. Die Haltevorrichtung 351 ist z. B. um die Drehhalterungseinrichtung 54 drehbar gelagert angeordnet.In the 4 is a second fluorescence photometer 51 in a perspective view with a holding device 351 for several flow cells 341 . 342 . 343 . 344 (four out of six possible) shown in a centrally symmetrical arrangement, wherein the holding device 351 a floor 52 for holding the flow cells 341 . 342 . 343 . 344 and associated partitions 531 . 532 . 533 . 534 . 535 . 536 belong. The three detection units 56 . 57 . 58 each consisting of an excitation arrangement 401 . 402 . 403 and a detection arrangement 431 . 432 . 433 , are a schematically illustrated rotary support device 54 associated with a reversible drive system (not shown) connected to the computer system 9 can be controlled from. The holding device 351 is z. B. to the rotary mounting device 54 arranged rotatably mounted.

Mittels der Trennwände 531, 532; 532, 533; 533, 534; 534, 535; 535, 536; 536, 531 und der jeweils dazwischen befindlichen Durchflussküvette 341, 342, 343, 344 usw. entsteht jeweils ein Messsektor 55, wobei in 4 sechs Messsektoren 55 einem Winkel von 60° zugeordnet und drei Detektionseinheiten 56, 57, 58 vorgesehen sind.By means of partitions 531 . 532 ; 532 . 533 ; 533 . 534 ; 534 . 535 ; 535 . 536 ; 536 . 531 and the respective intermediate flow cuvette 341 . 342 . 343 . 344 etc., a measuring sector is created in each case 55 , where in 4 six measuring sectors 55 associated with an angle of 60 ° and three detection units 56 . 57 . 58 are provided.

Das Fluoreszenzphotometer 3 kann auch, wie in 5 gezeigt ist, mit einer Halterungsvorrichtung 352 für die Durchflussküvetten 341, 342, 343 angeordnet sein, wobei die Durchflussküvetten 341, 342, 343 ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sein können. Das Fluoreszenzphotometer 3 kann dabei linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durchflussküvetten 341, 342, 343 verschiebbar angeordnet und die Halterungsvorrichtung 352 fest platziert sein. Auf einem in Pfeilrichtung 61 bewegbaren Verschiebetisch 62 sind die Anregungsanordnung und die Detektionsanordnung fest plat ziert. In einem vorgegebenen Strahlengang 63 befinden sich die Laserdiode 37, die erste Optik 38, der Anregungsfilter 39, die zweite Optik 44, der Detektionsfilter 45, die dritte Optik 46 und der Detektor 47, der über das Anschlusskabel 50 mit der Auswerteeinrichtung 48 verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel 64, der sich zwischen dem Anregungsfilter 39 und der zweiten Optik 46 befindet und die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette 342 zur dritten Optik 46 und dem Detektor 47 gerichtet umlenkt.The fluorescence photometer 3 can also, as in 5 is shown with a mounting device 352 for the flow cells 341 . 342 . 343 be arranged, the flow cuvettes 341 . 342 . 343 held stationary and can be aligned in series next to each other. The fluorescence photometer 3 can be linear and parallel to the series arrangement of the flow cells 341 . 342 . 343 slidably disposed and the mounting device 352 be firmly placed. On one in the direction of the arrow 61 movable translation table 62 are the excitation arrangement and the detection arrangement fixed plat benefits. In a given beam path 63 are the laser diode 37 , the first look 38 , the excitation filter 39 , the second optics 44 , the detection filter 45 , the third optics 46 and the detector 47 that's over the connection cable 50 with the evaluation device 48 connected, as well as a semipermeable mirror 64 that is between the excitation filter 39 and the second optics 46 and the retroreflective fluorescence to be detected in the flow cell 342 to the third optics 46 and the detector 47 directed deflected.

Zusätzlich können in beiden Fluoreszenzphotometern 3 und 51 Blenden in die Strahlengänge eingefügt, die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sowie die Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses sein.In addition, in both fluorescence photometers 3 and 51 Blends inserted into the beam paths, the deflection angle is optimally adjusted and the flow cells are colored black to substantially reduce the scattered light or to improve the wavelength-dependent fluorescence signal / noise ratio.

Als zweckmäßig erweisen sich Küvetten aus Quarzglas, mit denen das Signal-Rausch-Verhältnis wesentlich gesteigert werden kann.When prove expedient cuvettes made of quartz glass, which significantly increases the signal-to-noise ratio can be.

Auf dem Verschiebetisch 62 können auch mehrere parallel zueinander angebrachte Detektionseinheiten angebracht sein.On the translation table 62 it is also possible to attach a plurality of detection units mounted parallel to one another.

Die Fluoreszenzsignale bezogen auf den jeweiligen Marker 23 in der Flüssigkeit 25 werden folgendermaßen dargestellt:
In 6 ist eine Darstellung der Transmissions-Wellenlängen-Kurve des Anregungsfilters 39 und des Detektionsfilters 45 aus 3 oder 5 für eine Probe des Markers FITC-Dextran 23 bei einer Küvettenlänge von 10 mm und einer Konzentration von 100 μg/ml (rechte Größenachse) gezeigt. Dabei sind die Transmissionen des Anregungsfilters 39 und des Detektionsfilters 45 angegeben. Für eine Strahlung unter größerem Einfallswinkel als 90° verschiebt sich die Transmission des Detektionsfilters 45 zu kürzeren Wellenlängen, so dass dann auch Anregungslicht das Detektionsfilter 45 passieren kann. Das FITC-Fluoreszenzspektrum wird aus dem Absorptionsspektrum durch Spiegelung mit dem bekannten Emissionsmaximum von 517 nm berechnet. Zum Vergleich ist das Spektrum der eingesetzten Laserdiode 37 aufgetragen. Die Anregungswellenlänge 59 liegt etwa bei 470 nm, die fluoreszierende Beobachtungswellenlänge 60 hat ihr Maximum bei etwa 520 nm.The fluorescence signals relative to the respective marker 23 in the liquid 25 are represented as follows:
In 6 is a representation of the transmission-wavelength curve of the excitation filter 39 and the detection filter 45 out 3 or 5 for a sample of the marker FITC-Dextran 23 at a cuvette length of 10 mm and a concentration of 100 μg / ml (right size axis). Here are the transmissions of the excitation filter 39 and the detection filter 45 specified. For radiation at a greater angle of incidence than 90 °, the transmission of the detection filter shifts 45 to shorter wavelengths, so that then also excitation light the detection filter 45 can happen. The FITC fluorescence spectrum is calculated from the absorption spectrum by reflection with the known emission maximum of 517 nm. For comparison, the spectrum of the laser diode used 37 applied. The excitation wavelength 59 is about 470 nm, the fluorescent observation wavelength 60 has its maximum at about 520 nm.

In 7 ist eine Darstellung der Fluoreszenzintensität-Zeit-Kurve (Eichkurve) in Form einer Detektorsignal-Zeitreihe in Abhängigkeit von der Konzentration des FITC-Dextrans gezeigt, wobei die Fluoreszenzintensität als Signal jeweils im Detektor 47 in Ampere für eine Verdünnungsreihe von FITC-Dextran gemessen wird. Die Konzentration von FITC-Dextran wird ausgehend von einer Stammlösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml zunächst um einen Faktor 1000 auf 100 μg/ml verdünnt. Danach ist eine Verdünnungsreihe erstellt, bei der die Konzentration jeweils um einen Faktor 10 bis auf 0,1 ng/ml reduziert wird.In 7 is a representation of the fluorescence intensity-time curve (calibration curve) in the form of a detector signal time series as a function of the concentration of the FITC-dextrans shown, wherein the fluorescence intensity as a signal in each case in the detector 47 in amperes for a dilution series of FITC-dextran. The concentration of FITC-dextran is first diluted by a factor of 1000 to 100 μg / ml starting from a stock solution with a concentration of 100 mg / ml. Thereafter, a dilution series is prepared in which the concentration is reduced by a factor of 10 to 0.1 ng / ml.

Auch die verwendete Zellkulturlösung ergibt bereits ein geringes Fluoreszenzsignal. Ab einer Konzentration von 0,01 μg/ml ist eine deutliche Zunahme der Fluoreszenzintensität zu erkennen. Nach Erreichen der höchsten Konzentration von 100 μg/ml ist die Durchflussküvette mit der Flüssigkeit 25 gespült und erneut die Fluoreszenz gemessen worden. Der Vorgang wird solange wiederholt, bis kein weiterer Abfall der Detektorsignale mehr zu beobachten ist. Zwischen den einzelnen Messungen wird die Durchflussküvette 34 aus dem Strahlengang entfernt, was am Einbruch der Detektorsignale erkennbar ist.The cell culture solution used already gives a low fluorescence signal. From one Concentration of 0.01 μg / ml shows a significant increase in fluorescence intensity. After reaching the highest concentration of 100 μg / ml, the flow-through cuvette is filled with the liquid 25 rinsed and fluorescence was measured again. The process is repeated until no further drop in the detector signals is observed. Between the individual measurements becomes the flow cell 34 removed from the beam path, which is recognizable by the collapse of the detector signals.

In 8 ist ein Diagramm der relativen Fluoreszenz zur Konzentration von FITC-Dextran 23 dargestellt. Die aus den der 7 zugrunde liegenden Messungen ermittelten Fluoreszenzströme sind auf das Maximum normiert und gegen die Konzentra tion aufgetragen. Neben dem relativen Detektorstrom ist zum Vergleich das mit dem CytoFluor II 23 für die gleichen Lösungen bestimmte Fluoreszenzsignal aufgetragen. Zum leichteren Vergleich ist das Signal auch auf das Maximum normiert. Durch Abzug des auch mit reiner Nährlösung vorhandenen Rauschsignals können auch noch Konzentrationen im Bereich von 0,01 μg/ml erkannt werden.In 8th is a plot of relative fluorescence to the concentration of FITC-dextran 23 shown. The from the 7 Underlying measurements determined fluorescence currents are normalized to the maximum and plotted against the concentration. In addition to the relative detector current is compared with the CytoFluor II 23 applied fluorescence signal for the same solutions. For easier comparison, the signal is normalized to the maximum. By subtracting even with pure nutrient solution existing noise signal even concentrations in the range of 0.01 ug / ml can be detected.

Die Kombination von mehreren bei unterschiedlichen Wellenlängen arbeitenden Fluoreszenzdetektionseinheiten 56, 57, 58 im Fluoreszenzphotomer 51 ermöglicht nahezu simultane Messungen mehrerer Fluoreszenzmarker 23.The combination of multiple fluorescence detection units operating at different wavelengths 56 . 57 . 58 in the fluorescence photomer 51 enables nearly simultaneous measurements of several fluorescence markers 23 ,

In dem Verfahren zur Messung von Parametern zur Bestimmung von Permeabilitäten von Zellkulturen 22 werden folgende Schritte unter Verwendung der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 durchgeführt:

• – Messen des Eingangsvolumens V_E und der Eingangskonzentration K_E mittels der Filtereinrichtung 2,
• – Messen des Ausgangsvolumens V_A mittels des Füllstandsmessers 4,
• – Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels des Impedanzspektrometers 7,
• – Messung der Ausgangskonzentration K_A mittels des Fluoreszenzphotometers 3 oder 51,
• – Speichern der gemessenen Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A im Speicher des Computersystems 9,
• – Berechnung der Permeabilitäten P_p, P_t als Funktionen der Messwerte der Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A mit P_p, P_t = f(K_E, K_A, TER, V_E, V_A),
• – Darstellung der Permeabilitäten P_p, P_t in Kurvenform und
• – Vergleich der Permeabilitäts-Kurven.

In the method for the measurement of parameters for the determination of permeabilities of cell cultures 22 The following steps are performed using the device according to the invention 1 carried out:

• - Measuring the input volume V _E and the input concentration K _E by means of the filter device 2 .
• - Measuring the output volume V _A by means of the level gauge 4 .
• - Measuring the electrical transendothelial resistance TER by means of the impedance spectrometer 7 .
• - Measurement of the initial concentration K _A by means of the fluorescence photometer 3 or 51 .
• - Saving the measured quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A in the memory of the computer system 9 .
• Calculation of the permeabilities P _p , P _t as functions of the measured values of the quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A with P _p , P _t = f (K _E , K _A , TER, V _E , V _A )
• - Representation of the permeabilities P _p , P _t in waveform and
• - Comparison of the permeability curves.

Im Folgenden wird die Funktionsweise der erfindungsgemäßen Einrichtung 1 zur Messung von Parametern zur Bestimmung der Permeabilitäten P_p, P_t unter Bezugnahme auf die 2 und 1 erläutert.The following is the operation of the device according to the invention 1 for measuring parameters for determining the permeabilities P _p , P _t with reference to FIGS 2 and 1 explained.

Die schichtartige Zellkultur 16 wird je nach Bedarf auf Filtereinsätzen 15 von 6,5 mm, 12 mm, 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer 14 eingesetzt. Die Zellen der Zellkultur 16 werden somit während des Messvorgangs einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeits(Wasser)säule 17 ausgesetzt. Der Druck entspricht dem physiologischen, postkapillaren, hydrostatischen Druck in vivo und führt zu einem Abdichten der Zellkultur 16. Über die beiden Elektroden 18, 19 wird der elektrische transendotheliale Widerstand (TER – Trans Endothelial Resistance) mit Hilfe des Impedanzspektrometers 7 gemessen. Die zwischen den Kompartimenten 20, 21 strömende Flüssigkeit 25 wird mit Hilfe der Pumpe 5 ständig in dem Flüssigkeitskreislauf 6, der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen 17, 31 halboffen ist, gepumpt. In den Flüssigkeitskreislauf 6 ist das Fluoreszenzphotometer 3 eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare 24 mit der zweiten Flüssigkeitssäule 31 des Füllstandsmessers 4 angeordnet.The layered cell culture 16 is on filter inserts as needed 15 of 6.5 mm, 12 mm, 24 mm or other diameter and cultivated in the small-volume chamber 14 used. The cells of cell culture 16 Thus, during the measurement process, a hydrostatic pressure of 10 cm liquid (water) column 17 exposed. The pressure corresponds to the physiological, postcapillary, hydrostatic pressure in vivo and leads to a sealing of the cell culture 16 , About the two electrodes 18 . 19 is called the Transendothelial Resistance (TER) using the impedance spectrometer 7 measured. The between the compartments 20 . 21 flowing liquid 25 is using the pump 5 constantly in the fluid circuit 6 caused by the two open fluid columns 17 . 31 semi-open, pumped. In the fluid circuit 6 is the fluorescence photometer 3 integrated and in addition the volume measuring capillary 24 with the second liquid column 31 of the level gauge 4 arranged.

Das Fluoreszenzphotometer 3, wie in den 3, 4 und 5 gezeigt ist, erfasst mindestens einen durch die Zellkultur 16 diffundierenden und durch die Durchflussküvette 34 fließenden, fluoreszierenden Marker 23, z. B. ein FITC-Albumin oder ein TRITC-Dextran, die der Zellkultur 16 über das obere Kompartiment 20 unter Messung des zugeführten Volumens V_E gesteuert zugeführt werden. Die zuführbaren Marker 23 können sich im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.The fluorescence photometer 3 as in the 3 . 4 and 5 shown captures at least one by cell culture 16 diffusing and through the flow cell 34 flowing, fluorescent markers 23 , z. A FITC-albumin or a TRITC-dextran, the cell culture 16 over the upper compartment 20 be supplied controlled under measurement of the supplied volume V _E. The feedable markers 23 may differ in molecular weight or in quality from each other.

Mit der die zweite Flüssigkeitssäule 31 enthaltenden Volumenmesskapillare 24 kann das durch die Zellkultur 16 diffundier te Flüssigkeitsvolumen V_A mit dem Marker 23 über den zweiten Drucksensor 26 gemessen und überwacht werden.With the second liquid column 31 containing volume measuring capillary 24 This can be done through cell culture 16 Diffused liquid volume V _A with the marker 23 via the second pressure sensor 26 be measured and monitored.

Als Vergleichswerte für die Permeabilitäten P_p, P_t bezogen auf die den Marker 23 enthaltende Flüssigkeit im Bereich der Zellkultur 16 kann die Permeabilität P_w der verwendeten Flüssigkeit 25, insbesondere des Wassers in einem vorher oder nachfolgenden Messvorgang ermittelt werden.As comparison values for the permeabilities P _p , P _t relative to the marker 23 containing liquid in the field of cell culture 16 can the permeability P _{w of} the liquid used 25 , In particular of the water in a previous or subsequent measurement process can be determined.

Die Erfindung ermöglicht es, dass insbesondere mit einer mehrkanaligen Einrichtung mehrere in Molekulargewicht und Qualität verschiedene Marker 23 weitgehend zeitgleich angeboten und detektiert werden können.The invention makes it possible, in particular with a multichannel device, to have a plurality of markers different in molecular weight and quality 23 can be offered and detected largely at the same time.

Die aus den apparativen Einrichtungs-Komponenten 3, 4, 7 gemäß einem Messprogramm bereitgestellten Messwerte der Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A werden in einen Speicher des Computersystems 9 eingebracht, dort gespeichert, und nach Lesung mittels programmtechnischer Mittel zu Werten der zutreffenden Permeabilitäten P_p, P_t zumindest als Funktionen der Messwerte K_E, K_A, TER, V_E, V_A mit P_p, P_t = f(K_E, K_A, TER, V_E, V_A) berechnet, in Kurvenform dargestellt und zur Erstellung von Schlussfolgerungen miteinander verglichen.Those from the apparative furnishing components 3 . 4 . 7 Measured values of the quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A provided in accordance with a measuring program are stored in a memory of the computer system 9 introduced, stored there, and after reading by means of programmable means to values of the applicable permeabilities P _p , P _t at least as functions of the measured values K _E , K _A , TER, V _E , V _A with P _p , P _t = f (K _E , K _A , TER, V _E , V _A ), plotted and compared to form conclusions.

Mit den drei weitgehend zeitgleich aufgenommenen Messparametern – dem elektrischen transendothelialen Widerstand TER, den Konzentrationen K_E, K_A der Marker 23 und den Volumen V_E, V_A – können unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften der Marker 23 und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm nicht nur zwischen transzellulärer Permeabilität P_t und parazellulärer Permeabilität P_p unterschieden, sondern vorteilhafterweise auch Transportkinetiken präzise erstellt werden.With the three largely simultaneously recorded measurement parameters - the electrical transendothelial resistance TER, the concentrations K _E , K _{A of} the markers 23 and the volumes V _E , V _A - can, taking into account the biophysical and biochemical properties of the markers 23 and a mass balancing program present in the program-technical means not only differentiates between transcellular permeability P _t and paracellular permeability P _p , but advantageously also transport kinetics can be created precisely.

Die Massenbilanzierung wird mittels programmtechnischer Mittel unter Einbeziehung der gemessenen Größen im Computersystem 9 durchgeführt:
Die Berechnung der trans- und parazellulären Permeabilität P_t, P_p, die sich immer auf Wasser als Durchflussmittel der Zellkulturen bezieht, wird unter Verwendung folgender gemessener Parametern durchgeführt:

K_E

Eingangskonzentration der Markersubstanz vor der Zellkultur

K_A

Ausgangskonzentration der Markersubstanz nach der Zellkultur

V_E

Eingangsvolumen

V_A

Ausgangsvolumen

A

Durchgangsfläche der Zellkultur, wobei die Fläche aus dem Durchmesser des vorgegebenen Filtereinsatzes 15 bestimmbar ist,

die als gemessene Größen mit ihren Werten vorliegen. Es gilt, dass die Gesamtpermeabilität durch die Zellkultur 16 hindurch gleich der transzellulären Permeabilität P_t und der parazellulären Permeabilität P_p für Wasser nach Gleichung: PGes = Pt + Pp (I) ist. The mass balancing is done by means of program technology including the measured quantities in the computer system 9 carried out:
The calculation of the trans and paracellular permeability P _t , P _p , which always refers to water as the flow-through means of the cell cultures, is carried out using the following measured parameters:

K _E

Input concentration of the marker substance before cell culture

K _A

Initial concentration of the marker substance after cell culture

V _E

input volume

V _A

output volume

A

Passage area of the cell culture, wherein the area of the diameter of the given filter insert 15 is determinable

which are present as measured quantities with their values. It is true that the total permeability through cell culture 16 equals the transcellular permeability P _t and the paracellular permeability P _p for water according to equation: P Ges = P t + P p (I) is.

Für die einzelnen Permeabilitäten gelten folgende Gleichungen:
Für die transzelluläre Permeabilität P_t gilt die Gleichung Pt = dVt/dt × 1/A (II),für die parazelluläre Permeabilität P_p gilt die Gleichung Pp = dVp/dt × 1/A (III) undfür die Gesamtpermeabilität gilt die Gleichung PGes = dVA/dt × 1/A (IV). The following equations apply to the individual permeabilities:
For the transcellular permeability P _t , the equation applies P t = dV t / dt × 1 / A (II), for the paracellular permeability P _p , the equation applies P p = dV p / dt × 1 / A (III) and for the total permeability the equation applies P Ges = dV A / dt × 1 / A (IV).

Aus der Gleichung (I) und den Gleichungen (II, III, IV) ergibt sich die Gleichung: dVA/dt = dVt/dt + dVp/dt (V), wobei dV_t/dt den transzellulären Wassertransport und dV_p/dt den parazellulären Wassertransport beschreiben. Der Gesamtfluss dV_A/dt durch die Fläche A der Zellkulturen 16 hindurch wird durch eine Messung mittels des Drucksensors 26 bestimmt.From the equation (I) and the equations (II, III, IV) the equation results: dV A / dt = dV t / dt + dV p / dt (V), where dV _t / dt describes transcellular water transport and dV _p / dt describes paracellular water transport. The total flux dV _A / dt through the area A of the cell cultures 16 through is by a measurement by means of the pressure sensor 26 certainly.

Unter der Annahme, dass der Marker 23 nicht von den Zellen aufgenommen wird, wobei dann der transzelluläre Transport gleich Null ist, aber frei durch die Zellzwischenräume diffundieren kann, gilt weiterhin: KA = KE × dVp/dt/dVA/dt und KA = KE × dVp/dt/(dVt/dt + dVp/dt) (VI),wobei die Ausgangskonzentration K_A gleich der parazellulär transportierten Stoffmenge geteilt durch das trans- und parazellulär transportierte Flüssigkeitsvolumen ist.Assuming that the marker 23 is not taken up by the cells, in which case the transcellular transport is zero, but can freely diffuse through the cell interstices, the following also applies: K A = K e × dV p / Dt / dV A / dt and K A = K e × dV p / Dt / (dV t / dt + dV p / dt) (VI), wherein the initial concentration K _{A is} equal to the paracellularly transported amount of substance divided by the trans- and paracellular transported liquid volume.

Aus den Gleichungen (V) und (VI) lassen sich durch Einsetzen und Auflösen die beiden gesuchten Permeabilitäten – die parazelluläre Permeabilität P_p und die transzelluläre Permeabilität P_t – nach folgenden Gleichungen bestimmen: dVp/dt = KA/KE × (dVA/dt) → Pp = KA/KE × (dVA/dt)/A (VII)und dVt/dt = dVA/dt – KA/KE × (dVA/dt) → Pt = (dVA/dt – KA/KE × (dVA/dt))/A (VIII). From the equations (V) and (VI), the two sought permeabilities - the paracellular permeability P _p and the transcellular permeability P _t - can be determined by the following equations: dV p / dt = K A / K e × (dV A / dt) → P p = K A / K e × (dV A / dt) / A (VII) and dV t / dt = dV A / dt - K A / K e × (dV A / dt) → P t = (dV A / dt - K A / K e × (dV A / dt)) / A (VIII).

Die Permeabilitäten P_t, P_p können nun aus diesen Gleichungen (VII) und (VIII) jeweils als Kurven P_Ges(t), P_p(t) und P_t(t) über die Zeit aufgetragen und entweder im Computersystem 9 gespeichert oder ausgedruckt werden, wonach zu ausgewählten Zeitpunkten die zugehörigen Permeabilitäten bestimmt und abgelesen werden können.The permeabilities P _t , P _p can now be plotted over time from these equations (VII) and (VIII) respectively as curves P _Ges (t), P _p (t) and P _t (t) and either in the computer system 9 be stored or printed, after which the associated permeabilities can be determined and read at selected times.

Dabei stellt der TER eine Kontrollgröße für den jeweiligen Wert der parazellulären Permeabilität dar.there the TER sets a control size for each Value of paracellular Permeability.

Veränderungen, wie z. B. Verstoffwechselung und Spaltung der Marker 23 während des Messvorgangs können durch Proteinfällung oder mittels der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie – HPLC – bestimmt werden. Für die Proteinfällung werden Standardverfahren eingesetzt. Das abgespaltene TRITC oder das abgespaltene FITC sind nicht fällbar und können dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich in zuverlässiger Weise gemessen werden.Changes, such as B. Metabolism and cleavage of the markers 23 during the measurement process can be determined by protein precipitation or by high performance liquid chromatography - HPLC. For protein precipitation who used the standard method. The split-off TRITC or the cleaved FITC can not be precipitated and can then be reliably measured in the supernatant after centrifuging off the precipitated protein and adjusting the pH.

Aus der Kenntnis und Anzeige des Unterschiedes zumindest der beiden genannten Permeabilitäten P_t, P_p in Diagrammen können Schlussfolgerungen über Transportweg und deren Störungen in der Zellkultur 16 abgeleitet werden.From the knowledge and display of the difference of at least the two permeabilities P _t , P _p in diagrams, conclusions can be drawn about the transport route and its disturbances in the cell culture 16 be derived.

11

EinrichtungFacility

22

Filtereinrichtungfiltering device

33

FluoreszenzphotometerFluorescence Photometer

44

Füllstandsmesserlevel meter

55

Pumpepump

66

FlüssigkeitskreislaufLiquid circuit

77

Impedanzspektrometerimpedance spectrometer

88th

Erste VerbindungsleitungFirst connecting line

99

Computersystemcomputer system

1010

Erste LeitungenFirst cables

1111

Zweite LeitungenSecond cables

1212

Dritte Leitungenthird cables

1313

Vierte LeitungenFourth cables

1414

Kammerchamber

1515

Filtereinsatzfilter cartridge

1616

Zellkulturcell culture

1717

Erste FlüssigkeitssäuleFirst liquid column

1818

Ringelektrodering electrode

1919

Elektrodenplatteelectrode plate

2020

Oberes Kompartimentupper compartment

2121

Unteres Kompartimentlower compartment

2222

Zuführungsleitungfeed pipe

2323

Markermarker

2424

VolumenmesskapillareVolumenmesskapillare

2525

Flüssigkeitliquid

2626

Zweiter Drucksensorsecond pressure sensor

2727

Erster Drucksensorfirst pressure sensor

2828

Fünfte LeitungFifth lead

2929

Erste Diffusions-VorgängeFirst Diffusion processes

3030

Zweite Diffusions-VorgängeSecond Diffusion processes

3131

Zweite FlüssigkeitssäuleSecond liquid column

3232

Zweite VerbindungsleitungSecond connecting line

3333

Abflussoutflow

3434

DurchflussküvetteFlow Cell

341341

DurchflussküvetteFlow Cell

342342

DurchflussküvetteFlow Cell

343343

DurchflussküvetteFlow Cell

344344

DurchflussküvetteFlow Cell

3535

Haltevorrichtungholder

351351

Haltevorrichtungholder

352352

Halterungsvorrichtungmounting device

3636

EnergieversorgungseinheitPower supply unit

3737

Lichtquellelight source

3838

Erste OptikFirst optics

3939

Anregungsfilterexcitation filter

4040

Anregungsanordnungexcitation system

401401

Anregungsanordnungexcitation system

402402

Anregungsanordnungexcitation system

403403

Anregungsanordnungexcitation system

4141

KüvettenzuflussKüvettenzufluss

4242

KüvettenabflussKüvettenabfluss

4343

Detektoranordnungdetector array

431431

Detektoranordnungdetector array

432432

Detektoranordnungdetector array

433433

Detektoranordnungdetector array

4444

Zweite OptikSecond optics

4545

Detektionsfilterdetection filters

4646

Dritte Optikthird optics

4747

Detektordetector

4848

Auswerteeinrichtungevaluation

4949

Anschlusskabelconnection cable

5050

Anschlusskabelconnection cable

5151

Fluoreszenzphotometer-MehrfachanordnungFluorescence Photometer multiple arrangement

5252

Bodenground

531531

Trennwandpartition wall

532532

Trennwandpartition wall

533533

Trennwandpartition wall

534534

Trennwandpartition wall

535535

Trennwandpartition wall

536536

Trennwandpartition wall

5454

DrehhalterungseinrichtungRotary support mechanism

5555

Messsektormeasuring sector

5656

Detektionseinheitdetection unit

5757

Detektionseinheitdetection unit

5858

Detektionseinheitdetection unit

5959

AnregungswellenlängeExcitation wavelength

6060

BeobachtungswellenlängeObservation wavelength

6161

Pfeilrichtungarrow

6262

Verschiebetischtranslation stage

6363

Strahlengangbeam path

6464

Semipermeabler Spiegelsemipermeable mirror

V_E V _E

Eingangsvolumeninput volume

V_A V _A

Ausgangsvolumenoutput volume

TERTER

Transendothelialer Widerstandtransendothelial resistance

KK

Eingangskonzentration des Markersinlet concentration of the marker

K_A K _A

Ausgangskonzentration des Markersinitial concentration of the marker

P_p P _p

Parazelluläre PermeabilitätParacellular permeability

P_t P _t

Transzelluläre PermeabilitätTranscellular permeability

Claims (30)

Einrichtung zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen mit folgenden apparativen Einrichtungs-Komponenten innerhalb eines offenen Flüssigkeitskreislaufes (6): – mindestens einer die Zellkultur (16) enthaltende Filtereinrichtung (2) zur Analyse von Transzytoseprozessen in der Zellkultur (16) mittels einer Messung der jeweiligen Eingangskonzentration K_E und des Eingangsvolumens V_E mindestens eines fluoreszierenden Markers (23) in einer, die Zellkultur (16) mit hydrostatischem Druck belastenden Flüssigkeitssäule (17) sowie mit einem ersten Drucksensor (27) zur Regelung der Flüssigkeitssäule (17), – mindestens einem Fluoreszenzphotometer (3) zur Erfassung einer jeweiligen Ausgangskonzentration K_A des durch die Zellkultur (16) der Filtereinrichtung (2) diffundierenden Markers (23) und – einem Impedanzspektrometer (7) zur Messung des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER der Zellkultur (16), – mindestens einem Füllstandsmesser (4) mit einem zweiten Drucksensor (26) zur Messung von durch die Zellkultur (16) hindurch tretender Flüssigkeitsmenge mittels einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) und zur Bestimmung eines Ausgangsvolumens V_A der Flüssigkeit (25) mit dem darin befindlichen Marker (23), – mindestens einer Pumpe (5) zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitskreislaufes (6), die mit der Filtereinrichtung (2) in Verbindung steht, wobei die Filtereinrichtung (2), das Fluoreszenzphotometer (3), der Füllstandsmesser (4) und die Pumpe (5) sich im Flüssigkeitskreislauf (6) befinden, sowie – einem Computersystem (9) zur Messsteuerung und Auswertung sowie zur Anzeige der Permeabilitäten P_p, P_t als Funktionen der Parameter K_E, K_A, TER, V_E, V_A mittels einer programmtechnischen Massenbilanzierung.Device for measuring parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures with the following apparatus components within an open fluid circuit ( 6 ): - at least one cell culture ( 16 ) containing filter device ( 2 ) for the analysis of transcytosis processes in cell culture ( 16 ) by means of a measurement of the respective input concentration K _E and the input volume V _{E of} at least one fluorescent marker ( 23 ) in one, the cell culture ( 16 ) hydrostatic pressure-bearing liquid column ( 17 ) as well as with a first pressure sensor ( 27 ) for controlling the liquid column ( 17 ) At least one fluorescence photometer ( 3 ) for detecting a respective initial concentration K _A of the cell culture ( 16 ) of the filter device ( 2 ) diffusing marker ( 23 ) and - an impedance spectrometer ( 7 ) for measuring the electrical transendothelial resistance TER of the cell culture ( 16 ), - at least one level gauge ( 4 ) with a second pressure sensor ( 26 ) for measuring by cell culture ( 16 ) passing through the amount of liquid by means of a second liquid column ( 31 ) and for determining an initial volume V _{A of} the liquid ( 25 ) with the marker ( 23 ), - at least one pump ( 5 ) for maintaining the fluid circuit ( 6 ) connected to the filter device ( 2 ), the filter device ( 2 ), the fluorescence photometer ( 3 ), the level gauge ( 4 ) and the pump ( 5 ) in the fluid circuit ( 6 ), and - a computer system ( 9 ) for measuring control and evaluation as well as for displaying the permeabilities P _p , P _t as functions of the parameters K _E , K _A , TER, V _E , V _A by means of a programmable mass balancing. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtereinrichtung (2) ein oberes Kompartiment (20) und ein unteres Kompartiment (21) aufweist, wobei sich zwischen beiden Kompartimenten (20, 21) eine nach unten poröse kleinvolumige Kammer (14) mit einem darin einsetzbaren Filtereinsatz (15) befindet, in dem zumindest die Zellkultur (16) in Form einer Schicht aus zusammenhängenden Zellen vorhanden ist.Device according to claim 1, characterized in that the filter device ( 2 ) an upper compartment ( 20 ) and a lower compartment ( 21 ), whereby between the two compartments ( 20 . 21 ) a downwardly porous small volume chamber ( 14 ) with a filter insert ( 15 ) in which at least the cell culture ( 16 ) is in the form of a layer of contiguous cells. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der nach oben freien Kammer (14) auf der Zellkultur (16) eine erste Flüssigkeitssäule (17) von vorzugsweise 10 cm lastet, wobei die Kammer (14) zur ersten Flüssigkeitssäule (17) gerichtet mit einer dem oberen Kompartiment (20) zugeordneten Ringelektrode (18) sowie von der ersten Flüssigkeitssäule (17) abgewendet mit einer dem unteren Kompartiment (21) zugeordneten Elektrodenplatte (19) zur Messung des transendothelialen Widerstandes TER mit Hilfe des Impedanzspektrometers (7) in Verbindung steht und die Kammer (14) in das obere Kompartiment (20) einsetzbar ist und mit dem unteren Kompartiment (21) über den Flüssigkeitskreislauf (6) in Verbindung steht.Device according to claim 2, characterized in that in the upwardly free chamber ( 14 ) on the cell culture ( 16 ) a first liquid column ( 17 ) of preferably 10 cm, the chamber ( 14 ) to the first liquid column ( 17 ) directed with one of the upper compartment ( 20 ) associated ring electrode ( 18 ) as well as from the first liquid column ( 17 ) averted with a lower compartment ( 21 ) associated electrode plate ( 19 ) for measuring the transendothelial resistance TER by means of the impedance spectrometer ( 7 ) and the chamber ( 14 ) into the upper compartment ( 20 ) and with the lower compartment ( 21 ) via the fluid circuit ( 6 ). Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das obere Kompartiment (20) im Bereich der ersten Flüssigkeitssäule (17) mindestens eine Zuführungsleitung (22) zur gesteuerten Zugabe des Markers (23) besitzt, der gemischt mit Wasser auf der Zellkultur (16) lastet und oberhalb der Zellkultur (16) und des Filtereinsatzes (15) der Flüssigkeit (25) des Kreislaufs (6) zuführbar ist.Device according to claim 2, characterized in that the upper compartment ( 20 ) in the region of the first liquid column ( 17 ) at least one supply line ( 22 ) for the controlled addition of the marker ( 23 ) mixed with water on the cell culture ( 16 ) and above the cell culture ( 16 ) and the filter insert ( 15 ) of the liquid ( 25 ) of the cycle ( 6 ) can be fed. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Drucksensor (27) über eine fünfte Leitung (28) mit dem Computersystem (9) in Verbindung steht, mit dem die erste Flüssigkeitssäule (17) ständig höhenmäßig signaltechnisch überprüft wird.Device according to claim 4, characterized in that the first pressure sensor ( 27 ) via a fifth line ( 28 ) with the computer system ( 9 ), with which the first liquid column ( 17 ) is constantly checked in terms of signal level. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzphotometer (3) als Detektionseinheit folgende Bauelemente/Baugruppen aufweist: – eine Energieversorgungseinheit (36), an die – eine Lichtquelle (37) angeschlossen ist, – eine erste Optik (38), der – ein Anregungsfilter (39) nachgeordnet ist, wobei die Energieversorgungseinheit (36), die Lichtquelle (37), die erste Optik (38) und das Anregungsfilter (39) eine Anregungsanordnung (40) bilden, – eine auf einer Haltevorrichtung (35) angeordnete Durchflussküvette (34) mit einem Küvettenzufluss (41) und einem Küvettenabfluss (42), wobei sich in der Durchflussküvette (34) die Flüssigkeit (25) mit einem vorgesehenen Marker (23) befindet, – eine zweite Optik (44), – ein Detektionsfilter (45), – eine dritte Optik (46) sowie – ein Detektor (47), – eine Auswerteeinrichtung (48), die in das Computersystem (9) integriert ist, wobei die zweite Optik (44), das Detektionsfilter (45), die dritte Optik (46) und der Detektor (47) mit Auswerteeinrichtung (48) eine Detektoranordnung (43) darstellen.Device according to claim 1, characterized in that the fluorescence photometer ( 3 ) as a detection unit comprises the following components / assemblies: - a power supply unit ( 36 ), to which - a light source ( 37 ), - a first optic ( 38 ), which - an excitation filter ( 39 ), wherein the power supply unit ( 36 ), the light source ( 37 ), the first appearance ( 38 ) and the excitation filter ( 39 ) an excitation arrangement ( 40 ), - one on a holding device ( 35 ) arranged flow cuvette ( 34 ) with a cuvette influx ( 41 ) and a cuvette effluent ( 42 ), whereby in the flow cuvette ( 34 ) the liquid ( 25 ) with a designated marker ( 23 ), - a second optic ( 44 ), - a detection filter ( 45 ), - a third optic ( 46 ) as well as - a detector ( 47 ), - an evaluation device ( 48 ), which enter the computer system ( 9 ), the second optic ( 44 ), the detection filter ( 45 ), the third optic ( 46 ) and the detector ( 47 ) with evaluation device ( 48 ) a detector arrangement ( 43 ). Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Anschlusskabel (49, 50), die Versorgungs- und Signalempfangsleitungen darstellen, für den Anschluss der Lichtquelle (37) und für den Anschluss der Auswerteeinrichtung (48) das Fluoreszenzphotometer (3) vervollständigen.Device according to claim 6, characterized in that connection cable ( 49 . 50 ), which represent supply and signal receiving lines, for the connection of the light source ( 37 ) and for the connection of the evaluation device ( 48 ) the fluorescence photometer ( 3 ) to complete. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzphotometer (51) mit mehreren Detektionseinheiten (56, 57, 58) und einer Haltevorrichtung (351) für mehrere Durchflussküvetten (341, 342, 343, 344) in zentralsymmetrischer Anordnung versehen ist, wobei zur Haltevorrichtung (351) ein Boden (52) zur Halterung der Durchflussküvetten (341, 342, 343, 344) sowie zugehörige Trennwände (531, 532, 533, 534, 535, 536) gehören, wobei die Detektionseinheiten (56, 57, 58), jeweils bestehend aus einer Anregungsanordnung und Detektionsanordnung, einer Drehhalterungseinrichtung (54) zugeordnet sind, die mit einem die Drehrichtung umschaltbaren Antriebssystem verbunden ist, das vom Computersystem (9) aus steuerbar ist.Device according to claim 1, characterized in that the fluorescence photometer ( 51 ) with several detection units ( 56 . 57 . 58 ) and a holding device ( 351 ) for several flow cells ( 341 . 342 . 343 . 344 ) is provided in centrally symmetrical arrangement, wherein the holding device ( 351 ) a floor ( 52 ) for holding the flow cells ( 341 . 342 . 343 . 344 ) and associated partitions ( 531 . 532 . 533 . 534 . 535 . 536 ), the detection units ( 56 . 57 . 58 ), each consisting of an excitation arrangement and detection arrangement, a rotary support device ( 54 ) associated with a rotationally switchable drive system that is controlled by the computer system ( 9 ) is controllable. Einrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Trennwände (531, 532) und eine dazwischen befindliche Durchflussküvette (351) zu einem Messsektor (55) gehören.Device according to claim 8, characterized in that partitions ( 531 . 532 ) and a flow-through cuvette ( 351 ) to a measuring sector ( 55 ) belong. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzphotometer (3) mit einer Halterungsvorrichtung (352) für die Durchflussküvetten (341, 342, 343) in Verbindung steht, wobei die Durchflussküvetten (341, 342, 343) ortsfest gehaltert und in Reihe nebeneinander ausgerichtet sind und das Fluoreszenzphotometer (3) relativ linear und parallel zur Reihen-Anordnung der Durchflussküvetten (341, 342, 343) verschiebbar angeordnet ist und die Halterungsvorrichtung (352) fest platziert ist.Device according to claim 1, characterized in that the fluorescence photometer ( 3 ) with a holding device ( 352 ) for the flow cells ( 341 . 342 . 343 ), whereby the flow cells ( 341 . 342 . 343 ) are held stationary and aligned in series next to each other and the fluorescence photometer ( 3 ) relatively linear and parallel to the series arrangement of the flow cells ( 341 . 342 . 343 ) is arranged displaceably and the mounting device ( 352 ) is firmly placed. Einrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in einem vorgegebenen Strahlengang (63) sich die Lichtquelle (37), die erste Optik (38), das Anregungsfilter (39), die zweite Optik (44), das Detektionsfilter (45), die dritte Optik (46) und der Detektor (47), der über das Anschlusskabel (50) mit der Auswerteeinrichtung (48) verbunden ist, sowie ein semipermeabler Spiegel (64), der sich zwischen dem Anregungsfilter (39) und der zweiten Optik (46) befindet und der die rückstrahlende, zu erfassende Fluoreszenz in der Durchflussküvette (342) zur dritten Optik (46) und zu dem Detektor (47) gerichtet umlenkt, befinden.Device according to claim 10, characterized in that in a predetermined beam path ( 63 ) the light source ( 37 ), the first appearance ( 38 ), the excitation filter ( 39 ), the second optic ( 44 ), the detection filter ( 45 ), the third optic ( 46 ) and the detector ( 47 ), which is connected via the connecting cable ( 50 ) with the evaluation device ( 48 ) and a semipermeable mirror ( 64 ) located between the excitation filter ( 39 ) and the second optics ( 46 ) and the fluorescence to be detected in the flow-through cuvette ( 342 ) to the third optics ( 46 ) and to the detector ( 47 ) directed. Einrichtung nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in den Fluoreszenzphotometern (3,51) Blenden in die Strahlengänge eingefügt sind, die Ablenk-Winkel optimal eingestellt sind sowie die Durchflussküvetten schwarz eingefärbt zur wesentlichen Verringerung des Streulichts bzw. zur Verbesserung des wellenlängenabhängigen Fluoreszenzsignal/Rausch-Verhältnisses sind.Device according to claim 8 to 11, characterized in that in the fluorescence photometers ( 3 . 51 ) Are inserted into the beam paths, the deflection angle are optimally set and the flow cells are colored black to substantially reduce the scattered light or to improve the wavelength-dependent fluorescence signal / noise ratio. Einrichtung nach Anspruch 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchflussküvetten aus Quarzglas sind, mit denen ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erreichbar ist.Device according to claim 6 to 12, characterized that the flow cuvettes made of quartz glass, with which a high signal-to-noise ratio can be achieved is. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dem Füllstandsmesser (4) eine Volumenmesskapillare (24) mit einer zweiten Flüssigkeitssäule (31) zugeordnet ist, wobei die Volumenmesskapillare (24) mit einem Abfluss (33) verbunden ist, der ventilmäßig betätigbar ist, wobei das abfließende Vo lumen V_A als Messgröße an das Computersystem (9) übermittelt wird.Device according to claim 1, characterized in that the level gauge ( 4 ) a volume measuring capillary ( 24 ) with a second liquid column ( 31 ), wherein the volume measuring capillary ( 24 ) with a drain ( 33 ), which is operable by valve, wherein the outflowing volume V _{A is used} as a measured variable to the computer system ( 9 ) is transmitted. Einrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenmesskapillare (24) der Quantifizierung des durch die Zellkultur (16) hindurch diffundierenden Flüssigkeitsvolumens V_A dient.Device according to claim 14, characterized in that the volume measuring capillary ( 24 ) quantification of the cell culture ( 16 ) through diffusing liquid volume V _A serves. Einrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenquantifizierung über den zweiten Drucksensor (26) erfolgt, der mit der Volumenmesskapillare (24) gekoppelt ist.Device according to claim 13 or 14, characterized in that the volume quantification via the second pressure sensor ( 26 ), which is connected to the volume measuring capillary ( 24 ) is coupled. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Impedanzspektrometer (7) an die Filtereinrichtung (2) über elektrische Verbindungsleitungen (8, 32) angeschlossen ist.Device according to Claim 1, characterized in that the impedance spectrometer ( 7 ) to the filter device ( 2 ) via electrical connection lines ( 8th . 32 ) connected. Einrichtung nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Computersystem (9) über erste Leitungen (10) mit dem Impedanzspektrometer (7), über zweite Leitungen (11) mit dem Fluoreszenzphotometer (3), über dritte Leitungen (12) mit dem Füllstandsmesser (4) einschließlich des zweiten Drucksensors (26) und über vierte Leitungen (13) mit einer Pumpe (5) in elektrischer und signaltechnischer Verbindung steht.Device according to Claims 1 to 17, characterized in that the computer system ( 9 ) via first lines ( 10 ) with the impedance spectrometer ( 7 ), via second lines ( 11 ) with the fluorescence photometer ( 3 ), via third lines ( 12 ) with the level gauge ( 4 ) including the second pressure sensor ( 26 ) and fourth lines ( 13 ) with a pump ( 5 ) is in electrical and signaling connection. Einrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Computersystem (9) derart ausgebildet ist, dass es selbst eine Steuer-/Regeleinrichtung darstellt oder in eine solche als Hauptbestandteil integriert ist.Device according to claim 18, characterized in that the computer system ( 9 ) is designed such that it itself represents a control / regulating device or is integrated into such a main component. Einrichtung nach Ansprüchen 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass Mehrfachvorgänge in parallelen Flüssigkeitskreisläufen (6) durch eine entsprechende Anzahl der apparativen Einrichtungs-Komponenten durchgeführt werden, wobei – die Filtereinrichtung (2) mehrfach, – das Fluoreszenzphotometer (3, 51) für mehrere Detektionseinheiten (56, 57, 58), – der Füllstandsmesser (4) mehrfach, die jeweils in einzelne Flüssigkeitskreisläufe (6) integriert sind, während die Pumpe (5) als Mehrkanal-Rollerpumpe für mehrfache Messkammern ausgebildet ist, wobei jede Messkammer einem der Flüssigkeitskreisläufe (6) zugeordnet ist, und das Impedanzspektrometer (7) und das Computersystem (9) in einfacher Ausbildung vorgesehen sind.Device according to claims 1 to 19, characterized in that multiple operations in parallel fluid circuits ( 6 ) are performed by a corresponding number of the apparatus components, wherein - the filter device ( 2 ) several times, - the fluorescence photometer ( 3 . 51 ) for several detection units ( 56 . 57 . 58 ), - the level gauge ( 4 ), each in individual fluid circuits ( 6 ) while the pump ( 5 ) is designed as a multi-channel roller pump for multiple measuring chambers, each measuring chamber one of the fluid circuits ( 6 ), and the impedance spectrometer ( 7 ) and the computer system ( 9 ) are provided in a simple training. Einrichtung nach einem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die vorgesehenen, durch die Zellkultur (16) diffundierenden fluoreszierenden Marker (23) ein Fluorescein-isothiocyanat(FITC)-Albumin oder ein Tetramethylrhodamin-isothiocyanat(TRITC)-Dextran sind, wobei sich die zuführbaren Marker (23) im Molekulargewicht oder in der Qualität voneinander unterscheiden.Device according to any preceding claim, characterized in that the cells provided by the cell culture ( 16 ) diffusing fluorescent markers ( 23 ) is a fluorescein-isothiocyanate (FITC) -albumin or a tetramethylrhodamine-isothiocyanate (TRITC) -dextran, whereby the deliverable markers ( 23 ) differ in molecular weight or in quality from each other. Verfahren zur Messung von Parametern zur Bestimmung von parazellulären und transzellulären Permeabilitäten von Zellkulturen mittels einer Einrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21, wobei – ein Messen des Eingangsvolumens V_E der Flüssigkeit (25) einschließlich des Markers (23) und dessen Eingangskonzentration K_E mittels einer Filtereinrichtung (2), – ein Messen des elektrischen transendothelialen Widerstandes TER mittels eines Impedanzspektrometers (7) und – ein Messen der Ausgangskonzentration K_A des vorgegebenen Markers (23) mittels eines Fluoreszenzphotometers (3,51) erfolgen, durch folgende Schritte gekennzeichnet: – Durchlauf der Flüssigkeit (25) durch eine Filtereinrichtung (2), ein Fluoreszenzphotometer (3,51) und einen Füllstandsmesser (4), die miteinander verbunden in einem Kreislauf (6) mit einer die Flüssigkeit (25) im Kreislauf (6) bewegenden Pumpe (5) angeordnet sind, – Messen des Ausgangsvolumens V_A der Flüssigkeit (25) einschließlich des Markers (23) mittels eines Füllstandsmessers (4), – Speichern der gemessenen Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A im Speicher des Computersystems (9), – Berechnung der parazellulären Permeabilität P_p und der transzellulären Permeabilität P_t als Funktionen der Messwerte der Parameter K_E, K_A, TER, V_E, V_A mit P_p, P_t = f(K_E, K_A, TER, V_E, V_A), – Darstellung der Permeabilitäten P_p, P_t in Kurvenform und – Vergleichen der Permeabilitäts-Kurven.Method for the measurement of parameters for the determination of paracellular and transcellular permeabilities of cell cultures by means of a device according to claims 1 to 21, wherein - measuring the input volume V _{E of} the fluid ( 25 ) including the marker ( 23 ) and its input concentration K _E by means of a filter device ( 2 ), - measuring the electrical transendothelial resistance TER by means of an impedance spectrometer ( 7 ) and measuring the initial concentration K _{A of} the predetermined marker ( 23 ) by means of fluorescence photometers ( 3 . 51 ), characterized by the following steps: - passage of the liquid ( 25 ) by a filter device ( 2 ), a fluorescence photometer ( 3 . 51 ) and a level gauge ( 4 ), which are interconnected in a cycle ( 6 ) with a liquid ( 25 ) in the cycle ( 6 ) moving pump ( 5 ), - measuring the initial volume V _{A of} the liquid ( 25 ) including the marker ( 23 ) by means of a level gauge ( 4 ), - storing the measured quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A in the memory of the computer system ( 9 ), - calculation of the paracellular permeability P _p and the transcellular permeability P _t as functions of the measured values of the parameters K _E , K _A , TER, V _E , V _A with P _p , P _t = f (K _E , K _A , TER , V _E , V _A ), - Representation of the permeabilities P _p , P _t in waveform and - Comparing the permeability curves. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: – die Zellkultur (16) wird auf Filtereinsätze (15) von 6,5 mm, 12 mm, 24 mm oder anderer Durchmesser kultiviert und in die kleinvolumige Kammer (14) der Filtereinrichtung (2) eingesetzt, – danach wird durch die beiden Elektroden (18, 19) der transendotheliale Widerstand TER mit dem Impedanzspektrometer (7) gemessen, – die im unteren Kompartiment (21) strömende Flüssigkeit (25) wird mit Hilfe der Pumpe (5) ständig in den Flüssigkeits kreislauf (6), der bedingt durch die beiden offenen Flüssigkeitssäulen (17, 31) halboffen ist, gepumpt und – in den Flüssigkeitskreislauf (6) werden das Fluoreszenzphotometer (3) eingebunden und dazu in Reihe die Volumenmesskapillare (24) mit der zweiten Flüssigkeitssäule (31) des Füllstandsmessers (4) angeordnet.A method according to claim 22, characterized in that the following steps are carried out: - the cell culture ( 16 ) is applied to filter cartridges ( 15 ) of 6.5 mm, 12 mm, 24 mm or other diameter and into the small-volume chamber ( 14 ) of the filter device ( 2 ), then the two electrodes ( 18 . 19 ) the transendothelial resistance TER with the impedance spectrometer ( 7 ), - those in the lower compartment ( 21 ) flowing liquid ( 25 ) with the help of the pump ( 5 ) constantly in the liquid circulation ( 6 ) caused by the two open liquid columns ( 17 . 31 ) is semi-open, pumped and - into the fluid circuit ( 6 ), the fluorescence photometer ( 3 ) and in series the volume measuring capillary ( 24 ) with the second liquid column ( 31 ) of the level gauge ( 4 ) arranged. Verfahren nach Anspruch 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass mit der die zweiten Flüssigkeitssäule (31) enthaltende Volumenmesskapillare (24) das durch die Zellkultur (16) diffundierte, mindestens einen Marker (23) enthaltende Flüssigkeitsvolumen V_A über den zweiten Drucksensor (26) gemessen und überwacht wird.A method according to claim 22 and 23, characterized in that the second liquid column ( 31 ) volume measuring capillary ( 24 ) that through the cell culture ( 16 ) diffused, at least one marker ( 23 ) containing liquid volume V _A via the second pressure sensor ( 26 ) is measured and monitored. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass als Vergleichswerte für die Permeabilitäten P_p, P_t im Bereich der Zellkultur (16) die Permeabilität P_w des als Flüssigkeit (25) verwendeten Wassers ermittelt wird.Method according to one of claims 22 to 24, characterized in that as comparison values for the permeabilities P _p , P _t in the region of the cell culture ( 16 ) the permeability P _w of the liquid ( 25 ) is used. Verfahren nach Anspruch 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass mit der mehrkanaligen Einrichtung mehrere im Molekulargewicht und Qualität verschiedene Marker (23) zeitgleich angeboten und im unteren Kompartiment (21) detektiert werden.A method according to claim 22 to 25, characterized in that with the multi-channel device several markers different in molecular weight and quality ( 23 ) at the same time and in the lower compartment ( 21 ) are detected. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Zellkultur (16) während des Messvorgangs in der Filtereinrichtung (2) einem hydrostatischen Druck von 10 cm Flüssigkeitssäule (17) ausgesetzt werden.Method according to one of claims 22 to 26, characterized in that the cells of the cell culture ( 16 ) during the measuring process in the filter device ( 2 ) a hydrostatic pressure of 10 cm liquid column ( 17 ) get abandoned. Verfahren nach Ansprüchen 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass mit den drei aufgenommenen Messgrößen – dem Widerstand TER, den Konzentrationen K_E, K_A des Markers (23) und den Volumen V_E, V_A – unter Berücksichtigung der biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften des Markers (23) und einem in den programmtechnischen Mitteln vorhandenen Massenbilanzierungsprogramm sowohl die transzelluläre Permeabilität P_t und parazelluläre Permeabilität P_p als auch Transportkinetiken erstellt werden.Method according to claims 22 to 27, characterized in that with the three recorded measured variables - the resistance TER, the concentrations K _E , K _{A of} the marker ( 23 ) and the volume V _E , V _A - taking into account the biophysical and biochemical properties of the marker ( 23 ) and a mass balancing program present in the program means, both the transcellular permeability P _t and paracellular permeability P _p and transport kinetics are created. Verfahren nach Anspruch 22 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass Veränderungen der Marker (23) während des Messvorgangs durch Proteinfällung oder mittels der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie – HPLC – bestimmt werden, wobei für die Proteinfällung bekannte Verfahren eingesetzt werden und wobei das abgespaltene Tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC) oder das abgespaltene Fluorescein-isothiocyanat (FITC) nicht gefällt werden und dann im Überstand nach Abzentrifugieren des gefällten Proteins und einem pH-Abgleich gemessen werden.Method according to claim 22 to 28, characterized in that changes of the markers ( 23 ) during the measurement process by protein precipitation or by means of high-performance liquid chromatography - HPLC - are used, wherein the cleaved tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) or the split fluorescein isothiocyanate (FITC) are not precipitated known methods for protein precipitation and then measured in the supernatant after centrifuging off the precipitated protein and adjusting the pH. Verfahren nach Anspruch 22 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die gemessenen Größen K_E, K_A, TER, V_E, V_A mittels eines Gesamtprogramms im Computersystem (9) aufgenommen, gespeichert, ausgewertet und angezeigt werden, wobei die Werte aus den einzelnen Messgrößen K_E, K_A, TER, V_E, V_A gemäß eines Auswerteprogramms zu zugehörigen Permeabilitätsdiagrammen ausgewertet werden.A method according to claim 22 to 29, characterized in that the measured quantities K _E , K _A , TER, V _E , V _A by means of an overall program in the computer system ( 9 ), stored, evaluated and displayed, wherein the values from the individual measured variables K _E , K _A , TER, V _E , V _A are evaluated according to an evaluation program for the corresponding permeability diagrams.