DE10164501A1

DE10164501A1 - Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse einer Lymphoid-Zellteilungsstörung

Info

Publication number: DE10164501A1
Application number: DE10164501A
Authority: DE
Inventors: Matthias Burger; Buelent Genc; Evelyne Lipscher; Charles Caldwell; Sabine Maier; Inko Nimmrich
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-11-23
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2003-06-12

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft chemisch modifizierte genomische Sequenzen, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustandes von genomischer DNA, sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von Genen zur Verwendung bei der Differenzierung, Diagnose, Behandlung und/oder Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen, oder der Prädisposition für Lymphoid-Zellteilungsstörungen.

Description

Gebiet der Erfindung

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Translation dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene oder des Genoms korrelierbar. Insofern können sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms äußern.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Analyse von Lymphoid-Zellteilungsstörungen, die Unterscheidung zwischen Unterklassen dieser Erkrankung oder den Nachweis einer Prädisposition für diese Erkrankungen, durch Untersuchung der genetischen und/oder epigenetischen Parameter genomischer DNA und insbesondere deren Cytosin-Methylierungszustand.
Lymphome, z. B. solide Tumore von lymphoiden Zellen, fallen in zwei getrennte Gruppen: Hodgkin's Lymphom und Nicht-Hodgkin's Lymphom (NHL). In den Vereinigten Staaten wurde das Auftreten von NHL im Jahr 2000 auf 55 000 Fälle geschätzt, die zu geschätzten 26 000 Todesfällen führten. NHL ist die Ursache von 5% neuen Krebsfällen bei Männern und 4% von neuen Krebsfällen bei Frauen pro Jahr in den USA und ist verantwortlich für 5% der Todesfälle. 1997 wurde über NHL berichtet, daß es die führende Ursache von Tod durch Krebs bei Männern in einem Alter von zwischen 20 und 39 ist (Greenlee et al., Cancer J Clin 2000, 50: 7).
Nicht-Hodgkins's Lymphom (NHL) kann weiter in verschiedene Klassen gemäß seiner Abstammung von verschiedenen Differenzierungsstadien von B- oder T-Lymphozyten subklassifiziert werden.
Für B-Zell NHLs, können die folgenden Klassen auf zytologischer Basis unterschieden werden:

- chronische lymphozytische Leukämie/kleines lymphozytisches Lymphom (CLL/SLL, abstammend von der Mantelzone eines Lymphfollikels)
- Mantelzell-Lymphom (MCL, abstammend von der Mantelzone eines Lymphfollikels)
- follikuläres Lymphom (FL, abstammend vom Stammzellzentrum eines Lymphfollikels)
- diffuses großes B-Zell-Lymphom (DLBCL, abstammend vom Stammzellzentrum eines Lymphfollikels)
- lymphoplasmazytoides Lymphom (LPL, abstammend von dem Stammzellzentrum eines Lymphfollikels)
- Burkitt's Lymphom (BL, abstammend von dem Stammzellzentrum eines Lymphfollikels)
- Schleimhaut-assoziiertes lymphoides Gewebelymphom (MALT, abstammend von der marginalen Zone eines Lymphfollikels).

Eine korrekte Klassifizierung von NHL-Subtypen ist essentiell, da der klinische Ausgang und die Therapieoptionen zwischen den Klassen stark variieren. Insbesondere ist die korrekte Identifizierung von Mantelzell-Lymphomen von anderen β-Zell-Lymphomen klinisch relevant, da ein Mantelzell-Lymphom eine wesentlich aggressivere Erkrankung ist und eine signifikant kürzere Überlebenszeit zeigt, als andere histologisch verwandte Formen (Berger et al., Blood 1994, 83; 2829, Fisher et al., Blood 1995, 85: 1075). CLL/SLL, die von derselben Zone des Lymphfollikels wie die Mantelzell-Lymphome abstammen und oftmals Mantelzell- Lymphomen ähnlich sehen was die Morphologie betrifft, schreiten normalerweise relativ langsam fort und werden herkömmlich mit Chlorambucil und Cyclophosphamid behandelt. Im Unterschied dazu zeigen MCLs eine gesamte Überlebenszeit von drei Jahren mit einer Versagensfreien Überlebenszeit von einem Jahr nach Behandlung. MCL wird typischerweise mit Schemata behandelt, die Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin und Prednison enthalten. Aufgrund der schlechten Aussichten werden junge Patienten mit Mantelzell- Lymphomen oftmals autologen oder allogenischen Knochenmarkstransplantationen unterzogen (Stewart et al., Ann Oncol 1995, 6: 263). Seit kürzerem kann MCL mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab behandelt werden (Coiffier et al., Haematologica. 1999, 84: 14-8.).
Jedes dieser Neoplasien weist eine charakteristische Morphologie auf, die in einem bestimmten Fall vielleicht ausreichend sein kann, um eine Diagnose und Klassifizierung alleine aus morphologischen Gründen zu ermöglichen, wenn gut präparierte Schnitte erhältlich sind. Jedoch erfordert die histologische Diagnose von malignen Lymphomen viel Erfahrung und in Fällen, die mit einer atypischen Morphologie vorliegen, kann eine Klassifizierung nicht auf histologischen Gründen allein erhalten werden. In diesen Fällen sind zusätzliche Marker, wie zum Beispiel Immun-Phänotypisierung und Zytogenetik essentiell, um die Lymphome korrekt zu klassifizieren, wobei in den meisten anderen Fällen diese Verfahren hilfreich sind (Armitage et al., Principles & Practice of Oncology. De Vita VT, Hellmann S. Rosenberg SA. 6^th Edition).
In den letzten 20 Jahren wurde ein signifikanter Fortschritt erreicht, diese Subklassen auf zytologischem, zytogenetischem und molekularem Niveau zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, daß die meisten dieser genetischen Läsionen sich selektiv mit spezifischen NHL-Subtypen assoziieren lassen (Harris et al. Blood 1994, 84; 1361, Harris et al., J Clin Oncol 1999, 17: 3835). Das Wissen um spezifische molekulare Veränderungen hat das System der Klassifizierung verbessert und hilft, Patienten auf eine mehr klinisch relevante Weise zu kategorisieren.
Molekulare Marker bieten den Vorteil, daß sogar Biopsie-Proben von sehr kleinen Größen und Proben, deren Gewebearchitektur nicht aufrecht erhalten wurde, ziemlich effizient analysiert werden können. Zusätzlich werden neue Einsichten in die Immunologie und Genetik von Lymphomen fortschreitend neue therapeutische Ansätze eröffnen, z. B. monoklonale Antikörper, die gegen spezifische Proteine auf der Oberfläche von malignen Lymphomzellen gerichtet sind, die bereits weit angewendet wurden. Ebenfalls können molekulare Marker zu einem frühen Nachweis und der Überwachung auf einen Rückfall nach oder während der Therapie verwendet werden, mit einer mehrfach höheren Sensitivität im Vergleich zu Standard- Diagnostik-Techniken (Corradini et al., Leukemia 1999, 13: 1691). Innerhalb des letzten Jahrzehnts konnte von zahlreichen Genen gezeigt werden, daß sie zwischen verschiedenen Subtypen von NHLs unterschiedlich exprimiert werden. Zum Beispiel zeigen CLL/SLL-Fälle eine konsistente Hochregulierung von bcl-2 (Schena et al., Blood 1992, 79: 2981). Mantelzell- Lymphome sind typischerweise mit der t (11; 14) (q13; q32)-Translokation assoziiert, die zu einer Überexpression von bcl-1 führt (Raffeld et al., Blood 1991, 78; 259, Seto et al., Oncogene 1992, 7; 1401). Das am meisten auffällige Merkmal von follikulären Lymphomen ist die t (14; 18) (q32, q21)-Translokation, die mit Deregulation von bcl-2 assoziiert ist, einem Protein mit Anti-apoptotischen Eigenschaften, das für die Ausbildung von lang-überlebenden Memory-B-Zellen verantwortlich gemacht wurde. (Hockenberg et al., PNAS USA 1991, 88: 6961). Bis jetzt konnte kein einzelner Marker gezeigt werden, der für die korrekte Diagnose von einer der Subtypen ausreichend ist.
Hoch-dimensionale mRNA-basierte Ansätze wurden vor kurzem auf nicht-Hodgkin's Lymphome und andere Krebsarten angewendet. Diese scheinen ein besseres Mittel zur Verfügung zu stellen, um zwischen verschiedenen Subtypen zu unterscheiden und die Erkrankung nach dem klinischen Ausgang weiter zu subklassifizieren (Alizadeh et al., Nature. 2000 403: 503-11, Hofman et al., Blood. 2001; 98: 787-794). Jedoch wird die Anwendung als ein Routinediagnostisches Werkzeug in einer klinischen Umgebung durch die extreme Instabilität von mRNA, den schnell auftretenden Expressionsveränderungen im Anschluß an bestimmte auslösende Ereignisse (z. B. Probenentnahme) und, am wichtigsten, die für die Analyse benötigte große Menge an mRNA (Lipshutz, R. J. et al., Nature Genetics 21: 20-24, 1999; Bowtell, D. D. L. Nature genetics suppl. 21: 25-32, 1999), die oftmals nicht von einer Routinebiopsie erhalten werden kann, behindert.
Eine aberrante DNA-Methylierung innerhalb von CpG-Inseln ist in menschlichen malignen Erkrankungen verbreitet, was zu Abbruch oder Überexpression eines breiten Spektrums von Genen führt (Jones, P. A. Cancer Res 65: 2463-2467, 1996). Eine abnormale Methylierung wurde auch bei CpG-reichen regulatorischen Elementen in intronischen und kodierenden Teilen von Genen für bestimmte Tumore auftretend gezeigt (Chan, M. F., et al., Curr Top Microbiol Immunol 249: 75-86, 2000). Hoch charakteristische DNA-Methylierungsmuster konnten auch für Brustkrebszellinien gezeigt werden (Huang, T. H.-M., et al., Hum Mol Genet 8: 459-470, 1999). Methylierungsanalyse in großem Umfang wurde bis jetzt noch nicht auf Lymphome angewendet, jedoch wurden Veränderungen der Methylierung von einzelnen Genen in verschiedenen Subtypen von nicht-Hodgkin Lymphom beschrieben, z. B. TCL 1 (Yuille et al., Genes Chromosomes Cancer 2001, 30: 336-41), p15 und AR (Baur et al., Blood. 1999, 94: 1773-81, Martinez-Delgado et al., Leukemia. 1998 12: 937-41), dem Androgenrezeptor (McDonald et al., Genes Chromosomes Cancer. 2000 28: 246-57), und dem MyoD1 (Taylor et al., Leukemia. 2001, 15: 583-9).
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalente Basenmodifikation in der DNA eukaryontischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die vom 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden konnte, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin, beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24(24): 506-4-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsfällen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based an allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; S(2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint. 1997 Nov; 17(3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2529-31, WO-Patent 95/00669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25(12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; 16(6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6(3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22(4): 695-6; Martin V, Ribieras 5, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157(1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 97/45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.
Für die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise über ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-unterstützte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es einige ansprechende Matrizes für DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23(8): 1367-73). Die Kopplung eines "charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von "charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zell-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Analyse von biologischen Proben auf Merkmale zur Verfügung, die mit der Entwicklung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen assoziiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure von mindestens einem Mitglied der Gruppe umfassend MDR1, CSNK2B, EGR4, AR, CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYOD1, CDH3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKNIA, CDKNIB, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTP1, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS, MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKNIC, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXA5 mit einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien in Kontakt gebracht wird/werden, das/die in der Lage sind, zwischen methylierten und nicht methylierten CpG Dinucleotiden innerhalb der genomischen Sequenz von Interesse zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern in genomischer DNA zur Verfügung. Das Verfahren ist zur Anwendung bei der verbesserten Diagnose, Behandlung und Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen, genauer gesagt durch Ermöglichen der verbesserten Identifizierung von und Differenzierung zwischen Subklassen der Erkrankung und der genetischen Prädisposition dieser Erkrankungen, gedacht. Die Erfindung stellt Verbesserungen über den Stand der Technik dar, da es eine hochspezifische Klassifizierung von Lymphomen ermöglicht, wodurch eine verbesserte informierte Behandlung von Patienten ermöglicht wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren und Nukleinsäuren zur Verfügung, die die Differenzierung zwischen Mantelzell-Lymphom (hier im folgenden als MCL bezeichnet), diffusem B-Zell-Lymphom (hier im folgenden als DBCL bezeichnet), follikulärem Lymphom (FL) und chronischer lymphozytischer Leukämie, auch als kleines lymphozytisches Lymphom bekannt (hier im folgenden als CHL oder SLL bezeichnet) ermöglicht.
Weiterhin stellt das Verfahren die Analyse von Cytosin-Methylierungen und "single nucleotide polymorphisms" zur Verfügung.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
Im ersten Schritt des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe von Gewebe bzw. zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können lymphoide Gewebeproben, Zellinien, histologische Objektträger, Körperflüssigkeiten oder in Paraffin eingebettetes Gewebe sein. Die Extraktion kann durch für den Fachmann übliche Mittel erfolgen, wie der Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung mit Ultraschall und Vortexen mit Glasperlen. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische Doppelstrang-DNA bei der Untersuchung verwendet.
In einer bevorzugten Ausgestaltung kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden; dies kann mittels eines beliebigen, nach dem Stand der Technik übliches Mittel erreicht werden, insbesondere, aber nicht beschränkt auf, mit Restriktionsendonukleasen.
Im zweiten Schritt des Verfahrens wird die genomische DNA-Probe dann derart behandelt, daß an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt werden. Dies wird im folgenden unter "Vorbehandlung" verstanden.
Die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA erfolgt bevorzugt mit Bisulfit (Sulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse, was zur Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt. Wenn eine Bisulfit-Lösung für die Reaktion verwendet wird, dann findet eine Addition an den nicht methylierten Cytosin-Basen statt. Darüber hinaus muß ein denaturierendes Reagenz oder Lösemittel und ein Radikalfänger vorhanden sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt zu den Umwandlungen von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Die chemisch umgewandelte DNA wird dann für den Nachweis von methylierten Cytosinen verwendet.
Aus der chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäß SEQ ID NO: 213 bis SEQ ID NO: 290 und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100-2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA- Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
Das Verfahren kann auch durch die Verwendung von alternativen Primern ermöglicht werden, wobei die Konstruktion solcher Primer für den Fachmann offensichtlich ist. Diese sollten mindestens zwei Oligonukleotide enthalten, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im Anhang (SEQ. ID NO: 61 bis SEQ. ID NO: 212) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß sie keine CpG Dinukleotide enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die Sequenz der Primeroligonukleotide so gewählt, daß nur ein gezieltes Annealing und Amplifikation der relevanten Lymphoidgewebe-spezifischen DNA erfolgt, wodurch die Amplifikation von Hintergrund- bzw. nicht relevanter DNA minimiert wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird unter Hintergrund-DNA genomische DNA verstanden, die kein relevantes, Gewebe-spezifisches Methylierungsmuster aufweist, wobei es sich hier bei dem relevanten Gewebe um lymphoides Gewebe, sowohl gesundes als auch erkranktes, handelt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA- Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe, verwendet werden können.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, daß die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix unterstützter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an ein Array bzw. einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise wie folgt. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz von Sonden besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren. Die Amplifikate dienen im Verfahren als Sonden, die an vorher an eine Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonukleotide ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 291 bis SEQ ID NO: 602. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonukleotide ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 559 bis SEQ ID NO: 602. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 10 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG oder TpG Dinukleotid enthält. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Cytosin des CpG Dinukleotids, oder das Thymin im Falle des TpGs, das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 10 mers. Ein Oligonukleotid ist für jedes CpG oder TpG Dinukleotid vorhanden.
Im fünften Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. Dabei ist bevorzugt, daß an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, daß die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementären Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix unterstützter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführen und visualisieren kann. Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA eingesetzt.
Um das erfindungsgemäße Verfahren zur Verfügung zu stellen, stellt die Erfindung weiterhin die modifizierte DNA der Gene MDR1, CSNK2B, EGR4, AR, CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYOD1, CDH3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTPI, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS, MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKN1C, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXA5 sowie Oligonucleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis von Cytosin Methylierungen innerhalb dieser Gene zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß genetisch und epigenetische Parameters und insbesondere die Cytosin Methylierungsmuster von genomischer DNA für eine verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung von Lymphiod-Zellteilungsstörungen besonders geeignet sind. Weiterhin ermöglicht die Erfindung die Differenzierung zwischen verschiedenen Unterklassen von Lymphomen oder den Nachweis einer Prädisposition für Lymphome.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können zur Analyse von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA eingesetzt werden.
Diese Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung einer Nukleinsäure gelöst, die eine Sequenz in der Länge von mindestens 18 Basen der vorbehandelten genomischen DNA gemäß der SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 enthält und dazu komplementären Sequenzen.
Die modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht mit der Ermittlung von Erkrankungsrelevanten genetischen und epigenetischen Parametern in Verbindung gebracht werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiter durch ein Oligonukleotid oder Oligomer für die Analyse von vorbehandelter DNA, zum Nachweis des genomischen Cytosin- Methylierungsstatuses, gelöst, wobei das Oligonukleotid mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte genomische DNA nach SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 hybridisiert. Die Oligomersonden gemäß der vorliegenden Erfindung stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, die es zum ersten Mal ermöglichen, spezifische genetische und epigenetische Parameter während der Analyse von biologischen Proben auf Merkmale, die mit der Entwicklung von Lymphoid- Zellteilungsstörungen assoziiert sind, zu ermitteln. Diese Oligonukleotide erlauben die verbesserte Diagnose zur Behandlung und Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen und den Nachweis der Prädisposition für diese Störungen. Weiterhin erlauben sie die Differenzierung von verschiedenen Unterklassen von Lymphomen. Die Basensequenz der Oligomere enthält bevorzugterweise mindestens ein CpG- oder TpG-Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (peptid nucleic acid) vorhanden sein, die besonders bevorzugte Paarungseigenschafien aufweist. Besonders bevorzugt sind Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung, in denen das Cytosin des CpG-Dinukleotids das 5.-9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13-mers ist, im Fall von PNA-Oligomeren ist es für das Cytosin des CpG- Dinukleotids bevorzugt, daß es das 4.-6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers ist.
Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in sogenannten "Sets" verwendet, die mindestens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide innerhalb SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 enthalten. Bevorzugt ist ein Set, das mindestens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide enthält, von SEQ ID NO: 291 bis SEQ ID NO: 602. Weiter bevorzugt ist ein Set, das SEQ ID NO: 559 bis SEQ ID NO: 602 umfaßt.
Im Falle der Sets von Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, das mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Es ist weiter bevorzugt, daß alle Oligonukleotide eines Sets an eine feste Phase gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Set von mindestens 10 n (Oligonukleotide und/oder PNA-Oliomere), die für den Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands von genomischer DNA verwendet werden, unter der Verwendung von behandelten Versionen der genannten genomischen DNA (gemäß SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 und dazu komplementären Sequenzen). Diese Sonden ermöglichen eine verbesserte Diagnose zur Behandlung und Überwachung von Fortschreiten von Lymphoid-Zellteilungsstörungen. Insbesondere ermöglichen sie die Differenzierung zwischen verschiedenen Unterklassen von Lymphoid- Zellteilungsstörungen und den Nachweis einer Prädisposition dieser Erkrankungen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Set SEQ ID NO: 39 bis SEQ ID NO: 602.
Das Set von Oligomeren kann auch zum Nachweis von single nucleotide polymorphisms (SNPs) verwendet werden, unter der Verwendung von vorbehandelter genomischer DNA gemäß einer der SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß eine Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, das auf einer Weise vorliegt, daß es ebenfalls an eine feste Phase gebunden ist. Dieses Array von verschiedenen Olionukleotid und/oder PNA- Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es auf der festen Phase in Form eines rechteckigen oder diagonalen Gitters angeordnet ist. Die Oberfläche der festen Phase ist bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polytstyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch sind Nitrozellulose sowie Kunststoffe, wie zum Beispiel Nylon, das in Form von Pellets oder Harzmatrices vorliegen kann, ebenfalls geeignete Alternativen.
Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur verbesserten Diagnose, Behandlung und Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen, der Differenzierung zwischen verschiedenen Formen und Unterklassen von Lymphomen und/oder dem Nachweis der Prädisposition für Lymphoid-Zellteilungsstörungen. Bei diesen Verfahren wird mindestens ein Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase gekuppelt. Verfahren zur Herstellung dieser Arrays sind zum Beispiel auf U.S.-Patent 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabiler Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip für die verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen. Weiterhin ermöglicht der DNA-Chip den Nachweis der Prädisposition von Lymphoid- Zellteilungsstörungen und die Unterscheidung zwischen verschiedenen Unterklassen von Lymphomen. Der DNA-Chip enthält mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung. DNA-Chips sind zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,837,832 bekannt.
Weiterhin ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, das zum Beispiel aus einem Bisulfit-enthaltenden Reagens, einem Set von Primeroligonukleotiden, das mindestens zwei Oligonukleotide enthält, deren Sequenzen in jedem Fall einem 18 Basen langen Segment entsprechen oder zu ihm komplementär sind, der Basensequenzen, wie im Anhang angegeben (SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212), Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren, sowie Anweisungen zur Durchführung und Evaluierung des beschriebenen Verfahrens zusammengesetzt sein kann. Jedoch kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls nur einen Teil der vorgenannten Komponenten enthalten.
Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung oder Arrays davon sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung sind dazu gedacht, für die verbesserte Diagnose, die Behandlung und Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen verwendet zu werden. Weiterhin erstreckt sich die Verwendung der Erfindungen auf die Differenzierung zwischen den verschiedenen Unterklassen von Lymphomen und dem Nachweis der Prädisposition für Lymphoid-Zellteilungsstörungen. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren bevorzugterweise zur Analyse von wichtigen genetischen und/oder epigenetischen Parametern innerhalb genomischer DNA verwendet, insbesondere zur Verwendung bei der verbesserten Diagnose, Behandlung und Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen, dem Nachweis der Prädisposition für diese Art Störungen und die Unterscheidung zwischen Unterklassen dieser Störungen.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden zum Beispiel für die verbesserte Diagnose, Behandlung und Überwachung des Fortschreitens von Lymphoid- Zellteilungsstörungen, dem Nachweis der Prädisposition für diese Störungen und die Unterscheidung zwischen Unterklassen dieser Störungen, verwendet.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatuses von genomischer DNA ohne den Bedarf einer Vorbehandlung. Im ersten Schritt des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe vom Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können Zelllinien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeiten oder in Paraffin eingebettetes Gewebe einschließen. Die Extraktion kann durch Mittel, die Standard für den Durchschnittsfachmann sind, erfolgen, diese schließen die Verwendung von Detergens-Lysaten, Beschallung und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert sind, wird die genomische doppelsträngige DNA für die Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der Behandlung gespalten werden, dies kann durch jedes Standardmittel im Stand der Technik erreicht werden, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen. Im zweiten Schritt wird die DNA dann mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird so durchgeführt, daß die Hydrolyse der DNA an der Restriktionsstelle für den Methylierungsstatus eines spezifischen CpG-Dinukleotids informativ ist.
Im dritten Schritt werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dies unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion durchgeführt.
Im letzten Schritt werden die Amplifikate nachgewiesen. Dieser Nachweis kann durch Standardmittel im Stand der Technik erfolgen, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, Gel- Elektrophorese-Analyse, Hybridisierungsanalyse, Inkorporation von nachweisbaren Markern innerhalb des PCR-Produkts, DNA-Array-Analyse, MALDI- oder ESI-Analyse.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die nachteilhaft oder relevant für Patienten oder Individuen sind, in denen wichtige genetische und/oder epigenetische Parameter innerhalb genomischer DNA, wobei diese Parameter durch Mittel der vorliegenden Erfindung erhalten werden, mit einem anderen Set von genetischen und/oder epigenetischen Parametern verglichen werden, wobei die Unterschiede als Basis für die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen dient, die nachteilhaft oder relevant für die Patienten oder Individuen sind.
Die Gene, die die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, können dazu verwendet werden, ein "Gene Panel" zu bilden, d. h. eine Sammlung, die die besonderen Gene der vorliegenden Erfindung und/oder deren jeweiligen informativen Methylierungsstellen umfaßt. Die Bildung von Gene Panels ermöglicht eine schnelle und spezifische Analyse der mit Ihnen verwandten Erkrankungen. Die wie in dieser Erfindung beschriebenen und angewendeten Gene Panels können mit überraschend hoher Effizienz für die Diagnose, Behandlung und Überwachung von und die Analyse einer Prädisposition für die hier beschriebenen Erkrankungen verwendet werden.
Die Verwendung einer Vielzahl von CpG-Stellen aus einer diversen Anordnung von Gene, die Zellteilungsstörungen spezifisch regulieren, erlaubt zusätzlich ein relativ hohes Ausmaß an Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu einzelnen Gen-Diagnose- und Gen-Nachweis- Instrumenten. Weiterhin kann das hier beschriebene Panel im Vergleich zu anderen an eine spezifischere Verwendung bei der Analyse von multiplen Erkrankungen angepaßt werden, die alle durch Zellteilungsstörungen spezifisch hervorgerufen werden.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Bindung eines Oligonukleotids unter Ausbildung einer Duplex-Struktur an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA verstanden werden.
"Genetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von genomischer DNA und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere werden als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen.
"Epigenetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen genomischer DNA und zu deren Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter schließen beispielsweise die Acetylierung von Histonen ein, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA- Methylierung korreliert.
Die vorliegende Erfindung wird nun im folgenden anhand der Sequenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne daß die Erfindung hierauf eingeschränkt wird. In den beigefügten Zeichnungen zeigt
Fig. 1 den Ursprung aller Proben, die in den Analysen, beschrieben in Beispielen 1 und 2 verwendet wurden. Spalte "1" gibt die Probennummer an, die auf Fig. 2 bis 7 übertragbar ist. Spalte "2" zeigt die Erkrankungsdiagnose, wobei MCL Mantelzell-Lymphom bedeutet, FL follikuläres Lymphom bedeutet und CLL/SLL chronische lymphozytische Leukämie/kleines lymphozytisches Lymphom bedeutet und DLBCL diffuses großes B-Zell- Lymphom bedeutet. Spalte "3" zeigt das Alter des Patienten an, von dem die Probe erhalten wurde. Spalte "4" zeigt das Geschlecht des Patienten an, von dem die Probe erhalten wurde.
Fig. 2 zeigt die Differenzierung von MCL, DLBCL und CLL/SLL von FL I und II gemäß Beispiel 2. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen- und CpG-Identifizierer, diese entsprechen denen in Tabelle 3. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz (p- Wert, T-Test) des Unterschieds zwischen den Mitteln der zwei Gruppen an. Jede Reihe entspricht einem einzelnen CpG und jede Spalte den Methylierungsgraden einer Probe. Die CpGs sind nach ihrem Beitrag zur Unterscheidbarkeit der differentiellen Diagnose von den zwei Lymphomen angeordnet, mit ansteigendem Beitrag von oben nach unten. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung einer bestimmten CpG-Position, weiß bedeutet keine Methylierung an der bestimmten Position, mit Abstufungen an Methylierung, die in grau dargestellt sind, von hell (geringer Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung).
Fig. 3 die Differenzierung von MCL, DLBCL und CLL/SLL von Fl I und II (nur männliche Proben) gemäß Beispiel 2. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen- und CpG- Identifizierer, diese stimmen mit denen in Tabelle 4 überein. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz (p-Wert, T-Test) des Unterschieds zwischen den Mitteln der zwei Gruppen an. Jede Reihe entspricht einem einzelnen CpG und jede Spalte der Methylierungsgraden einer Probe. CpGs sind gemäß ihrem Beitrag zu der Unterscheidbarkeit der differenziellen Diagnose der zwei Lymphome angeordnet, mit ansteigendem Beitrag von oben nach unten. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung einer bestimmten CpG-Position an, weiß stellt keine Methylierung an der bestimmten Position dar, mit Abstufungen an Methylierung, die in grau dargestellt sind, von hell (geringer Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung).
Fig. 4 die Differenzierung von MCL von follikulärem Lymphom nach Beispiel 2. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen- und CpG-Identifizierer, diese entsprechen denen in Tabelle 5. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz an (p-Wert, T-Test) des Unterschieds zwischen den Mitteln der zwei Gruppen an. Jede Reihe entspricht einem einzelnem CpG und jede Spalte dem Methylierungsleveln einer Probe. Die CpGs sind nach Ihrem Beitrag zur Unterscheidbarkeit der differentiellen Diagnose der zwei Lymphome angeordnet, mit zunehmendem Beitrag von oben nach unten. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung einer bestimmten CpG-Position an, weiß bedeutet keine Methylierung der bestimmten Position, wobei Abstufungen von Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (niedriger Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung).
Fig. 5 die Differenzierung von MCL von follikulärem Lymphom (nur männliche Proben) gemäß Beispiel 2. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen und CpG-Identifizierer diese entsprechen denjenigen in Tabelle 6. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz an (p-Wert, T-Test) des Unterschieds zwischen den Mitteln der zwei Gruppen an. Jede Reihe entspricht einem einzelnem CpG und jede Spalte den Methylierungsgraden einer Probe. Die CpGs sind gemäß ihrem Beitrag zu der Unterscheidbarkeit der differentiellen Diagnose von den zwei Lymphomen angeordnet, mit zunehmendem Beitrag von oben nach unten. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung an einer bestimmten CpG-Position an, weiß zeigt keine Methylierung an der bestimmten Position an, wobei Abstufungen an Methylierung in grau dargestellt sind von hell (geringer Anteil von Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung).
Fig. 6 die Differenzierung von FL von CLL/SLL gemäß Beispiel 2. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen- und CpG-Identifizierer, diese entsprechen denjenigen in Tabelle 7. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz (p-Wert, T-Test) des Unterschieds zwischen den Mitteln der zwei Gruppen an. Jede Reihe entspricht einem einzelnem CpG und jede Spalte den Methylierungsgraden einer Probe. Die CpGs sind nach ihrem Beitrag zur Unterscheidbarkeit zu der differenziellen Diagnose der beiden Lymphome angeordnet, mit zunehmendem Beitrag von oben nach unten. Schwarz zeigt eine vollständige Methylierung an einer bestimmten CpG-Position an, weiß zeigt keine Methylierung an der bestimmten Position an, wobei Abstufungen von Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (niedriger Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung).
Fig. 7 die Differenzierung von FL von CLL/SLL (nur männliche Proben) gemäß Beispiel 2. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen- und CpG-Identifizierer, diese entsprechen denen in Tabelle 8. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz (p-Wert, T-Test) des Unterschieds zwischen den Mitteln der zwei Gruppen an. Jede Reihe entspricht einem einzelnem CpG und jede Spalte den Methylierungsgraden einer Probe. Die CpGs sind gemäß ihrem Beitrag zur Unterscheidbarkeit der differenziellen Diagnose der zwei Lymphome angeordnet, mit zunehmendem Beitrag von oben nach unten. Schwarz bedeutet vollständige Methylierung an einer bestimmten CpG-Position, weiß bedeutet keine Methylierung an der bestimmten Position, wobei Abstufungen an Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (geringer Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung).
SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 38 stellen 5' und/oder regulatorische Regionen der genomischen DNA der Gene MDR1, CSNK2B, EGR4, AR, CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYODl, CDH3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTP1, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS, MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKN1C, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXAS dar. Diese Sequenzen sind von der GenBank abgeleitet und werden als alle kleinen Variationen des Sequenzmaterials umfassend betrachtet, die im Augenblick noch nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel, aber nicht begrenzt auf, kleine Deletionen und SNPs.
SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 stellen die vorbehandelte Sequenz der DNA, abgeleitet von den Genen MDR1, CSNK2B, EGR4, AR, CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYOD1, CDH3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTP1, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS, MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKN1C, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXAS dar. Diese Sequenzen werden als alle kleinen Variationen des Sequenzmaterials umfassend betrachtet, die im Augenblick noch nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel, aber nicht begrenzt auf, kleine Deletionen und SNPs.
SEQ ID NO: 213 bis SEQ ID NO: 290 stellen die Sequenz von Primeroligonukleotiden für die Amplifikation von vorbehandelter DNA nach Sequenz ID NOs: 61 bis 212 dar.
SEQ ID NO: 291 bis SEQ ID NO: 602 stellen die Sequenz von Oligonmeren da, die für die Analyse von CpG Positionen innerhalb der genomischen DNA nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 38 brauchbar sind.
SEQ ID NO: 559 bis SEQ ID NO: 602 stellen die Sequenz von Oligonmeren da, die für die Analyse von CpG Positionen innerhalb der genomischen DNA nach SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 38 brauchbar sind.

Beispiele 1 und 2

Digitaler Phänotyp

In den folgenden Beispielen wurde eine Multiplex PCR an Proben von Patienten mit verschiedenen Unterklassen von Lymphomen durchgeführt (siehe Fig. 1 für weitere Einzelheiten). Jede Probe wurde in der unten in Beispiel 1 beschriebenen Weise behandelt, um den Methylierungszustand von CpG Positionen abzuleiten, die CpG Methylierungs-Information für jede Probe wurde zusammengestellt und dann in einer Analyse verwendet, wie genauer in Beispiel 2 angegeben. Ein alternatives Verfahren zur Analyse des CpG Methylierungsstatus ist weiterhin in Beispiel 3 beschreiben.

Beispiel 1

Im ersten Schritt wurde die genomische DNA aus den Zellproben unter der Verwendung des Wizzard Kits von Promega isoliert. Die isolierte genomische DNA von den Proben wurde unter der Verwendung einer Bisulfitlösung (Hydrogensulfit, Disulfit) behandelt. Die Behandlung erfolgt solcher Art, daß alle nicht ethylierten Cytosine innerhalb der Probe zu Thymidin umgewandelt werden, im Gegensatz dazu verbleiben 5-methylierte Cytosine innerhalb der Probe unmodifiziert. Die behandelten Nukleinsäuren wurden dann unter der Verwendung einer Multiplex-PCR amplifiziert, wobei 8 Fragmente pro Reaktion mit Cy5 Fluoreszenz-markierten Primern amplifiziert wurden. Die verwendeten PCR-Primer sind in Tabelle 1 beschrieben. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Reaktionslösung 10 ng Bisulfit-behandelte DNA
3,5 mM MgCl₂
400 µM dNTPs
2 pmol von jedem Primer
1 U Hot Star Taq (Qiagen)
Vierzig Zyklen wurden wie folgt ausgeführt. Denaturierung bei 95°C für 15 Minuten, gefolgt von Annealing bei 55°C für 45 Sekunden, Primerverlängerung bei 65°C für 2 Minuten. Eine letzte Verlängerung bei 65°C wurde für 10 Minuten durchgeführt. Alle PCR-Produkte von jeder individuellen Probe wurden dann an Glasscheiben hybridisiert, die ein Paar von immobilisierten Oligonukleotiden für jede CpG-Position, die analysiert wurde, trugen. Jedes dieser Nachweis-Oligonukleotide wurde so konstruiert, um an die Bisulfit-konvertierte Sequenz um eine CpG-Stelle herum zu hybridisieren, die entweder ursprünglich unmethyliert (TG) oder methyliert (CG) war. Siehe Tabelle 2 für weitere Einzelheiten aller verwendeten Hybridisierungsoligonukleotide (sowohl informative und nicht-informative). Die Hybridisierungsbedingungen wurden so gewählt, um den Nachweis des einzelnen Nukleotidunterschieds zwischen TG- und CG-Varianten zu ermöglichen.
5 µl Volumen jedes Multiplex-PCR-Produkts wurde in 10 × Ssarc-Puffer verdünnt (10 × Ssarc: 230 ml 20 × SSC, 180 ml Natriumlaurylsarcosinatlösung 20%, verdünnt auf 1000 ml mit dH₂O). Das Reaktionsgemisch wurde dann an die Nachweisoligonukleotide wie folgt hybridisiert. Denaturierung bei 95°C, Abkühlen auf 10°C, Hybridisierung bei 42°C über Nacht, gefolgt von Waschen mit 10 × Ssarc und dH₂O bei 42°C.
Fluoreszenzsignale von jedem hybridisierten Oligonukleotid wurden unter der Verwendung eines Genepix® Scanner und Software nachgewiesen. Die Verhältnisse für die zwei Signale (von dem CG-Oligonukleotid und dem TG-Oligonukleotid, das für jede CpG-Position verwendet wurde) wurden basierend auf dem Vergleich der Intensität der Fluoreszensignale berechnet.

Beispiel 2

Die Information wird dann in eine Bewertungsmatrix (wie in Fig. 2 bis 7 gezeigt) gemäß den CpG-Methylierungsunterschieden zwischen den zwei Gewebeklassen unter der Verwendung eines Algorithmus einsortiert. Die am meisten signifikanten CpG-Positionen befinden sich am unteren Ende der Matrix, wobei die Signifikanz in Richtung des oberen Endes abnimmt. Schwarz bedeutet vollständige Methylierung einer CpG-Position, weiß bedeutet keine Methylierung an der besonderen Position, wobei Abstufungen der Methylierung in grau dargestellt sind, von hell (geringer Anteil an Methylierung) zu dunkel (hoher Anteil an Methylierung). Jede Reihe stellt eine spezifische CpG-Position innerhalb eines Gens dar und jede Spalte zeigt das Methylierunsprofil für die verschiedenen CpGs einer Probe. Auf der linken Seite ist ein CpG- und Gen-Identifizierer gezeigt, dieser entspricht der beigefügten Tabelle (Tabellen 3 bis 8), um das zu untersuchende Gen und das verwendete Nachweisoligomer anzugeben. Auf der rechten Seite sind die p-Werte für die einzelnen CpG-Positionen gezeigt. Die p-Werte sind die Wahrscheinlichkeiten, daß die beobachtete Verteilung in dem Datenset zufällig auftrat.
Für ausgewählte Unterscheidungen wurde ein Lernalgorithmus (Unterstützungsvektormaschine, SVM) trainiert. Die SVM (wie diskutiert durch F. Moldel, P. Adorjan, A. Olek, C. Piepenbrock, Feature selection for DNA methylation based cancer classification. Bioinformatics. 2001 Jun, 17 Suppl 1: S. 157-64) erzeugt eine optimale Diskriminante zwischen den beiden Klassen von angegebenen Trainingsproben. In diesem Fall wird jede Probe durch die Methylierungsmuster (CG-/TG-Verhältnisse) an den untersuchten CpG-Stellen beschrieben. Das SVM wurde auf einer Untergruppe der Proben für jede Klasse trainiert, die mit der Diagnose beigefügt präsentiert wurden. Unabhängige Testproben, die dem SVM vorher nicht gezeigt wurden, wurden dann zur Evaluierung präsentiert, wenn die Diagnose basierend auf dem Prädiktor, der in der Trainingsrunde erzeugt wurde, korrekt vorhergesagt werden konnte. Dieses Verfahren wurde mehrere Male unter der Verwendung von verschiedenen Partitionen der Proben wiederholt, ein Verfahren, das Kreuzvalidierung genannt wird. Es ist zu bemerken, daß alle Runden ohne jegliches in den vorherigen Läufen erworbene Wissen durchgeführt werden. Die Zahl von korrekten Klassifizierungen wurde über alle Läufe gemittelt, was eine gute Abschätzung von unserer Testgenauigkeit (Prozent von richtig klassifizierten Proben während aller Läufe) ergibt.

MCL, DLBCL & CLL/SLL verglichen mit FLI und II. (Fig. 2 und 3)

In Fig. 2 ist die erste Gruppe aus 42 Proben von MCL, DLBCL und CLL/SLL von beiden Geschlechtern zusammengesetzt, die mit 38 Proben von FL I und II verglichen werden. Der p-Wert zeigt eine klare Diskriminierung zwischen den zwei Gruppen, 9 CpG-Positionen von 7 distinkten Genen erlauben eine Unterscheidung zwischen den zwei Gruppen (p < 0,05). Die Kreuzvalidierungsgenauigkeit, die durch das SVM erreicht wurde, wird als 75,8% einer Standardabweichung von 2,8% berechnet. Die signifikanten Gene und Nachweisoligonukleotide sind unten in Tabelle 3 gezeigt.
Die Analyse kann durch Durchführen des Vergleichs zwischen Mitgliedern des selben Geschlechts verfeinert werden. Der Vergleich von nur männlichen Proben (Fig. X) erhöhte die Genauigkeit auf 80,4% mit einer Standardabweichung von 2,9%. Die signifikanten Gene und Nachweisoligonukleotide sind in Tabelle G gezeigt.

MCL, verglichen mit follikulärem Lymphom. (Fig. 4 und 5)

Vergleich von männlichen MCL-Proben mit männlichen und weiblichen follikulären- Lymphom-Proben. Die Analyse erlaubte die Unterscheidung zwischen den zwei Klassen mit einer Genauigkeit von 92%, mit einer Standardabweichung von 2,4%. Die signifikanten Gene und Nachweisoligonukleotide sind in Tabelle 5 gezeigt.
Der Vergleich von nur männlichen Proben von FL II identifizierte informative CpG- Positionen in 9 Genen. Die Kreuzvalidierungsgenauigkeit ist 86,5%, mit einer Standardabweichung von 3,7%. Die abnehmende Genauigkeit ist im Hinblick auf die verringerte Probengröße, die für das Training des Klassifiziers verwendet wurde, nicht überraschend. Die signifikanten Gene und Nachweisoligonukleotide sind in Tabelle 6 gezeigt.

FL verglichen gegenüber CLL/SLL (Fig. 6 und 7)

Der Vergleich von MCL gegenüber CLL/SLL, nur männliche Proben, erlaubte eine Unterscheidung zwischen den zwei Gruppen mit einer Klassifizierungsgenauigkeit von 91% mit einer Standardabweichung von 2,3%. Die signifikanten Gene und Nachweisoligonukleotide sind in Tabellen 7 und 8 gezeigt.

Beispiel 3

Identifizierung des Methylierungsstatuses einer CpG-Stelle innerhalb des Gens CDNKIC. Das folgende Beispiel zeigt eine alternative Weise der CpG-Methylierungsstatus-Analyse, die anstelle an des in Beispiel 1 dargestellten Verfahrens verwendet werden kann um Daten für eine Analyse, wie in Beispiel 2 gezeigt, zur Verfügung zu stellen.
Ein Fragment des Gens CDNKIC (SEQ ID NO: 32) wurde unter der Verwendung der Primer CATTTGGGGAGGCAGATA und TGTCCTTGAGAGGTGCGA PCR amplifiziert. Das erhaltene Fragment (262 bp Länge) enthielt ein informatives CpG an Position 63. Die amplifizierte DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Eael, Erkennungsstelle YGGCCR verdaut. Die Hydrolyse durch die Endonuklease wird durch die Methylierung des CpG an Position 106 des Amplifikats blockiert. Der Verdau wurde als eine Kontrolle verwendet.
Genomische DNA wurde von Lymphomgeweben unter der Verwendung des Wizzard DNA- Isolierungskits (Promega) isoliert. Jede Probe wurde unter der Verwendung von Eael gemäß den Empfehlungen des Herstellers (New England Biolabs) verdaut.
10 ng jedes genomischen Verdaus wurden dann unter der Verwendung der PCR-Primer CATTTGGGGAGGCAGATA und TGRCCTTGAGAGGTGCGA amplifiziert. Die PCR- Reaktionen wurden unter der Verwendung eines Thermocyclers (Eppendorf GmbH) durchgeführt, unter der Verwendung von 10 ng DNA, 6 pmol jedes Primers, 200 µmol jedes dNTPs, 1,5 mM MgCl₂ und 1 U von Hotstart Taq (Qiagen AG). Die anderen Bedingungen waren wie durch den Taq-Polymerase-Hersteller empfohlen. Unter der Verwendung der oben genannten Primer wurden Genfragmente durch PCR amplifiziert, indem ein erster Denaturierungsschritt für 14 Minuten bei 96°C, gefolgt von 30-45 Zyklen (Schritt 2: 60 sek bei 96°C, Schritt 3: 45 sek 52°C, Schritt 4: 75 sek bei 72°C) und einer anschließenden finalen Verlängerung von 10 Minuten bei 72°C durchgeführt wurde. Die Anwesenheit von PCR-Produkten wurde durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
PCR-Produkte konnten mit Eael hydrolisierter DNA nachgewiesen werden, die von hoch methyliertem Gewebe isoliert wurde, wenn Schritt 2 bis Schritt 4 des Zyklusprogramms 34-, 37-, 39-, 42- und 45-fach wiederholt wurden. Im Unterschied dazu wurden signifikante Level von PCR-Produkten mit Eael hydroliserter DNA, die von herunter methylierter (und der Kontrollprobe) isoliert wurde, nur nachgewiesen, wenn Schritt 2 bis Schritt 4 des Zyklusprogramms 42- und 45-fach wiederholt wurden. Diese Ergebnisse wurden in einer Analyse wie in Beispiel 3 mit anderen Mitgliedern eines Genpanels für die Analyse von Lymphomgeweben zusammengestellt. Tabellen Tabelle 1 PCR Primer und Produkte

Tabelle 2 Hybridisierungs-Oligonukleotide

Tabelle 3 Oligonukleotide, die bei der Differenzierung von MCL, DLBCL & CLL/SLL von FL I und II verwendet wurden

Tabelle 4 Oligonukleotide, die bei der Differenzierung von MCL DLBCL & CLL/SLL von FL I und II verwendet wurden (nur männliche Proben)

Tabelle 5 Differenzierung von MCL von follikulärem Lymphom

Tabelle 6 Differenzierung von MCL von follikulärem Lymphom (nur männliche Proben)

Tabelle 7 Differenzierung von FL von CLL/SLL

Tabelle 8 Differenzierung von FL von CLL/SLL (nur männliche Proben)

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und der Differenzierung zwischen Lyphoid- Zellteilungsstörungen, assoziiert mit mindestens einem Gen und/oder deren regulatorischer Regionen aus der Gruppe umfassend MDR1, CSNK2B, EGR4, AR, CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYOD1, CDH3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTP1, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS, MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKN1C, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXAS in einem Subjekt, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen einer Zielnukleinsäure in einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien umfaßt, wobei das Reagenz oder die Serie von Reagenzien zwischen methylierten und nichtmethylierten CpG Dinucleotiden innerhalb der Zielnukleinsäure unterscheidet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zwischen mindestens zwei Mitgliedern der folgenden Gruppe medizinischer Zustände unterscheidet: diffuses B-Zell- Lymphom, Mantelzell-Lymphom, chronische lymphozytische Leukämie oder kleinem lymphozytischem Lymphom unterscheidet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zwischen Mantelzell-Lymphom und chronischer lymphozytischer Leukämie oder kleinem lymphozytischem Lymphom unterscheidet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren zwischen Mantelzell-Lymphom und follikulärem Lymphom unterscheidet.

5. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 2, 3 und 4, wobei das Verfahren dazu verwendet wird, um zwischen Lymphomen zu unterschieden, die von Subjekten desselben Geschlechts stammen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die folgenden Schritte:

- Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält

- Extrahieren der genomischen DNA

- Konvertierung der Cytosin-Basen in der genomischen DNA-Probe, die an der 5'- Position unmethyliert sind, durch Behandlung zu Uracil oder einer anderen Base, die in Bezug auf das Basenpaarungsverhalten von Cytosin verschieden ist;

- Abschnitte der vorbehandelten genomischen DNA werden amplifiziert

- Identifizierung des Methylierungsstatus von einer oder mehrerer Cyosin-Positionen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz eine Lösung von Bisulfit, Hydrogensulfit oder Disulfit ist.

8. Verfahren nach Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikationmittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mittels einer Hitze-resistenten DNA-Polymerase durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß mehr als 10 verschiedenen Fragmente amplifiziert werden, die eine Länge von 100-2000 Basenpaaren aufweisen.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei der Amplifikationsschritt unter der Verwendung eines Sets von Primer-Oliogonukleotiden, umfassend SEQ ID NO: 213 bis SEQ ID NO: 290, durchgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation von mehreren DNA-Segmenten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Amplifikationsschritt bevorzugterweise DNA amplifiziert ist, die von besonderem Interesse in gesundem und/oder erkranktem Lymphoid-Gewebe ist, basierend auf dem spezifischen genomischen Methylierungsstatus von Lymphoid-Gewebe, im Gegensatz zu Hintergrund DNA.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Methylierungsstatus innerhalb mindestens eines Gens und/oder ihrer regulatorischen Regionen aus der Gruppe umfassend DMR1, CSNK2B, EGR4, AR; CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYOD1, CHG3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTP1, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS, MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKN1C, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXA5 durch Hybridisierung von jedem Amplifikat an ein Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer nachgewiesen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer von der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 291 bis SEQ ID NO: 602 entnommen ist.

16. Verfahren nach Anspruch 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate markiert sind.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker der Amplifikate Fluoreszenzmarker sind.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker der Amplifikate Radionuklide sind.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente sind, die eine typische Masse aufweisen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate oder Fragmente im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis mittels Matrix unterstützter Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry (MALDI) oder unter Verwendung von Electron Spray Mass Spectrometry (ESI).

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend die folgenden Schritte;

a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält

b) Extrahieren der genomischen DNA

c) Verdauen der genomischen DNA, die mindestens eines oder mehrere CpGs der Gene MDR1, CSNK2B, EGR4, AR, CDK4, RB1, CDC25A, GPIb beta, MYOD1, CDH3, MYCL1, ELK1, ABL1, APC, BCL2, CDH1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN2a, CDKN2B, FOS, GSTP1, HIC-1, MGMT, MLH1, MOS MYC, PTEN, RBL2, TGFBR2, TP73, CDKN1C, GSK3ß, ESR1, APAF1, BAK1, BAX und HOXAS umfaßt, mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen

d) Nachweisen der DNA-Fragmente, die in dem Verdau von Schritt c) erzeugt wurden.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der DNA-Verdau vor Schritt d) amplifiziert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 und/oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation von mehr als einem DNA-Fragment in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine Hitze-resistente DNA-Polymerase ist.

28. Isolierte Nukleinsäure einer vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der Sequenzen entnommen aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 und dazu komplementärer Sequenzen.

29. Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer, wobei das Oligomer mindestens eine Basensequenz von mindestens 10 Nukleotiden umfaßt, die hybridisiert an oder identisch ist zu einer vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 gemäß Anspruch 28.

30. Oligonukleotid nach Anspruch 29, wobei die Basensequenz mindestens eine CpG- oder TpG-Dinukleotidsequenz einschließt.

31. Oligonukleotid nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Cytosin/die Cytosine des mindestens einen CpG- oder TpG-Dinukleotids ungefähr im mittleren Drittel des Oligomers lokalisiert ist/sind.

32. Oligomer, insbesondere ein Oligonukleotid oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomer gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 291 bis SEQ ID NO: 602.

33. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide nach einem der Ansprüche 29 bis 32.

34. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO: 559-578.

35. Eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe gemäß SEQ ID NO: 39-48.

36. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO: 561, 562, 565, 566, 569, 570 und 573-580.

37. Eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe gemäß SEQ ID NO: 40, 42, 44 und 46-49.

38. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO: 561-580, 587-590 und 595-602.

39. Eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe gemäß SEQ ID NO: 40-49, 53, 54 und 57-60.

40. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO: 561, 562, 565, 566, 569, 570, 575 und 576.

41. Eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe gemäß SEQ ID NO: 40, 42, 44 und 47.

42. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO: 559-596.

43. Eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe gemäß SEQ ID NO: 39-57.

44. Set von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO: 559-562, 565-570, 573-582, 589, 590 und 593-596.

45. Eine oder mehrere isolierte Nukleinsäuren, ausgewählt aus der Gruppe gemäß 5EQ ID NO: 39, 40, 42-44, 46-50, 54, 56 und 57.

46. Set von Oligomeren, Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomeren und/oder isolierten Nukleinsäuren nach Ansprüchen 33 bis 45, umfassend Oligomere zum Nachweis des Methylierungsstatus von allen CpG-Nukleotiden innerhalb einer oder mehrerer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 38 und dazu komplementären Sequenzen.

47. Verwendung eines Sets von Oligomeren oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomeren nach einem der Ansprüche 29 bis 34, 36, 38, 40, 42 und 44 als Sonden zum Nachweis des Methylierungsstatus und/oder Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) von Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 38 und dazu komplementärer Sequenzen.

48. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden nach Anspruch 34 oder Nukleinsäuren nach Anspruch 35 zur Unterscheidung von mindestens zwei Mitgliedern er folgenden Gruppe von medizinischen Zuständen: diffuses B-Zell-Lymphom, Mantelzell- Lymphom, chronische lymphozytische Leukämie, kleines lymphozytisches Lymphom und follikuläres Lymphom.

49. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden nach Anspruch 36 oder Nukleinsäuren nach Anspruch 37 zur Unterscheidung von mindestens zwei Mitgliedern der folgenden Gruppe von medizinischen Zuständen: diffuses B-Zell-Lymphom, Mantelzell- Lymphom, chronische lymphozytische Leukämie, kleines lymphozytisches Lymphom und follikuläres Lymphom, wobei diese Lymphome männlichen Ursprungs sind.

50. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden nach Anspruch 38 oder Nukleinsäuren nach Anspruch 39 zur Unterscheidung zwischen follikulärem Lymphom und chronischer lymphozytischer Leukämie oder kleinem lyphozytischen Lymphom.

51. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden nach Anspruch 41 zur Unterscheidung zwischen follikulärem Lymphom und chronischer lymphozytischer Leukämie oder kleinem lymphozytischem Lymphom, wobei die Lymphome männlichen Ursprungs sind.

52. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden nach Anspruch 42 oder Nukleinsäuren nach Anspruch 43 zur Unterscheidung zwischen Mantelzell-Lymphom und follikulärem Lymphom.

53. Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden nach Anspruch 44 oder Nukleinsäuren nach Anspruch 45 für die Unterscheidung zwischen Mantelzell-Lymphom und follikulärem Lymphom, wobei die Lymphome männlichen Ursprungs sind.

54. Set von mindestens zwei Oligonukleotiden oder Peptide Nucleic Acid (PNA)- Oligomeren nach Anspruch 29 als Primer-Oligonukleotide für die Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 nach Anspruch 28 und/oder dazu komplementären Sequenzen und Segmenten davon.

55. Verwendung einer vorbehandelten genomischen DNA nach Anspruch 28 zum Nachweis des Methylierungsstatus einer korrespondierenden genomischen DNA und/oder dem Nachweis von Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

56. Set von Oligonukleotiden oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomeren nach Ansprüchen 33, 34, 36, 38, 40, 42 oder 44, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist.

57. Set von Oligonukleotiden oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomeren nach Ansprüchen 33, 34, 36, 38, 40, 42 oder 44, dadurch gekennzeichnet, daß alle Mitglieder des Sets an eine feste Phase gebunden sind.

58. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung der verschiedenen Oligomeren oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomeren (Array) zur Analyse von mit dem entsprechenden genomischen Methylierungsstatus der CpG-Dinukleotide innerhalb einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 38 und dazu komplementären Sequenzen assoziierten Erkrankungen, wobei mindestens ein Oligomer nach einem der Ansprüche 33, 34, 36, 38, 40, 42 oder 44 an eine feste Phase gekuppelt sind.

59. Anordnung von verschiedenen Oligomeren oder Peptide Nucleic Acid (PNA)- Oligomeren (Array), erhältlich nach Ansprüchen 56 und 57.

60. Array von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, daß diese auf einer ebenen festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

61. Nukleinsäure oder Peptide Nucleic Acid Array für die Analyse von Lymphoid- Zellteilungsstörungen, assoziiert mit dem Methylierungsstatus von Genen umfassend mindestens eine Nukleinsäure nach einem der voranstehenden Ansprüche.

62. Array nach einem der Ansprüche 59 bis 61, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist.

63. Kit, umfassend ein Bisulfit ( = Disulfit, Hydrogensulfit)-Reagens, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 29 bis 45.

64. Verwendung von Oligonukleotiden oder Peptide Nucleic Acid (PNA)-Oligomeren gemäß SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 602 zum Nachweis einer Prädisposition für Differenzierung zwischen Unterklassen, Diagnosen, Prognose, Behandlung und/oder Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen.

65. DNA-Sequenz gemäß einer der Sequenzen aus der Gruppe umfassend SEQ ID NO: 61 bis SEQ ID NO: 212 und dazu komplementären Sequenzen zur Verwendung bei der Analyse von Cytosin-Methylierung innerhalb der Nukleinsäuren zum Nachweis einer Prädisposition zu, Differenzierung zwischen Unterklassen, Diagnose, Prognose, Behandlung und/oder Überwachung von Lymphoid-Zellteilungsstörungen.