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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von
Biomolekülen, insbesondere von Nukleinsäuren wie
DNA- und RNA-Molekülen.
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Technischer Hintergrund
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Die
Aufreinigung und Analyse von Biomolekülen aus biologischen
Proben spielt eine immer größere Rolle in der
biomedizinischen Grundlagenforschung, der klinischen Forschung und
Diagnostik, der forensischen Analytik, der Populationsgenetischen
Forschung, der epidemiologischen Analytik und diesen verwandten
Fachgebieten. Dies betrifft insbesondere Nukleinsäuren
wie DNA- und RNA-Moleküle, aber auch Aminosäuren,
Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide,
Fette, Fettsäuren und/oder Lipide.
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Die
Biologie hat in den letzen zwanzig Jahren hierfür ein umfassendes
molekularbiologisches Instrumentarium entwickelt. Daher ist für
die Zukunft mit einer noch stärkeren Verbreitung von molekularbiologischen Analysen
zu rechnen, z. B. in der medizinischen und klinischen Diagnostik,
in der Forensik, in der Pharmazie bei der Entwicklung und Evaluierung
von Arzneimitteln, in der Lebensmittelanalytik sowie bei der Überwachung
der Lebensmittelherstellung, in der Agrarwirtschaft bei der Züchtung
von Nutzpflanzen und Nutztieren sowie in der Umweltanalytik und
in vielen Forschungsgebieten.
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Durch
die Analyse des Transkriptoms, also der mRNA in Zellen, lassen sich
die Aktivitäten von Genen direkt bestimmen. Die quantitative
Analyse von Transkriptmustern (mRNA-Mustern) in Zellen durch moderne molekularbiologische
Methoden, wie z. B. Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR ("Real time
RT PCR") oder Genexpressions-Chip-Analysen ermöglicht z.
B. die Erkennung fehlerhaft exprimierter Gene, wodurch z. B. Stoffwechselkrankheiten,
Infektionen oder eine etwaige Prädisposition für
eine Krebserkrankung erkannt werden können.
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Die
Analyse des Genoms, also der Gesamtheit der zellulären
DNA, durch molekularbiologische Methoden, wie z. B. PCR, NASBA,
RFLP, AFLP oder Sequenzierung ermöglicht z. B. den Nachweis
genetischer Defekte oder die Bestimmung des HLA-Typs sowie anderer
genetischer Marker. Überdies fallen DNA-Fingerprinting
zur forensischen, populationsgenetischen oder lebensmittelrechtlichen
Analyse unter diesen Oberbegriff. Die Analyse genomischer DNA und
RNA wird auch zum direkten Nachweis von infektiösen Erregern,
wie Viren, Bakterien usw. eingesetzt.
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Die
Analyse anderer Biomoleküle, wie z. B. Aminosäuren,
Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide,
Fette, Fettsäuren und/oder Lipide, kann z. B. Auskunft
liefern über bestimmte physiologische Zustände, über
Kontaminationen in Lebensmitteln, über den Gehalt bestimmter
Nährstoffe und so weiter.
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Voraussetzung
all dieser Ansätze ist jedoch, dass die in einer Probe
enthaltenen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren,
isoliert bzw. aufgereinigt werden, um sie anschließend
einem der beschriebenen nachgeordneten Verfahren zuzuführen.
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Da
die nachzuweisenden Biomoleküle häufig nur in
sehr geringer Konzentration auftreten, ist eine effektive und ausbeutereiche
Aufreinigung der in der Probe enthaltenen Biomoleküle von
entscheidender Bedeutung.
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Es
gibt eine Vielzahl von Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen
aus biologischen Proben. Häufig wird dabei ein Zentrifugationsschritt
verwendet, in dessen Rahmen eine gelöste Probe in ein Zentrifugengefäß verbracht
wird, welches eine Bindungsmatrix aufweist. Bei der Zentrifugation
wird die Lösung durch die Matrix befördert und
die aufzureinigenden Biomoleküle verbleiben in gebundener
Form an der Matrix. Sie werden dann im weiteren Verlauf aus der
Matrix eluiert und aufgefangen.
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Ein
diesem Prinzip folgendes Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
ist z. B. das sogenannte "Boom principle"-Verfahren, das in der
EP389063 offenbart ist.
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Hierbei
wird eine Nukleinsäuren enthaltende Probe in Anwesenweit
eines chaotropen Salzes in ein Gefäß mit einer
Silikatmatrix gegeben. Anschließend wird das Gefäß zentrifugiert,
oder es wird ein Vakuum angelegt. Dies führt dazu, dass
die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix binden, während
alle anderen Bestandteile der Probe (insbesondere Zelltrümmer,
Organelle, Proteine und dergleichen) die Silikatmatrix passieren und
verworfen werden. Anschließend werden die gebundenen Nukleinsäuren
mit einem geeigneten Agens eluiert und der weiteren Analyse zugeführt.
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Die
für die Bindung relevanten Mechansimen sind z. B. in Melzak
et al. (1996), Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate
Solutions, Journal of Colloid and Interface Science 181 (2), 635–644,
beschrieben.
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Für
dieses Verfahren werden häufig sogenannte "spin columns"
verwendet. Dies sind Mikroreaktionsgefäße, die
eine scheibenförmige Silikatmatrix aufweisen, nach unten
hin offen sind, und in ein weiteres, unten geschlossenes Mikroreaktionsgefäß platziert
werden. Die Nukleinsäuren enthaltende Probe wird zusammen mit
einem chaotropen Salz in das Mikroreaktionsgefäß einpipettiert.
Anschließend wird die Kombination beider Mikroreaktionsgefäße
in eine Zentrifuge eingebracht und bei einem Beschleunigungswert
von etwa 10000 × g zentrifugiert. Die Nukleinsäuren
binden dabei an die Silikatmatrix, während alle anderen
Bestandteile der Probe die Silikatmatrix passieren und in das zweite,
unten geschlossene Mikroreaktionsgefäß überführt
werden. Letzteres wird anschließend verworfen, während
die gebundenen Nukleinsäuren mit einem geeigneten Agens eluiert
und der weiteren Analyse zugeführt werden.
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Solche
und ähnliche Produkte werden u. A. von der Anmelderin der
vorliegenden Erfindung angeboten, aber auch von Wettbewerbern wie
Promega, Ambion, Macherey und Nagel sowie Invitrogen.
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Kritisch
bei solchen Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen
ist, dass die erzielten Ausbeuten in vielen Fällen nicht
ausreichen. Es sind dies insbesondere Fälle, bei denen
die Biomolekülmenge in der Probe so gering ist, dass mit
den herkömmlichen Aufreinigungsmethoden die Ausbeute nicht
ausreicht, um die Moleküle anschließend nachzuweisen.
Bei solchen Proben handelt es sich z. B., um forensische Proben
oder Proben, in denen die RNA eines schwach exprimierten Gens analysiert
werden soll.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die beschriebenen,
sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu überwinden.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die
erwähnten Verfahren so zu verbessern, dass die erzielten
Biomolekülausbeuten erhöht werden, um so auch
unter ungünstigen Umständen Biomoleküle,
insbesondere Nukleinsäuren, aus einer Probe aufreinigen, und
sie einer anschließenden Analyse zugänglich machen
zu können.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Diese
Aufgabe wird mit den Merkmalen des vorgelegten Hauptanspruchs gelöst.
Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen
an. Dabei ist zu beachten, dass die genannten Bereichsangaben durchweg
einschließlich der jeweiligen Grenzwerte zu verstehen sind.
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Demgemäss
ist vorgesehen, ein Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen
aus einer Probe bereitzustellen, das die folgenden Schritte aufweist:
- a) Anordnen eines Reaktionsgefäßes
mit einer Bindungsmatrix in einer Zentrifuge, wobei vor bzw. nach
diesem Schritt eine Lösung bzw. Suspension aus einer Biomoleküle
enthaltenden Probe in dem Reaktionsgefäß hergestellt
bzw. in das Reaktionsgefäß eingefüllt
wird; sowie
- b) Einlegen mindestens eines mehrstufigen Zentrifugationsschritts,
bestehend aus mindestens einem ersten Zentrifugationsschritt bei
einem ersten Beschleunigungswert und mindestens einem zweiten Zentrifugationsschrittes
bei einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als
der erste Beschleunigungswert; wobei
- c) es sich bei Schritt b) um einen Bindeschritt, einen Waschschritt
und/oder einen Elutionsschritt handeln kann.
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Bevorzugt
handelt es sich bei dem mehrstufigen Schritt b) um einen Bindeschritt,
bei welchem die Biomoleküle durch Zentrifugation an die
Bindungsmatrix gebunden werden. In diesem Fall stellen sich erheblich verbesserte
Biomolekül-Ausbeuten ein, wie in den Beispielen gezeigt
ist. Ebenso bevorzugt kann es sich bei diesem Schritt aber auch
um einen Waschschritt handeln.
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Weiterhin
kann vorgesehen sein, dass ggf. weitere Zentrifugationsschritte
vor dem ersten, zwischen dem ersten und dem zweiten oder nach dem
zweiten Zentrifugationsschritt eingelegt werden.
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In
weiteren bevorzugten Ausgestaltung ist überdies vorgesehen,
dass das Verfahren mindestens einen Bindeschritt, einen Waschschritt
und einen Elutionsschritt umfasst, die Durchweg mindestens einen
ggf. mehrstufigen Zentrifugationsschritt umfassen.
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Besonders
bevorzugt ist vorgesehen, dass es sich bei den Biomolekülen
um Stoffe ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Nukleinsäuren,
Aminosäuren, Oligopeptide, Polypeptide, Monosaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, Fette, Fettsäuren und/oder
Lipide handelt.
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Unter
dem Begriff "Nukleinsäuren" werden im folgenden insbesondere
RNA und DNA verstanden. Als DNA kommt hier insbesondere plasmidische,
genomische, virale und mitochondriale DNA in Frage, während als
RNA insbesondere mRNA, siRNA, miRNA, rRNA, snRNA, t-RNA, hnRNA und
totalRNA in Frage kommt.
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Grundsätzlich
kann es sich bei den hier eingeführten Nukleinsäuren
um jeden Typ von Polynukleotid handeln, der ein N-Glykosid oder
C-Glykosid einer Purin- oder Pyrimidinbase darstellt. Die Nukleinsäure
kann einzel-, doppel- oder mehrsträngig, linear, verzweigt
oder zirkulär sein. Sie kann einem in einer Zelle vorkommenden
Molekül entsprechen, wie etwa genomische DNA oder Boten-RNA
(mRNA), oder in vitro erzeugt werden wie Komplementär-DNA
(cDNA), Gegenstrang-RNA (aRNA), oder synthetische Nukleinsäuren.
Die Nukleinsäure kann aus wenigen Nukleotiden oder auch
aus vielen tausend Nukleotiden bestehen.
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Unter
dem Begriff "Reaktionsgefäß mit einer Bindungsmatrix"
sollen im folgenden biochemische Trennprinzipien verstanden werden,
bei denen in einem Reaktionsgefäß oder einer miniaturisierten
Säule eine selektiv bestimmte Stoffe assoziierende Bindungsmatrix
angeordnet ist.
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Unter
dem Begriff "Beschleunigungswert" wird im Folgenden die durch die
Rotationsgeschwindigkeit der Zentrifuge erzielte, auf das Zentrifugationsgut
einwirkende Vielfache der Erdbeschleunigung bezeichnet. Diese wird
mit der Größe g = 9.81 ms–2 gemessen.
1000 × g bezeichnet z. B. einen Beschleunigungswert, der dem
1000-fachen der Erdbeschleunigung gleicht. Der Beschleunigungswert
wird auch als "Schleuderzahl" bezeichnet und entspricht nicht der
Drehzahl der Zentrifuge, die in der Regel in Umdrehungen pro Minute
(upm) bezeichnet wird. Der Beschleunigungswert wird konstruktiv
durch den Zentrifugen-Trommeldurchmesser (Wirkdurchmesser) und die
Drehzahl bestimmt.
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Unter
dem Begriff "Zentrifugationsschritt" wird im folgenden ein Verfahrensschritt
verstanden, der sich durch eine definierbare Dauer und einen definierbaren
Beschleunigungswert auszeichnet.
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Diese
Bindungsmatrix weist bevorzugt einen Anionentauscher, ein Silikatsubstrat,
ein Kunststoffsubstrat, oder ein Chitosan enthaltendes Substrat
auf.
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Unter
dem Begriff "Silikatsubstrat" soll im folgenden eine Membran, ein
Pellet, eine Packung oder eine Scheibe aus porösem Silikat
verstanden werden, die eine große innere Oberfläche
aufweist und in dem Reaktionsgefäß so angeordnet
ist, dass eine Lösung, die in das Reaktionsgefäß gegeben
wird, bei Anlage eines Vakuums oder bei Zentrifugation durch die
Membran, das Pellet, die Packung oder die Scheibe hindurchgetrieben
wird, dergestalt, dass die in der Lösung befindlichen Bestandteile
mit den Bestandteilen der Matrix in Kontakt treten. Bevorzugt handelt
es sich bei dem Silikatsubstrat um eine Matrix aus Kieselgel. Ebenso
kann das Silikatsubstrat aus gepressten Glasfasern oder Glaskugeln
(„microbeads") bestehen. Silikatsubstrate werden z. B.
in den von der Anmelderin unter den Handelsmarken QIAprep und RNeasy
vertriebenen Aufreinigungskits verwendet.
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Anionentauscher
sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt. Hier
wird in der Regel ein Harz verwendet, das z. B. mit den negativ
geladenen Phosphatresten des Nukleinsäure-Rückgrats
wechselwirkt. Die Salzkonzentration und die pH-Werte der verwendeten
Puffer bestimmen, ob die Nukleinsäure an das Harz bindet
oder aus der Säule eluiert wird.
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Solche
Anionentauscher werden z. B. von der Anmelderin unter den Handelsmarkem
QIAGEN Genomic-tip und Plasmid-tip vertrieben.
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Chitosan
ist erst in jüngerer Zeit als Bindungsagens für
Biomoleküle ins Gespräch gekommen. Es handelt
sich hierbei um ein Copolymer aus β-1,4-glykosidisch verknüpften
N-Acetyl-Glucosaminresten und Glucosaminresten. Unter physiologischen
Bedingungen trägt Chitosan positive Nettoladungen und ist
daher in der Lage, viele negative geladene Biomoleküle,
insbesondere Nukleinsäuren, Aminosäuren, Oligo-
und Polypeptide, Fette und Fettsäuren, zu binden.
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Weiterhin
ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt vorgesehen,
dass die Bindungsmatrix ein Silikatsubstrat aufweist, und dass ferner
die Biomoleküle enthaltende Probe vor der Zentrifugation
mit mindestens einem chaotropen Salz vermischt wird. Diese Ausgestaltung
eignet sich besonders für Nukleinsäuren. Das dabei
zur Anwendung kommende Trennprinzip beruht auf dem bereits diskutierten
"Boom principle"-Verfahren. Dabei wird eine Nukleinsäuren
enthaltende Probe in Anwesenheit eines chaotropen Salzes in ein
Gefäß mit einer Silikatmatrix gegeben. Anschließend
wird das Gefäß zentrifugiert, oder es wird ein
Vakuum angelegt. Dies führt dazu, dass die Nukleinsäuren
an die Silikatmatrix binden, während alle anderen Bestandteile
der Probe (insbesondere Zelltrümmer, Organelle, Proteine
und dergleichen) die Silikatmatrix passieren und verworfen werden.
Anschließend werden die gebundenen Nukleinsäuren
mit einem geeigneten Agens eluiert und der weiteren Analyse zugeführt.
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Bevorzugt
sind bei dieser Ausgestaltung die folgenden Schritte vorgesehen:
- a) Anordnen eines säulenartigen Reaktionsgefäßes
mit einer Bindungsmatrix aufweisend ein Silikatsubstrat in einer
Zentrifuge, wobei vor bzw. nach diesem Schritt eine Lösung
bzw. Suspension aus einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe
und mindestens einem chaotropen Salz in dem Reaktionsgefäß hergestellt bzw.
in das Reaktionsgefäß eingefüllt wird;
- b) Einlegen eines ersten Zentrifugationsschrittes bei einem
ersten Beschleunigungswert;
- c) Einlegen eines zweiten Zentrifugationsschrittes bei einem
zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der erste
Beschleunigungswert;
- d) ggf. Einlegen weiterer Zentrifugationsschritte zwischen Schritt
c) und Schritt d) bzw. nach Schritt d);
- e) ggf. Einlegen eines oder mehrerer Waschschritte; und
- f) Elution der an das Silikatsubstrat gebundenen Nukleinsäuren
mit einer Elustionslösung.
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In
dieser Ausgestaltung handelt es sich bei dem mehrschrittigen Zentrifugationsschritt
um einen Bindungsschritt, bei welchem die Nukleinsäuren
an die Silikatmatrix gebunden werden. Diese Ausgestaltung führt gegenüber
aus dem Stand der Technik bekannten, einschrittigen Verfahren mit
Silikatmatrices enthaltenden "Spin columns" zu einer erheblich verbesserten
Ausbeute an aufzureinigenden Nukleinsäuren. Alternativ
oder zusätzlich hierzu kann jedoch auch vorgesehen sein,
dass der Wasch- und/oder der Elutionsschritt im Sinne des obigen
Protokolls mehrschrittig ausgelegt sind.
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Der
oder die Waschschritte erfolgen bevorzugt mit einem Waschpuffer.
Dieser kann insbesondere Ethanol und/oder Aceton enthalten.
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Bei
der Elutionslösung zur Elution der an die Bindungsmatrix
gebundenen Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren,
kann es sich z. B. um Wasser (einschließlich Aqua dest)
oder eine niedrigmolare Lösung handeln. Hier kommt z. B.
eine schwach konzentrierte Kochsalzlösung in Frage.
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Das
chaotrope Salz liegt bevorzugt bereits in Lösung vor. Alternativ
kann die Nukleinsäuren enthaltende Probe in Lösung
bzw. Suspension vorliegen und an schließend mit einem chaotropen
Salz versetzt werden. Wiederum alternativ können Probe
und chaotropes Salz als Feststoff vorliegen und gemeinsam in Lösung
bzw. Suspension gebracht werden.
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Unter
dem Begriff „säulenartiges Reaktionsgefäß"
soll im folgenden ein Gefäß verstanden werden, dass
ggf. oben verschließbar und ggf. unten offen ist. Das Reaktionsgefäß weist
oben beschriebene Silikatmatrix auf. Ein typisches Beispiel für
ein Reaktionsgefäß im obigen Sinne sind die sogenannten „spin
columns", wie sie z. B. von der Anmelderin hergestellt und vertrieben
werden. Die Reaktionsgefäße können bevorzugt
so ausgestaltet sein, dass sie passgenau in einem handelsüblichen,
etwas größeren Reaktionsgefäß,
wie es z. B. von der Firma Eppendorf vertrieben wird, angeordnet
werden können. In diesem Fall dient das größere
Reaktionsgefäß als Auffanggefäß für
die die Bindungsmatrix passierende Flüssigkeit.
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Den
genannten erfindungsgemäßen Verfahren ist gemein,
dass durch die erstmalige Kombination aus einem Zentrifugationsschritt
bei niedrigem Beschleunigungswert und einem Zentrifugationsschritt
bei hohem Beschleunigungswert die Ausbeute bei der Biomolekülaufreinigung
um bis zu 20% erhöht wird, wie Untersuchungen der Anmelderin
ergeben haben (siehe Beispiele). Hierdurch werden analytische Untersuchungen
erheblich erleichtert und in vielen Fällen sogar erst ermöglicht;
es sind dies Fälle, bei denen z. B. die Nukleinsäuremenge
in der Probe so gering ist, dass mit den herkömmlichen
Aufreinigungsmethoden die Ausbeute nicht ausreicht, um die Nukleinsäuren
zu amplifizieren und/oder nachzuweisen.
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Die
erwähnten Verbesserungen der Ausbeute sind überraschend
und für den Fachmann nicht vorhersehbar gewesen. Angesichts
der Tatsache, dass "column spin"-Verfahren bislang durchweg bei
einem einzigen Beschleunigungswert durchgeführt werden,
erscheint ein zweischrittiges Zentrifugationsverfahren bei oberflächlicher
Betrachtung als sehr unattraktiv, weil dies eine längere
Zeit in Anspruch nimmt als ein einschrittiges Zentrifugationsverfahren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren kann in einer handelsüblichen,
manuell bedienbaren Tischzentrifuge durchgeführt werden,
wie sie z. B. von dem Laborgerätehersteller Eppendorf hergestellt
wird und in jedem biowissenschaftlich arbeitenden Labor vorhanden
ist. In diesem Fall wird das Zentrifugationsprotokoll mit mindestens
zwei Zentrifugationsschritten bei unterschiedlichen Beschleunigungswerten „von
Hand" absolviert, d. h. für das Einlegen der unterschiedlichen
Zentrifugationsschritte ist ein Benutzereingriff erforderlich.
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Bevorzugt
ist allerdings vorgesehen, dass das erfindungsgemäße
Verfahren in einer automatischen und/oder programmierbaren Zentrifuge
durchgeführt wird. Hier kann insbesondere vorgesehen sein,
dass die Zentrifuge bereits ein oder mehrere intern gespeicherte
Zentrifugationsprotokolle mit mindestens zwei Zentrifugationsschritten
bei unterschiedlichen Beschleunigungswerten aufweist. Eine solche
Zentrifuge fällt ausdrücklich unter den Schutzbereich
der vorliegenden Erfindung.
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Besonders
bevorzugt handelt es sich bei der biologischen Probe um ein Material
ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Probenmaterial, Plasma,
Körperflüssigkeiten, Blut, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta
Phlogistica, Sputum, Urin, Sperma, Faeces, forensische Proben, Abstriche,
Punktate, Biopsien, Gewebeproben, Gewebeteile und Organe, Lebensmittelproben,
Umweltproben, Pflanzen und Pflanzenteile, Bakterien, Viren, Viroide,
Prionen, Hefen und Pilze, sowie Fragmente oder Bestandteile der
vorgenannten Materialien, und/oder isolierte, synthetische bzw.
modifizierte Proteine, Nukleinsäuren, Lipide, Kohlenhydrate,
Stoffwechselprodukte und/oder Metaboliten.
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Zur
anschließenden Analyse der Nukleinsäuren in der
oder aus der biologischen Probe können dabei alle dem Fachmann
bekannten und geeignet erscheinenden Analyseverfahren eingesetzt
werden, vorzugsweise Verfahren ausgewählt aus der Gruppe
umfassend die Lichtmikroskopie, die Elektronenmikroskopie, die konfo
kale Laserscanningmikroskopie, die Laser-Micro-Dissection, Scanningelektro nenmikroskopie,
das Western-Blotting, den Southern-Blotting, den Enzymelinked Immonosorbent-Assay
(ELISA), die Immunpräzipitation, die Affinitätschromatographie,
die Mutationsanalyse, die Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE),
insbesondere die zweidimensionale PAGE, die HPLC, die Polymerasekettenreaktion
(PCR), die RFLP-Analyse (Restriction Fragment Length Polymorphism-Analyse),
die SAGE-Analyse (Serial Analysis of Gen Expression), die FPLC-Analyse
(Fast Protein Liquid Chromatography), die Massenspektrometrie, beispielsweise
die MALDI-TOFF-Massenspektrometrie oder die SELDI-Massenspektrometrie,
die Microarray-Analyse, die LiquiChip-Analyse, die Analyse der Aktivität
von Enzymen, HLA-Typing, Sequenzierung, WGA („Whole Genome Amplification"),
RT-PCR, Real-Time-PCR bzw -RT-PCR, RNase-Protection-Analyse oder
Primer-Extension-Analyse.
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Bevorzugt
ist vorgesehen, dass dem Verfahren ein Schritt zur Lyse von Biomoleküle
enthaltenden Zellen oder Geweben vorausgeht.
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Bei
diesem Lyseschritt kann es sich z. B. um eine physikalische oder
eine chemische Lyse handeln. Als physikalische Lyseverfahren kommen
insbesondere die Verwendung von Ultraschall, ein sukzessives Einfrieren
und Auftauen ("freeze/thaw"), die Verwendung von rotierenden Messern,
die Verwendung von oszillierenden Microbeads, die Einwirkung eines
hypotonischen Schocks, das sogenannte "French Press-Verfahren" oder
das sogenannte "Cell-Bomb-Verfahren" zum Einsatz.
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Als
chemisches Lyseverfahren kommt insbesondere die Verwendung von Phenol,
Chloroform und/oder Isoamylalkohol in Frage. Ebenso fallen enzymatische
Verfahren unter diesen begriff, so z. B. die Verwendung von Lysozym
für Bakterien oder die Verwendung von β-Glucuronidase
("snail gut enzyme") für Hefe.
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Eine
Sonderform ist die alkalische Lyse. Diese wird insbesondere angewendet,
um aus bereits lysierten Bakterien Plasmid-DNA zu isolieren. Durch
die Zugabe von NaOH zum Zellextrakt lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen
zwischen den komplementären DNA-Strängen sowohl
der chromosomalen als auch der Plasmid-DNA, wobei die Plasmid-DNA
aufgrund ihrer Konformation in der Lage ist, vollständig
zu renaturieren. Die chromosomale DNA, die durch die einzelnen Präparationsschritte
zerstückelt wurde, kann nach Neutralisation des pH-Wertes
mit Kaliumacetat und Eisessig nicht renaturieren, es bilden sich
DNA-Doppelstränge mit nur kurzen komplementären
Bereichen und durch die ungerichtete Verbindung vieler DNA-Einzelstränge
kommt es zur Ausbildung einer verworrenen DNA-Masse. Diese kann
relativ leicht zusammen mit dem durch die Neutralisation ausgefallenem
NaOH abzentrifugiert werden. Bei diesem Zentrifugationsschritt setzen sich
ferner Zellmembran- und Zellwandbestandteile sowie Proteine als
Pellet ab. Die Plasmid-DNA befindet sich nach der Zentrifugation
im Überstand.
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Weiterhin
ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten chaotropen
Salz um ein Salz bzw. ein Gemisch von Salzen ausgewählt
aus der Gruppe enthaltend Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumrhodanid,
Guanidiniumiodid, Harnstoff, Ammoniumsulfat, Natriumiodid, Kaliumiodid,
Natriumperchlorat, Natrium(iso)thiocyanat und Guanidiumthiocyanat
handelt.
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Chaotrope
Salze sind Salze, die eine hohe Affinität zu Wasser haben
und deshalb eine Hydrathülle ausbilden. In Anwesenheit
dieser Salze werden die hydrophoben Interaktionen in Proteinen destabilisiert,
weil die Löslichkeit der hydrophoben Seitenketten steigt,
und das Protein denaturiert. Nukleinsäuren wie DNA und RNA
werden hingegen nicht beeinträchtigt, weil zur Stabilisierung
derselben keine hydrophoben Wechselwirkungen erforderlich sind.
Hinzu kommt, dass die Kationen der chaotropen Salze in hohen Konzentrationen
die negativen Ladungen auf der Oberfläche von Silikaten,
insbesondere in Silikatmatrices, absättigen und eine positive
Nettoladung erzeugen, was die Bindung der Nukleinsäuren
an die Silikatmatrices erheblich forciert.
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Der
erste Zentrifugationsschritt des Verfahrens wird bevorzugt bei einem
Beschleunigungswert im Bereich zwischen 5–2000 × g
durchgeführt. Besonders geeignete Beschleunigungswerte
liegen bei 10 × g, 27 × g, 50 × g, 150 × g,
300 × g, 500 × g, 800 × g, 1000 × g
und 1500 × g. Dieser Zentrifugationsschritt kann beispielweise
eine Dauer von 5 s–20 min haben. Besonders bevorzugt ist
eine Dauer von 10 s–10 min. Besonders bevorzugt ist eine
Dauer von 30 s–5 min.
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Der
zweite Zentrifugationsschritt des Verfahrens wird bevorzugt bei
einem Beschleunigungswert im Bereich zwischen 100–25.000 × g
durchgeführt. Besonders geeignete Beschleunigungswerte
liegen bei 180 × g, 610 × g, 1000 × g,
2500 × g, 8000 × g, 12.000 × g und/oder
17.000 g. Dieser Zentrifugationsschritt kann ebenfalls beispielsweise
eine Dauer von 5 s–20 min haben. Besonders bevorzugt ist
eine Dauer von 10 s–10 min. Ganz besonders bevorzugt ist
eine Dauer von 30 s–5 min.
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Wie
aus der obigen Darstellung ersichtlich, überschneiden sich
die Wertebereiche für die Beschleunigungswerte des ersten
und des zweiten Zentrifugationsschritts. Es muß erfindungsgemäß jedoch
gewährleistet sein, dass der Bescheunigungswert des ersten
Zentrifugationsschritts immer unterhalb des Bescheunigungswerts
des zweiten Zentrifugationsschritts liegt.
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Weiterhin
ist bevorzugt vorgesehen, dass die Reaktionsgefäße
in einem Zentrifugenrotor vom „swing-out-Typ" zentrifugiert
werden. Bei solchen Rotoren stellt sich der erforderliche Zentrifugationswinkel erst
ein, wenn der Rotor in Bewegung versetzt wird. Zwar weist das erfindungsgemäße
Verfahren auch bei der Verwendung von Festwinkelrotoren die genannten
Verbesserungen bei der Ausbeute auf, allerdings kommen Zentrifugenrotoren
vom „swing-out-Typ" bevorzugt dann zum Einsatz, wenn Substanzen
in bereits im Rotor angeordnete Reakti ons- oder Zentrifugiergefäße
gegeben werden sollen, z. B. durch Pipettieren oder mit Hilfe eines
Pipettierroboters.
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Besonders
bevorzugt ist vorgesehen, dass die einzelnen Schritte des Verfahrens
automatisiert ablaufen. Hierzu hat die Anmelderin u. A. eine eigene
Vorrichtung entwickelt, die die Funktionen eines Pipettierroboters
und einer programmierbaren Zentrifuge vereint. Mit Hilfe eines solchen
automatisierten Verfahrens läßt sich der Labordurchsatz
wesentlich erhöhen und gleichzeitig Zuordnungsfehler weitgehend
vermeiden. Beide Faktoren spielen gerade in klinischen, forensischen,
epidemiologischen und populationsgenetischen Untersuchungen eine
wichtige Rolle.
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Ferner
ist ein Reaktionsgefäß, aufweisend eine Bindungsmatrix,
zur Verwendung in einem Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen,
bevorzugt Nukleinsäuren, aus einer Probe vorgesehen. Ein
solches Reaktionsgefäß ist z. B. in 3 gezeigt.
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Weiterhin
ist erfindungsgemäß eine Zusammensetzung zur Verwendung
in einem Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen, bevorzugt
Nukleinsäuren, aus einer Probe vorgesehen, wobei die Zusammensetzung
mindestens einen Bestandteil aufweist ausgewählt aus der
Gruppe enthaltend alkalische Agenzien, Phenol, lytische Enzyme,
Isoamylalkohol, Chloroform, Chaotrope Salze, Alkohole, Wasser, anorganische
oder organische Salze.
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Bei
dieser Zusammensetzung kann es sich z. B. um einen Lysepuffer (Phenol,
lytische Enzyme, Isoamylalkohol, Chloroform), einen Bindungspuffer
(Chaotrope Salze), einen Waschpuffer (Alkohole, anorganische oder
organische Salze) oder um einen Elutionspuffer (anorganische oder
organische Salze) handeln.
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Ferner
ist erfindungsgemäß ein Kit of Parts vorgesehen,
aufweisend mindestens eine solche Zusammensetzung. Besonders bevorzugt
weist dieser Kit mindestens ein wie oben erwähntes Reaktionsgefäß sowie weiterhin
Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen in oder aus einer
biologischen Probe oder zur Analyse der Morphologie einer biologischen
Probe auf.
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Als
Reagenzien zur Analyse von Biomolekülen kommen hier insbesondere
Reagenzien zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren,
Aminosäuren, Oligopeptiden, Polypeptiden, Monosacchariden,
Oligosacchariden, Polysacchariden, Fetten, Fettsäuren und/oder
Lipiden zum Einsatz. Der Fachmann kann solche Reagenzien aus der
Fachliteratur ohne eigene erfinderische Leistung auffinden. Häufig
sind solche Reagenzien als Kits für die jeweils zu analysierenden
Biomoleküle bereits fertig erhältlich. Diese Reagenzien
umfassen insbesondere Farbstoffe zum Färben von Zellen
oder Zellbestandteilen, Antikörper, gegebenenfalls markiert mit
Fluoreszenzfarbstoffen oder Enzymen, eine Absorptionsmatrix, wie
etwa DEAE-Zellulose oder eine Silica-Membran, Substrate für
Enzyme, Agarose-Gele, Polyacrylamid-Gele, Lösungsmittel
wie Ethanol oder Phenol, wässrige Pufferlösungen,
RNase-freies Wasser, Lyse-Reagenzien, alkoholische Lösungen
und dergleichen.
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Dabei
kann die Zusammensetzung bereits in dem Gefäß abgefüllt
sein. Denkbar ist aber auch, dass das Kit als einen weiteren Bestandteil
eine Dosierungsvorrichtung umfasst, die mit der Zusammensetzung
gefüllt ist und mittels derer definierte Portionen der
Zusammensetzung, vorzugsweise unter sterilen Bedingungen, in das
Gefäß eingefüllt werden können.
Eine solche Dosierungsvorrichtung kann beispielsweise in Form eines
Seifenspenders ausgebildet sein.
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Erfindungsgemäß ist überdies
eine Vorrichtung zur Aufreinigung von Biomolekülen, bevorzugt
Nukleinsäuren, aus einer Probe vorgesehen, aufweisend eine
Zentrifuge, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorrichtung
Mittel aufweist, die es ermöglichen, dass während
einer Zentrifugation ohne Benutzereingriff mindestens zwei Zentrifugationsschritte
mit unterschiedlich hohen Beschleunigungswerten automatisiert eingelegt werden.
Für diesen Zweck ist in der Regel eine Mikroprozessorsteuerung
erforderlich, die eine Speichereinrichtung aufweist, in welcher mehrschrittige
Zentrifugationsprotokolle abgespeichert und/oder abspeicherbar sind.
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Erfindungsgemäß ist
ebenso eine Zentrifugationsvorrichtung vorgesehen, die Mittel zur
Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens zur Aufreinigung
von Biomolekülen aus einer Probe gemäß aufweist. Hierbei
ist insbesondere an eine Mikroprozessorsteuerung gedacht, die es
ermöglicht, dass während einer Zentrifugation
ohne Benutzereingriff mindestens zwei Zentrifugationsschritte mit
unterschiedlich hohen Beschleunigungswerten automatisiert eingelegt
werden.
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Eine
solche Zentrifugationsvorrichtung weist Mittel zur automatisierten
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
auf. Hierzu zählt u. A. neben der erwähnten Mikroprozessorsteuerung
z. B. ein Pipettierroboter.
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Weiterhin
ist erfindungsgemäß eine aufgereinigte Nukleinsäure
vorgesehen, herstellbar mit einem Verfahren, einer Zusammensetzung,
einem Kit und/oder einer Vorrichtung gemäß der
vorliegenden Erfindung. Bei dieser Nukleinsäure handelt
es sich insbesondere um plasmidische, genomische, virale und mitochondriale
DNA bzw. mRNA, siRNA, miRNA, rRNA, snRNA, t-RNA, und hnRNA.
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Abbildungen und Beispiele
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden gezeigten und
diskutierten Beispiele sowie Abbildungen genauer erläutert.
Dabei ist zu beachten, dass die Beispiele nur beschreibenden Charakter
haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner
Form einzuschränken.
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Beispiel 1: Grundsätzliche Vorgehensweise
(einschrittiges Verfahren nach dem Stand der Technik)
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Auf
einer Agarplatte gewachsene Bakterienkolonien, enthaltend ein zu
isolierendes Plasmid, werden gepickt, in je 3 ml LB Flüssigkulturmedium
suspendiert und über Nacht bei 37°C zur Vermehrung
der inkubiert. Die gesättigten 3 ml Bakterienübernachtkulturen
werden in einer Tischzentrifuge bei 13000 rpm pelletiert. Die Isolation
der Plasmid-DNA erfolgt nach einem modifizierten Standardprotokoll
der Firma Qiagen nach der Methodik von Birnboim: Der Überstand
der Bakterienkultur wird abgenommen und verworfen. Das Pellet wird
mit 250 μl Puffer P1 (Qiagen) versetzt und resuspendiert.
Durch Zugabe von 250 μl Puffer P2 (Qiagen) und 4–5 mal
vorsichtigem Schütteln werden die Bakterien lysiert ("alkalische
Lyse"); die Lysereaktion darf nicht länger als 5 min andauern,
weil ansonsten die genomische DNA mobilisiert wird. Durch Zugabe
von 350 μl Puffer N3 (Qiagen) und sofortiges leichtes Schütteln
wird die Lysereaktion daher gestoppt. Die lysierten Bakterienwandbestandteile
werden für 10 min bei 13000 rpm pelletiert.
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Die
im Überstand befindlichen Plasmide werden vorsichtig abgenommen
und in eine vorbereitete Qiagen Spin Column pipettiert. Anschließend
wird wie folgt weiter verfahren:
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Beispiel 2A. Vergleich der DNA-Ausbeute
zwischen einschrittigem und zweischrittigem Zentrifugationsverfahren
(Bindungsschritt)
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3
ml einer Bakterienkultur (DH10B), die das Plasmid puc 19 enthält,
wurden geerntet und wie oben beschrieben lysiert und in Spin Columns
(Modell QIAprep) überführt, und anschließend
einem herkömmlichen einschrittigen ("manual 1-step protocol")
bzw. zweischrittigen ("manual 2-step binding") Zentrifugationsverfahren
zugeführt. Die Verfahrensparameter waren wie folgt:
| | einschrittig | zweischrittig |
| Probe | Bakterienpellet
in 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen | Bakterienpellet
in 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen |
| Lyseschritt | 250 μl
P1 | 250 μl
P1 |
| 250 μl
P2 | 250 μl
P2 |
| 350 μl
N3 | 350 μl
N3 |
| Lysatklärung | Zentrifugieren
10 min 17000 × g | Zentrifugieren
10 min 17000 × g |
| Bindungsschritt | geklärtes
Lysat auf Säule übertragen | geklärtes
Lysat auf Säule übertragen |
| Zentrifugieren
1 min 27 × g |
| Zentrifugieren
1 min 17000 × g | Zentrifugieren
1 min 2400 × g |
| Waschschritt | 750 μl
PE | 750 μl
PE |
| Zentrifugieren
1 min 17000 × g | Zentrifugieren
1 min 17000 × g |
| Elutionsschritt | 50 μl
EB | 50 μl
EB |
| 1
min/RT | 1
min/RT |
| Zentrifugieren
1 min 17000 × g | Zentrifugieren
1 min 17000 × g |
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Die
wesentlichen Unterschiede im Zentrifugationsprotokoll sind grau
hinterlegt. Die Puffer P1, P2, N2, PE und EB sind Bestandteile des
QIAprep-Kits. Anschließend wurde die Ausbeute an Plasmid-DNA
untersucht. Es wurden jeweils 8 parallele Versuche durchgeführt,
die Ergebnisse wurden statistisch ausgewertet und sind in 2A gezeigt.
Während mit dem einschrittigen Verfahren eine DNA-Ausbeute
von 8454 ng erzielt wurde, wurde mit dem zweischrittigen Verfahren
eine Ausbeute von 9540 ng erzielt. Die Unterschiede sind signifikant.
Es ist durchweg erkennbar, dass die DNA-Ausbeute mit dem zweischrittigen
Verfahren um ca. 13% höher ausfiel.
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Beispiel 2B. Vergleich der DNA-Ausbeute
zwischen einschrittigem und zweischrittigem Zentrifugationsverfahren
(Waschschritt)
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Ähnliche
Unterscheide waren feststellbar, wenn statt des Bindungsschrittes
der Waschschritt zweistufig ausgelegt war, etwa so wie in folgender
Tabelle dargestellt:
| | einschrittig | zweischrittig |
| Probe | Bakterienpellet
in 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen | Bakterienpellet
in 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen |
| Lyseschritt | 250 μl
P1 | 250 μl
P1 |
| 250 μl
P2 | 250 μl
P2 |
| 350 μl
N3 | 350 μl
N3 |
| Lysatklärung | Zentrifugieren
10 min 17000 × g | Zentrifugieren
10 min 17000 × g |
| Bindungsschritt | geklärtes
Lysat auf Säule übertragen | geklärtes
Lysat auf Säule übertragen |
| Zentrifugieren
1 min 17000 × g | Zentrifugieren
1 min 17000 × g |
| Waschschritt | 750 μl PE | 750 μl
PE |
| Zentrifugieren 1 min 12000 × g | Zentrifugieren
1 min 27 × g |
| Zentrifugieren
1 min 12000 × g |
| Elutionsschritt | 50 μl
EB | 50 μl
EB |
| 1
min/RT | 1
min/RT |
| Zentrifugieren
1 min 17000 × g | Zentrifugieren
1 min 17000 × g |
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Die
wesentlichen Unterschiede im Zentrifugationsprotokoll sind grau
hinterlegt. Es wurden jeweils 8 parallele Versuche durchgeführt,
die Auswertung erfolgte ähnlich wie in obigem Beispiel.
Die Ergebnisse sind in 2B gezeigt. Während
mit dem einschrittigen Verfahren eine DNA-Ausbeute von 4022 ng erzielt
wurde, wurde mit dem zweischrittigen Verfahren eine Ausbeute von
4803 ng erzielt. Die Unterschiede sind signifikant. Es ist durchweg
erkennbar, dass die DNA-Ausbeute mit dem zweischrittigen Verfahren
um ca. 19% höher ausfiel.
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Beispiel 2C. Vergleich der RNA-Ausbeute
zwischen einschrittigem und zweischrittigem Zentrifugationsverfahren
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Jurkat-Zellen
wurden mit einem Standardverfahren (Qiagen RNeasy) lysiert und in
Spin Columns (Modell RNeasy) überführt, und anschließend
einem herkömmlichen einschrittigen ("manual standard protocol") bzw.
zweischrittigen ("manual 2-step binding") Zentrifugationsverfahren
zugeführt. Die Verfahrensparameter waren wie folgt:
| | einschrittig | zweischrittig |
| Probe | Jurkat-Zellen
in 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen | Jurkat-Zellen
in 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen |
| Lyseschritt | 350 μl
RLT | 350 μl
RLT |
| 350
ml 70% EtOH | 350
ml 70% EtOH |
| Bindungsschritt | Zentrifugieren
1 min 8000 × g | Zentrifugieren
1 min 27 × g |
| Zentrifugieren
1 min 180 × g |
| Waschschritt | 700 μl
RW1 | 700 μl
RW1 |
| 500 μl
RPE | 500 μl
RPE |
| 1
min 8000 × g Eppendorf | 1
min 8000 × g Eppendorf |
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Die
Unterschiede im Zentrifugationsprotokoll sind grau hinterlegt. Die
Puffer RPE, RW1 und RLT sind Bestandteile des RNeasy-Kits. Anschließend
wurde die Ausbeute an RNA untersucht. Es wurden jeweils 8 parallele
Versuche durchgeführt, die Ergebnisse wurden statistisch
ausgewertet und sind in 2C gezeigt.
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Während
mit dem einschrittigen Verfahren eine RNA-Ausbeute von 1836 ng erzielt
wurde, wurde mit dem zweischrittigen Verfahren eine Ausbeute von
2011 ng erzielt. Die Unterschiede sind signifikant. Es ist durchweg
erkennbar, dass die RNA-Ausbeute mit dem zweischrittigen Verfahren
um ca. 9% höher ausfiel.
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1 zeigt
als Zeitdiagramm den beispielhaften Ablauf eines Zentrifugationsprotokolls
gemäß dem erfindungsgemäßen
Verfahren mit einem mehrstufigen Zentrifugationsschritt. In dem
gezeigten Beispiel handelt es sich bei dem mehrstufigen Zentrifugationsschritt
um einen Bindeschritt, bei welchem die Biomoleküle durch
Zentrifugation an die Bindungsmatrix gebunden werden.
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Hierzu
wird die aufzureinigende Probe mit dem Bindungspuffer versetzt und
dann zunächst für 1 min bei 500 × g zentrifugiert.
Anschließend beschleunigt die Zentrifuge, bis ein Beschleunigungswert
von 8000 × g erreicht ist, und die Probe wird bei diesem
Wert weitere 75 sec. zentrifugiert. Während dieser Prozedur
binden die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix, während
alle restlichen Bestandteile die Silikatmatrix passieren und verworfen
werden können. Anschließend wird mit einem Waschpuffer
gewaschen, und die Nukleinsäuren werden mit einem Elutionspuffer
von der Säule gewaschen und aufgefangen.
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2 zeigt die Ergebnisse der in Beispiel
2A, 2B und 2C beschriebenen Experimente. Dabei sind einerseits die
absoluten Ausbeuten an Nukleinsäure in ng gezeigt, und
andererseits ist der Performancevorsprung des jeweils zweischrittigen
Verfahrens in % gezeigt.
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3 zeigt
ein Reaktionsgefäß 30, aufweisend eine
Silikatmatrix 31, zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen
Verfahren. Nachdem das Reaktionsgefäß 30 mit
eine Lösung bzw. Suspension aus einer Nukleinsäuren
enthaltenden Probe und mindestens einem chaotropen Salz beschickt
bzw. eine solche Lösung bzw. Suspension in dem Reaktionsgefäß hergestellt
wurde, wird das Reaktionsgefäß in ein Passgenau
größeres Auffanggefäß 32 platziert.
Die Kombination aus beiden Gefäßen wird nun in
einer nicht dargestellten Zentrifuge dem erfindungsgemäßen
Zentrifugationsprotokoll mit erstem Zentrifugationsschritt bei einem
ersten Beschleunigungswert und zweitem Zentrifugationsschritt bei
einem zweiten Beschleunigungswert, der höher ist als der
erste Beschleunigungswert, unterzogen. Während dieser Prozedur
binden die Nukleinsäuren an die Silikatmatrix, während
alle restlichen Bestandteile die Silikatmatrix passieren und verworfen
werden können. Anschließend wird mit einem Waschpuffer
gewaschen, und die Nukleinsäuren werden mit einem Elutionspuffer von
der Säule gewaschen und aufgefangen.
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4 zeigt ähnlich
wie 1 als Zeitdiagramm den beispielhaften Ablauf von
zwei weiteren Zentrifugationsprotokollen gemäß dem
erfindungsgemäßen Verfahren. Im zuoberst dargestellten
Protokoll wird die Zentrifuge zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten
bei verschiedenen Beschleunigungswerten kurz angehalten. Es gelten
im Übrigen die zu 1 aufgeführten
Beschreibungen.
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In
dem zuunterst dargestellten Protokoll wird zwischen dem ersten und
dem zweiten Zentrifugationsschritt ein weiterer Zentrifugationsschritt
bei einem intermediären Beschleunigungswert eingelegt.
Es ist denkbar, dass noch weitere Zentrifugationsschritte eingelegt
werden, dies würde dem Zeitdiagramm ein mehr oder weniger
treppenförmiges Aussehen verleihen.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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-
Zitierte Patentliteratur
-
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Melzak et
al. (1996), Driving Forces for DNA Adsorption to Silica in Perchlorate
Solutions, Journal of Colloid and Interface Science 181 (2), 635–644 [0012]