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Die
Erfindung bezieht sich auf Tandem-Massenspektrometer (abgekürzt MS/MS),
also auf Massenspektrometer, die Massenspektren von Fragmentionen
einer selektierten Ionensorte aufnehmen und so die Menge und die
Masse der Fragmentionen bestimmen können.
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Es
ist das Neuartige der Erfindung, dass alle MS/MS-Untersuchungen
einer Probe an einem einmalig geschaffenen Vorrat von Ionen dieser
Probe vorgenommen werden, wobei die jeweils zu untersuchende Ionensorte
aus dem Vorrat massenselektiv exportiert wird, ohne die anderen
Ionensorten zu beschädigen.
Im Verfahren der Erfindung wird zunächst eine Probe (oder ein Teil
davon) vollständig
ionisiert und die Ionen werden, anders als bei bisherigen Tandem-Massenspektrometern,
in einem Speicherreservoir im Vakuum gespeichert. Alle darauf folgenden Analysen
werden an diesen gespeicherten Ionen ausgeführt, ohne weitere Ionen zuzuführen, um
keine Änderungen
der Konzentrationen der gespeicherten Ionensorten zu bewirken. Als
selektierende Einrichtung des Tandem-Massenspektrometers wird nicht, wie
im Stand der Technik üblich,
ein Massenfilter eingesetzt, das die nicht-selektierten Ionen vernichtet, sondern
ein massenselektives Ionentor. Das massenselektive Ionentor exportiert
die zu analysierenden Ionensorten aus dem Speicherreservoir und lässt die
nicht-selektierten Ionen unbeschädigt
im Speicherreservoir zurück.
Diese Ionen bleiben gespeichert und können später weiteren analytischen Untersuchungen
zugeführt
werden. Die exportierten Ionen werden fragmentiert, und die Fragmentionen werden
in einem schnellen Massenanalysator hoher Massenauflösung, bevorzugt
in einem Flugzeitmassenanalysator mit orthogonalem Ioneneinschuss,
als Massenspektrum aufgenommen. Die Vorgänge des Exports einer selektierten
Ionensorte mit anschließender
Fragmentierung und der Aufnahme des Fragmentionenspektrums können für beliebig
viele Ionensorten wiederholt werden. Verschiedene Arien massenselektiver
Ionentore werden vorgestellt.
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Die
Tandem-Massenspektrometrie hat sich in den letzten vier Jahrzehnten
zu einem außerordentlich
erfolgreichen Zweig der Massenspektrometrie entwickelt. Ein Tandem-Massenspektrometer (MS/MS)
filtert zunächst
aus einem stetigen Angebot eines Ionengemisches in Form eines kontinuierlichen Ionenstrahls
eine vorgewählte
Ionensorte aus, fragmentiert diese Ionensorte, und misst in einem
Massenanalysator das Spektrum der Fragmentionen. Die Ionen der ausgewählten Ionensorte
werden häufig „Elternionen" genannt, die Fragmentionen
heißen häufig „Tochterionen".
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Es
haben sich im Laufe der Zeit zwei grundsätzlich verschiedene Arten der
Tandem-Massenspektrometrie
entwickelt, die als „Tandem
im Raum" und „Tandem
in der Zeit" bezeichnet
werden.
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„Tandem
im Raum" bezeichnet
ein Verfahren, das ein Massenfilter (also ein erstes massenspektrometrisches
Trennsystem) als massenselektive Einrichtung benutzt, eine davon
räumlich
getrennte Kammer für
die Fragmentierung der selektierten Ionen verwendet und einen wiederum
räumlich
davon getrennten Massenanalysator (ein zweites massenspektrometrisches
Trennsystem) zur Aufnahme des Spektrums der Tochterionen. Die Verwendung zweier
massenspektrometrischen Trennsysteme hat zur Abkürzung MS/MS geführt. Als
Massenfilter wurden in der Anfangszeit der Tandem-Massenspektrometrie
regelmäßig magnetische
Sektorfelder verwendet, heute werden (außer bei so genannten TOF/TOF-Geräten) praktisch
ausschließlich
Hochfrequenz-Quadrupol-Massenfilter eingesetzt. Als Massenanalysatoren
können
mehrere Arten von Massenspektrometern verwendet werden, darunter Massenspektrometer
mit magnetischen Sektorfeldern, Hochfrequenz-Quadrupol-Massenspektrometer,
Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer, oder Flugzeitmassenspektrometer
mit orthogonalem Ioneneinschuss. Im Verfahren „Tandem im Raum" wird aber stets
im selektierenden Massenfilter zu einer gegebenen Zeit nur eine
einzige analytisch interessierende Ionensorte durchgelassen, alle
anderen Ionensorten des Ionengemisches werden vernichtet und sind
für weitere
Untersuchungen verloren.
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Das
Verfahren „Tandem
in der Zeit" besteht darin,
alle Schritte der Selektion, der Fragmentierung und der Analyse
der Tochterionen in einer einzigen Zelle, einer Ionenfalle, zeitlich
nacheinander auszuführen.
Auch hier wird, wie auch bei „Tandem
im Raum", im Schritt
der Selektion nur die analytisch interessierende Elternionensorte
behalten; alle anderen Ionensorten werden vernichtet und sind für alle Zeiten
verloren. Als Ionenfallen können
hier lineare Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen mit vier Polstäben, dreidimensionale
Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen mit einer Ringelektrode und zwei
Endkappenelektroden, oder auch die Zellen von Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometern
verwendet werden. Dieses Verfahren „Tandem in der Zeit" erlaubt es relativ
einfach, die Selektions- und Fragmentierungsschritte zu wiederholen
und damit nicht nur Tochterionenspektren, sondern auch Enkelionenspektren
oder sogar Urenkelionenspektren zu messen.
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Die
Vernichtung aller Ionensorten, die nicht gerade zur Analyse anstehen,
ist nicht nachteilig, so lange in einer Probe nur eine einzige Ionensorte
allein analysiert werden soll. Sollen dagegen mehrere oder sogar
viele Substanzen mit möglicherweise
jeweils vielen Ionensorten analysiert werden, so ist diese Vernichtung
eine Verschwendung von Probenmaterial und damit sehr nachteilig.
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Die
Bedeutung der Tandem-Massenspektrometrie liegt darin, dass sie durch
die Aufnahme der Fragmentionenspektren einerseits Einblicke in die Struktur
der selektierten Elternionen und andererseits eine sichere Identifizierung
der Art der Elternionen ermöglicht.
In den Biowissenschaften ermöglicht sie
insbesondere die Bestimmung von Sequenzen in Biopolymeren (oder
zumindest von Teilen dieser Sequenzen und auch von Modifizierungen dieser
Sequenzen), insbesondere von Aminosäuresequenzen in Proteinen und
Peptiden. Die Bedeutung der Tandem-Massenspektrometrie ist weiterhin
dadurch gestiegen, dass die besonderen Ionisierungsverfahren für Biomoleküle, insbesondere
Elektrosprühen
(ESI) und matrix-unterstützte
Laserdesorption (MALDI) außerordentlich
zart sind (so genannte „weiche" Ionisierungsverfahren)
und selbst praktisch keine Fragmentionen liefern, wie das für die frühen Ionisierungsverfahren
wie Elektronenstoß-Ionisierung
der Fall war. Die zarten Ionisierungsverfahren liefern nur so genannte
Pseudo-Molekülionen,
meist protonierte oder deprotonierte Moleküle, die als einzige Information die
Masse des Moleküls
liefern, aber darüber
hinaus keine weiteren Kenntnisse über Identität und Struktur der Moleküle. Für die sichere
Identifizierung einer Substanz sind daher weitergehende Informationen notwendig,
wie sie praktisch nur die Tandem-Massenspektrometrie liefert. Selbst
wenn es „nur" um eine quantitative
Bestimmung einer gesuchten, an sich bekannten Substanz handelt,
ist in der Bioanalytik eine sichere Identifizierung und damit die
Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie unabdingbar.
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Besonders
wichtig für
die Tandem-Massenspektrometrie ist die Fragmentierung der selektierten Ionen.
Für Proteine
und Peptide hat sich inzwischen herausgestellt, dass es wohl im
Wesentlichen zwei grundsätzlich
verschiedene Arten der Fragmentierung dieser Biopolymere gibt. Diese
beiden Arten der Fragmentierung liefern voneinander unabhängige Informationen
(man spricht hier oft von „orthogonalen" Verfahren), wobei
ein Vergleich der Fragmentionenspektren der beiden Fragmentierungsarten
besonders wertvolle zusätzliche
Information ergibt.
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Die
erste Art der Fragmentierung ist ein Zerfall der Elternionen, nachdem
sie durch einen oder mehrere Energieaufnahmeprozesse genügend innere
Energie aufgesammelt haben. Die innere Energie verteilt sich dabei
auf alle inneren Schwingungssysteme des Elternions, wobei sich aber
die Lokalisierung der Energie stets ändert, weil die Schwingungssysteme
gekoppelt sind und daher fortdauernd untereinander Energie austauschen.
Tritt schließlich
an einer Bindung des Elternions eine Kraft auf, die die Bindungskraft übersteigt,
so bricht hier das Elternion in zwei Fragmente. Die Brüche betreffen
dabei in statistischer Weise nur solche Bindungen, die niedrige
Bindungsenergien aufweisen. Diese Art des Zerfalls führt bei
Proteinen überwiegend
zu so genannten b- und y-Fragmentionen. Die Energie kann durch eine Vielzahl
von moderaten Stößen angesammelt
werden (CID = collision induced decomposition), aber auch durch
die Aufnahme einer Vielzahl von Infrarot-Quanten (IRMPD = infrared
multi photon decomposition).
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Eine
Abart davon ist die so genannte hochenergetische Stoßfragmentierung
(HE-CID). Bei Stößen im Bereich
kinetischer Energien von einigen Kiloeletronenvolt reicht ein Stoß, um zu
Fragmentierungen zu führen.
Die so erzeugten Fragmentspektren sehen etwas anders aus, weil sie
mehr Spontanfragmentierungen, beispielsweise an Seitenketten, und ebenfalls
mehr Folgefragmentierungen und daher insgesamt mehr Fragmentionensignale
enthalten. Sie sind schwerer zu interpretieren und werden daher eher
vermieden. Prinzipiell enthalten diese Hochenergie-Fragmentionenspektren
von Proteinen aber ebenfalls vorwiegend b- und y-Fragmentionen.
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Die
zweite Art des Zerfalls wird durch einen Elektronenübertrag
auf mehrfach positiv geladene Elternionen hervorgerufen; der Zerfall
ist spontan und führt
vorwiegend zu so genannten c- und z-Fragmentionen. Der Elektronenübertrag
kann durch direkten Einfang eines Elektrons (ECD = electron capture
dissociation), durch Übertragung
eines Elektrons eines negativ geladenen Ions (ETD = electron transfer
dissociation), oder durch den Übertrag
eines Elektrons aus einem hoch angeregten Atom auf das Elternion
hervorgerufen werden.
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Die
bisher kommerziell vertriebenen Tandem-Massenspektrometer haben
für die
Messung einer Mehrzahl von Substanzen aus einer Probe immer eine
relativ geringe Empfindlichkeit, da stets für die Auswahl einer Ionensorte
für die
weitere Präparation bis
zur Analyse ihrer Fragmentionen alle anderen Ionensorten vernichtet
werden und für
weitere Analysen nicht mehr zur Verfügung stehen. Für weitere Analysen
anderer Ionensorten oder anderer Substanzen der gleichen Probe müssen unter
weiterem Probenverbrauch jeweils neue Ionen generiert werden. Da
für viele
biochemische Fragestellungen nur sehr wenig Probenmaterial zur Verfügung steht,
sind die bisherigen Tandem-Massenspektrometer nachteilig. So ist
es ein Wunschziel vieler Molekularbiologen, das Proteom einer einzigen
Zelle, das aus nur etwa 108 Protein-Molekülen besteht,
bestimmen zu können.
Aber selbst in größeren Mengen
an ursprünglichem
Probenmaterial können
sich interessierende Analytsubstanzen in so extrem geringen Mengen
befinden, dass, etwa nach einer Extraktion mit einer entsprechenden
Mischung von Antikörpern,
nur sehr wenig Analytmoleküle
für eine
Bestimmung der relativen Konzentrationen zur Verfügung stehen.
Beispielsweise beträgt
die Konzentrationen der medizinisch außerordentlich interessanten
20 bis 30 verschiedenen Interleukine nur jeweils etwa 10 bis 100 Attomol
pro Milliliter. In einem Extrakt aus 100 Millilitern finden sich
somit nur gerade noch so eben nachweisbare Mengen an Interleukinen,
nicht ausreichend für
eine heutige MS/MS-Analyse.
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Dabei
muss jedoch die massenselektive Auswahl und Isolierung einer Ionensorte
nicht zwangsweise mit einer Zerstörung aller anderen Ionen verbunden
sein. Es kann beispielsweise eine Überführung der Ionen einer ausgewählter Ionensorte
von einem Ionenspeicher in einen anderen Ionenspeicher vorgenommen
werden, ohne die nicht ausgewählten
Ionen zu zerstören.
Es ist seit langem bekannt, dass man Ionen massenselektiv von einer
ersten Ionenzyklotronresonanzzelle in eine zweite überführen kann,
wobei die nicht überführten Ionen
in der ersten Zelle verbleiben. Auch die massenselektive Übertragung
von Ionen aus einer Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle in eine benachbarte
ist bekannt. Ganz allgemein kann man Ionen aus Ionenfallen durch
Resonanzprozesse massenselektiv auswerfen ohne die verbleibenden Ionen
zu zerstören, dabei
kann es sich um zweidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen mit vier
Polstäben,
um dreidimensionale Hochfrequenz-Ionenfallen mit Ringelektrode und
Endkappenelektroden oder auch um Ionenzyklotronresonanzzellen handeln.
Es handelt sich hier um das Grundprinzip aller Ionenfallen-Massenspektrometrie
mit externem Ionennachweis, bei dem stets massenselektiv eine Ionensorte
zur Messung ausgeworfen wird, während
die übrigen
Ionen unzerstört
in der Ionenfalle verbleiben.
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Ein
relativ einfaches Verfahren für
die massenselektive Überführung von
Ionen ohne Vernichtung aller anderen Ionen ist im Patent
US 6,177,668 B1 (J.
W. Hager) zu finden. Hier wird ein Verfahren mit einem massenselektiven
axialen Auswurf am Ende eines Hochfrequenz-Polstabsystems beschrieben.
Der Auswurf der Ionen wird durch eine Anregung der Ionen im Streufeld
am Ende des Polstabsystems bewirkt: „Trapped ions are axially
mass selectively ejected by taking advantage of the mixing of the
degrees of freedom induced by the fringing fields and other anti-harmonicities
in the vicinity of the end lens. Thus, ions can be mass selectively
ejected at the exit end at the same time as ions are being admitted
into the entrance end of the rod set, thereby taking better advantage
of the ion flux from a continuous ion source". (Zitiert aus der Zusammenfassung des
Patents). Dieser massenselektive Auswurf der Ionen wirft die Ionen
in diesem Patent auf einen Ionendetektor, wirkt also selbst als
ein Massenanalysator. Durch ein Scannen des Auswurfs nach Massen lässt sich
so ein Massenspektrum aufnehmen. Der Schwerpunkt der Erfindung dieses
Patentes liegt auf einer neuen Art eines Ionenfallen-Massenspektrometers
durch diesen Massenscan mit einem hohem Nutzgrad der eingesetzten
Ionen. Es lässt
sich damit eine sehr zufrieden stellende Massenauflösung erzielen,
wobei aber eine sehr langsame Scangeschwindigkeit in Kauf genommen
werden muss. Die Aufnahme der Massenspektren dauert sehr lange, beispielsweise
sind (nach den Daten aus dem Patent) für einen Massenscan über 3000
Masseneinheiten für
eine Massenauflösung
von R = 6000 insgesamt 24 Sekunden notwendig. Außerdem wird hier immer nur
in einem Scan ein relativ kleiner Teil der Ionen (größenordnungsmäßig etwa
fünf bis
zwanzig Prozent) aus der Ionenfalle ausgeworfen.
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J.
W. Hager beschreibt aber in seinem Patent nicht nur die Anwendung
dieses Ionenauswurfs im Streufeld als massenspektrometrisches Grundprinzip,
er verwendet das Prinzip auch bereits als einen Massenselektor für die Auswahl
von Elternionen für eine
nachfolgende Fragmentierung, immer aber in Verbindung mit derselben
Art der Ionenfallen-Massenspektrometrie mit axialem Ionenauswurf
als Massenanalysator für
die Fragmentionen und immer in Verbindung mit einem konstanten Einstrom
von Ionen aus einer Ionenquelle. In diesem Patent wird nicht die
allgemeine Bedeutung dieses Prinzips des Massenselektors für die Tandem-Massenspektrometrie
im Allgemeinen und insbesondere für die Analyse eines abgeschlossenen
Vorrats von Ionen erkannt und dargestellt.
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Ein
solcher Massenselektor, der Ionen eines ausgewählten kleinen Massenbereichs
von einem Ionenspeicher in einen anderen Ionenspeicher transportieren
kann, ohne die nicht ausgewählten
Ionen zu zerstören,
wird nachfolgend ein „Ionentor" (ion gate) genannt.
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Wenn
hier von „Masse
der Ionen" oder
auch nur einfach von „Masse" in Verbindung mit
Ionen die Rede ist, so ist stets die „ladungsbezogene Masse" m/z gemeint, also
die physikalische Masse m der Ionen geteilt durch die dimensionslose
und absolut genommene Anzahl z der positiven oder negativen Elementarladungen,
die dieses Ion trägt.
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Unter „Analyse" einer Ionensorte
oder einer Substanz soll hier sowohl die Feststellung der Menge relativ
zu anderen Ionensorten oder anderen Substanzen (die „quantitative
Analyse") verstanden
werden, wie auch die Feststellung der Identität der Ionensorte oder Substanz
(die „qualitative
Analyse") über weitergehende
Messungen, beispielsweise aus Messungen der inneren Struktur der
Ionen, oder auch nur die Feststellung der Struktur, bei Biopolymeren
die Sequenz der unmodifizierten oder modifizierten Polymerbausteine
der Ionen einer Ionensorte überhaupt
(die „Strukturanalyse", „Sequenzanalyse", „Modifikationsanalyse" und dergleichen).
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Aufgabe der
Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, Verfahren und Geräte bereitzustellen, mit denen
aus sehr kleinen Probenmengen eine größere Anzahl von Substanzen
mit höchster
Empfindlichkeit sicher analysiert werden können.
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Kurze Beschreibung
der Erfindung
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Im
Verfahren der Erfindung werden zunächst alle Ionen einer Probe
(oder einer Teilprobe) erzeugt und in einem Speicherreservoir gespeichert.
Ist das Speicherreservoirs mit genügend vielen Ionen gefüllt, oder
ist die gesamte Probe ionisiert, wird die weitere Zufuhr von Ionen
unterbunden, um die Konzentrationsverhältnisse im Speicherreservoir
während
der kommenden Analysen der verschiedenen Substanzen der Probe nicht
zu verändern.
Bei Verwendung einer Ionenquelle, die außerhalb des Vakuums angeordnet
ist, kann beispielsweise dafür
die Einfuhröffnung
für die
Ionen, die auch Umgebungsgas in das Massenspektrometer einlässt, durch
eine besondere Einrichtung verschlossen werden. Es kann jedoch auch
genügen,
einfach eine weitere Ionisierung durch Abschaltung von Spannungen
zu beenden.
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Nach
Abschluss der Füllung
des Speicherreservoirs wird jetzt eine Elternionensorte ausgewählt, die
zuerst analysiert werden soll. Diese Elternionen werden nun durch
ein massenselektives Ionentor aus dem ersten Speicherreservoir exportiert,
ohne dabei andere Ionen des Speicherreservoirs zu vernichten. Es
sollen dabei möglichst
wenige andere Ionensorten mit exportiert werden, das heißt, der
exportierte Massenbereich soll möglicht
klein sein. Die exportierten Ionen werden dann in einer der üblichen
Weisen fragmentiert und die Fragmentionen in einem Massenanalysator
hoher Massenauflösung
und hohen Nutzgrades für
die Ionen durch die Aufnahme des Fragmentionenspektrums analysiert.
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Das
Verfahren kann sodann für
andere Ionensorten der ersten Analytsubstanz und für beliebig viele
Ionensorten der anderen Analytsubstanzen wiederholt werden, ohne
dass dafür
stets neue Ionen aus neuem Probenmaterial erzeugt werden müssen, wie
das bei heute üblichen
Tandem-Massenspektrometern der Fall ist. Andere Ionensorten der
gleichen Analytsubstanz können
Ionen mit anderem Ladungszustand, beispielsweise dreifach statt
zweifach geladene Ionen, andere Ionen der Isotopengruppe oder aber
auch Ionen anderer Verdaupeptide des Analytproteins sein. Aus den
Fragmentionenspektren können
letztendlich die Identitäten,
die Konzentrationen oder die Strukturen aller zu untersuchenden
Analytsubstanzen bestimmt werden. Für quantitative Bestimmungen
sollen sich nach den Regeln guter Laborarbeit unter den Analytsubstanzen
auch Referenzsubstanzen bekannter Art und Konzentration befinden,
die zur Konzentrationsbestimmung dienen, aber auch für die ständige Überprüfung des
Verfahrens verwendet werden können.
Das Verfahren soll zuvor für
die Analytsubstanzen kalibriert worden sein.
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Die
Ionen im Speicherreservoir bleiben bei entsprechender Konstruktion
des Vakuumsystems durchaus über
Zeiten von vielen Minuten hinweg fast unverändert, aber abhängig von
der Reinheit des Vakuumsystems und der Reinheit des zugeführten Dämpfungs-
und Stoßgases
lassen sich störende Veränderungen
der Ionen, hauptsächlich über teilweise
Entladungen von höher
geladenen Ionen, über längere Zeiten
in der Größenordnung
von halben oder ganzen Stunden hinweg nicht vollständig vermeiden.
Da jedoch das erfindungsgemäße Tandem-Massenspektrometer
für die
Analyse einer Vielzahl von Ionensorten eingesetzt werden soll, beispielsweise
für die
Analyse von 20 bis 200 Ionensorten, die zu etwa 5 bis 20 verdauten
Proteinen gehören
können,
ist hier ein schneller Massenanalysator zur Aufnahme der Fragmentionenspektren
durchaus günstig,
möglicherweise
sogar erforderlich. Ein Massenanalysator soll hier als „schnell" betrachtet werden,
wenn er etwa ein volles Fragmentionenspektrum pro Sekunde aufnehmen
kann. Es können
dann viele Analytsubstanzen in relativ wenigen Minuten analysiert
werden. Es ist auch günstig,
wenn der Massenanalysator ein hohes Massenauflösungsvermögen, beispielsweise R = m/Δm > 10 000, besitzt. Weiter
ist günstig,
dass er zur Aufnahme der Fragmentspektren einen hohen Massenbereich
besitzt, dass er beispielsweise Fragmentionenspektren über den
Bereich von etwa 50 bis 4000 atomaren Masseneinheiten aufzunehmen
gestattet.
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Das
erfindungsgemäße, neuartige
Tandem-Massenspektrometer besteht also mindestens aus (a) einer
Ionenquelle für
die Ionisierung der Probe, (b) einem Speicherreservoir für die Ionen
der Probe, (c) einer Einrichtung zur Beendigung der Füllung des
Speicherreservoirs, (d) einem Ionentor, das Ionen eines ausgewählten kleinen
Massenbereichs aus dem Speicherreservoir exportiert und alle anderen
Ionen unbeschädigt
im Speicherreservoir zurücklässt, (e) einer
Fragmentierungseinrichtung für
die exportierten Ionen und (f) einem Massenanalysator für die Aufnahme
des Massenspektrums der Fragmentionen. Der Massenanalysator soll
bei guter Massenauflösung
schnell sein und die angebotenen Ionen gut ausnutzen. Ein bevorzugter
Massenanalysator ist ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem
Ioneneinschuss.
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Das
Speicherreservoir kann auch mit Einrichtungen versehen sein, negative
Ionen einzuschießen
oder Reaktantgase verschiedener Arten zuzugeben, um durch Ionen-Ionen-Reaktionen oder durch
Ionen-Molekül-Reaktionen
bestimmte gewünschte
Veränderungen
der Ionenpopulation vor der Analyse der Analytsubstanzen vorzunehmen. Beispiele
für solche
Reaktionen sind Verminderungen der Ladungen an hoch geladenen Ionen
(„charge stripping"), oder Austausch
von Wasserstoff durch Deuterium.
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Als
Massenanalysatoren kommen zwar prinzipiell fast alle Arten von Massenspektrometern
in Frage, die eingangs als Massenanalysatoren für Tandem-Massenspektrometer
aufgeführt
wurden. Besonders günstig
sind aber hier Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss,
da sie eine schnelle Spektrennahme, eine hohe Massengenauigkeit,
einen hohen Massenbereich, eine gute Ausnutzung der Ionen („duty cycle") und einen hohen dynamischen
Messbereich bei vergleichsweise geringen Herstellungskosten bieten.
Relativ ungünstig sind
hingegen Quadrupol-Massenanalysatoren und magnetische Sektorfeld-Massenanalysatoren,
weil diese wiederum als Massenfilter arbeiten, jeweils nur eine
Ionensorte nach der anderen für
eine Messung ausfiltern und währenddessen
alle anderen Ionensorten vernichten.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
ein einfaches Schema eines Tandem-Massenspektrometers nach dieser
Erfindung, mit einer Nanoelektrosprüh-Ionenquelle (1, 2), einer
Einlasskapillare (3), einem Verschlussmechanismus (19)
für die
Einlasskapillare (3), einem Ionentrichter (4),
einem ersten Speicherreservoir (6), dessen Ende das Ionentor
bildet, mit einem koaxialen Lochblendenbündel (7, 8, 9),
deren erste Lochblende (7) für die Anregung der ausgewählten Ionensorte
für den
Export geschlitzt ist (in der schematischen Darstellung nicht sichtbar),
einem zweiten Speicherreservoir (10), das hier auch als
Stoßzelle
für die
Fragmentierung der exportierten Ionen dient, und einem Flugzeitmassenanalysator,
bestehend aus Linsensystem (11) zur Formung eines feinen
Ionenstrahls, Pulser (12), Reflektor (13) und
Ionendetektor (14).
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2 zeigt
einen Querschnitt durch das Ende des Speicherreservoirs (6)
mit vier Polstäben (21–24)
und vier Hilfselektroden (25–28).
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Die 3, 4 und 5 zeigen
Formen der ersten Lochblende am Ende des quadrupolaren Stabsystems,
wobei die Lochblende zur Anregung der ausgewählten Ionensorte geschlitzt
ist: in 3 ist die Blende kreuzförmig geschlitzt
für eine zirkumpolare Anregung,
in 4 und 5 ist sie einfach geschlitzt,
einmal für
eine klassische und einmal für
eine diagonale Anregung.
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Die 6 und 7 geben
Querschnitte durch Stabsysteme wieder, die durch Form (41)
oder Dislozierung (42) jeweils eines Polstabs das quadrupolare
Hochfrequenzfeld im Inneren jeweils mit einem hexapolaren Multipolfeld überlagern.
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8 gibt
einen Querschnitt durch ein Stabsystem wieder, das durch die Form
zweier Polstäbe
(43, 44) das quadrupolare Hochfrequenzfeld im
Inneren mit einem oktopolaren Multipolfeld überlagert.
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9 zeigt,
wie durch jeweils zwei zusammen geschaltete Hilfselektroden in einem
Stabsystem, das eine hexapolare Überlagerung
liefert (siehe 6), eine günstige dipolare Anregung mit
einer Anregungswechselspannung erzeugt wird.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
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Bevorzugte
Ausführungsformen
und Verfahren werden in den Ansprüchen 1 bis 21 dargelegt.
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Im
Unterschied zu J. W. Hager wird in dieser Erfindung eine Probe (oder
Teilprobe) vollständig
ionisiert und die Ionen werden in einem genügend großen Speicherreservoir gespeichert,
ohne dass während
der Analysenvorgänge
für die
verschiedenartigen Bestandteile der Probe weitere Ionen in das Speichereservoir
eingelassen werden. Bei J. W. Hager wird es geradezu als Vorteil
angesehen, während der
Analyse weitere Ionen in das Volumen einströmen lassen zu können.: „Thus,
ions can be mass selectively ejected at the exit end at the same
time as ions are being admitted into the entrance end of the rod
set, thereby taking better advantage of the ion flux from a continuous
ion source". (Zitiert
aus der Zusammenfassung des Patentes).
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Das
Ionentor wird in der hier vorliegenden Erfindung nur für die selektierende Überführung der Ionen
in ein nächstes
Speicherreservoir verwendet. Für
die massenspektrometrische Aufnahme der Fragmentionen wird in dieser
Erfindung ein Massenanalysator bevorzugt, der für diese Aufgabe wesentliche
Eigenschaften besitzt, wie Schnelligkeit der Spektrenaufnahme, Massenauflösung, hoher
Massenbereich und insbesondere eine hohe Massengenauigkeit in der
Größenordnung
von wenigen Millionsteln der Masse (ppm). Vorzugsweise wird ein Flugzeitmassenanalysator
mit orthogonalem Ioneneinschuss verwendet.
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Das
Speicherreservoir kann in verschiedenen Formen gebaut werden, wobei
stets der größte Teil
der Wände
eine Struktur aus Elektroden besitzt, an denen die beiden Phasen
einer Hochfrequenzspannung ein Pseudopotential aufbauen, das Ionen beider
Polaritäten
abstößt und damit
in dem Speicherreservoir einsperren kann. Die Grundlagen für ein solches
Speicherreservoir sind in Patent
US 5,572,035 A angegeben (J. Franzen). Ein
Teil der Wände
kann auch Elektroden mit einem Ionen abstoßendem Gleichspannungspotential
tragen, dann sind aber nur Ionen einer einzigen Polarität speicherbar. Diese
Einschränkung
ist aber nicht nachteilig, da gleichzeitig gespeicherte Ionen verschiedener
Polarität
nur miteinander reagieren und sich so weitgehend gegenseitig vernichten
würden.
Besonders günstig sind
hier relativ einfache Speicherreservoire, die seit langem bekannt
sind und als Hexapol- oder vorzugsweise als Quadrupol-Stabsysteme
mit endständigen koaxialen
Lochblendensystemen aufgebaut sind. Die günstigste Form des Speicherreservoirs
hängt weitgehend
von der Art des verwendeten Ionentors ab.
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Es
gibt verschiedene Arten massenselektiver Ionentore. Sie basieren
in der Regel auf einer zumindest anfänglichen resonanten dipolaren
Anregung der Ionen zu schwingenden Bewegungen, bedingen also eine
Kammer, in der die Ionen durch rücktreibende
Zentralkräfte
Oszillationen ausführen können. So
können
beispielsweise die ausgewählten Elternionen
aus einem Quadrupol-Stabsystem, das als erstes Speicherreservoir
fungiert, durch resonante dipolare Anregung ihrer sekularen Schwingungen in
radialer Richtung aus Schlitzen in den Polstäben massenselektiv ausgeworfen,
in einem Ionentrichter eingefangen und zu einer Fragmentierungskammer weitergeleitet
werden. Dieser Auswurf führt
allerdings zu hohen kinetischen Energien der ausgeworfenen Ionen.
In ähnlicher
Weise können
Ionen aus einer dreidimensionalen Ionenfalle mit Ringelektrode und
zwei Endkappenelektroden massenselektiv ausgeworfen werden, ohne
die restlichen Ionen zu beschädigen.
Dieser massenselektive Export von Ionen ist die Grundlage aller
Massenanalyse mit Ionenfallen.
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Eine
prinzipiell andere Art eines solchen massenselektiven Ionentors
basiert wiederum auf einem Quadrupolfeld zwischen vier Polstäben, exportiert
die ausgewählten
Elternionen aber axial in ein zweites Speicherreservoir, siehe J.
W. Hager, oben zitiert. Diese Art von Ionentor beruht grundsätzlich auf
dem Vorhandensein dreier Charakteristika: erstens muss lokal eine
Schwächung
im axialen Verlauf dieses hochfrequenten Quadrupolfeldes vorliegen, die
zwangsweise mit axialen Kraftkomponenten des damit generierten Pseudopotentials
verbunden ist, zweitens muss eine Einrichtung zur resonanten Anregung
der ausgewählten
Ionensorte in radialer Richtung vorhanden sein und drittens muss
eine schwache Gleichspannungsbarriere quer zur Achsenrichtung das
Durchtreten der Ionen aus dem ersten Speicherreservoir in das zweite
verhindern, so lange die Ionen nicht zusätzlich Energie erhalten.
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Die
lokale Schwächung
des Quadrupolfeldes kann beispielsweise durch eine eng lokalisierte Änderung
im Querschnitt des Stabsystems, beispielsweise durch Einfräsungen,
Kerben oder Löcher
in den Polstäben,
besonders einfach aber durch das Streufeld am Ende des Stabsystems
gebildet werden. Hier kann eine Ionenlinse aus Lochblenden die Gleichspannungsbarriere
formen. Ist beispielsweise die erste Lochblende dieser Lochblendenlinse
quergeteilt, so kann durch sie auch die radiale Anregung der Elternionen
erfolgen. In anderen Ausbildungen kann sowohl die Gleichspannungsbarriere
wie auch die dipolare Anregung durch Hilfselektroden zwischen den
Polstäben
des Quadrupolsystems bewirkt werden.
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Am
Ort einer zunehmenden Schwächung des
Quadrupolfeldes in seinem axialen Verlauf, beispielsweise am Ende
des Polstabsystems, gibt es außerhalb
der Achse axiale Komponenten des Pseudopotentialgradientens (des
elektrischen Pseudofeldes). Werden die ausgewählten Elternionen an diesem
Ort radial resonant angeregt, so erleben sie bei einer Vergrößerung ihrer
radialen Oszillationen zunehmend die axial nach außen gerichtete
Kraft der axialen Komponente des Pseudofeldes, durch die sie eine
axial gerichtete Beschleunigung erhalten, dadurch die Gleichspannungsbarriere überwinden
und in das zweite, anschließende
Speicherreservoir eintreten können.
Bei kontinuierlichem Betrieb der radialen Anregung werden somit
die ausgewählten
Elternionen kontinuierlich in das zweite Speicherreservoir transportiert,
wobei ihre Konzentration im ersten Speicherreservoir vor dem Ionentor
kontinuierlich abnimmt. Die Diffusion der Ionen in axialer Richtung sorgt
für ständigen Nachschub.
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Es
werden weiter unten verschiedene Ausführungsformen dieses axial wirkenden
Ionentors diskutiert, die sich durch die Art der radialen Anregung
der ausgewählten
Ionensorte und durch verschiedenartige Ausbildungen des Polstabsystems unterscheiden.
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Da
die Kapazität
eines jeden Ionenspeichers begrenzt ist und durch hohe Raumladungen
weiträumige
Entmischungen von Ionen verschiedener ladungsbezogener Massen stattfinden,
wodurch eine konzentrationstreue Entnahme von Ionen erschwert wird,
kann das erste Speicherreservoir auch eine Einrichtung besitzen,
vorbekannte (oder vorher gemessene) Ionensorten besonders hoher
Häufigkeit,
aber ohne Interesse für
die analytische Aufgabe, zu entfernen. Damit wird der dynamische
Messbereich dieses neuartigen Tandem-Massenspektrometers erhöht.
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
des ersten Speicherreservoirs (6) verwendet ein etwa 20 Zentimeter
langes quadrupolares Stabsystem aus vier einfachen Rundstäben (21, 22, 23, 24)
mit einem Scheitelabstand von etwa zwei Zentimetern. Hyperbolisch
geformte Stäbe
sind ebenfalls möglich,
aber nicht unbedingt erforderlich. An den Enden des Polstabsystems
(6) befinden sich Bündel
koaxialer Lochblenden (5; 7, 8, 9),
die mit Gleichspannungen belegt werden können und so die Ionen einer
gewünschten
Polarität
durch Gegenspannungen im Inneren des Stabsystems (6) halten
können.
Die Kammer um das Stabsystem herum ist durch einen Vorratsbehälter (18)
mit einem nichtreaktiven Dämpfungsgas
befüllt,
beispielsweise mit Helium, doch sind auch andere leichte Dämpfungsgase
möglich, wie
etwa Reinststickstoff. Bei einem Druck im quadrupolaren Speicherreservoir
(6) von etwa 10–2 Pascal werden sämtliche
Bewegungen eingefüllter
Ionen einschließlich
ihrer Oszillationen quer zur Achse innerhalb von wenigen Millisekunden
so gedämpft, dass
sich die Ionen in der Längsachse
des Stabsystems (6) sammeln. Sie frieren jedoch nicht völlig ein, sondern
bewegen sich immer noch mindestens mit thermischen Energien und
vermischen sich ständig zumindest
in axialer Richtung durch diese Diffusionsbewegungen.
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Der
optimale Querschnitt des quadrupolaren Stabsystems (6)
für das
Speicherreservoir hängt sehr
stark von der genauen Art des verwendeten Ionentors ab und kann
nur zusammen mit der Funktion dieses Ionentors diskutiert werden.
In den 2, 6, 7 und 8 sind
verschiedenartige Querschnitte gezeigt.
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Es
ist seit langem bekannt, dass sich Ionen in dreidimensionalen Ionenfallen
aus Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, aber auch in anderen
Formen von Ionenspeichern über
längere
Zeiten (viele Minuten) ohne wesentliche Verluste speichern lassen,
wenn auch nach noch längeren
Zeiten leichte Veränderungen
der Ionen, insbesondere Verringerungen der Ionenladungen, zu beobachten
sind. Für einen
Hexapolspeicher im Ultrahochvakuum-Bereich eines FTICR-Massenspektrometers
siehe dazu beispielsweise: „A
Gated-beam Electrospray Ionization Source with an External Ion Reservoir.
A New Tool for the Characterization of Biomolecules Using Electrospray
Ionization Mass Spectrometry",
Steven A. Hofstadler et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, 1971–1979 (1999).
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Ein
voluminöses
quadrupolares Stabsystem (6) kann bis zum Überlauf
etwa 108 bis 1010 Ionen aufnehmen.
Es ist jedoch nicht zweckmäßig, so
viele Ionen einzufüllen,
da sich die Ionen dann im Inneren großräumig radial entmischen und
so eine konzentrationsproportionale Entnahme erschweren. Leichte Ionen
sammeln sich in der Achse, schwere Ionen werden durch die Raumladung
weit nach außen
gedrängt,
weil die rücktreibenden
Pseudokräfte
des quadrupolaren Hochfrequenzfeldes für diese schwereren Ionen kleiner
sind als für
leichtere Ionen. Die Anzahl der Ionen sollte daher auf etwa 106 bis maximal 108 Ionen
beschränkt
werden. Eine Anzahl von etwa 107 Ionen kann
sich bei genügender
Länge des Polstabsystems
in einer fadenförmigen
Wolke von nur wenig mehr als etwa einem Millimeter Durchmesser in
der Achse des Polstabsystems sammeln, womit die Ionen aller ladungsbezogenen
Massen mit etwa gleicher Wahrscheinlichkeit entnommen werden können. Die
leichten Ionen befinden sich zwar auch hier innen, sehr achsennah,
und die schwereren Ionen außen;
alle Ionen aber können
relativ gut durch ein dipolares Anregungsfeld erfasst und resonant
zu Oszillationen quer zur Achse angeregt werden.
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Das
Speicherreservoir soll mit einen Dämpfungsgas im Druckbereich
von etwa 10–4 bis
1 Pascal, vorzugsweise etwa 10–2 Pascal, betrieben
werden, um die gespeicherten Ionen in ihrer Bewegung zu dämpfen. Als
Dämpfungsgas
kommen beispielsweise Edelgase wie Helium oder Argon, aber auch Reinststickstoff
zur Anwendung. Diese niedermolekularen oder sogar edlen Gase können nicht
mit den Ionen reagieren, da ihre Reaktionsaffinitäten, besonders
auch ihre Protonenaffinitäten,
zu gering sind. Das Dämpfungsgas
und das zugrunde liegende Ultrahochvakuum müssen jedoch frei von Substanzdämpfen höheren Molekulargewichts
sein, da diese mit den gespeicherten Ionen in vielfältiger Weise
reagieren können.
Die häufigste
Reaktionsweise ist dabei die Protonenübertragung von mehrfach positiv geladenen
Analytionen auf die Verunreinigungsmoleküle. Dabei wird der Ladungszustand
der Analytio nen verringert; es findet so genanntes „Charge
Stripping" statt.
Dabei ist die Entstehung neuer Ionen der Verunreinigungssubstanzen
nicht so schädlich
wie die Verringerung der Konzentration der höher geladener Analytionen,
die gerade als Elternionen für
die Fragmentierung sehr günstig
sind. Das Vakuumsystem muss daher nach den Regeln von Ultrahochvakuum-Systemen
(UHV) aus entsprechenden Materialien wie Metall und Keramik und
mit entsprechenden Reinigungsmethoden gefertigt sein. Wird Helium
als Dämpfungsgas
verwendet, so ist es in der Regel äußerst rein; es müssen aber
die Zuleitungen und Druckminderer entsprechend sauber verlegt und
gereinigt sein.
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Ionen
der gleichen Polarität
können
untereinander nicht reagieren, weil sie sich gegenseitig durch ihre
Ladung abstoßen;
sie können
sich daher wegen ihrer relativ geringen kinetischen Energie nicht
auf solch kurze Abstände
nähern,
wie sie für chemische
Reaktionen unabdingbar notwendig sind. Es sind also nur Reaktionen
mit Ionen anderer Polarität
oder mit Neutralteilchen möglich.
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Zwischen
den vier Rundstäben
(21–24)
können
in einer günstigen
Ausführungsform
jeweils draht- oder schneidenförmige
Elektroden (25–28)
angebracht sein. Diese Elektroden werden im Weiteren als „Hilfselektroden" bezeichnet; sie
können
insbesondere in Längsrichtung
in verschiedene getrennte, voneinander isolierte Abschnitte eingeteilt
sein oder auch nur bestimmte Abschnitte überdecken. Durch Anlegen verschiedener
Gleich- und Wechselspannungen an diese Hilfselektroden oder durch
Spannungsabfälle
an verschiedenen Hilfselektrodenabschnitten längs der Achse können verschiedenartige Effekte
erzielt werden: Es kann beispielsweise eine Gleichspannungsbarriere
errichtet werden, oder es kann die Ionenwolke im Inneren umgerührt oder
in Längsrichtung
bewegt werden. Es können
vorgewählte
Ionensorten durch dipolar angelegte Wechselspannungen an zwei gegenüberliegenden
Hilfselektroden (zum Beispiel 25 und 27) angeregt
werden, beispielsweise, um sie durch ein Ionentor zu exportieren,
aber auch, um unerwünschte
Ionen aus dem Reservoir quer zur Achse auszuwerfen. Ein solches Auswerfen
von Ionen ist günstig,
wenn das Ionengemisch vorwiegend aus einigen wenigen Ionensorten besteht,
die jedoch analytisch nicht interessieren, aber den wesentlichen
Teil der Raumladung bilden. Der Auswurf aller Ionen dieser wenigen
hochkonzentrierten Ionensorten ermöglicht es, das Ionenreservoir
(6) mit den analytisch interessierenden Ionen zu füllen, so
dass auch Ionen sehr geringer Konzentration gemessen werden können.
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Das
Speicherreservoir wird vorzugsweise durch ein koaxiales Lochblendensystem
(5) an einer Stirnseite mit Ionen aus einer Ionenquelle
(1, 2) befüllt.
Die Ionenquelle kann sich innerhalb oder auch außerhalb des Vakuumsystems befinden.
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Besonders
günstig
ist hier eine besondere Abart einer Elektrosprüh-Ionenquelle, die sich Nanoelektrosprüh-Ionenquelle
nennt und außerhalb
des Vakuumsystems arbeitet (
US
5,504,329 , M. Mann und M. Wilm). Diese Ionenquelle wird
mit wenigen Mikrolitern einer gelösten Probe beschickt, die sich
in einer winzigen, zu einer feinen Spitze ausgezogenen Kapillare
(
2) befinden. Die Spitze hat eine Öffnung von nur etwa vier Mikrometer
Durchmesser. Eine elektrische Sprühspannung von etwa einem Kilovolt zieht
die Flüssigkeit
zu einem Taylor-Konus aus, von dessen Spitze aus ein kontinuierlicher
Strom kleinster, geladener Tröpfchen
fortfliegt. Diese Tröpfchen werden
in einem warmen bis heißen
Gegenstrom aus reinem Umgebungsgas, beispielsweise Reinststickstoff,
getrocknet. Es bleiben nach dem Trocknen der Mikrotröpfchen in
der Regel mehrfach geladene Ionen der gelösten Substanzen zurück. Diese
Ionen werden in üblicher
Weise in das Vakuumsystem eingeführt,
beispielsweise können
sie durch eine Einlasskapillare (
3) mit umgebendem Reinststickstoff
ins Vakuum gesaugt werden. Sie werden im Vakuumsystem in mehreren
differentiellen Pumpstufen vom eingesaugten Umgebungsgas befreit
und im Ionenreservoir gespeichert. Für die Abtrennung vom Umgebungsgas
können
insbesondere Ionentrichter (
4) (
US 6,107,628 , R. D. Smith und S. A.
Shaffer) verwendet werden. Es können
mit einer solchen Einrichtung etwa 10
6 Ionen
pro Sekunde in das Speicherreservoir eingespeichert werden. Eine
optimale Füllung
kann also in etwa 10 bis 100 Sekunden vollendet werden, vorausgesetzt,
dass aus dem Speicherreservoir nicht ständig uninteressante Ionen zur
Erhöhung
der Messdynamik wieder ausgeworfen werden.
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Nach
der Befüllung
des Speicherreservoirs wird der Zustrom weiterer Ionen unterbunden,
um für die
nachfolgenden Analysen keine Änderungen
der Konzentrationen zu erleben. Dieser Schritt ist ein wesentlicher
Teil der Erfindung. Die Unterbindung des Zustroms findet automatisch
statt, wenn die Probe vollständig
verbraucht ist, kann aber beispielsweise auch einfach durch ein
Absenken der Sprühspannung
der Nanoelektrosprüh-Ionenquelle
erreicht werden. Günstiger
ist es allerdings, durch ein Verschließen der Einlasskapillare (3)
durch eine besondere Verschlusseinrichtung (19) auch den
Zustrom von Umgebungsgas (etwa Reinststickstoff) und damit den Zustrom
von Spurenverunreinigungen zu unterbinden. Der Reinststickstoff
ist dann im Inneren des Massenspektrometers in wenigen Sekunden
abgepumpt. Es kann dann beispielsweise im Inneren des Massenspektrometers
mit sehr sauberen Helium als Stoß- und Dämpfungsgas gearbeitet werden,
unabhängig
von der Wahl des Umgebungsgases der Nanoelektrosprüh-Ionenquelle.
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Selbstverständlich können hier
auch andere Arten von Ionenquellen innerhalb oder außerhalb
des Vakuumsystems, unter anderem auch MALDI, verwendet werden. Jedoch
ist die Verwendung des Nanoelektrosprühens (1, 2)
besonders vorteilhaft, weil sie eine hohe Ausbeute an Ionen pro
eingesetztem Molekül
und einen hohen Anteil an mehrfach geladenen Ionen der Substanzen
liefert. Diese mehrfach geladenen Ionen eignen sich besonders gut
für eine gleichmäßige und
informationsreiche Bildung von Fragmentionen.
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Die
Ionen können
in diesem ersten Speicherreservoir (6) in vielfältiger Weise
für die
weitere Analyse präpariert
werden. So können
besonders häufige
Ionensorten die für
die analytische Aufgabe uninteressant sind, wie oben bereits angedeutet,
aus dem Speicher ausgeworfen werden. Das kann beispielsweise durch
eine starke resonante Anregung durch die oben geschilderten Hilfselektroden
(25–28)
geschehen. Es kann aber auch durch eine resonante Anregungsspannung
geschehen, die an zwei einander gegenüberliegende Polstäbe (zum
Beispiel 21, 23) selbst gelegt wird. Diese Ionen
können
aber schließlich
auch durch das Ionentor selbst entfernt werden. Das Entfernen kann
bereits während
der Befüllung
vorgenommen werden, um es gar nicht erst zu einer Überfüllung des
Reservoirs kommen zu lassen.
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Manchmal
sind reaktive Veränderungen
der Ionen im Speicherreservoir wünschenswert.
Sie können
im Speicherreservoir vorgenommen werden, indem entsprechende Reaktantgase
willkürlich
eingeführt
werden. Ein Beispiel dazu ist ein Austausch von Wasserstoffatomen
der Ionen durch Deuteriumatome; aber auch vielfältige Arten von Derivatisierungen der
Ionen mit chemischen Gruppen sind möglich. Durch das Einführen von
Ionen entgegen gesetzter Polarität
ist es möglich,
den Ladungszustand hoch geladener Ionen zu verringern („Charge
stripping"), also
beispielsweise fünf-
bis zwanzigfach geladene positive Ionen durch den Einschuss von
negativen Ionen, die Protonen aufnehmen können, auf zwei bis drei Ladungen
pro Ion zu reduzieren. Werden negative Ionen eingelassen, die leicht
Elektronen abgeben, so können
große,
mehrfach positiv geladene Proteine bereits in diesem Speicherreservoir
durch „Electron
Transfer Dissociation" gespalten
werden. Die Ionen der anderen Polarität können beispielsweise aus einer
entsprechend gewählten
Materiallösung
durch die gleiche Elektrosprüh-Ionenquelle
(1, 2) mit entgegengesetzt gepolter Sprühspannung
erzeugt und in analoger Weise durch den Ionentrichter (4)
und das Lochblendenbündel
(5) in das Speicherreservoir (6) eingebracht werden
und dort reagieren, auch wenn das Speicherreservoir für die dauerhafte
Speicherung von Ionen dieser Polarität nicht eingerichtet ist..
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Eine
bevorzugte Ausführungsform
eines Ionentors verwendet das Streufeld am Ende des quadrupolaren
Speicherreservoirs (6) für die Bereitstellung der axialen
Komponenten des Pseudofeldes, das zum Export ausgewählter Elternionen
in ein anschließendes
zweites Speicherreservoir dient. Am Ausgang des Stabsystems des
ersten Speicherreservoirs befindet sich für gewöhnlich eine Ionenlinse aus
koaxial angeordneten Lochblenden (7, 8, 9),
an denen Gleichspannungen liegen, die die ausgangsseitige Potentialbarriere
formen. Diese Potentialbarriere hält die gedämpften Ionen innerhalb des
ersten Speicherreservoirs (6). Solange das Speicherreservoir
(6) befüllt
wird, und die Ionen noch höhere
kinetische Energien besitzen, wird diese Potentialbarriere durch
höhere
Spannungen unüberwindbar
gemacht. Nach vollständiger
Befüllung
des Speicherreservoirs und nach Dämpfung der Ionen werden die
Linsenspannungen erniedrigt, so dass diese Potentialbarriere dann
in der Mitte einen relativ niedrigen Überlauf hat, der aber immer
noch die in ihrer Bewegung gedämpften
Ionen des Speicherreservoirs zurückhält. Durch
diesen Überlauf
im Lochblendensystem (7, 8, 9) können die
Ionen exportiert werden, aber nur, wenn sie durch eine axial wirkende
Kraft eine entsprechende kinetische Energie zur Überwindung der Potentialbarriere
erhalten.
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Im
Inneren des Polstabsystems (6) ist das quadrupolare Hochfrequenzfeld überall längs der Achse
im Querschnitt völlig
identisch geformt. Die lokale Verringerung der Stärke im Streufeld
am Ende des Polstabsystems (6) führt zu einer axialen Komponente
des elektrischen Hochfrequenzfeldes und damit zu einer axialen Feld-
oder Kraftkomponente des Pseudopotentials, die im Inneren des Stabsystems nicht
existiert. Diese axiale Kraftkomponente ist abhängig vom Radius; sie ist in
der Achse nicht vorhanden, steigt aber mit dem Radius zunehmend
nach außen
an. Das führt
dazu, dass radial angeregte Ionen mit der Vergrößerung ihrer Schwingungsweite
zunehmend die axial nach außen
wirkende Kraftkomponente des Pseudopotentials im hochfrequenten Streufeld
spüren,
axial nach außen
getrieben werden und in Achsenrichtung die Gleichspannungspotentialbarriere
des Linsensystems (7, 8, 9) überwinden können. Die
Ionen werden axial in die nächste
Kammer (das zweite Speicherreservoir 10) exportiert. Dazu
muss nur die Potentialbarriere genügend tief eingestellt werden,
so dass sie von den Ionen unter der Kraft der axialen Komponente
des Pseudopotentials überwunden
werden kann. Alle restlichen Ionen bleiben im ersten Speicherreservoir
(6). Sie können später ebenfalls
massenselektiv zu einer eigenständigen
Analyse ihrer Konzentration ausgeworfen werden.
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Es
lassen sich mit dieser Art von Ionentor durchaus sehr gute Massenauflösungsvermögen für den massenselektiven
Ionenexport erzielen. Das dazu notwendige langsame Ausfließen der
Ionen der eingestellten Exportmasse stört nicht sonderlich, da das
Ausfließen
im Wesentlichen durch die recht langsame Ionendiffusion für den Nachschub
bestimmt wird. Um den weit überwiegenden
Teil der eingestellten Ionensorte ausfließen zu lassen, sind einige
Hundert Millisekunden erforderlich. Es lassen sich dann Massenauflösungsvermögen der
Selektion von R = 5000 bis R = 10 000 erreichen. Das reicht für die Abtrennung
von Ionen einer nominalen Masse von Ionen der nächsten nominalen Masse.
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Normalerweise
kommt in der Tandem-Massenspektrometrie eine solch hohe Massenauflösung für die Selektion
nicht zur Anwendung, da es erwünscht
ist, dass alle Ionen einer Isotopengruppe fragmentiert werden. Nur
dann ist eine Isotopenverteilungstreue auch im Fragmentionenspektrum
zu erhalten. Eine solch hohe Massenauflösung kann aber sehr zweckmäßig sein,
beispielsweise, wenn durch die Auswahl der monoisotopischen Ionen
einer Ionensorte auch nur monoisotopische Fragmentionen erzeugt
und gemessen werden sollen (Näheres
dazu siehe unten). Gerade bei komplexen Gemischen kann das für die eindeutige
Erkennung einer Substanz sehr hilfreich sein. Soll dagegen eine
Isotopenverteilungstreue auch im Fragmentionenspektrum erhalten
bleiben, so können
die verschiedenen Ionen der Isotopengruppe auch nacheinander exportiert und
im zweiten Speicherreservoir wieder gemischt werden.
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Der
Nachschub an Ionen für
den Export durch das Ionentor kann aber auch gegenüber der reinen
Diffusionsbewegung beschleunigt werden. Werden beispielsweise für die radiale Anregung
der selektierten Ionen die oben beschriebenen Hilfselektroden verwendet,
so können
die selektierten Ionen im ganzen Speicherreservoir gleichmäßig zu Oszillationen
angeregt werden. Weiter unten wird beschrieben, wie es möglich ist,
die Amplitude dieser Oszillationen zu begrenzen. Jetzt kann man
an verschiedene Hilfselektrodenabschnitte eine Gleichspannung so
anlegen, dass im Inneren des Speicherreservoirs ein leichter Spannungsabfall
erzeugt wird, der Ionen in Richtung auf das Ionentor vorwärts treibt.
Es braucht sich hier nur Spannungsabfälle in Höhe von wenigen Zehnteln Volt
bis zu maximal einigen Volt zu handeln. In der Achse des Speicherreservoirs
wird dabei kein Spannungsabfall entstehen, da sich die gesamte Ionenwolke
so verschiebt, dass sich jeder Spannungsabfall durch Raumladung
ausgleicht. Außerhalb
der Achse können
aber die Ionen den Spannungsabfall fühlen; sie werden zum Ionentor
getrieben. Schwingen nun die ausgewählten Ionen durch die Achse
bis in Regionen außerhalb
der stationären Ionenwolke,
so erleben sie hier den Spannungsabfall und werden zum Ionentor
getrieben.
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Für die endständige Ausführungsform
des Ionentors gibt es eine ganze Reihe von verschiedenartigen Unterarten,
die sich durch die Einrichtung zur dipolaren Anregung der ausgewählten Elternionen und
durch die Ausformung des Polstabssystems unterscheiden und die hier
im Einzelnen kurz diskutiert werden sollen.
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Ausführungsform 1: Anregung durch
geteilte Linsenblende.
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Die
Lochblende des Linsensystems, die den Polstäben zugewandt ist, kann einfach
oder kreuzweise quer geteilt sein und zusätzlich zum Gleichspannungspotential
mit einer dipolar oder zirkumpolar wirkenden Wechselspannung versorgt
werden. Sie kann somit für
die radiale Anregung der zu exportierenden Elternionen verwendet
werden. Hier gibt es drei verschiedene Formen der Anregung:
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Ausführungsform 1a: Anregung in
der Ebene durch zwei Polstäbe
des Speicherreservoirs („klassische Anregung").
-
Hier
hat der Schlitz der Lochblende eine Ausrichtung, die parallel zur
Richtung zwischen zwei gegenüber
liegenden Polstäben
(22) und (24) ist, wie in 4 gezeigt.
Diese Form der geteilten Lochblende mit den Hälften (29) und (30)
führt zu
einer Anregung der Ionen in einer Ebene, die durch die zwei gegenüber stehenden
Polstäbe
(21) und (23) aufgespannt ist. Diese Anregung
ist ausreichend für
einen massenselektiven Ionenexport, aber es ist nicht die optimale
Anregung.
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Ausführungsform 1b: Anregung in
der Ebene durch die Lücke
mitten zwischen den Polstäben
des Speicherreservoirs („diagonale
Anregung").
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Diese
Form der Anregung hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber der
oben beschriebenen klassischen Anregungsweise. Es wird hier wiederum
eine zweigeteilte Lochblende (31, 32) benutzt, doch
liegt der Schlitz der Querteilung jetzt in der Richtung der gegenüber liegenden
Lücken
zwischen je zwei nebeneinander liegenden Polstäben, wie in 5 sichtbar.
Bei dieser Art der Anregung werden die Ionen auf eine Schwingungsbahn
gebracht, bei der die durch die Hochfrequenzspannung an den Polstäben (die „Treiber-Hochfrequenz") eingeprägten Zwangsschwingungen
der Ionen nicht in der Ebene der Sekularschwingungen, sondern senkrecht
dazu stattfinden. Hierdurch wird bewirkt, dass im Streufeld die
nach außen
wirkenden Pseudokräfte
bereits bei kleineren Schwingungsamplituden als bei der klassischen
Anregung erreicht werden. Damit wird der Export der Elternionen
erleichtert, der Export findet bei kleineren Amplituden statt.
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Ausführungsform 1c: Zirkumpolare
Anregung.
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Für diese
Art der Anregung ist es notwendig, die erste Lochblende wie in 3 kreuzweise
zu schlitzen und eine vierphasige Anregungswechselspannung zu verwenden.
Die vier Phasen der Anregungswechselspannung sind jeweils um 90° gegeneinander
verschoben und werden reihum an die vier Blendenviertel (33, 34, 35, 36)
angelegt. Die ausgewählten
Elternionen werden dann resonant zu Kreisbahnen kleiner Amplitude,
also kleinem Radius, angeregt. Hier werden die Pseudokräfte, die
zum Export der Elternionen über
die Potentialbarriere hinweg genügen,
bereits bei sehr kleinen Auslenkungen aus der Achse erreicht.
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Ausführungsform 2: Anregung durch
Hilfselektroden, die sich zwischen den Polstäben des Speichereservoirs befinden.
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Die
ausgewählten
Elternionen brauchen nicht durch geteilte Lochblenden angeregt zu
werden; sie können
auch durch die Hilfselektroden (25, 26, 27, 28)
angeregt werden, die sich wie in 2 gezeigt
in den Lücken
zwischen den Polstäben
(21, 22, 23, 24) befinden. Die
radiale, lang anhaltende Anregung der ausgewählten Elternionen birgt aber
immer die Gefahr einer Fragmentierung, wenn sie zu stark vorgenommen
wird, das heißt,
wenn sie zu großen
und schnellen Schwingungsamplituden führt. Eine Fragmentierung im
Speicherreservoir (6) ist aber unbedingt zu vermeiden,
da sie mit einer Verfälschung
der Konzentrationsverhältnisse
einhergeht. Nur bei kleinen Schwingungsweiten sind die Geschwindigkeiten
für eine
gegebene Ionensorte langsam, und nur bei langsamen Stößen mit
dem Dämpfungsgas
bleiben die Stöße elastisch,
nehmen also keine innere Energie auf.
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Ausführungsform 2a: Begrenzte Länge der
Hilfselektroden.
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Die
Hilfselektroden können
die Anregung zwar prinzipiell in der gesamten Länge des Speicherreservoirs
vornehmen, für
manche Anwendungen ist es aber günstiger,
die Anregung nur an längs
geteilten Hilfselektroden im endständigen Teil des Speicherreservoirs
vorzunehmen. Die Hilfselektroden dieses Abschnitts brauchen dabei
nur eine Län ge von
etwa 10 bis 20 Millimetern zu haben. Die Einschränkung der Anregung auf ein
kleines Volumen des Speicherreservoirs ist hier bereits hilfreich
gegen ein Fragmentierung. Diese dipolare Anregung darf trotzdem
nur sehr vorsichtig vorgenommen werden, da im Prinzip die Amplituden
der angeregten Ionen in Resonanz immer weiter steigen und nur durch
Stöße mit dem
Dämpfungsgas
gebremst werden. Es muss also ein kritisches Gleichgewicht zwischen
Anregung und Dämpfung
eingestellt werden.
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Die
schwingenden Elternionen bleiben nicht ortsfest an einer Stelle,
sondern wandern statistisch umher: kommen sie dabei in die Nähe des Endes
des Polstabsystems, so erleben sie die nach außen gerichteten Kräfte des
Pseudopotentials und werden exportiert. Sie fließen also allmählich aus
dem Speicherreservoir aus. Das statistische Umherwandern (die Diffusion)
wird durch die elastischen Stöße mit dem
Dämpfungsgas
unterstützt.
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Diese
Art der Anregung ist eigentlich nur dann günstig, wenn die Ionen sehr
langsam im Quadrupolfeld schwingen, wenn es sich also um sehr schwere
Ionen handelt und wenn das Quadrupolfeld sehr kleine Spannungen
hat. Es ist daher für
diesen Betrieb günstig,
mit den schwersten Elternionen, die zu analysieren sind, zu beginnen.
Dann werden die nächst
schweren Ionen analysiert. Im Verlaufe der folgenden Analysen kann
dabei auch stufenweise die Hochfrequenzspannung erniedrigt werden,
um immer sehr langsam schwingende Elternionen zu exportieren. Man
kann sogar so vorgehen, dass immer die gleiche, relative langsame
Anregungsfrequenz eingestellt bleibt, und dass die Auswahl der anzuregenden
und zu exportierenden Ionen durch die Stärke des Hochfrequenzfeldes
getroffen wird.
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Ausführungsform 2b: Begrenzung der
Schwingungsamplituden durch ein überlagertes
Hexapolfeld.
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Wird
für das
Polstabsystem des Speicherreservoirs eine Querschnittsform gewählt, die
dem Quadrupolfeld ein relativ starkes Hexapolfeld überlagert
(siehe 6 und 7), so werden die Sekularschwingungen
der Ionen auf Grenzamplituden beschränkt. Das Hexapolfeld bewirkt,
dass die Sekularfrequenz der schwingenden Ionen von ihrer Amplitude
abhängig,
und zwar mit steigender Amplitude kleiner wird. Da mit zunehmender
resonanter Anregung die Amplitude zunimmt, verschiebt sich die Sekularfrequenz
der schwingenden Ionen und die Ionen fallen schnell aus der Resonanz.
Ihre Amplitude wird nicht mehr größer. Hat sich die Phase der
Anregungsfrequenz dann um mehr als 90° gedreht, findet sogar eine
Verkleinerung der Schwingungsamplitude statt, bis wieder der Zustand
einer resonanten Vergrößerung erreicht
wird. Die Schwingungen der resonant angeregten Elternionen haben
also begrenzte Amplituden, deren Größe von der Stärke des überlagerten
Hexapolfeldes, also von der Form und Positionierung der Polstäbe abhängt, wie
in 5 und 7 dargestellt. Wandern die angeregten
Ionen nun in das Streufeld am Ende des Polstabsystems, so sehen
sie kurzzeitig ein schwächeres
radiales Pseudopotential, welches sie wieder in Resonanz bringt
und ihre Amplituden kurzzeitig vergrößert. Sie werden aber unmittelbar
darauf durch die wachsende axiale Komponente des Pseudopotentials
in das zweite, anschließende
Speicherreservoir exportiert. Es ist hier zweckmäßig, ein relativ starkes Hexapolfeld
zu überlagern,
damit die Oszillationen der Elternionen klein bleiben. Ein Hexapolfeld
kann übrigens auch
elektrisch überlagert
werden, indem die beiden Hochfrequenzspannungen der gleichen Phase,
die an zwei gegenüber
liegende Polstäbe
angelegt werden, nicht gleich groß sind. Es lässt sich
damit die Stärke
des Hexapolfeldes einstellen.
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Es
kann auch hier günstig
sein, die Anregung der Ionen durch die Hilfselektroden nur am Ende
des Speicherreservoirs vorzunehmen. Andererseits ist es hier interessant,
die Anregung im gesamten Speicherreservoir vorzunehmen, und die
begrenzt schwingenden Ionen, wie oben beschrieben, durch einen Spannungsfall
an den Hilfselektroden zum Ionentor zu treiben, um für diese
selektierten Ionen eine schnellere Leerung der Speicherreservoirs
zu erreichen. Der Spannungsabfall an den Hilfselektroden kann durch
geteilte Abschnitte der Hilfselektroden, aber auch durch einen Spannungsabfall
an drahtförmigen
Hilfselektroden erzeugt werden. Für die Reihenfolge bei der Auswahl
der Elternionen gelten die Überlegungen,
die schon zu Ausführungsform 2a
gemacht wurden.
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Ausführungsform 2c: Begrenzung der
Amplituden durch ein überlagertes
Oktopolfeld.
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In ähnlicher
Weise kann man dem Quadrupolfeld durch Form oder Positionierung
der Polstäbe ein
Oktopolfeld überlagern,
wie in 8 in einem Beispiel gezeigt wird. Ist dieses Oktopolfeld
stark genug, so werden wiederum die Amplituden resonant angeregter
Ionenschwingungen begrenzt. Dabei findet die Begrenzung der Anregung
von Schwingungen in einer der beiden Ebenen zwischen je zwei gegenüber liegenden
Polstäbe
durch Verringerung der Sekularfrequenz (Ebene durch Polstäbe 24–22),
in der anderen Ebene (durch Polstäbe 43–44)
durch Vergrößerung der
Sekularfrequenz statt. Die Wirkung zeigt sich erst beim Einwandern
der Ionen in das Streufeld: dabei wird in einem Falle die Amplitude
im Streufeld vorübergehend
vergrößert, im
anderen Falle verringert. Beide Richtungen sind für die Begrenzung
der Amplitude brauchbar. Das Oktopolfeld lässt sich nicht elektrisch einstellbar
machen, es kann nur durch Formänderungen
der Polstäbe
erzeugt werden.
-
Ausführungsform 2d: Verwendung der
nichtlinearen Resonanz.
-
Die Überlagerungen
mit Hexapol- oder Oktopolfeldern erzeugen auch nichtlineare Resonanzen, die
eintreten, wenn die Sekularfrequenz der Ionen gerade bei einem ganzzahligen
Bruchteil der Frequenz der Treiber-Hochfrequenzspannung liegt. Die erste
nichtlineare Hexapol-Resonanz liegt bei einem Drittel, die erste
Oktopol-Resonanz bei einem Viertel der Frequenz der Treiber-Hochfrequenzspannung. Zu
kleineren Bruchtei len hin nimmt die nichtlineare Resonanz sehr kräftig ab.
In einer solchen nichtlinearen Resonanz braucht man nur eine sehr
kleine Anregungsspannung der dipolaren Anregung, um die Ionen diese
nichtlineare Resonanz, die nur außerhalb der Achse wirkt und
nach außen
zunimmt, spüren
zu lassen. Die Ionen werden dann durch diese Resonanz erfasst und
schwingen automatisch bis zur Begrenzung ihrer Amplitude durch die
oben geschilderte Verschiebung ihrer sekularen Frequenz. Die Resonanzen
bei einem Drittel oder einem Viertel der Hochfrequenz haben leider
recht hohe Oszillationsfrequenzen; somit besteht hier immer die
Gefahr der Fragmentierung der Ionen, wenn nicht extrem kleine Amplituden
verwendet werden. Die Resonanzen bei wesentlich kleineren Bruchteilen
der Treiber-Hochfrequenz sind dagegen viel schwächer und weniger ausgeprägt. Alle
diese Resonanzen sind selbsthaltend: Ionen, die in der Resonanz
mit Maximalamplitude schwingen, halten sich selbst bei Abschalten
der äußeren Anregung
durch das Dipolfeld in der Resonanzschwingung, da diese Schwingung
durch nichtlineare Phänomene
aus der Treiber-Hochfrequenzspannung gespeist wird.
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Auch
für alle
die vorgenannten Ausführungsformen
2b bis 2d kann es günstig
sein, wenn die Abschnitte der Hilfselektroden, die zur Anregung
verwendet werden, nur relativ kurz sind und fast, aber nicht ganz,
bis an das Ende der Polstäbe
reichen. Die Elternionen aus dem übrigen Teil des Speicherreservoirs
wandern ständig
durch Diffusion in diesen Teil ein und werden hier auch angeregt.
Für die
Ausführungsformen
2b bis 2d, in denen Überlagerungen
mit Feldern höherer
Ordnung verwendet werden, können sich
diese Überlagerungen
mit höheren
Multipolfeldern und die anregenden Hilfselektroden aber auch über die
ganze Länge
des Speicherreservoirs erstrecken, wobei die angeregten Ionen durch
einen Spannungsabfall an den Hilfselektroden zum Ionentor getrieben
werden können.
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Die Überlagerungen
mit höheren
Multipolfeldern und die anregenden Hilfselektroden können jedoch
durch entsprechende Ausformung des Polstabsystems auch nur am Ende
des Polstabsystems ausgebildet sein. Für die Anregung in der Ausführungsform
2a ist wieder eine diagonale oder zirkumpolare Anregung sehr günstig; in
den Ausführungsformen 2b
bis 2d sind diese Anregungsformen ohne Belang, da die günstigsten
Anregungsrichtungen von der Richtung der überlagerten höheren Multipolfelder
abhängt.
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Die
Anregung der Ionenschwingungen quer zur Achse des Stabsystems sollte,
wie bereits mehrfach betont, für
einen axialen Export nicht groß sein, um
Fragmentierungen der Ionen zu vermeiden. Für einen gut massenaufgelösten Export
genügt
es, wenn die Schwingungen nur etwa zwei bis drei Millimeter zu jeder
Seite aus der Achse heraus reichen. Wie oben angemerkt, ist es günstig, die
Ionen langsam schwingen zu lassen; entweder durch Auswahl möglichst
schwerer Ionen oder durch die Wahl einer kleinen Hochfrequenzspannung.
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In
einer Anordnung mit verzerrt angeordneten oder ungleich dicken Polstäben, die
im Inneren einen nichtlinearen radialen Anstieg des Pseudopotentials
bewirken, lässt
sich eine Ionensorte zu Schwingungen mit einer nur noch schwach
einstellbaren, nur leicht modulierten Grenzamplitude anregen. Werden
lange Hilfselektroden benutzt, die sich über das ganze Speicherreservoir
erstrecken, so schwingen alle so angeregten Ionen im Speicherreservoir.
In diesem Fall lassen sich die selektierten Ionen in einigen Zehn
Millisekunden durch einen Spannungsabfall an den Hilfselektroden
zum Ionentor treiben.
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Es
kann jedoch auch besser (und einfacher) sein, wie oben bereits beschrieben,
nicht alle Elternionen gleichzeitig schwingen zu lassen, sondern
nur die Elternionen im letzten Endstück des Speicherreservoirs.
Da die Ionen nicht ortsfest gebunden sind, sondern sich ständig durch
Diffusion auch in Längsrichtung
bewegen, geraten sie auch in das Streufeld am Ende des Speicherreservoirs
und werden dabei durch das Ionentor in das zweite Speicherreservoir exportiert.
Es ist, als ob diese Ionen kontinuierlich aus dem Speicherreservoir
auslaufen. Dieses Exportieren der Elternionen erfolgt ebenfalls
kontinuierlich, indem die radiale Anregung über längere Zeit eingeschaltet bleibt.
Die Zeitdauer des Auslaufens der Ionen hängt von der Länge dieses
Speicherreservoirs ab; für
obig genannte Abmessungen herrscht eine Halbwertszeit in der Größenordnung
von etwa hundert Millisekunden. Werden die Ionen in ihrer Gesamtheit
durch leichte Wechselspannungen an verschiedenen Abschnitten der
Hilfselektroden im Speicherreservoir hin- und hergeschickt, so lässt sich
das Auslaufen der angeregten Elternionen noch etwas beschleunigen.
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Ist
das Speichereservoir mit sehr vielen Ionen gefüllt, so wird dabei durch die
herrschende Raumladung nur eine mäßige Massenauflösung des massenselektiven
Ionenexports durch das Ionentor erreicht, in der Regel beschränkt auf
einige atomare Masseneinheiten. Die Massenauflösung kann aber durch die Einrichtung
eines zweiten Ionentors verbessert werden. Dazu wird das zweite
Speicherreservoir wieder als ein quadrupolares Stabsystem ausgelegt,
das aber nie so stark befüllt
werden wird wie das erste Speicherreservoir, da ja stets nur ein kleiner
Teil der Ionen die eingestellte Exportmasse besitzt. Am Ende dieses
zweiten Reservoirs, das viel kürzer
sein kann als das erste Speicherreservoir, befindet sich das zweite
Ionentor, das jetzt weniger durch Raumladungen gestört ist und
daher besser massenselektiv arbeiten kann. Beide Ionentore können auch
gleichzeitig arbeiten. Sind die analytisch gewünschten Ionen in ein drittes
Speicherreservoir übertragen,
so können
die restlichen Ionen des zweiten Speicherreservoirs in das erste
Speicherreservoir zurück
geführt
werden, indem die Spannungsbarriere erniedrigt und die Achsenpotentiale
entsprechend eingestellt werden. Es gehen daher praktisch niemals
Ionen verloren. Dieser Vorgang lässt
sich beliebig oft für
die gleiche ladungsbezogene Masse oder auch später für eine andere Masse wiederholen.
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Ein
solches Tandem-Massenspektrometer mit mindestens drei Speicherreservoiren
und zwei Ionentoren kann aber nicht nur zur Erhöhung der Massenauflösung des
massenselektiven Ionenexports verwendet werden, sondern auch zur
Erzeugung von Enkelionen, also Fragmentionen der zweiten Fragmentierungsgeneration.
So können
beispielsweise die gut massenselektierten Ionen aus dem dritten Speicherreservoir
nach Entleerung des zweiten Speicherreservoirs in dieses zweite
Speicherreservoir zurückgeführt werden.
Sie können
dann in diesem zweiten Speicherreservoir fragmentiert werden, beispielsweise
durch radiale resonante Anregung, wie unten im Einzelnen beschrieben.
Die Stoßfragmentierung
kann auch erreicht werden, indem bei der Rückführung der Ionen aus dem dritten
Speicherreservoir in das zweite durch die Achsenpotential in der Reservoiren
entsprechende kinetische Energie mitgeteilt wird. Auch andere Fragmentierungsmechanismen
sind möglich,
wie unten näher
beschrieben. Aus dem Gemisch von Fragmentionen kann jetzt durch das
zweite Ionentor eine Ionensorte massenselektiv in das dritte Speicherreservoir überführt, dabei
(oder dort) fragmentiert und anschließend durch den Massenanalysator
als Enkelionenspektrum aufgenommen werden.
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Ein
besonders günstiges
Tandem-Massenspektrometer nach dieser Erfindung hat also nicht nur ein
Ionentor, sondern deren zwei, die zwischen entsprechenden Speicherreservoiren
angeordnet sind.
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Eine
ganz anders geartete Ausführungsform eines
massenselektiven Ionentores verwendet ebenfalls ein Speicherreservoir
in Form eines Quadrupol-Stabsystems. Hier ist aber einer der Polstäbe mit einem
langem Schlitz versehen, aus dem die ausgewählten Elternionen durch eine
dipolare resonante Anregung in einen Ionentrichter hinein ausgeworfen werden
können.
Ein mit Gas befüllter
Ionentrichter fängt
die Elternionen ein führt
sie in ein zweites Speicherreservoir.
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Dieser
massenselektive Auswurf der Elternionen arbeitet besonders gut,
wenn der Auswurf unter Bedingungen einer nichtlinearen Resonanz
erfolgt. Dazu ist die Anordnung der Polstäbe, die rund oder vorzugsweise
hypberbolisch geformt sein können, leicht
asymmetrisch zu verzerren, beispielsweise durch eine etwas größere Entfernung
nur eines einzigen Polstabes von der Achse, so dass dem entstehenden
Quadrupolfeld im Inneren des Stabsystems ein leichtes Hexapolfeld überlagert
wird. Es entsteht dadurch eine nichtlineare Resonanz für solche
Ionen, deren sekulare Schwingung gerade einem Drittel der an die
Polstäbe
angelegten Hochfrequenzspannung entspricht. Die unsymmetrische Verzerrung
mit dem überlagerten
Hexapolfeld bremst aber auch das Amplitudenwachstum aus, da jetzt
die Schwingungsfrequenz von der Amplitude der Schwingung abhängig wird.
Um diesen Effekt zu kompensieren, muss daher auch ein weiteres Multipolfeld
höherer
Ordnung, beispielsweise ein Oktopolfeld überlagert werden, da dieses
die Frequenzverschiebung durch das Hexapolfeld in gewissem Umfang
zu kompensieren gestattet. Dadurch kann man einen sehr gut nach
Massen aufgelösten
Auswurf der ausgewählten
Elternionen erreichen.
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Zum
Auswurf der Elternionen wird jetzt von demjenigen gegenüberliegenden
Stabpaar, das auch den Stab mit dem Schlitz enthält, die Hochfrequenzspannung
weggenommen. (Vorzugsweise werden jetzt die Lochblenden an beiden
Enden mit der halben einphasigen Hochfrequenzspannung belegt). Die
nur noch einphasige Hochfrequenzspannung an den beiden übrigen Polstäben wird
nun in seiner Spannung so eingestellt, dass die ausgewählten Elternionen
gerade bei einem Drittel der Hochfrequenz schwingen. Nunmehr wird
eine sehr leichte Wechselspannung mit der Frequenz von einem Drittel
der Hochfrequenz gegenphasig an die beiden spannungslosen Polstäbe gelegt.
Hierdurch werden die praktisch in der Achse ruhenden Elternionen
ganz leicht in ihrer Sekularfrequenz dipolar angeregt. Sie beginnen
zu schwingen, gelangen dadurch in den Wirkungsbereich der nichtlinearen
Resonanz und verlassen das Speichereservoir durch den Schlitz im Polstab.
Durch die Kombination aus Hexapolfeld und Oktopolfeld ist der Auswurf
streng einseitig. Dieser Auswurf ergibt trotz seiner hohen Auswurfgeschwindigkeit
eine sehr gute Massenauflösung
der Selektion. Es ist hier zweckmäßig, mit den leichtesten Ionen unter
den zu analysierenden Elternionen zu beginnen, da diese den feinsten
Ionenfaden nahe der Achse bilden. Es kann sogar zweckmäßig sein,
im Übergang
von einer Elternionensorte zur nächst
schwereren alle Ionensorten der dazwischen liegenden Massen auszuwerfen,
um immer die leichteste Ionensorte des Reservoirs auszuwerfen.
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Nachteilig
bei diesem Auswurf ist die relativ hohe kinetische Energie der ausgeworfenen
Ionen, bestehend aus einer Mindestenergie von einigen Hundert Elektronenvolt
und einer leider recht hohen Streunung der kinetischen Energie.
Die Mindestenergie kann dabei relativ leicht durch ein elektrisches Gegenfeld
beseitigt werden, die überschüssige Energie
kann aber nur durch Stöße mit einem
Dämpfungsgas
vernichtet werden. Dabei werden unvermeidlich bereits einige der
ausgeworfenen Ionen fragmentiert. Es ist daher günstig, den Innenraum des auffangenden
Ionentrichters bereits als Stoßkammer
zur Fragmentierung zu verwenden.
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Wir
kehren jetzt zum axialen Export zurück. Die massenselektierten
Ionen, die sich im zweitem Speicherreservoir befinden, sind jetzt
zu fragmentieren. Dazu sind sie beispielsweise in üblicher
Weise mit einer Stoßenergie
von 30 bis 100 Elektronenvolt in eine Fragmentierungskammer einzuschießen, die wiederum
als Quadrupol-Stabsystem ausgelegt sein kann. Die Fragmentierungskammer
ist ebenfalls mit einem Dämpfungsgas
befüllt,
das hier als Stoßgas für die Fragmentierung
wirkt. Es kann durchaus wieder Helium des gleichen Drucks wie im
Speicherreservoir verwendet werden, so dass vom ersten Speicherreservoir
bis zur Stoßfragmentierungskammer der
gleiche Druck herrscht. Der Druck kann durch einen Gasbehälter (18)
und eine Druck mindernde Zuführung
aufrecht erhalten werden.
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Die
Fragmentierungskammer kann durchaus mit dem zweiten Speicherreservoir
(10) identisch sein. Es findet dann die Beschleunigung
der Ionen auf einstellbare 30 bis 50 Elektronenvolt bereits beim Verlassen
des ersten Speicherreservoirs (6) durch das Ionentor statt,
wobei zwischen Potentialbarriere des Ionentors und dem Achsenpotential
des zweiten Speicherreservoirs (10) diese 30 bis 100 Volt
einzustellen sind. Sind zur Verbesserung der Selektion der Elternionen
zwei Ionentore hintereinander angeordnet, so kann das dritte Speicherreservoir
als Stoßkammer
dienen.
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Die
Fragmentierung kann aber auch im zweiten Speicherreservoir (oder
in einem weiteren) durch eine radiale dipolare Anregung der Elternionen
vorgenommen werden. Diese Anregung benötigt Zeiten von einigen zehn
bis zu etwa hundert Millisekunden für eine Fragmentierung, da viele
Stöße notwendig sind
um genügend
Energie für
einen Zerfall aufzunehmen. Diese Art der Stoßfragmentierung ist aber besonders
günstig,
weil im Wesentlichen nur direkte Tochterionen generiert werden,
keine Enkelionen, weil sich nach dem Zerfall der Elternionen die
Tochterionen nicht mehr in Resonanz mit dem anregenden Dipolfeld
befinden und sofort durch das Stoßgas gedämpft und gekühlt werden.
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Es
sind aber auch ganz andere Fragmentierungsarten bekannt, die ebenfalls
hier eingesetzt werden können.
So können
die selektierten Elternionen in der Fragmentierungskammer in an
sich bekannter Weise durch die Strahlung eines Infrarot-Lasers (IRMPD),
durch Elektroneneinfang (ECD), durch Beschuss mit hoch angeregten
Neutralteilchen aus einer FAB-Teilchenquelle (FAB = fast atom bombardment)
oder durch Elektronenübertragung
durch negative Ionen (ETD) fragmentiert werden.
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Für alle diese
Verfahren ist es günstig,
als Fragmentierungskammer (10) wieder ein Quadrupol- oder
ein Hexapol-Stabsystem zu verwenden, das mit einem Dämpfungsgas
beschickt wird. Es sammeln sich dann die Fragmentionen in der Längsachse
dieser Kammer (10) und können durch enge endständige Lochblenden
(11), die auch als Druckminderungsstufe dienen, als feiner
Ionenstrahl in den Massenanalysator eingebracht werden.
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Ein
für diese
Zwecke hervorragender Massenanalysator ist ein Flugzeitmassenspektrometer mit
orthogonalem Ioneneinschuss. Die Ionen werden in Form eines sehr
feinen Strahls und möglichst
monoenergetisch in den Pulser (12) des Flugzeitmassenspektrometers
eingeschossen. Der Pulser pulst dann periodisch mit einer Frequenz
von etwa 10 bis 20 Kilohertz einen Abschnitt des Ionenstrahls senkrecht
zur bisherigen Flugrichtung in die Driftstrecke des Flugzeitmassenspektrometers
aus. Die Ionen trennen sich dabei nach ladungsbezogenen Massen, weil
die Geschwindigkeiten der verschiedenen Ionensorten unterschiedlich
sind. Die Ionen treten dann in einen Ionenreflektor (13)
ein, der sie auf einen Ionendetektor (14) reflektiert.
Dabei tritt eine Orts- und Energiefokussierung ein, die ein hohes Massenauflösungsvermögen ergibt.
Im Ionendetektor werden die Ionenströme der einzelnen Ionensorten
verstärkt
und dann über
einen elektrischen Nachverstärker
einem Transientenrekorder zugeführt,
der die Ionenströme
in einem Takt von jeweils etwa einer halben Nanosekunde digitalisiert
und die Werte zu den phasengleich aufgenommenen Werten der früher aufgenommenen
Spektren zeitsynchron hinzuaddiert. Es werden somit Einzelspektren
von 50 bis 100 Mikrosekunden Länge
gemessen. Es entstehen Summenspektren, die beispielsweise in kommerziellen
Geräten
etwa 128 000 oder sogar 256 000 Ionenstromwerte umfassen.
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In
handelsüblichen
Tischgeräten
zeigen diese Flugzeitmassenspektren Massenauflösungen von m/Δm = 15 000
und Massengenauigkeiten von etwa 3 ppm (parts per million). Der
Pulser arbeitet mit etwa 15 Kilohertz, wenn Beschleunigungen im
Pulser von etwa 8 bis 10 Kilovolt verwendet werden. Es werden also
15 000 Massenspektren pro Sekunde generiert und addiert. Dabei werden
im Pulser sehr viele Ionen des feinen Ionenstrahls erfasst und periodisch
ausgepulst, gute Flugzeitmassenspektrometer haben Nutzgrade für die Ionen
des Ionenstrahls in der Größenordnung
von etwa 50 Prozent der eingeschossenen Ionen. Werden die Additionen
nach 1500 Spektren abgebrochen, so können zehn Summenspektren pro
Sekunde geliefert werden. Diese Geräte können also auch zur Verfolgung
schnell veränderlicher
Vorgänge
eingesetzt werden, sie verwenden einen großen Teil der Ionen des angebotenen
Ionenstrahls, und sie haben durch die einstellbare Anzahl der addierten
Massenspektren einen einstellbaren dynamischen Messbereich.
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Sind
höhere
Massengenauigkeiten erforderlich, so kann statt des Flugzeitmassenspektrometers ein
Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer nachgeschaltet werden.
Dieses arbeitet in der Regel mit einem Magnetfeld, das durch supraleitende
Magnetspulen erzeugt wird. Es sind Geräte mit sieben, neun und elf
Tesla erhältlich;
die Massengenauigkeiten können
beträchtlich
unter einem Millionstel der Masse liegen. Diese FTMS-Massenspektrometer
arbeiten allerdings relativ langsam; sie liegen an der Grenze der
Definition eines „schnellen" Massenspektrometers.
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Aber
auch andere Arten von Massenspektrometern können verwendet werden. Wird
beispielsweise ein Quadrupol-Massenspektrometer nachgeschaltet,
so erhält
man eine Abart eines so genannten Triple-Quad-Gerätes, das
wegen der drei aufeinander folgenden Quadrupol-Stabsysteme so benannt wurde:
das erste Stabsystem dient als Massenfilter zur Selektion der Ionen,
das zweite als Fragmentierungs-Quadrupol und das dritte als Massenanalysator
für die
Fragmentionen. Das selektierende Massenfilter, dass alle Ionen vernichtet,
die sich nicht im Prozess der Analyse befinden, wird dann hier erfindungsgemäß durch
ein sparsameres System mit einem massenselektiven Ionentor ersetzt.
Dieses Gerät
ist aber nicht ideal im Sinne der Erfindung, weil das Massenfilter
als Massenanalysator an der Grenze der Definition eines „schnellen" Massenspektrometers
liegt, und weil der Massenanalysator wieder sehr unökonomisch
arbeitet.
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Das
erste Speicherreservoir kann aber auch völlig anders gestaltet sein.
So ist es möglich,
eine dicke zylindrische Kammer mit zwei halbkugeligen Abschlüssen aus
zwei doppelhelikal gewickelten Drahtwendeln zu erzeugen, wobei die
zwei Hochfrequenzphasen an die beiden Drahtwendeln angeschlossen werden.
Frei gelassene Löcher
an beiden Enden dienen dem Einschuss der Ionen und der Extraktion.
Es ist dabei am besten, wenn das Extraktionsloch durch ein Quadrupol-Stabsystem
abgeschlossen wird, das dann mit einem Ionentor der beschriebenen
Art endet.
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Das
Tandem-Massenspektrometer kann auch mit einer weiteren Einrichtung
zur Erzeugung von Enkelionen ausgestattet sein, wie oben bereits beschrieben.
Dazu ist prinzipiell hinter der ersten Fragmentierungseinrichtung
ein weiteres Ionentor anzuordnen, mit denen eine bestimmte Tochterionensorte
selektiert wird. Die selektierten Tochterionen werden dann in einer
zweiten Fragmentierungseinrichtung zu Enkelionen fragmentiert. Der
Massenanalysator nimmt dann das Enkelionenspektrum auf. Die zweite
Fragmentierungsstufe erhöht
die Selektivität
des Verfahrens beträchtlich
und damit die Identifizierungssicherheit. Die nicht selektierten
anderen Tochterionen verbleiben in der ersten Fragmentierungseinrichtung
und können
in nachfolgenden Schritten ebenfalls nach selektiver Auswahl durch weitere
Fragmentierung analysiert werden. Wenn sich zwei Ionentore zwischen
drei Speicherreservoiren befinden, können damit sowohl eine Erhöhung der
Massenauflösung
für den
Ionenexport wie auch ein Export einer Fragmentionensorte für die Aufnahme
von Enkelionenspektren durchgeführt
werden, indem die Ionen zwischen den Speicherreservoiren nach Bedarf
hin und her geschoben werden. Mit drei Ionentoren zwischen vier
Speicherreservoiren lassen sich auch Urenkelionenspektren ohne Verluste
anderer Tochter- oder Enkelionen aufnehmen.
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Als
ein Verfahren für
die Anwendung des neuartigen Tandem-Massenspektrometers werde hier
die analytische Aufgabe betrachtet, in einem Gewebe, das nur aus
wenigen Zellen besteht, die relativen Konzentration von etwa 20
verschiedenartigen Proteinen zu messen. Es werden dazu mit durchaus bekannten
Methoden die Proteine dieser Zellen lysiert. Zu dem Lysat wird nun
eine bekannte Menge eines Referenzproteins zugegeben. Dieses dient
später
als Konzentrationsreferenz, dient aber auch zur Überprüfung des gesamten Verfahrens.
Die Analytproteine (einschließlich
des Referenzproteins) mögen
alle zu einer hydrophob affinen Gruppe gehören. Diese können daher
in einem ersten Schritt durch eine Breitband-Extraktion aus dem
Lysat extrahiert werden, um die Komplexität des Gemischs zu reduzieren.
Das kann beispielsweise durch magnetische Nanopartikel geschehen,
deren Oberfläche
durch eine hydrophobe Belegung affin aktiviert ist. Auf Einzelheiten
werde hier nicht eingegangen, sie sind dem Fachmann bekannt. Dem
Extrakt kann dann nochmals ein zweites Referenzprotein zugegeben
werden. Es gibt Breitband-Extraktionsverfahren für verschiedenartige Substanzgruppen
von Gemischen, beispielsweise für
anionische Peptide, kationische Peptide, phosphorylisierte Peptide
und viele andere.
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Die
Lösung
mit den extrahierten Analytproteinen kann jetzt mit einem Enzym,
beispielsweise Trypsin, verdaut werden, um Verdaupeptide zu erhalten,
die sich im eingeschränkten
Massenbereich von etwa 100 bis 4000 atomaren Masseneinheiten analysieren
lassen. Die Verdaupeptide der Analytproteine müssen in diesem Fall genau bekannt
sein. Das gelöste
Gemisch der Verdaupeptide, das nur wenige Mikroliter Lösung umfasst,
wird nun in eine Nanosprühkapillare
eingefüllt
und durch ein elektrisches Feld mit negativer Ziehspannung versprüht, wobei nach
Verdampfen der Tröpfchen
die Verdaupeptide zu praktisch 100 Prozent positiv ionisiert werden.
Aus einer sehr geringen Anzahl von Zellen, im Grenzfall aus einer
einzigen Zelle, lassen sich so etwa 108 Ionen
der Verdaupeptide aus den extrahierten Proteinen herstellen. Die
meisten dieser Ionen sind dabei übrigens
doppelt positiv geladen.
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Von
diesen Ionen lassen sich mit modernen Mitteln etwa zehn Prozent,
also etwa 107 Ionen, in das Speicherreservoir
einspeichern. Da einige Verdaupeptide, die aber nicht zu den Analytproteinen
gehören, überragend
häufig
auftreten, können
diese durch Anregung ihrer sekularen Schwingungen mit Hilfe der
Hilfselektroden aus dem Speicherreservoir auswerfen. Es mögen dann
etwa 106 Ionen im Speicherreservoir übrig bleiben,
eine Anzahl, die für
die weiteren Analysen vorteilhaft ist.
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Beginnend
mit den der schwersten Sorte der Verdaupeptidionen, werden nun ausgewählte Ionensorten
der Analytsubstanzen und Referenzsubstanzen einzeln nacheinander
analysiert. Dazu werden vorzugsweise die doppelt geladenen Ionen
ausgewählter
Verdaupetide dieser Substanzen verwendet. Diese doppelt geladenen
Ionen werden in beschriebener Weise durch das Ionentor in die Fragmentierungskammer
exportiert und dort mit einer der zur Verfügung stehenden Fragmentierungsarten
fragmentiert. Die Fragmentionen werden im Flugzeitmassenspektrometer
als Fragmentionenspektrum aufgenommen.
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Die
Ionen der Verdaupeptide eines komplexen Gemisches besetzen im Allgemeinen
alle Massen des Massenbereichs vielfach. Es ist bekannt, dass einfach
geladene Verdaupeptidionen bei jeder Massenzahl einen Cluster bilden,
der etwa 0,3 atomare Masseneinheiten breit ist. Doppelt geladene
Ionen bilden einen Cluster von 0,15 Masseneinheiten Breite um halbzahlige
Massenwerte. Selektiert man also die monoisotopischen Ionen eines
Verdaupeptids mit Einheitsauflösung
(eine ganzzahlige Massenzahl wird von der nächsten getrennt), so ist mit
einer Überlagerung
von mehreren Ionen gleicher Massenzahl, aber verschiedener Identität, zu rechnen.
Zur Erhöhung
der Selektivität
findet daher die Aufnahme der Fragmentionenspektren statt, da diese
für jedes Verdaupeptid
weitgehend einmalig sind, ähnlich
einem Fingerabdruck. Da sich bei der gleichzeitigen Fragmentierung
mehrerer Verdaupeptide die Fragmentionenspektren überlagern,
muss das bekannte Fragmentionenspektrum des analytisch interessierenden
Verdaupeptids mit bekannten mathematischen Verfahren ausgefiltert
werden.
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Unter
den „monoisotopischen" Ionen des Verdaupeptids
versteht man diejenigen Ionen der Isotopengruppe, die nur aus 12C, 1H, 14N, 16O, 32S und 31P bestehen.
Werden diese gut von den anderen Ionen der Isotopengruppe getrennt
selektiert und dann fragmentiert, so besteht das Fragmentionenspektrum dieser
monoisotopischen Ionen nur noch aus Einzellinien, nicht mehr aus
Isotopengruppen. Dieser Effekt kann bei dem Filterprozess gut verwendet
werden, da die meisten der überlagerten
Ionensorten nicht monoisotopische Tonen sind und nach der Fragmentierung
als (meist seltsam verzerrte) Isotopengruppen erscheinen.
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Für organische
Substanzen ist das monoisotopische Ionensignal bis zu einem Molekulargewicht von
m < 2200 atomaren
Masseneinheiten das stärkste
Signal, hier ist also die Wahl der monoisotopischen Ionen besonders
günstig.
Im anschließenden
Bereich der Molekülge wichte
von m = 2200 bis zu m = 3300 atomaren Masseneinheiten ist das Ionensignal der
Ionen, die ein 13C enthalten, das stärkste Signal. Werden
diese Ionen exportiert und fragmentiert, so erhält man ein Fragmentionenspektrum
aus jeweils zwei Ionensignalen pro Isotopengruppe mit leicht vorhersagbaren
Intensitätsverhältnissen.
Auch dieses Fragmentionenspektrum lässt sich daher leicht erkennen
und für
eine Analyse verwenden. Im übertragenen
Sinne gilt das auch für
Ionen, die zwei und mehr 13C-Atome enthalten,
die Interpretation der Fragmentionenspektren wird aber immer komplizierter.
Es ist aber durchaus nicht immer notwendig, eine Isotopentreue im
Fragmentionenspektrum dadurch anzustreben, dass man alle Isotopensignale
einer Isotopengruppe exportiert und fragmentiert.
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Dieser
Analysenprozess wird dann für
alle bekannten Verdaupeptide aller Analytproteine und Referenzproteine
durchgeführt.
Es mögen
dabei für die
20 Analytproteine durchaus etwa 100 bis 200 Verdaupeptide analysiert
werden müssen.
Die Zusammenfassung dieser Resultate gibt aber eine große Sicherheit
für die
quantitative Analyse der Analytproteine. Das Analysenverfahren muss
dabei, wie in der analytischen Chemie stets erforderlich, vorher
mit bekannten Mischungen der gleichen Proteine kalibriert werden.
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Der
analytische Prozess ist übrigens
sehr schnell. Setzt man für
jedes Verdaupeptid eine Extraktionszeit und eine Analysenzeit von
je einer vollen Sekunde an, so dauert der gesamte Analysenprozess
nur etwa 200 bis 400 Sekunden, zuzüglich der Zeit der Ionisierung
von etwa drei Minuten. Die Analyse umfasst also die Zeit von rund
acht Minuten. Verglichen mit einer Analyse, die eine Substanztrennung durch
Flüssigkeitschromatographie
oder Kapillarelektrophorese voraussetzt, ist diese Analysenzeit sehr
kurz. Durch doppelt ausgelegte erste Speicherreservoire, wie sie
in Patentanmeldung DE 10 2004 028 638.8-54 beschrieben sind, kann
die Zeit verkürzt
werden.
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Sind
nur wenige Substanzen in günstig
aufbereiteten Proben quantitativ über Enkelionenspektren zu messen,
so können
dafür mit
der vorliegenden Erfindung Verfahren entwickelt werden, die insgesamt
nur zwei bis drei Minuten dauern und ohne jegliche Chromatographie
auskommen.
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Selbstverständlich können Proteingemische auch
ohne enzymatischen Verdau gemessen werden. Dann muss der Flugzeitmassenanalysator
auf einen hohen Massenbereich von einigen 100 000 atomaren Masseneinheiten
eingestellt werden. Hier kann es günstig sein, ein Charge Stripping
vorzunehmen.
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Ein
weiteres Verfahren kann beispielsweise die Proteine identifizieren,
die sich in einem 2D-Gel weitgehend aufgetrennt als so genannte „Spots" befinden. Die angefärbten Spots
werden ausgestanzt, einem enzymatischen Verdau des Proteins unterworfen
und die Verdaupeptide werden anschließend aus dem Gel eluiert. Wenige
Mikroliter des Eluats werden in die Kapillare einer Nanoelektrosprüh-Ionenquelle eingebracht;
die Ionen werden im Speicherreservoir gespeichert. Ein kleiner repräsentativer
Teil der Ionen aus dem Speicherre servoir wird nun ohne Selektion und
Fragmentierung dem Flugzeitmassenspektrometer zugeführt, um
einen Überblick über die
Massen der vorhandenen Verdaupeptidionen zu erhalten. Die Ionen
der Verdaupeptide werden dann einzeln in erfinderischer Weise exportiert
und fragmentiert. Die Fragmentionenspektren dienen in üblicher
Weise zur Identifizierung des Proteins im Spot verwendet, indem
die Spektren den bekannten Suchmaschinen für Vergleiche mit Proteinsequenzdatenbanken
zugeführt
werden. Für
eine solche Identifizierung sind bei einem automatisierten Verfahren
einschließlich
der Ionisierung und der Spektrennahme nur wenige Sekunden erforderlich,
beispielsweise nur etwa zehn bis dreißig Sekunden.
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Die
Anwendung von Gerät
und Verfahren ist vielfältig.
Das Verfahren mit seinen vielen Abwandlungen kann beispielsweise
in der zellbiologischen Forschung, in der medizinischen Diagnostik
mit Biomarker-Proteinen, in klinischen Studien zur Pharmakokinetik
und vielen anderen forschungsmäßig wie routinemäßig durchgeführten Untersuchungen
zur Konzentrationsbestimmung von Substanzen in komplexen Gemischen
eingesetzt werden.