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Die
vorliegende Erfindung betrifft natürliche und synthetische Acylphloroglucinole,
insbesondere Hyperforin und Myrtucommulon sowie deren strukturellen
Derivate als Hemmstoffe der induzierbaren mitochondrialen Prostaglandin
E2 Synthase-1 und deren Anwendung zur Therapie
von Prostaglandin E2-vermittelten Erkrankungen.
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Die
Prostaglandinbiosynthese wird durch die initialen Schritte der Umwandlung
von Arachidonsäure
zu Prostaglandin (PG)H2 durch die Cyclooxygenase
(COX)-1 oder -2 eingeleitet. Gewisse PGs, dazu gehörend das
PGE2, sind Mediatorstoffe bei Entzündungen
(v. a. rheumatoide Arthritis), Schmerz und Fieber, und sind des
Weiteren bei Krebserkrankungen (Lunge, Kolon, Endometrium) beteiligt,
andere PGs dagegen erfüllen
wichtige physiologische Funktionen [1]. Hemmstoffe der COX-1 und
-2 unterbinden damit die Synthese aller PGs und weisen aufgrund
der Hemmung physiologisch wichtiger PGs (wie PGF2α, PGI2, PGD2) und aufgrund
der PGE2 Hemmung in der Magenmucosa beträchtliche
Nebenwirkungen (Magen, Niere, kardiovaskuläres System) auf [2]. Der Biosyntheseweg
der Prostaglandine ist in 1 gezeigt.
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Die
induzierbare mikrosomale Prostaglandin E2 Synthase-1
(mPGES-1) ist Mitglied der MAPEG Familie und katalysiert die Umwandlung
von PGH2 zu PGE2 [3].
Neben der mPGES-1 sind die mPGES-2 und die cytosolische (c) PGES
als PGE2 Synthasen bekannt [4]. Interessanterweise
ist die mPGES-1 an die Aktivität
der COX-2 gekoppelt und die Expression beider Enzyme ist durch entzündungsrelevante
Stimuli (Interleukin-1β,
Tumornekrosisfaktorα)
induzierbar. Die COX-1 dagegen stellt PGH2 als
Substrat für die
cPGES bereit und beide Enzyme werden konstitutiv exprimiert. Das
von der COX-2/mPGES-1 lokal synthetisierte PGE2 weist
im Gegensatz zu den physiologisch notwendigen PGs ausgeprägte pathophysiologische
Eigenschaften (Entzündung,
Schmerz, Fieber, Krebserkrankungen, Angiogenese) auf. Dagegen wird
das für
die Magenmucosa protektiv wirkende PGE2 von
der COX-1/cPGES direkt im Magen produziert.
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Seit
Entdeckung der mPGES-1 im Jahre 1999 ist man bestrebt, potente und
selektive Hemmstoffe gegen die mPGES-1 zu entwickeln, um die PGE2 Synthese bei entzündlichen Vorgängen selektiv
zu inhibieren, ohne dabei die Bildung der physiologisch wichtigen
PGs und des im Magen protektiv wirkenden PGE2 zu
unterdrücken.
Weiterhin konnte im Gegensatz zu selektiven COX-2 Inhibitoren (sog. Coxibe
wie z. B. Rofecoxib oder Celecoxib) die Suppression des vasodilatorischen
PGI2 durch selektiven pharmakologischen
Angriff an der mPGES-1 vermieden werden. Dies macht die mPGES-1
zu einem hochinteressanten Arzneistoff-Target, v. a. bei entzündlichen
Erkrankungen (z. B. rheumatoide Arthritis), die mit Schmerz oder
Fieber einhergehen, aber auch bei diversen Krebserkrankungen. Allerdings
ist bislang kein Inhibitor der mPGES-1 als Arzneimittel zur Therapie
zugelassen. Die Anzahl verfügbarer Hemmstoffe
(wie z. B. MK-886) ist noch äußerst gering,
die derzeit noch am Anfang der klinischen Prüfung stehen. Die Motivation
der pharmazeutischen Forschung sichere und selektive Hemmstoffe
der mPGES-1 zu finden ist enorm.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Nachteile der
bekannten Verfahren (Einsatz von Hemmstoffen der COX Enzyme) zu
umgehen, und Wirkstoffe, insbesondere Naturstoffe, und pharmazeutische
Zubereitungen zu identifizieren, die in der Lage sind, die mPGES-1
selektiv zu hemmen. Diese Wirkstoffe sollen zur therapeutischen
Behandlung von PGE2-vermittelten Erkrankungen,
insbesondere rheumatoide Arthritis, bereitgestellt werden, um bei
einer hohen Effizienz geringe Nebenwirkungen aufzuweisen.
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Diese
Aufgabe wird durch den Einsatz von Acylphloroglucinolen, insbesondere
Hyperforin und Myrtucommulon sowie deren struktureller Derivaten gelöst, wie
es im Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungen
sowie das Verfahren zur therapeutischen Behandlung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis
10 genannt.
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Hyperforin
ist ein natürlich
vorkommendes, prenyliertes Acylphloroglucinol aus dem Johanniskraut
(Hypericum perforatum L.) [5]. In geläufigen, kommerziell in Apotheken
oder Drogerien erhältlichen
Johanniskrautextrakten ist Hyperforin bis zu 4% enthalten. Johanniskrautextrakte
kommen hauptsächlich
zur Anwendung um leichte bis mittelstarke Depressionen zu lindem
[6]. Hyperforin gilt hierbei als wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoff
und führte
in zahlreichen zellulären
und tierexperimentellen Untersuchungen zur Erhöhung der Konzentration verschiedener
Neurotransmitter im zentralen Nervensystem [7]. Der genaue Wirkmechanismus
ist unbekannt. Daneben wurden für
Hyperforin apoptotische Eigenschaften beschrieben, die besonders
gegenüber
Krebszellen ausgeprägt
zu sein scheinen [8]. Auch zur Behandlung von atopischer Dermatitis
wurde Hyperforin getestet [9]. Als molekulare Targets für Hyperforin
wurden der Pregnan-X-Rezeptor, die 5-Lipoxygenase und die Cyclooxygenase-1
beschrieben [10]. In der Literatur sind Untersuchungen von Effekten
des Hyperforins auf die Biosynthese des PGE2 nicht
bekannt.
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Myrtucommulon
ist ein nicht-prenyliertes Acylphoroglucinoiderivat, das bislang
nur in den Blättern
(0,12% in getrockneten Blättern)
der Myrte (Myrtus communis L.) nachgewiesen wurde. Myrte wird seit
Jahrtausenden als Gewürz
und zur Herstellung von Likören
verwendet. Für
Myrte bzw. deren charakteristische Inhaltstoffe wurden bisher nur
wenige pharmakologische Wirkungen nachgewiesen. Dazu gehören anti-hyperglykämische [11-13],
antibakterielle [14, 15] und analgetische Effekte [16]. Darüber hinaus
wurden schwache antioxidative Wirkungen beobachtet [17-19]. Es wurde
außerdem
kürzlich
gezeigt, dass Myrtucommulon proinflammatorische Eigenschaften von
Leukozyten suprimiert [20]. So hemmt Myrtucommulon die COX-1 moderat
(IC50 = 17 μM), die Aktivität der COX-2
wird dagegen nicht inhibiert. Effekte auf die Biosynthese des PGE2 durch Präparationen der Myrte oder deren
charakteristischen Inhaltsstoffen (insbesondere Myrtucommulon) sind
nicht bekannt. Ebenso sind toxische oder unerwünschte Wirkungen an Menschen
durch Applikation von Myrte-Zubereitungen nicht oder kaum beobachtet
worden. Die Strukturformeln von Acylphloroglucinolen Myrtucommulon
und Hyperforin sowie von zwei weiteren Substanzen Semi-Myrtucommulon und
Isobutyrophenon-Kern sind in 2 gezeigt.
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In
der vorliegenden Erfindung konnte zum ersten Mal gezeigt werden,
dass Hyperforin aus Johanniskraut, natürliches Myrtucommulon aus den Blättern der
Myrte und vollsynthetisches Myrtucommulon die katalytische Aktivität der humanen
mPGES-1 (Umwandlung von PGH2 zu PGE2) hemmen (3 und 4).
Damit sind Acylphloroglucinole, insbesondere Hyperforin und Myrtucommulon
sowie deren Derivate als direkte Hemmstoffe der mPGES-1 bzw. Hemmstoffe
der PGE2 Synthese zu betrachten. Bislang
sind weder Hyperforin noch Myrtucommulon als Hemmstoffe der PGE2-Synthese beschrieben worden.
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In
einer Ausführung
der Erfindung werden Extrakte aus den ganzen Myrtenpflanzen oder
Teilen davon verwendet, wobei insbesondere frische oder getrocknete
Blätter
der Myrte geeignet sind, welche die höchste Konzentration der Substanz
Myrtucommulon enthalten. Daneben werden Extrakte aus den Blüten des
Johanniskrauts verwendet. Besonders bevorzugt sind dabei jeweils
lipophile Extrakte, z. B. auf der Basis von Chloroform, Aceton o. ä., weil
sie im Vergleich zu nicht-lipophilen Extrakten (z. B. zu Extrakten
in Wasser oder Ethanol) wesentlich mehr Myrtucommulon bzw. Hyperforin
enthalten.
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In
einer weiteren Ausführung
der Erfindung wird natürliches
Hyperforin aus den Blüten
des Johanniskraut, natürliches
Myrtucommulon aus den Blättern
der Myrte, als auch vollsynthetisches Myrtucommulon verwendet. In
einer bevorzugten Ausführung
der Erfindung wird vollsynthetisches Myrtucommulon verwendet. Dieses
kann z. B. nach einem Verfahren von Jauch et al. (nicht publiziert)
gewonnen werden.
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In
einer weiteren Ausführung
werden strukturelle Derivate des Myrtucommulons oder des Hyperforins
verwendet, die eine vergleichbare oder bessere Hemmwirkung auf die
mPGES-Aktivität
haben.
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Die
Erfindung umfasst ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
mindestens einen Wirkstoff aus Johanniskraut, Myrte oder/und eines seiner
Derivate und gegebenenfalls ein pharmazeutisches Trägermaterial
enthält.
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Die
Erfindung umfasst ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
mindestens ein anderes Acylphloroglucinol und gegebenenfalls ein pharmazeutisches
Trägermaterial
enthält.
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Zur
therapeutischen Behandlung von PGE2-vermittelten
Erkrankungen sind Plasmakonzentrationen von ca. 3 μM Myrtucommulon
oder Hyperforin erstrebenswert, das könnte etwa die p. o. Gabe von
etwa 500-1000 mg/Tag sein.
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Die
Verabreichung von Acylphloroglucinolen wie Hyperforin oder Myrtucommulon
und deren Derivaten oder diese enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen
zur Therapie von Erkrankungen kann oral oder parenteral erfolgen.
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Der
Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass für das Arzneistofftarget
mPGES-1 mit Acylphloroglucinolen Grundstrukturen identifiziert wurden,
die zur Hemmung der Aktivität
der mPGES-1 führen.
Damit könnte
nun selektiv die Synthese des PGE2 durch
COX-2/mPGES-1 gehemmt werden, ohne dabei, wie bislang mittels Inhibitoren
der COX-1 und -2, auch die Synthese anderer (physiologisch wichtiger)
PGs zu hemmen. Dies hat zur Folge, dass die Therapie PGE2-vermittelter Erkrankungen mittels Acylphloroglucinolen
im Vergleich zu COX-1/2 Inhibitoren weniger Nebenwirkungen aufweisen
dürfte. Des
Weiteren kann durch Verwendung von Acylphloroglucinolen der Einsatz
bzw. die Dosis von nicht-steroidalen Antiphlogistika (COX Inhibitoren)
reduziert und die Dauer der Einnahme verkürzt werden, die wegen ihrer
unspezifischen Blockade der Synthese aller PGs zu erheblichen Nebenwirkungen
führen.
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Die
Erfindung kann genutzt werden, um alle Formen von Erkrankungen,
die mit einer erhöhten Produktion
von PGE2 einhergehen, zu behandeln. Dabei
handelt es sich primär
um entzündliche
Erkrankungen (v. a. rheumatoide Arthritis), fiebrige und schmerzhafte
Zustände,
sowie Krebserkrankungen, bei denen PGE2 eine
Rolle spielt.
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Weitere
Vorteile, Merkmale und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden
nachstehend anhand der Ausführungsbeispiele
mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen:
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1:
Biosyntheseweg des PGE2;
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2:
Struktur von Acylphloroglucinolen Myrtucommulon (MC), Semi-Myrtucommulon (S-MC),
Isobutyrophenon-Kern (IBP-C) und Hyperforin (Hyp);
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3:
Hemmung der mPGES-1-vermittelten Synthese von PGE2 (Prozentuale
Aktivität
gegenüber
der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in der mikrosomalen Fraktion
von Interleukin-1β-stimulierten A549
Zellen (Mittelwert + Standardfehler, n = 4). 1 = natürliches
Myrtucommulon, 2 = synthetisches Myrtucommulon, 3 = Semi-Myrtucommulon, 4
= Isobutyrophenon-Kern;
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4:
Hemmung der mPGES-1-vermittelten Synthese von PGE2 (Prozentuale
Aktivität
gegenüber
der Kontrolle mit DMSO als Solvent) in der mikrosomalen Fraktion
von Interleukin-1β-stimulierten A549
Zellen (Mittelwert + Standardfehler, n = 4), Hyp = natürliches
Hyperforin.
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Ausführungsbeispiele
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Einfluss von Acylphloroglucinolen auf
die Aktivität
der mPGES-1
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A549
Zellen wurden mit Interleukin-1β (1 ng/ml)
für 72
Stunden inkubiert. Nach Ernte und Zellzahlbestimmung wurden die
pelletierten Zellen auf Trockeneis/Ethanol schockgefroren, durch
Zugabe von 1 ml Homogenisierungspuffer (4°C) wieder aufgetaut und mittels
Ultraschall homogenisiert. Nach Zentrifugation (10.000 g für 10 min
bei 4°C)
wurde der erhaltene Überstand
bei 174.000 g und 4°C
für 1 h
Stunde zentrifugiert um Mikrosomen zu gewinnen. Das Pellet (Mikrosomen)
wurde im Homogensierungspuffer gelöst und mit den Testsubstanzen
(Hyperforin, Myrtucommulon und Derivate bzw. DMSO) für 10 min
bei 4°C
in 96-well Platten vorinkubiert. Dann wurde PGH2 als
Substrat zugegeben und die Reaktion nach 1 min bei 4°C mittels
Stopplösung (enthält u. a.
Fe2+, Citronensäure und 11-β-PGE2 als Standard)
beendet. Ein Ansatz wird bereits vor Reaktionsbeginn mit der Stopplösung versetzt
um den Gehalt an PGE2 in der PGH2-Lösung
zu ermitteln. Nach Festphasenextraktion (RP-18-Säulen und Acetonitril als Elutionsmittel)
wurde die Probe mittels HPLC (RP-18, UV-Detektion bei 190 nm) analysiert.
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Es
zeigt sich, dass die Vorinkubation der mikrosomalen Fraktion von
Interleukin-1β-stimulierten A549
Zellen zu einer potenten Hemmung der mPGES-1 Aktivität führt, indem
3 μM Myrtucommulon die
PGE2-Synthese aus PGH2 zu
ca. 74% hemmt, der IC50-Wert liegt bei ca.
1 μM (3).
Hyperforin hemmt die PGE2-Synthese aus PGH2 bei einer Konzentration von 10 μM zu 77%,
der IC50-Wert liegt bei ca. 2,8 μM (4).
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