DE102007056198B4 - Assessment of the effect of an endogenous or exogenous effect on epithelial tissue by mapping the tissue using labeled histological tissue sections - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Erstellung von Proteinprofilen und zur Erfassung von Expressionsmustern einer Zelle in einem vom Menschen oder Tier stammenden Gewebe mittels Bildverarbeitung, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Proteinprofile und die Expressionsmuster entlang eines Differenzierungsprozesses der Zelle in dem Gewebe räumlich und/oder quantitativ erfassen lassen, wobei das Gewebe eine mittels mindestens einem Struktur- und mindestens einem Funktionsmarker markierte Gewebeprobe ist, die getrennt voneinander in mindestens zwei zueinander parallel stehenden und anhand des mindestens einen Strukturmarkers markierten Bereichen des Gewebe zueinander ausrichtbaren Schnittebenen betrachtet und ausgemessen wird, wobei in jeder Schnittebene ein von den oder der anderen Schnittebene unterschiedlicher Funktionsmarker gemessen wird.Method for creating protein profiles and for detecting expression patterns of a cell in a tissue originating from humans or animals by means of image processing, characterized in that the protein profiles and the expression patterns can be detected spatially and / or quantitatively along a differentiation process of the cell in the tissue, wherein the tissue is a tissue sample marked by means of at least one structural marker and at least one functional marker, which is viewed and measured separately from one another in at least two mutually parallel cutting planes that are marked with the aid of the at least one structural marker and can be aligned with one another, with one of the or the other cutting plane of different function markers is measured.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erstellung von Proteinprofilen und zur Erfassung von Expressionsmustern einer Zelle in einem vom Menschen oder Tier stammenden Gewebe mittels Bildverarbeitung und die Verwendung des Verfahrens für die klinische Diagnostik, toxikologische und pharmakologische Untersuchungen sowie Referenzmuster für Proteinnetzwerke.The invention relates to a method for producing protein profiles and for detecting expression patterns of a cell in a tissue originating from humans or animals by means of image processing and the use of the method for clinical diagnostics, toxicological and pharmacological investigations as well as reference patterns for protein networks.

Äußere sowie innere Körperoberflächen werden von stratifiziertem epithelialem Gewebe bedeckt. Dieses Gewebe, insbesondere die Zellen dieses Gewebes unterliegen einem komplex reguliertem Gleichgewicht, aus Zellproliferation, Zelldifferenzierung und reguliertem Zelltod bei einer über die Zeit konstanten Morphologie. Dieses Gleichgewicht wird auch als Homöostase bezeichnet. Bei stratifiziertem (geschichtetem), epithelialem Gewebe werden im Allgemeinen vier Schichten unterschieden: Stratum Basale, Stratum Spinosum, Stratum Granulosum und Stratum Corneum.External and internal body surfaces are covered by stratified epithelial tissue. This tissue, particularly the cells of this tissue, is subject to a complex regulated balance of cell proliferation, cell differentiation and regulated cell death with a morphology constant over time. This balance is also called homeostasis. In stratified (stratified) epithelial tissue, four layers are generally distinguished: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, and stratum corneum.

Bei Störungen der Homöostase, welche sich auf Störungen der Proteinexpression oder Änderungen an DNS und RNS zurückführen lassen, kann es zu starken pathologischen Veränderungen wie der Schuppenflechte und epithelialen Tumoren kommen. Grundlage für die Diagnose und Therapie dieser pathologischen Veränderungen ist ein tiefes Verständnis des komplexen biologischen Systems der Homöostase. In diesem Zusammenhang gewinnen die systembiologische Analyse und die systembiologische Modellierung zunehmend an Bedeutung. Da die epitheliale Homöostase wesentlich durch die gezielte Proteinexpression vieler Proteine gleichzeitig gesteuert wird, besteht zur dynamischen systembiologischen Modellierungen des Epithels der Bedarf an multiparametrischen und quantitativen Daten zur Proteinexpression in Abhängigkeit von der Zelldifferenzierung. Die Beschreibung einer räumlichen Co-Expression von Genen, also von DNS und RNS, und Proteinen ist demnach eine grundlegende Technologie zur Analyse von Geweben, wobei die zu untersuchenden Zielmoleküle als Biomarker bezeichnet werden. Die Bestimmung der räumlichen Korrelation von Biomarkern in Gewebeproben aus Gewebekulturen und aus nativem Gewebe ist derzeit aber nur mit sehr wenigen (bis zu maximal fünf Markern) möglich.Homeostatic disturbances, which can be attributed to protein expression or DNA and RNA changes, can lead to severe pathological changes such as psoriasis and epithelial tumors. The basis for the diagnosis and treatment of these pathological changes is a deep understanding of the complex biological system of homeostasis. In this context, systems biology analysis and systems biology modeling are becoming increasingly important. Since epithelial homeostasis is essentially controlled by the targeted protein expression of many proteins at the same time, there is a need for multiparametric and quantitative data on protein expression as a function of cell differentiation for dynamic system-biological modeling of the epithelium. The description of a spatial coexpression of genes, ie DNA and RNA, and proteins is therefore a fundamental technology for the analysis of tissues, wherein the target molecules to be investigated are referred to as biomarkers. The determination of the spatial correlation of biomarkers in tissue samples from tissue cultures and from native tissue is currently only possible with very few (up to a maximum of five markers).

In der biomedizinischen Forschung werden beispielsweise standardmäßig histologische Schnitte gefärbt, um anhand der Färbung die Lokalisation von Biomarkern sichtbar machen zu können. Anhand der Lokalisation der Biomarker ist eine genaue Bestimmung des funktionalen Zustandes einer biologischen Gewebeprobe möglich. Dabei gilt: Je größer die Zahl der gleichzeitig betrachteten Biomarker ist, desto spezifischer lässt sich eine Aussage über Funktionsveränderungen der untersuchten Gewebeprobe treffen.In biomedical research, for example, histological sections are stained by default in order to visualize the localization of biomarkers on the basis of the staining. Based on the localization of the biomarker, an accurate determination of the functional state of a biological tissue sample is possible. The following applies: the larger the number of biomarkers considered at the same time, the more specific can a statement be made about functional changes in the examined tissue sample.

Gegenwärtig lassen sich aber, wie oben beschrieben, nicht mehr als drei bis maximal fünf Biomarker gleichzeitig in einem Gewebeschnitt nachweisen. Visuell lassen sich die Biomarker auch nur dann voneinander unterscheiden, wenn die Biomarker verschiedene Gewebestrukturelemente anfärben, z. B. Zellwände, Cytoplasma, Zellkern. Es ist auch nicht möglich eine größere Zahl (z. B. 10–50) Marker gleichzeitig, objektiv und quantitativ in einem Gewebe in ihrer räumlichen Expression zu vergleichen und in Beziehung zueinander zu setzen. Daher kann die räumliche Korrelation von Biomarkern bisher nur qualitativ und subjektiv erfasst und beschrieben werden. Eine typische Aussage in der gegenwärtigen Literatur ist z. B. „der Marker wird nur in der basalen Schicht des Gewebes exprimiert”. Eine derartige Aussage enthält keine Quantifizierung der Stärke der Expression. Auch erlaubt die Aussage keinen objektiven Vergleich mit den Ergebnissen einer anderen Forschungsarbeit, da die verwendete Beschreibung „basale Schicht” sehr subjektiv im Auge des Betrachters liegt. Somit ist derzeit keine automatische, objektive Analyse mit Quantifizierung der Proteinexpression einer großen Zahl von Gewebeproben aus Gewebekulturen oder nativem Gewebe auf räumliche Korrelation von Biomarkern möglich. Die gezielte kombinatorische Betrachtung einer größeren Zahl ausgewählter Biomarker (z. B. 10–50) ist derzeit somit nicht in histologischen Schnitten möglich.At present, however, as described above, no more than three to a maximum of five biomarkers can be detected simultaneously in one tissue section. Visually, the biomarkers can only be distinguished from one another if the biomarkers stain various tissue structure elements, eg. B. cell walls, cytoplasm, nucleus. It is also not possible to compare a larger number (eg 10-50) markers simultaneously, objectively and quantitatively in a tissue in their spatial expression and to relate them to each other. Therefore, the spatial correlation of biomarkers can only be grasped and described qualitatively and subjectively. A typical statement in the current literature is e.g. B. "the marker is expressed only in the basal layer of the tissue". Such a statement does not quantify the level of expression. Also, the statement does not allow an objective comparison with the results of another research work, as the description used "basal layer" is very subjectively in the eye of the beholder. Thus, no automatic, objective analysis with quantification of protein expression of a large number of tissue culture or native tissue samples for spatial correlation of biomarkers is currently possible. The targeted combinatorial analysis of a larger number of selected biomarkers (eg 10-50) is therefore currently not possible in histological sections.

Gängige Verfahren zur quantitativen Messung von Proteinexpressionsmustern im Gewebe sowie einzelner Zellen sind als Protein-Profiling bekannt. Diese Verfahren, wie beispielsweise Protein-Arrays und 2D-Gelelektrophorese basieren auf der Homogenisierung von Gewebe. Durch die Homogenisierung des Gewebes geht allerdings die Korrelation zwischen räumlicher Lage und Proteinexpression verloren. Beispielhaft ist hier Comparative proteomic profiling of murin skin, J. Invest. Dermatol., 2003, 121: 51–64 von Huang, C. M., Foster, K. W., et al. Zu nennen.Common methods for quantitative measurement of protein expression patterns in tissue as well as single cells are known as protein profiling. These methods, such as protein arrays and 2D gel electrophoresis, are based on the homogenization of tissue. By homogenizing the tissue, however, the correlation between spatial position and protein expression is lost. Exemplary here is Comparative proteomic profiling of murine skin, J. Invest. Dermatol., 2003, 121: 51-64 by Huang, C.M., Foster, K.W., et al. To call.

In der US-Amerikanischen Anmeldung 60/451,923 wird ein manuelles visuelles System zur Unterstützung des Vergleichs mehrerer histologischer Schnitte vorgestellt, wobei eine Ortsauflösung von Proteinexpressionen mit diesem System nur schwer durchführbar.U.S. Patent Application 60 / 451,923 discloses a manual visual system for assisting in the comparison of multiple histological sections, where spatial resolution of protein expressions is difficult to achieve with this system.

Ein neueres Verfahren stellt das MALDI-Imaging dar, welches zwar eine Ortsauflösung, dass heißt die Ermittlung der räumlichen Lage zulässt, jedoch dessen Ortsauflösung zu gering ist, um das Proteinexpressionsmuster mit der räumlichen Lage in quantitativ verwertbarer Weise beschreiben zu können [J. Pathol., 2003, 200: 298–307]. A newer method is the MALDI imaging, which although a spatial resolution, that is, allows the determination of the spatial position, but its spatial resolution is too low to describe the protein expression pattern with the spatial position in a quantitatively usable way can [J. Pathol., 2003, 200: 298-307].

Mit der Veröffentlichung Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy, Nature Biotechnology published online 1 October 2006; doi:10.1038/nbt1250 von Schubert et al. wurde bestätigt, dass Proteinnetzwerke, in diesem Artikel Cluster genannt, eine Art Visitenkarte für Zellen/Gewebe darstellen. Bei dem in diesem Artikel genannten Verfahren, wird ein und derselbe Gewebeschnitt mit unterschiedlichen Funktionsmarkern nacheinander gefärbt. Dabei wird nach Untersuchung eines Markers der Gewebeschnitt ausgeblichen und ein weiterer Marker durch das so genannte „cyclic staining/imaging”-Verfahren angefärbt und gemessen. Diese Technik erlaubt keine quantitative Messung der Proteinexpression im Gewebe, da durch das Ausbleichen des Gewebes, das Gewebe, insbesondere die Proteinmarkerbindungsstellen in Mitleidenschaft gezogen werden. Zusätzlich tritt eine sterische Behinderung durch das zyklische Mehrfachfärben auf, die eine quantitative Messung verhindert.With the publication Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy, Nature Biotechnology published online 1 October 2006; doi: 10.1038 / nbt1250 by Schubert et al. It has been confirmed that protein networks, called clusters in this article, are a kind of cell / tissue business card. In the procedure referred to in this article, one and the same tissue section is stained with different function markers one after the other. After examination of a marker, the tissue section is faded out and another marker is stained and measured by the cyclic staining / imaging method. This technique does not allow a quantitative measurement of protein expression in the tissue, as the bleaching of the tissue affects the tissue, in particular the protein marker binding sites. In addition, steric hindrance occurs due to cyclic multiple dyeing which prevents quantitative measurement.

Die oben genannten Verfahren sind nicht dazu geeignet, automatisiert Differenzierungsprozesse einer Zelle im Gewebe räumlich und/oder quantitativ zu erfassen und genügen aufgrund der unzureichenden Anzahl an multiparametrischen Daten nicht den Vorgaben, um diese in der klinischen Diagnostik und für toxikologische und pharmakologische Untersuchungen einzusetzen. Daher ist auch die Erstellung quantitativer Referenzmuster für Proteinnetzwerke, für klinische Anwendungen beispielsweise zur Bestimmung der Art des Gewebes oder von toxischen bzw. pharmakologischen Substanzen, mit denen ein Gewebe penetriert wurde, mit den bekannten Verfahren in automatisierter Weise nicht umsetzbar.The abovementioned methods are not suitable for spatially and / or quantitatively detecting differentiation processes of a cell in the tissue and, because of the insufficient number of multiparametric data, do not meet the requirements for use in clinical diagnostics and for toxicological and pharmacological investigations. Therefore, the creation of quantitative reference patterns for protein networks, for clinical applications, for example for determining the type of tissue or of toxic or pharmacological substances with which a tissue has been penetrated, can not be implemented in an automated manner using the known methods.

Daher entstammen räumliche Beschreibungen der Proteinexpressionen in Geweben hauptsächlich noch immer der mikroskopischen Analyse einzelner Spezialisten.Therefore, spatial descriptions of protein expression in tissues mainly still stem from the microscopic analysis of individual specialists.

Die daraus resultierenden linguistischen und bildhaften Aussagen lassen sich jedoch nur schwer in Parameter für Gewebesimulationen übersetzen. Auch ist eine Standardisierung aufgrund der sehr subjektiven Wahrnehmungen des einzelnen Betrachters nicht möglich. Die Bestimmung der räumlichen Korrelationen von Biomarkern würde aber eine starke Verbesserung für die Qualität der Diagnose bzw. Beurteilung von nativem oder kultiviertem Gewebe darstellen, da so molekulare Veränderungen in den Geweben erheblich sensitiver und spezifischer erkannt werden.However, the resulting linguistic and visual statements are difficult to translate into parameters for tissue simulations. Also, a standardization due to the very subjective perceptions of the individual viewer is not possible. However, determining the spatial correlations of biomarkers would greatly improve the quality of the diagnosis or assessment of native or cultured tissue, as it would make molecular changes in tissues much more sensitive and specific.

Aus dem Internetdokument zu POMMERENKE, T erhältlich unter http:/www.gmds2006.de/Abstracts/399.pdt ist ein Verfahren zum „Protein-Profiling stratefizierter Epithelien mittels Bildverarbeitung histologischer Serienschnitte” bekannt. Wie in Absatz 4 [Material und Methoden] des Dokuments beschrieben, wird mittels einer Dreifachfärbung an Gefrierschnitten das interessierende Protein, Kollagen-I, als Bestandteil der extrazellulären sowie die Zellkerne mit DAPI angefärbt. Da in einem Gewebeschnitt nur eine begrenzte Anzahl von Proteinexpressionsmustern erzeugbar ist, wird eine Analyse anhand von Serienschnitten durchgeführt. Dazu wird in einem ersten Schritt das Epithel segmentiert. Dies erfolgt „lediglich” über die in einem Phasenkontrastbild mittels Kantendetektion identifizierten Gewebekonturen unter Maskierung von Bereichen intensiver DAPI-Färbung. Als Ergebnis dieses Verfahrens konnte erstmalig eine quantitative Beschreibung der Proteinexpression im Epithel beschrieben werden, wobei beispielhaft die kombinatorische Expression von fünf Schlüssel-Markern der epithelialen Homöostase in normaler humaner Epidermis untersucht wurde. Wie dem letzten Absatz des Dokuments zu entnehmen ist, ist eine Erweiterung der bestehenden Methode zur Detektion von lokalen Anormalitäten geplant, dazu sollen Veränderungen im kombinatorschen Expressionsmuster ausgewählter Marker auf zellulärer Ebene identifiziert und analysiert werden. Der simultanen Erfassung unterschiedlicher Marker wird dabei eine Kernbedeutung zugesprochen. Es bleibt demnach Folgendes festzustellen:

• – Proteinexpressionsmuster unter Verwendung von Serienschnitten durch kombinatorische Expression von unterschiedlichen Markern für die epitheliale Homöostase sind bekannt,
• – Die Ausrichtung der Serienschnitte zueinander (Epithelsegmentierung) erfolgt im Stand der Technik im Phasenkontrastbild mittels Kantendetektion identifizierter Gewebekonturen, also anhand der Morphologie des Gewebes und
• – die Erfassung von mehr als einem Marker in einem Gewebeschnitt unter Vermeidung von Mehrfachfärbungen und den damit einhergehenden Einschränkungen, diesbezüglich die Anzahl der Marker, ist bekannt.

From the internet document to POMMERENKE, T available at http://www.gmds2006.de/Abstracts/399.pdt is known a method for "protein profiling of stratified epithelia using image processing of histological serial sections". As described in paragraph 4 [Material and Methods] of the document, the protein of interest, collagen I, as a component of the extracellular and the cell nuclei is stained with DAPI by means of a triple stain on frozen sections. Since only a limited number of protein expression patterns can be generated in a tissue section, an analysis is performed on the basis of serial sections. For this purpose, the epithelium is segmented in a first step. This is done "only" via the tissue contours identified in a phase contrast image by means of edge detection, masking areas of intense DAPI staining. As a result of this method, a quantitative description of protein expression in the epithelium could be described for the first time, by way of example the combinatorial expression of five key markers of epithelial homeostasis in normal human epidermis was investigated. As the last paragraph of the document indicates, an extension of the existing local abnormality detection method is planned to identify and analyze changes in the combinatorial expression pattern of selected markers at the cellular level. The simultaneous acquisition of different markers is assigned a core importance. The following remains:

• Protein expression patterns using serial sections through combinatorial expression of different markers for epithelial homeostasis are known
• - The alignment of the serial sections to each other (epithelial segmentation) takes place in the prior art in the phase contrast image by means of edge detection of identified tissue contours, ie on the basis of the morphology of the tissue and
• - The detection of more than one marker in a tissue section to avoid multiple stains and the associated limitations, in this regard, the number of markers is known.

Nachteilig aus dem bekannten Verfahren ist, dass Serienschnitte eines Gewebes nur anhand ihrer Gewebekonturen im Phasenkontrastbild zueinander ausgerichtet werden können. Daraus ergibt sich das Problem, dass bei inhomogenem Schnittbild von Serienschnitten eines Gewebes, diese nicht mehr zueinander ausgerichtet werden können, oder anders gesagt, die Erfassung eines Proteinexpressionsmusters, insbesondere als Korrelation zwischen räumlicher Lage und Proteinexpression, nicht durchführbar ist.A disadvantage of the known method is that serial sections of a tissue can be aligned with each other only on the basis of their tissue contours in the phase contrast image. This results in the problem that in an inhomogeneous sectional image of serial sections of a tissue, this no longer to each other can be aligned, or in other words, the detection of a protein expression pattern, in particular as a correlation between spatial position and protein expression, is not feasible.

Aus der DE 100 14 685 B4 ist ein Verfahren zur Identifizierung von zellspezifischen Zielstrukturen anhand eines Vergleichs unterschiedlicher Objekte (Zellen und/oder Zellmembranen) bekannt. Eine Korrelation zwischen räumlicher Lage und Proteinexpression, also die räumliche Verbindung der quantitativen Erfassung von Proteinprofilen und Expressionsmustern entlang eines Differenzierungsprozesses einer Zelle im Gewebe ist in der Druckschrift nicht die Rede.From the DE 100 14 685 B4 For example, a method for identifying cell-specific target structures based on a comparison of different objects (cells and / or cell membranes) is known. A correlation between spatial position and protein expression, ie the spatial connection of the quantitative detection of protein profiles and expression patterns along a differentiation process of a cell in the tissue is not mentioned in the document.

Aus der DE 100 43 470 B4 ist ganz allgemein ein Verfahren zur Ermittlung zellspezifischer togologischer Proteinkombinationsmuster von nZellen auf Einzelzellniveau bekannt. Bei dem Verfahren wird ein Vergleich zwischen Proteinkombinationsmustern gesunder und pathologisch oder physiologisch veränderter Zellen abgestellt.From the DE 100 43 470 B4 In general, a method for determining cell-specific togological protein combination patterns of n cells at the single cell level is known. In the method, a comparison is made between protein combination patterns of healthy and pathologically or physiologically altered cells.

Aus der DE 10 2006 012 613 A1 ist ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen in einer Zell-Blut- oder Gewebeprobe bekannt, bei dem ein markiertes therapeutisch wirksames Protein oder Peptid in einer Reagenzlösung auf die Probe aufgetragen wird und über das Bindungsverhalten des aufgetragenen Proteins oder Peptids an den relevanten Zellstrukturen die therapeutische Wirksamkeit ermittelt wird.From the DE 10 2006 012 613 A1 For example, there is known a method of determining the therapeutic efficacy of substances in a cell-blood or tissue sample by applying a labeled therapeutically-active protein or peptide in a reagent solution to the sample and binding the applied protein or peptide to the relevant cell structures the therapeutic efficacy is determined.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren anzugeben, mit dem sich sowohl die räumliche Verteilung von Proteinexpressionen als auch deren Quantität in Geweben mittels Bildverarbeitung ausmessen und bestimmen lässt, und welches sich für die klinische Diagnostik und zur Untersuchung von toxikologischen und pharmakologischen Substanzen in einem Gewebe einsetzen lässt.The present invention is therefore based on the object of specifying a method with which both the spatial distribution of protein expressions and their quantity in tissues can be measured and determined by image processing, and which is useful for clinical diagnostics and for the investigation of toxicological and pharmacological substances in a tissue.

Darüber hinaus liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Möglichkeit der objektiven Betrachtungsweise mittels bildverarbeitender Technik zur Verfügung zu stellen, die in standardisierter Weise die Erfassung von Proteinnetzwerken erlaubt, die auch als Referenzmuster zur Bestimmung der Art eines Gewebes und für die Bewertung toxikologischer und pharmakologischer Substanzen in einem Gewebe einsetzbar sind.In addition, the present invention has for its object to provide a way of objectively viewing by means of image processing technology that allows in a standardized way the detection of protein networks, which also serve as reference patterns for determining the type of tissue and for the evaluation of toxicological and pharmacological Substances can be used in a tissue.

Die oben genannte Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst, weiches dadurch gekennzeichnet ist, dass
dass sich die Proteinprofile und die Expressionsmuster entlang eines Differenzierungsprozesses der Zelle in dem Gewebe räumlich und/oder quantitativ erfassen lassen, wobei das Gewebe eine mittels mindestens einem Struktur- und mindestens einem Funktionsmarker markierte Gewebeprobe ist, die getrennt voneinander in mindestens zwei zueinander parallel stehenden und anhand des mindestens einen Strukturmarkers markierten Bereichen des Gewebes zueinander ausrichtbaren Schnittebenen betrachtet und ausgemessen wird, wobei in jeder Schnittebene ein von den oder der anderen Schnittebene unterschiedlicher Funktionsmarker gemessen wird.The above object is achieved by a method according to claim 1, which is characterized in that
in that the protein profiles and the expression patterns can be detected spatially and / or quantitatively along a differentiation process of the cell in the tissue, wherein the tissue is a tissue sample labeled by at least one structural and at least one functional marker, which are separated from each other in at least two mutually parallel and is viewed and measured on the basis of the at least one structure marker marked areas of the fabric aligned to each other sectional planes, wherein in each sectional plane of the one or the other sectional plane different function marker is measured.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass sich eine Gewebeprobe in Serienschnitten, nämlich in parallel zueinander ausrichtbaren Schnittebenen, räumlich erfassen lässt, indem die Gewebeschnitte anhand von Strukturmarkern markierten Bereiche zueinander ausgerichtet werden. Insofern ist auch erfindungsgemäß erkannt worden, dass sich Strukturmarker, wobei es sich erfindungsgemäß um stabil im Gewebe exprimierte Proteine handelt, als Referenzpunkte verwenden lassen (s. Seite 8, Absatz 2, vorletzter Satz der Anmeldungsunterlagen). Zudem ist erkannt worden, dass sich jeder Schnittebene mindestens ein Funktionsmarker getrennt von den Funktionsmarkern der anderen Schnittebenen zuordnen lässt, wodurch sich eine räumliche Erfassung von Proteinexpressionen durchführen lässt. Im Gegensatz zu dem aus dem gattungsbildenden Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgt demnach mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine Orientierung der Schnittebenen durch ein Gewebe über Markierungspunkte (Strukturmarker) unabhängig von der Gewebekontur der Schnitte. Dies stellt eine grundlegende Voraussetzung für die Standardisierbarkeit der Erstellung von Proteinprofilen und zur Erfassung von Expressionsmustern für den Einsatz, beispielsweise in der klinischen Diagnostik, dar.According to the invention, it has been recognized that a tissue sample can be detected spatially in serial sections, namely in sectional planes that can be aligned parallel to each other, by aligning the tissue sections to one another using areas marked by structure markers. In this respect, it has also been recognized according to the invention that structural markers, which are stable proteins expressed in the tissue according to the invention, can be used as reference points (see page 8, paragraph 2, penultimate sentence of the application documents). In addition, it has been recognized that at least one function marker can be assigned to each section plane separately from the function markers of the other section planes, as a result of which a spatial detection of protein expressions can be carried out. In contrast to the method known from the generic state of the art, the method of the present invention thus implements an orientation of the cutting planes through a tissue via marking points (structure markers) independently of the tissue contour of the cuts. This is a fundamental prerequisite for the standardization of the production of protein profiles and for the detection of expression patterns for use, for example in clinical diagnostics.

Folglich ist erfindungsgemäß ein Verfahren angegeben, bei dem sich sowohl die räumliche Verteilung von Proteinexpressionen als auch deren Quantität in Geweben mittels Bildverarbeitung ausmessen und bestimmen lässt, und welches sich für die klinische Diagnostik und zur Untersuchung von toxikologischen und pharmakologischen Substanzen in einem Gewebe einsetzen lässt.Thus, according to the invention, a method is provided in which both the spatial distribution of protein expressions and their quantity in tissues can be measured and determined by means of image processing, and which can be used for clinical diagnosis and for the investigation of toxicological and pharmacological substances in a tissue.

Darüber hinaus ist die vorliegende Aufgabe durch die Verwendungen gemäß der nebengeordneten Patentansprüche 22, 23, 27, 28 und durch die Verfahren gemäß den Ansprüchen 29, 31 gelöst, die auf Basis des mit den Merkmalen des Anspruchs 1 beanspruchten Verfahrens, die Verwendung in der klinischen Diagnostik und die Untersuchung von toxikologischen und pharmakologischen Substanzen im Gewebe ermöglichen und durch dessen Standardisierbarkeit Referenzmuster für Proteinnetzwerke zur Bestimmung der Art einer Gewebeprobe und für die Beurteilung toxikologischer oder pharmakologischer Substanzen in einer Gewebeprobe hergestellt werden können. Zudem ist mit dem gemäß Anspruch 29 beanspruchten Verfahrens, nämlich unter Verwendung eines Scanners, dessen Prisma so mit den Farbstoffen für die Marker abgestimmt ist, dass getrennte digitale Bilder aus einer Schnittebene des Gewebes erzeugt werden können, eine erhöhte Automatisierung auf Seiten der bildverarbeitenden Technik möglich. In addition, the present object is achieved by the uses according to the independent claims 22, 23, 27, 28 and by the methods according to claims 29, 31, based on the claimed with the features of claim 1 method, the use in the clinical Diagnostics and the investigation of toxicological and pharmacological substances in tissue and its standardizability reference pattern for protein networks to determine the nature of a tissue sample and for the assessment of toxicological or pharmacological substances in a tissue sample can be produced. In addition, with the method claimed in claim 29, namely using a scanner whose prism is tuned with the dyes for the markers that separate digital images can be generated from a cutting plane of the tissue, increased automation on the part of image processing technology possible ,

Zudem ist die oben aufgeführte Aufgabe bezüglich des mit Anspruch 32 beanspruchten Testsystems gelöst, welches unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Automatisierung für pharmakologische und/oder toxikologische Untersuchungen in 3D in vitro Zellkulturen erlaubt.In addition, the abovementioned object is achieved with respect to the test system claimed with claim 32, which allows automation of pharmacological and / or toxicological investigations in 3D in vitro cell cultures using the method according to the invention.

Ganz allgemein bestehen für das hier beanspruchte Testsystem folgende prinzipielle Einsatzmöglichkeiten, im Folgenden:

• 1.) Den Vergleich von Geweben, der zum Beispiel die Überwachung der Produktqualität bei 3D in vitro Kulturen erlaubt, oder den Vergleich von Patientenproben ermöglicht, um prognostische und diagnostische Aussagen machen zu können;
• 2.) Den Vergleich von Biomarkern, die durch moderne Genomics- und Proteomics-Technologien in großer Anzahl generiert werden. Durch das beanspruchte Testsystem unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erstmalig möglich, die Biomarker automatisiert und in standardisierter Form an Geweben miteinander zu vergleichen. Dadurch wird es ermöglicht, aus einer Kandidatenmenge an Biomarkern diejenigen herauszuselektieren, mit denen sich einzeln oder auch in Kombination eine bestimmte diagnostische Aussage mit einer minimalen geforderten Sensitivität und Spezifizität treffen lassen.
• 3.) Den Vergleich von Modulatoren (Substanzen, Behandlungen) für die Untersuchung von kosmetischen oder therapeutischen Substanzen oder zur Untersuchung von therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten (z. B. strahlentherapie), die zu einer Veränderung der epithelialen Homöostase führen. Mittels des Verfahrens ist es dabei möglich, kosmetische und therapeutische Substanzen oder Behandlungsmöglichkeiten erstmals quantitativ an einer Vielzahl von Biomarkern einzusetzen.

In general, the following principal application possibilities exist for the test system claimed here, in the following:

• 1.) The comparison of tissues, for example, the monitoring of product quality in 3D in vitro cultures allowed, or the comparison of patient samples allows to make prognostic and diagnostic statements;
• 2.) The comparison of biomarkers generated by modern genomics and proteomics technologies in large numbers. The claimed test system using the method according to the invention makes it possible for the first time to compare the biomarkers in an automated manner and in standardized form in tissues. This makes it possible to select out of a candidate set of biomarkers those with which, individually or in combination, a specific diagnostic statement with a minimum required sensitivity and specificity can be made.
• 3.) The comparison of modulators (substances, treatments) for the examination of cosmetic or therapeutic substances or for the investigation of therapeutic treatment options (eg radiotherapy), which lead to a change in epithelial homeostasis. By means of the method, it is possible for the first time to quantitatively employ cosmetic and therapeutic substances or treatment options on a large number of biomarkers.

Es kann also mit dem beanspruchten Verfahren der biofunktionale Zustand einer Gewebeprobe bestimmt werden. Darüber hinaus ist mit dem beanspruchten Verfahren eine diagnostische Entscheidung für einen Patienten sowie eine prognostische Voraussage für einen Patienten möglich und zudem eine biofunktionale Beschreibung einer Gewebeprobe zu Forschungszwecken. Bei letzterer Anwendung ermöglicht das beanspruchte Verfahren z. B. die objektive und quantitative Messung der biofunktionalen Veränderung im Gewebe, die bei der Behandlung einer Gewebekultur mit einer chemischen Substanz auftritt. Das beanspruchte Verfahren ist damit in der Lage die Wirkung chemischer Substanzen auf das Hautwachstum objektiv zu quantifizieren und damit zu beurteilen.It can therefore be determined with the claimed method of biofunctional state of a tissue sample. In addition, the claimed method provides a diagnostic decision for a patient as well as a prognostic prediction for a patient and also a biofunctional description of a tissue sample for research purposes. In the latter application, the claimed method allows z. For example, the objective and quantitative measurement of biofunctional change in tissue that occurs in the treatment of a tissue culture with a chemical substance. The claimed method is thus able to objectively quantify the effect of chemical substances on the growth of the skin and thus to assess it.

Für die quantitative Messung ist es notwendig, dass die Schnittebenen bei Verwendung von zwei Gewebeschnitten so ausgerichtet werden, dass identische Gewebeabschnitte übereinander gelagert sind. Das Gleiche gilt, wenn in einzelnen Schnitten Expressionsgradienten der Proteine gemessen wurden, dann ist ein Überlagern der Expressionsgradienten durch Übereinanderlagern identischer Gewebebereiche zwingend notwendig, um quantitative und räumliche Aussagen über die Proteinexpression im Gewebe machen zu können. Es Ist aber mit dem beanspruchten Verfahren auch grundsätzlich möglich, ohne Ausrichtung einen Vergleich von Proteinprofilen durch die Gradientenbildung zwischen einzelnen Gewebeschnitten durchzuführen. Erst beim Auftragen aller Gradienten der einzelnen Schnitte in ein multidimensionales Expressionsprofil werden Schnitte theoretisch anhand von festgelegten Referenzpunkten überlagert. Das macht eine Registrierung der einzelnen Schnitte überflüssig, da die Gradienten aller Biomarker unabhängig voneinander berechnet werden, bevor sie zu einem Multi-Biomarker-Profil zusammengesetzt werden. Als Referenzpunkte zum Ausrichten der Schnittebenen oder der Expressionsgradienten eignen sich dazu in besonderer Weise morphologische Marker, die identische, in den Schnittebenen vorkommende Strukturen markieren. Insbesondere eignen sich als Referenzpunkte bekannte, in den Geweben stabil exprimierte Proteine, wobei als morphologische Marker Antikörper verwendet werden, die an die stabil exprimierten Proteine binden. Als Beispiel sind hierbei Zellverbindungsproteine, wie Desmoplakin (Dp), Desmoglein, E-cadherin, beta-catenin oder Pancadherin, Integrine und Proteine des Zellcytoskeletts, wie Pankreatin, Actin und Tubulin zu nennen. Weitere Beispiele für morphologische Marker sind weiter unten genannt.For the quantitative measurement it is necessary that the cutting planes are aligned with the use of two tissue sections so that identical tissue sections are superimposed. The same applies if expression gradients of the proteins were measured in individual sections, then overlaying the expression gradients by superimposing identical tissue regions is absolutely necessary in order to be able to make quantitative and spatial statements about protein expression in the tissue. However, it is also fundamentally possible with the claimed method to carry out a comparison of protein profiles by the gradient formation between individual tissue sections without alignment. Only when applying all gradients of the individual sections to a multidimensional expression profile, sections are theoretically superimposed on the basis of fixed reference points. This eliminates the need to register the individual sections since the gradients of all biomarkers are calculated independently before being assembled into a multi-biomarker profile. As reference points for aligning the cutting planes or the expression gradients, morphological markers which mark identical structures occurring in the cutting planes are particularly suitable for this purpose. In particular, proteins which are known as reference points and are stably expressed in the tissues are suitable, antibodies which bind to the stably expressed proteins being used as morphological markers. Examples include cell binding proteins such as desmoplakin (Dp), desmoglein, E-cadherin, beta-catenin or pancadherin, cell cytoskeleton integrins and proteins, such as pancreatin, actin and tubulin. Further examples of morphological markers are mentioned below.

In vorteilhafter Weise ermöglicht das Verfahren die Bestimmung einer großen Anzahl von Kombinationen von räumlich korrelierten Biomarkern in einer Gewebeprobe, z. B. 10–50, die aber nur durch die Menge der zur Verfügung stehenden Gewebeschnitte begrenzt ist. Es sind also n = unendlich Biomarker mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmbar und räumlich korrelierbar. Dazu wird die Gewebeprobe fixiert und es werden Serienschnitte angefertigt. Alle Schnitte werden so gefärbt, dass ein oder mehrere morphologische Marker C_j die räumliche Zuordnung der Serienschnitte (z. B. Collagen-IV, Laminin 1) sowie die Erkennung und Segmentierung des interessierenden Gewebebereiches ermöglichen und ein oder mehrere unterschiedliche Funktionsmarker X_i eine molekulare Eigenschaft des Gewebes anzeigen (z. B. einen Gewebedifferenzierungsmarker in Epithelien wie z. B. Keratin K1, Keratin K10, Keratin K14)). Die Erkennung der Marker erfolgt über eine in allen Serienschnitten identische Färbung. Als Färbetechniken können z. B. in situ Hybridisierung (ISH), Antikörper (AK), Kernfärbungen oder eine Gegenfärbung eingesetzt werden. Alle Serienschnitte werden dabei so eingefärbt, dass die auf allen Schnitten über Cj gemeinsam enthaltenen morphologischen Merkmale eingefärbt werden. Die Biomarker X_i beschreiben in jedem einzelnen der Serienschnitte eine andere molekulare Eigenschaft des Gewebes. Alle Schnitte sind somit in mindestens zwei Farben eingefärbt. Es können aber auch mehrere morphologische oder mehrere Biofunktionsmarker pro einzelnen Serienschnitt angefärbt werden. Die morphologischen Marke Cj dienen neben der Erkennung von Referenzbereichen, die zum Übereinanderlagern und ausrichten einzelner Schnitte zueinander als Referenzpunkte dienen, auch für eine durch ein Computerverfahren automatisierte Erkennung (Segmentierung) des Epithelanteils im Gewebeschnitt. Advantageously, the method enables the determination of a large number of combinations of spatially correlated biomarkers in a tissue sample, e.g. B. 10-50, which is limited only by the amount of available tissue sections. Thus, n = infinite biomarkers can be determined using the method according to the invention and spatially correlated. For this purpose, the tissue sample is fixed and serial sections are made. All sections are stained such that one or more morphological markers C _j enable the spatial assignment of the serial sections (eg collagen IV, laminin 1) as well as the recognition and segmentation of the tissue region of interest and one or more different function markers X _i Indicate property of the tissue (eg a tissue differentiation marker in epithelia such as keratin K1, keratin K10, keratin K14)). The markers are identified by an identical color in all series sections. As dyeing techniques z. B. in situ hybridization (ISH), antibodies (AK), nuclear stains or a counterstain can be used. All serial sections are stained in such a way that the morphological features common to all sections via Cj are colored. The biomarkers X _i describe a different molecular property of the tissue in each of the serial sections. All cuts are thus dyed in at least two colors. However, it is also possible to stain several morphological or several biofunction markers per individual serial section. The morphological mark Cj serve in addition to the detection of reference areas, which serve as a reference points for superimposing and aligning individual sections to each other, also for a computerized automated detection (segmentation) of the epithelial portion in the tissue section.

Mit dem genannten Verfahren können in geeigneter Weise Gewebeproben mit „Protein Cancer Marker” markiert werden. Insbesondere eignen sich diese Marker bei toxikologischen Tests von Irritation, Genotoxizität und Kanzerogenität. Dabei könnte das beanspruchte Verfahren unter Verwendung von Krebsbiomarkern ein Alternative zum Cytotox-Test (MTT-Test (Farbumschlagtest)) für die Irritation, zum für die Genotoxizität bekannten Comet-Assay, mit dem Strangbrüche in der DNS nachgewiesen werden, und zum Amnes-Test darstellen.With the method mentioned, tissue samples can be suitably labeled with "protein cancer markers". In particular, these markers are useful in toxicological tests of irritation, genotoxicity and carcinogenicity. The claimed method using cancer biomarkers could provide an alternative to the cytotox test (MTT (color change test)) for irritation, the comet assay known for genotoxicity, which detects strand breaks in DNA, and the Amnes test represent.

Als Krebsbiomarker kommen sämtliche bekannte Biomarker in Betracht, insbesondere auch die in Biomarker Insights 2006:2, A List of Candidate Cancer Biomarkers for Targeted Proteomics vorgestellten Krebsbiomarker.All known biomarkers can be considered as cancer biomarkers, in particular the cancer biomarkers presented in Biomarker Insights 2006: 2, A List of Candidate Cancer Biomarkers for Targeted Proteomics.

Neben den Krebsbiomarkern eignen sich insbesondere Biomarker der epithelialen Homöostase, wie Integrin-α₆, Transglutaminase, Loricin und Keratin 6 für das erfindungsgemäße Verfahren.In addition to the cancer biomarkers are particularly biomarkers of epithelial homeostasis, such as integrin α ₆ , transglutaminase, loricin and keratin 6 for the inventive method.

Aber auch andere Biomarker, wie beispielweise die in Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 2458–2472 oder die in Toxicology in Vitro 20 (2006) 975–985 beschriebenen Biomarker können in dem beanspruchten Verfahren eingesetzt werden.However, other biomarkers such as the biomarkers described in Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 2458-2472 or in Toxicology in Vitro 20 (2006) 975-985 can also be used in the claimed process.

Als besonders vorteilhaft eignen sich für die Färbung der Schnitte Floureszenzfarbstoffe (z. B. Cy2, Cy3, Cy5) oder im sichtbaren Frequenzbereich (z. B. Haemotxylin, Eosin) emittierende Farbstoffe. Es können aber auch fluoreszente organische Farbstoffe, wie beispielsweise Alexa 488, Alexa 594, Alexa 405, und für Zellkernfärbungen Sytox Green oder DAPI (Invitrogen, Carlsbad, California) verwendet werden. Aus der Möglichkeit, dass das beanspruchte Verfahren auch auf Farbstoffe einsetzbar ist, die eine Zellkernfärbung ermöglichen, kann erstmalig eine quantitative und automatische Vermessung der Morphologie einzelner Zellen im Gewebe erfolgen. So kann zum Beispiel der Verlust eines Zellkerns einer Zelle im Laufe des Differenzierungsprozesses der Zelle im Gewebe wahrgenommen und gemessen werden, beispielsweise durch den graduellen Verlust der DAPI-Färbung. Es ist aber auch erstmalig die Möglichkeit gegeben, die Veränderung der Größe einer Zelle automatisiert zu erfassen, nämlich die Volumenänderung oder den Umfang der Zelle durch Veränderung des Musters von membranständigen und beispielsweise fluoreszent angefärbten Proteinen, bildverarbeitungstechnisch automatisiert mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zu vermessen.Florescent dyes (eg Cy2, Cy3, Cy5) or dyes emitting in the visible frequency range (eg haemotxylin, eosin) are particularly suitable for dyeing the sections. However, it is also possible to use fluorescent organic dyes such as Alexa 488, Alexa 594, Alexa 405, and for nuclear staining Sytox Green or DAPI (Invitrogen, Carlsbad, California). From the possibility that the claimed method can also be used on dyes which enable nuclear staining, a quantitative and automatic measurement of the morphology of individual cells in the tissue can be carried out for the first time. For example, the loss of a cell nucleus of a cell may be sensed and measured in the tissue during the process of differentiating the cell, for example, by the gradual loss of DAPI staining. However, it is also possible for the first time to automatically detect the change in the size of a cell, namely to measure the volume change or the circumference of the cell by changing the pattern of membrane-bound and, for example, fluorescently stained proteins, image-processing-automated with the method according to the invention.

Insbesondere in Bezug auf mit dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Referenzmuster von Proteinnetzwerken eignen sich an nanokristalline Strukturen gebundene Fluoreszenzfarbstoffe, so genannte Quantum-Dots. Vorteil dieser Farbstoffe im Gegensatz zu organischen Farbstoffen ist die Tatsache, dass Quantum-Dots nicht ausbleichen, also das Referenzmuster erhalten bleibt und sie ein sehr klar definiertes Expressionsspektrum aufweisen. In Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, welches auch automatisiert, das heißt auch vollautomatisch durchführbar ist, dass für klinische Diagnosen, beispielsweise in der Pathologie, es erstmalig möglich ist, die mit dem Verfahren hergestellten Referenzmuster von Proteinnetzwerken für automatische Diagnosen in klinischen Laboratorien standardisiert und den Vorgaben für klinische Diagnostik entsprechend einzusetzen. Zudem ist vorteilhaft bei der Verwendung von Quantum-Dots in der digitalen Bildakquise, beispielsweise dem Gewebescanning, dass die gefärbten Proteine in ihrer absoluten Menge quantifizierbar sind. Dies ist besonders bei der Erstellung von Proteinnetzwerken sehr hilfreich. Beispielhaft sind hier Quantum-Dot gekoppelte Sekundärantikörper zu nennen. Diese werden zum Beispiel von der Firma Invitrogen unter dem Namen Qdot^® 525 mit 525 nm Emission vertrieben. Es werden aber auch Quantum-Dot gekoppelte Sekundärantikörper angeboten, die bei 565, 585, 605, 655 und 705 nm emittieren. Es können aber natürlich auch direktgekoppelte farbige Primärantikörper oder über Streptavidin/Biotin gekoppelte Antikörper bei dem beanspruchten Verfahren verwendet werden.In particular with respect to reference patterns of protein networks produced by the method according to the invention, fluorescent dyes bound to nanocrystalline structures, so-called quantum dots, are suitable. The advantage of these dyes in contrast to organic dyes is the fact that quantum dots do not fade, ie the reference pattern is retained and they have a very clearly defined expression spectrum. In connection with the method according to the invention, which is also automated, that is also fully automatic feasible, that for clinical diagnoses, for example in pathology, it is possible for the first time, standardized with the method of reference protein networks for automatic diagnosis in clinical laboratories standardized and the Use guidelines for clinical diagnostics. In addition, it is advantageous when using quantum dots in digital image acquisition, for example tissue scanning, that the colored proteins are in their absolute amount are quantifiable. This is especially helpful when creating protein networks. By way of example, quantum-dot coupled secondary antibodies can be mentioned here. These are, for example, from Invitrogen under the name Qdot ^® 525 marketed with 525 nm emission. However, quantum-dot coupled secondary antibodies are also available which emit at 565, 585, 605, 655 and 705 nm. However, it is of course also possible to use direct-coupled colored primary antibodies or streptavidin / biotin-coupled antibodies in the claimed method.

Wenn als Detektionssystem ein zweistufiges System, das heißt mit einem Primär-Antikörper und einem farbmarkiertem Sekundärantikörper, eingesetzt wird, ist es vorteilhaft, wenn bei einer Doppelfärbung in einer Schnittebene, beispielsweise der Färbung von Bio- und Strukturmarker, für den Biomarker ein von einer zu dem Strukturmarker unterschiedlichen Spezies stammender Primärantikörper eingesetzt wird, zum Beispiel ein aus einem Kaninchen und ein aus einer Maus gewonnener Primärantikörper.If a two-stage system, that is to say with a primary antibody and a color-labeled secondary antibody, is used as the detection system, it is advantageous if, in the case of a double staining in a sectional plane, for example the staining of bioburden and structure marker, for the biomarker one of the primary marker used in the structure marker of different species is used, for example a primary antibody obtained from a rabbit and from a mouse.

Es werden dann Digitalfarbbilder der Schnitte durch eine CCD-Kamera so aufgenommen, dass die morphologischen Marker von den biofunktionalen Markern in verschiedenen Farbkanälen vorliegen. Bei nicht-fluoreszenten Färbungen wie z. B. Hämatoxylin und Eosin (HE)-Färbungen, die auch colorimetrische Färbungen genannt werden ist es in der Regel nicht möglich, dass morphologische und biofunktionale Marker in verschiedenen Farbkanälen vorliegen. Entsprechende computerbasierte Algorithmen, die eine mathematische Zerlegung von Digitalbildern mit colorimetrischen Mehrfachfärbungen in einzelne Farbkanäle approximativ durchführen können sind unter dem Begriff „color unmixing” in der Fachwelt bekannt. Hierzu kann ein spezieller Scanner oder ein Mikroskop eingesetzt werden. Eine automatische Transporteinrichtung des Scanners ermöglicht das automatische Verarbeiten einer großen Anzahl von Serienschnitten und von Proben. Es ist möglich von jedem Serienschnitt zunächst als Teilbilder aufzunehmen und diese Teilbilder dann anschließend automatisch zu einem Gesamtbild vor der weiteren Bildverarbeitung zusammenzufügen. Das Färben und Aufnehmen der Digitalbilder kann in einem maschinellen Prozess automatisiert werden (Apparatus). Färbeautomaten und Scanner auf Basis von Objektträgern sind auf dem Forschungsmarkt erhältlich (Firmen: Leica, Zeiss, Olympus und Hamamatsu Photonics).Digital color images of the slices are then taken by a CCD camera so that the morphological markers are present from the biofunctional markers in different color channels. For non-fluorescent dyeings such. As hematoxylin and eosin (HE) stains, which are also called colorimetric stains, it is usually not possible that morphological and biofunctional markers are present in different color channels. Corresponding computer-based algorithms which can approximately perform a mathematical decomposition of digital images with colorimetric multiple stains into individual color channels are known by the term "color unmixing" in the art. For this purpose, a special scanner or a microscope can be used. An automatic transport device of the scanner enables the automatic processing of a large number of serial cuts and samples. It is possible to first capture each of the series sections as partial images and then automatically combine these partial images into a complete image before further image processing. The dyeing and recording of the digital images can be automated in a machine process (Apparatus). Dyeing machines and scanners based on microscope slides are available on the research market (companies: Leica, Zeiss, Olympus and Hamamatsu Photonics).

Für die Bestimmung der räumlich korrelierten Biomarker über eine Bildverarbeitungssoftware werden im Folgenden zwei mögliche Lösungen angegeben.For the determination of spatially correlated biomarkers via image processing software, two possible solutions are given below.

Die erste Lösung ist für die Analyse von Gewebeproben mit unregelmäßiger Struktur geeignet (z. B. im Anwendungsfall der Krebsdiagnostik kann die Gewebestruktur sehr verändert vorliegen). Durch eine Registrierungssoftware werden die einzelnen Schnittebenen gemäß der morphologischen Gewebemerkmale aufeinander registriert, d. h. sie werden so zueinander ausgerichtet, dass die morphologischen Gewebemerkmale, die allen Schnitten gemeinsam sind, sich möglichst gut überdecken. Die Registrierung über die morphologischen Merkmale richtet damit automatisch die biofunktionalen Marker zueinander aus.The first solution is suitable for the analysis of tissue samples with an irregular structure (eg in the application of cancer diagnostics, the tissue structure may be very different). By registration software, the individual cutting planes are registered with each other according to the morphological fabric characteristics, i. H. they are aligned with each other so that the morphological tissue features that are common to all sections cover as well as possible. The registration via the morphological features thus automatically aligns the biofunctional markers with each other.

Anschließend werden bei dieser Lösung geometrische Subregionen, die allen Schnitten gemeinsam sind, definiert. Diese können sich an den morphologischen Gewebemerkmalen orientieren, müssen es aber nicht. Es kann z. B. auch ein einfaches Gitternetz über alle Schnitte gelegt werden, so dass das Gitter dieselben Geweberegionen auf allen Schnitten eindeutig beschreiben kann. Es wird dann ein mittlerer Wert der Färbung mit B in allen Geweberegionen bestimmt. Die mittlere Färbung in der Geweberegion auf einem Schnitt j entspricht dann der mittleren Expression des Biomarkers j in dieser Geweberegion. Der Vergleich aller Geweberegionen in allen Serienschnitten (also allen Biomarkern) ergibt ein räumliches Profil der korrelierten Biomarker. Es können dann durch einfaches Auszählen die häufigen korrelierten und anti-korrelierten Biomarker identifiziert werden.Subsequently, this solution defines geometric subregions that are common to all sections. These may or may not be based on morphological tissue characteristics. It can, for. As well as a simple grid over all sections are placed so that the grid can clearly describe the same tissue regions on all sections. An average value of staining with B in all tissue regions is then determined. The mean staining in the tissue region on a section j then corresponds to the mean expression of the biomarker j in this tissue region. The comparison of all tissue regions in all serial sections (ie all biomarkers) results in a spatial profile of the correlated biomarkers. By simply counting out, the frequent correlated and anti-correlated biomarkers can then be identified.

Die zweite Lösung ist für die Analyse von Gewebeproben mit einer relativ konstanten Struktur geeignet (z. B. im Anwendungsfall einer Gewebekultur). Organotypische Haut-Gewebekulturen weisen z. B. bei der Analyse der Wirkung chemischer Substanzen in der Regel wenig grundsätzliche Änderungen der Gewebemorphologie auf. Es wird daher bei dieser Lösung ein Gradient für jeden Marker innerhalb des Gewebes berechnet, der die mittlere Expression des Biomarkers über die Gewebetiefe angibt. Dieser Gradient wird für horizontale Abschnitte der Gewebeprobe berechnet. Die Übereinanderlagerung der Gradienten aller Biomarker aus allen Serienschnitten in allen Abschnitten ergibt die räumlich korrelierten Biomarker. Die zuvor beschriebene Färbung der morphologischen Strukturmarker Cj kann dabei so gewählt werden, dass Beginn und Ende des Gradienten durch automatische Bildverarbeitungsverfahren automatisch erkannt werden können.The second solution is suitable for the analysis of tissue samples with a relatively constant structure (eg in the case of tissue culture use). Organotypic skin tissue cultures have e.g. For example, when analyzing the effect of chemical substances, there are generally few fundamental changes in tissue morphology. Thus, in this solution, a gradient is calculated for each marker within the tissue that indicates the mean expression of the biomarker across tissue depth. This gradient is calculated for horizontal sections of the tissue sample. The superimposition of the gradients of all biomarkers from all serial sections in all sections yields the spatially correlated biomarkers. The previously described coloring of the morphological structure markers Cj can be chosen such that the beginning and end of the gradient can be automatically recognized by automatic image processing methods.

Daher eignet sich das beanspruchte Verfahren insbesondere für die Verwendung an 3D-in vitro Kulturen der Haut. Diese werden zum Beispiel für die Kosmetikindustrie verwendet, um auf diesen toxikologische Tests, sogenannte Tox-Tests durchzuführen. Dazu müssen die 3D-in vitro Gewebekulturen standardisierbar sein und unterliegen einer höchst anspruchsvollen Qualitätskontrolle. Mit dem Verfahren in Verbindung mit den Tox-Tests an 3D-Kulturen besteht erstmalig die Möglichkeit, die Effektivität, das heißt die Wirkung einer Substanz auf die epitheliale Homöostase und deren Toxizität, also das Risiko der Substanz, in einem einzigen Test-Verfahren quantitativ zu untersuchen. Bisher wurden die Effektivität und die Toxizität einer Substanz in der Pharmaindustrie und Kosmetikindustrie nämlich in verschiedenen Testsystemen (Bakterien, Tiere, Zellkulturen etc.) durchgeführt und mit einem Abstand von Monaten oder Jahren nacheinander getestet. Es ist also mit dem beanspruchten Verfahren möglich, die Wirkung von Substanzen auf Irritation, Genotoxizität und/oder Kanzerogenität bei Kontakt mit einem Gewebe zu untersuchen. Hier kommen neben der Wirkung von Substanzen natürlich auch Untersuchungen von Behandlungsformen (Strahlentherapie, Röntgenstrahlung) oder Umweltbelastungen auf das Gewebe, zum Beispiel UV-Strahlung oder bei der Strahlentherapie eingesetzte radioaktive Strahlungen in Betracht. Es lässt sich also mit dem beanspruchten Verfahren erstmalig ein Behandlungsrisiko oder Behandlungserfolg einer Strahlentherapie, auch in Verbindung mit Substanzen wie Chemotherapeutika, in einem Testsystem vor der klinischen Anwendung quantifizieren. Als besonders vorteilhaft ist dabei zu erwähnen, dass das beanspruchte Verfahren Tierversuche in der Kosmetik- und Pharmaindustrie ersetzen kann.Therefore, the claimed method is particularly suitable for use on 3D in vitro cultures of the skin. These are used, for example, for the cosmetics industry to look for these toxicological Tests to perform so-called tox tests. For this purpose, the 3D in vitro tissue cultures must be standardized and subject to a very demanding quality control. For the first time, the method in connection with the Tox-Tests on 3D cultures gives the possibility to quantify the effectiveness, ie the effect of a substance on the epithelial homeostasis and its toxicity, ie the risk of the substance, in a single test procedure investigate. So far, the effectiveness and toxicity of a substance in the pharmaceutical industry and cosmetics industry namely in various test systems (bacteria, animals, cell cultures, etc.) were performed and tested with a spacing of months or years in a row. Thus, it is possible with the claimed method to study the effect of substances on irritation, genotoxicity and / or carcinogenicity on contact with a tissue. In addition to the effect of substances, investigations of treatment forms (radiation therapy, X-radiation) or environmental stresses on the tissue, for example UV radiation or radioactive radiation used in radiotherapy, are of course also considered here. Thus, with the claimed method, it is possible for the first time to quantify a treatment risk or treatment success of radiation therapy, also in conjunction with substances such as chemotherapeutic agents, in a test system prior to clinical application. It is particularly advantageous to mention that the claimed method can replace animal experiments in the cosmetics and pharmaceutical industries.

Entsprechende Biomarker für Irritationstests für die Haut, insbesondere an in vitro Gewebekulturen, sind zum Beispiel aus der Publikation Proteomic Analysis of the response of EpiDermTM cultures to sodium lauryl sulphate, S. T. Fletcher, D. A. Basketter/Toxicology in Vitro 20 (2006) 975–985 (Irritation von Haut mit SLS auf einer 3D-in vitro Hautkultur von MatTek Corporation) bekannt.Corresponding biomarkers for irritation tests for the skin, in particular on in vitro tissue cultures, are known, for example, from the publication Proteomic Analysis of the response of EpiDerm ™ cultures to sodium lauryl sulphate, ST Fletcher, DA Basketter / Toxicology in Vitro 20 (2006) 975-985 (2006). Irritation of skin with SLS on a 3D in vitro skin culture from MatTek Corporation).

Beispielhaft sei an dieser Stelle auf den üblichen Stand der Technik der Untersuchung von 3D-in vitro Gewebekulturen verwiesen, der sich aus der Publikation Functional Characterization of the Epidermal Cholinergic System In Vitro, Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 2458–2472. doi:10.1038/sj.jid.5700443; published online 29 June 2006 ergibt, wobei das Expressionsmuster in einfachen Tabellen mit einem „+” oder einem „–” für das gesamte untersuchte Gewebe dargestellt wird. Allerdings eignen sich auch die in dieser Publikation genannten Biomarker als Antigene, sowie deren entsprechende Antikörper als Biomarker für das vorliegend beanspruchte Verfahren.By way of example, reference should be made here to the state of the art in the investigation of 3D in vitro tissue cultures, which is known from the publication Functional Characterization of the Epidermal Cholinergic System In Vitro, Journal of Investigative Dermatology (2006) 126, 2458-2472. doi: 10.1038 / sj.jid.5700443; published online 29 June 2006 where the expression pattern is presented in simple tables with a "+" or a "-" for the entire tissue examined. However, the biomarkers mentioned in this publication are also suitable as antigens, as well as their corresponding antibodies as biomarkers for the presently claimed method.

Aber auch die oben erwähnte Qualitätskontrolle der 3D-in vitro Gewebekulturen ist vollautomatisch über die durch das beanspruchte Verfahren hergestellten Referenzmuster mit dem beanspruchten Verfahren möglich. Es ist also auch erstmalig möglich mit dem beanspruchten eine vollautomatische Qualitätskontrolle bei der Produktion der 3D-in vitro Gewebekulturen durchzuführen.However, the above-mentioned quality control of 3D in vitro tissue cultures is also fully automatic via the reference pattern produced by the claimed method with the claimed method. It is therefore also possible for the first time to carry out the claimed fully automatic quality control in the production of 3D in vitro tissue cultures.

Neben den frei käuflich erwerbbaren 3D-Kulturen der Haut kommen auch alle anderen stratifizierten Epithelgewebe zur Erstellung von räumlich und quantitativ erfassbaren Proteinprofilen in Betracht. So können außer der Haut auch Gewebe, wie beispielsweise die Mundschleimaut, das Zahnfleisch, vaginales Gewebe, oesophageales Gewebe und aleovolares Gewebe untersucht werden.In addition to the freely purchasable 3D cultures of the skin, all other stratified epithelial tissues are also suitable for the generation of spatially and quantitatively detectable protein profiles. Thus, in addition to the skin, tissues such as oral mucosa, gums, vaginal tissue, oesophageal tissue and aleovolar tissue may also be examined.

Für das bildverarbeitende Verfahren eignet sich insbesondere die Verwendung eines digitalen mikroskopischen Scanners. Beispielsweise sind hier Scanner der Firma Hamamatsu zu nennen, mit denen es möglich ist, komplette Gewebeschnitte einzuscannen und auszuwerten. Insbesondere kommen für das beanspruchte Verfahren, welches in vorteilhafter Weise vollautomatisiert durchführbar sein soll, Scanner mit einem Prisma in Betracht, welches auf die Farbstoffe der verwendeten Marker so abgestimmt ist, dass es nach Farben getrennte digitale Bilder aus einer Schnittebene des Gewebes erzeugt. Noch bevorzugter ist die Verwendung eines kontinuierlichen Prismas zu nennen, welches mehrere Farbkanäle gleichzeitig in einem digitalen Bild aus einer Schnittebene des untersuchten Gewebes spektral aufnimmt.In particular, the use of a digital microscopic scanner is suitable for the image processing method. For example, scanners from Hamamatsu can be mentioned here, with which it is possible to scan and evaluate complete tissue sections. In particular, scanners with a prism come into consideration for the claimed method, which should be able to be carried out fully automatically in an advantageous manner, which is adapted to the dyes of the markers used in such a way that it generates digital images separated from colors by a cutting plane of the fabric. Even more preferred is the use of a continuous prism, which spectrally receives several color channels simultaneously in a digital image from a section plane of the examined tissue.

Neben den oben erwähnten Verwendungsmöglichkeiten, lassen sich erstmalig quantitativ und räumlich korrelierte Proteinnetzwerke darstellen. Daraus resultiert, dass mit dem bekannten Verfahren Referenzmuster für Proteinnetzwerke erstellt werden können. Diese Referenzmuster können dann quasi als Schablone in der klinischen Diagnostik, bei der Qualitätskontrolle von 3D-in vitro Gewebekulturen und für die Bestimmung pharmakologischer und toxikologischer Substanzen dienen. Natürlich kann dabei der Abgleich des Referenzmusters mit dem erfassten Proteinnetzwerk vollautomatisch erfolgen, beispielsweise durch Hinterlegung einer Vielzahl von mit dem Verfahren hergestellten Referenzmustern in einer Datenbank, die mit dem neu rekonstruierten Proteinnetzwerk verglichen werden.In addition to the above-mentioned uses, it is possible for the first time to represent quantitatively and spatially correlated protein networks. As a result, reference patterns for protein networks can be created by the known method. These reference patterns can then be used as a template in clinical diagnostics, in the quality control of 3D in vitro tissue cultures and for the determination of pharmacological and toxicological substances. Of course, the comparison of the reference pattern with the detected protein network can be carried out fully automatically, for example by depositing a multiplicity of reference patterns produced by the method in a database, which are compared with the newly reconstructed protein network.

Es können aber auch ganz allgemein bekannte mathematische Verfahren dazu angewandt werden durch Interpretation aller Expressionsgradienten als quantitative Zeitserien von Werten die Netzwerke aus multiplen Zeitserien zu rekonstruieren. However, well-known mathematical methods can also be used to reconstruct the networks of multiple time series by interpreting all expression gradients as quantitative time series of values.

Anhand des folgenden Beispiels und der Zeichnungen wird das erfindungsgemäße Verfahren nachfolgend erläutert. An dieser Stelle sei darauf hingewiesen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf das nachfolgende Ausführungsbeispiel eingeschränkt ist.The method according to the invention will be explained below with reference to the following example and the drawings. It should be noted that the present invention is not limited to the following embodiment.

In den Zeichnungen zeigen die Figuren im Einzelnen:In the drawings, the figures show in detail:

1 Schema eine Doppelfärbung auf Gewebeschnitten mit gemeinsamer Strukturfärbung und verschiedenen Funktionsfärbungen; 1 Scheme a double staining on tissue sections with common staining and different functional staining;

2 Doppelfärbung auf Gewebeschnitten mit gemeinsamer Strukturfärbung C1 und verschiedenen Markerfärbung X1 bis X5; 2 Double staining on tissue sections with common structural staining C1 and different marker staining X1 to X5;

3 Dreifachfärbung auf Gewebeschnitten mit zweifacher gemeinsamer Strukturfärbung C1, C2 und verschiedenen Markerfärbung X1 bis X5; 3 Triple staining for tissue sections with dual common staining C1, C2 and different staining X1 to X5;

4 Schema eines vollautomatischen Verlauf für die Bestimmung von quantitativen Expressionsgradienten für eine große Anzahl von Schnitten; 4 Scheme of a fully automatic procedure for the determination of quantitative expression gradients for a large number of sections;

5 Schema der Registrierung von Schnittbildern einzelner Gewebeschnitte eines Gewebes; 5 Scheme of registration of sectional images of individual tissue sections of a tissue;

6 Schema der Bestimmung der räumlichen Korrelation der Gewebeschnitte aus 5 durch ein Gitternetz; 6 Scheme of determination of spatial correlation of tissue sections 5 through a grid;

7 Auswertung von Expressionsprofilen von 4 Markern als Gradienten; 7 Evaluation of expression profiles of 4 markers as gradients;

8 Expressionsprofile der vier Marker aus als Gradienten, 8th Expression profiles of the four markers as gradients,

9(a) quantitative Differenzierungsprofile von Strukturproteinen; 9 (a) quantitative differentiation profiles of structural proteins;

9(b) Schema der zeitlichen und räumlichen Übereinstimmung von Strukturproteinen der aus 9(a) errechneten quantitativen Differenzierungsprofile; 9 (b) Scheme of temporal and spatial agreement of structural proteins of the 9 (a) calculated quantitative differentiation profiles;

9(c)/(d) schematische Darstellung von Proteinnetzwerken; 9 (c) / (d) schematic representation of protein networks;

10 schematische Darstellung von Einsatzmöglichkeiten des Verfahrens und 10 schematic representation of possible uses of the method and

11 Konzepte zur Generierung der räumlichen Expressionsgradienten am Beispiel eines schematischen Schnittes durch eine Gewebeprobe der menschlichen Haut 11 Concepts for generating the spatial expression gradients using the example of a schematic section through a tissue sample of the human skin

Beispielexample

In einem ersten Schritt wird eine epidermale Gewebeprobe, beispielsweise eine kryokonservierte Gewebeprobe der menschlichen oder tierischen Haut, fixiert und es werden Serienschnitte angefertigt. Es ist allerdings nicht notwendig Serienschnitte zu verwenden. Alle Schnitte werden so gefärbt, dass ein oder mehrere morphologische Marker C_j (z. B. Collagen-IV, Laminin 1) die Segmentierung sowie die räumliche Zuordnung der Serienschnitte ermöglichen und ein oder mehrere andere Funktionsmarker X_i eine molekulare Eigenschaft des Gewebes anzeigen (z. B. einen Gewebedifferenzierungsmarker in Epithelien wie z. B. Keratin K1, Keratin K10, Keratin K14)). Der oder die konstanten Marker werden in allen Serienschnitten durch dieselbe Färbung erreicht. Als Färbetechniken können z. B. in situ hybridisierung (ISH), Antikörper (AK), Kernfärbungen oder eine Gegenfärbung eingesetzt werden.In a first step, an epidermal tissue sample, for example a cryopreserved tissue sample of the human or animal skin, is fixed and serial sections are produced. However, it is not necessary to use serial cuts. All sections are stained such that one or more morphological markers C _j (eg, collagen IV, laminin 1) allow for segmentation and spatial assignment of the serial sections, and one or more other function markers X _i indicate a molecular property of the tissue ( eg a tissue differentiation marker in epithelia such as keratin K1, keratin K10, keratin K14)). The constant marker or markers are achieved in all serial sections by the same staining. As dyeing techniques z. B. in situ hybridization (ISH), antibodies (AK), nuclear staining or counterstaining be used.

1 zeigt in einem Schema ein Beispiel einer Doppelfärbung jedes einzelnen Gewebeschnittes mit einer gemeinsamen Strukturfärbung und verschiedenen Funktionsfärbungen. Insgesamt werden in diesem Beispiel 6 verschiedene Biomarker räumlich aufgelöst. 1 shows in a diagram an example of a double staining of each individual tissue section with a common staining and different functional staining. Overall, 6 different biomarkers are spatially resolved in this example.

Alle Serienschnitte werden durch eine der beschriebenen Färbetechniken so eingefärbt, dass die auf allen Schnitten mit Cj gemeinsam enthaltenen morphologischen Merkmale eingefärbt werden. Die Biomarker X_i beschreiben in jedem einzelnen der Serienschnitte eine andere molekulare Eigenschaft des Gewebes. Alle Schnitte sind somit in mindestens zwei Farben eingefärbt. Es können aber auch mehrere morphologische oder mehrere Biofunktionsmarker pro einzelnen Serienschnitt angefärbt werden. All serial sections are stained by one of the described staining techniques so that the morphological features common to all sections are stained with Cj. The biomarkers X _i describe a different molecular property of the tissue in each of the serial sections. All cuts are thus dyed in at least two colors. However, it is also possible to stain several morphological or several biofunction markers per individual serial section.

2 zeigt eine Doppelfärbung von Gewebeschnitten eines Gewebes mit einer gemeinsamen Strukturfärbung C1 und verschiedenen Markerfärbung X1 bis X5. 2 shows a double staining of tissue sections of a tissue with a common staining C1 and different marker staining X1 to X5.

3 zeigt eine Dreifachfärbung von Gewebeschnitten eines Gewebes mit zwei gemeinsamen Strukturfärbungen C1 und C2, sowie einer in jedem Schnitt verschiedenen Markerfärbung X1–X5, die in unterschiedlichen Regionen des Gewebes zu erkennen sind. 3 shows a triple staining of tissue sections of a tissue with two common structural stains C1 and C2, as well as a different in each section marker staining X1-X5, which can be seen in different regions of the tissue.

Die Färbung der Schnitte kann durch Floureszenzfarbstoffe (z. B. Cy2, Cy3, Cy5) oder im sichtbaren Frequenzbereich (z. B. Haemotxylin, Eosin) emittierende Farbstoffe erfolgen.The staining of the sections can be carried out by fluorescent dyes (eg Cy2, Cy3, Cy5) or in the visible frequency range (eg haemotxylin, eosin) emitting dyes.

Nachfolgend werden Digitalfarbbilder der Schnitte durch eine CCD-Kamera so aufgenommen, dass die morphologischen Marker von den biofunktionalen Markern in verschiedenen Farbkanälen vorliegen. Hierzu kann ein spezieller Scanner oder ein Mikroskop eingesetzt werden. Eine automatische Transporteinrichtung des Scanners ermöglicht das automatische Verarbeiten einer großen Zahl von Serienschnitten und von Proben. Es ist möglich jeden Serienschnitt zunächst als Teilbild aufzunehmen und diese dann automatisch zu einem Gesamtbild vor der weiteren Bildverarbeitung zusammenzufügen. Das Färben und Aufnehmen der Digitalbilder kann in einem maschinellen Prozess automatisiert werden (Apparatus). Färbeautomaten und Scanner auf Basis von Objektträgern sind auf dem Forschungsmarkt erhältlich (Firmen: Leica, Zeiss, Olympus und Hamamatsu).Subsequently, digital color images of the slices are taken by a CCD camera so that the morphological markers from the biofunctional markers exist in different color channels. For this purpose, a special scanner or a microscope can be used. An automatic transport device of the scanner allows automatic processing of a large number of serial sections and samples. It is possible to first capture each series cut as a subpicture and then automatically combine them into a complete image before further image processing. The dyeing and recording of the digital images can be automated in a machine process (Apparatus). Staining machines and scanners based on microscope slides are available on the research market (companies: Leica, Zeiss, Olympus and Hamamatsu).

4 zeigt den vollautomatischen Verlauf für die Bestimmung von quantitativen Expressionsgradienten für eine große Anzahl von Schnitten. Die einzelnen Schritte können mit auf dem Markt erwerblichen Instrumenten durchgeführt werden. 4 shows the fully automatic course for the determination of quantitative expression gradients for a large number of sections. The individual steps can be carried out using instruments available on the market.

Mittels Bildverarbeitungssoftware werden die Schnittbilder dann gemäß der morphologischen Gewebemerkmale aufeinander registriert, d. h. sie werden so zueinander ausgerichtet, dass die morphologischen Gewebemerkmale, die allen Schnitten gemeinsam sind, sich möglichst gut überdecken. Die Registrierung über die morphologischen Merkmale richtet damit automatisch die biofunktionalen Marker zueinander aus.By means of image processing software, the sectional images are then registered with each other according to the morphological tissue characteristics, d. H. they are aligned with each other so that the morphological tissue features that are common to all sections cover as well as possible. The registration via the morphological features thus automatically aligns the biofunctional markers with each other.

In 5 ist die Registrierung der Schnittbilder aufgrund der gemeinsamen morphologischen Färbung C, aufeinander dargestellt. Dies kann, wie abgebildet, morphologische Deformationen, Rotationen und Skalierungen der Bilder notwendig machen.In 5 the registration of the sectional images due to the common morphological staining C is shown on top of each other. This may require morphological deformations, rotations, and scaling of the images, as shown.

Anschließend erfolgt die Bestimmung der räumlich korrelierten Biomarker.This is followed by the determination of spatially correlated biomarkers.

Für die oben beschriebene erste Lösung, die für die Analyse von Gewebeproben mit unregelmäßiger Struktur geeignet ist (z. B. im Anwendungsfall der Krebsdiagnostik kann die Gewebestruktur sehr verändert vorliegen) werden zunächst nach Registrierung der einzelnen Schnitte anhand morphologischer Gewebemerkmale geometrische Subregionen, die allen Schnitten gemeinsam sind, definiert.For the first solution described above, which is suitable for the analysis of tissue samples with an irregular structure (eg in the application of cancer diagnostics, the tissue structure can be very changed) are first registered after registration of individual sections on the basis of morphological tissue features geometric subregions, the all sections together are defined.

In 5 ist die Registrierung der Schnittbilder aufgrund der gemeinsamen morphologischen Färbung C_i aufeinander dargestellt. Dies kann, wie abgebildet, morphologische Deformationen, Rotationen und Skalierungen der Bilder notwendig machen.In 5 the registration of the sectional images due to the common morphological staining C _{i is shown} on top of each other. This may require morphological deformations, rotations, and scaling of the images, as shown.

Vorliegend wird ein einfaches Gitternetz über alle Schnitte gelegt, so dass das Gitter dieselben Geweberegionen auf allen Schnitten eindeutig beschreiben kann. Es wird dann ein mittlerer Wert der Färbung mit B in allen Geweberegionen bestimmt. Die mittlere Färbung in der Geweberegion auf einem Schnitt j entspricht dann der mittleren Expression des Biomarkers j in dieser Geweberegion. Der Vergleich aller Geweberegionen in allen Serienschnitten (also allen Biomarkern) ergibt ein räumliches Profil der korrelierten Biomarker. Es können dann durch einfaches Auszählen die häufigen korrelierten und anti-korrelierten Biomarker identifiziert werden.In the present case, a simple grid is placed over all sections, so that the grid can clearly describe the same tissue regions on all sections. An average value of staining with B in all tissue regions is then determined. The mean staining in the tissue region on a section j then corresponds to the mean expression of the biomarker j in this tissue region. The comparison of all tissue regions in all serial sections (ie all biomarkers) results in a spatial profile of the correlated biomarkers. By simply counting out, the frequent correlated and anti-correlated biomarkers can then be identified.

In 6 ist die Bestimmung der räumlichen Korrelation durch ein Gitternetz auf den registrierten, gefärbten Gewebeschnitten dargestellt. Für das Feld mit den Koordinaten (7,2) wird die durchschnittliche Genexpression für jeden Marker bestimmt. Es ergibt sich ein beispielhaftes qualitatives Profil von (X1, X2, X3, X4) (An, Aus, An, Aus), wobei vereinfacht an = Marker wird exprimiert, aus = Marker wird nicht exprimiert bedeutet.In 6 the determination of the spatial correlation through a grid on the registered stained tissue sections is shown. For the field with the coordinates (7,2) the average Gene expression determined for each marker. The result is an exemplary qualitative profile of (X1, X2, X3, X4) (on, off, on, off), where simplified an = marker is expressed, off = marker is not expressed means.

Die oben beschriebene zweite Lösung ist für die Analyse von Gewebeproben mit einer relativ konstanten Struktur geeignet (z. B. im Anwendungsfall einer Gewebekultur, beispielsweise einer 3D-in vitro Gewebekultur).The second solution described above is suitable for the analysis of tissue samples having a relatively constant structure (eg, in the case of tissue culture, for example, a 3D in vitro tissue culture).

7 zeigt schematisch die beispielhafte Auswertung der Expressionsprofile von 4 Markern als Gradienten. Beispielhaft sind einige auszuwertende Gradienten angegeben. In einer Realisierung werden alle möglichen Gradienten analog der beispielhaften Gradienten horizontal über jeden Gewebeschnitt ausgewertet und gemittelt. 7 schematically shows the exemplary evaluation of the expression profiles of 4 markers as gradients. By way of example, some gradients to be evaluated are indicated. In one implementation, all possible gradients are evaluated and averaged horizontally over each tissue section analogously to the exemplary gradients.

Der mittlere Gradient gibt die mittlere Expression des Biomarkers über die Gewebetiefe angibt.The mean gradient indicates the mean expression of the biomarker across the tissue depth indicates.

Die Übereinanderlagerung der Gradienten aller Biomarker aus allen Serienschnitten in allen Abschnitten ergibt, wie in 8 dargestellt, die räumlich korrelierten Biomarker, wobei die Expressionsprofile der vier Marker aus als Gradienten in die drei schematischen Bereiche „Bottom”, „Mid” und „Top” zusammengefasst werden. Die beispielhafte qualitative Auswertung der Co-Expression in den schematischen Regionen Bottom, Mid, Up ergibt, wie nachfolgend tabellarisch dargestellt (Tabelle 1), die Co-Expressionen der Marker X1, X2, X3 und X4 in den Bereichen.The superposition of the gradients of all biomarkers from all serial sections in all sections yields, as in 8th presented the spatially correlated biomarkers, with the expression profiles of the four markers are summarized as gradients in the three schematic areas "bottom", "mid" and "top". The exemplary qualitative evaluation of the co-expression in the schematic regions Bottom, Mid, Up gives, as tabulated below (Table 1), the coexpressions of the markers X1, X2, X3 and X4 in the areas.

Die Auswertung kann auch analog quantitativ erfolgen und ist hier aber nur aus Verständnisgründen qualitativ dargestellt. Im quantitativen Fall könnten die Korrelationen zum Beispiel über die bekannte Pearson-Korrelation ermittelt werden. Tabelle 1 Bottom Mid Top X1 No No Yes X2 Yes No No X3 No Yes No X4 Yes No Yes The evaluation can also be carried out quantitatively analogously and is shown here qualitatively only for reasons of understanding. In the quantitative case, the correlations could be determined, for example, via the known Pearson correlation. Table 1 bottom Mid Top X1 No No Yes X2 Yes No No X3 No Yes No X4 Yes No Yes

Als logische Ausdrücke formuliert: Bottom: not(X1) and X2 and not(X3) and X4 Mid: not(X1) and not(X2) and X3 and not(X4) Top: X1 and not(X2) and not(x3) and X4 Formulated as logical expressions: bottom: not (X1) and X2 and not (X3) and X4 Mid: not (X1) and not (X2) and X3 and not (X4) Top: X1 and not (X2) and not (x3) and X4

Die Häufigkeit bestimmter regionaler Kombinationen kann über Algorithmen wie den apriori-Algorithmus (Agrawal et al. 1997) bestimmt werden. In diesem Fall werden nicht alle Gradienten aus gemittelt, sondern es werden mehrere verschiedene Profile über jeden einzelnen Gewebeschnitt ausgewertet. Im Beispiel von könnte z. B. für jeden Bereich zwischen zwei beispielhaften Gradienten ein Profil erstellt werden (regionale Profile). Eine Zählung der Häufigkeiten in den regionalen Profilen kann dann häufige und nicht häufige Korrelationen und Anti-Korrelationen von Biomarkern aufdecken.The frequency of certain regional combinations can be determined by algorithms such as the apriori algorithm (Agrawal et al., 1997). In this case, not all gradients will go out averaged, but several different profiles are evaluated on each individual tissue section. In the example of could z. For example, a profile can be created for each area between two exemplary gradients (regional profiles). A count of frequencies in regional profiles can then reveal frequent and infrequent correlations and anti-correlations of biomarkers.

Die in illustrierte schematische Kartierung des Epithels in drei Bereiche anhand dreier Biomarker ermöglicht mittels des beanspruchten Verfahrens insbesondere für organotypische in-vitro Kulturen die Kartierung mit einer nahezu unbegrenzten Zahl an Biomarkern.In the illustrated schematic mapping of the epithelium in three areas based on three biomarkers allows by means of the claimed method, in particular for organotypic in vitro cultures, the mapping with a virtually unlimited number of biomarkers.

Dabei beschreibt die ermittelte Kartierung von Biomarkern den biologischen Funktionszustand einer Gewebeprobe. Der Vergleich dieser Kartierungen zwischen zum Beispiel normalem und beeinflusstem Gewebe erlaubt somit eine Diagnose oder Prognose für einen Patienten oder die Wirkung einer pharmakologischen oder toxikologischen Substanz kann bestimmt werden.The determined mapping of biomarkers describes the biological functional state of a tissue sample. The comparison of these maps between, for example, normal and affected tissue thus allows a diagnosis or prognosis for a patient, or the effect of a pharmacological or toxicological substance can be determined.

9 zeigt in (c) und (d) Muster von Proteinnetzwerken, die aus quantitativen Multi-Marker-Expressionsprofilen mittels des beanspruchten Verfahrens hergestellt wurden. 9 shows in (c) and (d) patterns of protein networks prepared from quantitative multi-marker expression profiles by the claimed method.

Beispielhaft wurden mit dem entwickelten Verfahren die kombinatorische Expression von den fünf Strukturproteinen Desmoplakin (Dp), Filaggrin (Fil), Integrin-α₆ß₄ (Int), Involucrin (Inv) und Keratin 1/10 (K1/10) untersucht, die charakteristisch für die üblicherweise beschriebenen Differenzierungsstufen sind. Für die Analyse wurden epidermale Gewebeproben, Epidermis 1, Epidermis 2 und Epidermis 3 (aus drei humanen Individuen) gewählt. In dem in 9(a) dargestellten Multi-Marker-Profil handelt es sich je Marker um ein gemitteltes Expressionsprofil aus mehreren Bild datensätzen jeweils derselben Gewebeprobe. Die Erstellung der Expressionsprofile kann dabei grundsätzlich über den distanzbasierten Ansatz, das heißt über die normierte Distanz zum Bindegewebe (mit d = 0% direkt am Bindegewebe und d = 100% an der Oberfläche), da sich differenzierende Zellen in Richtung Oberfläche bewegen. Es sind aber auch andere Ansätze denkbar.For example, the combinatorial expression of the five structural proteins Desmoplakin (Dp), filaggrin were with the developed method (Fil), integrin α ₆ beta ₄ (Int), involucrin (Inv) and keratin 1/10 (K1 / 10) examined the characteristic of the differentiation stages usually described. For analysis, epidermal tissue samples, epidermis 1, epidermis 2 and epidermis 3 (from three human individuals) were selected. In the in 9 (a) shown multi-marker profile is per marker to an average expression profile of several image sets each of the same tissue sample. The creation of the expression profiles can basically by the distance-based approach, that is on the normalized distance to the connective tissue (with d = 0% directly to the connective tissue and d = 100% at the surface), as differentiating cells move towards the surface. But there are also other approaches conceivable.

Im vorliegenden Fall erfolgte die Erstellung der Expressionsprofile über den distanzbasierten Ansatz, wozu zur Beschreibung dieses Ansatzes auf die 11 und die Figurenbeschreibung verwiesen wird.In the present case, the expression profiles were compiled using the distance - based approach, for which purpose the description of this approach was based on the 11 and the description of the figures is referenced.

Aus den Expressionsprofilen der Epidermis 1 bis 3 werden Korrelationen zwischen den fünf Strukturproteinen Desmoplakin (Dp), Filaggrin (Fil), Integrin-α₆β₄ (Int), Involucrin (Inv) und Keratin 1/10 (K1/10) als Netzwerkmuster (Referenzmuster) in (c) und (d) dargestellt, indem aufsteigende und absteigende Flanken für die Strukturproteine über die Distanz der Differenzierung korreliert werden. Die daraus resultierenden Proteinnetzwerke sind in der dargestellten Ausprägung charakteristisch für das humane epidermale Gewebe; das ergibt ein Vergleich der Proteinnetzwerke (c) Epidermis 1 bis 3 und der Proteinnetzwerke (d) Epidermis 1 bis 3.From the expression profiles of epidermis 1 to 3, correlations between the five structural proteins desmoplakin (Dp), filaggrin (Fil), integrin α ₆ β ₄ (Int), involucrin (Inv), and keratin 1/10 (K1 / 10) are network patterns (Reference pattern) in (c) and (d) by correlating ascending and descending flanks for the structural proteins over the distance of differentiation. The resulting protein networks are characteristic of the human epidermal tissue in the form shown; this results in a comparison of the protein networks (c) epidermis 1 to 3 and the protein networks (d) epidermis 1 to 3.

Mit Hilfe des hier beanspruchten Verfahrens konnten daher zum ersten Mal Proteinnetzwerke aus den ermittelten quantitativen Expressionsgradienten rekonstruiert werden, die sich als Referenzmuster für die klinische Diagnostik und bei der Untersuchung von toxikologischen und pharmakologischen Substanzen eignen.With the aid of the method claimed here, it was therefore possible for the first time to reconstruct protein networks from the quantitative expression gradients determined, which are suitable as reference patterns for clinical diagnostics and in the investigation of toxicological and pharmacological substances.

Dabei ist das beanspruchte Verfahren und ein unter Verwendung dieses Verfahrens zur Verfügung gestelltes Testsystem, wie die 10 zeigt, prinzipiell für verschiedene Einsatzmöglichkeiten konzipiert, nämlich A) für den Vergleich von Geweben, wobei die verwendeten Biomarker und Modulatoren bekannt und für die zu untersuchenden und zu vergleichenden Gewebe gleich sind; B) für den Vergleich von Biomarkern, wobei die Gewebe und die Modulatoren gleich sind, also aus einem Kandidatenpool von Biomarkern diejenigen zu selektieren, um die qualitativ besten Marker von nicht so hochwertigen Markern zu reduzieren und C) für den Vergleich von Modulatoren, das heißt, für den Vergleich von Substanzen und Behandlungen, wobei die Modulatoren unbekannt und die Gewebe sowie die Biomarker gegeben sind.Therein, the claimed method and a test system provided using this method, such as the 10 shows, in principle, designed for various uses, namely A) for the comparison of tissues, the biomarkers and modulators used are known and the same for the tissues to be examined and compared; B) for the comparison of biomarkers, wherein the tissues and the modulators are the same, ie to select those from a candidate pool of biomarkers those to reduce the best quality markers of not so high quality markers and C) for the comparison of modulators, that is , for the comparison of substances and treatments, where the modulators are unknown and the tissues and biomarkers are given.

11 zeigt in a und b zentrale Konzepte zur Generierung der räumlichen Expressionsgradienten am Beispiel eines schematischen Schnittes durch eine Gewebeprobe der menschlichen Haut. 11a zeigt die schematische Darstellung des Gewebeschnittes mit einzelnen Gewebeschichten. Dabei sind I: das mikroskopierte Gewebebild, B: Stratum Corneum, D: das dichte Band der untersten Epithelschicht aus basalen Epidermis-Zellen (Keratinozyten), CT: Bindegewebe (Connective Tissue), L: Basallamina als Grenze zwischen Epithel E und Bindegewebe CT, und X als erweiterte Zone von L zum Bindegewebe ausgerichtet. 11b zeigt den Querschnitt aus 11a ohne detaillierte Darstellung der einzelnen Gewebeschichten. Während des Differenzierungsprozesses migrieren die Zellen von unten nach oben im Epithel E auf einem gedachten Gradienten von 0–100%. Dabei kann die relative Position einer jeden Zelle durch eine normalisierte Distanz d = d_AbsD/(d_AbsU + d_AbsD) errechnet werden, wobei d_AbsU die absolute Distanz einer Zelle im Epithel zum Stratum Corneum ist und d_AbsD die absolute Distanze einer Zelle zum Bindegewebe CT ist. Für jede Position im Gewebe enstpricht d_AbsD + d_AbsU 100% der Wegstrecke auf dem Gradienten. 11 shows in a and b central concepts for generating the spatial expression gradients on the example of a schematic section through a tissue sample of the human skin. 11a shows the schematic representation of the tissue section with individual tissue layers. Where I: the microscopic tissue image, B: stratum corneum, D: the dense band of the lowest epithelial layer of basal epidermis cells (keratinocytes), CT: connective tissue (Connective Tissue), L: basal lamina as the boundary between epithelium E and connective tissue CT, and X is aligned as an extended zone of L to connective tissue. 11b shows the cross-section from FIG. 11a without a detailed representation of the individual fabric layers. During the differentiation process, the cells migrate from bottom to top in the epithelium E on an imaginary gradient of 0-100%. The relative position of each cell can be calculated by a normalized distance d = d _AbsD / (d _AbsU + d _AbsD ), where d _{AbsU is} the absolute distance of a cell in the epithelium to the stratum corneum and d _{AbsD is} the absolute distance of a cell Connective tissue CT is. For each position in the tissue, d _AbsD + d _{AbsU corresponds to} 100% of the distance on the gradient.

Claims (32)

Verfahren zur Erstellung von Proteinprofilen und zur Erfassung von Expressionsmustern einer Zelle in einem vom Menschen oder Tier stammenden Gewebe mittels Bildverarbeitung, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Proteinprofile und die Expressionsmuster entlang eines Differenzierungsprozesses der Zelle in dem Gewebe räumlich und/oder quantitativ erfassen lassen, wobei das Gewebe eine mittels mindestens einem Struktur- und mindestens einem Funktionsmarker markierte Gewebeprobe ist, die getrennt voneinander in mindestens zwei zueinander parallel stehenden und anhand des mindestens einen Strukturmarkers markierten Bereichen des Gewebe zueinander ausrichtbaren Schnittebenen betrachtet und ausgemessen wird, wobei in jeder Schnittebene ein von den oder der anderen Schnittebene unterschiedlicher Funktionsmarker gemessen wird.Method for producing protein profiles and for detecting expression patterns of a cell in a tissue originating from humans or animals by means of image processing, characterized in that the protein profiles and the expression patterns can be detected spatially and / or quantitatively along a differentiation process of the cell in the tissue the tissue is a tissue sample marked by means of at least one structural marker and at least one functional marker, which is viewed and measured separately from one another in at least two mutually parallel and marked by the at least one structural marker areas of the tissue alignable sections planes, wherein in each sectional plane one of the or the other cutting plane of different function markers is measured. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Strukturmarker morphologische Marker verwendet werden.A method according to claim 1, characterized in that are used as structural markers morphological markers. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als morphologische Marker im Gewebe stabil exprimierte Proteine verwendet werden. A method according to claim 2, characterized in that are used as morphological markers in the tissue stably expressed proteins. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die stabil exprimierten Proteine Zellverbindungsproteine, Integrine und/oder Proteine des Zellcytoskelettes sind.A method according to claim 3, characterized in that the stably expressed proteins are cell connection proteins, integrins and / or proteins of the cell cytoskeleton. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Funktionsmarker Biomarker verwendet werden.Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that biomarkers are used as function markers. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Biomarker Krebsbiomarker verwendet werden.Method according to claim 5, characterized in that cancer biomarkers are used as biomarkers. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Biomarker Marker der epithelialen Homöostase verwendet werden.A method according to claim 6, characterized in that are used as biomarkers markers of epithelial homeostasis. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die parallelen Schnittebenen aus einem in mindestens zwei zueinander parallel geführte Gewebeschnitte geschnittenen Gewebe resultieren.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the parallel cutting planes resulting from a cut into at least two mutually parallel guided tissue sections tissue. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass für die zueinander parallel geführten Gewebeschnitte aus einem Gewebe angefertigte Serienschnitte verwendet werden.A method according to claim 8, characterized in that for the mutually parallel tissue sections produced from a tissue serial sections are used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur- und/oder Biomarker durch colorimetrische und/oder durch Fluoreszenzfarbstoffe gefärbt werden.Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that the structural and / or biomarkers are colored by colorimetric and / or by fluorescent dyes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass organische Farbstoffe und/oder an nanokristalline Strukturen gebundene Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden.Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that organic dyes and / or bound to nanocrystalline structures fluorescent dyes are used. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeschnitte mittels digitaler Bildverarbeitungstechnik als Digitalbilder aufgenommen werden, wobei die morphologischen Marker und die Biomarker in verschiedenen Farbkanälen vorliegen.Method according to one of claims 8 to 11, characterized in that the tissue sections are recorded by means of digital image processing technology as digital images, wherein the morphological markers and the biomarkers are present in different color channels. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die digitale Bildverarbeitungstechnik ein mikroskopischer Scanner für Gewebeschnitte oder Mikroskop mit CCD-Technik ist.A method according to claim 12, characterized in that the digital image processing technique is a microscopic scanner for tissue sections or microscope with CCD technology. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet dass die Expressionsmuster als quantitative Expressionsgradienten entlang einer fiktiven Bewegungstrajektorie der Zelle dargestellt werden, wobei entlang von bestimmten Bewegungstrajektorien der Zelle mindestens ein quantitativer Expressionsgradient jeweils eines Biomarkers bestimmt wird.Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that the expression patterns are represented as quantitative expression gradients along a fictitious movement trajectory of the cell, along at least one quantitative expression gradient of a respective biomarker is determined along certain movement trajectories of the cell. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass durch Übereinanderlagerung verschiedener quantitativer Expressionsgradienten für verschiedene Biomarker der mindestens zwei Biomarker in den mindestens zwei zueinander parallel stehenden und anhand des mindestens einen Strukturmarkers ausrichtbaren Schnittebenen eine räumliche und/oder funktionelle Korrelation der mindestens zwei Biomarker ermittelt wird.A method according to claim 14, characterized in that a spatial and / or functional correlation of the at least two biomarkers is determined by superimposing different quantitative expression gradients for different biomarkers of the at least two biomarkers in the at least two mutually parallel and alignable using the at least one structure marker cutting planes. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass für die Schnittebenen getrennt voneinander der oder die quantitativen Expressionsgradienten in einem ersten Schritte gemessen und errechnet werden und in einem zweiten Schritt die errechneten quantitativen Expressionsgradienten zweier zueinander parallel stehender Schnittebenen durch Ausrichten der Schnittebenen zueinander mittels mindestens einem, den Schnittebenen gemeinsamen Strukturmarker übereinander gelagert werden.A method according to claim 14 or 15, characterized in that for the cutting planes separately or the quantitative expression gradients are measured and calculated in a first step and in a second step, the calculated quantitative expression gradients of two parallel cutting planes by aligning the cutting planes to each other by means of at least one, the sectional planes common structure markers are stored one above the other. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet dass durch Ermittlung der räumlichen und/oder funktionellen Korrelation der mindestens zwei Biomarker und Übereinanderlagerung der für die verschiedenen Biomarker berechneten Gradienten, die Art und/oder der biologische Funktionszustand des Gewebes bestimmt wird.A method according to claim 15 or 16, characterized in that by determining the spatial and / or functional correlation of the at least two biomarkers and superimposition of the calculated for the different biomarkers gradient, the type and / or biological condition of the tissue is determined. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass durch Bestimmung des quantitativen Expressionsgradienten und der Beschreibung der räumlichen und/oder funktionellen Korrelation der Biomarker zueinander ein Proteinnetzwerk des Gewebes rekonstruierbar ist.Method according to one of claims 13 to 17, characterized in that by determining the quantitative expression gradient and the description of the spatial and / or functional correlation of the biomarker to each other a protein network of the tissue is reconstructed. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die rekonstruierten Netzwerke zu größeren Strukturen zusammengelegt werden. A method according to claim 18, characterized in that the reconstructed networks are merged into larger structures. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Digitalisieren der gefärbten Gewebeproben, die Ermittlung des quantitativen Expressionsgradienten, die räumliche und/oder funktionelle Korrelation der Proteine und die Rekonstruktion des Proteinnetzwerkes des Gewebes vollautomatisch durchgeführt werden.Method according to one of claims 12 to 19, characterized in that the digitizing of the stained tissue samples, the determination of the quantitative expression gradient, the spatial and / or functional correlation of the proteins and the reconstruction of the protein network of the tissue are carried out fully automatically. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die vollautomatisch erstellten Proteinnetzwerke als standardisierte Muster dargestellt werden, die als Referenzmuster für die Bestimmung von Geweben, für die klinische Diagnostik und für pharmakologische und toxikologische Untersuchungen in Geweben verwendet werden.A method according to claim 20, characterized in that the fully automatically created protein networks are represented as standardized patterns that are used as reference patterns for the determination of tissues, for clinical diagnostics and for pharmacological and toxicological studies in tissues. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für die klinische Diagnostik von Gewebeproben.Use of the method according to one of claims 1 to 21 for the clinical diagnosis of tissue samples. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für toxikologische Untersuchungen in Geweben.Use of the method according to one of claims 1 to 21 for toxicological examinations in tissues. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 23 für toxikologische Tests von Substanzen auf Irritation, Genotoxizität und/oder Kanzerogenität unter Verwendung von Krebsbiomarkern.Use of the method according to claim 23 for toxicological tests of substances for irritation, genotoxicity and / or carcinogenicity using cancer biomarkers. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 23 oder 24, als Testverfahren zur Bestimmung von Effektivität oder Toxizität einer toxikologischen Substanz oder Behandlungsform.Use of the method according to claim 23 or 24, as a test method for determining the effectiveness or toxicity of a toxicological substance or treatment form. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, das die Effektivität und Toxizität der toxikologischen Substanz in einem gemeinsamen Test quantitativ untersucht wird.Use of the method according to claim 25, characterized in that the effectiveness and toxicity of the toxicological substance are quantitatively investigated in a joint test. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für eine Qualitätskontrolle bei der Produktion von 3D-in vitro Gewebekulturen.Use of the method according to any one of claims 1 to 21 for quality control in the production of 3D in vitro tissue cultures. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für pharmakologische Untersuchungen in Geweben.Use of the method according to one of claims 1 to 21 for pharmacological investigations in tissues. Verfahren und Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung eines digitalen mikroskopischen Scanners gemäß Anspruch 13 die Farbstoffe für die Marker mit einem Prisma im Scanner abgestimmt werden, welches die Farben trennt, wobei das Prisma mit den Farbstoffen so abgestimmt ist, dass nach Farbkanälen getrennte digitale Bilder aus einer Schnittebene des Gewebes erzeugt werden.Method and use of the method according to one of claims 1 to 28, characterized in that when using a digital microscopic scanner according to claim 13, the dyes for the markers are matched with a prism in the scanner, which separates the colors, the prism with the dyes is tuned so that after color channels separate digital images are generated from a cutting plane of the tissue. Verfahren und Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Prisma ein kontinuierliches Prisma ist, welches die Farbstoffe für die Marker in wenigstens zwei Farbkanälen in einem digitalen Bild aus einer Schnittebene des Gewebes spektral auftrennt.Method and use according to claim 29, characterized in that the prism is a continuous prism which spectrally separates the dyes for the markers in at least two color channels in a digital image from a sectional plane of the tissue. Referenzmuster für Proteinnetzwerke für die klinische Diagnostik und/oder die Bestimmung der Art einer Gewebeprobe und/oder für die Bestimmung von toxikologischen oder pharmakologischen Substanzen in einem Gewebe, wobei die Referenzmuster nach dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 30 herstellbar sind.Reference pattern for protein networks for clinical diagnosis and / or determination of the nature of a tissue sample and / or for the determination of toxicological or pharmacological substances in a tissue, wherein the reference pattern can be produced by the method of claims 1 to 30. Automatisiertes Testsystem unter Verwendung des Verfahrens nach einem der vorangegangenen Ansprüche für pharmakologische und/oder toxikologische Untersuchungen an 3D.Automated test system using the method according to one of the preceding claims for pharmacological and / or toxicological investigations on 3D.

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