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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskop mit einem eine Probe entlang
eines Mikroskopstrahlenganges abbildenden Objektiv und einer Autofokusvorrichtung,
welche über
einen Strahlteiler in den Mikroskopstrahlengang eingespiegelt ist.
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Um
mittels einer Abbildungsoptik präzise
Abbildungen einer Probe bzw. eines Probenschnitts zu erhalten, ist
es erforderlich, die Probe exakt in die Fokusposition des Objektivs
zu stellen. Ist die Abbildung unscharf, ist es wichtig zu erfahren,
um welchen Betrag und in welcher Richtung eine Lageveränderung der
Probe relativ zur Abbildungsoptik bzw. zum Objektiv zu veranlassen
ist und gegebenenfalls entsprechende Stellbefehle abzuleiten, die
zu einer Nachfokussierung genutzt werden können. In diesem Zusammenhang
sind im wesentlichen Triangulationsverfahren, abbildende Verfahren
mit Kontrastauswertung und die Positionsbestimmung mittels schräg gestellter
konfokaler Spaltblende bekannt. Bei Triangulationsverfahren wird
ein kollimierter Laserstrahl in die Pupillenebene eines Objektives
eingespiegelt und aus dem Verlauf dieses Laserstrahls relativ zum Abbildungsstrahlengang
auf die z-Position des von der Probe reflektierten Laserlichts geschlossen.
Bei der Abbildung des Laserlichts in unterschiedlich tief gelegene
Ebenen der Probe treten jedoch Bildfehler auf, so daß die Autofokusgüte über einen
gegebenen Tiefenschärfebereich
stark variiert. Auch sind Schwankungen dahingehend festzustellen,
ob das Meßergebnis
vom Zentrum oder am Rand der Probe bzw. des verwendeten Detektors
ermittelt wird. Üblicherweise
wird ein Triangulationsverfahren deshalb iterativ ausgeführt, was
verhältnismäßig zeitraubend ist.
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Bei
abbildenden Verfahren mit Kontrastauswertung wird die Probe mit
einer bestimmten Intensitätsverteilung
beleuchtet, meist indem in eine Feldblendenebene eines Beleuchtungsstrahlengangs
ein Gitter gestellt wird. Man nimmt eine Serie von Bildern mit unterschiedlichen
Abständen
zwischen Abbildungsoptik und Probe auf und ermittelt in dieser Serie
das Bild mit dem höchsten
Kontrast, dem dann der optimale Fokusabstand zugeordnet ist. Nachteilig hieran
ist, daß zur
Aufnahme der Bildserie verschiedene z-Positionen mit hoher Genauigkeit
angefahren werden müssen,
was wiederum zeitraubend ist. Beispiele für eine Autofokuseinrichtung
mittels Kontrastanalyse eines auf eine Probe projizierten Musters
finden sich in der
US 5604344 oder
der
US 6545756 .
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Bei
der Positionsbestimmung mittels schräg gestellter konfokaler Spaltblende
wird in eine Feldblendenebene des Beleuchtungsstrahlengangs eine Spaltblende
gestellt und auf die Probe abgebildet. Das von der Probe reflektierte
Licht wird auf eine relativ zur Spaltblende geneigt angeordnete
CCD-Zeile gerichtet und es wird die Position auf der CCD-Zeile bestimmt,
an dem das reflektierte Licht ein Maximum hat. Dieses Verfahren
ist sehr schnell, hat allerdings Probleme mit Verunreinigungen auf
der Probe oder Probenoberfläche,
die zu Intensitätsschwankungen führen können. Auch
ist ein sehr großer
Justieraufwand bei der Abbildung des Spaltes auf die CCD-Zeile aufzubringen,
denn der Spalt muß,
um eine hohe Genauigkeit erreichen zu können, sehr schmal sein. Eine
Verbesserung der Positionsbestimmung mittels schräggstellter
konfokaler Spaltblende ist in der
DE 103 19 182 A1 geschildert.
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Allen
Verfahren ist gemein, daß sie
die Fokusebene zwar sehr genau finden können, jedoch die Lage dieser
Fokusebene innerhalb der Probe, insbesondere bezüglich weiterer Grenzflächen, nur
eingeschränkt
zu ermitteln erlauben.
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Oftmals
möchte
man jedoch nicht nur die Meßebene
exakt finden, sondern auch deren Lage, d. h. deren Abstand zu einer
Referenzebene ermitteln. Ein Bezug auf eine als Referenzebene dienende Grenzfläche kann
dabei im Stand der Technik entweder dadurch erfolgen, daß eine zweite
Autofokuseinrichtung verwendet wird, die auf die Grenzfläche fokussiert
wird. Das erhöht
natürlich
den optischen Aufwand, und meist muß man einen Bereich der Detektions-
bzw. Beleuchtungsapertur für
diesen zusätzlichen
Autofokus reservieren. Mehrere Autofokusstrahlengänge zu verwenden,
ist beispielsweise in der WO 00/43820 beschrieben. Zum anderen ist
es im Stand der Technik bekannt, für kurze Zeit die Messung zu
unterbrechen und durch eine Fokusverstellung die Autofokuseinrichtung
auf die gewünschte Referenzebene
einzustellen. Der Betrag der Fokusverstellung stellt dann ein Maß für den Abstand
der Meßebene
zur Referenzebene dar. Nachteilig ist dabei, daß die eigentliche mikroskopische
Messung für die
Bestimmung des Abstandes zur Referenzebene unterbrochen werden muß.
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Die
gleiche Problemstellung ergibt sich, wenn in einer Probe ein Objekt,
das an unterschiedlichen z-Positionen liegen kann, gefunden oder
verfolgt werden soll. Ein solches Objekt kann z. B. eine in einer
Probe befindliche Zelle sein, die sich in der Probe (z. B. in einer
flüssigen
Lösung)
bewegt.
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Der
Erfindung liegt also die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop mit einer
Autofokusvorrichtung anzugeben, mit der nicht nur die Lage der Meßebene exakt
bestimmt werden kann, sondern zugleich auch der Abstand zu einer
Referenzebene erfaßbar
oder ein Objektracking oder -finder möglich ist. Insbesondere sollte
eine separate Autofokusvorrichtung, die nur zur Bestimmung der Referenzebene
vorgesehen ist, und/oder ein wiederholtes Verstellen der Fokuslage
in z-Richtung vermieden werden.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch ein Mikroskop mit einem eine Probe entlang eines Mikroskopstrahlenganges
abbildenden Objektiv und einer Autofokuseinrichtung, die einen Autofokusstrahlengang aufweist,
welcher über
einen Strahlteiler in den Mikroskopstrahlengang in Probenabbildungsrichtung an
einer Stelle nach dem Objektiv eingekoppelt ist, einen Lichtmodulator
zur Erzeugung eines zweidimensionalen, intensitätsmodulierten Modulationsobjektes
aufweist, das im Autofokusstrahlengang in einer zur Fokusebene des
Objektives konjugierten Ebene liegt oder diese schneidet und in
die Fokusebene des Objektives abgebildet ist, und eine Kamera zur
Aufnahme eines zweidimensionalen Bildes aufweist, auf die das in
der Probe liegende Bild des Modulationsobjektes abgebildet ist,
wobei die Bildebene der Kamera eine zum Modulationsobjekt konjugierte Ebene
schneidet oder in dieser Ebene liegt und die Kamera den Kontrast
des in der Probe liegenden Bildes des Modulationsobjekt erfaßt, wobei
das Modulationsobjekt und/oder die Bildebene der Kamera schräg zur optischen
Achse des Autofokusstrahlenganges liegen/liegt.
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Die
Erfindung sieht also vor, daß ein
zweidimensionales Modulationsobjekt, z. B. durch Beleuchtung eines
entsprechenden Lichtmodulators (Gitter, LCD oder DMD) erzeugt und
in den Mikroskopstrahlengang, z. B. den Beleuchtungsstrahlengang,
eingespiegelt wird, um eine strukturierte Autofokus-Beleuchtung
der Probe zu erreichen. Die strukturierte Beleuchtung erfolgt dabei über eine
separate Lichtquelle, die von der Beleuchtungsquelle unabhängig ist,
vorzugsweise über
LED. Natürlich
sind beliebige Weißlicht-
oder farbige Beleuchtungsquellen möglich. Zusätzlich wird an einer Stelle
eine zweidimensionale Kamera (z. B. CCD oder CMOS) in den Strahlengang
eingefügt.
Verschiedene Orte sind hier möglich.
Entweder die Kamera oder das Modulationsobjekt liegt schräg zur optischen
Achse. Auch beide können
schräg
zur optischen Achse liegen. Dadurch kann eine Dimension der Kamera
einem gewissen Tiefenbereich und somit verschiedenen Fokusebenen
zugeordnet werden. Über
die Wahl der Schräglage
kann der erfaßte
Tiefenbereich eingestellt werden. Ziel ist es, die Lage einer rückstreuenden
oder reflektierenden (d.h. spiegelnden) Grenzflächean, in oder bei der Probe
und/oder die Lage einer Probe mit Eigenkontrast zu bestimmen.
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Das
Modulationsobjekt wird räumlich
moduliert und kann bei Verwendung eines verstellbaren Lichtmodulators
auch zusätzlich
zeitlich moduliert werden. Eine zeitliche Modulation kann man dazu verwenden,
die Beleuchtung durch das Modulationsobjekt von der übrigen Mikroskopbeleuchtung
zu unterscheiden. Hierbei kann eine Lock-In-Technik zum Einsatz
kommen. Eine zeitliche Modulation erfolgt vorzugsweise mit so hoher
Frequenz, daß sie
bei visueller Beobachtung im Mikroskop, z. B. durch ein Mikroskopokular
nicht wahrnehmbar ist. Ein möglicher
Frequenzbereich liegt oberhalb der Bildverschmelzungsfrequenz des
Auges, die im helladaptierten Zustand etwa 50 Hz beträgt, beispielsweise zwischen
50 und 200 Hz sind ein möglicher
Bereich.
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Die
Ein- und Auskopplung der strukturierten Beleuchtung sowie der Abbildung
der strukturiert beleuchteten Probe auf die Kamera kann vorteilhafterweise
mit Teilerspiegeln erfolgen, die nur einen geringen Einfluß auf den übrigen Mikroskopstrahlengang haben,
z. B. durch einen hohen Transmissionsgrad (ca. 95% und höher sind
möglich).
Weiter ist es günstig,
sie einseitig zu entspiegeln, um den übrigen Mikroskopstrahlengang
möglichst
gering zu beeinflussen. Natürlich
kann bei Bedarf der Reflexionsgrad aber auch auf Kosten des Transmissionsgrades
erhöht
werden. Arbeitet das Autofokussystem mit einer infraroten (NIR)-Beleuchtungsquelle,
so wird vorzugsweise mindestens ein dichroitischer Strahlteiler verwendet,
die die NIR-Strahlung mit hoher Effizienz im Autofokus-Strahlengang
führt oder
umlenkt.
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Vorteilhaft
erfolgt durch die Abbildung des Modulationsobjekts eine Streifenbeleuchtung,
bei der das Modulationsobjekt dann ein Streifenmuster ist. Auf der
Kamera erscheint dann ein Streifenmuster, dessen Kontrast in der
zur aktuellen Fokusebene konjugierten Ebene maximal ist. Hierdurch
läßt sich ein
sehr zuverlässiges
und genaues Autofokussystem für
Grenzflächen
an der Probe (z. B. Glas/Wasser, Glas/Luft oder Wasser/Luft) realisieren.
Die zweite Dimension der Kamera liefert redundante Informationen,
wodurch vorzugsweise über
Mittelung mehrerer Zeilensignale ein sehr robustes Autofokussignal entsteht.
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Um
möglichst
geringe Einflüsse
durch die Abbildung des Meßobjektes
in die Probe zu erzeugen, kann die Struktur eines räumlich modulierten Modulationsobjektes
in schneller Folge (z. B. mit größer als
30 Hz) alternierend lateral verschoben werden. Eine weitere Möglichkeit,
die bei einem verstellbaren Lichtmodulator gegeben ist, besteht
darin, immer oder zeitweise (z. B. nach Auffinden eines zu mikroskopierenden
Objektes) nur noch bestimmte Teil-Bereiche des vom Objektiv erfaßten Objektfeldes auszuleuchten.
Hierdurch kann der Bildkontrast für das Autofokus bzw. die Meßobjektnachführung, gegebenenfalls
aber auch für
die normale Mikroskopdetektion erhöht werden.
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Wesentlich
für die
Erfindung ist, daß entweder
das Modulationsobjekt oder die Kamera schräg zur optischen Achse steht.
Es können
auch beide schräg
dazu stehen. Es kann also das Modulationsobjekt schräg zur optischen
Achse und die Bildebene der Kamera senkrecht zur optischen Achse
stehen, es kann das Modulationsobjekt senkrecht zur optischen Achse
und die Bildebene der Kamera schräg zur optischen Achse stehen,
oder es ist eine gegenseitige Schrägstellung von Modulationsobjekt
und Bildebene möglich,
wobei diese dann bezogen auf die optische Achse gegensinnig schräg gestellt
sein müssen.
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Durch
Verwendung mehrerer Kameras ist auch ein dreidimensionales Bildobjektnachführungs- bzw. Autofokus-System
möglich.
Dann kann zusätzlich
eine zweite Kamera senkrecht zur optischen Achse stehen, und eine
dritte ist um eine Kippachse gedreht, die nicht mit der Kippachse
der ersten Kamera zusammenfällt.
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Die
strukturierte Autofokus-Beleuchtung kann natürlich im Durchlicht und/oder
in Dunkelfeldbeleuchtung realisiert werden. Im Durchlichtprobenbetrieb
wäre die
Anwendung dann allerdings auf transparente Probenträger eingeschränkt.
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Bei
allen Varianten des Mikroskops ist es vorzuziehen, eine rechnerische
Auswertevorrichtung zu verwenden, die die Signalauswertung der Kameras
vornimmt, einen gegebenenfalls verstellbaren Lichtmodulator ansteuert
und die Steuerung von gegebenenfalls vorhandenen mechanischen Stelleinheiten
am Mikroskop (z. B. zur Fokusverstellung, zu x-y-Verstellung, zum
Einschwenken und/oder Einschalten von Filtern etc.) vornimmt. Auswertung
und Steuerung können
sowohl Schaltungs- als auch Software-technisch implementiert werden.
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Für stark
lichtstreuende Oberflächen
ist eine Weiterbildung der Erfindung möglich, die das von der Probe
reflektierte bzw. gestreute Licht analysiert. Hier ist es vorgesehen,
daß sowohl
Kamera als auch Modulationsobjekt gegenüber der optischen Achse verkippt
sind. Beide liegen in zueinander konjugierten Ebenen. Der Kippwinkel
ist vorzugsweise gleich. Es wird von der Probe gestreutes oder reflektiertes Licht
moduliert auf die Kamera abgebildet. Die Stärke der Modulation liefert
Strukturinformationen über
die Probe und kann für
Autofokus und/oder Bildobjektnachführungszwecke verwendet werden.
Aufgrund der Schrägstellung
von Modulationsobjekt und Kamera erhält man simultan Strukturinformation
aus verschiedenen Tiefen (z-Positionen der Fokusebene des Objektives)
der Probe.
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In
ungünstigen
Fällen
kann die Lichtmodulation, die auf der Kamera nachgewiesen wird,
d. h. das Bild des in die Probe abgebildeten Objektes, durch Speckle-Effekte
beeinträchtigt
werden. Für
derartige Zwecke kann es vorteilhaftig sein, die Probe oder das Modultionsobjekt
und/oder ggf. die diese beleuchtende Lichtquelle gleichförmig oder
periodisch zu bewegen, um Speckle-Muster herauszumitteln. Alternativ ist
auch ein synchrones Bewegen von Modulationsobjekt und Kamera möglich.
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Prinzipiell
können
weitere Kameras eingespiegelt werden, die Strukturinformationen
von der Probe ableiten. Diese Kameras sind dann so angeordnet, daß auf Ihnen
unterschiedliche Schnittebenen der Probe abgebildet werden, d. h.
die Kameras sind mit unterschiedlichen Kippwinkeln zur optischen Achse
bzw. unterschiedlichen Drehwinkeln um die optische Achse angeordnet.
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Zur
Erhöhung
des Autofokus-Fangbereiches in z-Richtung kann zusätzlich noch
eine Kamera in einer zum Lichtmodulator nicht-konjugierten Ebene
angebracht sein. Durch den entsprechenden Verkippwinkel läßt sich
der Fangbereich einstellen. Das Schrägstellen einer nicht-konjugiert
angeordneten Kamera ist äquivalent
zu einem geänderten
Winkel, den das Modulationsobjekt mit der optischen Achse einschließt. Da dieser
Winkel jedoch aus praktischen Gründen
wegen sphärischen
Bildfehlern und Reflexionsverlusten kaum kleiner als 30° gewählt werden kann,
ergibt sich durch eine solche weitere Kamera die Möglichkeit
den Fangbereich der Autofokuseinrichtung zu erhöhen.
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Das
Mikroskop kann insbesondere als inverses Mikroskop ausgebildet sein,
wie es z. B. zum Auslesen von Titerplatten verwendet wird, die nach oben
geöffnete
Küvetten
mit Flüssigkeiten
besitzen. Zu Fokussieren ist hier regelmäßig auf die Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche des
Titerplattenbodens, an der meist Zellen haften. Da solche Zellen
den Kontrast des abgebildeten Modulationsobjektes beeinträchtigen,
wird vorzugsweise über
mehrere Zeilen der zweidimensionalen Kamera gemittelt, um die Meßgenauigkeit
zu verbessern.
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Zwischen
Objektiv und Titerplattenboden kann Luft oder eine Immersionsflüssigkeit
angeordnet werden. Ohne Immersionsflüssigkeit erzeugt die Luft/Glas-Grenzfläche am Titerplattenboden
den höchsten
Kontrast. Mit Immersionsflüssigkeit
erhält man
den stärksten
Kontrast von der Grenzfläche
zwischen Küvettenflüssigkeit
und Titerplattenboden-Oberseite.
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Eine
besonders gute Anpassung an verschiedene Proben ist gegeben, wenn
der Lichtmodulator ansteuerbar und zur Erzeugung eines räumlich oder
zeitlich intensitätsmodulierten
Modulationsobjektes ausgebildet ist. Diese Ansteuerbarkeit kann dadurch
erreicht werden, daß als
Lichtmodulator ein beleuchtetes LCD- oder DMD-Element verwendet wird.
Die dabei eingesetzte Wellenlänge
unterscheidet sich vorzugsweise von der normalen Beleuchtungsstrahlung
im Mikroskop. Prinzipiell kann die Autofokuseinrichtung hinsichtlich
des Lichtmodulators und/oder der Kamera in den Beleuchtungsstrahlengang
eines Auflicht-Mikroskopes eingekoppelt werden. Alternativ ist eine
Einstrahlung parallel zum Auflichtbeleuchtungsstrahlengang in den
Mikroskopstrahlengang möglich,
d. h. im Mikroskopstrahlengang befindet sich ein eigener Strahlteiler
für den
Autofokusstrahlengang. Dann kann Strahlung verwendet werden, die
bezüglich
Ihrer Wellenlänge
oberhalb der für
die Mikroskopiervorgänge
verwendeten Wellenlängen
liegt, da nicht auf die möglicherweise
dichroitischen Eigenschaften des Beleuchtungs-Strahlenteilers im
Mikroskop Rücksicht
genommen werden muß – die Autofokuseinrichtung
ist über
einen eigenen Strahlenteiler eingebunden. Bei der Fluoreszenzmikroskopie
sind für
die Autofokus-Beleuchtung Wellenlängen oberhalb 800 nm bevorzugt,
da dann für
Fluoreszenz- oder Durchlichtmessungen keine nennenswerten Einschränkungen
zu befürchten sind.
Durch einen geeigneten Spektralfilter vor der Kamera der Autofokuseinrichtung
kann potentiell störende
Strahlung der Mikroskopbeleuchtung effektiv unterdrückt und
bei der Autofokuseinrichtung ausgeblendet werden. Für die simultane
Anwendung des Autofokus bei 2-Photonen-Mikroskopie wird der Strahlteiler
so ausgelegt, daß er
nur einen schmalen Wellenlängenbereich,
z.B. 20 nm, der sich nicht mit der 2-Photonen-Anregungsstrahlung überschneidet, reflektiert.
Grundsätzlich
kann jedoch auch der gesamte sichtbare Bereich und UV für die Autofokusfunktion
verwendet werden.
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Eine
besonders einfache Analyse des in die Probe abgebildeten Modulationsobjektes
erhält
man, wenn das abgebildete Modulationsobjekt eine Streifengitterstruktur
aufweist.
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Zweckmäßigerweise
wird man die Autofokuseinrichtung in den Strahlengang des Mikroskops über einen
Strahlteiler einspiegeln, wobei zugleich die Abbildung des Modulationsobjektes,
wie auch die Rück-Abbildung
des abgebildeten Modulationsobjektes auf die Kamera über denselben
Strahlteiler eingekoppelt ist. Der Aufbau ist dann besonders einfach
an ein bestehendes Mikroskop anzupassen. Dies ist jedoch nicht zwingend.
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Der
Winkel der Schrägstellung
von Bildebene der Kamera bzw. Modulationsobjekt zur optischen Achse
stellt den Fangbereich bzw. Tiefenbereich ein, in dem die Autofokuseinrichtung
arbeitet. Ein Winkel zwischen 20° und
70° ist
zweckmäßig. Wie
bereits erwähnt,
kann man mehrere Kameras verwenden, deren Bildebenen zueinander,
insbesondere unterschiedlich, geneigt sind.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung beispielhalber
noch näher erläutert. Es
zeigen:
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1 ein
Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung für Reflexionsmessungen,
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2 ein
Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung für Fluoreszenzmessungen,
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3 ein
Mikroskop ähnlich
dem der 1, adaptiert für streuende
Proben,
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4 ein
Mikroskop ähnlich
dem der 1 mit einem erhöhten Fangbereich,
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5 ein
inverses Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung mit Einspiegelung
der Beleuchtung zwischen Objektiv und Filterwürfel und
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6 ein
inverses Mikroskop mit einer Autofokuseinrichtung mit Einspiegelung
im Mikroskopbeleuchtungsstrahlengang.
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1 zeigt
ein Mikroskop 1, mit dem eine Probe 2, die sich
auf einem Probenträger 3 befindet mittels
eines Objektivs 4 auf einen Detektor 5 abgebildet
wird. Die Darstellung in 1 ist dabei stark vereinfacht.
Bei dem Mikroskop 1 kann es sich um ein Weitfeldmikroskop
handeln, d. h. der Detektor 5 ist z.B. eine Kamera oder
ein Okulareinblick. Aber auch jede andere Mikroskopbauweise kommt
für das Mikroskop 1 in
Frage, beispielsweise ein Laser-Scanning-Mikroskop. Dann ist dem Mikroskopstrahlengang
noch eine Scananordnung vorgesehen, die auf der optischen Achse
OA1 liegt. Das Objektiv 4 ist in seiner Fokuslage verstellbar,
wie der Doppelpfeil andeutet. Alternativ kann auch der Probenträger 3 verstellbar
sein.
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An
einem Strahlteiler 6, der gegebenenfalls als Dichroit oder
als plattenförmiger
Farbteiler ausgebildet sein kann, ist Mikroskop-Beleuchtungsstrahlung
aus einer Mikroskop-Beleuchtungsquelle 8 eingekoppelt,
die über
eine Beleuchtungs-Tubusoptik 7 die Probe 2 durch
das Objektiv 4 beleuchtet. In diesen Beleuchtungsstrahlengang
ist mittels eines Strahlteilers 11 eine Autofokuseinrichtung
eingekoppelt. Die Autofokuseinrichtung verfügt über einen Lichtmodulator 12,
der von einer Lichtquelle 13, beispielsweise eine LED im
Transmissionsbetrieb oder von einer Lichtquelle 14 (z.B.
eine LED) im Reflexionsbetrieb beleuchtet ist. Der beleuchtete Lichtmodulator 12 generiert
ein Modulationsobjekt. Dies wird über den Strahlteiler 11,
die Beleuchtungs-Tubusoptik 7, den Strahlteiler 6 sowie
das Objektiv 4 in die Probe 2 projiziert, also
abgebildet. Dadurch ist eine Autofokus-Beleuchtung realisiert. Das
in der Probe 2 erzeugte Bild des Modulationsobjektes wird
im gegenläufigen
Weg mittels einer Kamera 16 erfaßt, der ein Strahlteiler 15 auf
der optischen Achse OA2 der Autofokuseinrichtung vorgelagert ist.
Die dabei erhaltene optische Achse OA3 ist optional weiter noch über einen
Strahlteiler 17 auf eine Kamera 18 geleitet.
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Von
den Kameras sind in den Figuren generell nur die Bildebenen gezeichnet.
Die Kameras können
generell CCD-Kameras sein.
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In
der Bauweise der 1 liegt der Lichtmodulator 12 und
damit das Modulationsobjekt senkrecht zur optischen Achse OA2. Die
Kamera 16 steht mit ihrer Bildebene dagegen schräg zur optischen Achse
OA3. Nimmt der Lichtmodulator 12 beispielsweise eine räumliche
Modulation vor, z. B. ein Streifenmuster, findet sich der maximale
Kontrast in einer senkrecht zur Zeichenebene liegenden Zeile der
Kamera 16. Die Lage der Zeile längs der Kamera 16 ist ein
Maß für die Lage
der Fokusebene längs
der optischen Achse, d. h. in z-Richtung.
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Mit
Hilfe der Beleuchtungstubusoptik 7 und des Objektivs 4 wird
das Modulationsobjekt, das vom Lichtmodulator 12 entweder
in Transmissionsbetrieb (Lichtquelle 13) oder im Reflexionsbetrieb
(Lichtquelle 14) erzeugt wird, in die Probe abgebildet.
Durch die schräggestellte
Kamera 16 erfolgt eine Tiefenauflösung. Mittels der Kamera 18 kann
zusätzlich
eine laterale Verschiebung der strukturiert beleuchteten Probe detektiert
werden.
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Im
Falle eines Fluoreszenzmikroskops werden ein Anregungsfilter 10 sowie
ein Emissionsfilter 9 (für die Fluoreszenzstrahlung)
verwendet. Das Mikroskop 1 kann ohne weitere Einschränkung hinsichtlich
der Autofokuseinrichtung auch als scannendes Mikroskop, insbesondere
als Laser-Scanning-Mikroskop
ausgebildet sein.
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2 zeigt
eine alternative Gestaltung des Mikroskops der 1 hinsichtlich
der Autofokuseinrichtung. Im Mikroskop der 2 sind Bauteile,
die bereits anhand 1 erläutert wurden, mit denselben
Bezugszeichen versehen; auf ihre wiederholte Beschreibung wird deshalb
verzichtet. Die Kamera 16 detektiert hier den Fluoreszenzkontrast
der Probe, welcher durch die strukturierte Autofokus-Beleuchtung
noch verstärkt
werden kann.
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Die
Abbildung des Modulationsobjektes erfolgt ähnlich wie bei der Bauweise
gemäß 1.
Die Erfassung des in die Probe 2 abgebildeten Modulationsbildes
geschieht jedoch nicht aus dem Beleuchtungsstrahlengang heraus,
sondern über
einen eigenständigen
Strahlteiler aus dem Mikroskopstrahlengang. Um das in die Probe
abgebildete Modulationsobjekt mittels der Kamera 16 erfassen
zu können, ist
dieser Kamera eine entsprechende Relaisoptik 20 vorgeordnet,
deren optische Charakteristik dafür sorgt, daß die Bildebene der Kamera 16 eine
konjugierte Ebene zum Modulationsobjekt schneidet, idealerweise
nahe oder auf der optischen Achse (wie bei 1 auch).
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Die
von der Fokuseinrichtung, insbesondere der Kamera 16 gelieferten
Signale werden zur Ansteuerung einer Fokusverstellung längs der
z-Achse verwertet. Dies ist in 1 schematisch
durch einen Doppelpfeil veranschaulicht. Das dabei eingesetzte Steuergerät ist in
den 1 und 2 nicht gezeigt.
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Ist
das Mikroskop 1 in 2 als Laser-Scanning-Mikroskop
ausgebildet, wird wiederum die Kombination aus Emissionsfilter 9 und
Anregungsfilter 10 vorgesehen, wie auch optional ein weiterer
Spektralfilter 21, der dafür sorgt, daß auf die Kamera 16 der Spektralbereich
des leuchtenden Modulationsobjektes fällt und nicht weiter interessierende
Strahlenbereiche ausgeblendet sind.
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3 zeigt
eine Ausbildung des Mikroskops 1 für stark streuende und wenig
reflektierende Proben. Elemente, die bereits anhand der 1 oder 2 erläutert wurden,
werden nicht weiter beschrieben. Sie sind in der Figur mit den gleichen
Bezugszeichen versehen.
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Für stark
lichtstreuende Oberflächen,
wie z. B. Gewebeschnitte ist die Autofokuseinrichtung gemäß 3 abgewandelt.
Es handelt sich um eine Einrichtung, die vorwiegend das von der
Probe gestreute Licht analysiert.
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Bei
dieser Anordnung schließt
der zweidimensionale Lichtmodulator 12 mit der optischen
Achse OA2 einen Winkel zwischen 0° und
90°, bevorzugt zwischen
20° und
70° ein.
Der Lichtmodulator 12 entspricht wieder der bereits geschilderten
Bauweise, d. h. es kann sich um ein Transmissions-LCD, ein Reflexions-LCD,
ein DMD oder ein Amplitudengitter mit Verschiebevorrichtung handeln.
Die Struktur besteht vorzugsweise wiederum aus Hell-Dunkel-Streifen. Die Beleuchtung
des Lichtmodulators 12 erfolgt vorzugsweise durch eine
oder mehrere leistungsstarke LED. Auch dies war bei den 1 und 2 möglich. Bei
einem Transmissionsmodulator ist dabei die Lichtquelle 13 vorgesehen,
bei einem Reflexionsmodulator die Lichtquelle 14. Übliche optische
Vorrichtungen zur Lichthomogenisierungen und Optiken zu Zwischenabbildungen
können
zur Erzeugung des Modulationsobjektes mit dem Lichtmodulator 12 verwendet
werden und sind aus Gründen
der Übersicht in
der 3 (wie auch in den 1 und 2)
nicht dargestellt.
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Mit
Hilfe der Beleuchtungstubusoptik 7 und des Objektivs 4 wird
das Modulationsobjekt in die Probe 2 abgebildet. Da der
Lichtmodulator 12 und damit das Modulationsobjekt nicht
senkrecht zur optischen Achse steht, wird das Modulationsobjekt
(z. B. alternierende Hell-Dunkel-Streifen) schräg zur optischen Achse und damit
in die Tiefe der Probe abgebildet.
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Die
Bildebene der Kamera 18 liegt in einer zum Lichtmodulator 12 und
damit zum Modulationsobjekt konjugierten Ebene. Sie ist also im
gleichen Winkel zur optischen Achse (hier die optische Achse OA3)
verkippt, wie der Lichtmodulator 12. Hierdurch wird von
der Probe gestreutes Licht moduliert auf die Kamera 18 abgebildet.
Der Kontrast des Modulationsobjektes erscheint auf Kamera 18 nur
dort, wo er von der Probe gestreut wird. Daher ist die Ausführung in 2 besonders
für dünne oder
intransparente, streuende Proben geeignet, beispielsweise in der
Materialmikroskopie.
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Zusätzlich weist
die Autofokuseinrichtung für die
Autofokusfunktion noch die Kamera 16 auf, deren Bildebene
gegenüber
dem Lichtmodulator 12 und damit dem Modulationsobjekt schräg steht,
da sie senkrecht zur optischen Achse OA3 liegt. Sie ist über einen
50%-Splitter 17 eingespiegelt.
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4 zeigt
eine weitere Abwandlung des Mikroskops hinsichtlich der Autofokuseinrichtung.
Die Anordnung der 4 unterscheidet sich von der
der 3 dadurch, daß die
Kamera 18 nun gegensinnig zum Lichtmodulator verkippt ist.
Die Bildebene der Kamera 18 und der Lichtmodulator 12 sind
hier derart verkippt, daß sie
nicht konjugiert zueinander liegen. Hierdurch kann der Fangbereich
vergrößert, typischerweise
verdoppelt werden.
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4 zeigt
gestrichelt noch eine Alternative zur Ankopplung der Autofokuseinrichtung
an den Strahlengang des Mikroskops 1. Diese Alternative
ist prinzipiell für
alle Bauweisen der Autofokuseinrichtung möglich und sieht einen eigenständigen Strahlteiler 11' im Mikroskopstrahlengang
vor, der die Strahlung des Lichtmodulators 12 einkoppelt
und die Darstellung des in die Probe abgebildeten Modulationsobjektes
auf die Kamera 16 bzw. 18 leitet. In der Darstellung der 4 entfällt bei
dieser Bauweise dann der Strahlteiler 11. Statt dessen
ist optional ein Umlenkspiegel 11" vorgesehen. Auch erfolgt die Einkopplung über den
Strahlteiler 11 mittels einer optionalen Optik 20,
die eine gegebenenfalls nötige
Zwischenabbildung erzeugt und sicherstellt, daß das Modulationsobjekt, d.
h. der beleuchtete Lichtmodulator 12, in einer zur Fokusebene
des Objektives 4 konjugierten Ebene liegt, mithin das Modulationsobjekt
durch das Objektiv 4 in die Probe 2 abgebildet wird.
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Die
in 4 exemplarisch alternativ eingezeichnete Bauweise
hat den Vorteil, daß die
Autofokuseinrichtung sehr zuverlässig
simultan zu allen gängigen
Mikroskopiervorgängen
arbeiten kann. Insbesondere ist es möglich, für das Modulationsobjekt, d.
h. die Beleuchtung des Lichtmodulators 12, Strahlung zu
verwenden, die mit ihrer Wellenlänge
oberhalb der für
die Mikroskopiervorgänge
verwendeten Wellenlängen
liegt. Bei Fluoreszenz- oder Durchlichtmessungen kann ein Wellenlängenbereich
oberhalb von 700 nm, vorzugsweise oberhalb von 800 nm für die Autofokuseinrichtung
verwendet werden. Ein zusätzlicher
Spektralfilter vor der Kamera bzw. den Kameras kann potentiell störendes Licht
der Mikroskopbeleuchtung effektiv unterdrücken.
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Die
Bauweisen der 1 bis 4 zeigen die
Anordnung der Autofokuseinrichtung bei einem aufrechten Mikroskop 1 mit
einem Objektträger
als Probenhalter. Zwischen Objektträger und Objektiv kann sich
ein Deckglas wie auch eine Immersionsflüssigkeit (z. B. Öl, Wasser,
Glycerin) befinden. Dies ist aber nicht zwingend erforderlich. Es
gibt also zwei zu unterscheidende Anwendungsfälle: Ohne Immersionsflüssigkeit
erzeugt den höchsten Gitterkontrast die
Luft/Glas-Grenzfläche
an der Deckglas- oder Objektträgeroberseite.
Mit Immersionsflüssigkeit
erhält man
den höchsten
Gitterkontrast von der Grenzfläche
zwischen Deckglas-Unterseite und Einbettmedium. Zur Unterdrückung von
Streulicht oder unerwünschten
Reflexen können
Blenden, z.B. halbkreisförmige
Blenden, in den Autofokus-Strahlengang eingebracht werden.
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Der
Strahlteiler 11 oder 11' kann eine planparallele Glasplatte
sein, die auf einer Seite entspiegelt ist, ohne störende Sekundärbilder
zu vermeiden. Die der Reflexion des Autofokussignals dienende Seite der
Glasplatte kann auch eine dichroitische Beschichtung aufweisen,
die die Reflektivität
für das langwellige
Autofokuslicht erhöht
(wenn die Variante mit langwelliger Autofokusbeleuchtung verwendet wird)
und das kurzwelligere Nutzlicht der Mikroskopie (z. B. Fluoreszenzstrahlung) überwiegend
transmittieren.
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5 zeigt
ein inverses Mikroskop 1 mit einer erfindungsgemäßen Autofokusvorrichtung.
Solche inversen Mikroskope werden vorwiegend zum Auslesen von Titerplatten
verwendet, welche nach oben geöffente
Küvetten 22 mit
Flüssigkeiten
besitzen. Zu Fokussieren ist hier meist auf die der Glas/Flüssigkeits-Grenzfläche des
Titerplattenbodens oder in der Nähe,
an dem meist Zellen haften. Da diese Zellen den Kontrast des projizierten
Gitters, d. h. des Modulationsobjektes, beeinträchtigen, werden bei dieser
Bauweise vorzugsweise mindestens 10 Zeilen der flächigen Kamera 16 ausgewertet.
Dadurch kann das Kontrastsignal über
eine größere Anzahl
von Zeilen gemittelt werden, was die Meßgenauigkeit wesentlich verbessert.
Zwischen Objektiv 4 und Titerplattenboden kann sich wiederum
Luft oder eine Immersionsflüssigkeit
befinden, das oben bereits Gesagte gilt analog. Der einzige Unterschied
besteht darin, daß anstelle
des Einbettmediums eine ausgedehnte Flüssigkeitssäule vorliegt, die über der Probe
in der Küvette 22 steht.
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Die
Autofokuseinrichtung ist in der Bauweise der 5 wiederum über einen
eigenen Strahlteiler 11' in
den Mikroskopstrahlengang und nicht in den Beleuchtungsstrahlengang
eingekoppelt. Ansonsten gilt das bereits Gesagte analog. Zusätzlich ist
in 5 noch der optionale Spektralfilter 21 eingezeichnet.
Auch ist die Ausleuchtungsoptik 23 zur Erzeugung des Modulationsobjektes
aus dem Lichtmodulator 12 exemplarisch dargestellt. Zur
homogenen Ausleuchtung des Lichtmodulators 12 enthält vorzugsweise
die Ausleuchtungsoptik 23 auch eine Streuscheibe. Eine
Ausleuchtungsoptik 23 kann in allen beschriebenen Varianten
verwendet werden.
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Weiter
zeigt 5, daß die
Signale der Kamera 16 an ein Steuergerät 26 geleitet werden,
das entsprechende Berechnungen vornimmt und unter anderem einen
z-Antrieb 27 zur Verstellung der Fokuslage ansteuert. Natürlich ist
das Steuergerät 26 in der
Regel auch mit dem Lichtmodulator 12 verbunden, sofern
dieser ansteuerbar ist. Gleiches gilt für die Lichtquelle 13.
Das Steuergerät
und die damit verbundenen Elemente sind auch bei den Bauweisen gemäß 1 bis 4 möglich.
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6 zeigt
eine Abwandlung der Bauweise der 5. Hier
ist nun analog zur Bauweise der 1 die Autofokuseinrichtung über den
Strahlteiler 11 in den Beleuchtungsstrahlengang eingespiegelt. Die
separate Optik 20 kann entfallen, da dann keine Autofokusbeleuchtungstubusoptik
nötig ist;
deren Funktion wird von der Beleuchtungstubusoptik 7 erfüllt. Zusätzlich sind
in 6 noch optionale Filter 24 und 25 im
Beleuchtungsstrahlengang eingezeichnet. Auch ist der Einkopplung über den
Strahlteiler 11 in Abbildungsrichtung des Modulationsobjektes
eine Verkleinerungsoptik 28 vorgeordnet, die den Fangbereich
der Autofokuseinrichtung beeinflußt und so dessen ideale Auslegung
ermöglicht.
Die Optiken 7, 20 und 28 können auch
als (motorisierte) Variooptiken ausgelegt sein, um unterschiedliche
Objektiwergrößerungen
auszugleichen.
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Für alle Ausführungsformen
des Mikroskops 1 mit Autofokuseinrichtung gilt folgendes.:
Um
bei einem Online-Tracking möglichst
geringe Einflüsse
durch die strukturierte Beleuchtung, d. h. das Bild des Modulationsobjektes,
zu produzieren, kann als Modulationsobjekt ein Streifenmuster auf
die Probe projiziert werden, das in schneller Folge (>30 Hz) alternierend
lateral verschoben wird. Bei zwei Positionen wäre es eine Phasenverschiebung
um 180°,
bei drei Positionen eine Phasenverschiebung um 120°. Die Gitterstruktur
(Gitterkonstante, Hell/Dunkel-Verhältnis) kann dabei über den
elektronischen Lichtmodulator 12 in der Ansteuerung leicht
derart angepaßt werden,
daß im
zeitlichen Mittel eine homogene Beleuchtung entsteht. Die Anpassung
der optimalen Gitterstruktur an das jeweils verwendete Objektiv 4 bzw.
dessen NA oder Vergrößerung ist
auch möglich.
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Ein
weiterer Vorteil eines verstellbaren, insbesondere ansteuerbaren
Lichtmodulators 12 und damit einer variablen Autofokus-Beleuchtungsstruktur
besteht darin, nach dem Auffinden eines Objektes nur noch die interessanten
Bereiche des Objektfeldes auszuleuchten. Hierdurch kann der Bildkontrast für die Tracking-Vorrichtung,
gegebenenfalls aber auch für
den normalen Detektionskanal erhöht
werden.
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Prinzipiell
ist die strukturierte Autofokus-Beleuchtung, z.B. mittels LCD oder
DMD, auch bei einem Durchlichtmikroskop und/oder als Dunkelfeldbeleuchtung
realisierbar. Im Durchlicht ist die Anwendung dann aber auf transparente
Probenträger
sowie auf streuende oder fluoreszierende Proben eingeschränkt.
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Bei
allen Varianten des Autofokus- und Tracking-Systems wird eine rechnerische
Steuer- und Auswerteeinrichtung (z.B. ein Computer) verwendet, die
die Signalanalyse und die Steuerung des Aktuatoren (z-Trieb, x-y-Tisch,
Filter etc.) vornimmt. Auswertung und Steuerung können Firmware-
und/oder Software-technisch implementiert werden. Diese Steuer-
und Auswerteeinrichtung übernimmt
sämtliche
hier geschilderte Ablaufsteuerung.
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Statt
verstellbarer, z. B. elektrisch schaltbarer Lichtmodulatoren (z.
B. LCD, DMD) können
auch statische Lichtmodulatoren (Transmissions- oder Phasengitter)
verwendet werden. Das projizierte Modulationsobjekt kann mit verkippbaren
Planplatten oder anderen Vorrichtungen probenseitig verschiebbar
sein. Ein Austausch der Gitter kann zur Variation der Gitterkonstante
oder -struktur ebenfalls möglich sein.
Alternativ dazu kann eine flächige
Gitterstruktur verwendet werden, die mehrere unterschiedliche Gitterperioden
aufweist, beispielsweise 2 bis 10 nebeneinander angeordnete Streifengitter
mit unterschiedlichen Gitterfrequenzen.
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Da
das erfindungsgemäße Autofokusverfahren
mit flächigen
(zweidimensionalen) Kameras arbeitet, kann für jeden Anwendungsfall das
am besten geeignete Gitter durch Auslesen der entsprechenden Kamerazeilen
gewählt
werden, ohne mechanische Änderungen
(Austausch des Gitters) vornehmen zu müssen. Grundsätzlich sind
senkrecht zur optischen Achse stehende Lichtmodulatoren 12 als
Transmissionsmodulatoren leichter implementierbar, während geneigte
Lichtmodulatoren 12 leichter als Reflexionsmodulatoren
realisierbar sind. Sollen sehr kleine Objekte durch das Tracking-System
erfaßt
werden, so kann es vorkommen, daß eine hinreichend hochfrequente
Beleuchtungsmodulation nicht mehr möglich ist. In diesem Fall kann
auch räumlich
unmoduliert beleuchtet und nur die Intensität der gestreuten oder reflektierten
Signale ausgewertet werden. Als ortsauflösende Detektoren kommen neben
CCD-Kameras auch
CMOS- sowie alle anderen Arten von Digitalkameras in Frage.
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Die
Autofokuseinrichtung soll einen bestimmten Bereich der Probe automatisch
fokussieren oder in der Fokusebene des Objektivs halten. Hierzu kann
ein Offset (typisch 0 ... 1000 μm)
zwischen Grenzfläche
und relevanter Probenebene vorgegeben werden. Wird dieser Offset
in Stufen variiert, so ist es auch möglich sogenannte z-Stapel von
Bildern aufzunehmen, wobei jedes Bild einen definierten und kontrollierten
Abstand zur Grenzfläche
hat. Die Anordnung kann in Verbindung mit allen gängigen Kontrastverfahren
der Mikroskopie verwendet werden: u.a. Fluoreszenz, Durchlicht,
Phasenkontrast, Interferenzkontrast, Polarisationskontrast, Auflicht,
Luminiszenz, CARS (= Coherent Anti-Stokes Raman Scattering), OCT
(= Optical Coherence Tomography), SPIM (= Selective Plane Illumination)
etc.