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Die
Erfindung betrifft eine optische Objektuntersuchungseinrichtung,
umfassend einen Objektbereich, in dem wenigstens ein zu untersuchendes
Objekt oder ein Objektträger
mit wenigstens einem zu untersuchenden Objekt platzierbar ist; einen
Beobachtungsstrahlengang, der vom Objektbereich zu einem Bildbereich
oder Beobachtungsbereich führt, wobei
der Beobachtungsstrahlengang zumindest bereichsweise in Richtung
einer Einrichtungsachse, ggf. vertikal, verläuft; wenigstens zwei weitere
Strahlengänge,
die zum Objektbereich führen
und über
die Anregungslicht oder Beleuchtungslicht dem Objektbereich zuführbar ist
und von denen wenigstens einer zumindest bereichsweise in einer
von der Einrichtungsachse geschnittenen Ebene, ggf. Horizontalebene,
verläuft.
Es wird insbesondere an eine solche Objektuntersuchungseinrichtung
gedacht, bei der zur Beleuchtung/Anregung einer Probe Licht einer
linear polarisierten Lichtquelle, wie beispielsweise einem Laser,
möglichst
effizient mit Licht einer unpolarisierten Lichtquelle, wie beispielsweise
einer Bogenlampe, vereinigt wird, oder zwischen diesen Lichtquellen im
Zuge von Untersuchungen umzuschalten ist. Dies ist beispielsweise
dann von Vorteil, wenn Fluoreszenzmikroskopie mit TIR-Beleuchtung
(TIRF-Mikroskopie) in schnellem Wechsel mit klassischer Fluoreszenzmikroskopie
durchgeführt
werden soll.
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Eine
derartige totale-interne-Reflexion-Fluoreszenz-Anregung ist beispielsweise
zur Untersuchung von biologischen Objekten weit gebräuchlich. Dabei
handelt es sich um eine Sonderform der Fluoreszenzmikroskopie, bei
der die Tatsache genutzt wird, dass bei Totalreflexion eines Strahls
an einer Grenzfläche
von optisch dichterem zu optisch dünnerem Medium in unmittelbarer
Nähe dieser
Grenzfläche
Lichtintensität
auch im optisch dünneren
Medium vorliegt. Diese fällt allerdings,
je nach Wellenlänge, über ca.
200 bis 300 nm exponentiell ab. Damit ist es möglich, Farbstoffe, die im optisch
dünneren
Medium vorliegen, selektiv in einer dünnen, an die Grenzfläche angrenzenden
Anregungsschicht anzuregen, wodurch diffuse Hintergrundfluoreszenz
von Farbstoffen außerhalb
der dünnen
Anregungsschicht praktisch vollständig unterdrückt wird.
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Durch
die Begrenzung der Fluoreszenzanregung auf eine dünne Anregungsschicht
angrenzend an die Grenzfläche
bietet die TIRF-Mikroskopie
auch die Möglichkeit,
einzelne Farbstoffmoleküle
zu erkennen, d. h. beispielsweise Objekte, insbesondere Moleküle, die
nur etwa mit einem einzigen Farbstoffmolekül markiert sind, zu detektieren
und zu verfolgen.
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Bei
der TIRF-Mikroskopie wird die Probe in der Regel mit einem linear
polarisierten Laser angeregt. Bei klassischer Fluoreszenzmikroskopie
wird die Probe häufig
mit dem Licht einer Bogenlampe angeregt, welches durch einen Anregungsfilter
(Bandpassfilter) auf ein Wellenlängenband
eingeschränkt wird.
Häufig
ist es zweckmäßig, im
Zuge von Untersuchungen zwischen den beiden genannten Beleuchtungsarten
umzuschalten.
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Bei
manchen Anwendungen wird die Möglichkeit
ausgenutzt, dass Farbstoffe durch Beleuchtung/Anregung mit hinreichender
Intensität
ausgebleicht werden können.
Dabei ist häufig
ein Wechsel zwischen einer solchen Beleuchtung/Anregung und einer
Beleuchtung/Anregung für
die klassische Fluoreszenzmikroskopie im Zuge von Untersuchungen zweckmäßig. Die
Beleuchtung zum Ausbleichen einer Probe kann im Hinblick auf die
benötigte
Intensität
mit einem Laser durchgeführt
werden, während für die klassische
Fluoreszenzmikroskopie die Probe zweckmäßig mit dem Licht einer Bogenlampe
angeregt werden kann, welches durch einen Bandpassfilter auf ein
beispielsweise die Laserwellenlänge
enthaltendes Wellenlängenband
eingeschränkbar
ist.
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Im
Bereich der Mikroskopie werden bisher zur Vereinigung von Strahlengängen gewöhnliche Strahlteiler
eingesetzt, die den Nachteil haben, dass die in der gewünschten
Richtung durchgelassenen oder reflektierten Strahlen immer entsprechend
dem Teilungsverhältnis
des Strahlteilers abgeschwächt werden.
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Neben
dem Zusammenführen
von Licht unterschiedlicher Wellenlänge besteht insbesondere auch
Interesse daran, Licht gleicher oder im Wesentlichen gleicher Wellenlänge zusammenzuführen, etwa
für Anwendungen
wie vorangehend angesprochen.
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Demgegenüber ist
es eine Aufgabe der Erfindung, eine Objektuntersuchungseinrichtung
der angesprochenen Art anzugeben, bei der wenigstens zwei Strahlengänge zur
Beleuchtung bzw. Anregung eines Objekts so zum Objektbereich geführt sind, dass
die zur Verfügung
stehende Intensität
gut ausnutzbar ist, und ein Wechsel zwischen wenigstens zwei Beleuchtungsarten/Anregungsarten
schnell möglich
ist.
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Erfindungsgemäß wird daher
für die
angesprochene optische Objektuntersuchungseinrichtung vorgeschlagen,
dass diese wenigstens einen einem ersten und einem zweiten der weiteren
Strahlengänge
zugeordneten polarisierenden Strahlteiler aufweist, wobei der erste
Strahlengang derart durch den polarisierenden Strahlteiler verläuft, dass
von über den
ersten Strahlengang einfallendem Licht zumindest Licht einer ersten
Polarisation durch den polarisierenden Strahlteiler in Richtung
zum Objektbereich durchgelassen wird, und wobei vermittels des polarisierenden
Strahlteilers zwei unter einem Winkel zueinander verlaufende Abschnitte
des zweiten Strahlengangs derart aneinander angeschlossen sind, dass
von über
den einen Abschnitt des zweiten Strahlengangs einfallendem Licht
zumindest Licht einer zweiten Polarisation durch den polarisierenden Strahlteiler
in den anderen Abschnitt des zweiten Strahlengangs in Richtung zum
Objektbereich reflektiert wird.
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Dadurch,
dass der polarisierende Strahlteiler für s-polarisiertes Licht ein hohes
Reflexionsvermögen
aufweist, und für
p-polarisiertes Licht gute Transmissionseigenschaften aufweist,
ist es mit Hilfe eines polarisierenden Strahlteilers möglich, linear
polarisiertes Licht mit nur sehr geringen Intensitätsverlusten
zum Objektbereich zu leiten, entweder indem dieses als p-polarisiertes
Licht dem Strahlteiler für
die Transmission in Richtung zum Objektbereich zugeführt wird
oder indem dieses als s-polarisiertes Licht dem Strahlteiler für die Reflexion
in Richtung zum Objektbereich zugeführt wird. Besonders geringe
Intensitätsverluste
ergeben sich also dann, wenn über den
ersten weiteren Strahlengang zum Objektbereich geleitetes Licht
im Bezug zum polarisierenden Strahlteiler p-Polarisation aufweist
und wenn über den
zweiten weiteren Strahlengang zum Objektbereich geleitetes Licht
in Bezug zum polarisierenden Strahlteiler s-Polarisation aufweist.
Unpolarisiertes Licht, das über
den ersten oder den zweiten weiteren Strahlengang zum Objektbereich
geleitet wird, wird durch den polarisierenden Strahlteiler zwangsläufig um
etwa 50% in der Intensität
reduziert. Steht allerdings genug Beleuchtungs-/Anregungsintensität etwa einer
konventionellen Beleuchtungsquelle zur Verfügung, etwa im Falle von Beleuchtungslicht
oder Anregungslicht für
die klassische Fluoreszenzmikroskopie, bei der überdies vom Objekt in der Regel
ein intensitätsstarkes
Signal emittiert wird, ist es weniger kritisch, wenn die Anregungsintensität durch
die Verwendung des polarisierenden Strahlteilers reduziert wird.
Für TIRF-Mikroskopie
oder zum Ausbleichen einer Probe ist die Anregungsintensität allerdings
entscheidend. Die Erfindung bietet diesbezüglich die Möglichkeit, die Intensitätsverluste
bei Anregung mit polarisiertem (Laser-)Licht zu minimieren, durch
Ausnutzung der Eigenschaften des polarisierenden Strahlteilers.
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Polarisierende
Strahlteiler können
beispielsweise mit Dünnschichttechniken
produziert werden. Hier ist das Reflektionsvermögen für die s-Polarisation und das
Transmissionsvermögen
für die
p-Polarisation in Grenzen gestaltbar, so dass die Transmission für unpolarisiertes
Licht in einem gewissen Bereich gestaltbar ist. Zudem kann der pol.
Strahlteiler vorteilhaft so gestaltet werden, dass er nur in einem gewissen
Wellenlängenband
eine hohe Reflektion für die
s-Polarisation aufweist und außerhalb
das unpolarisierte Licht im Wesentlichen verlustfrei transmittiert.
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Es
sind im Prinzip diverse Strahlengangverläufe denkbar. Es wird aber vor
allem daran gedacht, dass der erste Strahlengang und der andere
Abschnitt des zweiten Strahlengangs bereichsweise zumindest näherungsweise
parallel verlaufen oder zusammenfallen.
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Vorteilhaft
kann dem ersten und dem zweiten Strahlengang wenigstens ein dichroitischer
Strahlteiler zugeordnet sein, der vom polarisierenden Strahlteiler
her einstrahlendes Licht der ersten bzw. zweiten Polarisation in
Richtung zum Objektbereich umlenkt. Der Beobachtungsstrahlengang
kann hierbei durch den dichroitischen Strahlteiler verlaufen, so dass – im Falle
einer typischen Anwendungssituation – der dichroitische Strahlteiler
das kurzwellige Beleuchtungs- bzw. Anregungslicht in Richtung zum Objektbereich
reflektiert, während
er das langwellige Fluoreszenzlicht vom Objekt in Richtung zum Beobachtungsbereich
durchlässt.
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Vorteilhaft
kann wenigstens eine Laserlichtquelle vorgesehen sein, die an wenigstens
einem vom ersten und zweiten Strahlengang angeschlossen oder anschließbar ist,
um von der Laserlichtquelle erzeugtes Anregungslicht oder Beleuchtungslicht dem
Objektbereich zuzuführen.
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Die
Laserlichtquelle kann hierbei derart an wenigstens einen vom ersten
und zweiten Strahlengang angeschlossen oder anschließbar sein,
dass von der Laserlichtquelle erzeugtes Anregungslicht oder Beleuchtungslicht
so auf den bzw. auf einen dichroitischen Strahlteiler trifft, dass
es in Bezug zum dichroitischen Strahlteiler s-polarisiert ist.
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Weiterhin
kann die Laserlichtquelle an einem vom ersten und zweiten Strahlengang
angeschlossen oder anschließbar
sein, und es kann eine weitere Lichtquelle, insbesondere eine konventionelle
Lichtquelle wie eine Bogenlampe oder Entladungslampe, am anderen
vom ersten und zweiten Strahlengang angeschlossen oder anschließbar sein,
um von der konventionellen Lichtquelle erzeugtes Anregungslicht
oder Beleuchtungslicht dem Objektbereich zuzuführen. Hiermit ist es möglich, ein
Objekt gleichzeitig mit einer Laserlichtquelle und einer konventionellen Lichtquelle
zu beleuchten und beispielsweise durch ansteuerbare Verschlüsse sehr
schnell, insbesondere quasi instantan, zwischen beiden Anregungs-/bzw. Beleuchtungsquellen
zu wechseln.
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Über einen
vom ersten und zweiten Strahlengang kann Anregungslicht derart dem
Objektbereich zuführbar
sein, dass das Anregungslicht unter einem Einfallswinkel auf eine
Grenzfläche,
insbesondere eine Grenzfläche
des Objektträgers,
trifft, und dass das Anregungslicht an der Grenzfläche reflektiert wird,
um eine Fluoreszenzanregung im Wege von evaneszenten elektromagnetischen
Feldern vorzusehen (so genannte TIRF-Anregung).
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Ferner
kann vorgesehen sein, dass über
einen vom ersten und zweiten Strahlengang Anregungslicht derart
und mit einer derartigen Intensität dem Objektbereich zuführbar ist,
dass geeignete Farbstoffe im Objektbereich ausbleichbar sind. Dadurch
kann das Ausbleichen eines Farbstoffes in einem bestimmten Areal
oder in der gesamten Probe in sehr schnellem Wechsel, insbesondere
quasi instantan mit klassischer Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden,
etwa unter Verwendung mechanischer Schalter und dergleichen.
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Die
optische Objektuntersuchungseinrichtung kann so ausgelegt sein,
dass das Licht der zweiten Polarisation als p-polarisiertes Licht
auf den dichroitischen Strahlteiler trifft. Weiterhin kann das Licht
der ersten Polarisation als s-polarisiertes Licht auf den dichroitischen
Strahlteiler treffen. Dabei können
die beiden Abschnitte des zweiten Strahlengangs in der von der Einrichtungsachse
geschnittenen Ebene, ggf. Horizontalebene, liegen. Insbesondere
können
die das Anregungslicht und das Beleuchtungslicht führenden
Strahlengänge
bis zum dichroitischen Strahlteiler ausschließlich in der von der Einrichtungsachse
geschnittenen Ebene, ggf. Horizontalebene, liegen.
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Alternativ
kann die Objektuntersuchungseinrichtung so ausgelegt sein, dass
das Licht der zweiten Polarisation als s-polarisiertes Licht auf
den dichroitischen Strahlteiler trifft. Weiterhin kann das Licht
der ersten Polarisation als p-polarisiertes Licht auf den dichroitischen
Strahlteiler treffen. Dabei kann der eine Abschnitt des zweiten
Strahlengangs die von der Einrichtungsachse geschnittene Ebene,
ggf. Horizontalebene, oder eine hierzu parallele Ebene schneiden.
Insbesondere kann der eine Abschnitt des zweiten Strahlengangs vertikal
verlaufen, wenn die Objektuntersuchungseinrichtung so ausgelegt
ist, dass die Einrichtungsachse vertikal läuft und die von der Einrichtungsachse
geschnittene Ebene die Horizontalebene ist.
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Gemäß einer
ersten Ausführungsform,
bei der das Licht der zweiten Polarisation als p-polarisiertes Licht
auf den dichroitischen Strahlteiler trifft oder/und das Licht der
ersten Polarisation als s-polarisiertes Licht auf den dichroitischen
Strahlteiler trifft, ist die Laserlichtquelle am zweiten Strahlengang
angeschlossen oder anschließbar.
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Bei
dieser Ausführungsform
kann insbesondere der zweite Strahlengang für die Fluoreszenzanregung im
Wege von evaneszenten elektromagnetischen Feldern (so genannte TIRF-Anregung)
vorgesehen sein. Hierbei reflektiert der polarisierende Strahlteiler
das Licht des zweiten weiteren Strahlengangs in der von der Einrichtungsachse
geschnittenen Ebene, ggf. Horizontalebene, und der dichroitische
Strahlteiler reflektiert das Licht dann in die Einrichtungsachse,
ggf. vertikal, zum Objektbereich hin. Die Reflexionsebenen von polarisierendem
Strahlteiler und dichroitischem Strahlteiler sind also ggf. senkrecht
zueinander und Licht, das in Bezug zum polarisierenden Strahlteiler
s-polarisiert ist, weist in Bezug zum dichroitischen Strahlteiler
p-Polarisation auf. Dies bedeutet, dass Licht aus der am zweiten
Strahlengang ggf. angeschlossenen Laserlichtquelle durch den polarisierenden
Strahlteiler in Richtung zum Objektbereich reflektiert wird und
als p-polarisiertes Licht auf den dichroitischen Strahlteiler trifft.
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Der
zweite Strahlengang ist dann so justiert, dass das Licht vom dichroitischen
Strahlteiler so auf bzw. in das Objektiv und damit auf den Objektträger trifft,
dass es an einer Grenzfläche
des Objektträgers totalreflektiert
wird. Diese Ausführungsform
hat diesbezüglich
allerdings den Nachteil, dass bei einem dichroitischen Strahlteiler
die p-Kante der Reflexion bei kürzeren
Wellenlängen
liegt als die s-Kante. Daher ist es bei p-polarisiertem Licht notwendig, eine
kürzere
Laserwellenlänge
zu wählen,
damit das Licht vom dichroitischen Strahlteiler in Richtung zum
Objektbereich reflektiert wird. Dies kann dazu führen, dass die Anregungswellenlänge nicht
mehr im Absorptionsmaximum des anzuregenden Farbstoffs liegt, da
der dichroitische Strahlteiler gleichzeitig so gewählt werden
muss, dass die Transmission für
Fluoreszenzlicht möglichst
hoch ist, d. h. dass die Fluoreszenzbande des Farbstoffs auf jeden
Fall im Transmissionsbereich des dichroitischen Strahlteilers liegen muss.
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Ferner
kann bei der ersten Ausführungsform vorgesehen
sein, dass der zweite Strahlengang für Zuführung von Anregungslicht zum
Ausbleichen von geeigneten Farbstoffen vorgesehen ist. Hierbei stellt sich
das Problem der kürzerwelligen
p-Kante des dichroitischen Strahlteilers in geringerem Maße, da das
Ausbleichen des Objekts durch direkte Beleuchtung erfolgt, und daher
ein Intensitätsverlust
durch eine Anregung außerhalb
des Absorptionsmaximums nicht ganz so kritisch ist.
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Gemäß einer
zweiten Ausführungsform,
bei der das Licht der zweiten Polarisation als s-polarisiertes Licht
auf den dichroitischen Strahlteiler trifft oder/und das Licht der
ersten Polarisation als p-polarisiertes Licht auf den dichroitischen
Strahlteiler trifft, ist die Laserquelle am ersten Strahlengang
angeschlossen oder anschließbar.
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Weiterhin
kann bei der zweiten Ausführungsform
vorgesehen sein, dass der erste Strahlengang für die Fluoreszenzanregung im
Wege von evaneszenten elektromagnetischen Feldern (so genannte TIRF-Anregung)
vorgesehen ist. Diese Ausführungsform,
bei der die ggf. verwendete Laserlichtquelle am ersten Strahlengang
angeschlossen oder anschließbar
ist und vom polarisierenden Strahlteiler in Richtung zum dichroitischen
Strahlteiler ohne Richtungsänderung
durchgelassen wird, hat die gleichen Probleme wie die erste Ausführungsform,
da auch hier das Laserlicht als p-polarisiertes Licht auf den dichroitischen
Strahlteiler trifft. Zwar sind bei dieser Ausführungsform die Reflexionsebenen
des polarisierenden Strahlteilers und des dichroitischen Strahlteilers
im Wesentlichen parallel zueinander, aber da die Laserlichtquelle
als p-polarisiertes Licht durch den polarisierenden Strahlteiler
durchgelassen wird, weist sie dann auch in Bezug zum dichroitischen
Strahlteiler p-Polarisation auf.
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Ferner
kann bei der zweiten Ausführungsform
vorgesehen sein, dass der erste Strahlengang für Zuführung von Anregungslicht zum
Ausbleichen von geeigneten Farbstoffen vorgesehen ist.
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Bei
einer dritten und gegenüber
der ersten und zweiten Ausführungsform
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, bei der das Licht der zweiten Polarisation
als s-polarisiertes Licht auf den dichroitischen Strahlteiler trifft
oder/und das Licht der ersten Polarisation als p-polarisiertes Licht auf
den dichroitischen Strahlteiler trifft, ist vorgesehen, dass die
Laserlichtquelle am zweiten Strahlengang angeschlossen oder anschließbar ist.
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Vorteilhaft
kann bei der dritten Ausführungsform
vorgesehen sein, dass der zweite Strahlengang für die Fluoreszenzanregung im
Wege von evaneszenten elektromagnetischen Feldern (so genannte TIRF-Anregung)
vorgesehen ist. Bei dieser Ausführungsform
ist die vorzugsweise verwendete Laserlichtquelle am zweiten Strahlengang
angeschlossen und es sind bei dieser Ausführungsform die Reflexionsebenen
des polarisierenden Strahlteilers und des dichroitischen Strahlteilers
zueinander im Wesentlichen parallel, so dass das bezüglich des
polarisierenden Strahlteilers s-polarisierte Laserlicht, das am
polarisierenden Strahlteiler reflektiert wurde, auch bezüglich des
dichroitischen Strahlteilers s-Polarisation aufweist.
Dadurch kann unter Ausnutzung der längerwelligen Reflexionskante
für s-polarisiertes
Licht am dichroitischen Strahlteiler eine größere Wellenlänge für die TIRF-Anregung
gewählt
werden, so dass das Anregungslicht für eine möglichst hohe Fluoreszenzintensität näher am Absorptionsmaximum des
Farbstoffs liegen kann, und trotzdem noch vom dichroitischen Strahlteiler
in Richtung zum Objektbereich reflektiert wird.
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Ferner
kann bei der dritten Ausführungsform vorgesehen
sein, dass der zweite Strahlengang für Zuführung von Anregungslicht zum
Ausbleichen von geeigneten Farbstoffen vorgesehen ist.
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Bei
einer vierten und gegenüber
der ersten und zweiten Ausführungsform
ebenfalls bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, bei der das Licht der zweiten Polarisation
als p-polarisiertes Licht auf den dichroitischen Strahlteiler trifft
oder/und das Licht der ersten Polarisation als s-polarisiertes Licht
auf den dichroitischen Strahlteiler trifft, ist vorgesehen, dass
die Laserlichtquelle am ersten Strahlengang angeschlossen oder anschließbar ist.
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Vorteilhaft
kann bei der vierten Ausführungsform
vorgesehen sein, dass der erste Strahlengang für die Fluoreszenzanregung im
Wege von evaneszenten elektromagnetischen Feldern (so genannte TIRF-Anregung)
vorgesehen ist. Bei dieser Ausführungsform
ist die vorzugsweise verwendete Laserlichtquelle am ersten Strahlengang
angeschlossen und es sind bei dieser Ausführungsform die Reflexionsebenen
des polarisierenden Strahlteilers und des dichroitischen Strahlteilers
zueinander im Wesentlichen senkrecht, so dass das bezüglich des
polarisierenden Strahlteilers p-polarisierte Laserlicht, das durch
den polarisierenden Strahlteiler durchgelassen wird, bezüglich des
dichroitischen Strahlteilers s-Polarisation
aufweist. Dadurch kann, wie bei der dritten Ausführungsform, die längerwellige
s-Kante des dichroitischen Strahlteilers ausgenutzt werden.
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Bei
der erfindungsgemäßen Objektuntersuchungseinrichtung
wird der Beobachtungsstrahlengang in der Regel als Mikroskopstrahlengang
ausgeführt
sein. Die optische Objektuntersuchungseinrichtung kann ein wenigstens
den Objektbereich, den Beobachtungsstrahlengang und die weiteren
Strahlengänge
aufweisendes Mikroskop umfassen. Dieses Mikroskop kann als Aufrecht-Mikroskop
oder vorzugsweise als Invers-Mikroskop
ausgeführt
sein. Es wird vor allem daran gedacht, dass das Mikroskop als Abbildungs-Mikroskop
ausgeführt
ist, das über
den Beobachtungsstrahlengang optisch ein Bild in den Bildbereich
oder Beobachtungsbereich abbildet.
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Wie
implizit schon angedeutet, kann die optische Objektuntersuchungseinrichtung
eine wenigstens den Objektbereich, den Beobachtungsstrahlengang
und die weiteren Strahlengänge
aufweisende, ggf. das Mikroskop umfassende Fluoreszenzmessvorrichtung
umfassen.
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Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Untersuchung von Objekten
auf optischem Wege unter Verwendung einer erfindungsgemäßen optischen Objektuntersuchungseinrichtung.
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Bereitgestellt
wird insbesondere ein solches Verfahren, bei dem Laserlicht über den
ersten oder zweiten Strahlengang derart eingestrahlt wird, dass es
als s-polarisiertes Licht auf den bzw. auf einen dichroitischen
Strahlteiler trifft und in Richtung zum Objektbereich umgelenkt
wird. Dabei kann über
den anderen Strahlengang vom ersten und zweiten Strahlengang konventionelles
Licht eingestrahlt werden, welches als p-polarisiertes Licht auf
den dichroitischen Strahlteiler trifft und in Richtung zum Objektbereich
umgelenkt wird.
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Nach
einer besonders bevorzugten Ausgestaltung trifft das Laserlicht
unter einem Einfallswinkel auf eine Grenzfläche, insbesondere eine Grenzfläche des
Objektträgers.
Das Laserlicht wird dann an der Grenzfläche vollständig reflektiert, um eine Fluoreszenzanregung
im Wege von evaneszenten elektromagnetischen Feldern vorzusehen
(so genannte TIRF-Anregung).
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Nach
einer weiteren bevorzugten Auslegung wird das Laserlicht derart
und mit einer derartigen Intensität dem Objektbereich zugeführt, dass
geeignete Farbstoffe im Objektbereich ausbleichen.
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand von in den Figuren gezeigten,
keinesfalls beschränkend auszulegenden
Ausführungsbeispielen
näher erläutert.
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1 zeigt
die prinzipiellen Transmissionseigenschaften eines polarisierenden
Strahlteilers für eingestrahltes
Licht unterschiedlicher Polarisationen.
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2 ist
eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung.
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3 ist
eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung.
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4 zeigt
die prinzipiellen Reflexionseigenschaften eines dichroitischen Strahlteilers.
Gleichzeitig sind zur Information ein Absorptionsspektrum und ein
Emissionsspektrum eines Farbstoffs eingezeichnet.
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5 ist
eine schematische Darstellung einer dritten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung.
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6 ist
eine schematische Darstellung einer vierten, ebenfalls bevorzugten,
Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung.
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7 ist
eine schematische Darstellung einer fünften Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung.
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Aus 1 ist
ersichtlich, dass ein polarisierender Strahlteiler eine hohe Durchlässigkeit
für p-polarisiertes
Licht und ein hohes Reflexionsvermögen für s-polarisiertes Licht aufweist.
Unpolarisiertes Licht, das auf einen polarisierenden Strahlteilennrürfel eingestrahlt
wird, wird etwa zur Hälfte
durchgelassen und zur Hälfte
reflektiert, wobei das durchgelassene Licht hinter dem Strahlteilerwürfel p-Polarisation
aufweist und das reflektierte Licht s-Polarisation. In den Ausführungsbeispielen
der 2, 3, 5 und 6 wird
ein polarisierender Strahlteiler dazu benutzt, Licht aus einer polarisierten
Lichtquelle, wie beispielsweise einer Laserlichtquelle, und aus einer
unpolarisierten Lichtquelle, wie beispielsweise einer Bogenlampe,
zu vereinigen. Dabei kann das entsprechend polarisierte Laserlicht
fast verlustfrei in Richtung zum Objektbereich geleitet werden,
während
vom unpolarisierten Licht immerhin noch etwa die Hälfte der
ursprünglichen
Intensität
in Richtung zum Objektbereich geleitet wird.
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2 zeigt
ein erfindungsgemäßes Mikroskop 10 gemäß einer
ersten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Zur Verdeutlichung der Lage der Strahlengänge im Raum
ist ein Koordinatensystem eingezeichnet, wobei die x- und y-Achse
eine horizontale Ebene aufspannen und die z-Achse vertikal verläuft. Das
Mikroskop umfasst einen Objektbereich 12, in den eine zu
untersuchende Probe zu platzieren ist, ein Objektiv 14,
einen dichroitischen Strahlteiler 16, einen Langpassfilter 18,
eine Abbildungsoptik 20 und einen Beobachtungsbereich,
beispielsweise eine OCD-Kamera, 22. Weiterhin sind zur
Beleuchtung bzw. Anregung der Probe zwei Lichtquellen vorgesehen,
eine Bogenlampe 24 mit einem Bandpassfilter 26 und
eine Laserlichtquelle 28. Von der Bogenlampe 24 ausgehendes
Licht verläuft
in einem ersten weiteren Strahlengang 34, 38 durch
den Bandpassfilter 26 und einen polarisierenden Strahlteilerwürfel 30,
der den p-polarisierten Anteil dieses Lichts zum dichroitischen
Strahlteiler 16 durchlässt.
Von der Laserlichtquelle 28 ausgehendes Licht, das in Bezug
zum polarisierenden Strahlteilerwürfel s-polarisiert ist, verläuft entlang
eines ersten Abschnitts 36 eines zweiten weiteren Strahlengangs
und wird dann am polarisierenden Strahlteiler 30 in Richtung
zum dichroitischen Strahlteiler 16 in einen zweiten Abschnitt 38 des
zweiten weiteren Strahlengangs reflektiert, wobei dieser zweite
Abschnitt 38 des zweiten weiteren Strahlengangs im Wesentlichen
mit dem Abschnitt des ersten weiteren Strahlengangs 34, 38 zwischen dem
polarisierenden Strahlteilerwürtel
und dem dichroitischen Strahlteiler 16 zusammenfällt.
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In
Bezug zum dichroitischen Strahlteiler 16 ist das vom Strahlteilerwürfel durchgelassene
Licht von der Bogenlampe s-polarisiert und ist das vom Strahlteilerwürfel reflektierte
Licht vom Laser p-polarisiert, wie in 2 durch
die Schwingungsrichtung des elektrischen Wechselfeldes repräsentierende Pfeile
angedeutet.
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Der
dichroitische Strahlteiler 16 reflektiert kürzerwelliges
Anregungs- und/oder
Beleuchtungslicht von der Bogenlampe 24 und von der Laserlichtquelle 28 in
Richtung zum Objektiv 14 und Objektbereich 12 und
lässt längenwelliges
Fluoreszenzlicht vom Objektbereich 12 in Richtung zum Beobachtungsbereich 22 durch.
Da die Reflexionsebene des polarisierenden Strahlteilerwürfels 30 die
von der x- und y-Achse aufgespanne Horizontalebene ist, hat das
bezüglich
des polarisierenden Strahlteilerwürfels 30 s-polarisierte
Laserlicht ein in z-Richtung schwingendes elektrisches Feld, wie
schon angesprochen. Die Reflexionsebene des dichroitischen Strahlteilers ist
die von der x- und der z-Achse
aufgespannte Ebene, so dass das bezüglich des polarisierenden Strahlteilerwürfels 30 s-polarisierte
Laserlicht in Bezug auf den dichroitischen Strahlteiler 16 p-Polarisation
aufweist, da das in z-Richtung schwingende elektrische Feld parallel
zur Reflexionsebene am dichroitischen Strahlteiler 16 schwingt.
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Von
der im Objektbereich 12 befindlichen Probe ausgehendes
Fluoreszenzlicht wird durch das Objektiv 14 auf den dichroitischen Strahlteiler 16 geleitet,
der es in Richtung zum Langpassfilter 18 durchlässt. Der
Langpassfilter 18 hat die Aufgabe, Anregungs- bzw. Beleuchtungslicht
auszufiltern und nur Fluoreszenzlicht von der Probe in Richtung
zur Abbildungsoptik 20 und zum Beobachtungsbereich 22,
beispielsweise einer CCD-Kamera, durchzulassen.
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In
den beiden Strahlgängen
können
jeweils zwischen der Bogenlampe 24 und dem Strahlteüerwürfel 30 einerseits
und zwischen der Laserlichtquelle 28 und dem Strahlteilerwürfel 30 andererseits Strahlgangunterbrechungsvorrichtungen,
wie etwa ansteuerbare Verschlüsse
und dergleichen, angeordnet sein, um ein quasi-instantanes Umschalten
zwischen einer Beleuchtung bzw. Anregung auf Grundlage der Bogenlampe
und einer Beleuchtung bzw. Anregung auf Grundlage der Laserlichtquelle
zu ermöglichen.
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Im
Folgenden werden weitere Ausführungsbeispiele
beschrieben, wobei für
identische, analoge oder entsprechende Komponenten die gleichen
Bezugszeichen verwendet werden, jeweils erhöht um 100. Soweit nichts anderes
ausgeführt
ist, gelten die Ausführungen
zu dem vorangehend beschriebenen Ausführungsbeispiel auch für die nachfolgend
behandelten Ausführungsbeispiele.
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3 zeigt
eine zweite Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, bei der einer der weiteren Strahlengänge für Anregungs-
bzw. Beleuchtungslicht zumindest teilweise nicht – wie in
der Mikroskopie sonst üblich – in der
horizontalen Ebene, sondern vertikal angeordnet ist. Dadurch beschränkt sich
die gesamte Strahlenführung
auf eine von der x- und der z-Achse aufgespannte Ebene.
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Ein
Mikroskop 110 gemäß der zweiten
Ausführungsform
umfasst einen Objektbereich 112, ein Objektiv 114,
einen dichroitischen Strahlteiler 116, einen Langpassfilter 118,
eine Abbildungsoptik 120 und einen Beobachtungsbereich 122,
beispielsweise eine CCD-Kamera. Weiterhin sind zur Beleuchtung bzw.
Anregung eine im Objektbereich 112 befindlichen Probe eine
Bogenlampe 124 mit einem dazugehörigen Bandpassfilter 126 und
eine Laserlichtquelle 128 vorgesehen. Gemäß der zweiten
Ausführungsform
verläuft
Licht aus der Laserlichtquelle 128 entlang des ersten Strahlengangs 134, 138 durch
einen polarisierenden Strahlteilerwürtel 130 zum dichroitischen
Strahlteiler 118. Licht aus der Bogenlampe 124 verläuft entlang
eines ersten Abschnitts 136 eines zweiten weiteren Strahlengangs
zum polarisierenden Strahlteilerwürfel 130, der den
s-polarisierten Anteil dieses Lichts in einen zweiten Abschnitt 138 des zweiten
weiteren Strahlengangs in Richtung zum dichroitischen Strahlteiler 116 umlenkt.
Der zweite Abschnitt 138 des zweiten weiteren Strahlengangs
fällt dabei
im Wesentlichen mit dem Abschnitt des ersten Strahlengangs 134, 138 zwischen
dem polarisierenden Strahlteilerwürfel und dem dichroitischen Strahlteiler 116 zusammen.
Da bei dieser Ausführungsform
die Reflexionsebene sowohl des polarisierenden Strahlteilerwürfels als
auch des dichroitischen Strahlteilers in der von der x- und der
z-Achse aufgespannten Ebene liegen, ist das bezüglich des polarisierenden Strahlteilerwürfels 130 p-polarisierte Laserlicht,
das zum dichroitischen Strahlteiler 116 durchgelassen wird,
auch in Bezug zum dichroitischen Strahlteiler 116 p-polarisiert.
Der bezüglich des
polarisierenden Strahlteilerwürfels 130 s-polarisierte
Anteil des Lichts aus der Bogenlampe 124, der zum dichroitischen
Strahlteiler 116 reflektiert wird, ist auch bezüglich des
dichroitischen Strahlteilers 116 s-polarisiert.
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Sowohl
bei der ersten als auch bei der zweiten oben erläuterten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung trifft daher bezüglich des dichroitischen Strahlteilers 116 p-polarisiertes
Laserlicht auf den dichroitischen Strahlteiler 116. 4 zeigt
das Reflexionsvermögen
eines dichroitischen Langpassstrahlteilers. Dabei ist ersichtlich,
dass die s-Kante bei längeren
Wellenlängen
liegt als die p-Kante. Der Abstand der Kanten kann 20 bis 30 nm
betragen. 4 zeigt weiterhin schraffiert
ein Absorptionsspektrum und ein Emissionsspektrum für einen
in Verbindung mit dem beispielsweise dem Strahlteiler 16 bzw. 116 entsprechenden Langpassstrahlteiler
verwendbaren Farbstoff. Das Absorptionsspektrum und Emissionsspektrum
sind relativ zueinander verschoben. Es besteht das grundsätzliche
Interesse, möglichst viel
Emissionslicht zu detektieren und gleichzeitig den Farbstoff nahe
dem Maximum der Absorption anregen zu können. Daher muss die Lage der
Kante des zum jeweiligen Farbstoff passenden dichroitischen Strahlfieilers
geschickt gewählt
werden. Wegen des endlichen Wellenlängenbereichs zwischen Sperr-
und Durchlassbereich ist jedoch ein Kompromiss notwendig. Bei der
in 4 gezeigten Lage der Farbstoffspektren relativ
zur Reflexionskante des dichroitischen Strahlteilers wird zwar das
vom Farbstoff emittierte Licht größtenteils in Richtung zum Beobachtungsbereich
durchgelassen, bei Anregung mit p-polarisiertem Laserlicht ist es
allerdings nicht möglich,
eine Anregungswellenlänge
zu wählen,
die nahe des Absorptionsmaximums liegt und vom dichroitischen Strahlteiler
in Richtung zum Objektbereich reflektiert wird. Es ist also vorteilhaft,
den Farbstoff mit s-polarisiertem Laserlicht anzuregen, um die längerwellige
Reflexionskante für
s-polarisiertes Licht ausnutzen zu können, und daher eine Anregungswellenlänge wählen zu
können,
die näher
am Absorptionsmaximum des Farbstoffs liegt.
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Letzteres
ist bei einer dritten und bevorzugten Ausführungsform möglich. 5 zeigt
ein Beispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 210,
bei dem – wie
bei der zweiten Ausführungsform – alle Strahlengänge in einer
von der x- und der z-Achse aufgespannten Ebene verlaufen. Licht,
das von der Bogenlampe 224 ausgeht und durch den Bandpassfilter 226 durchgelassen
wird, verläuft
entlang eines ersten weiteren Strahlengangs 234, 238 durch
den polarisierenden Strahlteilerwürfel 230, der den
p-polarisierten Anteil dieses Lichts in Richtung zum dichroitischen
Strahlteiler 216 durchlässt.
Von der Laserlichtquelle 228 ausgehendes s-polarisiertes
Licht verläuft
entlang eines ersten Abschnitts 236 eines zweiten weiteren
Strahlengangs zum polarisierenden Strahlteilerwürfel 230, der es in
einen zweiten Abschnitt 238 des zweiten weiteren Strahlengangs
in Richtung zum dichroitischen Strahlteiler 216 reflektiert.
Bei dieser Ausführungsform
sind die Reflexionsebenen von polarisierendem Strahlteilerwürfel 230 und dichroitischem
Strahlteiler 216 zueinander parallel, so dass bezüglich des
polarisierenden Strahlteilerwürfels 230 s-polarisiertes
Laserlicht auch bezüglich
dem dichroitischen Strahlteiler 216 s-polarisiert ist.
Damit kann für
die Zuführung
des Anregungslaserlichts die längerwellige
s-Kante des dichroitischen Strahlteilers 216 ausgenutzt
werden (siehe 4) und es ist daher möglich, den
Farbstoff näher
am Absorptionsmaximum anzuregen. Es wird eine größere Fluoreszenzausbeute erzielt.
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6 zeigt
eine vierte und ebenfalls bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung, bei der wie bei der ersten Ausführungsform die Beleuchtungs-/Anregungsstrahlengänge in einer
von der x- und der y-Achse aufgespannten Ebene verlaufen. Im Unterschied
zur ersten Ausführungsform
ist hier allerdings der Laser 328 an den ersten Beleuchtungs-/Anregungsstrahlengang 334, 338 angeschlossen,
so dass der polarisierende Strahlteiler 330 das bezüglich des
polarisierenden Strahlteilers 330 p-polarisierte Laserlicht
in Richtung zum dichroitischen Strahlteiler 316 durchlässt. Eine
Bogenlampe 324 ist an den zweiten Beleuchtungs-/Anregungsstrahlengang 336, 338 angeschlossen,
so dass der polarisierende Strahlteiler 330 den Anteil
des Lichts von der Bogenlampe 324, der bezüglich des
polarisierenden Strahlteilers 330 s-polarisiert ist, in Richtung zum dichroitischen
Strahlteiler 316 umlenkt. Da bei dieser Ausführungsform
die Reflexionsebenen des polarisierenden Strahlteilerwürfels und
des dichroitischen Strahlteilers senkrecht aufeinander stehen, ist
das vom polarisierenden Strahlteiler 330 durchgelassene
Laserlicht in Bezug zum dichroitischen Strahlteiler 316 s-polarisiert, wie
in 6 durch die Schwingungsrichtung des elektrischen Wechselfeldes
repräsentierende
Pfeile angedeutet. Damit kann wie bei der dritten Ausführungsform
für die
Zuführung
des Anregungslaserlichts die längerwellige
s-Kante des dichroitischen Strahlteilers 316 ausgenutzt
werden (siehe 4) und es ist daher möglich, den
Farbstoff näher
am Absorptionsmaximum anzuregen und eine größere Fluoreszenzausbeute zu
erzielen.
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7 zeigt
eine fünfte
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung mit einem Mikroskop 410, das
als Durchlichtmikroskop ausgeführt
ist, so dass Anregungs- und Beleuchtungslicht von unten auf den Objektbereich 412 trifft
und Fluoreszenzlicht von der Probe nach oben zum Beobachtungsbereich 422 geleitet
wird. Auch bei diesem Durchlichtmikroskop wird Licht von der Bogenlampe 424 und
von der Laserlichtquelle 428 mittels eines polarisierenden Strahlteilerwürfels 430 vereinigt
und in Richtung zum Objektbereich 412 durchgelassen bzw.
umgelenkt. Bei dieser Geometrie kann ein dichroitischer Strahlteiler
entfallen. Die Trennung des Anregungs- und Beleuchtungslichts von dem vom
Farbstoff emittierten Fluoreszenzlicht kann lediglich auf Grundlage des
Langpassfilters 418 erfolgen.
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Aufgrund
der Transmissionseigenschaften des polarisierenden Strahlteilerwürfels 430 (siehe 1)
ist das Licht, das über
den ersten Strahlengang 434, 438 zum Objektiv 440 und
zum Objektbereich 412 geleitet wird, im Abschnitt 438 hinter
dem polarisierenden Strahlteiler 430 zwangsläufig in
Bezug zum polarisierenden Strahlteiler 430 p-polarisiert und
Licht, das über
den zweiten Strahlengang 436, 438 zum Objektiv 440 und
zum Objektbereich 412 geleitet wird, zwangsläufig in
Bezug zum polarisierenden Strahlteiler 430 s-polarisiert.
Da beim Durchlichtmikroskop 410 ein dichroitischer Strahlteiler
entfallen kann, macht es hier für
die Fluoreszenzausbeute keinen Unterschied, ob, wie in 7 gezeigt, s-polarisiertes Laserlicht über den
zweiten Strahlengang 436, 438 und p-polarisiertes Licht
von der Bogenlampe über
den ersten Strahlengang 434, 438 zum Objektbereich
geleitet werden, oder ob alternativ ein Laser 428, der
p-polarisiertes Licht emittiert, an den ersten Strahlengang 434, 438 und
eine Bogenlampe 424 an den zweiten Strahlengang 436, 438 angeschlossen
ist.
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Es
ist darauf hinzuweisen, dass man je nach Zweckmäßigkeit die Strahlengänge bzw.
Strahlengangabschnitte zwischen Laserlichtquelle und Strahlteilerwürfel, zwischen
Bogenlampe und Strahlteilerwürfel
und zwischen Strahlteilerwürfel
und dichroitischem Strahlteiler in Abweichung von den gezeigten
Ausführungsbeispielen
nicht geradlinig, sondern aus mehreren, über Umlenkelemente verbundenen
Strahlgangsegmenten ausführen
kann, etwa wenn dies im Hinblick auf gewisse Platzverhältnisse
und sonstige Anforderungen vorteilhaft ist. Entsprechendes gilt
auch für
den Beobachtungsstrahlengang zwischen Objektbereich und Beobachtungsbereich.
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Die
optischen Objektuntersuchungseinrichtungen bzw. Mikroskope gemäß 1 bis 7 lassen
sich vorteilhaft für
vielfältige
Untersuchungen und Analysen verwenden, speziell auch für fluoreszenzmikroskopische
Anwendungen. Ein wichtiges Beispiel ist die TIRF-Mikroskopie. Es
können
hier in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Strahlgangführung die
im Stand der Technik bekannten Techniken für die Einkopplung der TIRF-Anregungsstrahlung
in die die TIRF-Reflexionsgrenzfläche aufweisende optische Komponente,
insbesondere Objektträger,
verwendet werden. Es kann beispielsweise ein Mikroskopobjektiv mit
hoher numerischer Apertur verwendet werden. Es kann dann das Laserlicht
vermittels einer Linsenanordnung in die Fokusebene des Objektivs
bzw. der Objektivlinse fokussiert werden, und zwar in einen Seitenabstand
zur optischen Achse, so dass das aus der Objektivlinse zuerst in ein Öl-Immersionsmedium
und dann in einen Glas-Objektträger
eintretende Laserlicht unter einem Winkel auf eine Grenzfläche zwischen
dem Objektträger
und einem demgegenüber
optisch dünneren Medium,
beispielsweise Wasser, trifft, dass das Laserlicht an der Grenzfläche totalreflektiert
wird und dass in das optisch dünnere
Medium nur evaneszente elektromagnetische Felder eintreten. Soweit
erforderlich, können
bei den Anordnungen gemäß den 2, 3, 5, 6 und 7 für die Implementierung
der TIRF-Mikroskopie noch zusätzliche Komponenten
eingesetzt werden. Hierzu ist der Fachmann auf Grundlage seiner
Kenntnisse in der Lage. Ergänzend
wird auf den Inhalt der am 17.12.2003 eingereichten PCT-Anmeldung,
Aktenzeichen PCT/EP 03/014405 bzw. der dieser zugrundeliegenden
deutschen Patentanmeldung 102 58 945.3 vom 17.12.2002 mit dem Titel „Fluoreszenzbasierte
optische Objektuntersuchungseinrichtung, insbesondere für die TIRF-Mikroskopie" verwiesen. Dieser
Inhalt wird durch Bezugnahme in den Inhalt der vorliegenden Anmeldung
einbezogen.
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Vorgeschlagen
wird unter anderem eine optische Objektuntersuchungseinrichtung,
bei der Beleuchtungs- und Anregungslicht aus zwei verschiedenen
Lichtquellen, wie beispielsweise einem Laser und einer Bogenlampe,
mittels eines polarisierenden Strahlteilers zum Objektbereich hin
durchgelassen bzw. umgelenkt werden. Dabei kann Laserlicht so eingekoppelt
werden, dass es sich für
TIRF-Mikroskopie oder zum Ausbleichen einer Probe eignet, während mit
dem Licht der Bogenlampe gleichzeitig oder in schnellem Wechsel
klassische Fluoreszenzmikroskopie betrieben werden kann.