Auf
dem Markt sind eine Reihe von Analysenrobotern zum vollautomatisierten
Einsatz von ELISA-Tests verfügbar.
Vielfach beinhalten diese Roboter zumindest einen Pipettier- bzw.
Greifarm, eine Waschstation, einen Schüttler, einen Reader, eine Steuer-
und Auswerteeinheit sowie teilweise elektronisch temperierte Inkubatoren
(Heizung). Anbieter solcher Systeme sind z.B. TECAN (z.B. Freedom
EVO) und IBL (Gerät: Triturus).
Der Einsatzbereich dieser Analysenroboter liegt hauptsächlich im
Bereich der Human- und Veterinärmedizin,
wobei der Fokus in der Regel auf einem hohen Probendurchsatz liegt,
d.h. es wird angestrebt, möglichst
viele Proben täglich
zu analysieren. Für
diese Systeme gilt, dass Messfehler bzw. Störungen bei den Messungen möglichst
dadurch vermieden werden sollen, dass die Messungen möglichst
gleichzeitig unter identischen Bedingungen durchgeführt werden.
Hierzu dient insbesondere der Einsatz von Mehrfachpipetten, welche
die parallele Analyse mehrerer Proben ermöglichen. Der Nachteil dieser
Vorgehensweise besteht allerdings darin, dass die Messwerte, obwohl
untereinander sehr ähnlich,
alle denselben Fehler aufweisen. Dieser Nachteil führt insbesondere
dazu, dass auch durch Wiederholung von Messungen und Mittelung einzelner Werte
nur geringe Verbesserungen der Messgenauigkeit erreicht werden.
Weiterhin
benutzen alle automatisierten Messsysteme, soweit sie eine Auswerteeinheit
beinhalten, in der Regel die sogenannte 4-Parameter-Gleichung, um
das Messsignal des Readers (Mikrotiterplattenphotometers), den sog.
OD-Wert (OD = optische Dichte) in einen Konzentrationswert umzurechnen.
Diese erzeugte 4-Parameter-Kurve
berücksichtigt
weder die unterschiedliche Position der gemessenen Kavität auf der
Mikrotiterplatte, noch den Zeitpunkt der Bearbeitung oder Abweichungen
der Kalibrierkurve von der 4-Parameter-Kurve. Die genannten Aspekte
können
jedoch speziell bei niedrigen Konzentrationen einen sehr starken Einfluss
auf das Messergebnis haben und sollten daher entsprechend berücksichtigt
werden. Schließlich
beinhalten die genannten Messsysteme – wenn überhaupt – kein allgemein anerkanntes
System zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze. Man behilft
sich daher bei der Nachweisgrenze mit der Verwendung des 3-Sigma-Bereiches.
Der Messbereich beginnt demnach erst oberhalb der durch die dreifache
Standardabweichung des Blindwertsignals errechneten Nachweisgrenze.
Bei
allen Messgeräten
wird Parallelität
von Messung und Kalibrierung angestrebt. Es wird also angestrebt,
dass die auftretenden Fehler sich durch Parallelität ihres
Auftretens möglichst
gegenseitig aufheben.
Detaillierte
Beschreibung
Ausgehend
von diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die
Aufgabe zugrunde, Messfehler zu eliminieren, um eine wesentlich
empfindlicheres Messverfahren zu erhalten, welches – je nach Spezifizierung
der Messparameter – eine
Verbesserung der Empfindlichkeit um den Faktor 10 oder mehr ermöglicht.
Zur Realisierung dieses Messverfahrens dient ein neuer Analysenroboter
für ELISA-Tests, der eine Reihe
von Innovationen beinhaltet. Dieser Analysenroboter ist mit einer
Pipettierfunktion ausgestattet, weiterhin mit einem Washer für die Pipettiernadel,
einem Reader mit integriertem Schüttler, eine leistungsfähige Temperiereinheit
nebst zugehöriger
Softwaresteuerung.
A Technische
Realisierung des Analysenroboters
Bei
der Pipettiernadel handelt es sich um eine einfache Doppelnadel,
die sowohl zum Pipettieren der Reagenzien und Proben dient, als
auch zum Waschen der einzelnen Kavitäten durch Pipettieren der Waschflüssigkeit
und gleichzeitiges Absaugen. Die Pipettiernadel ist auf einem einfachen
Roboterarm befestigt und kann über
Softwarebefehle beliebig bewegt werden. Die Temperiereinheit besteht
aus einem Peltierelement mit Ventilator, der durch Lufttemperierung
sowohl Heizung als auch Kühlung
des gesamten Innenraumes ermöglicht.
Temperatursensoren dienen zur Überwachung
der Temperatur. Bislang vorliegende Geräte ermöglichen bestenfalls eine Erwärmung des
gesamten Innenraums, nicht jedoch dessen Kühlung, was jedoch für eine Messung
mittels ELISA-Tests nahe der Nachweisgrenze sehr wichtig ist.
Das
Gehäuse
ist allseitig mit Dämmmaterial
ausgekleidet. Die Pipettierung erfolgt mittels Pipettierroboter
auf der Mikrotiterplatte, die auf dem Transportschlitten des Reader
eingerastet aufliegt. Der Reader sollte mit einer Schüttelfunktion
ausgestattet sein, damit auf einen separaten Schüttler samt zugehörigem Greifarm verzichtet
werden kann.
B Anwendung des Prinzips
der zeitlichen und räumlichen
Randomisierung der Einzelmessungen
Die
Softwaresteuerung des Analysenroboters ist so ausgelegt, dass die
einzelnen Kavitäten
der Mikrotiterplatte zeitlich und räumlich randomisiert angesteuert
werden. Die bis zu 15 Arbeitsschritte (Pipettieren und Absaugen
diverser Substanzen mit integrierten Wasch- und Schüttelschritten)
werden über
einen einheitlichen Arbeitstakt gesteuert. In jedem Arbeitstakt
wird eine einzelne Kavität
der Mikrotiterplatte behandelt, so dass je Arbeitsschritt insgesamt
96 Takte (für
die 96 Kavitäten)
erforderlich sind. Jede Kavität
wird also einzeln mittels einer Doppelnadel (Pipettieren, Absaugen
und Waschen) behandelt. Die aufeinander folgenden Arbeitsschritte
werden über
eine Datenbank gesteuert. Über
die Softwaresteuerung werden alle Arbeitsschritte protokolliert
und die zugehörigen
Umgebungsbedingungen (Temperatur etc.) registriert. Durch die Taktsteuerung
ist gewährleistet,
dass die Arbeitsschritte für
jede Kavität
in der gleichen zeitlichen Abfolge durchgeführt werden. Diese Vorgehensweise
hat gegenüber
der üblichen
parallelen Abarbeitung den großen
Vorteil, dass die immer wirksamen Messabweichungen je Messwert in
anderer Weise wirksam sind, so dass durch Mittelung ein großer Teil
dieser Messabweichungen aufgehoben werden kann. Dies bedeutet auch,
dass die für
die Kalibrierung benötigten
Standardproben in randomisierter Weise auf der Mikrotiterplatte
angeordnet werden können.
Dies verhindert die sonst üblichen
systematischen Fehler.
Bis
zu 25 Messwiederholungen einzelner Proben sind vorgesehen. Dies
ermöglicht
bei der optischen Dichte eine Verbesserung der Empfindlichkeit um
den Faktor 5, und bei der Konzentration – je nach Streuung der Einzelwerte – eine Verbesserung
um den Faktor 20.
C Automatische Korrektur
des aus unterschiedlichen Bedingungen resultierenden Messfehlers
Weiterhin
beinhaltet der Analysenroboter ein Auswertemodul, welches ermöglicht,
dass die aus unterschiedlichen Bedingungen resultierenden Messfehler
korrigiert werden können.
Das Auswertemodul berücksichtigt
bei der Kalibrierung neben der optischen Dichte die jeweilige Spalte
und Spalte und Zeile der Kavität und
ihre Ordnungsnummer (im zeitlichen Ablauf). Ggf. kann auch die Temperatur
berücksichtigt
werden. Die zugrunde liegende Kalibrierfunktion hat dann folgende
Gestalt
Dabei
bezeichnet OD die optische Dichte, A, B, C, D sind die Parameter
der 4-Parametergleichung,
c bezeichnet die Konzentration, Spalten- und Zeileneffekt sind die
als linear angenommenen räumlichen
Effekte, Trend bezeichnet den als linear unterstellten zeitlichen
Effekt (der durch die Ordnungsnummer beschrieben werden kann), und
der Temperatureffekt ist ebenfalls ein linearer Term, der proportional
zur jeweiligen Temperatur ist. Die Ermittlung der unbekannten Parameter
erfolgt mittels der bekannten Maximum-Likelihood-Methode. Die Ermittlung
der Parameter der Störeffekte
(Spalteneffekt, Zeileneffekt, Trend, Temperatureffekt) kann automatisch
und spezifisch für
jede Mikrotiterplatte erfolgen. Alternativ ist eine plattenübergreifende
Festlegung und dann Eintragung in eine Datenbank möglich. Dies
hat den Vorteil, dass die Anzahl der für die Kalibrierung benötigten Messungen
reduziert werden kann. Es ist festzuhalten, dass in bisherigen Systemen
eine automatische Fehlerkorrektur der Messabweichungen prinzipiell
nicht möglich
ist, da die Messungen parallel abgearbeitet werden und die Kalibrierfunktion
immer nur die einfache 4-parametrische Gestalt hat, also
D Kalibrierung mittels
einer verallgemeinerten 5-Parameter-Funktion
Das
Auswertemodul berücksichtigt
bei der Kalibrierung neben der optischen Dichte die jeweilige Spalte
und Spalte und Zeile der Kavität
und ihre Ordnungsnummer (im zeitlichen Ablauf). Ggf. kann auch die
Temperatur berücksichtigt
werden. Die zugrunde liegende Kalibrierfunktion hat dann folgende
Gestalt
Die
Ermittlung der unbekannten Parameter erfolgt mittels der bekannten
Maximum-Likelihood-Methode.
Der Parameter F wird in der Regel fest vorgegeben, z.B. F = exp(In(D) – 2). Die
5-Parameter-Funktion hat gegenüber
der sonst verwendeten 4-Parameter-Funktion
den großen
Vorteil, dass die speziell in der Nähe der Nachweisgrenze zu beobachtenden
Abweichungen der Kalibrierkurve nach „unten" besser modelliert werden können.
E Ermittlung
der Nachweisgrenze
Das
Auswertemodul ermöglicht
weiterhin die Erfassung der Nachweisgrenze auf Basis des Likelihood-Quotiententests.
Für jede
zu untersuchende Probe erfolgt die Berechnung der Likelihood-Funktion
auf der Basis der festgelegten Kalibrierfunktion unter Einbeziehung
der Standards sowie der zu untersuchenden Probe, wobei die Konzentration
dieser Probe als unbekannt vorausgesetzt wird. Weiterhin erfolgt
dieselbe Berechnung unter der Annahme, dass die Konzentration der
genannten Probe bei Null liegt. Die Differenz der beiden Likelihood-Werte
dient als Grundlage des Likelihood-Ratio-Tests, bei dem Normalverteilung
der optischen Dichten vorausgesetzt wird. Er erlaubt eine Entscheidung,
ob die Konzentration der unbekannten Probe signifikant über 0 liegt.
Ersetzt man die gemessene optische Dichte der Probe durch einen
theoretischen Wert, erhält
man durch Gleichsetzung der Differenz der beiden Likelihood-Werte
mit dem kritischen Wert und Umformung des Ausdrucks die Nachweisgrenze,
wobei diese Nachweisgrenze von der Anzahl der Messwiederholungen
abhängig
ist.
F Das Auswertemodul in
einem flexibel einsetzbaren Dateneingabe- und Auswertungsgerät
Die
in C–E
beschriebenen Funktionen des Auswertemoduls lassen sich in einem
flexibel einsetzbaren Dateneingabe- und Auswertungsgerät, welches
z.B. direkt an den Reader angeschlossen werden kann, zusammenfassen.
Damit sind diese Funktionen auch für manuell pipettierte Mikrotiterplatten
realisierbar. Allerdings ist eine genaue Temperaturkontrolle damit
nicht mehr möglich,
ebenso wenig wie das Prinzip der zeitlichen und räumlichen
Randomisierung: Um Pipettierfehler und Verwechslungen zu vermeiden,
wird in der Praxis immer darauf geachtet, dass alle Pipettierungen
in einer systematischen Reihenfolge abgearbeitet werden.
G Anwendungsvalidierung
Der
Analysenroboter beinhaltet weiterhin ein Sondermodul, welches eine
automatische Durchführung einer
Anwendungsvalidierung gemäß EG 2002/657.
Für die
Anwendungsvalidierung gemäß EG 2002/657 werden
acht Mikrotiterplatten benötigt,
die mit unbelasteten Proben unterschiedlicher Herkunft nach einem
faktoriellen Faktorplan bestückt
werden. Für
jede Einzelplatte wird ein randomisiertes Pipettiermuster verwendet, wobei
verschiedene Umgebenungsbedingungen variiert werden (insbesondere
Temperatur). Die Softwaresteuerung beinhaltet daher die Importmöglichkeit
für ein
externes XML-File, und ebenso die Auslesemöglichkeit der Ergebnisse in
einem vorgegebenen XML-Format. Diese XML- Datei wird dann extern
durch einen Fachmann für
Anwendungsvalidierung ausgewertet, der auch die XML-Datei mit dem randomisierten
Pipettiermuster vorgibt. Um die XML-Datei mit den Ergebnissen auszuwerten,
ist eine gesonderte Software erforderlich.
H Der ELISA-Test
Der
Analysenroboter basiert bezüglich
des verwendeten ELISAs auf der Technik des so genannten direkten,
kompetitiven, heterogenen Enzymimmunoassays. Dabei werden zwei Antikörper verwendet,
die für 17β-Estradiol
bzw. das synthetisch hergestellte 17α-Ethinylestradiol selektiv sind.
Das Signal wird in einer enzymkatalysierten Reaktion erzeugt. Das
verwendete Enzym ist die Meerettich-Peroxidase, die zusammen mit den Substraten
Wasserstoffperoxid und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) einen blauen
Farbstoff ergibt, welcher nach geeigneter Absenkung des pH-Wertes
nach gelb umschlägt
und dessen Lichtabsorption (sog. "optische Dichte") bei 450 nm (abzüglich seiner Absorption bei
650 nm) das Messsignal darstellt. Bestimmt wird dadurch die Menge
an einem sog. "Tracer" (einer Kopplung
des Analytmoleküls
evtl. über
eine Brücke
an ein Enzymmolekül),
welche über
die Konkurrenzsituation zum Analyten in den Standards bzw. in der
Probe indirekt mit der zu bestimmenden Analytkonzentration zusammenhängt. Die
beiden Verwendung findenden Antikörper sind selektiv für einmal
das natürliche
Steroidhormon 17β-Estradiol
(Östradiol,
Oestradiol, E2) bzw. das synthetisch hergestellte 17α-Ethinylestradiol
(Ethynylestradiol, Ethinylöstradiol,
Ethinyloestradiol, EE2). Die Antikörper wurden durch Immunisierung
von Kaninchen mit Hilfe eines geeigneten immunogenen Analyt-Proteinkonjugates
und anschliessende Blutentnahme gewonnen. Das Enzym-Analyt-Konjugat
("Tracer") und das Trägerprotein-Analyt-Konjugat
("Immunogen") wurden dabei nach
dem selben Syntheseprinzip hergestellt. Das Prinzip des ESTR-A-LISERs,
mittels eines Immunoassays einen Analyten hochreproduzierbar und
empfindlich nachzuweisen, lässt
sich, ohne den grundlegenden Aufbau des Systems ändern zu müssen, in mannigfaltiger Weise
modifizieren:
- – Messung der optischen Dichte
bei einer anderen Wellenlänge
- – Verwendung
eines anderen chromogenen Substrates. Außer TMB können auch eine Vielzahl anderer Substrate
eingesetzt werden, die teils durch Peroxidase, teils durch andere
Enzyme (siehe Punkt 3), umgesetzt werden.
- – Verwendung
anderer Substrate, z.B. fluorogener Substrate etc.
- – Das
substratumsetzende Enzym, Meerrettichperoxidase, kann ersetzt werden
durch andere Enzyme, z.B. alkalische Phosphatase, Glucosidase etc.
- – Die
Antikörper
können
durch andere E2 bzw. EE2-bindende Antikörper ersetzt werden, die nicht
aus Kaninchen stammen müssen
und auch monoklonale Antikörper
sein können.
Auch Antikörper
gegen andere Analyten sind einsetzbar.
- – Das
Testformat kann in der Weise geändert
werden, dass es sich nicht mehr um einen direkten Immunoassay handelt,
sondern beispielsweise um einen indirekten kompetitiven ELISA.
Alle
Inkubations- und sonstigen Wartezeiten sind veränderbar und müssen je
nach Anforderungen verändert
bzw. optimiert werden.
