DE10150945A1 - Adenoviral nucleic acid useful for preventing or treating malignant or benign tumors, by inducing cell lysis, comprises a sequence for the YB-1 protein - Google Patents

Abstract

Adenovirus (AdV) nucleic acid (I) that includes a sequence (II) for the YB-1 protein, is new. Independent claims are also included for the following: (1) nucleic acid (III) that includes (II) and a sequence (IIa) that mediates nuclear transport of YB-1; (2) AdV nucleic acid (IV) in which a functional late E2 promoter has been replaced by a tumor- or tissue-specific promoter; (3) an AdV replication system comprising: (i) AdV nucleic acid deficient for expression of the E1A protein and (ii) a helper virus nucleic acid that contains (II); (4) a vector, particularly an expression vector, comprising any of (I), (III) or (IV); (5) a set of vectors that together comprise the system of (3); (6) AdV comprising any of (I), (III) and (IV); (7) a cell containing any of (I), (III), (IV), the system of (3), the vectors of (4) or (5), or AdV of (6); (8) screening patients for suitability for treatment with an E1B-deficient AdV; and (9) a complex of a YB-1 and a E1B 55 kD protein or E1A protein.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren umfassend adenovirale Nukleinsäure, diese umfassende Adenoviren und deren Verwendung. The present invention relates to nucleic acids comprising adenoviral nucleic acid comprehensive adenoviruses and their use.

Bei der Behandlung von Tumoren werden derzeit eine Vielzahl von Therapiekonzepten verfolgt. Neben der Verwendung chirurgischer Techniken stehen dabei die Chemotherapie und die Strahlentherapie im Vordergrund. All diese Techniken sind jedoch für den Patienten mit nicht unerheblichen Nebenwirkungen verbunden. A variety of therapy concepts are currently used in the treatment of tumors tracked. In addition to the use of surgical techniques, there is chemotherapy and radiation therapy in the foreground. However, all of these techniques are for the patient associated with not inconsiderable side effects.

Mit der Verwendung von replikationsselektiven onkolytischen Viren wurde eine neue Plattform für die Behandlung von Tumoren geschaffen. Dabei wird eine selektive intratumorale Replikation eines viralen Agens herbeigeführt, die in der Folge zur Virusreplikation, Lyse der infizierten Tumorzelle und Verbreitung des Virus auf benachbarte Tumorzellen führt. Infolge der Beschränkung der Replikationsfähigkeit des Virus auf Tumorzellen bleibt normales Gewebe von der Infektion und damit der Lyse durch den Virus verschont. Beispiele für derartige replikationsselektive onkolytische Viren sind Genattenuierte Adenovirus und Herpesviren (Martuza, R. et al. Science 252, 854-858 (1991); Fueyo, J et al. Oncogene 19, 2-12 (2000)). With the use of replication-selective oncolytic viruses, a new Platform for the treatment of tumors created. Doing so is selective intratumoral replication of a viral agent, which subsequently led to Virus replication, lysis of the infected tumor cell and spread of the virus to neighboring ones Leads tumor cells. Due to the limitation of the replication ability of the virus Tumor cells remain normal tissue from infection and thus lysis by the virus spared. Examples of such replication-selective oncolytic viruses are Genattenuated adenovirus and herpes viruses (Martuza, R. et al. Science 252, 854-858 (1991); Fueyo, J et al. Oncogene 19, 2-12 (2000)).

Ein Beispiel für einen derartigen Adenoviren ist dl 1520 (Onyx-015), der bereits erfolgreich in den klinischen Phasen I und II eingesetzt wurde (Khuri, F. et al. Nature Medicine 6, 879-885 (2000)). Onyx-015 ist ein Adenovirus, bei dem das E1B 55-kDa-Gen deletiert ist. Das E1B-55 kDa-Genprodukt ist beteiligt an der Inhibierung von p53, dem Transport viraler mRNA und dem Abschalten der Proteinsynthese der Wirtszelle. Die Inhibierung von p53 erfolgt dabei durch Ausbilden eines Komplexes aus p53 und dem adenoviral codierten E1B- 55 kDa Protein. Von p53, codiert von TP53, geht ein komplexer regulatorischer Mechanismus aus (Zambetti, G. P. et al., FASEB J, 7, 855-865), der u. a. auch dazu führt, dass eine effiziente Replikation von Viren wie Adenoviren in der Zelle unterdrückt wird. Das Gen TP53 ist in etwa 50% aller menschlichen Tumoren deletiert oder mutiert mit der Folge, dass es zu keiner - erwünschten - Apoptose infolge einer Chemotherapie oder einer Bestrahlungstherapie kommt und damit der Erfolg dieser Tumorbehandlungen im Normalfall unterbleibt. An example of such an adenovirus is dl 1520 (Onyx-015), which has already been successful was used in clinical phases I and II (Khuri, F. et al. Nature Medicine 6, 879-885 (2000)). Onyx-015 is an adenovirus with the E1B 55 kDa gene deleted. The E1B-55 kDa gene product is involved in the inhibition of p53, the transport of viral mRNA and switching off the protein synthesis of the host cell. Inhibition of p53 takes place by forming a complex of p53 and the adenovirally encoded E1B- 55 kDa protein. P53, encoded by TP53, has a complex regulatory mechanism from (Zambetti, G.P. et al., FASEB J, 7, 855-865), et al. a. also leads to efficient Replication of viruses such as adenoviruses in the cell is suppressed. The TP53 gene is in about 50% of all human tumors deleted or mutated with the result that none of them - Desired - Apoptosis due to chemotherapy or radiation therapy comes and thus the success of these tumor treatments is usually omitted.

DNA-Tumorviren, wie Adenoviren, treiben die infizierten Zellen in die S-Phase des Zellzyklus, um die virale DNA-Replikation zu erleichtern. Onyx-015 exprimiert das E1B-55 kDa Protein nicht und repliziert selektiv in Tumorzellen gegenüber normalen Zellen. Darüber hinaus besteht eine weitere Selektivität dahingehend, dass solche Tumoren infolge der viralen Lyse der Tumorzellen eine vergleichsweise stärkere Nekrose erfahren, die p53- defizient sind, als jene, die den p53-Wildtyp aufweisen (Khuri et al., aaO). Trotz der grundsätzlichen Wirksamkeit von Onyx-015 bei der viral induzierten Onkolyse im Falle von p53-defizienten Tumoren ist die Erfolgsrate von 15% der behandelten Tumore sehr gering. DNA tumor viruses, such as adenoviruses, drive the infected cells into the S phase of the Cell cycle to facilitate viral DNA replication. Onyx-015 expresses this E1B-55 kDa protein does not and replicates selectively in tumor cells over normal cells. In addition, there is another selectivity in that such tumors as a result of viral lysis of the tumor cells experience a comparatively stronger necrosis, the p53 are deficient than those that have the p53 wild type (Khuri et al., loc. cit.). Despite the basic effectiveness of Onyx-015 in virally induced oncolysis in the case of p53-deficient tumors, the success rate of 15% of the tumors treated is very low.

Ries et al. (Ries, S. J. et al. Nature Medicine 6, 1128-1132 (2000)) haben eine prinzipielle Möglichkeit aufgezeigt, wie Onyx-015 auch bei Tumoren mit p53-Wildtyp erfolgreich verwendet werden können. Dabei wird das Tumorsuppressor-Protein p14ARF nicht exprimiert. In Folge des Fehlens von p14ARF unterbleibt die normale Reaktion des p53- Systems auf eine virale Infektion und erlaubt damit die Replikation von Onyx-015 auch in diesen Tumoren. Eine Anwendung dieser Erkenntnis setzt jedoch voraus, dass in der Tumorzelle ein geeigneter genetischer Hintergrund existiert oder durch geeignete therapeutische Maßnahmen bereitgestellt wird. Im ersteren Falle würde sich die Anzahl der mittels Onyx-015 therapierbaren Tumoren weiter verringern, im zweiten Fall wäre eine aufwendige Änderung des genetischen Hintergrundes der Tumorzellen erforderlich. Ries et al. (Ries, S.J. et al. Nature Medicine 6, 1128-1132 (2000)) have a principle Possibility shown how onyx-015 also successful in tumors with p53 wild type can be used. The tumor suppressor protein p14ARF is not expressed. Due to the absence of p14ARF, the normal reaction of the p53- Systems on a viral infection and thus allows the replication of Onyx-015 also in these tumors. However, application of this knowledge requires that in the Tumor cell has a suitable genetic background or by a suitable one therapeutic measures are provided. In the former case, the number of further reduce tumors that can be treated with Onyx-015, in the second case one would be extensive changes in the genetic background of the tumor cells required.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bestehenden adenoviralen Systeme für die viral induzierte Onkolyse zu verbessern. Insbesondere soll dabei die Erfolgsrate, mit der Tumoren erfolgreich behandelt werden können, erhöht sein verglichen mit dem Stand der Technik. The present invention has for its object the existing adenoviral To improve systems for virally induced oncolysis. In particular, the The success rate at which tumors can be successfully treated can be increased compared with the state of the art.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, adenovirale Systeme für die viral induzierte Onkolyse bereitzustellen, die auch bei solchen Tumoren wirksam sind, die vom p53-Wildtyp sind. It is another object of the present invention to provide adenoviral systems for the viral to provide induced oncolysis, which are also effective in those tumors developed by are p53 wild type.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure eine für YB-1 codierende Nukleinsäuresequenz umfasst. According to the invention, the object is achieved in a first aspect by a nucleic acid comprising an adenoviral nucleic acid, the nucleic acid encoding a YB-1 Nucleic acid sequence comprises.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die adenovirale Nukleinsäure eine für E1-B codierende Nukleinsäure umfasst. In one embodiment it is provided that the adenoviral nucleic acid is one for E1-B encoding nucleic acid.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die adenovirale Nukleinsäure eine für E4orf6 codierende Nukleinsäure umfasst. In a further embodiment it is provided that the adenoviral nucleic acid is a for N4orf6 encoding nucleic acid.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist ein Promotor vorgesehen, der die Expression von E1-B steuert. In a still further embodiment, a promoter is provided which expresses E1-B controls.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass ein Promotor vorgesehen ist, der die Expression von E4orf6 steuert. In a still further embodiment it is provided that a promoter is provided that controls the expression of E4orf6.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass E1B das E1-B 55 kDa-Protein ist. In yet another embodiment it is provided that E1B is the E1-B 55 kDa protein is.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure für funktional inaktive Genprodukte E1B und/oder E1 und/oder E3 und/oder E4 codiert. In a further embodiment it is provided that the nucleic acid is functional encoded inactive gene products E1B and / or E1 and / or E3 and / or E4.

In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Nukleinsäure umfassend eine für YB-1 codierende Nukleinsäuresequenz und eine einen Kerntransport von YB-1 vermittelnde Nukleinsäuresequenz. In a second aspect, the object is achieved by a nucleic acid comprising one for YB-1 coding nucleic acid sequence and a nuclear transport of YB-1 mediating Nucleic acid sequence.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die den Kerntransport von YB-1 vermittelnde Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die Signalsequenzen und Transportsequenzen umfasst. In one embodiment it is provided that the mediating the core transport of YB-1 Nucleic acid sequence is selected from the group consisting of signal sequences and Transport sequences includes.

In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, wobei die adenovirale Nukleinsäure anstelle eines bzw. des funktionalen late E2-Promotors, insbesondere des funktional aktiven late E2-Promotors, einen tumorspezifischen Promotor aufweist. In a third aspect, the invention relates to a nucleic acid comprising an adenoviral Nucleic acid, the adenoviral nucleic acid instead of one or the functional late E2 promoter, in particular the functionally active late E2 promoter has tumor-specific promoter.

In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, wobei die adenovirale Nukleinsäure anstelle eines bzw. des funktionalen late E2-Promotors, insbesondere des funktional aktiven late E2-Promotors, einen gewebespezifischen Promotor aufweist. In a fourth aspect, the invention relates to a nucleic acid comprising an adenoviral Nucleic acid, the adenoviral nucleic acid instead of one or the functional late E2 promoter, in particular the functionally active late E2 promoter has tissue-specific promoter.

In einem fünften Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein adenovirales Replikationssystem umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, wobei die adenovirale Nukleinsäure defizient für die Expression des E1A-Proteins ist, und umfassend eine Nukleinsäure eines Helfervirus, wobei die Nukleinsäure des Helfervirus eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für YB-1 codiert. In a fifth aspect, the task is solved by an adenoviral replication system comprising an adenoviral nucleic acid, the adenoviral nucleic acid being deficient for is the expression of the E1A protein and comprises a nucleic acid of a helper virus, wherein the nucleic acid of the helper virus comprises a nucleic acid sequence which is for YB-1 coded.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die adenovirale Nukleinsäure und/oder die Nukleinsäure des Helfervirus als replizierbarer Vektor vorliegt. In one embodiment it is provided that the adenoviral nucleic acid and / or the Nucleic acid of the helper virus is present as a replicable vector.

In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch einen Vektor, bevorzugterweise einen Expressionsvektor, der ein der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfasst. In a sixth aspect, the task is solved by a vector, preferably an expression vector which comprises one of the nucleic acids according to the invention.

In einem siebten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch eine Vektorgruppe umfassend mindestens zwei Vektoren, wobei die Vektorgruppe insgesamt ein erfindungsgemäßes adenovirales Replikationssystem umfasst. In a seventh aspect, the task is solved comprehensively by a vector group at least two vectors, the vector group altogether one according to the invention adenoviral replication system.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass eine jede Komponente des adenoviralen Replikationssystems auf einem eigenen Vektor, bevorzugterweise einem Expressionsvektors, angeordnet ist. In one embodiment it is provided that each component of the adenoviral Replication system on its own vector, preferably an expression vector, is arranged.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass mindestens zwei Komponenten des adenoviralen Replikationssystems auf einem Vektor der Vektorgruppe angeordnet sind. In a further embodiment it is provided that at least two components of the adenoviral replication system are arranged on a vector of the vector group.

In einem achten Aspekt betrifft die Erfindung ein Adenovirus umfassend eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. In an eighth aspect, the invention relates to an adenovirus comprising one of the nucleic acids according to the invention.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Adenovirus ein Kapsid umfasst. In one embodiment it is provided that the adenovirus comprises a capsid.

In einem neunten Aspekt betrifft die Erfindung eine Zelle umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und/oder ein erfindungsgemäßes adenovirales Replikationssystem und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor und/oder eine erfindungsgemäße Vektorgruppe und/oder einen erfindungsgemäßen Adenovirus. In a ninth aspect, the invention relates to a cell comprising an inventive cell Nucleic acid and / or an adenoviral replication system according to the invention and / or a vector according to the invention and / or a vector group according to the invention and / or an adenovirus according to the invention.

In einem zehnten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder eines erfindungsgemäßen adenoviralen Replikationssystems und/oder eines erfindungsgemäßen Vektors und/oder einer erfindungsgemäßen Vektorengruppe und/oder eines erfindungsgemäßen Adenovirus und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Medikaments. In a tenth aspect, the invention relates to the use of an inventive Nucleic acid and / or an adenoviral replication system according to the invention and / or a vector according to the invention and / or a vector group according to the invention and / or an adenovirus according to the invention and / or a cell according to the invention for Manufacture of a drug.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Medikament für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen ist. In one embodiment it is provided that the medicament for the treatment and / or Prophylaxis of tumor diseases is.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Medikament weiter eine pharmazeutisch wirksame Verbindung enthält. In a further embodiment, it is provided that the medicament continues to be a contains pharmaceutically active compound.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die pharmazeutische Verbindung aus gewählt ist aus der Gruppe, die Zytostatika umfasst. Geeignete Zytostatika sind, unter anderem cis- Platin, Taxol, Daunoblastin, Adriamycin und Mitoxantron. In one embodiment it is provided that the pharmaceutical compound is selected from is from the group that includes cytostatics. Suitable cytostatics include cis Platinum, Taxol, Daunoblastin, Adriamycin and Mitoxantron.

In einem elften Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder eines erfindungsgemäßen adenoviralen Replikationssystems und/oder eines erfindungsgemäßen Vektors und/oder einer erfindungsgemäßen Vektorengruppe und/oder eines erfindungsgemäßen Adenovirus und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen, wobei die Tumorzellen eine vom Zellzyklus unabhängige Kernlokalisation von YB-1 aufweisen. In an eleventh aspect, the invention relates to the use of an inventive Nucleic acid and / or an adenoviral replication system according to the invention and / or a vector according to the invention and / or a vector group according to the invention and / or an adenovirus according to the invention and / or a cell according to the invention for Manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of Tumor diseases, the tumor cells being independent of the cell cycle Have core localization of YB-1.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure für eine adenovirale Nukleinsäure codiert und die adenovirale Nukleinsäure E1B-defizient, insbesondere E1B 55 kDa-defizient ist. In one embodiment it is provided that the nucleic acid for an adenoviral Nucleic acid encoded and the adenoviral nucleic acid E1B deficient, in particular E1B 55 kDa is deficient.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Adenovirus E1B-defizient, insbesondere E1B 55 kDa-defizient ist. In a further embodiment it is provided that the adenovirus E1B deficient, E1B in particular is 55 kDa deficient.

In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure für eine adenovirale Nukleinsäure codiert und die adenovirale Nukleinsäure für E1B codiert, insbesondere für E1B 55 kDa. In an alternative embodiment it is provided that the nucleic acid for a encoded adenoviral nucleic acid and encoded the adenoviral nucleic acid for E1B, especially for E1B 55 kDa.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Adenovirus E1B exprimiert, insbesondere E1B 55 kDa. In one embodiment it is provided that the adenovirus expresses E1B, in particular E1B 55 kDa.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die adenovirale Nukleinsäure für E1A codiert. In a still further embodiment it is provided that the adenoviral nucleic acid encoded for E1A.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Adenovirus E1A exprimiert. In a still further embodiment it is provided that the adenovirus expresses E1A.

In den verschiedenen Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Tumor und/oder die Tumorerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die p53-positive Tumoren, p53-negative Tumoren, maligne Tumoren, benigne Tumoren und Kombinationen davon umfasst. In the various embodiments it is provided that the tumor and / or the Tumor disease is selected from the group consisting of p53-positive tumors, p53-negative Tumors, malignant tumors, benign tumors and combinations thereof.

In einem zwölften Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Patienten, die mit einem E1B-defizienten, bevorzugterweise E1B 55 kDa-defizienten, Adenovirus behandelbar sind, welches die folgenden Schritte umfasst:

• - Untersuchen einer Probe des Tumorgewebes und
• - Feststellen, ob YB-1 im Kern Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist.

In a twelfth aspect, the invention relates to a method for screening patients who can be treated with an E1B-deficient, preferably E1B 55 kDa-deficient, adenovirus, which comprises the following steps:

• - Examine a sample of the tumor tissue and
• - Determine whether YB-1 is located in the nucleus independently of the cell cycle.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Untersuchung des Tumorgewebes unter Verwendung eines Mittels erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper gegen YB-1 umfasst. In one embodiment it is provided that the examination of the tumor tissue under An agent is selected that is selected from the group consisting of antibodies against YB-1 includes.

In einem dreizehnten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers gegen YB-1 zur Bestimmung von Patienten, insbesondere Tumorpatienten, die mit einem E1B- defizientem, bevorzugterweise E1B 55 kDa-defizientem Adenovirus behandelbar sind. In a thirteenth aspect, the invention relates to the use of an antibody against YB-1 for the determination of patients, especially tumor patients, who are treated with an E1B deficient, preferably E1B 55 kDa deficient adenovirus can be treated.

In einem vierzehnten Aspekt betrifft die Erfindung einen Komplex umfassend mindestens ein YB-1-Molekül und mindestens ein E1B 55 kDa-Protein. In a fourteenth aspect, the invention relates to a complex comprising at least one YB-1 molecule and at least one E1B 55 kDa protein.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das YB-1-Molekül ein transgenes YB-1- Molekül ist. In one embodiment it is provided that the YB-1 molecule is a transgenic YB-1 Molecule is.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das YB-1 nukleär exprimiertes YB-1 ist. In a further embodiment it is provided that the YB-1 is nuclear expressed YB-1 is.

Im Zusammenhang mit den hierin offenbarten Nukleinsäuren wird der Begriff auch im Sinne von Nukleinsäuresequenzen verwendet. Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ebenso wie bei den erfindungsgemäßen Adenoviren handelt es sich bevorzugterweise um rekombinante Produkte, insbesondere dann, wenn eine Veränderung gegenüber dem Wildtyp vorgenommen wurde. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weisen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sowie die erfindungsgemäßen Adenoviren typischerweise eine E1-Deletion, eine E1-E3-Deletion und/oder eine E4-Deletion auf, d. h. die Nukleinsäure bzw. die entsprechenden Adenoviren sind nicht in der Lage, funktional aktive E1- und/oder E3- und/oder E4-Expressionsprodukte zu erzeugen bzw. entsprechende Produkte können von diesen nicht erzeugt werden. Typischerweise wird dies durch eine Deletion oder eine entsprechende Mutation, einschließlich einer Punktmutation, bewerkstelligt. In connection with the nucleic acids disclosed herein, the term is also used in the sense of nucleic acid sequences used. The same applies to the nucleic acids according to the invention as with the adenoviruses according to the invention, they are preferably recombinant products, especially when there is a change from the wild type was made. In connection with the present invention, the nucleic acids according to the invention and the adenoviruses according to the invention typically an E1 deletion, an E1-E3 deletion and / or an E4 deletion, i.e. H. the nucleic acid or the corresponding adenoviruses are not able to functionally active E1 and / or E3 and / or E4 expression products or corresponding products can be produced by these are not generated. Typically, this is through a deletion or corresponding mutation, including a point mutation.

In einem fünfzehnten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Komplexes umfassend mindestens ein YB-1-Molekül und mindestens ein E1A-Protein. In a fifteenth aspect, the invention relates to the use of a complex comprising at least one YB-1 molecule and at least one E1A protein.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass ein oder mehrere der Proteine der E1A-Region transaktivierend auf die adenovirale Genexpression, aber nicht auf die Replikation eines Adenovirus aktivierend wirkt/wirken. In one embodiment it is provided that one or more of the proteins of the E1A region transactivating to adenoviral gene expression, but not to replication of one Adenovirus activates.

In einem sechzehnten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Komplexes umfassend mindestens ein YB-1-Molekül und mindestens ein E1A-Protein zur Tumorbehandlung, insbesondere zur Tumorlyse. In a sixteenth aspect, the invention relates to the use of a Complex according to the invention comprising at least one YB-1 molecule and at least one E1A protein for tumor treatment, especially for tumor lysis.

In einem siebzehnten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines E1B- defizienten Adenovirus zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Tumoren, die YB-1 im Kern aufweisen. In a seventeenth aspect, the present invention relates to the use of an E1B deficient adenovirus for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors, which have YB-1 in the core.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Kernlokalisation von YB-1 unter dem Einfluss exogener Maßnahmen erfolgt. In a preferred embodiment it is provided that the core localization of YB-1 takes place under the influence of exogenous measures.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die exogenen Maßnahmen solche Maßnahmen sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Bestrahlung, Zytostatika und Hyperthermie umfasst. In a particularly preferred embodiment it is provided that the exogenous Measures are measures that are selected from the group consisting of radiation, Includes cytostatics and hyperthermia.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die exogene Maßnahme an dem Organismus angewandt wird, für den das Medikament bestimmt ist. In a still further embodiment it is provided that the exogenous measure on the Organism is used for which the drug is intended.

Weitere Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen. Further embodiments result from the subclaims.

Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass nach Infektion einer Zelle, typischerweise einer Tumorzelle mit Adenovirus eine Komplexbildung zwischen YB-1 und dem adenoviralen Genprodukt E1B-55 kDa und infolge dieser Komplexbildung ein Transport von YB-1 in den Kern erfolgt, was eine effektive Replikation des Virus im Zellkern in vivo erlaubt. Dabei wurde weiter festgestellt, dass auch E4orf6 an E1B-55 K bindet (Weigel, S., Dobbelstein, M. J. Virology, 74, 764-772, 2000,. The nuclear export signal within the E4orf6 protein of adenovirus type 5 supports virus replication and cytoplasmic accumulation of viral mRNA; Keith N. Leppard, Seminars in Virology, 8, 301-307, 1998. Regulated RNA processing and RNA transport during adenovirus infection) und somit den Transport bzw. die Verteilung von E1B-55 K in den Kern vermittelt. Durch das Zusammenwirken von E1B-55 K und YB-1 bzw. E1B-55 K, YB-1 und E4orf6 erfolgt somit eine effiziente Replikation des Virus, was wiederum zur einer Lyse der Zelle, Freisetzung des Virus und Infektion und Lyse benachbarter Zellen führt, so dass im Falle der Infektion einer Tumorzelle bzw. eines Tumors letztlich eine Lyse des Tumors, d. h. eine Onkolyse, auftritt. The invention is based on the surprising finding that after infection of a cell, typically a tumor cell with adenovirus complexes between YB-1 and the adenoviral gene product E1B-55 kDa and, as a result of this complex formation, a transport of YB-1 occurs in the nucleus, resulting in an effective replication of the virus in the nucleus in vivo allowed. It was also found that E4orf6 also binds to E1B-55 K (Weigel, S., Dobbelstein, M.J. Virology, 74, 764-772, 2000 ,. The nuclear export signal within the E4orf6 protein of adenovirus type 5 supports virus replication and cytoplasmic accumulation of viral mRNA; Keith N. Leppard, Seminars in Virology, 8, 301-307, 1998. Regulated RNA processing and RNA transport during adenovirus infection) and thus the transport or the Distribution of E1B-55 K mediated into the core. Through the interaction of E1B-55 K and YB-1 or E1B-55 K, YB-1 and E4orf6 thus an efficient replication of the Virus, which in turn leads to cell lysis, virus release and infection and lysis neighboring cells leads, so that in the event of infection a tumor cell or a tumor ultimately tumor lysis, i.e. H. oncolysis occurs.

Eine weitere der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis besteht darin, dass YB-1 als Transkriptionsfaktor an den späten E2-Promotor (engl. E2 late Promotor) von Adenovirus bindet und die Replikation des Adenovirus über diesen aktiviert. Damit werden neue Adenoviren und adenovirale Systeme für die Onkolyse möglich. Another finding on which the invention is based is that YB-1 as Transcription factor to the late E2 promoter (English E2 late promoter) of adenovirus binds and activates the replication of the adenovirus. This will create new ones Adenoviruses and adenoviral systems for oncolysis possible.

Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die Expression des Transgens YB-1 in einem adenoviralen Vektor zur viralen Replikation führt. Dabei werden die viralen Gene E1B, E3 und E4 nicht eingeschaltet, was im wesentlichen darin begründet: liegt, dass der adenovirale Vektor hinsichtlich E1 und/oder E3 deletiert ist. Diese Gene sind jedoch für eine sehr effiziente Replikation bzw. Partikelbildung notwendig (Goodrum, F. D., Ornelles, D. A. Roles for the E4 orf6, orf3, and E1B 55-kilodalton proteins in cell cycle-independent adenovirus replication. J. Virol., 73, 7474-7488 (1999)); Medghalchi, S., Padmanabhan, R., Ketner, G. Early region 4 modulates adenovirus DNA replication by two genetically separable mechanisms. Virology, 236, 8-17 (1997). Es ist weiterhin bekannt, dass zwei Proteine (das 12S- und das 13S-Protein), die von E1A codiert werden, die Expression der anderen adenoviralen Gene steuern bzw. induzieren (Nevins, J. R. Mechanism of activation of early viral transcription by the adenovirus E1A gene products. Cell 26, 213-220 (1981); Boulanger, P et al. (1991); Biochem. J. 275, 281-299). Dabei hat sich gezeigt, dass hauptsächlich die CR3-Region des 13S-Proteins die transaktivierende Funktion ausübt (Wong HK, Ziff EB. Complementary functions of Ela conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirus serotype 5 early promoters. J Virol. 1994, 68(8): 4910-20). Adenoviren, die bestimmte Deletionen in der CR1- und/oder CR2- Region des 13S-Proteins aufweisen, können nicht replizieren, wirken aber noch transaktivierend auf die viralen Gene bzw. Promotoren (Wong HK, Ziff EB. Complementary functions of E1a conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirus serotype 5 early promoters. J Virol. 1994, 68(8): 4910-20). Furthermore, the present invention is based on the surprising finding that the Expression of the transgene YB-1 in an adenoviral vector leads to viral replication. The viral genes E1B, E3 and E4 are not switched on, which is essentially The reason for this is that the adenoviral vector has been deleted with respect to E1 and / or E3. However, these genes are necessary for very efficient replication or particle formation (Goodrum, F.D., Ornelles, D.A. Roles for the E4 orf6, orf3, and E1B 55-kilodalton proteins in cell cycle-independent adenovirus replication. J. Virol., 73, 7474-7488 (1999)); Medghalchi, S., Padmanabhan, R., Ketner, G. Early region 4 modulates adenovirus DNA replication by two genetically separable mechanisms. Virology, 236, 8-17 (1997). It is further known two proteins (the 12S and the 13S protein) encoded by E1A control or induce the expression of the other adenoviral genes (Nevins, J. R. Mechanism of activation of early viral transcription by the adenovirus E1A gene products. Cell 26: 213-220 (1981); Boulanger, P et al. (1991); Biochem. J. 275, 281-299). Doing it was shown that mainly the CR3 region of the 13S protein transactivates the Function (Wong HK, Ziff EB. Complementary functions of Ela conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirus serotype 5 early promoters. J Virol. 1994, 68 (8): 4910-20). Adenoviruses that have certain deletions in the CR1 and / or CR2 Region of the 13S protein can not replicate, but still work transactivating to the viral genes or promoters (Wong HK, Ziff EB. Complementary functions of E1a conserved region 1 cooperate with conserved region 3 to activate adenovirus serotype 5 early promoters. J Virol. 1994, 68 (8): 4910-20).

Die Kombination eines derartigen Systems, d. h. eines Systems, welches die viralen Gene einschaltet, aber nicht zur viralen Replikation fähig ist, mit einer Tumor- bzw. Gewebespezifischen Expression des Transgens YB-1 würde hingegen eine sehr effektive virale Replikation bzw. Partikelbildung und damit eine Onkolyse erlauben. Als geeignete Tumor- bzw. Gewebe-spezifische Promotoren können jene verwendet werden, wie sie hierin insgesamt beschrieben wurden. The combination of such a system, i. H. of a system that contains the viral genes switches on, but is not capable of viral replication, with a tumor or Tissue-specific expression of the transgene YB-1, on the other hand, would be a very effective viral Allow replication or particle formation and thus oncolysis. As a suitable tumor or tissue-specific promoters, those as used herein can be used were described as a whole.

YB-1 ist ein Vertreter der Y-Box-Proteinfamilie, die an das DNA-Sequenzmotiv Y-Box bindet. Das Y-Box-Motiv stellt ein transkriptionell regulatorisches Element dar, das sich in den Promotor oder Enhancer-Regionen einer Anzahl unterschiedlicher Gene findet, die ein Rolle bei der Regulation der Zellproliferation spielen (Ladomery, M. et al., 1995; Bioassays 17: 9-11; Didier, D. K. et al., 1988, PNAS, 85, 7322-7326). YB-1 is a member of the Y-Box protein family that is linked to the DNA sequence motif Y-Box binds. The Y-box motif is a transcriptionally regulatory element that can be found in the promoter or enhancer regions of a number of different genes that a Play a role in regulating cell proliferation (Ladomery, M. et al., 1995; Bioassays 17: 9-11; Didier, D.K. et al., 1988, PNAS, 85, 7322-7326).

Adenoviren sind in der Technik bekannt. Dabei handelt es sich um dsDNA-Viren (Boulanger, P et al. (1991); Biochem. J. 275, 281-299). Die Organisation des Genoms ist in Fig. 1 dargestellt. Die vollständige Nukleotidsequenz des adenoviralen Genoms ist bekannt und beschrieben in (Chroboczek, J. et al., Virology 1992, 186, 280-285). Ein für die Verwendung von Adenoviren besonders wichtiger Teil des Genoms sind die sogenannten frühen oder early Gene und deren Genprodukte, die als E1, E2, E3 und E4 bezeichnet werden. Dabei umfasst E1 zwei Genprodukten E1A und E1B, die Onkogene darstellen. Die insgesamt drei Genprodukte der Gruppe E2 sind zusammen mit den Genprodukten E3 und E4 an der Replikation beteiligt. Adenoviruses are known in the art. These are dsDNA viruses (Boulanger, P et al. (1991); Biochem. J. 275, 281-299). The organization of the genome is shown in Fig. 1. The complete nucleotide sequence of the adenoviral genome is known and is described in (Chroboczek, J. et al., Virology 1992, 186, 280-285). A particularly important part of the genome for the use of adenoviruses are the so-called early or early genes and their gene products, which are referred to as E1, E2, E3 and E4. E1 comprises two gene products E1A and E1B, which are oncogenes. The three gene products in group E2 together with gene products E3 and E4 are involved in replication.

Die im Stand der Technik bekannten adenoviralen Systeme zur Onkolyse wie beispielsweise Onyx-015 weisen eine Deletion für E1B-55 kDa-Protein auf. Diese Deletion war vorgenommen worden unter der Annahme, dass ein intaktes p53-Gen einer effiziente Replikation in vivo entgegenwirkt und um eine adenovirale Replikation in vivo nur in p53- negativen/mutierten Zellen sicher zu stellen, führt jedoch verglichen mit dem Wildtyp zu einer um zwei Größenordnungen verringerten Partikelanzahl infolge gestörter Replikation. Andererseits greifen diese adenoviralen Systeme nach dem Stand der Technik auf E1A zurück, um vermittels des frühen E2-Promotors (E2 early Promotor) die in vivo Replikation zu steuern. The adenoviral systems for oncolysis known in the prior art, for example Onyx-015 have a deletion for E1B-55 kDa protein. That deletion was was made on the assumption that an intact p53 gene is an efficient Counteracts replication in vivo and adenoviral replication in vivo only in p53- Ensuring negative / mutant cells, however, results in compared to the wild type a two order of magnitude reduced particle count due to disrupted replication. On the other hand, these prior art adenoviral systems use E1A back to in vivo replication by means of the E2 early promoter (E2 early promoter) to control.

Die vorliegende Erfindung wendet sich von diesem Prinzip insoweit ab, als dass die hierin beschriebenen adenovirale Systeme auf den späten E2-Promotor zurückgreifen. The present invention turns away from this principle insofar as the present invention described adenoviral systems fall back on the late E2 promoter.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sollen hierin die Begriffe Adenovirus und adenovirale Systeme als im wesentlichen die gleiche Bedeutung aufweisend verstanden werden. Unter Adenovirus soll dabei insbesondere das vollständige Viruspartikel verstanden werden umfassend das Kapsid und die Nukleinsäure. Der Begriff adenovirales System stellt insbesondere darauf ab, dass die Nukleinsäure gegenüber dem Wildtyp verändert ist. Bevorzugt umfassen derartige Änderungen Änderungen im Aufbau des Genoms des Adenovirus wie Deletieren und/oder Hinzufügen und/oder Mutieren von Promotoren, regulativen Sequenzen und codierende Sequenzen (wie Leserahmen). Der Begriff adenovirale Systeme wird darüber hinaus bevorzugt in dem Zusammenhang verwendet, dass es sich dabei um einen Vektor handelt. Within the scope of the present invention, the terms adenovirus and adenoviral systems are understood to have essentially the same meaning become. Adenovirus is understood to mean in particular the complete virus particle encompass the capsid and nucleic acid. The term adenoviral system represents especially depends on the fact that the nucleic acid is changed compared to the wild type. Such changes preferably include changes in the structure of the genome of the Adenovirus such as deleting and / or adding and / or mutating promoters, regulatory sequences and coding sequences (such as reading frames). The term adenoviral Systems is also preferably used in the context that it is is a vector.

Die adenoviralen Nukleinsäuren, auf die hierin Bezug genommen wird, sind im Stand der Technik bekannt. Es ist im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet, für die Erfindung unwesentlichen adenoviralen Nukleinsäuresequenzen zu deletieren bzw. zu mutieren. Derartige Deletionen können z. B. die für E3 codierende Nukleinsäure betreffen. In bevorzugten Ausführungsformen können diese adenoviralen Nukleinsäuren noch in das virale Kapsid verpackt werden und damit infektiöse Partikel ausbilden. Gleiches gilt für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Generell gilt es auch noch festzuhalten, dass die adenoviralen Systeme hinsichtlich einzelner oder mehrerer Expressionsprodukte defizient sein können. Dabei ist zu berücksichtigen, dass dies zum einen darauf beruhen kann, dass die für die das Expressionsprodukt codierende Nukleinsäure vollständig oder in dem Maße mutiert oder deletiert ist, dass im wesentlichen kein Expressionsprodukt mehr gebildet wird, oder darauf, dass regulative bzw. die Expression steuernde Elemente wie Promotoren oder Transkriptionsfaktoren fehlen, sei es auf der Ebene der Nukleinsäure (Fehlen eines Promotors; cis-wirkende Element) oder auf der Ebene des Translations- bzw. Transkriptionssystems (trans-wirkende Elemente). Gerade der letztere Aspekt kann dabei vom jeweiligen zellulären Hintergrund abhängen. The adenoviral nucleic acids referred to herein are in the prior art Technology known. It is within the knowledge of professionals in the field for which To delete or to delete insignificant adenoviral nucleic acid sequences mutate. Such deletions can e.g. B. concern the nucleic acid coding for E3. In preferred embodiments, these adenoviral nucleic acids can still be viral Capsid packaged and thus form infectious particles. The same applies to the nucleic acids according to the invention. In general, it should also be noted that the adenoviral systems may be deficient in terms of single or multiple expression products can. It must be taken into account that this can be based on the one hand on the fact that for the nucleic acid encoding the expression product mutates completely or to the extent or deleted that essentially no more expression product is formed, or on the fact that regulative or expression controlling elements such as promoters or Transcription factors are missing, be it at the level of the nucleic acid (lack of a promoter; cis-acting element) or at the level of the translational or Transcription system (trans-acting elements). The latter aspect in particular can be from depend on each cellular background.

Bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die eine adenovirale Nukleinsäure und zusätzlich eine für YB-1 codierende Nukleinsäuresequenz umfasst, handelt es sich bevorzugterweise um eine rekombinante Nukleinsäuren. Der Leserahmen für die für YB-1 codierende Nukleinsäure kann dabei unter der Kontrolle eines die Expression und/oder Translation steuernden Elementes stehen. Dabei kann es sich beispielsweise um einen adenoviralen Promotor oder einen nicht-adenoviralen Promotors handeln. Geeignete nicht-adenovirale Promotoren können ausgewählt sein aus der Gruppe, die Cytomegalovirus-Promotor, RSV-(Rous sarcoma Virus)- Promotor, adenovirus-basierender Promotor Va I und den nichtviralen YB-1-Promotor umfasst. Weitere virale Promotoren, die im Zusammenhang mit einem jeden Aspekt der hierin offenbarten Erfindung verwendet werden können, stellen der Telomerase-Promotor, der Alpha-Fetoprotein (AFP)-Promotor, der Caecinoembryonic Antigen Promotor (CEA) (Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Caomparison of carcinoembryonic antigen promoter regions isolated from human colorectal carcinoma and normal adjacent mucosa to induce strong tumourselective gene expression. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998), der L-Plastin-Promotor (Chung, L, Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Use of L-plastin promoter to develop an adenoviral system that confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in normal mesothelial cells. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), Argenin- Vasopressin-Promotor (Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. Tumour-specific arginine vasopressin promoter activation in small-cell lung cancer. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999) und der PSA-Promotor (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. A novel tumour-specific replication-restricted adenoviral vector for gene therapy of hepatocellular carcinoma. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999) dar. In the nucleic acid according to the invention, which is an adenoviral nucleic acid and additionally comprises a nucleic acid sequence coding for YB-1, it is preferably a recombinant nucleic acid. The reading frame for the nucleic acid coding for YB-1 can be under the control of expression and / or translation Element. This can be, for example, an adenoviral promoter or act as a non-adenoviral promoter. Suitable non-adenoviral promoters can be selected from the group consisting of the cytomegalovirus promoter, RSV (Rous sarcoma Virus) - Promoter, adenovirus-based promoter Va I and the non-viral YB-1 promoter includes. More viral promoters related to every aspect of the invention disclosed herein, the telomerase promoter, which Alpha-fetoprotein (AFP) promoter, the Caecinoembryonic Antigen Promoter (CEA) (Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Caomparison of carcinoembryonic antigen promoter regions isolated from human colorectal carcinoma and normal adjacent mucosa to induce strong tumor selective gene expression. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998), the L-plastin promoter (Chung, L, Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Use of L-plastin promoter to develop an adenoviral system that confers transgene expression in ovarian cancer cells but not in normal mesothelial cells. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), argenin Vasopressin promoter (Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. Tumor-specific arginine vasopressin promoter activation in small-cell lung cancer. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999) and the PSA promoter (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. A novel tumor-specific replication-restricted adenoviral vector for gene therapy of hepatocellular carcinoma. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999).

Hinsichtlich des Telomerase-Promotors ist bekannt, dass dieser in humanen Zellen von einer zentralen Bedeutung ist. So wird die Telomeraseaktivität durch die transkriptionelle Kontrolle des Telomerase reverse Transkriptase-Gens (hTERT), welches die katalytische Untereinheit des Enzyms darstellt, reguliert. Die Expression der Telomerase ist in 85% von humanen Tumorzellen aktiv. Dahingegen ist sie in den meisten normalen Zellen inaktiv. Ausgenommen sind Keimzellen und embryonales Gewebe [Braunstein, I. et al. (2001). Human telomerase reverse transcription promoter regulation in normal and malignant human ovarian epithelial cells. Cancer Research, 61, 5529-5536; Majumdar AS et al. (2001). Tehe telomerase reverse transcriptase promoter drives effcacious tumor suicide gene therapy while preventing hepatotoxicity encountered with constitutive promoters. Gene Therapy, 8, 568-578]. Genaue Untersuchungen am hTERT-Promotor haben gezeigt, dass Fragmente des Promotors von 283 bp bzw. 82 bp vom Initiationscodon entfernt für eine spezifische Expression in Tumorzellen ausreichend sind (Braunstein I. et al.; Majumdar AS et al., aaO). Daher eignet sich dieser Promotor bzw. die spezifischen Fragmente, um eine spezifische Expression eines Transgens nur in Tumorzellen zu erzielen. Der Promotor soll die Expression des Transgens YB-1 und/oder ein verkürzte Form, die funktionell noch aktiv ist, nur in Tumorzellen ermöglichen. Die Expression des Transgens in einem adenoviralen Vektor führt dann zur viralen Replikation des adenoviralen Vektors und in der Folge zu einer Onkolyse. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Leserahmen des YB-1 im Leserahmen (engl. "in frame") mit einem oder mehreren der Genprodukte des adenoviralen Systems ist. Der Leserahmen von YB-1 kann jedoch auch unabhängig davon sein. Bei der für YB-1 codierenden Nukleinsäure kann es sich um die vollständige Sequenz handeln. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäuresequenz verkürzt ist. Eine derartige verkürzte Nukleinsäuresequenz und damit auch ein derartiges verkürztes YB-1- Protein ist insbesondere auch dann noch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn ein derartiges verkürztes YB-1 noch eine Funktion oder Eigenschaft aufweist, wie das vollständige YB-1. Eine derartige Funktion oder Eigenschaft ist beispielsweise die Fähigkeit, in den Kern zu gelangen, mit oder ohne an E1B-55 kDa-Protein zu binden, oder an den E2 late- Promotor zu binden. With regard to the telomerase promoter it is known that this is in human cells from one is of central importance. So is the telomerase activity through the transcriptional control of the telomerase reverse transcriptase gene (hTERT), which is the catalytic subunit of the enzyme, regulates. The expression of telomerase is 85% human Tumor cells active. In contrast, it is inactive in most normal cells. Except are germ cells and embryonic tissue [Braunstein, I. et al. (2001). Human telomerase reverse transcription promoter regulation in normal and malignant human ovarian epithelial cells. Cancer Research, 61, 5529-5536; Majumdar AS et al. (2001). Do the telomerase reverse transcriptase promoter drives effcacious tumor suicide gene therapy while preventing hepatotoxicity encountered with constitutive promoters. Gene Therapy, 8, 568-578]. exact Studies on the hTERT promoter have shown that fragments of the promoter from 283 bp or 82 bp from the initiation codon for specific expression in tumor cells are sufficient (Braunstein I. et al .; Majumdar AS et al., loc. cit.). Therefore, this is suitable Promoter or the specific fragments to a specific expression of a transgene can only be achieved in tumor cells. The promoter is said to express the transgene YB-1 and / or a shortened form, which is still functionally active, only possible in tumor cells. Expression of the transgene in an adenoviral vector then leads to the viral one Replication of the adenoviral vector and subsequently oncolysis. It is also in the Framework of the present invention that the reading frame of the YB-1 in the reading frame. "in frame") with one or more of the gene products of the adenoviral system. The However, YB-1's reading frame can also be independent of it. For the YB-1 The nucleic acid encoding can be the complete sequence. However, it is also in the context of the present invention that the nucleic acid sequence is shortened. A such a shortened nucleic acid sequence and thus also such a shortened YB-1- In particular, protein is still within the scope of the present invention if a such truncated YB-1 still has a function or property like that complete YB-1. Such a function or property is, for example, the ability get into the nucleus with or without binding to E1B-55 kDa protein, or to the E2 tie late promoter.

Die adenovirale Nukleinsäure, die in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfasst ist, kann dabei eine jede adenovirale Nukleinsäure sein, die zu einem Replikationsereignis für sich oder in Verbindung mit weiteren Nukleinsäuresequenzen führt. Bei den weiteren Nukleinsäuresequenzen kann es sich beispielsweise um YB-1 handeln. Dabei ist es möglich, wie hierin noch ausgeführt werden wird, dass mittels Helferviren die für die Replikation erforderlichen Sequenzen und/oder Genprodukte bereitgestellt werden. Ein Beispiel für eine derartige adenovirale Nukleinsäure stelle die Nukleinsäure von Onyx-015 dar, die eine Expression von E1A aber nicht für E1B erlaubt. The adenoviral nucleic acid which is included in the nucleic acid according to the invention can each be an adenoviral nucleic acid that leads to a replication event by itself or leads in connection with further nucleic acid sequences. With the others Nucleic acid sequences can be YB-1, for example. It is possible as will be explained herein, that helper viruses are used for replication required sequences and / or gene products are provided. An example of a such adenoviral nucleic acid is the nucleic acid of Onyx-015, the one Expression of E1A but not allowed for E1B.

Bei der Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die eine für YB-1 codierende Nukleinsäureseduenz umfasst, kann vorgesehen sein, dass die adenovirale Nukleinsäure eine für E1-B codierende Nukleinsäure umfasst. Dabei ist es möglich, dass die für E1-B codierende Nuhleinsäure zwar vorhanden ist, jedoch das durch sie codierte E1-B nicht exprimiert wird. Dies wird beispielsweise dadurch bewerkstelligt, dass der für E1-B codierenden Nukleinsäure ein geeigneter Promotor fehlt. Dies kann beispielsweise dann der Fall sein, wenn E1A nicht exprimiert wird. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass es zu einer Expression von E1-B kommt, beispielsweise indem die für E1-B codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors steht. Ein geeigneter Promotor ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe, die Cytomegalovirus-Promotor, RSV-(Rous sarcoma Virus)-Promotor, adenovirus-basierender Promotor Va I und den nicht- viralen YB-1-Promotor umfasst. Darüber hinaus eignen sich auch in diesem Falle die vorstehend genannten Promotoren, d. h. der Telomerase-Promotor, der Alpha-Fetoprotein (AFP)-Promotor, der Caecinoembryonic Antigen Promotor (CEA), der L-Plastin-Promotor, Argenin-Vasopressin-Promotor und der PSA-Promotor. In the embodiment of the nucleic acid according to the invention, which encodes a YB-1 Nucleic acid deduction, it can be provided that the adenoviral nucleic acid nucleic acid encoding E1-B. It is possible that the E1-B encoding nucleic acid is present, but the E1-B encoded by it is not is expressed. This is accomplished, for example, by the fact that the E1-B a suitable promoter is missing. This can be the case, for example To be the case if E1A is not expressed. However, it is also within the scope of the present Invention that there is expression of E1-B, for example by the E1-B coding nucleic acid is under the control of a suitable promoter. A suitable one Promoter is selected, for example, from the group, the cytomegalovirus promoter, RSV (Rous sarcoma Virus) promoter, adenovirus-based promoter Va I and the non- YB-1 viral promoter. In addition, the are also suitable in this case the above promoters, d. H. the telomerase promoter, the alpha fetoprotein (AFP) promoter, the caecinoembryonic antigen promoter (CEA), the L-plastin promoter, Argenin vasopressin promoter and the PSA promoter.

Wie hierin offenbart ist E1-B-55 k an der Verteilung bzw. dem Transport von YB-1 in den Zellkern beteiligt. Da E4orf6 wiederum an E1-B-55 k bindet und ebenfalls für den Transport von E1-B-55 in den Kern verantwortlich ist, spielt insoweit E4orf6 auch eine bedeutende Rolle für die Verteilung bzw. den Transport von YB-1 in den Zellkern. Es ist somit auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Gene der E4-Region, insbesondere E4orf6 auch unter Kontrolle eines der vorstehend genannten Promotors steht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass der adenovirale E4-Promotor nicht mehr funktional ist. Es ist dabei besonders bevorzugt, wenn der adenovirale E4-Promotor deletiert ist. As disclosed herein, E1-B-55k is at the distribution or transport of YB-1 in the Cell nucleus involved. Since E4orf6 in turn binds to E1-B-55 k and also for transport from E1-B-55 to the core, E4orf6 also plays an important part Role for the distribution or transport of YB-1 in the cell nucleus. It is therefore also in the Within the scope of the present invention, the genes of the E4 region, in particular E4orf6, too is under the control of one of the above promoters. In a preferred one Embodiment provides that the adenoviral E4 promoter is no longer is functional. It is particularly preferred if the adenoviral E4 promoter is deleted is.

Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die eine für YB-1 codierende Nukleinsäuresequenz umfasst, kann vorgesehen sein, dass die adenovirale Nukleinsäure eine für E1-A codierende Nukleinsäure umfasst, die adenovirale Nukleinsäure jedoch keine Expression von E1-B erlaubt und somit dem Aufbau der DNA von Onyx-015 entspricht. In one embodiment of the nucleic acid according to the invention, the one for YB-1 encoding nucleic acid sequence, it can be provided that the adenoviral Nucleic acid comprises a nucleic acid coding for E1-A, the adenoviral nucleic acid however, no expression of E1-B is allowed and thus the construction of the DNA of Onyx-015 equivalent.

Allgemein gilt hierin, das wann immer Bezug genommen wird auf E1-B dies bevorzugterweise für E1B 55 kDa-Protein gilt, sofern sich kein hierzu gegenteiliger Hinweise findet. In general, it applies here that whenever reference is made to E1-B this is preferably applies to E1B 55 kDa protein, unless otherwise indicated place.

Sofern hierin auf codierende Nukleinsäuresequenzen Bezug genommen wird und es sich dabei um solche Nukleinsäuresequenzen handelt, die bekannt sind, ist es im Rahmen der Erfindung, dass nicht nur die identische Sequenz verwendet wird, sondern auch hiervon abgeleitete Sequenzen. Unter abgeleiteten Sequenzen sollen hierin insbesondere solche Sequenzen verstanden sein, die noch zu einem Genprodukt führen, das eine Funktion aufweist, die einer Funktion der nicht abgeleiteten Sequenz entspricht. Dies kann durch einfache Routinetests festgestellt werden. Ein Beispiel für derartige abgeleitete Nukleinsäuresequenzen sind jene Nukleinsäuresequenzen, die für das gleiche Genprodukt, insbesondere für die gleiche Aminosäuresequenz codieren, jedoch infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes eine andere Basenabfolge aufweisen. Insofar as reference is made to coding nucleic acid sequences and it is these are nucleic acid sequences that are known, it is within the scope of Invention that not only the identical sequence is used, but also the same derived sequences. Derived sequences are intended to include those in particular Sequences are understood that still lead to a gene product that has a function which corresponds to a function of the non-derived sequence. This can be done by simple routine tests are found. An example of such derived Nucleic acid sequences are those nucleic acid sequences that are for the same gene product, encode in particular for the same amino acid sequence, but due to degeneracy of the genetic code have a different base sequence.

Ein weiterer Aspekt bestehend in der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfassend eine für YB-1 codierende Nukleinsäure und eine einen Kerntransport von YB-1 vermittelnde Nukleinsäuresequenz beruht auf der ebenfalls überraschenden Erkenntnis, dass bei Vorhandensein von YB-1 im Kern, insbesondere unabhängig vom Zellzyklus, eine Replikation von Adenoviren in einer Zelle, bevorzugterweise in einer Tumorzelle erfolgt. Als Adenoviren bzw. adenovirale Systeme und damit die entsprechenden Nukleinsäuren können im Zusammenhang damit und in Kombination mit diesen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Adenoviren und adenoviralen Systeme sowie die im Stand der Technik bekannten Adenoviren wie beispielsweise Onyx-015 verwendet werden. Another aspect consisting in the nucleic acid according to the invention comprising a for YB-1 encoding nucleic acid and a core transport of YB-1 mediating Nucleic acid sequence is based on the equally surprising finding that at Presence of YB-1 in the nucleus, especially regardless of the cell cycle, a Replication of adenoviruses takes place in a cell, preferably in a tumor cell. As Adenoviruses or adenoviral systems and thus the corresponding nucleic acids can in connection with this and in combination with these nucleic acids according to the invention the nucleic acids, adenoviruses and adenoviral systems according to the invention and the im Adenoviruses known in the art such as, for example, Onyx-015 can be used.

Geeignete den Kerntransport vermittelnde Nukleinsäuresequenzen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in (Whittaker, G. R. et al., Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E. C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D. A. et al., Bioessays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biocehm. (Tokyo) 1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227). Bei den den Kerntransport vermittelnden Nukleinsäuresequenzen können verschiedene Prinzipien verwendet werden. Ein derartiges Prinzip besteht darin, dass, dass YB-1 als Fusionsprotein mit einem Signalpeptid ausgebildet wird und infolge des Signalpeptids YB-1 in den Zellkern geschleust wird. Ein weiteres Prinzip besteht darin, dass YB-1 mit einer Transportsequenz versehen wird, die dazu führt, dass YB-l, bevorzugterweise ausgehend von einer Synthese im Cytoplasma, in den Zellkern geschleust wird und dort die virale Replikation befördert. Ein Beispiel für eine besonders wirksame den Kerntransport vermittelnde Nukleinsäuresequenz stellt die TAT-Sequenz von HIV dar, die neben weiteren geeigneten derartigen Nukleinsäuresequenzen beispielsweise beschrieben ist in Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA. The HIV-1 tat nuclear localisation sequence confers novel nuclear import properties. JBC, 273, 1623. Suitable nucleic acid sequences mediating the core transport are known to those skilled in the art known in the art and described, for example, in (Whittaker, G.R. et al., Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D.A. et al., Bioessays 2000 Jun; 22 (6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biocehm. (Tokyo) 1997 May; 121 (5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryote. Gene Expr. 1993; 3 (3): 193-227). At the mediating the core transport Various principles can be used for nucleic acid sequences. Such a thing Principle is that YB-1 is formed as a fusion protein with a signal peptide and is smuggled into the cell nucleus as a result of the signal peptide YB-1. Another one The principle is that YB-1 is provided with a transport sequence that leads to that YB-1, preferably starting from a synthesis in the cytoplasm, in the cell nucleus is smuggled and promotes viral replication there. An example of a special one the nucleic acid sequence mediating the nuclear transport is the TAT sequence of HIV, which, for example, in addition to other suitable nucleic acid sequences of this type is described in Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA. The HIV-1 did nuclear localization sequence confers novel nuclear import properties. JBC, 273, 1623.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung bestehend in einer Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, wobei die adenovirale Nukleinsäure anstelle des späten (late) E2- Promotors einen tumorspezifischen Promotor aufweist, beruht ebenfalls auf der überraschenden. Erkenntnis, dass die Expression und somit die Replikation des Adenovirus und damit die Onkolyse wesentlich von der Steuerung der adenoviralen Gene und Genprodukte, insbesondere der E2-Region durch den späten E2-Promotor, insbesondere in vivo, abhängt. Die eine Transkriptionseinheit darstellende E2-Region von Adenovirus besteht aus den E2A- und E2B-Genen, die für die virale Replikation vitale Proteine codieren: pTP (precursor terminal proein), die DNA-Polymerase und DBP, ein multifunktionelles DNA- Bindungs-Protein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Begrifflichkeiten deletierter Promotor, nicht-funktional aktiver, funktional nicht aktiver oder nicht-funktionaler Promotor, dass der Promotor als solcher nicht mehr aktiv ist, d. h. von diesem aus keine Transkription mehr erfolgt. Ein derartiger nicht-funktionaler Promotor kann auf den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Wegen erzeugt werden. Beispielsweise kann dies erfolgen durch eine vollständige Deletion des Promotors, durch eine teilweise Deletion des Promotors oder aber auch durch eine Punktmutation. Weitere Möglichkeiten der Mutationen derartiger Promotoren können darin bestehen, dass die räumliche Beziehung der den Promotor aufbauenden Elemente verändert und dieser dadurch funktional inaktiv wird. Another aspect of the invention consisting of a nucleic acid comprising a adenoviral nucleic acid, the adenoviral nucleic acid instead of the late (late) E2- Promoter has a tumor-specific promoter, is also based on the surprising. Realization that the expression and thus the replication of the adenovirus and thus the oncolysis essentially from the control of the adenoviral genes and Gene products, especially in the E2 region through the late E2 promoter, especially in vivo, depends. The adenovirus E2 region constituting a transcription unit consists from the E2A and E2B genes coding for vital proteins for viral replication: pTP (precursor terminal proein), the DNA polymerase and DBP, a multifunctional DNA Binding protein. In the context of the present invention denote the terms deleted promoter, non-functionally active, functionally inactive or non-functional Promoter that the promoter as such is no longer active, i. H. from this none Transcription is done more. Such a non-functional promoter can on the Paths known to those skilled in the art are generated. For example, this can done by a complete deletion of the promoter, by a partial deletion of the Promotors or also by a point mutation. Further possibilities of mutations Such promoters can consist in that the spatial relationship of the Promoter-building elements changed and this becomes functionally inactive.

Mit der Inaktivierung des späten E2-Promotors und dessen Ersatz durch einen tumorspezifischen bzw. gewebespezifischen Promotor und damit dem Herstellen einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren wird gewährleistet, dass die für die adenovirale Replikation wichtigen Gene bzw. Genprodukte unter der Kontrolle des Tumors bzw. des entsprechenden Gewebes stehen mit der Folge, dass die Replikation des Adenovirus spezifisch im Tumor oder in einem bestimmten Gewebe erfolgt. Damit wird der Forderung nach spezifischer viral vermittelter Lyse von Zellen entsprochen und damit die Sicherheit des Systems gewährleistet. Die Inaktivierung des späten E2-Promotors kann dabei dadurch erfolgen, dass dieser vollständig deletiert ist. Es ist jedoch auch im Rahmen der Erfindung, dass der späte E2-Promotor so verändert ist, dass er nicht mehr als Promotor funktionell aktiv ist. Dies kann beispielsweise dadurch bewerkstelligt werden, dass die Bindungsstelle des Promotors für YB-1 so verändert, beispielsweise mutiert oder deletiert, wird, dass eine Bindung von YB-1 an den Promotor nicht mehr möglich wird. Eine entsprechende Deletion könnte die Deletion der Y-Box aus dem Promotor darstellen. Der hierin verwendete Begriff, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäure anstelle des E2-Promotors einen gewebe- oder tumorspezifischen Promotor aufweist, umfasst die vorstehend beschriebenen Möglichkeiten. Insoweit ist der Begriff funktional zu verstehen. With the inactivation of the late E2 promoter and its replacement by a tumor-specific or tissue-specific promoter and thus the manufacture of one of the The nucleic acids according to the invention ensure that those for the adenoviral Replication of important genes or gene products under the control of the tumor or the the corresponding tissue stands with the consequence that the replication of the adenovirus occurs specifically in the tumor or in a specific tissue. This is the requirement after specific virally mediated lysis of cells and thus the safety of the Systems guaranteed. This can inactivate the late E2 promoter that it is completely deleted. However, it is also within the scope of the invention that the late E2 promoter is changed so that it is no longer functionally active as a promoter is. This can be accomplished, for example, in that the binding site of the Promoter for YB-1 so changed, for example mutated or deleted, that a Binding of YB-1 to the promoter is no longer possible. A corresponding deletion could represent the deletion of the Y box from the promoter. The term used here that a nucleic acid according to the invention instead of the E2 promoter a tissue or has tumor-specific promoter, includes the possibilities described above. In this respect, the term is to be understood functionally.

Um die Sicherheit des Systems, welches die Expression der E2-Genprodukte über einen Tumor- bzw. Gewebe-spezifischen Promotor steuert, nochmals zu verbessern, soll in einer bevorzugten Ausführungsform gleichzeitig zum E2 late Promotor der E2 early Promotor funktional inaktiv sein, beispielsweise deletiert bzw. so verändert werden, dass er nicht mehr als Promotor funktional aktiv ist. Damit wird sichergestellt, dass der E2 early Promotor keinen Einfluss auf die Expression der E2-Gene ausüben kann. Stattdessen werden erfindungsgemäß die beiden Promotoren, d. h. der E2 late Promotor sowie der E2 early Promotor bevorzugter Weise durch einen Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotor ersetzt. Auch hier können die hierin im Zusammenhang mit der YB-1 kodierenden Nukleinsäuresequenz beschriebenen Promotoren verwendet werden. In order to ensure the security of the system, which expresses the expression of the E2 gene products Tumor- or tissue-specific promoter controls to improve again, should in one preferred embodiment at the same time as the E2 late promoter the E2 early promoter be functionally inactive, for example deleted or changed so that it no longer is functionally active as a promoter. This ensures that the E2 early promoter can have no influence on the expression of the E2 genes. Instead be according to the invention the two promoters, d. H. the E2 late promoter and the E2 early Promoter preferably replaced by a tissue or tumor specific promoter. Again, those encoding herein in connection with the YB-1 Promoters described nucleic acid sequence can be used.

Die adenovirale Nukleinsäure bzw. die entsprechenden Adenoviren umfassen bevorzugterweise die Gene für E1A, E1B, E2 und E3. In bevorzugten Ausführungsformen kann die für E3 codierende Nukleinsäure deletiert sein. Include the adenoviral nucleic acid or the corresponding adenoviruses preferably the genes for E1A, E1B, E2 and E3. In preferred embodiments the nucleic acid coding for E3 can be deleted.

Die vorstehend beschriebenen Konstrukte von Adenoviren und insbesondere deren Nukleinsäuren können auch in eine Zelle, insbesondere eine Tumorzelle, in Teilen eingebracht werden, wobei dann infolge der Anwesenheit der verschiedenen Einzelkomponenten diese so zusammenwirken, als stammten die Einzelkomponenten von einer einzelnen Nukleinsäure. Eine typische Ausprägung dieses hierin als adenovirales Replikationssystem bezeichneten sieht dabei vor, dass die adenovirale Nukleinsäure defizient für die Expression des E1A-Proteins ist. Das bevorzugterweise zelluläre Replikationssystem umfasst eine Nukleinsäure eines Helfervirus, wobei die Nukleinsäure des Helfervirus eine Nukleinsäureseduenz umfasst, die für YB-1 codiert. Dabei kann vorgesehen sein, dass die adenovirale Nukleinsäure oder die Nukleinsäure des Helfervirus einzeln oder getrennt als replizierbare Vektoren vorliegen. The adenovirus constructs described above, and particularly their Nucleic acids can also be divided into parts of a cell, in particular a tumor cell be introduced, then due to the presence of the different Individual components interact as if the individual components came from a single nucleic acid. A typical expression of this as an adenoviral The replication system designated here provides that the adenoviral nucleic acid is deficient for the expression of the E1A protein. The preferably cellular replication system comprises a nucleic acid of a helper virus, the nucleic acid of the helper virus being one Nucleic acid deduction encoding YB-1. It can be provided that the adenoviral nucleic acid or the nucleic acid of the helper virus individually or separately as replicable vectors are present.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können als Vektoren vorliegen. Bevorzugterweise handelt es sich um virale Vektoren. Im Falle der adenovirale Nukleinsäuren umfassenden erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ist das Viruspartikel dabei der Vektor. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in einem Plasmidvektor vorliegen. In einem jeden Fall weist der Vektor Elemente auf, die für die Vermehrung der inserierten Nukleinsäure (Replikation) und ggf. Expression der inserierten Nukleinsäure sorgen bzw. diese steuern. Geeignete Vektoren, insbesondere auch Expressionsvektoren, und Elemente sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Grunhaus, A., Horwitz, M. S., 1994, Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C., Hrsg., Seminars in virology, London: Saunders Scientific Publications, 1992; 237-252. The nucleic acids according to the invention can be present as vectors. preferably, are viral vectors. In the case of comprehensive adenoviral nucleic acids According to the nucleic acids according to the invention, the virus particle is the vector. However, it is also in the context of the present invention that the nucleic acids according to the invention in one Plasmid vector are present. In any case, the vector has elements necessary for the Multiplication of the inserted nucleic acid (replication) and possibly expression of the inserted Ensure or control nucleic acid. Suitable vectors, in particular also Expression vectors and elements are known to those skilled in the art and for example described in Grunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994, Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C., ed., Seminars in virology, London: Saunders Scientific Publications, 1992; 237-252.

Die oben beschriebene Ausführungsform, dass die verschiedenen Elemente der erfindungsgemäßen Nukleinsäure nicht notwendigerweise auf nur einem Vektor enthalten sein müssen, trägt der Aspekt der Erfindung Rechnung, der die Vektorgruppe umfasst. Eine Vektorgruppe umfasst entsprechend mindestens zwei Vektoren. Ansonsten gilt betreffend die Vektoren das hierin allgemein zu Vektoren ausgeführte. The embodiment described above that the various elements of the nucleic acid according to the invention not necessarily contained on only one vector must take into account the aspect of the invention which comprises the vector group. A Correspondingly, vector group comprises at least two vectors. Otherwise applies to the Vectors that are generally referred to herein as vectors.

Die erfindungsgemäßen Adenoviren sind durch die verschiedenen hierin offenbarten Nukleinsäuren charakterisiert und umfassen ansonsten all jene den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Elemente, wie dies auch bei Adenoviren vom Wildtyp der Fall ist (Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, 3. Auflage, Hrsg. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, Kapitel 67). The adenoviruses of the invention are characterized by the various ones disclosed herein Nucleic acids characterize and otherwise include all those of those skilled in the art known elements, as is also the case with wild-type adenoviruses (Shenk, T .: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, 3rd edition, ed. Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67).

Die erfindungsgemäßen Agenzien, d. h. die Nukleinsäuren, diese enthaltende Vektoren und Vektorengruppen, Zellen und Adenoviren und adenoviralen Replikationssysteme können für die Herstellung eines Medikamentes verwendet werden. Infolge der spezifischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Agenzien wird das Medikament bevorzugt ein solches für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen sein. Grundsätzlich eignen sich diese Agenzien für alle Tumorerkrankungen bzw. Tumoren, insbesondere auch solche Tumoren, die p53 enthalten, und solche, denen p53 fehlt. Unter dem Begriff Tumor sollen sowohl maligne wie benigne Tumoren verstanden werden. The agents according to the invention, i. H. the nucleic acids, vectors containing them and Vector groups, cells and adenoviruses and adenoviral replication systems can be used for the manufacture of a drug can be used. As a result of specific activities of the agents according to the invention, the medicament is preferably one for Treatment and / or prophylaxis of tumor diseases. Basically, are suitable these agents for all tumor diseases or tumors, in particular also those Tumors that contain p53 and those that lack p53. Under the term tumor should both malignant and benign tumors can be understood.

Das Medikament kann dabei in verschiedenen Formulierungen vorliegen, bevorzugterweise in einer flüssigen Form. Weiterhin wird das Medikament Hilfsstoffe wie Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen enthalten, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Galenik bekannt sind. The medicament can be present in various formulations, preferably in a liquid form. The drug is also used as auxiliary substances such as stabilizers, buffers, Contain preservatives and the like, which the expert in the field of Galenics are known.

Das Medikament kann dabei insbesondere auch weitere pharmazeutisch aktive Verbindungen enthalten. Die Art und der Umfang dieser weiteren pharmazeutisch aktiven Verbindungen wird dabei von der Art der Indikation abhängen, für die das Medikament eingesetzt wird. Im Falle der Verwendung des Medikamentes für die Behandlung und/oder die Prophylaxe von Tumorerkrankungen werden typischerweise Zytostatika, wie beispielsweise cis-Platin und Taxol, Daunoblastin, Adriamycin und/oder Mitoxantron verwendet. The drug can in particular also other pharmaceutically active compounds contain. The nature and scope of these other pharmaceutically active compounds will depend on the type of indication for which the drug is used. in the In case of use of the drug for the treatment and / or prophylaxis of Tumor diseases are typically cytostatics, such as cis-platinum and Taxol, Daunoblastin, Adriamycin and / or Mitoxantron are used.

Die Verwendung von attenuierten Adenoviren wie Onxy-015, der hinsichtlich des E1B-55 kDa-Proteins defizient ist, ist bei der Verwendung zur viralen Onkolyse mit vergleichsweise geringen Erfolgsaussichten verbunden. Der vorliegende Erfinder hat überraschenderweise festgestellt, dass diese attenuierten Viren, insbesondere auch Onyx-015 mit besonders großer Erfolgsrate bei. solchen Tumoren verwendet werden kann, wo YB-1 unabhängig vom Zellzyklus im Zellkern vorkommt. Normalerweise ist YB-1 im Cytoplasma, insbesondere auch im perinukleärem Plasma vorhanden. In der S-Phase des Zellzyklus findet sich YB-1 im Zellkern von sowohl normalen wie auch Tumorzellen. Dies ist jedoch nicht ausreichend, um eine virale Onkolyse unter Verwendung der von attenuierten Adenoviren zu bewerkstelligen. Die im Stand der Technik beschriebene vergleichsweise geringe Wirksamkeit von attenuierten Adenoviren wie Onyx-015 beruht auch auf deren fehlerhaften Anwendung. Mit anderen Worten, es können derartige Systeme, insbesondere auch Onxy-015 mit einer größeren Wirksamkeit dort eingesetzt werden, wo die molekularbiologischen Voraussetzungen für eine virale Onkolyse gegeben sind. Im Falle von insbesondere Onyx-015 liegen diese Voraussetzungen vor bei solchen Tumorerkrankungen, deren Zellen eine vom Zellzyklus unabhängige Kernlokalisation von YB-1 aufweist. Diese Form der Kernlokalisation kann dabei durch die Art des Tumors selbst bedingt sein, oder aber durch die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Agenzien bewirkt werden. Die vorliegende Erfindung definiert somit eine neue Gruppe von Tumoren bzw. Tumorerkrankungen und damit auch von Patienten, die mit den erfindungsgemäßen Agenzien, besonders aber auch mit dem im Stand der Technik bereits beschriebenen attenuierten Adenovirus, bevorzugt mit E1B-defizienten, bevorzugterweise E1B 55 kDa-defizienten, Adenovirus und bevorzugterweise mit Onyx-015 mit großer Erfolgsrate behandelt werden können. The use of attenuated adenoviruses such as Onxy-015, which is related to the E1B-55 kDa protein is deficient when compared to viral oncolysis low chances of success. The present inventor surprisingly has found that these attenuated viruses, especially onyx-015 with particularly large Success rate at. such tumors can be used where YB-1 is independent of Cell cycle occurs in the nucleus. Usually YB-1 is in the cytoplasm, especially also present in the perinuclear plasma. YB-1 is found in the S phase of the cell cycle Cell nucleus from both normal and tumor cells. However, this is not enough to to accomplish viral oncolysis using that of attenuated adenoviruses. The comparatively low effectiveness of described in the prior art Attenuated adenoviruses such as Onyx-015 are also due to their incorrect use. With in other words, systems of this type, in particular also Onxy-015 with a greater effectiveness where the molecular biological Requirements for viral oncolysis are given. In the case of Onyx-015 in particular these preconditions exist for those tumor diseases whose cells are from Cell cycle independent nuclear localization of YB-1 has. This form of The location of the nucleus can be determined by the type of tumor itself or by the type of tumor Agents of the invention described herein are effected. The present The invention thus defines a new group of tumors or tumor diseases and thus also by patients who are using the agents according to the invention, but especially also the attenuated adenovirus already described in the prior art, preferably with E1B deficient, preferably E1B 55 kDa deficient, adenovirus and can preferably be treated with Onyx-015 with a high success rate.

Eine weitere Gruppe von Patienten, die unter Verwendung der im Stand der Technik beschriebenen Adenoviren, insbesondere solche, die E1B-defizient sind, wie beispielsweise ONYX-015, therapiert werden können, sind jene, bei denen durch Anlegen bestimmter Bedingungen gewährleistet wird, dass YB-1 in den Kern wandert oder transportiert wird. Die Verwendung derartiger Adenoviren bei dieser Patientengruppe beruht insoweit auf der Erkenntnis, dass die Induktion der viralen Replikation auf der Kernlokalisation von YB-1 mit anschließender Bindung an den E2-late-Promotor beruht. Infolge der hierin offenbarten Erkenntnisse ist das Adenovirus ONYX-015, welches E1B-defizient ist, nicht in der Lage, den Kerntransport des zellulären YB-1 zu vermitteln. Dies begründet die beschränkte Verwendung und Erfolg von ONYX-015 auf solche Tumoren, die YB-1 bereits im Kern aufweisen. Dies ist jedoch nur bei einer sehr geringen Patientengruppe gegeben. Durch Kernlokalisation von YB-1 kann durch Stress von außen bzw. lokal applizierten Stress induziert werden. Diese Induzierung kann beispielsweise durch Bestrahlung, insbesondere UV-Bestrahlung, Anwendung von Zytostatika, wie sie unter anderem hierin ebenfalls offenbart sind, und Hyperthermie erfolgen. Im Zusammenhang mit der Hyperthermie ist beachtlich, dass diese zwischenzeitlich sehr spezifisch realisiert werden kann und somit ebenfalls spezifisch ein Kerntransport von YB-1 in den Zellkern erfolgt und infolgedessen die Voraussetzungen für eine Replikation des Adenovirus und damit einer Zell- und Tumorlyse gegeben sind (Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann S. Schlag PM, Royer HD. Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of' multidrug resistance-related ABC transporters. J Biol Chem. 2001,276(30): 28562-9; Hu Z, Jin S. Scotto KW. Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation. Role of NF-Y and Spl. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275(4): 2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. Direct involvement of the Y-box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene. J Biol Chem. 1998, 273(11): 5997-6000). Another group of patients using those in the prior art described adenoviruses, especially those that are E1B deficient, such as ONYX-015 that can be treated are those that are created by applying certain Conditions is ensured that YB-1 migrates into the core or is transported. The The use of such adenoviruses in this patient group is based on the Recognition that the induction of viral replication on the core localization of YB-1 with subsequent binding to the E2 late promoter is based. As a result of those disclosed herein Findings, the adenovirus ONYX-015, which is E1B deficient, is unable to to mediate the core transport of cellular YB-1. This justifies the limited Use and success of ONYX-015 on those tumors that have YB-1 already in the nucleus exhibit. However, this only applies to a very small group of patients. By Core localization of YB-1 can be caused by external or locally applied stress be induced. This induction can be caused, for example, by radiation, in particular UV radiation, application of cytostatics, as also among others herein are disclosed, and hyperthermia take place. It is related to hyperthermia remarkable that this can now be realized very specifically and thus A specific nuclear transport of YB-1 into the cell nucleus also takes place and consequently the Prerequisites for replication of the adenovirus and thus cell and tumor lysis are given (Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann S. Schlag PM, Royer HD. Hyperthermia-induced nuclear translocation of transcription factor YB-1 leads to enhanced expression of 'multidrug resistance-related ABC transporters. J Biol Chem. 2001, 276 (30): 28562-9; Hu Z, Jin S. Scotto KW. Transcriptional activation of the MDR1 gene by UV irradiation. Role of NF-Y and Spl. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275 (4): 2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. Direct involvement of the Y-box binding protein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene. J Biol Chem. 1998, 273 (11): 5997-6000).

Das erfindungsgemäße Medikament würde somit an solche Patienten und Patientengruppen verabreicht werden bzw. wäre für solche bestimmt, bei denen durch geeignete Vorbehandlungen ein Transport von YB-1, insbesondere in die entsprechenden Tumorzellen, bedingt werden würde. The medication according to the invention would thus be sent to such patients and patient groups be administered or would be intended for those, by suitable Pretreatments a transport of YB-1, in particular into the corresponding tumor cells, would be conditioned.

Damit betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt auch ein Verfahren zum Screenen von Patienten, die mit einem attenuierten Adenovirus, wie Onyx-1 oder allgemeiner mit E1Bdefizienten, bevorzugterweise E1B 55 kDa-defizienten, Adenovirus behandelbar sind, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• - Untersuchen einer Probe des Tumorgewebes und
• - Feststellen, ob YB-1 im Kern Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist.

In a further aspect, the invention thus also relates to a method for screening patients who can be treated with an attenuated adenovirus, such as Onyx-1 or more generally with E1B deficient, preferably E1B 55 kDa deficient, adenovirus, characterized by the following steps:

• - Examine a sample of the tumor tissue and
• - Determine whether YB-1 is located in the nucleus independently of the cell cycle.

Die Probe des Tumorgewebes kann dabei durch Punktion oder durch einen chirurgischen Eingriff erhalten werden. Die Feststellung, ob im Kern YB-1 Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist, wird dabei häufig unter Verwendung mikroskopischer Techniken und/oder mittels Immunhistoanalyse, typischerweise unter Verwendung von Antikörpern, erfolgen. Die Detektion von YB-1 erfolgt dabei unter Verwendung eines Mittels, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper gegen YB-1, umfasst. Der Nachweis darüber, dass YB-1 im Kern und insbesondere dort Zellzyklus-unabhängig lokalisiert wird, ist dem Fachmann bekannt. The sample of the tumor tissue can be punctured or by a surgical Intervention can be obtained. Determining whether the nucleus is YB-1 cell cycle independent is often localized using microscopic techniques and / or by means of immunohistoanalysis, typically using antibodies. The Detection of YB-1 is carried out using an agent selected from the Group comprising antibodies to YB-1. Evidence that YB-1 at its core and is localized independently of the cell cycle, in particular, is known to the person skilled in the art.

Beispielsweise kann bei dem Durchmustern von gegen YB-1 gefärbten Gewebeschnitten die Lokalisation von YB-1 leicht erkannt werden. Dabei ergibt sich bereits infolge der Häufigkeit des Auftretens von YB-1 im Kern, dass es sich um eine Zellzyklus unabhängige Lokalisation im Kern handelt. Eine weitere Möglichkeit zum zellzyklusunabhängigen Nachweise von YB- 1 im Kern besteht in der Durchführung einer Färbung gegen YB-1 und Feststellen, ob YB-1 im Kern lokalisiert ist, und Durchführung der Bestimmung des Zellstadiums der Zellen. Auch dies kann mittels geeigneter Antikörper erfolgen (Doppelimmunohistoanalyse). For example, when screening tissue sections stained against YB-1, the location of YB-1 can be easily recognized. The frequency of the occurrence of YB-1 in the nucleus already shows that it is a cell cycle-independent localization in the nucleus. Another possibility for the cell cycle-independent detection of YB- 1 in the nucleus is to carry out a staining against YB-1 and to determine whether YB-1 is localized in the nucleus and to carry out the determination of the cell stage of the cells. This can also be done using suitable antibodies (double immunohistoanalysis).

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Figuren und Beispiel weiter erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen, Anwendungen und Vorteile ergeben. The invention is further explained below with reference to the figures and example which result in further features, embodiments, applications and advantages.

Dabei zeigt It shows

Fig. 1 die grundsätzliche molekulargenetische Organisation des Adenovirus; FIG. 1 shows the basic molecular genetic organization of adenovirus;

Fig. 2 eine Übersicht verschiedener erfindungsgemäßer Nukleinsäure- bzw. Adenoviruskonstrukte; und Fig. 2 shows an overview of various inventive nucleic acid or deficient adenovirus; and

Fig. 3 das Ergebnis einer Northern Blot-Analyse. Fig. 3 shows the result of Northern blot analysis.

In Fig. 2 sind verschiedene der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. Nukleinsäurekonstrukte dargestellt. So zeigt Fig. 2.1A einen erfindungsgemäßen rekombinanten adenoviralen Vektor, der E1A-defizient und E1B-defizient ist, aber das Protein YB-1 exprimiert. In FIG. 2, several of the nucleic acid or nucleic acid constructs of the invention are shown. 2.1A as shown in FIG. A recombinant adenoviral vector according to the invention, the E1A and E1B deficient is deficient, however, expressing the protein YB-1.

Fig. 2.1B zeigt einen erfindungsgemäßen rekombinanten adenoviralen Vektor, der ebenfalls YB-1 exprimiert, bei dem jedoch die E1A-Region deletiert ist. Da E1A für die Expression für E1B verantwortlich ist, kommt es zu keiner bzw. einer verringerten Aktivierung von E1B, obwohl der Vektor das Gen aufweist. FIG. 2.1B shows a recombinant adenoviral vector according to the invention which also expresses YB-1, but in which the E1A region is deleted. Since E1A is responsible for the expression of E1B, there is no or a reduced activation of E1B, although the vector has the gene.

Fig. 2.2 zeigt einen erfindungsgemäßen rekombinanten adenoviralen Vektor, der ebenfalls YB-1 exprimiert. Hier wird das Gen E1B bzw. E1B-55 kDa über einen externen E1A- unabhängigen Promotor gesteuert. Ein derartiger Promotor kann der CMV-, RSV- oder der YB-1-Promotor sein. Fig. 2.2 shows a recombinant adenoviral vector according to the invention, which also YB-1 expressed. Here the E1B or E1B-55 kDa gene is controlled via an external E1A-independent promoter. Such a promoter can be the CMV, RSV or the YB-1 promoter.

Fig. 2.3 zeigt einen weiteren erfindungsgemäßen rekombinanten adenoviralen Vektor, der einen YB-1- unabhängigen E2 late-Promotor aufweist. Dies wird dadurch erreicht, dass der vollständige E2 late-Promotor entfernt wird oder eine gezielte Veränderung der Gensequenz innerhalb des Promotors vorgenommen wird, an welche YB-1 bindet (die sogenannte Y-Box) Fig. 2.4 zeigt einen weiteren erfindungsgemäßen rekombinanten adenoviralen Vektor, bei dem sowohl der E2 late als auch der E2 early -Promotor deletiert und somit nicht mehr funktional aktiv ist. In dem schematisch dargestellten Vektor sind die beiden Promotoren durch einen Tumor- oder Gewebe-spezifischen Promotor, wie er hierin offenbart ist, ersetzt. Fig. 2.3 shows another recombinant adenoviral vector of the invention comprising a YB-1 late promoter has independent E2. This is achieved by removing the complete E2 late promoter or by deliberately changing the gene sequence within the promoter to which YB-1 binds (the so-called Y box) . in which both the E2 late and the E2 early promoter are deleted and are therefore no longer functionally active. In the schematically illustrated vector, the two promoters are replaced by a tumor or tissue-specific promoter as disclosed herein.

Beispiel 1example 1 Bedeutung von YB-1 für die adenovirale ReplikationImportance of YB-1 for adenoviral replication

Um den Nachweis zu erbringen, dass YB-1 die Expression von E2 über den E2 late-Promotor stuert, wurde der folgende experimentelle Ansatz gewählt. To provide evidence that YB-1 expresses E2 via the E2 late promoter the following experimental approach was chosen.

Tumorzellen (HeLa-Zellen) wurden entweder mit Wildtyp-Adenovirus, einen E1-minus Adenovirus oder mit einem E1-minus Adenovirus, welches YB-1 exprimiert (AdYB-1) infiziert (K steht dabei für Kontrolle; nicht infiziert). Nach 24 h wurde die gesamte RNA isoliert. Anschließend wurde eine Northern Blot-Analyse durchgeführt. Die isolierte RNA wurde dann gelelektrophoretisch in einem Formaldehyd-Agarose-Gel nach der Größe aufgetrennt und auf eine Nylon-Membran geblottet und unter UV fixiert. Als radioaktiv markierte Sonde wurde ein cDNA-Fragment von 250 Basen, das komplementär ist zu einer Sequenz verwendet, die zwischen dem E2 early Promotor und dem E2 late Promotor liegt. Die Markierung der Sonde erfolgte mit Hilfe des Random Prime Labeling Systems der Firma Amersham. Die Auswertung der Filme ergab, dass nur bei mit Wildtyp-Adenovirus infizierten Zellen ein E2-spezifisches Signal vorhanden ist. Tumor cells (HeLa cells) were either wild-type adenovirus, an E1 minus Adenovirus or with an E1-minus adenovirus expressing YB-1 (AdYB-1) infected (K stands for control; not infected). After 24 h, the entire RNA isolated. Northern blot analysis was then performed. The isolated RNA was then gel electrophoretically sized in a formaldehyde agarose gel separated and blotted onto a nylon membrane and fixed under UV. As radioactive labeled probe was a 250 base cDNA fragment that is complementary to one Sequence used that lies between the E2 early promoter and the E2 late promoter. The probe was labeled using the company's Random Prime Labeling System Amersham. The evaluation of the films showed that only those infected with wild-type adenovirus Cells an E2-specific signal is present.

Beispiel 2Example 2 Bedeutung von YB-1 für die adenovirale ReplikationImportance of YB-1 for adenoviral replication

Um den Nachweis zu erbringen, dass YB-1 die Expression von E2 über den E2 late-Promotor steuert, wurde der folgende weitere experimentelle Ansatz gewählt, der auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Ansatz aufbaut. To provide evidence that YB-1 expresses E2 via the E2 late promoter controls, the following further experimental approach was chosen, based on that in Example 1 approach described.

Die radioaktive Sonde nach Beispiel 1 wird durch Kochen für 2 Minuten in Wasser entfernt und nochmals mit einer anderen cDNA-Sonde hybridisiert. Diese Sonde liegt stromaufwärts des E2 late-Promotors. The radioactive probe according to Example 1 is removed by boiling in water for 2 minutes and hybridized again with another cDNA probe. This probe is upstream of the E2 late promoter.

Die Auswertung ergab das folgende Ergebnis: Sowohl die Wildtyp-Adenovirus infizierten Zellen wie auch die mit AdYB-1 infizierten Zellen weisen ein deutliches Signal bzw. eine spezifische E2-Bande auf. Daraus ergibt sich, dass YB-1 die E2-Region über den E2 late- Promotor steuert bzw. aktiviert. The evaluation gave the following result: Both the wild-type adenovirus infected Cells as well as cells infected with AdYB-1 have a clear signal or a specific E2 band. It follows that YB-1 late E2 region over the E2 Promoter controls or activates.

Beispiel 3Example 3

Nachweis der spezifischen Bindung von YB-1 an den E2-PromotorDetection of the specific binding of YB-1 to the E2 promoter

Dem Experiment liegt die Überlegung zugrunde, das YB-1 als Transkriptionsfaktor an die Y- Box (CAAT-Sequenz) innerhalb des E2 late-Promotors binden sollte. Um eine solche spezifische Bindung von YB-1 an diesen Promotor nachzuweisen, wird eine sogenannte EMSA-Analyse (electrophoretic mobility shift assay) durchgeführt. Dabei werden 24 h nach Infektion der Zellen mit Wildtyp-Adenovirus die Kernprotein isoliert. Anschließend werden 1-10 µg Protein und ein kurzes DNA-Fragment mit einer Länge von 30 bis 80 Basen, das die E2 late-Promotorsequenz aufweist, zusammen bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Dieses DNA-Fragment (Oligo) wird zuvor mit einer Kinase am 5'-Ende mit ³²P radioaktiv markiert. The experiment is based on the consideration that YB-1 should bind as a transcription factor to the Y box (CAAT sequence) within the E2 late promoter. In order to detect such specific binding of YB-1 to this promoter, a so-called EMSA analysis (electrophoretic mobility shift assay) is carried out. The core proteins are isolated 24 hours after infection of the cells with wild-type adenovirus. Then 1-10 ug protein and a short DNA fragment with a length of 30 to 80 bases, which has the E2 late promoter sequence, are incubated together at 37 ° C for 30 minutes. This DNA fragment (oligo) is previously radioactively labeled with ³² P using a 5 'end kinase.

Anschließend erfolgt die Auftrennung in einem nativen Polyacrylamidgel. Falls das Protein YB-1 an einer Sequenz am Oligo bindet, kommt es zu einem sogenannten shift (Verschiebung), da durch die Bindung von YB-1 an das kurze DNA-Fragment, das am 5'- Ende radioaktiv markiert ist, im Gel langsamer wandert als ein ungebundenes Oligo. Dieser shift kann wieder aufgehoben werden, sobald man einen hundertfachen Überschuss an nicht markiertem Oligo zum Reaktionsansatz zugibt. The separation is then carried out in a native polyacrylamide gel. If the protein YB-1 binds to a sequence on the oligo, a so-called shift occurs (Shift), since the binding of YB-1 to the short DNA fragment, which is on the 5'- Radiolabeled at the end, moves more slowly in the gel than an unbound oligo. This Shift can be canceled again as soon as you have a hundredfold excess of not adds labeled oligo to the reaction mixture.

Als Ergebnis konnte festgestellt werden, dass YB-1 spezifisch an den E2-late-Promotor bindet. As a result, it was found that YB-1 was specific to the E2 late promoter binds.

Als Kontrolle wurde Kommpetitions-Experimente durchgeführt. Dabei wird ein Überschuß vom nicht-markiertem E2-late-Promotor-Fragment zum Reaktionsansatz zugegeben. Daraufhin ist in dem obigen Reaktionsansatz ein shift nicht mehr festzustellen. Commitment experiments were carried out as a control. This will result in a surplus from the unlabeled E2 late promoter fragment added to the reaction mixture. As a result, a shift can no longer be determined in the above reaction batch.

Soweit in der vorstehenden Beschreibung Bezug genommen wird auf den Stand der Technik, wird dieser bzw. dessen Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Insofar as reference is made to the prior art in the above description, this or its disclosure content is hereby incorporated by reference herein.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein. Those disclosed in the above description, the claims and the drawings Features of the invention can be used both individually and in any combination for the Realization of the invention in its various embodiments may be essential.

Claims (46)

1. Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine für YB-1 codierende Nukleinsäuresequenz umfasst. 1. Nucleic acid comprising an adenoviral nucleic acid, characterized in that the nucleic acid comprises a nucleic acid sequence coding for YB-1. 2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure eine für E1-B codierende Nukleinsäure umfasst. 2. Nucleic acid according to claim 1, characterized in that the adenoviral Nucleic acid comprises a nucleic acid coding for E1-B. 3. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure eine für E4orf6 codierende Nukleinsäure umfasst. 3. Nucleic acid according to claim 1 or 2, characterized in that the adenoviral Nucleic acid comprises a nucleic acid coding for E4orf6. 4. Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Promotor vorgesehen ist, der die Expression von E1-B steuert. 4. Nucleic acid according to claim 1 or 2, characterized in that a promoter is provided that controls the expression of E1-B. 5. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Promotor vorgesehen ist, der die Expression von E4orf6 steuert 5. Nucleic acid according to one of claims 3 or 4, characterized in that a A promoter is provided which controls the expression of E4orf6 6. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass E1B das E1-B 55 kDa-Protein ist. 6. Nucleic acid according to one of claims 1 to 5, characterized in that E1B the E1-B is 55 kDa protein. 7. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für funktional inaktive Genprodukte E1B und/oder E1 und/oder E3 und/oder E4 codiert. 7. Nucleic acid according to one of claims 1 to 6, characterized in that the Nucleic acid for functionally inactive gene products E1B and / or E1 and / or E3 and / or E4 coded. 8. Nukleinsäure umfassend eine für YB-1 codierende Nukleinsäure und eine einen Kerntransport von YB-1 vermittelnde Nukleinsäuresequenz. 8. Nucleic acid comprising a nucleic acid coding for YB-1 and one Nuclear transport of YB-1 mediating nucleic acid sequence. 9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die den Kerntransport von YB-1 vermittelnde Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die Signalsequenzen und Transportsequenzen umfasst. 9. Nucleic acid according to claim 8, characterized in that the core transport nucleic acid sequence mediating YB-1 is selected from the group consisting of Includes signal sequences and transport sequences. 10. Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure anstelle eines funktionalen late E2-Promotors (später E2- Promotors) einen tumorspezifischen Promotor aufweist. 10. Nucleic acid comprising an adenoviral nucleic acid, characterized in that the adenoviral nucleic acid instead of a functional late E2 promoter (later E2- Promotors) has a tumor-specific promoter. 11. Nukleinsäure umfassend eine adenovirale Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure anstelle eines funktionalen late E2-Promotors (später E2- Promotors) einen gewebespezifischen Promotor aufweist. 11. Nucleic acid comprising an adenoviral nucleic acid, characterized in that the adenoviral nucleic acid instead of a functional late E2 promoter (later E2- Promotors) has a tissue-specific promoter. 12. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure einen nicht-funktionalen early E2-Promotor (früher E2- Promotor) umfasst. 12. Nucleic acid according to one of claims 10 or 11, characterized in that the adenoviral nucleic acid is a non-functional early E2 promoter (formerly E2- Promoter). 13. Adenovirales Replikationssystem umfassen eine adenovirale Nukleinsäure, wobei die adenovirale Nukleinsäure defizient für die Expression des E1A-Proteins ist, und umfassend eine Nukleinsäure eines Helfervirus, wobei die Nukleinsäure des Helfervirus eine Nukleinsäureseduenz umfasst, die für YB-1 codiert. 13. Adenoviral replication system comprise an adenoviral nucleic acid, wherein the adenoviral nucleic acid is deficient for the expression of the E1A protein, and comprehensive a nucleic acid of a helper virus, wherein the nucleic acid of the helper virus is a Nucleic acid deduction encoding YB-1. 14. Adenovirales Replikationssystem nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure und/oder die Nukleinsäure des Helfervirus als replizierbarer Vektor vorliegt. 14. Adenoviral replication system according to claim 13, characterized in that the adenoviral nucleic acid and / or the nucleic acid of the helper virus as a replicable vector is present. 15. Vektor, bevorzugterweise ein Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12. 15. Vector, preferably an expression vector, comprising a nucleic acid after one of claims 1 to 12. 16. Vektorgruppe umfassend mindestens zwei Vektoren, wobei die Vektorgruppe insgesamt ein adenovirales Replikationssystem nach Anspruch 13 oder 14 umfasst. 16. Vector group comprising at least two vectors, the vector group overall comprises an adenoviral replication system according to claim 13 or 14. 17. Vektorgruppe nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine jede Komponente des adenoviralen Replikationssystems auf einem eigenen Vektor, bevorzugterweise einem Expressionsvektors, angeordnet ist. 17. Vector group according to claim 16, characterized in that each component of the adenoviral replication system on its own vector, preferably one Expression vector is arranged. 18. Vektorgruppe nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Komponenten des adenoviralen Replikationssystems auf einem Vektor der Vektorgruppe angeordnet sind. 18. Vector group according to claim 16, characterized in that at least two Components of the adenoviral replication system on a vector of the vector group are arranged. 19. Adenovirus umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12. 19. Adenovirus comprising a nucleic acid according to any one of claims 1 to 12. 20. Adenovirus nach Anspruch 19 umfassend ein Kapsid. 20. Adenovirus according to claim 19 comprising a capsid. 21. Zelle umfassend eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder ein adenovirales Replikationssystem nach Anspruch 13 oder 14 und/oder einen Vektor nach Anspruch 15 und/oder eine Vektorgruppe nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und/oder einen Adenovirus nach Anspruch 19 oder 20. 21. Cell comprising a nucleic acid according to one of claims 1 to 11 and / or An adenoviral replication system according to claim 13 or 14 and / or a vector according to Claim 15 and / or a vector group according to one of Claims 16 to 18 and / or one Adenovirus according to claim 19 or 20. 22. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und/oder eines adenoviralen Replikationssystems nach Anspruch 13 oder 14 und/oder eines Vektors nach Anspruch 15 und/oder einer Vektorengruppe nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und/oder eines Adenovirus nach Anspruch 19 oder 20 und/oder einer Zelle nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Medikaments. 22. Use of a nucleic acid according to one of claims 1 to 12 and / or one adenoviral replication system according to claim 13 or 14 and / or a vector according Claim 15 and / or a vector group according to any one of claims 16 to 18 and / or an adenovirus according to claim 19 or 20 and / or a cell according to claim 21 for Manufacture of a drug. 23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen ist. 23. Use according to claim 22, characterized in that the medicament for is the treatment and / or prophylaxis of tumor diseases. 24. Verwendung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament weiter eine pharmazeutisch wirksame Verbindung enthält. 24. Use according to claim 22 or 23, characterized in that the Medicament further contains a pharmaceutically active compound. 25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Verbindung aus gewählt ist aus der Gruppe, die Zytostatika umfasst, die bevorzugterweise ausgewählt sind aus der Gruppe, die cis-Platin, Taxol, Daunoblastin, Adriamycin und Mitoxantron umfasst. 25. Use according to claim 24, characterized in that the pharmaceutical Compound is selected from the group that includes cytostatics, preferably are selected from the group consisting of cis-platinum, taxol, daunoblastin, and adriamycin Mitoxantron includes. 26. Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und/oder eines adenoviralen Replikationssystems nach Anspruch 13 oder 14 und/oder eines Vektors nach Anspruch 12 und/oder einer Vektorengruppe nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und/oder eines Adenovirus nach Anspruch 19 oder 20 und/oder einer Zelle nach Anspruch 21 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Tumorerkrankungen, wobei die Tumorzellen eine vom Zellzyklus unabhängige Kernlokalisation von YB-1 aufweisen. 26. Use of a nucleic acid according to one of claims 1 to 12 and / or one adenoviral replication system according to claim 13 or 14 and / or a vector according Claim 12 and / or a vector group according to one of Claims 16 to 18 and / or an adenovirus according to claim 19 or 20 and / or a cell according to claim 21 for Manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of Tumor diseases, the tumor cells being independent of the cell cycle Have core localization of YB-1. 27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für eine adenovirale Nukleinsäure codiert und die adenovirale Nukleinsäure E1B-defizient, insbesondere E1B 55 kDa-defizient ist. 27. Use according to claim 26, characterized in that the nucleic acid for encodes an adenoviral nucleic acid and the adenoviral nucleic acid is E1B-deficient, E1B in particular is 55 kDa deficient. 28. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus E1Bdefizient, insbesondere E1B 55 kDa- defizient ist. 28. Use according to claim 25, characterized in that the adenovirus E1B deficient, in particular E1B 55 kD deficient. 29. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure für eine adenovirale Nukleinsäure codiert und die adenovirale Nukleinsäure für E1B codiert, insbesondere für E1B 55 kDa. 29. Use according to claim 26, characterized in that the nucleic acid for encodes an adenoviral nucleic acid and encodes the adenoviral nucleic acid for E1B, especially for E1B 55 kDa. 30. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus E1B exprimiert, insbesondere E1B 55 kDa. 30. Use according to claim 26, characterized in that the adenovirus E1B expressed, in particular E1B 55 kDa. 31. Verwendung nach Anspruch 26, 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die adenovirale Nukleinsäure für E1A codiert. 31. Use according to claim 26, 27 or 28, characterized in that the adenoviral nucleic acid encoded for E1A. 32. Verwendung nach einem der Ansprüche 26, 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus E1A exprimiert. 32. Use according to one of claims 26, 27 or 28, characterized in that the adenovirus E1A expressed. 33. Verwendung nach einem der Ansprüche 26 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor und/oder die Tumorerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die p53-positive Tumoren, p53-negative Tumoren, maligne Tumoren, benigne Tumoren und Kombinationen davon umfasst. 33. Use according to one of claims 26 to 32, characterized in that the Tumor and / or the tumor disease is selected from the group that is p53-positive Tumors, p53 negative tumors, malignant tumors, benign tumors and combinations of which includes. 34. Verfahren zum Screenen von Patienten, die mit einem E1B-defizienten, bevorzugterweise E1B 55 kDa-defizienten, Adenovirus behandelbar sind, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Untersuchen einer Probe des Tumorgewebes und - Feststellen, ob YB-1 im Kern Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist. 34. A method for screening patients who can be treated with an E1B-deficient, preferably E1B 55 kDa-deficient, adenovirus, characterized by the following steps: - Examine a sample of the tumor tissue and - Determine whether YB-1 is located in the nucleus independently of the cell cycle. 35. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Untersuchung des Tumorgewebes unter Verwendung eines Mittels erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper gegen YB-1 umfasst. 35. The method according to claim 38, characterized in that the examination of the Tumor tissue is carried out using an agent selected from the group consisting of which includes antibodies to YB-1. 36. Verwendung eines Antikörpers gegen YB-1 zur Bestimmung von Patienten, insbesondere Tumorpatienten, die mit einem E1B-defizientem, bevorzugterweise E1B 55 kDadefizientem Adenovirus behandelbar sind. 36. Use of an antibody against YB-1 for the determination of patients, especially tumor patients with an E1B deficient, preferably E1B 55 kDeficient adenovirus are treatable. 37. Komplex umfassend mindestens ein YB-1-Molekül und mindestens ein E1B 55 kDa- Protein. 37. Complex comprising at least one YB-1 molecule and at least one E1B 55 kDa- Protein. 38. Komplex nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das YB-1-Molekül ein transgenes YB-1-Molekül ist. 38. Complex according to claim 37, characterized in that the YB-1 molecule is transgenic YB-1 molecule. 39. Komplex umfassend mindestens ein YB-1-Molekül und mindestens ein E1A-Protein. 39. Complex comprising at least one YB-1 molecule and at least one E1A protein. 40. Komplex nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere der Proteine der E1A-Region transaktivierend auf die adenovirale Genexpression, aber nicht auf die Replikation eines Adenovirus aktivierend wirkt/wirken. 40. Complex according to claim 39, characterized in that one or more of the Proteins of the E1A region transactivating to adenoviral gene expression, but not to the replication of an adenovirus activates. 41. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 39 zur Tumorbehandlung, insbesondere zur Tumorlyse. 41. Use of a complex according to claim 39 for tumor treatment, in particular for tumor lysis. 42. Komplex nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass das YB-1 nukleär exprimiertes YB-1 ist. 42. Complex according to claim 37 or 38, characterized in that the YB-1 is nuclear is expressed YB-1. 43. Verwendung eines E1B-defizienten Adenovirus zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren, die YB-1 im Kern aufweisen. 43. Use of an E1B deficient adenovirus for the manufacture of a medicament for the treatment of tumors that have YB-1 in the nucleus. 44. Verwendung nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Kernlokalisation von YB-1 unter dem Einfluss exogener Maßnahmen erfolgt. 44. Use according to claim 43, characterized in that the core localization of YB-1 takes place under the influence of exogenous measures. 45. Verwendung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, dass die exogenen Maßnahmen solche Maßnahmen sind, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Bestrahlung, Zytostatika und Hyperthermie umfasst. 45. Use according to claim 44, characterized in that the exogenous Measures are measures that are selected from the group consisting of radiation, Includes cytostatics and hyperthermia. 46. Verwendung nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, dass die exogene Maßnahme an dem Organismus angewandt wird, für den das Medikament bestimmt ist. 46. Use according to claim 44 or 45, characterized in that the exogenous Measure is applied to the organism for which the drug is intended.