DE102006040513A1 - Method for the quantitative determination of colocalization of molecular markers in tissue sections - Google Patents

Method for the quantitative determination of colocalization of molecular markers in tissue sections Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet: - Erzeugung eines digitalisierten Bildes des Gewebeschnittes für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers, - Überlagerung der digitalisierten Bilder zu einem Summenbild, - bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild, - Erzeugung einer Matrix, wobei jedem Bildpunkt ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten die quantisierten Molekülmarkersignale der wenigstens zwei Molekülmarker sind, und - gewebespezifische standardisierte Ausrichtung der Matrix. Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, sowie eine Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.The invention relates to a method for the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections. The method according to the invention is characterized by the following method steps: generation of a digitized image of the tissue section for each of the at least two molecular markers for displaying the respective molecule marker, superposition of the digitized images into a summation image, pixel-wise quantization of the molecular marker signal for each of the at least two molecule markers in the Summation image, - generation of a matrix, wherein each pixel is assigned a vector whose components are the quantized molecular marker signals of the at least two molecular markers, and - tissue-specific standardized orientation of the matrix. Furthermore, the invention relates to a device for the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections, as well as a use of the method according to the invention.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten.The The invention relates to a method for the quantitative determination of Colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, especially in skin and Mucosal tissue sections.

Zur Untersuchung der korrelativen Verteilung und Anordnung verschiedener Molekülspezies in Gewebeschnitten, werden derzeit verschiedene Techniken und Verfahren im Bereich der Biologie, der Biochemie und der Medizin angewandt. Zielsetzung bei der Anwendung solcher Verfahren ist es, aus den so gewonnenen Kenntnissen zur Molekülanordnung und Verteilung diagnostische Daten zu bestimmten Krankheitsbildern zu erhalten oder Erkenntnisse über die Organisation von Zellen oder Zellsystemen auf molekularer Ebene zu gewinnen.to Investigation of the correlative distribution and arrangement of various molecular species in tissue sections, are currently various techniques and procedures applied in the field of biology, biochemistry and medicine. The objective of applying such methods is to derive from the thus gained knowledge about the molecular arrangement and distribution diagnostic To obtain data on specific diseases or findings on the Organization of cells or cell systems at the molecular level to win.

Die aus dem Stand der Technik bekannten und in der Biologie, Biochemie und Medizin standardmäßig eingesetzten Verfahren basieren weitgehend auf manuellen Methoden. Bei diesen wird der zu untersuchende Gewebeschnitt mit einer Lösung versetzt, die ein spezifisches Reagenz, z. B. einen Farbstoff oder einen Antikörper, enthält. Dieses markiert eine zu untersuchende Molekülgruppe dadurch, dass es sich an diese anlagert oder mit ihr beispielsweise unter Bildung eines spezifischen Komplexes reagiert. Im Anschluss wird der die so markierten Molekülgruppen enthaltene Gewebeschnitt durch verschiedene, zumeist optische Methoden untersucht, wobei ein die zu ermittelnde Anordnung und Verteilung der interessierenden Molekülgruppe wiedergebendes Signalverteilungsmuster aufgenommen wird.The known in the art and in biology, biochemistry and medicine used by default Procedures are based largely on manual methods. In these the solution to be examined is treated with a solution, which is a specific reagent, eg. As a dye or an antibody contains. This marks a group of molecules to be examined in that it is attaches to this or with her example, to form a reacts specific complex. After that, the so marked molecular groups contained tissue section by various, mostly optical methods examined, with a to be determined arrangement and distribution the molecular group of interest reproducing signal distribution pattern is recorded.

Eine bewährte Methode stellt hierbei die Fluoreszenzmikroskopie dar, bei der die Fluoreszenz von mit einem Fluorophor, beispielsweise Fluorescein-Iso-Thiocyanat oder Phycoerythrin, markierten Molekülen gemessen wird. Dabei wird ein Fluoreszenzsignalverteilungsmuster aufgenommen, welches die Verteilung und Anordnung des markierten Moleküls in dem mikroskopierten Objekt wiedergibt. Zur Bestimmung der Kolokalisation mehrerer markierter Molekülspezies ist das vorstehend beschriebene Verfahren unter dem Einsatz jeweils unterschiedlicher Fluorophore entsprechend oft zu wiederholen. Die für die unterschiedlichen Molekülspezies jeweils erhaltenen Fluoreszenzsignalverteilungsmuster sind anschließend zur Bestimmung der korrelativen Verteilung der untersuchten Molekülspezies gemeinsam auszuwerten.A proven The method is fluorescence microscopy, in which the Fluorescence from with a fluorophore, for example fluorescein iso-thiocyanate or phycoerythrin, labeled molecules is measured. This becomes a fluorescence signal distribution pattern which shows the distribution and arrangement of the labeled molecule in the reproduces the microscopic object. To determine the colocalization several labeled molecule species is the method described above under the use respectively Repeat different fluorophores often. The for the different molecular species respectively obtained fluorescence signal distribution pattern are then to Determination of the correlative distribution of the investigated molecular species together evaluate.

Ein Verfahren zur Automatisierung wiederholter Fluoreszenzmarkierung zum Zwecke der Ermittlung der Kolokalisation von Molekülspezies in einer Zell- oder Gewebeprobe ist in der DE 197 09 348 C2 beschrieben. Bei diesem als "automatisches Multi-Epitop-Ligand-Kartierungsverfahren" (MELK) bezeichneten automatisierten Verfahren wird eine Vorrichtung verwendet, die ein Pipettiersystem, ein 3D-Handhabungssystem sowie ein optisches Messsystem umfasst. Durch das automatische Pipettiersystem wird die zu untersuchende Zell- oder Gewebeprobe nach und nach mit unterschiedlichen Inkubationslösungen, die jeweils ein oder mehrere Fluorophor-konjugierte Reagenzien enthalten, versetzt, wobei bei jedem Inkubationszyklus ein Fluoreszenzverteilungsmuster durch ein an ein Fluoreszenzmikroskop angeschlossenes Bildaufnahmegerät, beispielsweise eine CCD-Kamera, aufgenommen wird. Die so erhaltenen Fluoreszenzbilder, deren Anzahl der Anzahl der unterschiedlichen Inkubationslösungen entspricht, können nun computerunterstützt überlagert werden, so dass aus den verschiedenen Einzelmustern ein resultierendes komplexes Kombinationsmuster zur gemeinsamen Darstellung der Verteilung und Anordnung der unterschiedlichen markierten Molekülspezies entsteht. Mit diesem Verfahren ist es folglich möglich, mit vergleichsweise geringem manuellpräparativem Aufwand Aufschluss über die molekulare Anordnung bzw. Verteilung einzelner Molekülspezies in einer Zell- oder Gewebeprobe zu erhalten. Allerdings ist das Verfahren auf rein qualitative Aussagen zur Kolokalisation unterschiedlicher Molekülspezies beschränkt.A method of automating repetitive fluorescence labeling for the purpose of determining the colocalization of molecular species in a cell or tissue sample is described in U.S. Pat DE 197 09 348 C2 described. This automated method, termed "automatic multi-epitope ligand mapping method" (MELK), uses a device that includes a pipetting system, a 3D handling system, and an optical measuring system. The automatic pipetting system is used to gradually add the cell or tissue sample to be incubated with different incubation solutions, each containing one or more fluorophore-conjugated reagents, a fluorescence distribution pattern being passed through an image acquisition device, such as a CCD, attached to a fluorescence microscope at each incubation cycle. Camera, is being recorded. The fluorescence images thus obtained, the number of which corresponds to the number of different incubation solutions, can now be superimposed with computer assistance, so that a complex complex pattern resulting from the various individual patterns for the common representation of the distribution and arrangement of the different labeled molecule species. With this method, it is consequently possible to obtain information about the molecular arrangement or distribution of individual molecular species in a cell or tissue sample with comparatively little manual preparatory effort. However, the method is limited to purely qualitative statements on the colocalization of different molecular species.

Davon ausgehend liegt somit der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, welches auch verlässliche quantitative Aussagen zur Kolokalisation von Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, ermöglicht.From that The invention is therefore based on the object, a method indicate which is also reliable quantitative statements on the colocalization of molecular markers in tissue sections, especially in skin and mucosal tissue sections enabled.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren gelöst, welches durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:

  • – Erzeugung eines digitalisierten Bildes des Gewebeschnittes für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers,
  • – Überlagerung der digitalisierten Bilder zu einem Summenbild,
  • – bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild und
  • – Erzeugung einer Matrix, wobei jedem Bildpunkt ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten die quantisierten Molekülmarkersignale der wenigstens zwei Molekülmarker sind.
This object is achieved according to the invention by a method which is characterized by the following method steps:
  • Generation of a digitized image of the tissue section for each of the at least two molecular markers to represent the respective molecular marker,
  • - superimposition of the digitized images into a summation image,
  • Pixel-wise quantization of the molecular marker signal for each of the at least two molecular markers in the summation image and
  • Generation of a matrix, wherein each pixel is assigned a vector whose components are the quantized molecular marker signals of the at least two molecular markers.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker ein Bild, welches das Signalverteilungsmuster des jeweiligen Molekülmarkers darstellt, aufgenommen und digitalisiert. Die Bilder können durch unterschiedliche Analyseverfahren erzeugt werden. Als besonders geeignet erweist sich dabei die Fluoreszenzmikroskopie als ein in Biologie und Medizin seit Jahren bewährtes Analyseverfahren. Hierbei werden entsprechend Fluorophore als Molekülmarker eingesetzt, deren Fluoreszenzsignale in einem Fluoreszenzbild dargestellt werden. Zur Erzeugung der digitalisierten Bilder des Gewebeschnittes können jedoch auch andere Analyseverfahren eingesetzt werden, so beispielsweise die Autoradiographie, bei der die digitalisierten Bilder durch Auslesen eines Strahlungsdetektors, welcher die von Isotopen-markierten Molekülen ausgesendete radioaktive Strahlung registriert, oder durch Digitalisierung eines durch die Strahlung entsprechend geschwärzten fotographischen Filmes erzeugt werden.In the method according to the invention, an image which represents the signal distribution pattern of the respective molecular marker is first recorded and digitized for each of the at least two molecular markers. The images can be generated by different analysis methods. The fluorescence proves to be particularly suitable zenzmikroskopie as a proven in biology and medicine for years analysis method. In this case, fluorophores are used as molecular markers whose fluorescence signals are displayed in a fluorescence image. However, other methods of analysis may be used to generate the digitized images of the tissue section, such as autoradiography, in which the digitized images are read by reading a radiation detector which records the radioactive radiation emitted by isotope-labeled molecules, or by digitizing one by the radiation blackened photographic film are generated.

Die digitalisierten Bilder werden sodann erfindungsgemäß zu einem Summenbild überlagert, wobei es besonders auf eine präparatepunkt- bzw. bildpunktgenaue Überlagerung ankommt, um exakte Aussagen über die relativen Positionen der einzelnen Molekülmarker zueinander zu erhalten. Hierzu ist es von Vorteil, neben den einzelnen Bildern zur Darstellung der jeweiligen Molekülmarker in an sich bekannter Weise auch ein Phasenkontrastbild aufzunehmen.The digitized images are then according to the invention to a Sum picture superimposed, where It is particularly important to or pixel-precise overlay arrives to exact statements about to get the relative positions of each molecule marker to each other. For this it is advantageous, in addition to the individual images for presentation the respective molecular marker in a conventional manner also record a phase contrast image.

Erfindungsgemäß werden nach erfolgter Bildüberlagerung die Signale für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild bildpunktweise quantisiert. Dies kann durch unterschiedliche Arten der Codierung erfolgen, beispielsweise durch eine Trinär-Codierung (Basis 3) oder allgemein durch eine Codierung zur Basis einer Zahl n.According to the invention after image overlay the signals for each of the at least two molecular markers quantized pixel by pixel in the summation image. This can be done through different ones Types of coding take place, for example by means of a trinary coding (Base 3) or generally by coding to the base of a number n.

Gemäß der Lehre der Erfindung wird abschließend eine Matrix erzeugt, wobei jedem Bildpunkt des Summenbildes ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten den quantisierten Molekülmarkersignalen der wenigstens zwei Molekülmarker entsprechen. Hierdurch ist es nunmehr möglich, die in den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren gewonnenen qualitativen Messdaten zur Kolokalisation von Molekülmarkern auch quantitativ präzise auszuwerten. Dies ermöglicht unter anderem eine valide Vergleichbarkeit von Messergebnissen, die beispielsweise an unterschiedlichen Proben gewonnen wurden.According to the teaching the invention is exhaustive generates a matrix, with each pixel of the summation image Vector is assigned, whose components are the quantized molecular marker signals which correspond to at least two molecular markers. This now makes it possible those obtained in the methods known from the prior art qualitative data for the colocalization of molecular markers also be able to evaluate quantitatively precisely. this makes possible among other things, a valid comparability of measurement results, which were obtained for example on different samples.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, dass der Gewebeschnitt vor der Erzeugung der digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet wird. Im Falle eines Hautgewebeschnittes kann die standardisierte Ausrichtung beispielsweise derart erfolgen, dass die Basalmembranzone (BMZ) des Hautgewebes in jedem der digitalisierten Bilder im wesentlichen horizontal angeordnet ist. Alternativ können auch die digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet werden, so dass eine Ausrichtung des Gewebeschnittes selbst nicht erforderlich ist.To an advantageous embodiment of the invention is provided that the tissue section before generating the digitized images anatomically standardized. In case of a skin tissue cut For example, the standardized alignment can be done in such a way that the basal membrane zone (BMZ) of the skin tissue in each of the digitized Images arranged essentially horizontally. Alternatively, too the digitized images are anatomically standardized, so that alignment of the tissue section itself is not required is.

Nach einer weiteren vorteilhaften Lehre der Erfindung werden unmittelbar vor der Überlagerung der Bilder zu einem Summenbild jedes der Bilder hinsichtlich nichtinformativer Inhalte, insbesondere hinsichtlich etwaiger Artefakte, überprüft, mit nichtinformativen Inhalten belegte Bildareale markiert und diese Bildareale aus allen Bildern entfernt. Hierdurch ist gewährleistet, dass die zu einem Summenbild überlagerten digitalisierten Bilder keine die quantitative Analyse der Molekülmarkerkolokalisation verfälschenden Bildinhalte mehr enthalten. Das Entfernen der bei zumindest einem Bild mit nichtinformativen Inhalten belegten Bildareale aus allen digitalisierten Bildern ermöglicht, dass das im Anschluss daran durch Überlagerung erzeugte Summenbild in jedem Bildpunkt verwertbare Informationen zu allen Molekülmarkern enthält. Als Prüfkriterien kommen z.B. die Intaktheit des Gewebeschnitts oder die Kontamination des Gewebeschnitts durch Partikel in Frage. Auch offensichtlich unnatürlich hohe Signalwerte rechtfertigen einen Ausschluss des betreffenden Bildareals.To a further advantageous teaching of the invention will become immediate before the overlay of the Pictures to a sum picture of each of the pictures with regard to non-informative Contents, in particular with regard to any artifacts, checked with non-informative content marked image areas and this Image areas removed from all images. This ensures that that superimposed to a sum picture digitized images no the quantitative analysis of molecular marker colonization falsifying Image content more included. The removal of at least one Image with non-informative content occupied image areas of all allows digitized images, that the summation image subsequently generated by superposition Usable information on all molecular markers in every pixel contains. As test criteria come for example the integrity of the tissue section or the contamination the tissue section by particles in question. Also obvious unnatural high signal values justify an exclusion of the relevant Image area.

Nach einer weiteren vorteilhaften Lehre der Erfindung werden die jedem Bildpunkt zugeordneten Vektoren auf eine definierte horizontale Breite eines Hautgewebeschnitts normiert. Dies kann durch vektorielle Addition der Signalvektoren der auf der definierten horizontalen Breite des Hautgewebeschnitts nebeneinander angeordneten Bildpunkte erfolgen. Dies trägt der biologischen Situation Rechnung, dass es sich bei der Haut um ein nichthomogenes, stratifiziertes, sich senkrecht zur BMZ-Linie permanent ausdifferenzierendes epitheliales Gewebe handelt, so dass eine Normierung folglich nur entlang der BMZ-Linie, d. h. in horizontaler Richtung, und nicht senkrecht dazu sinnvoll ist. Die definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts kann beispielsweise 100 μm betragen.To A further advantageous teaching of the invention, the each Pixel associated vectors on a defined horizontal Normalized width of skin tissue cut. This can be done by vectorial Addition of the signal vectors of the defined horizontal Width of Hautgewebeschnitts juxtaposed pixels respectively. This carries the biological situation takes into account that it is the skin around a nonhomogeneous, stratified, perpendicular to the BMZ line permanently differentiating epithelial tissue, so that a standardization therefore only along the BMZ line, d. H. in horizontal Direction, and not perpendicular to it makes sense. The defined horizontal width of Hautgewebeschnitts may be for example 100 microns.

Die Analytik der für jeden Bildpunkt als Vektor dargestellten quantisierten Molekülmarkersignale kann sich auf den gesamten Gewebeschnitt beziehen, möglich ist jedoch auch, die Kolokalisation bestimmter Molekülmarker, z. B. bestimmter T-Zell-Subpopulationen, toposelektiv in bestimmten Mikrokompartimenten, wie der Epidermis, im Blut- oder Lymphgefäßsystem oder in der Dermis, quantitativ zu bestimmen. Ebenso können die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der Molekülmarker in wenigstens einem Fokusfeld des Gewebeschnitts erfolgen. Als Fokusfeld kann ein beliebiges, beispielsweise ein rechteckiges, kreisförmiges oder beliebig mehreckiges Areal, in dem zu untersuchenden Gewebeschnitt festgelegt werden.The Analytics of for each pixel can be represented as a vector quantized molecular marker signals refer to the entire tissue section, but it is also possible that Colocalization of certain molecular markers, z. B. certain T-cell subpopulations, toposelective in certain microcompartments, like the epidermis, in the blood or lymphatic system or in the dermis, to be determined quantitatively. Similarly, the quantitative determination the colocalization of the molecular markers take place in at least one focal field of the tissue section. As a focus field can be any, for example, a rectangular, circular or Any polygonal area in the tissue section to be examined be determined.

Aufgrund des hohen Automatisierungspotentials des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es sinnvoll, dieses unter Ausführung eines Computerprogramms auf einer Datenverarbeitungsanlage durchzuführen.by virtue of the high automation potential of the method according to the invention it makes sense to do this by running a computer program on a data processing system.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, zu schaffen, welche sich aus kommerziell verfügbaren Standardkomponenten zusammensetzt und damit vergleichsweise kostengünstig zu realisieren ist.Of the Invention is also the object of a device for quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections, to create which is made up of commercially available standard components composed and thus is relatively inexpensive to implement.

Die Aufgabe wird mit einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 15 gelöst.The The object is achieved with a device according to claim 15.

Vorteilhafterweise ist die Einheit zur Erzeugung digitalisierter Bilder als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet und umfasst eine CCD-Kamera.advantageously, For example, the unit for generating digitized images is designed as a fluorescence microscope and includes a CCD camera.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand einer Ausführungsbeispiele darstellenden Zeichnung näher erläutert, wobei weitere Vorteile der Erfindung deutlich werden. Es zeigenin the The invention will be described below with reference to an exemplary embodiment Drawing closer explains wherein other advantages of the invention will become apparent. Show it

1 einen Hautgewebeschnitt mit eingezeichneter Bezugslinie entlang der Basalmembranzone (BMZ), 1 a skin tissue section with a reference line along the basal membrane zone (BMZ),

2 eine Anzahl von Fluoreszenzbildern des Hautgewebeschnitts aus 1 sowie ein Phasenkontrastbild mit horizontal ausgerichteter BMZ-Linie, 2 a number of fluorescence images of Hautgewebeschnitts from 1 as well as a phase contrast image with horizontal BMZ-line,

3 die Bestimmung eines für alle Fluoreszenzbilder gültigen Bildareals unter Ausschluss nichtinformativer Bildinhalte, 3 the determination of an image area valid for all fluorescence images, excluding non-informative image contents,

4 die bildpunktweise Quantisierung der Signalwerte für jeden der verwendeten Molekülmarker, 4 the pixel-by-pixel quantization of the signal values for each of the molecular markers used,

5 die quantitative Analytik in Mikrokompartimenten des Bildareals aus 3 in einem aus den Fluoreszenzbildern der 2 gebildeten Summenbild, 5 quantitative analysis in microcompartments of the image area 3 in one of the fluorescence images of the 2 formed sum picture,

6a–d die quantitative Analytik in einzelnen Fokusfeldern des Bildareals der 3, 6a -D the quantitative analysis in individual focus fields of the image area of the 3 .

7 die Analytik der unmittelbaren Bildpunktnachbarschaft eines ausgewählten Bildpunktes, 7 the analysis of the immediate pixel neighborhood of a selected pixel,

8 die Analytik der Bildpunktnachbarschaft zu einem ausgewählten Bildpunkt in höherer Ordnung, 8th the analysis of the pixel neighborhood to a selected pixel in higher order,

9 die graphische Darstellung einer bivariaten Analyse zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation eines Key-Molekülmarkers mit jedem einzelnen der übrigen Molekülmarker und 9 the graphical representation of a bivariate analysis for the quantitative determination of the colocalization of a key molecule marker with each one of the remaining molecular markers and

10 der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Zellerkennung und -charakterisierung. 10 the use of the method according to the invention for cell recognition and characterization.

In 1 ist das mikroskopische Bild eines Hautgewebeschnittes dargestellt. Erkennbar ist als oberste Schicht die Hornschicht 1 (Stratum corneum) und darunter die Oberhaut 2 (Epidermis). Ferner erkennbar sind die Basalmembranzone 3 (BMZ), die Lederhaut 4 (Dermis) sowie die Unterhaut 5 (Subcutis). Im Bereich der Basalmembranzone 3 und der Lederhaut 4 sind verschiedene Blut- und Lymphgefäße 6 im Querschnitt dargestellt.In 1 the microscopic picture of a skin tissue cut is shown. Visible is the horny layer as the uppermost layer 1 (Stratum corneum) and below the epidermis 2 (Epidermis). Also recognizable are the basement membrane zone 3 (BMZ), the dermis 4 (Dermis) and the subcutaneous tissue 5 (Subcutis). In the area of the basal membrane zone 3 and the dermis 4 are different blood and lymph vessels 6 shown in cross section.

Zur Vorbereitung der erfindungsgemäß vorgesehenen Erzeugung digitalisierter Bilder des Gewebeschnitts zur Darstellung der jeweils eingesetzten Molekülmarker wird zunächst das mikroskopische Bild des Hautgewebeschnittes in geeigneter Weise anatomisch standardisiert ausgerichtet. Vorzugsweise erfolgt dies derart, dass die Basalmembranzone 3 im Bezugskoordinatensystem des Bildaufnahmegerätes im Wesentlichen horizontal verläuft. Der mittlere Verlauf der Basalmembranzone 3 ist in 1 als BMZ-Linie bezeichnet.To prepare the inventively provided generation of digitized images of the tissue section to represent the molecular marker used in each case, the microscopic image of the skin tissue section is first aligned anatomically standardized in a suitable manner. This is preferably done in such a way that the basal membrane zone 3 is substantially horizontal in the reference coordinate system of the image pickup device. The mean course of the basal membrane zone 3 is in 1 referred to as BMZ line.

In 2 sind nun insgesamt vier digitalisierte Bilder des Hautgewebeschnittes aus 1 dargestellt, wobei dieser im Rahmen einer Versuchsreihe mit n verschiedenen Molekülmarkern versetzt wurde. Sämtliche Bilder wurden durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen und zeigen die jeweils als schraffierte Fläche dargestellten Fluoreszenzsignale des jeweils dargestellten Molekülmarkers. In 2 tragen diese das Bezugszeichen 7. Ferner ist in 2 ein Phasenkontrastbild des Hautgewebeschnitts dargestellt. Die Aufnahme eines Phasenkontrastbildes erleichtert die präparatepunktgenaue Überlagerung der Fluoreszenzbilder im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Wie der 2 ferner zu entnehmen ist, sind bereits sämtliche Fluoreszenzbilder sowie das Phasenkontrastbild durch horizontale Anordnung der Basalmembranzone anatomisch standardisiert ausgerichtet.In 2 There are now a total of four digitized images of the skin tissue section 1 in which, in the course of a series of experiments, this was mixed with n different molecular markers. All images were taken by fluorescence microscopy and show the fluorescence signals of the molecular marker shown in each case as a hatched area. In 2 they bear the reference number 7 , Furthermore, in 2 a phase contrast image of the Hautgewebeschnitts shown. The inclusion of a phase contrast image facilitates the preparation point exact superposition of the fluorescence images in the context of the method according to the invention. Again 2 It can also be seen that all the fluorescence images and the phase contrast image are already anatomically standardized by the horizontal arrangement of the basal membrane zone.

Wie in 3 dargestellt ist, wird für alle Fluoreszenzbilder (die Fluoreszenzsignale sind der Übersichtlichkeit halber in 3 nicht dargestellt) sowie das Phasenkontrastbild ein einheitliches Bildareal (generelles Informativfeld) festgelegt. Dazu werden gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens unmittelbar vor der Überlagerung der Fluoreszenzbilder zu einem Summenbild sämtliche Fluoreszenzbilder hinsichtlich nichtinformativer Inhalte, insbesondere Artefakte, überprüft. Im vorliegenden Beispiel ist in dem ersten Fluoreszenzbild ein durch einen unnatürlichen Fluoreszenzsignalwert oder einen Partikel eindeutig feststellbares technisches Artefakt 8 identifiziert. Das mit dem Artefakt 8 belegte Bildareal wird markiert und aus dem durch den oberen Rand des Hautgewebeschnittes und eine im Bereich der Unterhaut dazu parallel gezogene Linie horizontal und durch vertikale Linien seitlich begrenzten Bildareal bei allen Fluoreszenzbildern entfernt. Im Ergebnis wird bei allen Fluoreszenzbildern nur noch das in 5 dargestellte als generelles Informativfeld bezeichnete Bildareal des Hautgewebeschnittes betrachtet. 5 stellt gleichzeitig das Summenbild aus den einzelnen Fluoreszenzbildern dar. Hierbei kann bereits auf qualitativer Ebene die Kolokalisation der einzelnen Molekülmarker in dem Gewebeschnitt ermittelt werden.As in 3 is shown for all fluorescence images (the fluorescence signals are in FIG 3 not shown) and the phase contrast image set a uniform image area (general informative field). For this purpose, according to an advantageous embodiment of the method according to the invention immediately before the superimposition of the fluorescence images into a summation image, all the fluorescence images are checked for non-informative contents, in particular artifacts. In the present example, a technical artifact uniquely detectable by an unnatural fluorescence signal value or a particle is in the first fluorescence image 8th identified. The artifact 8th Occupied image area is marked and removed from the top of the skin tissue section and a line drawn parallel to it in the area of the subcutaneous tissue are removed horizontally and image areas bounded by vertical lines on all fluorescence images. As a result, in all fluorescence images only the in 5 viewed as a general information field designated image area of the skin tissue section considered. 5 simultaneously represents the sum image from the individual fluorescence images. Here, the colocalization of the individual molecule markers in the tissue section can already be determined on a qualitative level.

In 4 ist nun ein weiterer wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Nach erfolgter präparate- bzw. bildpunktweiser Überlagerung der digitalen Fluoreszenzbilder zu einem Summenbild werden die Signale sämtlicher Molekülmarker in dem Summenbild bildpunktweise quantisiert. Im vorliegenden Fall werden sie trinär codiert, d. h. in die drei Kategorien "nicht vorhanden" (Wert 0), "schwach vorhanden" (Wert 1) sowie "stark vorhanden" (Wert 2) eingeteilt. Somit wird erfindungsgemäß für jeden Bildpunkt des Summenbildes ein Vektor, dessen Dimension der Anzahl der untersuchten Molekülmarker und damit der Anzahl der verschiedenen Fluoreszenzbilder entspricht, gebildet und in einer dem Pixelraster der digitalisierten Bilder entsprechenden Matrix angeordnet. Anders ausgedrückt: Die Komponenten der für jeden Bildpunkt des Pixelrasters gebildeten Vektoren entsprechen den quantisierten Molekülmarkersignalen der n analysierten Molekülmarker. Diese einzelnen Vektoren können auch als molekularer Phänotyp (MOLP) bezeichnet werden. In 4 wird nun konkret ein 4×4-Pixelblock und davon speziell der Bildpunkt P32 (3. Zeile, 2. Spalte) betrachtet. Dieser liefert für den Molekülmarker 1 kein Signal, da das Fluoreszenzsignal X erkennbar nicht hinreichend weit in den 4×4-Pixelblock hineinragt. Anders verhält es sich bei dem Molekülmarker 2. Hier wird das schwache Signal Y im Rahmen der Quantisierung durch den Wert 1 repräsentiert. Bei dem Signal Z (Molekülmarker 3) handelt es sich um ein starkes Signal. Entsprechend wird dies mit dem Wert 2 quantisiert. Für den Molekülmarker n wird, wie aus dem entsprechenden Fluoreszenzbild hervorgeht, kein Signal registriert (d.h. quantisierter Wert 0).In 4 Now, another essential step of the method according to the invention is shown. Once the digital fluorescence images have been superimposed in the form of a preparation or on a pixel-by-pixel basis, the signals of all the molecular markers in the sum image are quantized pixel by pixel. In the present case they are trinely coded, ie divided into the three categories "not available" (value 0), "weakly available" (value 1) and "strongly present" (value 2). Thus, according to the invention, for each pixel of the summation image, a vector whose dimension corresponds to the number of examined molecular markers and thus to the number of different fluorescence images is formed and arranged in a matrix corresponding to the pixel grid of the digitized images. In other words, the components of the vectors formed for each pixel of the pixel grid correspond to the quantized molecular marker signals of the n molecular markers analyzed. These individual vectors can also be referred to as Molecular Phenotype (MOLP). In 4 Now, in concrete terms, a 4 × 4 pixel block and specifically the pixel P 32 (3rd row, 2nd column) is considered. This provides no signal for the molecular marker 1, since the fluorescent signal X recognizably does not protrude sufficiently far into the 4 × 4 pixel block. The situation is different with the molecular marker 2. Here, the weak signal Y is represented by the value 1 in the context of the quantization. The signal Z (molecular marker 3) is a strong signal. Accordingly, this is quantized with the value 2. As can be seen from the corresponding fluorescence image, no signal is registered for the molecular marker n (ie quantized value 0).

Es erweist sich als zweckmäßig, die für jeden Bildpunkt erhaltenen Signalvektoren auf eine definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts zu normieren. Die Normierung erfolgt bevorzugt durch vektorielle Addition der Signalvektoren nebeneinander angeordneter Bildpunkte auf der definierten horizontalen Breite des Hautgewebeschnitts, die vorliegend zweckmäßigerweise auf 100 μm festgelegt wird. Die Normierung berücksichtigt die biologische Situation, dass es sich bei der Haut um ein sich senkrecht zur BMZ-Linie permanent ausdifferenzierendes epitheliales Gewebe handelt, so dass eine Normierung nur entlang der BMZ-Linie, d. h. in horizontaler Richtung sinnvoll ist. Diese Normierung wird auch als "normalized number of Pixels (NORP) with respect to a defined horizontal skin width" bezeichnet.It proves to be appropriate, the for every pixel received signal vectors to a defined horizontal width normalize the skin tissue cut. The standardization is preferred by vectorial addition of the signal vectors juxtaposed Pixels on the defined horizontal width of the skin tissue section, the present expediently to 100 microns is determined. Standardization takes into account the biological situation that it is permanent in the skin around a perpendicular to the BMZ line differentiating epithelial tissue, so a normalization only along the BMZ line, d. H. in a horizontal direction makes sense is. This normalization is also called "normalized number of pixels (NORP) with Respect to a defined horizontal skin width ".

Gemäß 5 kann sich die Analytik der quantisierten Molekülmarkersignale auf den gesamten Gewebeschnitt beziehen, möglich ist jedoch auch eine toposelektive Kolokalisation bestimmter Molekülmarker in bestimmten Mikrokompartimenten des Hautgewebeschnittes. Wie in 5 beispielhaft gezeigt, können dies die Epidermis 2, Blut- oder Lymphgefäße 6 oder auch die Dermis 4 sein.According to 5 If the analysis of the quantized molecular marker signals can refer to the entire tissue section, it is also possible to achieve a toposelective colocalization of specific molecular markers in certain microcompartments of the skin tissue section. As in 5 By way of example, this may be the epidermis 2 , Blood or lymph vessels 6 or the dermis 4 be.

Wie in den 6a bis 6d dargestellt, lässt sich die Kolokalisation der analysierten Molekülmarker auch durch Analyse einzelner Fokusfelder des Gewebeschnitts vornehmen. Diese können beliebig geometrisch geformt sein, beispielsweise als Quadrat (6a), als Kreise (6b) oder auch als beliebige Fläche (6d).As in the 6a to 6d shown, the colocalization of the analyzed molecular marker can also make by analyzing individual focal areas of the tissue section. These can be of any geometrical shape, for example as a square ( 6a ), as circles ( 6b ) or as any surface ( 6d ).

Wie in den 7 und 8 dargestellt, kann die Kolokalisation der untersuchten Molekülmarker durch unterschiedliche Suchstrategien näher bestimmt werden. 7 zeigt die Untersuchung der unmittelbaren Bildpunktnachbarschaft zu einem zentralen Bildpunkt (Pixel). Bei dieser als "Pixel-neighbourhood-search" bezeichneten Suchstrategie, werden die acht lateral bzw. diagonal an den zentralen Bildpunkt angrenzenden Nachbarbildpunkte zur Erkennung der Verteilungsmuster der Molekülmarker untersucht.As in the 7 and 8th shown, the colocalization of the investigated molecular marker can be determined by different search strategies. 7 shows the examination of the immediate pixel neighborhood to a central pixel. In this search strategy, referred to as "pixel neighborhood search", the eight neighboring pixels laterally or diagonally adjacent to the central pixel are examined in order to recognize the distribution patterns of the molecular markers.

8 zeigt eine in höherer Ordnung durchgeführte Untersuchung benachbarter Bildpunkte zum Zwecke der Erkennung von Molekülmarkerverteilungsmustern. Bei diesem als "closest-Pixels-centrifuge" bezeichneten Prinzip werden auch die zum zentralen Bildpunkt in erster, zweiter, dritter oder n-ter Ordnung benachbarten Bildpunkte analysiert, wobei dies im gesamten untersuchten generellen Informativfeld (vgl. 5) oder in einzelnen Mikrokompartimenten (vgl. 5) oder Fokusfeldern (vgl. 6) erfolgen kann. So lässt sich beispielsweise in im Vergleich zum Stand der Technik unerreichter Qualität die molekulare Nachbarschaft von T-Zell-Subpopulationen in einem Gewebekontext abbilden und analysieren. 8th Figure 4 shows a higher order examination of adjacent pixels for the purpose of detecting molecular marker distribution patterns. In this principle, referred to as the "closest-pixel centrifuge", the pixels adjacent to the central pixel in the first, second, third or nth order are also analyzed, whereby this is the case in the entire general information field (cf. 5 ) or in individual microcompartments (cf. 5 ) or focus fields (cf. 6 ). For example, in a quality unmatched by the prior art, the molecular neighborhood of T-cell subpopulations in a tissue context can be mapped and analyzed.

Die mit verschiedenen Suchstrategien in unterschiedlichen Teilarealen des untersuchten Gewebeschnitts quantitativ ausgewerteten Signalvektoren zu jedem Bildpunkt können nun den unterschiedlichsten biomathematischen Auswertemethoden unterzogen werden. Beispielsweise kann eine monovariate Analyse der Signalvektoren vorgenommen werden. Aufgrund der bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens praktisch unbegrenzten Anzahl analysierbarer Molekülmarker ist ein mit den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren bisher nicht erreichbarer Informationsgewinn, beispielsweise bei der immundermahistologischen Diagnostik kutaner Lymphone möglich.The signal vectors for each pixel that have been quantitatively evaluated with different search strategies in different subareas of the examined tissue section can now be subjected to the most varied biomathematical evaluation methods. For example, a monovariate analysis of the signal vectors can be performed. Due to the practically unlimited number of analysable molecular markers when using the method according to the invention, one with those from the State of the art known methods previously unachievable information gain, for example, in the immunodermahistological diagnosis of cutaneous lymphoma possible.

In 9 ist die bivariate Analyse der Signalvektoren zum Zwecke der Quantifizierung der Kolokalisation eines Key-Molekülmarkers mit jedem einzelnen der übrigen analysierten Molekülmarker dargestellt. Hierdurch wird die Analyse der dual-radialen Beziehung eines Key-Molekülmarkers, eines sogenannten Hub-Markers, zu den übrigen Molekülmarkern eines Netzwerkes möglich. Es versteht sich, dass neben monovariater und bivariater Analyse der Signalvektoren auch eine multivariate Analyse als komplexeste Form der Datenauswertung durchgeführt werden kann. So lässt sich z. B. die Häufigkeit einer bestimmten Lymphozyten-Subpopulation, welche durch das positive Auftreten von zwei oder mehr Molekülmarkern charakterisiert ist, innerhalb des Mikrokompartiments der Dermis exakt erfassen.In 9 Figure 2. Bivariate analysis of signal vectors for the purpose of quantifying the colocalization of a key molecular marker with each of the remaining molecular markers analyzed. This allows the analysis of the dual-radial relationship of a key molecular marker, a so-called stroke marker, to the remaining molecular markers of a network. It goes without saying that in addition to monovariate and bivariate analysis of the signal vectors, a multivariate analysis can also be carried out as the most complex form of data evaluation. So can be z. For example, the frequency of a particular lymphocyte subpopulation characterized by the positive appearance of two or more molecular markers within the microcompartment of the dermis can be accurately detected.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung wird abschließend im Zusammenhang mit 10 erläutert. Aufgrund des Lipidgehaltes der Zellmembranen und bestimmter Fixierschritte, die Lipide aus dem Gewebeschnitt herauslösen, ist eine Zellerkennung in Bezug auf intakte Zellmembranen im Allgemeinen nicht möglich. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren besteht jedoch die Möglichkeit, zellkernbezogen eine automatische Zellerkennung zu erreichen. Ausgangspunkt hierzu ist die Verwendung eines geeigneten Zellkernmarkers, mit dessen Hilfe in einer Eichmessung die Fläche des Zellkerns 9 definiert werden kann. Davon ausgehend ist es unter Einsatz der vorstehend erläuterten Suchstrategie unter Berücksichtigung in erster und höherer Ordnung zu einem zentralen Pixel oder Pixelblock benachbarter Pixel ("closest Pixel-centrifuge"-Prinzip) möglich, die zytoplasmatische Umgebung molekülmarkerbezogen zu analysieren.Another aspect of the invention will be conclusively related to 10 explained. Due to the lipid content of the cell membranes and certain fixation steps that dissolve lipids from the tissue section, cell recognition with respect to intact cell membranes is generally not possible. With the method according to the invention, however, it is possible to achieve an automatic cell recognition based on the cell nucleus. The starting point for this is the use of a suitable nuclear marker, with the aid of which, in a calibration measurement, the area of the cell nucleus 9 can be defined. Based on this, using the above-described search strategy, taking first and higher order into a central pixel or pixel block of neighboring pixels ("closest pixel-centrifuge" principle), it is possible to analyze the cytoplasmic environment by molecular marker.

Gemäß 10 beginnt die Analyse der zytoplasmatischen Umgebung des Zellkerns 9 in dessen Zentrum durch Analyse der zu einem zentralen Bildpunkt benachbarten Bildpunkte in zunächst erster Ordnung (vgl. 7) und dann sukzessive in höherer Ordnung (vgl. 8). Dies erfolgt z.B. solange bis in den zu den einzelnen Bildpunkten zugehörigen Signalvektoren das dem Zytoplasma 10 entsprechende Molekülmarkersignal abbricht.According to 10 begins the analysis of the cytoplasmic environment of the nucleus 9 in its center by analysis of adjacent to a central pixel pixels in first-order first (see. 7 ) and then successively in a higher order (cf. 8th ). This takes place, for example, until the signal vectors belonging to the individual pixels reach the cytoplasm 10 corresponding molecule marker signal stops.

Insgesamt erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren somit die Analyse der absoluten und relativen räumlichen Lage ausgewählter Zellen im Bezug zueinander bzw. auf die extrazelluläre Matrix.All in all allows the method according to the invention thus the analysis of the absolute and relative spatial position of selected cells in relation to each other or to the extracellular matrix.

Claims (19)

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schieimhautgewebeschnitten, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: – Erzeugung eines digitalisierten Bildes des Gewebeschnittes für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers, – Überlagerung der digitalisierten Bilder zu einem Summenbild, – bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals (7, X, Y, Z) für jeden der wenigstens zwei Molekülmarker in dem Summenbild und – Erzeugung einer Matrix, wobei jedem Bildpunkt ein Vektor zugeordnet wird, dessen Komponenten die quantisierten Molekülmarkersignale (7, X, Y, Z) der wenigstens zwei Molekülmarker sind.Method for the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in cutaneous and cutaneous tissue sections, characterized by the following method steps: generation of a digitized image of the tissue section for each of the at least two molecular markers for displaying the respective molecule marker, overlaying the digitized images a summation image, - pixel-wise quantization of the molecular marker signal ( 7 , X, Y, Z) for each of the at least two molecular markers in the summation image and generating a matrix, wherein each pixel is assigned a vector whose components are the quantized molecular marker signals ( 7 , X, Y, Z) which are at least two molecular markers. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Molekülmarker Fluorophore sind, die mittels Fluoreszenzmikroskopie jeweils in einem Fluoreszenzbild dargestellt werden.Method according to claim 1, characterized in that that the at least two molecular markers fluorophores are by fluorescence microscopy each in a fluorescence image being represented. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Gewebeschnitt vor der Erzeugung der digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet wird.Method according to claim 1 or 2, characterized that the tissue section before generating the digitized images anatomically standardized. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die digitalisierten Bilder anatomisch standardisiert ausgerichtet werden.Method according to claim 1 or 2, characterized that the digitized images are anatomically standardized become. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Gewebeschnitt ein Hautgewebeschnitt ist und die Ausrichtung des Gewebeschnitts oder der digitalisierten Bilder derart erfolgt, dass die Basalmembranzone (3, BMZ) des Hautgewebes in jedem der Bilder im wesentlichen horizontal angeordnet ist.Method according to claim 3 or 4, characterized that the tissue section is a skin tissue cut and the orientation the tissue section or the digitized images is such that the basal membrane zone (3, BMZ) of the skin tissue in each of the images is arranged substantially horizontally. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass unmittelbar vor der Überlagerung der Bilder zu einem Summenbild folgende zusätzliche Verfahrensschritte ausgeführt werden: – Prüfung jedes der Bilder hinsichtlich nichtinformativer Inhalte, insbesondere Artefakte (8), – Markierung der mit nichtinformativen Inhalten belegten Bildareale und – Entfernung der Bildareale aus allen Bildern.Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that immediately before the superimposition of the images into a summation image, the following additional process steps are carried out: - testing each of the images with regard to non-informative content, in particular artifacts ( 8th ), - marking the image areas occupied by non-informative content and - removing the image areas from all images. verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die bildpunktweise Quantisierung des Molekülmarkersignals (7, X, Y, Z) durch eine Trinär-Codierung oder eine Codierung zur Basis der Zahl n erfolgt.Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that the pixel-by-pixel quantization of the molecular marker signal ( 7 , X, Y, Z) by a trinary coding or a coding to the base of the number n. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die jedem Bildpunkt zugeordneten Vektoren auf eine definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts normiert werden.Method according to one of claims 1 to 7 and claim 5, characterized in that the vectors assigned to each pixel point to a de Finished horizontal width of Hautgewebeschnitts be normalized. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Normierung durch vektorielle Addition der Signalvektoren der auf der definierten horizontalen Breite des Hautgewebeschnitts nebeneinander angeordneten Bildpunkte erfolgt.Method according to claim 8, characterized in that that the normalization by vectorial addition of the signal vectors on the defined horizontal width of the skin tissue cut juxtaposed pixels takes place. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die definierte horizontale Breite des Hautgewebeschnitts 100 μm beträgt.Method according to claim 8 or 9, characterized the defined horizontal width of the Hautgewebeschnitts is 100 microns. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der wenigstens zwei Molekülmarker in wenigstens einem Mikrokompartiment des Gewebeschnitts erfolgt.Method according to one of claims 1 to 10, characterized that the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers takes place in at least one microcompartment of the tissue section. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Gewebeschnitt ein Hautgewebeschnitt ist und die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der wenigstens zwei Molekülmarker in der Epidermis (2), im Blut- oder Lymphgefäßsystem (6) oder in der Dermis (4) erfolgt.A method according to claim 11, characterized in that the tissue section is a skin tissue section and the quantitative determination of the colocalization of the at least two molecular markers in the epidermis ( 2 ), in the blood or lymphatic system ( 6 ) or in the dermis ( 4 ) he follows. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung der Kolokalisation der wenigstens zwei Molekülmarker in wenigstens einem Fokusfeld des Gewebeschnitts erfolgt.Method according to one of claims 1 to 10, characterized that the quantitative determination of the colocalization of at least two molecular markers takes place in at least one focal field of the tissue section. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren unter Ausführung eines Computerprogramms auf einer Datenverarbeitungsanlage durchgeführt wird.Method according to one of claims 1 to 13, characterized that the procedure under execution a computer program is performed on a data processing system. Computerprogramm zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, dessen Ausführung wenigstens einen Prozessor veranlasst, ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 auszuführen.Computer program for the quantitative determination of Colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, especially in skin and mucosal tissue sections, the execution of which at least a processor, a method according to any one of claims 1 to 13 execute. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Kolokalisation von wenigstens zwei Molekülmarkern in Gewebeschnitten, insbesondere in Haut- und Schleimhautgewebeschnitten, umfassend eine Einheit zur Erzeugung digitalisierter Bilder des Gewebeschnittes zur Darstellung des jeweiligen Molekülmarkers und eine Datenverarbeitungsanlage, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 eingerichtet ist.Apparatus for the quantitative determination of colocalization of at least two molecular markers in tissue sections, in particular in skin and mucosal tissue sections, comprising a unit for generating digitized images of the Tissue section for displaying the respective molecule marker and a data processing system, characterized in that the device for execution the method according to any one of claims 1 to 13 is arranged. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Einheit zur Erzeugung digitalisierter Bilder als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet ist.Device according to claim 16, characterized in that that the unit for generating digitized images as a fluorescence microscope is trained. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluoreszenzmikroskop eine CCD-Kamera umfasst.Device according to claim 17, characterized in that the fluorescence microscope comprises a CCD camera. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Zellerkennung in Gewebeschnitten, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der wenigstens zwei Molekülmarker ein Zellkernmarker ist.Use of the method according to one of claims 1 to 13 for cell recognition in tissue sections, characterized that at least one of the at least two molecular markers is a nuclear marker is.
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