DE10133407A1 - New expression cassette for transgene expression, useful particularly in selection of transformed plants, contain specific constitutive Arabidopsis promoters - Google Patents
New expression cassette for transgene expression, useful particularly in selection of transformed plants, contain specific constitutive Arabidopsis promotersInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Expressionskassetten und Vektoren, die pflanzliche konstitutive Promotoren enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen - bevorzugt Selektionsmarkern - in Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. The invention relates to expression cassettes and vectors that contain herbal constitutive promoters, as well as the Use of these expression cassettes or vectors for transgenic Expression of nucleic acid sequences - preferably selection markers - in organisms, preferably in plants. The invention relates also with these expression cassettes or vectors transformed transgenic plants, crops derived therefrom, parts or Propagation material, and the use of the same for production of food, feed, seeds, pharmaceuticals or Fine chemicals.
Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität. Die Herstellung transgener Pflanzen ist eine grundlegende Technik der Pflanzenbiotechnologie und damit eine unerlässliche Voraussetzung für die pflanzliche Grundlagenforschung, sowie für die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten, neuen Eigenschaften für die Landwirtschaft, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487-96). Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197). Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizidresistenz erzielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert und Ernteverluste verringert (Ott KH et al. (1996) J Mol Biol 263(2): 359-368). Auch kann die Qualität der Erzeugnisse verbessert werden. So kann die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von Ernteerzeugnissen zum Beispiel durch Inaktivierung bestimmter Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 77-89). The aim of biotechnological work on plants is to manufacture them of plants with improved properties, for example for Increase agricultural productivity. The Production of transgenic plants is a basic technique of Plant biotechnology and therefore an essential prerequisite for basic plant research, as well as for production of plants with improved new properties for the Agriculture, to improve the quality of food or Production of certain chemicals or pharmaceuticals (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487-96). Often they are natural Defense mechanisms of the plant, for example, against pathogens insufficient. The introduction of foreign genes from plants, animals or Defense can be enhanced by microbial sources. Examples are the Protection against insect damage in tobacco through expression of the Bacillus thuringiensis endotoxin under the control of the 35 S CaMV promoter (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) or the protection of tobacco against fungal attack by expression of a chitinase from the bean under the control of the CaMV promoter (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197). Furthermore, through the introduction of foreign genes herbicide resistance can be achieved, which is the growing conditions optimized and crop losses reduced (Ott KH et al. (1996) J Mol Biol 263 (2): 359-368). Also, the quality of the products be improved. So the durability and shelf life of Harvest products, for example, by inactivating certain Ripening genes can be increased. This was shown for example the tomato by inactivating the polygalacturonase (Hamilton AJ et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 77-89).
Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt. Dabei kann zwischen konstitutiven Promotoren, die eine lokal und zeitlich nur wenig beschränkte Expression in verschiedenen Teilen einer Pflanze ermöglichen, und spezifischen Promotoren, die eine Expression nur in bestimmten Teilen oder Zellen einer Pflanze (z. B. Wurzel, Samen, Pollen, Blättern etc.) oder nur zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gestatten, unterschieden werden. Konstitutive Promotoren werden beispielsweise für die Expression sogenannter Selektionsmarker verwendet. Selektionsmarker (z. B. Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene) erlauben es, das Transformationsereignis aus der Vielzahl der nicht transformierten, aber ansonsten identischen pflanzlichen Individuen herauszufiltern. A basic requirement for the transgenic expression of certain Genes in plants are more plant-specific Promoters. Various plant promoters are known. there can distinguish between constitutive promoters that are local and Expression in different parts limited in time a plant, and specific promoters that a Expression only in certain parts or cells of a plant (e.g. root, seeds, pollen, leaves etc.) or just too allow certain times of development to be distinguished. For example, constitutive promoters are used for expression so-called selection marker used. Selection marker (e.g. Antibiotic or herbicide resistance genes) allow that Transformation event from the multitude of untransformed, but otherwise identical vegetable individuals filter out.
Konstitutive, pflanzliche Promotoren sind bislang relativ selten geschrieben. Zu nennen sind der TR-Doppelpromotor oder die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991). Constitutive, plant promoters have so far been relatively rare written. The TR double promoter or the Promoters of vacuolar ATPase subunits or the promoter of a proline-rich protein from wheat (WO 91/13991).
Die derzeit in Pflanzen überwiegend verwendeten konstitutiven Promotoren sind fast ausschließlich virale oder aus Agrobacterium isolierte Promotoren. Dabei handelt es sich im einzelnen um den Nopalinsynthase (nos) Promotor (Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846), den Mannopinsynthase (mas) promotor (Comai et al. (1990) Plant Mol Biol 15 (3): 373-381) und den Octopinsynthase (ocs) Promotor (Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557) aus Agrobacterium tunefaciens oder der CaMV35S Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus. Letzterer ist der am häufigsten verwendete Promotor in Expressionssystemen mit ubiquitärer und andauernder Expression (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Benfey et al. (1990) EMBO J 9(69): 1677-1684; US 5,612,472). Der häufig als konstitutiver Promoter angewandte CaMV 35S Promotor zeigt jedoch Variationen in der Aktivität in unterschiedlichen Pflanzen und in unterschiedlichen Geweben derselben Pflanze (Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37: 275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907). Ein weiterer Nachteil des 35S Promotors ist, das bei einer Infektion mit dem Blumenkohlmosaikvirus und seinen typischen pathogenen Varianten die Expression des Transgens verändert wird. So sind Pflanzen, die das BAR Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimieren nicht mehr resistent nach Infektion mit dem Virus, der in der Natur typischerweise vorkommt (Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99). The constitutive predominantly currently used in plants Promoters are almost exclusively viral or from Agrobacterium isolated promoters. This is the individual Nopaline synthase (nos) promoter (Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 (20): 7831-7846), the mannopine synthase (mas) promoter (Comai et al. (1990) Plant Mol Biol 15 (3): 373-381) and the Octopine synthase (ocs) promoter (Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 (5): 2553-2557) from Agrobacterium tunefaciens or the CaMV35S promoter from the cauliflower mosaic virus. The latter is the most commonly used promoter in expression systems with ubiquitous and persistent expression (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Benfey et al. (1990) EMBO J 9 (69): 1677-1684; US 5,612,472). Often used as a constitutive promoter However, CaMV 35S promoter shows variations in activity in different plants and in different tissues same plant (Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37: 275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907). Another disadvantage of the 35S Promotors is that in case of infection with the cauliflower mosaic virus and its typical pathogenic variants the expression of Transgene is changed. So are plants that contain the BAR gene control of the 35S promoter no longer express resistant after infection with the virus that is typically found in nature occurs (Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99).
Als Alternative zum CaMV 35S Promotor aus dem Bereich viraler Promotoren wurde der Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) beschrieben (Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39(6): 1221-1230), der ein dem CamV ähnliches Expressionsmuster vermittelt. Die Aktivität des ScBV Promotors wurde in transienten Expressionsanalysen mit verschiedenen zweikeimblättrigen Pflanzen, darunter Nicotiana tabacurn und N. benthamiana, Sonnenblume und Raps, und einkeimblättrigen Pflanzen, hier anhand von Banane, Mais und Hirse, analysiert. In den transienten Analysen in Mais war das ScBV Promotor vermittelte Expressionsniveau vergleichbar mit dem des Ubiquitin-Promotors aus Mais (s. unten). Weiterhin wurde die ScBV Promotor vermittelte Expressionsrate in transgenen Bananen- und Tabakpflanzen getestet und zeigte in beiden Pflanzenspezies im wesentlichen konstitutive Expression. As an alternative to the CaMV 35S promoter from the viral area The Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) was promoted (Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39 (6): 1221-1230), which conveys an expression pattern similar to the CamV. The ScBV promoter activity was transient Expression analysis with various dicotyledonous plants, including Nicotiana tabacurn and N. benthamiana, sunflower and rapeseed, and monocotyledonous plants, here using banana, corn and millet, analyzed. The ScBV was in the transient analyzes in maize Expression level mediated by promoter comparable to that of the Corn ubiquitin promoters (see below). Furthermore, the ScBV Promoter-mediated expression rate in transgenic banana and Tobacco plants tested and showed in both plant species in essential constitutive expression.
Als gängige Promotoren zur Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen werden vor allem der nos-Promotor, aber auch der mas- und ocs-Promotor verwendet, die allesamt aus Agrobacterium-Stämmen isoliert wurden. As common promoters for the expression of selection markers in Plants are primarily the nos promoter, but also the mass and ocs promoter, all of which are used Agrobacterium strains were isolated.
Der Verwendung viraler Sequenzen wird seitens des Verbrauchers oft mit großen Vorbehalt begegnet. Diese Bedenken werden nicht zuletzt durch Untersuchungen genährt, die die Sicherheit des 35S CaMV Promotors - aufgrund eines möglichen horizontalen Gentransfers bedingt durch einen Rekombinations-"Hot Spot" - in Frage stellen (Ho MW et al. (1999) Microbial Ecology in Health and Disease 11: 194-197; Cummins J et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 363). Ein Ziel künftiger biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist daher der Ersatz viraler genetischer Elemente durch regulatorische pflanzliche Elemente, um so nah wie möglich am pflanzlichen System zu bleiben. The use of viral sequences is on the part of the consumer often met with great reservations. These concerns will not last nourished by examinations that the safety of the 35S CaMV promoters - due to a possible horizontal Gene transfers due to a recombination "hot spot" - in question (Ho MW et al. (1999) Microbial Ecology in Health and Disease 11: 194-197; Cummins J et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 363). A goal of future biotechnological work Plants are therefore the replacement of viral genetic elements by regulatory herbal elements to be as close as possible to herbal system to stay.
Aufgrund der herrschenden Bedenken hinsichtlich viraler Promotoren gibt es umfangreiche Bemühungen, diese durch pflanzliche Promotoren zu ersetzen. Ein den viralen Elementen vergleichbarer Promotor pflanzlicher Herkunft ist bislang jedoch noch nicht beschrieben worden. Because of the prevailing concerns about viral There are extensive promoters to this through herbal promoters To replace promoters. A comparable one to the viral elements So far, however, there is no promoter of plant origin have been described.
Beschrieben wurde ein pflanzlicher Ubiquitin-Promotor aus Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12486-12493; Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-747). Entgegen den Befunden in den genannten Artikeln, ergaben eigene Untersuchungen, dass der Arabidopsis Ubiquitin Promotor für die Expression von Selektionsmarkergenen ungeeignet ist und seine allgemeine Anwendbarkeit aus diesem Grund in Frage gestellt werden muss (s. Vergleichsbeispiel 1 und 3). A herbal ubiquitin promoter has been described Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12,486 to 12,493; Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-747). Contrary to the findings in the articles mentioned, our own results Studies show that the Arabidopsis ubiquitin promoter for the Expression of selection marker genes is unsuitable and its general applicability are questioned for this reason must (see Comparative Examples 1 and 3).
Das vom Mais-Ubiquitin Promotor vermittelte Expressionsmuster wurde für die Ubi-1 and Ubi-2 Promotoren aus Mais beschrieben (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18(4): 675-689). Während der Ubi-1 Promotor in Mais und anderen monokotylen Pflanzen gute Expressionsaktivität aufweist, zeigt er in dikotylen Tabakpflanzen nur 10% der Aktivität, die in vergleichbaren Experimenten mit dem viralen 35S Promotor erzielt worden war. Ferner wurde gezeigt, dass der Mais Ubi-1 Promotor für die Überexpression von Genen in monokotylen Pflanzensystemen geeignet ist und darüber hinaus auch hinreichend stark ist, um eine Herbizid-Resistenz durch Expression von Selektionsmarkern zu vermitteln (Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5(3): 213-218). Für dikotyle Expressionsysteme erwies sich der Ubi-1 promotor als ungeeignet. The expression pattern mediated by the maize ubiquitin promoter has been described for the maize Ubi-1 and Ubi-2 promoters (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18 (4): 675-689). While the Ubi-1 promoter is good in maize and other monocotyledonous plants Has expression activity, he shows in dicotyledons Tobacco plants only 10% of the activity in comparable experiments with the 35S viral promoter. Further was demonstrated that the maize Ubi-1 promoter for overexpression of Genes in monocotyledonous plant systems and above is also sufficiently strong to be herbicide resistant through expression of selection markers (Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5 (3): 213-218). For dicotyledons The Ubi-1 promoter proved to be unsuitable for expression systems.
Ein Vergleich der Organspezifität und Stärke verschiedener konstitutiver Promotoren wurde von Holtorf (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29(4): 637-646) anhand stabil transformierter Arabidopsis-Pflanzen durchgeführt. Die Studie umfaßte u. a. den CaMV35S-Promotor, den blattspezifischen Thionin-Promotor aus Gerste und den Arabidopsis Ubiquitin-Promotor (UBQ1). Die höchste Expressionsrate zeigte der CaMV35S-Promotor. Anhand der Verwendung eines zusätzlichen translationalen Enhancers (TMV omega element) konnte die Expressionsrate des Promotors bei unveränderter Organspezifität um das Zwei- bis Dreifache gesteigert werden. Der blattspezifische Thionin-Promotor aus Gerste war in der Mehrzahl der transformierten Linien inaktiv, während der UBQ1 Promotor aus Arabidopsis mittlere Expressionsraten ergab. A comparison of the organ specificity and strength of different constitutive promoters was developed by Holtorf (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29 (4): 637-646) using stably transformed Arabidopsis plants performed. The study included a. the CaMV35S promoter, the leaf-specific thionine promoter Barley and the Arabidopsis Ubiquitin Promoter (UBQ1). The highest The CaMV35S promoter showed expression rate. Based on Use of an additional translational enhancer (TMV omega element) the expression rate of the promoter was unchanged Organ specificity can be increased two to three times. The leaf-specific barley thionine promoter was in the majority of the transformed lines become inactive while the UBQ1 promoter is off Arabidopsis showed medium expression rates.
McElroy und Mitarbeiter berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Act1) Promotor basierenden Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231: 150-160). Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlußfolgert, daß die auf dem Act1-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern. McElroy and co-workers reported one on the rice Actin 1 (Act1) promoter-based construct for transformation monocotyledonous plants (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231: 150-160). Overall, was from the previously described Studies concluded that those on the Act1 promoter based expression vectors are suitable, a sufficient strong and constitutive expression of foreign DNA in to control transformed cells of monocotyledonous plants.
Als konstitutiver Promotor ist ferner der Promotor einer S-Adenosyl-L-Methionin Synthetase beschrieben (WO 00/37662). Nachteilig ist hier vor allem eine Abhängigkeit der Expressionstärke von der Methioninkonzentration (siehe WO 00/37662; Fig. 7). The promoter of an S-adenosyl-L-methionine synthetase is also described as a constitutive promoter (WO 00/37662). The main disadvantage here is that the expression level is dependent on the methionine concentration (see WO 00/37662; FIG. 7).
WO 99/31258 beschreibt chimäre, konstitutive pflanzliche Promotoren, die sich aus verschiedenen Elementen verschiedener Promotoren mit komplementären Expressionsmustern zusammensetzen, so dass die Kombination einzelner Gewebespezifitäten additiv zu einem konstitutiven Expressionsmuster führt. WO 99/31258 describes chimeric, constitutive plant Promoters made up of different elements different Assemble promoters with complementary expression patterns so that the combination of individual tissue specificities additive to one constitutive expression pattern.
Die Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase (FNR) ist ein Protein der Elektronentransportkette und reduziert NADP+ zu NADPH. Experimente in Spinat mit dem Spinat-FNR Promotor, der mit dem GUS Gen fusioniert wurde, deuten auf ein lichtinduzierbares Element im FNR Promotor (Oelmüller et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237: 261-72). Aufgrund seine Funktion wäre für den Promotor ein streng blattspezifisches Expressionsmuster zu erwarten gewesen. Aufgrund des gewebeabhängigen Expressionsmusters wäre der Promotor schlecht geeignet für Expression von Selektionsmarkern. Hier ist eine Selektion in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten. The Ferredoxin NADPH Oxidoreductase (FNR) is a protein of the Electron transport chain and reduced NADP + to NADPH. Experiments in spinach with the spinach FNR promoter, which with the GUS gene merged, indicate a light - inducible element in the FNR promoter (Oelmüller et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237: 261-72). Because of its function, one would be for the promoter strictly leaf-specific expression pattern was to be expected. Due to the tissue-dependent expression pattern, this would be Promoter poorly suited for expression of selection markers. Here selection in as many tissue parts as possible is required, to ensure an efficient selection.
Der Promotor des Triose-Phosphat-Translokator (TPT) sollte aufgrund seiner Funktion während der Photosynthese vorwiegend blattspezifisch sein. Beschrieben sind die cDNAs von Kartoffel (Schulz et al. (1993) Mol Gen Genet 238: 357-61), Blumenkohl (Fischer et al. (1997) Plant Cell 9: 453-62), Raps (WO 97/25346) und Mais Kammerer B (1998) The Plant Cell 10: 105-117). Kammerer et al. zeigen, dass die Mais TPT mRNA Expression stark in den Blättern und den Staubgefäßen erfolgt. Kein Expression ist hingegen im Stengel oder den Wurzeln zu beobachten. Aufgrund des gewebeabhängigen Expressionsmusters wäre der Promotor schlecht geeignet für Expression von Selektionsmarkern. Hier ist eine Selektion in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten. The promoter of the triose phosphate translocator (TPT) should mainly due to its function during photosynthesis be leaf-specific. The cDNAs from Kartoffel (Schulz et al. (1993) Mol Gen Genet 238: 357-61), cauliflower (Fischer et al. (1997) Plant Cell 9: 453-62), rapeseed (WO 97/25346) and maize Kammerer B (1998) The Plant Cell 10: 105-117). Kammerer et al. show that the maize TPT mRNA expression is high in the leaves and the stamens. However, there is no expression in the stem or watching the roots. Because of the tissue-dependent Expression pattern, the promoter would be poorly suited for Expression of selection markers. Here is a selection in if possible all tissue parts required for an efficient selection guarantee.
Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten
"konstitutiven" Promotoren weisen einen oder mehrere der nachfolgenden
Nachteile auf:
- 1. Mangelhafte Homogenität der Expression:
Die bekannten, sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen vielfach eine unterschiedliche Expressionshöhe je nach Gewebe- oder Zelltyp. Zudem ist die Expressionseigenschaft oft stark von dem Insertionsort des Wirtsgenoms abhängig. Dies hat zur Folge, dass die durch heterologe Expression zu erzielenden Effekte nicht in dem gleichen Ausmaß homogen in der Pflanze erreicht werden können. Es kann zu Unter- oder Überdosierungen kommen. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken. - 2. Mangelhaftes Zeitprofil:
Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen oft eine nicht konsitente Aktivität während der Entwicklung eines Gewebes. Damit können zum Beispiel in der frühen Phase der somatischen Embryogenese keine wünschenswerten Effekte (wie Selektion) erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen in vitro Bedingungen und Stressfaktoren - vorteilhaft wäre. - 3. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten:
Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "konstitutiven" Promotoren sind oft nicht in allen Arten in gleicher Weise aktiv. - 4. Beim Vorliegen mehrerer Expressionskassetten mit jeweils dem gleichen "konstitutiven" Promotor in einem Organismus kann es zu Wechselwirkungen zwischen denselben und sogar zum Abschalten ("Gene Silencing") einzelner Expressionskassetten kommen (Mette et al. (1999) EMBO J. 18: 241-248).
- 5. Promotoren viralen Ursprungs können durch Virusinfektionen der transgenen Pflanze beeinflußt werden und die gewünschte Eigenschaft dann nicht mehr ausprägen (Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99).
- 6. Die öffentliche Akzeptanz gegenüber der Verwendung von Promotoren und Elementen aus pflanzlichen Systemen ist höher als bei viralen Systemen.
- 7. Die Zahl der für die Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen geeigneten Promotoren ist gering und sie sind gewöhnlicher Weise viralen oder bakteriellen Ursprungs.
- 8. Pollen/Antheren-Expression: Die genannten Promotoren (wie beispielsweise 35S CaMV) zeigen eine starke Aktivität im Pollen oder den Staubbeuteln (Antheren). Die kann unvorteilhafte Auswirkungen auf die Umwelt haben. So hatte eine unspezifische Expression von Bacillus thuringiensis Endotoxinen nicht nur den gewünschten Effekt auf Fraßinsekten durch Expression in der Wurzel, sondern auch infolge einer Expression im Pollen bedeutende Schäden im Bestand des Monarchfalters zur Folge, der den Pollen als Hauptnahrungsquelle nutzt (Losey JE et al. (1999) Nature 399, 214).
- 1. Poor homogeneity of expression:
The known, so-called "constitutive" promoters often show a different level of expression depending on the tissue or cell type. In addition, the expression property is often strongly dependent on the insertion site of the host genome. As a result, the effects to be achieved by heterologous expression cannot be achieved to the same extent in the plant to the same extent. Underdosing or overdosing may occur. This can adversely affect plant growth or plant value. - 2. Poor time profile:
The so-called "constitutive" promoters known in the prior art often show inconsistent activity during the development of a tissue. In the early phase of somatic embryogenesis, for example, no desirable effects (such as selection) can be achieved with this, which would be advantageous here - due to the sensitivity of the embryo to in vitro conditions and stress factors. - 3. Inapplicability to many plant species:
The so-called "constitutive" promoters described in the prior art are often not equally active in all types. - 4. If there are several expression cassettes with the same “constitutive” promoter in one organism, there may be interactions between them and even gene silencing of individual expression cassettes (Mette et al. (1999) EMBO J. 18: 241 -248).
- 5. Promoters of viral origin can be influenced by virus infections of the transgenic plant and then no longer express the desired property (Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99).
- 6. Public acceptance of the use of promoters and elements from plant systems is higher than that of viral systems.
- 7. The number of promoters suitable for the expression of selection markers in plants is small and they are usually of viral or bacterial origin.
- 8. Pollen / anther expression: The promoters mentioned (such as 35S CaMV) show a strong activity in the pollen or the anthers. This can have adverse effects on the environment. Nonspecific expression of Bacillus thuringiensis endotoxins not only had the desired effect on feeding insects by expression in the root, but also, as a result of expression in pollen, resulted in significant damage to the population of the monarch butterfly, which uses pollen as the main food source (Losey JE et al. (1999) Nature 399, 214).
Ein idealer konstitutiver Promotor sollte möglichst zahlreiche
der nachfolgenden Eigenschaften haben:
- a) Möglichst homogene lokale und zeitliche Genexpression d. h. eine Expression in möglichst vielen Zelltypen oder Geweben eines Organismus während der verschiedenen Phasen des Entwicklungszyklus. Gewünscht wird ferner eine effizient Selektion in dedifferentierten Zellen (verschiedenen Kallus-Phasen) aus Gewebekultur und weiteren Entwicklungsstadien, die für die Gewebekultur geeignet sind.
- b) Möglichst breite Anwendbarkeit auf verschiedene Pflanzenarten bzw. Anwendbarkeit auf Arten, in denen mit den bisher bekannten "konstitutiven" Promotoren keine Expression erreicht werden kann.
- c) Um eine Kombination von mehreren Transgenen in einer Pflanze zu realisieren, ist es wünschenswert, mehrere Transformationen hintereinander zu schalten oder Konstrukte mit mehreren Promotor-Kassetten zu verwenden, ohne daß durch die mehrmalige Verwendung identischer regulatorischer Sequenzen Silencing-Effekte erzeugt werden.
- d) Pflanzlichen Ursprung zur Vermeidung von Akzeptanzproblemen beim Konsumenten und eventuellen zukünftigen Zulassungsproblemen.
- e) Nebenaktivitäten eines Promotors in den Antheren/Pollen sind nicht wünschenswert, zum Beispiel um Umweltschäden zu vermeiden (s. o.).
- a) As homogeneous as possible local and temporal gene expression ie an expression in as many cell types or tissues of an organism as possible during the different phases of the development cycle. What is also desired is an efficient selection in dedifferentiated cells (different callus phases) from tissue culture and further development stages which are suitable for tissue culture.
- b) The broadest possible applicability to different plant species or applicability to species in which no expression can be achieved with the "constitutive" promoters known to date.
- c) In order to realize a combination of several transgenes in one plant, it is desirable to connect several transformations in series or to use constructs with several promoter cassettes without the silencing effects being generated by the repeated use of identical regulatory sequences.
- d) Vegetable origin to avoid consumer acceptance problems and possible future approval problems.
- e) Secondary activities of a promoter in the anthers / pollen are not desirable, for example to avoid environmental damage (see above).
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand also in der Bereitstellung von pflanzlichen regulatorischen Sequenzen, die möglichst viele der oben genannten Eigenschaften erfüllen, vor allem eine ubiquitäre und entwicklungsunabhängige (konstitutive) Expression einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz - bevorzugt kodierend für einen Selektionsmarker vermitteln. Trotz verschiedener pflanzlicher Promotoren für die eine konstitutive Expression zumindest in einzelnen Arten beansprucht wird, wurde bislang kein Promotor mit den oben aufgezählten gewünschten Eigenschaften beschrieben. Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu identifizieren. The object underlying the present invention was so in the provision of herbal regulatory Sequences that have as many of the above properties as possible fulfill, especially a ubiquitous and development-independent (constitutive) expression of an expression to be expressed Nucleic acid sequence - preferably coding for a selection marker convey. Despite various plant promoters for one constitutive expression claimed at least in individual species has so far been no promoter with the above Desired properties described. It therefore existed Task to identify appropriate promoters.
Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung von Expressionskassetten basierend auf dem Promotoren eines putativen Ferredoxin Gens (infolge pFD "putative Ferredoxin") Gens aus Arabidopsis thaliana, des Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase (infolge FNR) Gens aus Arabidopsis thaliana und des Triose-Phosphat Translokator (TPT) Gens aus Arabidopsis thaliana: This task was accomplished by providing expression cassettes based on the putative ferredoxin gene promoter (as a result of pFD "putative ferredoxin") gene from Arabidopsis thaliana, of the ferredoxin NADPH oxidoreductase (as a result of FNR) gene Arabidopsis thaliana and the Triose-Phosphate Translocator (TPT) gene from Arabidopsis thaliana:
Bei der Analyse des Arabidopsis Genoms wurde ein putativer ORF eines Ferredoxingens identifiziert. Die isolierten 836 bp 5' flankierter Sequenz fusioniert mit dem Gen der Glucuronidase zeigten in transgenem Tabak überraschenderweise ein konstitutives Expressionspattern. Die Sequenz entspricht einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 4 von Arabidopsis thaliana wie er in der GenBank unter der Acc.-No. Z97337 hinterlegt ist (Version Z97337.2; Basenpaar 85117 bis 85952; das Gen beginnend ab bp 85953 ist mit "strong similarity to ferredoxin [2Fe-2S] I, Nostoc muscorum" annotiert). (Das Gen ist nicht zu verwechsweln mit dem unter der GenBank Acc.-No: X51370 annotierten A.thaliana Gen für Preferredoxin; Vorst O et al. (1990) Plant Mol Biol 14(4): 491-499). When analyzing the Arabidopsis genome, a putative ORF of a ferredoxin gene identified. The isolated 836 bp 5 'flanked sequence fused to the gene of Surprisingly, glucuronidase showed up in transgenic tobacco constitutive expression pattern. The sequence corresponds to one Sequence section on chromosome 4 of Arabidopsis thaliana as he at GenBank under Acc.-No. Z97337 is deposited (Version Z97337.2; base pair 85117 to 85952; the gene starting from bp 85953 is with "strong similarity to ferredoxin [2Fe-2S] I, Nostoc muscorum "annotated). (The gene is not to be confused with that under GenBank Acc.-No: X51370 annotated A.thaliana gene for preferredoxin; Vorst O et al. (1990) Plant Mol Biol 14 (4): 491-499).
In den Antheren/Pollen der geschlossenen Blütenknospen konnte nur eine schwache Aktivität, in den der reifen Blüten gar keine mehr detektiert werden. Entgegen dem aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der vermuteten Blattspezifität oder der Funktion im photosynthetischen Elektronentransport), konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Phosphinothricin-Resistenzgen (bar/pat) demonstriert werden. In the anthers / pollen of the closed flower buds could only a weak activity in which the ripe flowers even no more can be detected. Contrary to that from the Reservations derived from literature findings against the suitability of the Promoters for the effective expression of selection markers (for Example based on the suspected leaf specificity or the Function in photosynthetic electron transport) a highly efficient selection by combination with for example the phosphinothricin resistance gene (bar / pat) be demonstrated.
Ausgehend von den Informationen eine cDNA aus N. tabacum wurde in der Arabidopisdatenbank nach einem homologen Gen gesucht. Entsprechend dieser Sequenzinformationen wurden Primer synthetisiert. Der über PCR aus genomischer DNA von Arabidopsis thaliana amplifizierte Promotor (634 bp), von dem eine blattspezifische Expression erwartet wurde, zeigte in transgenen Tabakpflanzen eine überraschend ubiquitäre und vom Insertionsort unabhängige Expression. Based on the information, a cDNA from N. tabacum was in the Arabidopis database for a homologous gene searched. According to this sequence information, primers became synthesized. The via PCR from genomic DNA from Arabidopsis thaliana amplified promoter (634 bp), one of which leaf-specific expression was expected, showed in transgenic tobacco plants a surprisingly ubiquitous and of Expression independent of insertion site.
Die Promotorsequenz entspricht teilweise einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana wie er in der GenBank unter der Acc.-No. AB011474 hinterlegt ist (Version AB011474.1 vom 27.12.2000; Basenpaar 70127 bis 69583; das Gen beginnend ab bp 69492 ist mit "ferredoxin-NADP+ reductase" annotiert). The promoter sequence corresponds in part to one Sequence section on chromosome 5 of Arabidopsis thaliana as described in the GenBank under Acc.-No. AB011474 is deposited (Version AB011474.1 from December 27, 2000; base pair 70127 to 69583; the gene starting from bp 69492 is with "ferredoxin-NADP + reductase "annotated).
In den Antheren/Pollen konnte keine Aktivität detektiert werden. Entgegen dem aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der vermuteten Blattspezifität oder der Funktion im photosynthetischen Elektronentransport), konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Phosphinothricin-Resistenzgen (bar/pat) demonstriert werden. No activity could be detected in the anthers / pollen become. Contrary to what is derived from the literature findings Reserved against suitability of the promoter for effective Expression of selection markers (for example due to the suspected leaf specificity or function in photosynthetic electron transport), could be a highly efficient Selection by combination with, for example, the Phosphinothricin resistance gene (bar / pat) will be demonstrated.
Ein 2041bp langes PCR Fragment wurde amplifiziert ausgehend von Arabidopsis Genbankdaten vom Chromosome V, clone MCL19.10. Die Promotorsequenz entspricht einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana wie er in der GenBank unter der Acc.-No. AB006698 hinterlegt ist (Version AB006698.1 vom 27.12.2000; Basenpaar 53242 bis 55281; das Gen beginnend ab bp 55282 ist mit "phosphate/triose-phosphate translocator" annotiert). A 2041bp PCR fragment was amplified starting of Arabidopsis gene bank data from chromosome V, clone MCL19.10. The promoter sequence corresponds to one Sequence section on chromosome 5 of Arabidopsis thaliana as described in the GenBank under Acc.-No. AB006698 is deposited (Version AB006698.1 from December 27, 2000; base pair 53242 to 55281; the gene starting with bp 55282 is with "phosphate / triose-phosphate translocator" annotated).
Transgene Tabakpflanzen zeigten überraschender Weise nicht nur eine starke Aktivität in zahlreichen Pflanzenteilen. In den Antheren/Pollen konnte keine Aktivität detektiert werden. Entgegen dem aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der vermuteten Blattspezifität), konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Phosphinothricin-Resistenzgen (bar/pat) demonstriert werden. Surprisingly, transgenic tobacco plants did not show only a strong activity in numerous parts of plants. In no activity could be detected in the anthers / pollen. Contrary to what is derived from the literature findings Reserved against suitability of the promoter for effective Expression of selection markers (for example due to the suspected leaf specificity), could make a highly efficient selection by combination with, for example, the Phosphinothricin resistance gene (bar / pat) will be demonstrated.
Das ubiquitäre Expressionsmuster, vor allem aber auch die Fähigkeit des TPT Promotors hinsichtlch der Expression von Selektionsmarkern stellt eine große Überraschung für den Fachmann dar, da der Triosephosphattranslokator verantwortlich für den Austausch von C3 Zuckerphosphaten zwischen Cytosol und Plastiden in photosynthetischen Blättern ist. Der TPT ist in der inneren Chloroplasten Membran lokalisiert. Farblose Plastiden enthalten typischerweise Hexose Transporter über den der C6-Zuckerphosphat Austausch erfolgt. Es ist nicht zu erwarten, daß solche Gene in den frühen Callus und Embryogenese Stadien aktiv sind (Stitt (1997) Plant Metabolism, 2nd ed., Dennis eds. Longman Press, Harlow, UK, 382-400). The ubiquitous expression pattern, but above all that Ability of the TPT promoter to express Selection markers are a big surprise for the Specialist because the triose phosphate translocator is responsible for the exchange of C3 sugar phosphates between cytosol and plastids in photosynthetic sheets. The TPT is localized in the inner chloroplast membrane. Colorless Plastids typically contain hexose transporters the C6 sugar phosphate exchange takes place. It is not too expect such genes in the early callus and Embryogenesis stages are active (Stitt (1997) Plant Metabolism, 2nd ed., Dennis eds. Longman Press, Harlow, UK, 382-400).
Sowohl der pFD, FNR als auch der TPT Promotor erwiesen sich als hinreichend stark, um Nukleinsäuresequenzen insbesondere Selektionsmarkergene erfolgreich zu exprimieren. Both the pFD, FNR and the TPT promoter were found to be sufficiently strong to be particularly nucleic acid sequences Successfully express selection marker genes.
Weiterhin wurden im Rahmen der genannten Arbeiten der Arabidopsis thaliana Ubiquitin-Promotor (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646) und der Squalen Synthase-Promotor (Kribii et al. (1997) Eur J Biochem 249: 61-69) untersucht, die aber beide überraschenderweise nicht geeignet waren, Selektionsmarkergen-Expression zu vermitteln, obwohl die Literaturdaten der Ubiquitin-Promotoren aus Monokotylen (siehe oben) hatten vermuten lassen, daß insbesondere der Ubiquitin-Promotor einer dikotylen Pflanze als Promotor eines Selektionsmarkersystems hätte funktionieren müssen (siehe Vergleichsbeispiele 1 und 3). Ähnliches gilt für den Squalensynthase-Promotor, dessen Charakterisierung hätte erwarten lassen, dass ausreichend hohe Expressionsraten für die erfolgreiche Steuerung eines Selektionsmarkergens erzielt werden können (Del Arco and Boronat (1999) 4th European Symposium on Plant Isoprenoids, 21.-23.4.1999, Barcelona, Spanien) (siehe Vergleichsbeispiele 2 und 3). Furthermore, the Arabidopsis thaliana ubiquitin promoter (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646) and the squalene synthase promoter (Kribii et al. (1997) Eur J Biochem 249: 61-69), but both were surprisingly not suitable To mediate selection marker gene expression, although the literature data of Ubiquitin promoters from monocots (see above) had suggested that especially the ubiquitin promoter of a dicotyledonous plant A promoter of a selection marker system should have worked (see comparative examples 1 and 3). The same applies to the Squalene synthase promoter, the characterization of which would have been expected let that sufficiently high expression rates for the successful control of a selection marker gene can be achieved (Del Arco and Boronat (1999) 4th European Symposium on Plant Isoprenoids, April 21-23, 1999, Barcelona, Spain) (see Comparative Examples 2 and 3).
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher
Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren umfassend
- a) einen Promotor gemäss SEQ ID NO: 1, 2 oder 3,
- b) ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a), das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt,
- a) a promoter according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3,
- b) a functional equivalent or equivalent fragment of a) which has essentially the same promoter activity as a),
Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur transgenen Expression
von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit
- a) einen Promotor gemäss SEQ ID NO: 1, 2 oder 3, oder
- b) einem funktionelle Äquivalent oder äquivalente Fragment von a), das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,
- a) a promoter according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3, or
- b) a functional equivalent or equivalent fragment of a) which has essentially the same promoter activities as a),
Expression umfasst die Transkription der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz, kann aber - im Falle eines offenen Leserasters in "sense"-Orientierung - auch die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid. Expression includes transcription of the transgene expressing nucleic acid sequence, but can - in the case of an open Reading frames in "sense" orientation - also the translation of the transcribed RNA of the nucleic acid sequence to be expressed transgenically into a corresponding polypeptide.
Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
oder Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren
umfasst alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommene
Konstruktionen oder Verfahren, in denen sich entweder
- a) ein Promotor gemäss SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, oder
- b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
- c) (a) und (b)
- a) a promoter according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or a functional equivalent or equivalent fragment thereof, or
- b) the nucleic acid sequence to be expressed, or
- c) (a) and (b)
Die erfindungsgemässen Expressionskassetten, von ihnen abgeleitete Vektoren oder die erfindungsgemäßen Verfahren können funktionelle Äquivalente zu den unter SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotorsequenzen umfassen. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang den durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 definierten Sequenzen abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen. The expression cassettes according to the invention, by them derived vectors or the methods according to the invention can functional equivalents to those under SEQ ID NO: 1, 2 or 3 described promoter sequences include. Functionally equivalent Sequences also include all of the sequences made by the complementary counter strand that defined by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 Sequences are derived and essentially the same Have promoter activity.
Funktionelle Äquivalente in bezug auf die erfindungsgemäßen Promotoren meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der unter SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotorsequenzen sowie seine Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen. Functional equivalents with respect to those of the invention Promoter means in particular natural or artificial mutations of the promoter sequences described under SEQ ID NO: 1, 2 or 3 as well as its homologues from other plant genera and species, which continues to have essentially the same promoter activity exhibit.
Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeichnet, wenn die Transkription eines bestimmten zu exprimierenden Gens unter Kontrolle eines bestimmten von SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 abgeleiteten Promotors unter ansonsten unveränderten Bedingungen eine Lokalisation innerhalb der Pflanze aufweist, die zu mindestens 50%, bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindesten 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 95% deckungsgleich ist mit einer Vergleichsexpression erhalten unter Verwendung eines des durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotors. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50%, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10% von einem Vergleichswert erhalten mit einem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50%, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% einen Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichswert die Expressionshöhe der natürliche mRNA des jeweiligen Gens oder des natürlichen Genproduktes. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) oder die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907). Promoter activity is considered essentially the same denotes when the transcription of a particular to be expressed Gene under the control of a particular one of SEQ ID NO: 1, 2 or 3 derived promoters under otherwise unchanged conditions has a localization within the plant that is too at least 50%, preferably at least 70%, particularly preferred at least 90% very particularly preferably at least 95% congruent is obtained using a comparison expression one of the promoters described by SEQ ID NO: 1, 2 or 3. The expression level can go down as well as down above compared to a comparison value. Prefers such sequences, their level of expression, are measured on the basis of the transcribed mRNA or the one translated as a result Protein, quantitatively under otherwise unchanged conditions not more than 50%, preferably 25%, particularly preferably 10% of a comparison value obtained with one by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 promoter differs. Particularly preferred are those sequences, the expression level of which is measured using the transcribed mRNA or the protein translated as a result, under otherwise unchanged conditions, quantitatively by more than 50%, preferably 100%, particularly preferably 500%, very particularly preferably 1000% receive a comparison value with that obtained from SEQ ID NO: 1, 2 or 3 described promoter exceeds. Is preferred the level of expression of the natural mRNA of the respective gene or the natural gene product. Is preferred furthermore obtained the expression level with a as a comparison value any, but certain nucleic acid sequence, preferred those nucleic acid sequences that are easy to quantify Encode proteins. Are particularly preferred Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) such as the "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5): 912-8, 1997) chloramphenicol transferase, a Luciferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) or the β-galactosidase, which is very particularly preferred β-glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907).
Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird. Unveränderte Bedingungen bedeutet ferner, dass alle Rahmenbedingungen wie bespielsweise Pflanzenart, Entwicklungsstadium der Pflanzen, Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate etc.) zwischen den zu vergleichenden Expressionen identisch gehalten werden. Otherwise unchanged conditions means that the expression, through one of the expression cassettes to be compared is initiated, not by combination with additional ones genetic control sequences, for example enhancer sequences, is modified. Unchanged conditions also means that all Framework conditions such as plant species, Stage of development of the plants, growing conditions, assay conditions (such as Buffers, temperature, substrates etc.) between those to be compared Expressions are kept identical.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation eines Promotors gemäss SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein. Mutations include substitutions, additions, deletions, Inversion or insertions of one or more nucleotide residues. Such nucleotide sequences are thus also carried out, for example the present invention encompasses, which one by Modification of a promoter according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3. aim Such a modification can further narrow the scope of the contained sequence or z. B. also the insertion of more Restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or adding more sequences, for example more regulatory sequences.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen. Where insertions, deletions or substitutions, such as. B. Transitions and transversions, in themselves, can be considered known techniques, such as in vitro mutagenesis, "primer repair", Restriction or ligation can be used. Through manipulations, such as B. restriction, "chewing-back" or replenishment of Overhangs for "blunt ends" can be complementary ends of the fragments for the ligation will be made available. Too analog Results can also be obtained using the polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide primers.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität
der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge
verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus
GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin,
Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung
folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12;
Length Weight: 4;
Average Match: 2,912;
Average Mismatch: -2,003.
Homology between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleic acid sequence over the entire entire length of the sequence, which can be determined by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) with the following parameters is calculated:
Gap Weight: 12;
Length Weight: 4;
Average match: 2,912;
Average mismatch: -2.003.
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO. 1, 2 oder 3 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50% aufweist. An example is a sequence that has a homology of at least 50% nucleic acid based with the sequence SEQ ID NO: 1, 2 or 3, understood a sequence that in a Comparison with the sequence SEQ ID NO. 1, 2 or 3 according to the above Program algorithm with the above parameter set a homology of has at least 50%.
Funktionelle homologe zu den obengenannten Promotoren zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten umfasst bevorzugt solche Sequenzen die die eine Homologie aufweisen von mindestens 50%, bevorzugt 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, am meisten bevorzugt 99% über eine Länge von von mindestens 100 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt von mindestens 300 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 400 Basenpaaren, am meistens bevorzugt von mindestens 500 Basenpaaren. Functional homologs to the above promoters Use in the expression cassettes according to the invention comprises prefers those sequences which have a homology of at least 50%, preferably 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95%, most preferably 99% over a length of at least 100 base pairs, preferably at least 200 base pairs, particularly preferably of at least 300 base pairs, whole particularly preferred of at least 400 base pairs, most often preferably of at least 500 base pairs.
Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium anuus, Linum sativum durch Homologievergleiche aus Datenbanken leicht auffinden. Further examples of the in the invention Expression cassettes or vectors used promoter sequences can be, for example, from different organisms, their genomic sequence is known, such as from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium anuus, Linum sativum by comparing homology easy to find from databases.
Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen gleichen Eigenschaften haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Functional equivalents also means DNA sequences that are under Standard conditions with the nucleic acid sequence coding for a promoter according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or to it hybridize complementary nucleic acid sequences and the im have essentially the same properties. Standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent as well less stringent hybridization conditions. Such Hybridization conditions are among others at Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pages 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. described.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20X SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7.0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben: For example, the conditions during the washing step be selected from the range of conditions limited by low stringency (approximately 2X SSC at 50 ° C) and those with high stringency (with about 0.2X SSC at 50 ° C preferably at 65 ° C) (20X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0). In addition, the temperature during the washing step of low stringent conditions at room temperature, around 22 ° C, raised to more stringent conditions at around 65 ° C become. Both parameters, salt concentration and temperature, can can be varied simultaneously, also one of the two Parameters kept constant and only the other can be varied. While hybridization can also denaturing agents such as Example formamide or SDS can be used. In the presence of 50% formamide, hybridization is preferred at 42 ° C executed. Some exemplary conditions for hybridization and Wash step are given as a result:
(1) Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel
- a) 4X SSC bei 65°C, oder
- b) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder
- c) 4X SSC, 50% Formamid, bei 42°C, oder
- d) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, oder
- e) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
- f) 2X oder 4X SSC, 30 bis 40% Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
- g) 6x SSC bei 45°C, oder,
- h) 50% Formamid, 4xSSC bei 42°C, oder
- i) 50% (vol/vol) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyviylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75mM Natriumcitrate bei 42°C, oder
- j) 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 2mM EDTA, 1% BSA und 7% SDS.
- a) 4X SSC at 65 ° C, or
- b) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 µg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA at 65 ° C, or
- c) 4X SSC, 50% formamide, at 42 ° C, or
- d) 6X SSC, 0.5% SDS, 100 µg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA, 50% formamide at 42 ° C, or
- e) 2X or 4X SSC at 50 ° C (weakly stringent condition), or
- f) 2X or 4X SSC, 30 to 40% formamide at 42 ° C (weakly stringent condition).
- g) 6x SSC at 45 ° C, or,
- h) 50% formamide, 4xSSC at 42 ° C, or
- i) 50% (vol / vol) formamide, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Ficoll, 0.1% polyvinyl pyrrolidone, 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM sodium citrate at 42 ° C, or
- j) 0.05 M sodium phosphate buffer pH 7.0, 2 mM EDTA, 1% BSA and 7% SDS.
- a) 0.1X SSC bei 65°C, oder a) 0.1X SSC at 65 ° C, or
- b) 0,1X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder b) 0.1X SSC, 0.5% SDS at 68 ° C, or
- c) 0,1X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder c) 0.1X SSC, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C, or
- d) 0,2X SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder d) 0.2X SSC, 0.1% SDS at 42 ° C, or
- e) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung), oder e) 2X SSC at 65 ° C (weakly stringent condition), or
- f) 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 1% SDS, 2 mM EDTA. f) 40 mM sodium phosphate buffer pH 7.0, 1% SDS, 2 mM EDTA.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3. Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschliessend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer "trial-by- error" Prozedur durchmustert werden. Besonders vorteilhafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise eine erhöht Resistenz gegenüber einem Selektionsmarker, die Höhe der resultierenden Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz. Process for the production of functional Equivalents preferably include the introduction of mutations Promoter according to SEQ ID NO: 1, 2 or 3. Mutagenesis can undirected ("random"), the mutagenized sequences then with regard to their properties after a "trial-by- error "procedure. Particularly advantageous Selection criteria include, for example, increased resistance versus a selection marker, the amount of the resulting Expression of the introduced nucleic acid sequence.
Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen eines der erfindunsggemäßen Promotors deletiert werden ohne die genannten Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktionell äquivalente Teile des Promotors beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 dar. Beispielhaft sei für so eine Deletionsmutatent die verkürzte pFD-Promotorsequenz (pFDs) gemäß SEQ ID NO: 4 zu nennen, die als funktionell äquivalentes Teil aussdrücklich mit umfasst sei. Alternatively, non-essential sequences can be one of the promoters according to the invention are deleted without the aforementioned To significantly impair properties. such Deletion variants represent functionally equivalent parts of the promoter described by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 such a deletion mutant the truncated pFD promoter sequence (pFDs) according to SEQ ID NO: 4, which are functional equivalent part is expressly included.
Die Eingrenzung Promotorsequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden (K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300) oder der BIOBASE Datenbank "Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig). Narrowing the promoter sequence to certain essential ones regulatory regions can also be used to search with the help of search routine be made by promoter elements. Often in those for Promoter activity relevant regions certain promoter elements abundant. This analysis can be done with, for example Computer programs such as the program PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements ") (K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300) or the BIOBASE database "Transfac" (Biological Databases GmbH, Braunschweig).
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z. B. im Rahmen einer "Site-specific mutagenesis"). Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al., Methods Enzymol, 154: 367-382, 1987; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995) Biotechniques 18(1): 29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden. Methods for mutagenizing nucleic acid sequences are Known to those skilled in the art and include, for example, the use of Oligonucleotides with one or more mutations compared to the region to be mutated (e.g. as part of a "Site-specific mutagenesis"). Typically, primers come with about 15 up to about 75 nucleotides or more, wherein preferably about 10 to about 25 or more nucleotide residues on both sides the sequence to be changed are localized. Details and Implementation of said mutagenesis methods are familiar to the person skilled in the art (Kunkel et al., Methods Enzymol, 154: 367-382, 1987; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995) Biotechniques 18 (1): 29-30; US 4,237,224). Mutagenesis can also by treating, for example, vectors that are one of the contain nucleic acid sequences according to the invention, with mutagenizing agents such as hydroxylamine can be realized.
Die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten enthaltenen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem der erfindungsgemäßen Promotor funktionell verknüpft sein. The contained in the expression cassettes according to the invention Nucleic acid sequences which are to be expressed transgenically can be used with other genetic control sequences in addition to one of the promoter according to the invention can be functionally linked.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung Promotors, der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. A functional link is, for example the sequential arrangement of the promoter that is transgenic expressing nucleic acid sequence and possibly other regulatory elements such as a terminator such that each of the regulative elements its function in transgenic expression of the Nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This is not a direct link in the chemical sense is absolutely necessary. Genetic control sequences, such as Enhancer sequences can also function from more distant positions or even from other DNA molecules to the target sequence exercise. Arrays are preferred in which the transgene is too expressing nucleic acid sequence behind that acting as a promoter Sequence is positioned so that both sequences are covalent are interconnected. The distance between is preferred the promoter sequence and the transgene to be expressed Nucleic acid sequence less than 200 base pairs, particularly preferred less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 Base pairs.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. A functional link can be created using common recombination and cloning techniques are realized, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) are described. But there can also be more between the two sequences Sequences are positioned, for example, the function of a Linkers with certain restriction enzyme interfaces or one Have signal peptides. The insertion of sequences for Expression of fusion proteins result.
Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäureseuenz einen der erfindungsgemäßen Promotoren und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. The concept of genetic control sequences is broad understand and mean all those sequences that have an impact on the Established or the function of the inventive Expression cassette. Modify genetic control sequences for example transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms. Preferably, the Expression cassettes according to the invention 5 'upstream from the respective transgenic nucleic acid sequence to be expressed one of the promoters according to the invention and 3'-downstream one Terminator sequence as an additional genetic control sequence, as well if necessary, further customary regulatory elements, in each case functionally linked to the transgene to be expressed Nucleic acid sequence.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991; 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schöffl F et al., Molecular & General Genetics 217(2-3): 246-53, 1989) beschrieben. Genetic control sequences also include other promoters Promoter elements or minimal promoters that the can modify expression-controlling properties. So through genetic control sequences, for example the tissue-specific ones Expression also depend on certain stress factors. Corresponding elements are for example for water stress, Abscisic acid (Lam E and Chua NH, J Biol Chem 1991; 266 (26): 17131-17135) and heat stress (Schöffl F et al., Molecular & General Genetics 217 (2-3): 246-53, 1989).
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzenpromotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass eine bestimmte Nukleinsäuresequenz durch einen Promotor (zum Beispiel einen der erfindungsgemäßen Promotoren) in einem Pflanzengewebe als sense-RNA transkribiert und in das entsprechende Protein translatiert wird, während die gleiche Nukleinsäuresequenz durch einen anderen Promotor mit einen anderen Spezifität in einem anderen Gewebe zu anti-sense- RNA transkibiert und das entsprechende Protein herrunterreguliert wird. Dieses kann durch eine erfindungsgemässe Expressionskassette realisiert werden, indem der eine Promotor vor die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz positioniert wird und der andere Promotor dahinter. Further promoters can also functionally function with the expressing nucleic acid sequence linked to expression in other plant tissues or in other organisms, such as Example E.coli enable bacteria. As plant promoters in principle all promoters described above come into question. For example, it is conceivable that a certain Nucleic acid sequence by a promoter (for example one of the promoters according to the invention) in a plant tissue as sense RNA is transcribed and translated into the corresponding protein while using the same nucleic acid sequence through a different promoter another specificity in a different tissue to anti-sense RNA transcribed and the corresponding protein down-regulated becomes. This can be done by an inventive Expression cassette can be realized by the one promoter in front of the transgene the nucleic acid sequence to be expressed is positioned and the other promoter behind it.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen, bevorzugt -Gens. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebespezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435-440.). Umgekehrt unterdrückt die 5'-untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65-73). Die unter SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 angegebene Nukleinsäuresequenz enthält den Abschnitt-Gens, der den Promotor und die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon Proteins repräsentiert. Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the 3' non-coding region of Genes, preferably gene. It has been shown that this one significant functions in the regulation of gene expression can play. So it was shown that 5'-untranslated Sequences that can enhance transient expression of heterologous genes. They can also promote tissue specificity (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435-440.). Conversely, suppresses the 5'-untranslated region of the opaque-2 gene expression. A Deletion of the corresponding region leads to an increase in Gene activity (Lohmer S et al. (1993) Plant Cell 5: 65-73). The below SEQ ID NO: 1, 2 or 3 specified nucleic acid sequence contains the Section gene that promoter and 5'-untranslated Region up to the ATG start codon protein represented.
McElroy und Mitarbeiter (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231(1):150-160) berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Act1) Promotor basierenden Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen. In transgenen Reiszellen führte die Verwendung des Act1-Introns in Kombination mit dem 35S-Promotor zu einer gegenüber dem isolierten 35S-Promotor um das Zehnfache gesteigerten Expressionsrate. Eine Optimierung der Sequenzumgebung der Translationsinitiationsstelle des Reportergen-Gens (GUS) resultierte in einer vierfachen Steigerung der GUS-Expression in transformierten Reiszellen. Eine Kombination der optimierten Translations-Initiationsstelle und des Act1-Introns resultierte in einer 40-fachen Steigerung der GUS-Expression durch den CaMV35S-Promotor in transformierten Reiszellen; ähnliche Ergebnisse wurden anhand von transformierten Maiszellen erzielt. Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlußfolgert, daß die auf dem Actl-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern. McElroy et al. (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231 (1): 150-160) reported one on the rice Actin 1 (Act1) Promoter-based construct for the transformation of monocotyledons Plants. In transgenic rice cells, the use of the Act1 introns in combination with the 35S promoter into one compared to the isolated 35S promoter increased tenfold Expression rate. An optimization of the sequence environment of the Translation initiation site of the reporter gene (GUS) resulted in a fourfold increase in GUS expression in transformed rice cells. A combination of the optimized Translation initiation site and the Act1 intron resulted in a 40-fold increase in GUS expression by the CaMV35S promoter in transformed rice cells; similar Results were obtained using transformed maize cells. Overall, the investigations described above concluded that those based on the Actl promoter Expression vectors are suitable for a sufficiently strong and constitutive expression of foreign DNA in transformed cells to control monocotyledonous plants.
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in einer der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten sein. The expression cassette can advantageously one or more so-called "enhancer sequences" functionally linked to the Contain promoters that have an increased transgenic expression of the Enable nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the transgene expressing nucleic acid sequences can be additional advantageous sequences are inserted, such as further regulatory ones Elements or terminators. The transgene to be expressed Nucleic acid sequences can be in one or more copies in one of the Expression cassettes according to the invention may be included.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebsspezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. (1998) Methods. 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen. Control sequences are also to be understood as those which a homologous recombination or insertion into the genome of a Allow host organism or removal from the genome allow. In homologous recombination, for example, the natural promoter of a particular gene against one of the promoter according to the invention can be replaced. Methods like that cre / lox technology allow tissue-specific, under certain circumstances inducible removal of the expression cassette from the genome of the Host organism (Sauer B. (1998) Methods. 14 (4): 381-92). Here certain flanking sequences are added to the target gene (lox sequences), which are later removed using the Enable cre recombinase.
Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen plaziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Zielgens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem entsprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an dem gewünschten Ort vor dem Zielgen platzieren, so dass die Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemässe Expressionskassette bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten-reziproken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz verwendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist geeignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotor auszutauschen und so den Expressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren. Die funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemässe Expressionskassette dar. The promoter to be introduced can be homologous recombination are placed in front of the target gene to be expressed by: the promoter is linked to DNA sequences, for example are homologous to endogenous sequences that correspond to the reading frame of the Target gene are upstream. Such sequences are considered genetic Understand control sequences. After a cell with that the corresponding DNA construct has been transformed, the two can homologous sequences interact and thus the promoter sequence the desired location in front of the target gene so that the Promoter sequence now functionally linked to the target gene stands and forms an expression cassette according to the invention. The Selection of the homologous sequences determines the insertion site of the Promoter. Here, the expression cassette can be homologous Recombination using a simple or a double-reciprocal recombination are generated. With the simply reciprocal Recombination becomes just a single recombination sequence used and the entire inserted DNA is inserted. In the case of double-reciprocal recombination, the one to be introduced DNA flanked by two homologous sequences and the Insertion of the flanked area. The latter is procedure suitable to the natural promoter of a certain gene against one of the promoters according to the invention exchange and so the expression location and time of this gene modify. The functional link provides one Expression cassette according to the invention.
Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). For the selection of successfully homologously recombined or transformed cells, it is usually necessary to use one selectable marker to introduce the successful recombined cells resistance to a biocide (for Example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-Deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic. The Selection marker allows the selection of the transformed cells from untransformed (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spezifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird ausserhalb der zu integrierenden DNA-Sequenz, d. h. ausserhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom übertragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällg insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion inaktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E. coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34bp lox-Sequenz bzw. 47 p FRT-Sequenz) um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.) Homologous recombination is a relatively rare event in higher eukaryotes, especially in plants. Random integrations in the host genome predominate. A chance that happens remove integrated sequences and thus cell clones with a Enriching correct homologous recombination consists in Use of a sequence-specific recombination system as in US 6,110,736. This consists of three elements: two Pairs of specific recombination sequences and one sequence-specific recombinase. This recombinase catalyzes one Recombination only between the two pairs of specific recombination sequences. The one pair of these specific ones DNA sequences will be outside the DNA sequence to be integrated, d. H. located outside of the two homologous DNA sequences. In the case of a correct homologous recombination, these become Sequences not transferred into the genome. In case of a random integration they usually insert together with the Rest of the construct. Using a special recombinase and a construct containing a second pair of specific sequences can be the randomly inserted sequences be cut out or inactivated by inversion while the sequences inserted correctly via homologous recombination in the Genome remain. A variety of sequence specific Recombination systems can be used, for example Bacteriophage P1 Cre / lox system, yeast FLP / FRT system, the Mu Phage gin recombinase, the E. pin recombinase called coli and the R / RS system of the pSR1 plasmid. Prefers are the bacteriophage P1 Cre / lox and the yeast FLP / FRT system. Here the recombinase (Cre or FLP) interacts specifically their respective recombination sequences (34bp lox sequence or 47 p FRT sequence) to the intermediate sequences delete or invert. The FLP / FRT and cre / lox Recombinase system has already been used in plant systems (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.)
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator. Suitable polyadenylation signals as control sequences vegetable polyadenylation signals, preferably those which are in the essential T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, especially gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) or functional equivalents thereof. Examples for particularly suitable terminator sequences are the OCS (Octopine synthase) terminator and the NOS (Nopaline synthase) terminator.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Nukleinsäuren bzw. Proteinen
bekannt, deren rekombinante Expression gesteurt durch die
erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Verfahren vorteilhaft ist.
Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch
deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer
entsprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte
erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend für
vorteilhafte Effekte seien zu nennen:
- - Erleichtere Herstellung eines transgenen Organismus beispielsweise durch die Expression von Selektionsmarkern
- - Erzielen einer Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV-Strahlung)
- - Erzielen einer Resistenz gegen biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten)
- - Verbesserung von Nahrungs- oder Futtereigenschaften
- - Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages.
- - Easier production of a transgenic organism, for example, by the expression of selection markers
- - Achieve resistance to abiotic stress factors (heat, cold, dryness, increased moisture, environmental toxins, UV radiation)
- - Achieve resistance to biotic stress factors (pathogens, viruses, insects and diseases)
- - Improvement of food or feed properties
- - Improve growth rate or earnings.
Nachfolgend seien einige konkrete Beispiele für Nukleinsäuren genannt, deren Expression die gewünschten vorteilhaften Effekte bietet: Below are some concrete examples of nucleic acids called whose expression the desired beneficial effects provides:
Selektionsmarker umfasst sowohl positive Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, Herbizid oder Biozid verleihen, als auch negative Selektionsmarker, die eine Sensitivität gegen eben diese verleihen, als auch Marker die dem transformierten Organismus einen Wachstumsvorteil gewähren (bespielsweise durch Expression von Schlüsselgenen der Cytokinbiosynthese; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121). Bei der positiven Selektion gedeihen nur die Organismen, die den entsprechenden Selektionsmarker exprimieren, während bei der negativen Selektion eben diese eingehen. Bei der Herstellung transgener Pflanzen ist die Verwendung eines positiven Selektionsmarkers bevorzugt. Bevorzugt ist ferner die Verwendung von Selektionsmarkern, die Wachstumsvorteile verleihen. Negative Selektionsmarker können vorteilhaft verwendet werden, wenn es darum geht, bestimmt Gene oder Genomabschnitte aus einem Organismus zu entfernen (beispielsweise im Rahmen eines Kreuzungsprozesses). Selection marker includes both positive selection markers, which are resistant to an antibiotic, herbicide or Give biocide, as well as negative selection markers, the one Giving sensitivity to these, as well as markers a growth advantage for the transformed organism grant (for example by expressing key genes of the cytokine; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121). Thrive in positive selection only the organisms that have the corresponding selection marker express, while in the negative selection it is precisely this received. In the production of transgenic plants Use of a positive selection marker preferred. It is also preferred to use selection markers which Give growth advantages. Negative selection markers can be used to advantage when it comes to determined Remove genes or sections of genomes from an organism (for example as part of an intersection process).
Der mit der Expressionskassette eingebrachte selektionierbare Marker verleiht den erfolgreich rekombinierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt: The selectable inserted with the expression cassette Marker gives the successfully recombined or transformed cells resistance to a biocide (for example a herbicide such as phosphinothricin, glyphosate or Bromoxynil), a metabolism inhibitor like 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or an antibiotic, for example Kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin. The selection marker allows the selection of the transformed cells from untransformed (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Particularly preferred selection markers are those confer resistance to herbicides. Exemplary as Selection markers are mentioned:
Dem Fachmann sind zahlreiche derartiger Selektionsmarker und die für diese kodierenden Sequenzen bekannt. Nachfolgen seien beispielshaft jedoch nicht einschränkend zu nennen: Numerous selection markers of this type are known to the person skilled in the art the known for these coding sequences. To be successors to name but not restrictive:
Der mit dem Expressionskassette eingebrachte
selektionierbaren Marker verleiht den erfolgreich rekombinierten oder
transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum
Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder
Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor wie
2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum
Beispiel Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418,
Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin, verleiht. Der
Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von
untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5
(1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind
solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen.
Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
- - DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren, welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetyliert und damit eine Detoxifizierung des PPT erreicht (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (auch Bialophos®resistenzgen (bar) genannt). Das bar Gen kodierend für eine Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) kann aus beispielsweise Streptomyces hygroscopicus oder S. viridochromogenes isoliert werden. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (aus Streptomyces hygroscopicus Gen- Bank Acc.-No.: X17220 und X05822, aus Streptomyces viridochromogenes GenBank Acc.-No.: M 22827 und X65195; US 5,489,520). Ferner sind synthetische Gene beispielsweise für die Expression in Plastiden beschrieben AJ028212. Ein synthetisches Pat Gen ist beschrieben bei Becker et al. (1994), The Plant J. 5: 299-307. Ganz besonders bevorzugt ist ebenfalls die Expression des Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 5, beispielsweise kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Die Gene verleihen Resistanz gegen das Herbizid Bialaphos oder Glufosinat und sind ein vielbenutzter Marker in transgenen Pflanzen (Vickers, JE et al. (1996). Plant Mol. Miol. reporter 14: 363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO Journal 6: 2519-2523).
- - 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen. Das unselektive Herbizid Glyphosat hat 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase (EPSPS) als molekulares Target. Diese hat eine Schlüsselfunktion in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren in Microben und Pflanzen, jedoch nicht in Säugern (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun. 94: 1207-1212; Levin JG und. Sprinson DB (1964) J. Biol. Chem. 239: 1142-1150; Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate a literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E und Atkinson D (eds.). The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston.). Glyphosat-tolerante EPSPS Varianten werden bevorzugt als Selektionsmarker verwendet (Padgette SR et al. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready™ gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke, S.O., ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL; Saroha MK und Malik VS (1998) J Plant Biochemistry and Biotechnology 7: 65-72). Das EPSPS Gen des Agrobacterium sp. strain CP4 hat eine natürliche Toleranz gegen Glyphosat, die auf entsprechende transgene Pflanzen transferiert werden kann. Das CP4 EPSPS Gen wurde aus Agrobacterium sp. strain CP4 kloniert (Padgette SR et al. (1995)Crop Science 35(5): 1451-1461). 5-Enolpyrvylshikimate-3-phosphate-synthasen die Glyphosat-tolerant sind wie beispielsweise beschrieben in US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5,627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571, wobei die jeweils in den Patenten beschriebenen Sequenzen auch in der GenBank hinterlegt sind. Weitere Sequenzen sind beschrieben unter GenBank Accession X63374. Ferner ist das aroA Gen bevorzugt (M10947 S. typhimurium aroA locus 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (aroA protein) gene).
- - das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase). GOX (beispielsweise die Glyphosatoxidoreductase aus Achromobacter sp.) katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung in Glyphosat was so zu Aminomethylphosphonsäure (AMPA) und Glyoxylat umgesetzt wird. GOX kann dadurch eine Resistenz gegen Glyphosat vermitteln (Padgette SR et al. (1996) J Nutr. 1996 Mar; 126(3): 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
- - das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon® inaktiviert), (GenBank Acc.-No.: AX022822, AX022820 sowie WO99/27116)
- - bxn Gene, die für Bromoxynil® degradierende Nitrilaseenzyme kodieren. Beispielsweise die Nitrilase aus Klebstella ozanenae. Sequenzen sind in der genbank beispielsweise unter den Acc.-No: E01313 (DNA encoding promoxynil specific nitrilase) und J03196 (K.pneumoniae bromoxynilspecific nitrilase (bxn) gene, complete cds) zu finden.
- - Neomycinphosphotransferasen verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduziert. Besonders bevorzugt ist das nptII Gen. Sequenzen können aus der GenBank erhalten werden (AF080390 Minitransposon mTn5-GNm; AF080389 Minitransposon mTn5-Nm, complete sequence). Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF234316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201). Das NPTII Gen kodiert für eine Aminoglycosid-3'O-phosphotransferase aus E.coli, Tn5 (GenBank Acc.- No: U00004 Position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336).
- - das DOGR1-Gen. Das Gen DOGR1 wurde aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836). Es codiert für eine 2-Desoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202, Sequenz: GenBank Acc.-No.: NC001140 chromosom VIII, Saccharomyces cervisiae Position 194799-194056).
- - Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon inaktivierende
Acetolactatsynthasen, die eine Resistenz gegen
Imidazolinon/Sulfonylharnstoff-Herbizide verleihen. Beispielhaft seien
für Imidazolinon-Herbizide die Wirkstoffe
Imazamethabenzmethyl, Imazzamox, Imazapyr, Imazaguin, Imazethapyr zu
nennen. Für Sulfonylharnstoff-Herbizide seien
beispielhaft Amidosulforon, Azimsulfuron, Chlorimuronethyl,
Chlorsulfuron, Cinosulfuron, Imazosulforon, Oxasulforon,
Prosulforon, Rimsulforon, Sulfosulforon zu nennen. Dem
Fachmann sind zahlreiche weitere Wirkstoffe der genannten
Klassen bekannt. Geeignet sind beispielsweise die
Nukleinsäuren unter der GenBank Acc-No.: X51514 abgelegte
Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC
4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res.
18(8):2188). Acetolactatesynthasen die eine Resistenz
gegen Imidazolinon-Herbizide verleihen sind ferner
beschrieben unter den GenBank Acc.-No.:
- a) AB049823 Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide resistant biotype
- b) AF094326 Bassia scoparia herbicide resistant acetolactate synthase precursor (ALS) gene, complete cds
- c) X07645 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRB (EC 4.1.3.18)
- d) X07644 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRA (EC 4.1.3.18)
- e) A19547 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
- f) A19546 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
- g) A19545 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
- h) I05376 Sequence 5 from Patent EP 0257993
- i) I05373 Sequence 2 from Patent EP 0257993
- j) AL133315
- - Hygromycinphosphotransferasen (X74325 P.pseudomallei gene for hygromycin phosphotransferase) die eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleihen. Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAMBIA-1303; AF234298 pCAMBIA-1302; AF354046 pCAMBIA-1305.; AF354045 pCAM- BIA-1305.1)
- - Resistenzgene gegen
- 1. Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyltransferase),
- 2. Tetracyclin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z. B. X65876 S. ordonez genes class D tetA and tetR for tetracycline resistance and repressor proteins X51366 Bacillus cereus plasmid pBC16 tetracycline resistance gene. Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden
- 3. Streptomycin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z. B. mit der GenBank Acc.-No.: AJ278607 Corynebacterium acetoacidophilum ant gene for streptomycin adenylyltransferase.
- 4. Zeocin, das entsprecende Resistenzgen ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren (z. B. L36849 Cloning vector pZEO) und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
- 5. Ampicillin (β-Lactamase Gen; Datta N, Richmond HR. (1966) Biochem J. 98(1): 204-9; Heffron F et al (1975) J. Bacteriol 122: 250-256; das Amp Gen wurde zuerst zur Herstellung des E. coli Vektors pBR322 kloniert; Bolivar F et al. (1977) Gene 2: 95-114). Die Sequenz ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
- - Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens (strain: PO22) (Genbank Acc.-No.: AB025109). Das ipt Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z. B. Selektion auf Cytokin-freien Medium). Das Verfahren zur Nutzung des ipt Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121; Ebinuma, H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
- - DNA sequences which code for phosphinothricin acetyltransferases (PAT), which acetylates the free amino group of the glutamine synthase inhibitor phosphinothricin (PPT) and thus detoxifies the PPT (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (also Bialophos ®resistance gene (bar) called). The bar gene coding for a phosphinothricin acetyltransferase (PAT) can be isolated from, for example, Streptomyces hygroscopicus or S. viridochromogenes. Corresponding sequences are known to the person skilled in the art (from Streptomyces hygroscopicus GenBank Acc.-No .: X17220 and X05822, from Streptomyces viridochromogenes GenBank Acc.-No .: M 22827 and X65195; US 5,489,520). Furthermore, synthetic genes are described, for example, for expression in plastids AJ028212. A synthetic Pat gene is described by Becker et al. (1994), The Plant J. 5: 299-307. Expression of the polypeptide according to SEQ ID NO: 5 is also very particularly preferred, for example encoded by a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 4. The genes confer resistance to the herbicide bialaphos or glufosinate and are a widely used marker in transgenic plants (Vickers, JE et al. (1996) Plant Mol. Miol. reporter 14: 363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO Journal 6: 2519-2523).
- - 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase genes (EPSP synthase genes) which confer resistance to Glyphosat® (N- (phosphonomethyl) glycine). The unselective herbicide glyphosate has 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase (EPSPS) as its molecular target. This has a key function in the biosynthesis of aromatic amino acids in microbes and plants, but not in mammals (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun. 94: 1207-1212; Levin JG and. Sprinson DB (1964) J. Biol. Chem. 239: 1142-1150; Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate a literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E and Atkinson D (eds.). The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston.). Glyphosate-tolerant EPSPS variants are preferably used as selection markers (Padgette SR et al. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready ™ gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke, SO, ed.), Pp 53-84 CRC Press, Boca Raton, FL; Saroha MK and Malik VS (1998) J Plant Biochemistry and Biotechnology 7: 65-72). The EPSPS gene of Agrobacterium sp. strain CP4 has a natural tolerance to glyphosate, which can be transferred to corresponding transgenic plants. The CP4 EPSPS gene was derived from Agrobacterium sp. strain CP4 cloned (Padgette SR et al. (1995) Crop Science 35 (5): 1451-1461). 5-enolpyrvylshikimate-3-phosphate synthases which are glyphosate-tolerant as described, for example, in US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5,627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571, the sequences described in the patents also being stored in the GenBank. Further sequences are described under GenBank Accession X63374. The aroA gene is also preferred (M10947 S. typhimurium aroA locus 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (aroA protein) gene).
- - the gox gene (glyphosate oxidoreductase) coding for the glyphosate® degrading enzyme. GOX (for example the glyphosate oxidoreductase from Achromobacter sp.) Catalyzes the cleavage of a CN bond into glyphosate, which is converted into aminomethylphosphonic acid (AMPA) and glyoxylate. GOX can thereby confer resistance to glyphosate (Padgette SR et al. (1996) J Nutr. 1996 Mar; 126 (3): 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
- - the deh gene (coding for a dehalogenase which inactivates Dalapon®), (GenBank Acc.-No .: AX022822, AX022820 and WO99 / 27116)
- - bxn genes which code for Bromoxynil® degrading nitrilase enzymes. For example, the nitrilase from Klebstella ozanenae. Sequences can be found in the genebank, for example, under Acc.-No: E01313 (DNA encoding promoxynil specific nitrilase) and J03196 (K.pneumoniae bromoxynilspecific nitrilase (bxn) gene, complete cds).
- - Neomycin phosphotransferases confer resistance to antibiotics (aminoglycosides) such as neomycin, G418, hygromycin, paromomycin or kanamycin by reducing their inhibitory effect through a phosphorylation reaction. The nptII gene is particularly preferred. Sequences can be obtained from GenBank (AF080390 mini transposon mTn5-GNm; AF080389 mini transposon mTn5-Nm, complete sequence). In addition, the gene is already part of numerous expression vectors and can be isolated from them using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (AF234316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201). The NPTII gene codes for an aminoglycoside-3'O-phosphotransferase from E. coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336).
- - the DOG R 1 gene. The gene DOG R 1 was isolated from the yeast Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836). It encodes a 2-deoxyglucose-6-phosphate phosphatase that confers resistance to 2-DOG (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202, Sequence: GenBank Acc.-No .: NC001140 chromosome VIII, Saccharomyces cervisiae position 194799-194056).
- - Sulfonylurea and imidazolinone inactivating acetolactate synthases which confer resistance to imidazolinone / sulfonylurea herbicides. The active substances imazamethabenzmethyl, imazzamox, imazapyr, imazaguin and imazethapyr are examples of imidazolinone herbicides. Examples of sulfonylurea herbicides are amidosulforon, azimsulfuron, chlorimuronethyl, chlorosulfuron, cinosulfuron, imazosulforon, oxasulforon, prosulforon, rimsulforon, sulfosulforon. Numerous other active substances of the classes mentioned are known to the person skilled in the art. For example, the nucleic acids under GenBank Acc-No .: X51514 are suitable sequences for the Arabidopsis thaliana Csr 1.2 gene (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18 (8): 2188). Acetolactate synthases which confer resistance to imidazolinone herbicides are also described under GenBank Acc.-No .:
- a) AB049823 Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide resistant biotype
- b) AF094326 Bassia scoparia herbicide resistant acetolactate synthase precursor (ALS) gene, complete cds
- c) X07645 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRB (EC 4.1.3.18)
- d) X07644 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRA (EC 4.1.3.18)
- e) A19547 synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
- f) A19546 synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
- g) A19545 synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
- h) I05376 Sequence 5 from Patent EP 0257993
- i) I05373 Sequence 2 from Patent EP 0257993
- j) AL133315
- - Hygromycin phosphotransferases (X74325 P. pseudomallei gene for hygromycin phosphotransferase) which confer resistance to the antibiotic hygromycin. The gene is part of numerous expression vectors and can be isolated from them using methods known to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction) (AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAMBIA-1303; AF234298 pCAMBIA-130) -1305 .; AF354045 pCAM- BIA-1305.1)
- - resistance genes against
- 1. chloramphenicol (chloramphenicol acetyl transferase),
- 2. Tetracycline, various resistance genes are described for. B. X65876 S. ordonez genes class D tetA and tetR for tetracycline resistance and repressor proteins X51366 Bacillus cereus plasmid pBC16 tetracycline resistance gene. In addition, the gene is already part of numerous expression vectors and can be isolated from these using methods familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction)
- 3. Streptomycin, various resistance genes are described e.g. B. with GenBank Acc.-No .: AJ278607 Corynebacterium acetoacidophilum ant gene for streptomycin adenylyl transferase.
- 4. Zeocin, the corresponding resistance gene is a component of numerous cloning vectors (for example L36849 cloning vector pZEO) and can be isolated from these using methods which are familiar to the person skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction).
- 5. Ampicillin (β-lactamase gene; Datta N, Richmond HR. (1966) Biochem J. 98 (1): 204-9; Heffron F et al (1975) J. Bacteriol 122: 250-256; the Amp gene was first cloned to produce the E. coli vector pBR322; Bolivar F et al. (1977) Gene 2: 95-114). The sequence is part of numerous cloning vectors and can be isolated from them using methods familiar to those skilled in the art (such as, for example, polymerase chain reaction).
- - Genes such as the isopentenyl transferase from Agrobacterium tumefaciens (strain: PO22) (Genbank Acc.-No .: AB025109). The ipt gene is a key enzyme in cytokine biosynthesis. Its overexpression facilitates the regeneration of plants (e.g. selection on cytokine-free medium). The procedure for using the ipt gene is described (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121; Ebinuma, H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt , rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19(6) 719-726). TK thymidine kinase (TK) and diphtheria toxin A fragment (DT-A), codA Gen kodierend für eine Cytosindeaminase (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40(2): 223-35; Perera RJ et al. (1993) Plant Mol. Biol 23(4): 793-799; Stougaard J; (1993) Plant J 3: 755-761), das Cytochrom P450 Gen (Koprek et al. (1999) Plant J. 156: 719-726), Gene kodierend für eine Haloalkan Dehalogenase (Naested H (1999) Plant J. 18: 571-576), das iaaH Gen (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9: 1797-1810) oder das tms2 Gen (Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3: 273-289). Negative selection markers allow, for example, the Selection of organisms with successfully deleted sequences, comprising the marker gene (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19 (6) 719-726). TK thymidine kinase (TK) and diphtheria toxin A fragment (DT-A), coding for codA gene for a cytosine deaminase (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40 (2): 223-35; Perera RJ et al. (1993) Plant Mol. Biol 23 (4): 793-799; Stougaard J; (1993) Plant J 3: 755-761) that Cytochrome P450 gene (Koprek et al. (1999) Plant J. 156: 719-726), genes coding for a haloalkane dehalogenase (Naested H (1999) Plant J. 18: 571-576), the iaaH gene (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9: 1797-1810) or the tms2 gene (Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3: 273-289).
Die jeweils für die Selektion verwendeten Konzentrationen der Antibiotika, Herbizide, Biozide oder Toxine müssen an die jeweiligen Testbedingungen bzw. Organismen angepasst werden. Beispielhaft seien für Pflanzen zu nennen Kanamycin (Km) 50 mg/l, Hygromycin B 40 mg/l, Phosphinothricin (Ppt) 6 mg/l. The concentrations of the used for the selection Antibiotics, herbicides, biocides or toxins must be added to the be adapted to the respective test conditions or organisms. Kanamycin (Km) 50 should be mentioned as an example for plants mg / l, hygromycin B 40 mg / l, phosphinothricin (Ppt) 6 mg / l.
Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d. h. zu einer Selektion transformierter Organismen befähigt sind. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen.
- 1. Verbesserter Schutz der Pflanze gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), Calciumabhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyltransferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREB1A-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphatsynthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 2. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich, zum Beispiel die Expression von Phytase und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodierende cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äquivalente derselben.
- 3. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten,
Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder
Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine in der
Epidermis des Embryos. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate
(Abwehr von Herbivoren), Chitinasen oder Glucanasen und
andere Enzyme die die Zellwand von Parasiten zerstören,
Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der
pflanzlichen Resistenz- und Stressreaktion, wie sie bei
Verletzung oder mikrobiellen Befall von Pflanzen oder chemisch
durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen
induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie
zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozm aus verschiedenenen
Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis
Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea
Trypsininhibitor), Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin,
Schneeglöckchenlectin, Weizenkeimagglutinin, RNAsen oder
Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die
chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-
No.: 578423) oder für das N-hydroxylierende,
multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) Proteine aus Sorghum bicolor
(GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente
derselben kodieren.
Bekannt ist die Akkumulation von Glucosinolaten in Pflanzen der Gattung der Cardales insbesondere der Ölsaaten zum Schutz vor Schädlingen (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42: 93-113; Menard R et al. (1999) Phytochemistry 52: 29-35), die Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35 S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197).
Durch Expression des Lectins Agglutinin aus Schneeglöckchen (Galanthus nivalis) kann eine Resistenz gegen Schädlinge wie den Reisschädling Nilaparvata lugens beispielsweise in transgenen Reispflanzen erreicht werden (Rao et al. (1998) Plant J. 15(4): 469-77.). Nilaparvata lugens zählt zu den Phloem- saugenden Schädlingen und fungiert darüberhinaus als Überträger bedeutender Virus-bedingter Pflanzenkrankheiten.
Die Expression synthetischer cryIA(b) and cryIA(c) Gene, die für Lepidopteren-spezifische delta-Endotoxine aus Bacillus thuringiensis kodieren, kann in verschiedene Pflanzen eine Resistenz gegen Schadinsekten bewirken. So kann in Reis eine Resistenz gegen zwei der wichtigsten Reisschädlinge, den gestreiften Stengelbohrer (Chilo suppressalis) und den gelben Stengelbohrer (Scirpophaga incertulas), erzielt werden (Cheng X et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(6): 2767-2772; Nayak P et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2111-2116). - 4. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Feinchemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotiniden bewirken. Beispielhaft sei die Phytoendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 5. Produktion von Neutraceuticals wie zum Beispiel polyungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z. B. das methioninreiche 2S Albumingens der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No.: AB044391), die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15: 39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), die Δ5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), die Δ5-Fettsäuredesaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.-No.: AF078796), die Δ5-Desaturase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 6. Produktion von Feinchemikalien (wie beispielsweise Enzymen) und Pharmazeutika (wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92). Beispielsweise konnte rekombinantes Avidin aus Hühnereiweiß und bakterieller β-Glucuronidase (GUS) in großen Maßstab in transgenen Maispflanzen produziert werden (Hood et al. (1999) Adv Exp Med Biol 464: 127-47. Review.). Diese rekombinanten Proteine aus Maispflanzen werden von der Firma Sigma (Sigma Chemicals Co.) als hochreine Biochemikalien vertrieben.
- 7. Erreichen einer erhöhten Speicherfähigkeit in Zellen, die normalerweise weniger Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substanzen zu erhöhen, zum Beispiel durch Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
- 1. Improved protection of the plant against abiotic stress factors such as drought, heat, or cold, for example by overexpression of the "antifreeze polypeptides from Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, the Arabidopsis thaliana transcription activator CBF1, glutamate dehydrogenases (WO 97/00512) , WO 98/11240), calcium-dependent protein kinase genes (WO 98/26045), calcineurins (WO 99/05902), farnesyltransferases (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), ferritin ( Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), oxalate oxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREB1A factor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), genes of mannitol or trehalose synthesis such as trehalose phosphate synthase or trehalose phosphate phosphatase (WO 97/42326), or by inhibiting genes such as trehalase (WO 97/50561) Especially before There are nucleic acids encoding the transcriptional activator CBF1 from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: U77378) or the "antifreeze protein" from Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No .: AF306348) or functional equivalents thereof.
- 2. Expression of metabolic enzymes for use in the feed and food sector, for example the expression of phytase and cellulases. Nucleic acids such as the artificial cDNA coding for a microbial phytase (GenBank Acc.-No .: A19451) or functional equivalents thereof are particularly preferred.
- 3. Achieving resistance, for example, to fungi, insects, nematodes and diseases through the targeted secretion or accumulation of certain metabolites or proteins in the epidermis of the embryo. Examples include glucosinolates (defense against herbivores), chitinases or glucanases and other enzymes that destroy the cell wall of parasites, ribosome-inactivating proteins (RIPs) and other proteins of the plant resistance and stress reaction, such as those caused by injury or microbial attack on plants or chemically induced by, for example, salicylic acid, jasmonic acid or ethylene, lysozymes from non-plant sources such as, for example, T4 lysozyme or lysozyme from various mammals, insecticidal proteins such as Bacillus thuringiensis endotoxin, α-amylase inhibitor or protease inhibitors (cowpea trypsin inhibitor L, such as gline) Phytohemagglutinin, snowdrop lectin, wheat germ agglutinin, RNAsen or ribozymes. Nucleic acids which are particularly preferred are those for the chit42 endochitinase from Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No .: 578423) or for the N-hydroxylating, multifunctional cytochrome P-450 (CYP79) proteins from Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No .: U32624) or encode their functional equivalents.
The accumulation of glucosinolates in plants of the Cardales genus, in particular oilseeds for protection against pests, is known (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42: 93-113; Menard R et al. (1999) Phytochemistry 52: 29- 35), the expression of the Bacillus thuringiensis endotoxin under the control of the 35 S CaMV promoter (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) or the protection of the tobacco against fungal attack by expression of a chitinase from the bean under the control of the CaMV promoter (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197).
Expression of the lectin agglutinin from snowdrops (Galanthus nivalis) can achieve resistance to pests such as the rice pest Nilaparvata lugens, for example, in transgenic rice plants (Rao et al. (1998) Plant J. 15 (4): 469-77.). Nilaparvata lugens is one of the phloem-sucking pests and also acts as a carrier of important virus-related plant diseases.
The expression of synthetic cryIA (b) and cryIA (c) genes which code for lepidopteran-specific delta endotoxins from Bacillus thuringiensis can cause resistance to insect pests in various plants. In rice, resistance to two of the most important rice pests, the striped stem borer (Chilo suppressalis) and the yellow stem borer (Scirpophaga incertulas), can be achieved (Cheng X et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 (6): 2767 -2772; Nayak P et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2111-2116). - 4. Expression of genes which cause the accumulation of fine chemicals, such as tocopherols, tocotrienols or carotenoids. The phytoendesaturase may be mentioned as an example. Preferred are nucleic acids which code for the phytoendesaturase from Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No .: X78815) or functional equivalents thereof.
- 5.Production of neutraceuticals such as polyunsaturated fatty acids such as arachidonic acid or EP (eicosapentaenoic acid) or DHA (docosahexaenoic acid) by expressing fatty acid elongases and / or desaturases or production of proteins with improved nutritional value such as a high proportion of essential amino acids ( e.g. the methionine-rich 2S albumingens of Brazil nut). Preferred nucleic acids are those for the methionine-rich 2S albumin from Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No .: AB044391), the Δ6-acyl lipid desaturase from Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No .: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15 : 39-48), the Δ6-desaturase from Mortierella alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), the Δ5-desaturase from Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), the Δ5-fatty acid desaturase (des-5) from Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.-No .: AF078796), the Δ5-desaturase from Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), the Δ6-elongase from Caenorhabditis elegans ( Beaudoin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), which encode Δ6 elongase from Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) or functional equivalents thereof.
- 6. Production of fine chemicals (such as enzymes) and pharmaceuticals (such as antibodies or vaccines as described in Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND ( 1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92). For example, recombinant avidin from chicken protein and bacterial β-glucuronidase (GUS) could be produced on a large scale in transgenic maize plants (Hood et al. (1999) Adv Exp Med Biol 464: 127-47. Review.). These recombinant proteins from maize plants are sold by Sigma (Sigma Chemicals Co.) as high-purity biochemicals.
- 7. Achieving increased storage capacity in cells that normally contain fewer storage proteins or lipids with the aim of increasing the yield of these substances, for example by expression of an acetyl-CoA carboxylase. Preference is given to nucleic acids which code for Medicago sativa acetyl-CoA carboxylase (Accase) (GenBank Acc.-No .: L25042) or functional equivalents thereof.
Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96. Further examples of advantageous genes are mentioned, for example at Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Pages 487-96.
Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren bzw. Proteine exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d. h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer Signaltransduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen. Funktionelle Analoga meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch einer Signalpeptidsequenz kodieren. Furthermore, functional analogs of the nucleic acids mentioned can or proteins are expressed. Functional analogs mean here all the sequences that have essentially the same function d. H. to the function (for example a substrate conversion or a signal transduction) are also capable as an example called protein. The functional analogue can distinguish other characteristics. For example it can have a higher or lower activity or also about have additional functionalities. Functional analogues also means Sequences for fusion proteins consisting of one of the preferred proteins and other proteins for example another preferred protein or a signal peptide sequence encode.
Die Expression der Nukleinsäuren unter Kontrolle der
Erfindungsgemäßen Promotoren ist in jedem gewünschten Zellkompartiment, wie
z. B. dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten
möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges sind gewünschte
Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen u. ä. möglich. Auch
die Sekretion des Zielproteins zur Zelloberfläche bzw. die
Sezernierung ins Kulturmedium, beispielsweise bei Nutzung
suspensionskultivierter Zellen oder Protoplasten ist möglich. Die dafür
notwendigen Targetsequenzen können sowohl in einzelnen
Vektorvariationen berücksichtigt werden als auch durch Verwendung einer
geeigneten Klonierungsstrategie gemeinsam mit dem zu klonierenden
Zielgen in den Vektor mit eingebracht werden. Als Targetsequenzen
können sowohl Gen eigene, sofern vorhanden, oder heterologe
Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe zur funktionellen
Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen
sind weitere Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der
subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden,
im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im
Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie
Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem
Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und
dergleichen. Das Verfahren, an sich nicht in den Plastiden
lokalisierte Proteine, gezielt in die Plastiden zu transportieren ist
beschrieben (Klosgen RB und Weil JH (1991) Mol Gen Genet
225(2): 297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol.
38(3): 491-496). Bevorzugte Sequenzen sind:
- a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonnenblume
- b) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen Fettsäurebiosynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP), die Stearyl-ACP-Desaturase, β-Ketoacyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase.
- c) das Transitpeptid für GBSSI ("Starch Granule Bound Synthase I")
- d) LHCP II Gene.
- a) Small subunit (SSU) of ribulose bisphosphate carboxylase (Rubisco ssu) from pea, corn, sunflower
- b) Transit peptides derived from genes of plant fatty acid biosynthesis such as the transit peptide of the plastid "acyl carrier protein" (ACP), the stearyl-ACP desaturase, β-ketoacyl-ACP synthase or the acyl-ACP thioesterase.
- c) the transit peptide for GBSSI ("Starch Granule Bound Synthase I")
- d) LHCP II genes.
Die Zielsequenzen können mit anderen, von dem Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedenen, Targeting-Sequenzen verknüpft sein, um eine subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten zu gewährleisten. Ferner können sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen zum Einsatz kommen. The target sequences can be shared with others from the transit peptide coding sequences linked to different targeting sequences to be a subcellular localization in the apoplast, in the Vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic Reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or others To ensure compartments. Furthermore, as well Translation enhancers such as the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) and the like are used.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch antisense reprimieren muss. Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(4): 1495-500). Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens. So kann man die gewünschten Effekte auch durch Expression eines entsprechenden Zinkfinger- Transkriptionsfaktor unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren erreichen. The person skilled in the art is also aware that he described the above Genes not directly using the coding for these genes Express nucleic acid sequences or for example by antisense must repress. It can also be artificial, for example Use zinc finger protein type transcription factors (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 (4): 1495-500). These factors are reflected in the regulatory areas of endogenous genes to be expressed or repressed and depending on the design of the factor, cause an expression or Repression of the endogenous gene. So you can get the ones you want Effects also by expression of a corresponding zinc finger Transcription factor under the control of one of the invention Reach promoters.
Die erfindungsgemäßen Expressionkassetten können ebenso zur Unterdrückung bzw. Reduktion von Replikation oder/und Translation von Targetgenen durch "gene silencing" eingesetzt werden. The expression cassettes according to the invention can also be used for Suppression or reduction of replication or / and translation of target genes can be used by "gene silencing".
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können auch eingesetzt werden, um Nukleinsäuren zu exprimieren, die sogenannte "antisense" Effekte vermitteln und so beispielsweise zur Verminderung der Expression eines Zielprotein befähigt sind. The expression cassettes according to the invention can also be used to express nucleic acids, the so-called Mediate "antisense" effects and thus, for example, for reduction are capable of expressing a target protein.
Bevorzugte Gene bzw. Proteine, deren Suppression einen
vorteilhaften Phänotyp bedingt, umfassen beispielshaft, aber nicht
einschränkend:
- a) Polygalakturonase zur Verhinderung von Zellabbau und "Matschig"-werden von Pflanzen und Früchten bespielsweise Tomaten. Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die des Polygalakturonase-Gens der Tomate (GenBank Acc.-No.: X14074) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
- b) Verminderung der Expression von allergenen Proteinen wie beispielsweise beschrieben bei Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391(3): 341-345 oder Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60(8): 1215-1221ö.
- c) Veränderung der Blütenfarbe durch Suppression der Expression von Enzymen der Anthocyanbiosynthese. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Forkmann G, Martens S. (2001) Curr Opin Biotechnol 12(2): 155-160). Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die der Flavonoid-3'-hydroxylase (GenBank Acc.-No.: AB045593), der Dihydroflavanol-4-reduktase (GenBank Acc.-No.: AF017451), der Chalconisomerase (GenBank Acc.-No.: AF276302), der Chalconsynthase (GenBank Acc.-No.: AB061022), der Flavanone-3-betahydroxylase (GenBank Acc.-No.: X72592) oder der Flavonesynthase II (GenBank Acc.-No.: AB045592) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
- d) Verschiebung des Amylose/Amylopektingehaltes in Stärke durch Suppression des Verzweigungsenzyms Q, das für die α-1,6-glykosidische Verknüpfung verantwortlich ist. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Schwall GP et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5): 551-554). Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die des Starch branching enzyme II der Kartoffel (GenBank Acc.-No.: AR123356; US 6,169,226) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
- a) Polygalacturonase to prevent cell degradation and "mushy" plants and fruits, for example tomatoes. Nucleic acid sequences such as that of the tomato polygalacturonase gene (GenBank Acc. No .: X14074) or its homologs from other genera and species are preferably used for this purpose.
- b) Reduction of the expression of allergenic proteins as described for example in Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391 (3): 341-345 or Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60 (8): 1215-1221ö.
- c) Change in flower color by suppression of the expression of enzymes in anthocyanbiosynthesis. Appropriate procedures are described (for example, in Forkmann G, Martens S. (2001) Curr Opin Biotechnol 12 (2): 155-160). Nucleic acid sequences such as that of flavonoid 3'-hydroxylase (GenBank Acc.-No .: AB045593), dihydroflavanol-4-reductase (GenBank Acc.-No .: AF017451), chalcone isomerase (GenBank Acc.-No. : AF276302), chalcone synthase (GenBank Acc.-No .: AB061022), flavanone-3-beta-hydroxylase (GenBank Acc.-No .: X72592) or Flavonesynthase II (GenBank Acc.-No .: AB045592) or its homologue used from other genera and species.
- d) Shift in the amylose / amylopectin content in starch by suppression of the branching enzyme Q, which is responsible for the α-1,6-glycosidic linkage. Appropriate procedures are described (for example in Schwall GP et al. (2000) Nat Biotechnol 18 (5): 551-554). Nucleic acid sequences such as that of the Starch branching enzyme II of the potato (GenBank Acc.-No .: AR123356; US 6,169,226) or its homologs from other genera and species are preferably used for this purpose.
Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nukleinsäuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges besagten Zielproteins komplementär ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternative cDNA oder das korrespondierendes Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende antisense- Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "antisense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des Zielproteins oder einem Teil desselben. Die "antisense" Nukleinsäure kann aber auch zu der nicht-kodierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenzinformation zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nukleinsäure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Eine antisense Nukleinsäure kann komplementär zu der gesamten oder einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines Zielproteins sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die antisense Nukleinsäure ein Oligonukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden. An "antisense" nucleic acid means one at first Nucleic acid sequence wholly or partly to at least part of the "sense" strands of said target protein is complementary. the Those skilled in the art are known to use alternative cDNA or the corresponding gene as the starting template for corresponding antisense Can use constructs. The "antisense" is preferred Nucleic acid complementary to the coding region of the target protein or part of the same. The "antisense" nucleic acid can also to the non-coding region or a part thereof to be complementary. Based on the sequence information for a Target protein, can contain an antisense nucleic acid Consideration of the base pair rules of Watson and Crick in the expert be designed in a common manner. An antisense nucleic acid can be complementary to all or part of the Nucleic acid sequence of a target protein. In a preferred one In one embodiment, the antisense nucleic acid is an oligonucleotide a length of, for example, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 Nucleotides.
Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform α-anomere Nukleinsäuremoleküle. α-Anomere Nukleinsäuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). The antisense nucleic acid comprises in a preferred Embodiment α-anomeric nucleic acid molecules. α-anomer Nucleic acid molecules form special double-stranded hybrids complementary RNA in which, in contrast to the normal β-units Strands run parallel to each other (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641).
Ebenso umfasst ist die Verwendung der oben beschriebenen Sequenzen in sense-Orientierung, was wie dem Fachmann geläufig ist, zu einer Kosuppression führen kann. In Tabak, Tomate und Petunie ist demonstriert worden, dass die Expression von sense-RNA zu einem endogenen Gen, die Expression desselben vermindern oder ausschalten kann, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Goring et al. (1991) Proc. Natl Acad Sci USA, 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-299). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu verminderne Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. The use of those described above is also included Sequences in sense orientation, which is familiar to the person skilled in the art can lead to co-suppression. In tobacco, tomato and petunia is it has been demonstrated that the expression of sense RNA results in a endogenous gene that reduce expression of the same or can switch off, similar to that described for antisense approaches (Goring et al. (1991) Proc. Natl Acad Sci USA, 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-299). The introduced construct can do that represent the reduced gene in whole or in part. The Possibility of translation is not necessary.
Ganz besonders bevorzugt ist auch die Verwendung von Verfahren wie der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double- stranded RNA interference"). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z. B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; Wo 99/32619; Wo 99/53050; Wo 00/68374; Wo 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Einbringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unterdrückung nativer Gene bewirkt. The use of methods is also very particularly preferred such as gene regulation using double-stranded RNA ("double- stranded RNA interference "). Corresponding methods are the Known to those skilled in the art and described in detail (e.g. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; Where 99/32619; Where 99/53050; Where 00/68374; Where 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). To those in the procedures and methods described quotations expressly referred. Here is through simultaneous contribution of strand and counter strand a highly efficient suppression native genes.
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner NK. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer anti-sense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 und EP-A1 0 360 257. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460) beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al., Plant Mol Biol. 1992; 18(2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al., Mol Gen Genet. 1994 Mar; 242(6): 653-657). Beispielhaft sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119 mRNA können selektioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418). The antisense strategy can be advantageous with one Ribozyme processes are coupled. Ribozymes are catalytically active RNA Sequences that are linked to the antisense sequences that Split target sequences catalytically (Tanner NK. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257-75). This can make an anti-sense more efficient Increase strategy. Expression of ribozymes for reduction certain proteins are known to the person skilled in the art and for example described in EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 and EP-A1 0 360 257. Suitable target sequences and ribozymes can be, for example, like by Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460), by secondary structure calculations of ribozyme and target RNA as well as by their interaction (Bayley CC et al., Plant Mol Biol. 1992; 18 (2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al., Mol Gen Genet. 1994 Mar; 242 (6): 653-657). Are exemplary To call "hammerhead" ribozymes (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Preferred ribozymes are based on derivatives of Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Further Ribozymes with selectivity for an L119 mRNA can be selected (Bartel D and Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).
In einer weiteren Ausführungsform kann Verminderung der Zielprotein-Expression unter Verwendung von Nukleinäsuresequenzen bewirkt werden, die komplementär zu regulativen Elementen der Zielprotein-Gene sind, mit diesen eine triple-helikale Struktur ausbilden und so die Gen-Transkription verhindern (Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12): 807-815). In a further embodiment, reduction in the Target protein expression using nucleic acid sequences are brought about, which are complementary to the regulatory elements of the Target protein genes are, with these, a triple-helical structure educate and thus prevent gene transcription (Helene C (1991) Anticancer drug des. 6 (6): 569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14 (12): 807-815).
Die erfindungsgemässen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. The expression cassettes according to the invention and those of them derived vectors can contain further functional elements.
Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all
solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung
oder Funktion der erfindungsgemässen Expressionskoassetten oder
von diesen abgeleitete Vektoren oder Organismen haben.
Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
- a) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine
kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung
der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder
-zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind
dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch
Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie
- - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228).
- - Chloramphenicoltransferase (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828),
- - Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859); erlaubt Bioluminescenzdetektion.
- - β-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
- - β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das uidA Gen, das ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate kodiert.
- - R-Locus Genprodukt: Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, lBth Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988).
- - β-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741), Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin).
- - xylE Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105), Catecholdioxygenase, die chromogene Catechole umsetzen kann.
- - Alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241-242).
- - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
- - Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
- b) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
- c) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen", die einen Agrobakterien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
- d) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen.
- a) Reporter genes, which code for easily quantifiable proteins and ensure an assessment of the transformation efficiency, the place of expression or the point in time via self-color or enzyme activity. Genes coding for reporter proteins are very particularly preferred (see also Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) such as
- "Green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5): 912-8, 1997; Sheen et al. ( 1995) Plant Journal 8 (5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12) : 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228).
- Chloramphenicol transferase (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828),
- - Luciferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859); allows bioluminescence detection.
- - β-galactosidase, encoded for an enzyme for which various chromogenic substrates are available.
- β-glucuronidase (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) or the uidA gene, which encodes an enzyme for various chromogenic substrates.
- - R-Locus gene product: protein that regulates the production of anthocyanin pigments (red color) in plant tissue and thus enables a direct analysis of the promoter activity without the addition of additional auxiliaries or chromogenic substrates (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, lBth Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988).
- β-lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741), enzyme for various chromogenic substrates (e.g. PADAC, a chromogenic cephalosporin).
- - xylE gene product (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105), catechol dioxygenase, which can convert chromogenic catechols.
- Alpha amylase (Ikuta et al. (1990) Bio / technol. 8: 241-242).
- - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714), enzyme that oxidizes tyrosine to DOPA and dopaquinone, which consequently form the easily detectable melanin.
- - Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268), can be used in calcium-sensitive bioluminescence detection.
- b) Origins of replication, which ensure an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli. Examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori or P15A ori (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
- c) Elements, for example “border sequences”, which enable agrobacterium-mediated transfer into plant cells for the transfer and integration into the plant genome, such as, for example, the right or left border of the T-DNA or the vir region.
- d) Multiple cloning regions (MCS) allow and facilitate the insertion of one or more nucleic acid sequences.
Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfindungsgemässen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion eines der erfindungsgemäßen Promotoren (oder eines funkrionellen Äquivalentes oder funktionell äquivalenten Teilsgemäss SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder eines funktionellen Äquivalentes mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer für eine Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M. L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Various ways are known to the person skilled in the art to achieve a expression cassette according to the invention. The production an expression cassette according to the invention for example by fusion of one of the promoters according to the invention (or of a functional equivalent or a functional equivalent Partly in accordance with SEQ ID NO: 1, 2 or 3 or a functional one Equivalent with a nucleotide sequence to be expressed, optionally a sequence coding for a transit peptide, preferably a chloroplast-specific transit peptide, which preferably between the promoter and the respective Nucleotide sequence is arranged, as well as a terminator or Polyadenylation signal. Common recombination and Cloning techniques such as those described in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) as well as in T.J. Silhavy, M. L. Berman and L.W. Enquist, experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungsgemässe Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides in der Pflanze steuert. Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird die Expression des bestimmten Polypeptides in Pflanzen herrunterreguliert oder ausgeschaltet. However, there are also those under an expression cassette Understand constructions in which the promoter is used without it functional with a nucleic acid sequence to be expressed was linked, for example via a targeted homologue Recombination or a random insertion into a host genome becomes regulatory control over with it then functional linked nucleic acid sequences takes over and the transgenic Expression controls same. By inserting the promoter - to Example by homologous recombination - before one for one a certain polypeptide encoding nucleic acid is obtained Expression cassette according to the invention, the expression of controls certain polypeptides in the plant. Furthermore, the Insertion of the promoter also take place in such a way that antisense RNA the nucleic acid encoding a particular polypeptide is expressed. This expresses the particular polypeptide down regulated in plants or switched off.
Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den endogenen, natürlichen Promotor plaziert werden, wodurch man eine erfindungsgemässe Expressionskassette erhält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäureseuquenz in den Keimblättern des pflanzlichen Embryos steuert. Analogously, a transgene can also be expressed Nucleic acid sequence for example by homologous recombination behind the endogenous, natural promoter can be placed, resulting in a Expression cassette according to the invention receives the expression the transgenic nucleic acid sequence to be expressed in the Controls cotyledons of the plant embryo.
Erfindungsgemäss sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien sein. According to the invention are also vectors that described above Expression cassettes included. Vectors can be exemplary Plasmids, cosmids, phages, viruses or even agrobacteria.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen Expressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen. Another object of the invention relates to transgenic Organisms transformed with at least one according to the invention Expression cassette or a vector according to the invention, and Cells, cell cultures, tissues, parts - such as in vegetable organisms leaves, roots etc. - or Propagation material derived from such organisms.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze. Under organism, parent or host organisms prokaryotic or eukaryotic organisms, such as Microorganisms or plant organisms understood. preferred Microorganisms are bacteria, yeast, algae or fungi.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis. Preferred bacteria are bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes or Cyanobacteria, for example, of the genus Synechocystis.
Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Kassetten befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismen sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agrobakterium tumefaciens. Especially preferred are microorganisms that are used for infection of plants and thus for the transfer of the invention Cassettes are capable. Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from Art Agrobacterium tumefaciens.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia. Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, or Hansenula Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze. Preferred mushrooms are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) on page 15, table 6 described mushrooms.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. Preferred host or as transgenic organisms The main organisms are plants. Included in the Invention all genera and species higher and lower Plants of the plant kingdom. The tires are also included Plants, seeds, sprouts and seedlings, as well as thereof derived parts, propagation material and cultures, for example Cell cultures. Mature plants mean plants to any Developmental stage beyond the seedling. Seedling means a young, immature plant at an early stage of development.
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die Expression von Genen ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae. Annual, perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants are preferred host organisms for the production of transgenic Plants. The expression of genes is also advantageous in all ornamental plants, useful or ornamental trees, flowers, Cut flowers, shrubs or lawn. Exemplary but not restrictive May be mentioned angiosperms, bryophytes such as Hepaticae (liverwort) and Musci (moss); Pteridophytes like ferns, Horsetail and lycopods; Gymnosperms like conifers, cycads, Ginkgo and Gnetalen; Algae such as Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatoms) and Euglenophyceae.
Pflanzen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielhaft und nicht einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr. Plants within the scope of the invention include examples and not restricting the families of Rosaceae like Rose, Ericaceae like Rhododendrons and azaleas, Euphorbiaceae such as poinsettias and Croton, Caryophyllaceae like cloves, Solanaceae like petunias, Gesneriaceae like the African violet, Balsaminaceae like that Balsam, orchidaceae like orchids, iridaceae like gladiolus, iris, Freesia and crocus, Compositae like marigold, Geraniaceae like Geraniums, Liliaceae like the dragon tree, Moraceae like ficus, Araceae like Philodendron and others more.
Beispielhaft aber nicht einschränkend für Blütenpflanzen seien zu nennen die Familien der Leguminosae wie Erbse, Alfalfa und Soja; Gramineae wie Reis, Mais, Weizen; Solanaceae wie Tabak und andere mehr; die Familie der Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; die Familie der Solanacea, besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr; die Familie der Leguminosae, besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) und andere mehr; und die Familie der Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli); und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana und andere mehr; die Familie der Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art Sativa (Salat) und andere mehr. Exemplary but not restrictive for flowering plants name the families of leguminosae such as pea, alfalfa and soy; Gramineae such as rice, corn, wheat; Solanaceae like tobacco and others more; the Umbelliferae family, especially the genus Daucus (especially the species carota (carrot)) and Apium (whole especially the species graveolens dulce (Selaria)) and others more; the Family of the Solanacea, especially the genus Lycopersicon, whole especially the species esculentum (tomato) and the genus Solanum, whole especially the species tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and others; and the genus Capsicum, especially the species annum (pepper) and others; the Leguminosae family, especially the genus Glycine, especially the species max (Soybean) and others more; and the Cruciferae family, especially the genus Brassica, especially the species campestris (turnip), oleracea cv Tastie (cabbage), oleracea cv Snowball Y (cauliflower) and oleracea cv Emperor (broccoli); and the genus Arabidopsis, especially the species thaliana and others; the family of Compositae, especially the genus Lactuca, especially the species Sativa (salad) and others.
Die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspecies. The transgenic plants according to the invention are in particular selected from monocot crops, such as Cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, maize, Rice or oats and sugar cane. Furthermore, the transgenic plants according to the invention in particular selected from dicotyledonous crops, such as Brassicacae such as rapeseed, cress, arabidopsis, cabbage or canola, Leguminosae such as soy, alfalfa, peas, alfalfa, beans or peanut Solanaceae such as potato, tobacco, tomato, eggplant or paprika, Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula, Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini, as well as flax, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, Carrot, sugar beet and the various tree, nut and Grapevine species.
Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss. Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis and all genera and Species that are used as food or feed, like the cereals described, or for the production of oils, such as oilseeds (such as rapeseed), types of nuts, Soy, sunflower, pumpkin and peanut.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose. Plant organisms in the sense of the invention are still other photosynthetically active competent organisms, such as Example algae or cyanobacteria, as well as mosses.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Preferred algae are green algae, such as algae from Genus Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox or Dunaliella.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtzelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. The production of a transformed organism or one transformed cell requires that the corresponding DNA be in the corresponding host cell is introduced. For this operation, which is called transformation stands for a variety of Methods are available (see also Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). For example, DNA can be direct by microinjection or by bombardment with DNA-coated microparticles are introduced. The cell can also chemically permeabilized, for example with polyethylene glycol so that the DNA can get into the cell by diffusion. The DNA can also be obtained by protoplast fusion with others DNA-containing units such as minicells, cells, or lysosomes Liposomes are done. Electroporation is another suitable method for the introduction of DNA, in which the cells are reversible through a electrical impulse can be permeabilized.
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion. In plants, the methods described are used Transformation and regeneration of plants from plant tissues or Plant cells for transient or stable transformation used. Suitable methods are, above all Protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake biolistic methods with the gene cannon, the so-called particle bombardment method, electroporation, incubation dry embryos in DNA-containing solution and microinjection.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobaterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. In addition to these "direct" transformation techniques, a Transformation also by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes can be performed. These strains contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is based on the plant is transmitted after agrobaterium infection. A part this plasmid, called T-DNA (transferred DNA), is inserted into the Plant cell genome integrated.
Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen. The Agrobacterium -mediated transformation is best for dicotyledons, diploid plant cells suitable, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.
Die Einführung einer erfindungsgemässen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden. The introduction of an expression cassette according to the invention in Cells, preferably in plant cells, can be beneficial under Using vectors can be realized.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen. In an advantageous embodiment, the introduction of Expression cassette realized using plasmid vectors. Prefers are such vectors that provide stable integration of the Enable expression cassette into the host genome.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet. In the case of injection or electroporation of DNA into plant cells are no special requirements for the used Plasmid. Simple plasmids like the pUC series can be used. Should whole plants from the transformed cells are regenerated, so it is required that there is an additional selectable marker gene on the plasmid located.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikationsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc. Transformation techniques are different for different monocots and dicotyledonous plant organisms. Also stand different possible plasmid vectors for the introduction of foreign ones Genes available in plants that are usually one Origin of replication for reproduction in E.coli and a marker gene for contain a selection of transformed bacteria. Examples are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 etc.
Die Expressionskassete kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. The expression cassette can be inserted into the vector using a suitable Restriction interface will be introduced. The resulting Plasmid is first introduced into E. coli. Correctly transformed E.coli are selected, grown and the recombinant Plasmid obtained using methods familiar to the person skilled in the art. Restriction analysis and sequencing can serve the Check cloning step.
Transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (Rathore KS et al., Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Transformed cells d. H. those that have the introduced DNA can be integrated into the DNA of the host cell untransformed can be selected if a selectable Marker is part of the DNA introduced. Can be used as a marker exemplary each gene act that resistance to Can confer antibiotics or herbicides. Transformed cells, who express such a marker gene are able to Presence of concentrations of an appropriate antibiotic or survive herbicides that are an untransformed wild type kill. Example are the bar gene that resistance to that Herbicide gives phosphinothricin (Rathore KS et al., Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21 (5): 871-884), the nptII gene that resistance imparts resistance to kanamycin, the hpt gene Hygromycin confers, or the EPSP gene, resistance to the herbicide Gives glyphosate.
Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Depending on the method of DNA introduction, additional genes can be found on the Vector plasmid may be required. If Agrobacteria are used, so the expression cassette is in special plasmids integrate, either into an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or a binary vector. If for example a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, is at least the right boundary, but mostly the right one and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as flanking region with the expression cassette to be inserted connected. Binary vectors are preferably used. binary Vectors can be found in both E.coli and Agrobacterium replicate. They usually contain a selection marker gene and one Left or polylinker flanked by the right and left T-DNA Border sequence. You can go straight to Agrobacterium can be transformed (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). The selection marker gene allows selection transformed Agrobacteria and is for example the nptII gene that confers resistance to kanamycin. In this case as Host organism that acts as Agrobacterium should already be one Contain plasmid with the vir region. This is for the Transfer of T-DNA to the plant cell required. Such a transformed Agrobacterium can be used for transformation plant cells can be used.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.). The use of T-DNA to transform plant cells has been intensively investigated and described (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci. 4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Various Binary vectors are known and some are commercially available such as pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).
Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemässen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-DOG oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist. For the transfer of the DNA to the plant cell herbal explants with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes co-cultivated. Starting from infected Plant material (e.g. leaf, root or stem parts, but also Protoplasts or suspensions of plant cells) can be whole plants using a suitable medium that for example Antibiotics or biocides for selection of transformed cells can contain, be regenerated. The plants obtained can then on the presence of the introduced DNA, here the expression cassette according to the invention. Once the DNA is integrated into the host genome is the corresponding genotype usually stable and the corresponding insertion is also in the successor generations. Usually contains the integrated expression cassette a selection marker that the transformed plant becomes resistant to a biocide (for Example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-DOG or an antibiotic such as kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin or phosphinothricin, etc. The selection marker allows the selection of transformed cells from untransformed ones (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). The Plants obtained can be grown and crossed in the usual way become. Two or more generations should be cultivated to ensure that genomic integration is stable and is heritable.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobakterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711). The methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S. D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) described. Preferably, the construct to be expressed is in one Vector cloned that is suitable for Agrobacterium tumefaciens transform, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Once a transformed plant cell has been made, a whole plant using the skilled person known methods can be obtained. Here you go as an example from callus cultures. From these still undifferentiated Cell masses can cause sprout and root formation in a known manner be induced. The sprouts obtained can be planted out and be bred.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden. The effectiveness of expression of the transgenic expressed Nucleic acids can, for example, in vitro Shoot meristem propagation using one of those described above Selection methods are determined.
Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte. According to the invention are also those described above transgenic organisms derived cells, cell cultures, parts - such as Example with transgenic plant organisms roots, leaves etc. -, and transgenic propagation material such as seeds or fruits.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden. Genetically edible according to the invention which can be consumed by humans and animals modified plants can also, for example, directly or after processing known per se as food or Feed are used.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Another object of the invention relates to the use of Transgenic organisms according to the invention described above and the cells, cell cultures, parts derived from them - such as Example with transgenic plant organisms roots, leaves etc. -, and transgenic propagation material such as seeds or fruits, for the production of food or feed, pharmaceuticals or fine chemicals.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung
von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei
ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen
Expressionskoassetten oder vektoren transformiert wird und diese
Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die
gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der
gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte
Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus
dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für
Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker,
Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und
Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion
von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die
Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus
den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit
dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von
Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben
bei Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999
Aug; 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol.
1999; 236: 275-92.
Sequenzen
Also preferred is a process for the recombinant production of pharmaceuticals or fine chemicals in host organisms, wherein a host organism is transformed with one of the expression coassettes or vectors described above and this expression cassette contains one or more structural genes which code for the desired fine chemical or catalyze the biosynthesis of the desired fine chemical, the transformed host organism is grown and the desired fine chemical is isolated from the growth medium. This process is widely applicable to fine chemicals such as enzymes, vitamins, amino acids, sugars, fatty acids, natural and synthetic flavors, aromas and colors. The production of tocopherols and tocotrienols and carotenoids is particularly preferred. The transformed host organisms are grown and isolated from the host organisms or from the growth medium using methods known to those skilled in the art. The production of pharmaceuticals, such as antibodies or vaccines, is described by Hood EE, Jilka JM. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol Immunol. 1999; 236: 275-92. sequences
Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467). The chemical synthesis of oligonucleotides can, for example, in a known manner, according to the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd Edition, Wiley Press New York, pages 896-897). The in Performed within the scope of the present invention Cloning steps such as B. restriction splits, Agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids on nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, Propagation of phages and sequence analysis of recombinant DNA will be as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6. The Recombinant DNA molecules are sequenced using a Laser fluorescence DNA sequencer from ABI using the method of Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).
Zur Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana werden
ca. 0,25 g Blattmaterial junger Pflanzen im vegetativen Stadium
in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert. Das
pulverisierte Pflanzenmaterial wird zusammne mit 1 ml 65°C-warmem CTAB
I-Puffer (CTAB: Hexadecyltrimethylammoniumbromid, auch genannt
Cetyltrimethylammoniumbromid; Sigma Kat.-Nr.: H6269) und 20 µl
β-Mercaptoethanol in einen vorgewärmten zweiten Mörser gegeben
und nach vollständiger Homogenisierung wird der Extrakt in ein 2
ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 1 h bei 65°C unter
regelmäßiger, vorsichtiger Durchmischung inkubiert. Nach Abkühlung auf
Raumtemperatur wird der Ansatz mit 1 ml Chloroform/Octanol (24 : 1,
mit 1 M Tris/HCl, pH8,0 ausgeschüttelt) durch langsames
Invertieren extrahiert und zur Phasentrennung für 5 min bei 8.500 rpm
(7.500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wird
die wäßrige Phase erneut mit 1 ml Chloroform/Octanol extrahiert,
zentrifugiert und durch Invertieren mit 1/10 Volumen auf 65°C
vorgewärmtem CTAB II-Puffer sorgfältig gemischt. Anschließend wird
der Ansatz durch vorsichtige Schwenken mit 1 ml Chloroform/
Octanol-Gemisch (siehe oben) versetzt und zur erneuten Phasentrennung
für 5 min bei 8.500 rpm (7.500 × g) und Raumtemperatur
zentrifugiert. Die wäßrige untere Phase wird in ein frisches Eppendorff-
Gefäß überführt und die obere organische Phase wird in einem
frischen Eppendorff-Gefäß erneut für 15 min bei 8.500 rpm (7.500 ×
g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die hieraus resultiernde
wäßrige Phase wird mit der wäßrigen Phase des vorherigen
Zentrifugationsschrittes vereinigt und der gesamte Ansatz mit exakt
demselben Volumen vorgewärmtem CTAB III-Puffer versetzt. Es folgt
eine Inkubation bei 65°C, bis die DNA in Flocken ausfällt. Dies
kann bis zu 1 h dauern oder durch Inkubation bei 37°C über Nacht
erfolgen. Das aus dem anschließenden Zentrifugationsschritt
(5 min. 2000 rpm (500 × g), 4°C) resultierende Sediment wird mit
250 µl auf 65°C vorgewärmtem CTAB IV-Puffer versetzt und für
mindestens 30 min bzw. bis zur vollständigen Auflösung des Sediments
bei 65°C inkubiert. Anschließend wird die Lösung zur Fällung der
DNA mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol vermischt und für 1 h bei
-20°C inkubiert. Alternativ kann der Ansatz mit 0.6 Volumina
Isopropanol vermischt und ohne weitere Inkuabtion sofort für 15 min
bei 8.500 rpm (7.500 × g) und 4°C zentrifugiert werden. Das
sedimentierte DNA wird durch Invertieren des Eppendorff-Gefäßes
zweimal mit je 1 ml 80%igem eiskaltem Ethanol gewaschen, nach jedem
Waschschritt erneut zentrifugiert (5 min. 8.500 rpm (7.500 × g),
4°C) und anschließend für ca. 15 min luftgetrocknet. Abschließend
wird die DNA in 100 µl TE mit 100 µg/ml RNase resuspendiert und
für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA Lösung ist nach
einer weiteren Inkubationsphase über Nacht bei 4°C homogen und
kann für weiterführende Experimente verwendet werden.
Lösungen für CTAB:
Lösung I (für 200 ml):
100 mM Tris/HCl pH 8,0 (2,42 g)
1,4 M NaCl (16,36 g)
20 mM EDTA (8,0 ml von 0,5 M Stammlösung)
2%(w/v) CTAB (4,0 g)
Jeweils vor der Verwendung werden frisch zusetzen: 2%
β-Mercaptoethanol (20 µl für 1 ml Lösung I).
Lösung II (für 200 ml):
0,7 M NaCl (8,18 g)
10%(w/v) CTAB (20 g)
Lösung III (für 200 ml):
50 mM Tris/HCl pH 8,0 (1,21 g)
10 mM EDTA (4 ml 0,5 M von 0,5 M Stammlösung)
1% (w/v) CTAB (2,0 g)
Lösung IV (High-salt TE) (für 200 ml):
10 mM Tris/ HCl pH 8,0 (0,242 g)
0,1 mM EDTA (40 µl 0.5 M Stammlösung)
1 M NaCl (11, 69 g)
Chloroform/Octanol (24 : 1) (für 200 ml)
192 ml Chloroform
8 ml Octanol
Die Mischung wird 2x mit 1 M TrisHCl pH 8,0 ausschüttelt und
vor Licht geschützt gelagert.
For the isolation of genomic DNA from Arabidopsis thaliana, approx. 0.25 g leaf material of young plants in the vegetative stage are ground into fine powder in liquid nitrogen. The pulverized plant material is put together with 1 ml of 65 ° C warm CTAB I buffer (CTAB: hexadecyltrimethylammonium bromide, also called cetyltrimethylammonium bromide; Sigma cat.-no .: H6269) and 20 µl β-mercaptoethanol in a pre-warmed second mortar and after complete Homogenization, the extract is transferred to a 2 ml Eppendorf tube and incubated for 1 h at 65 ° C with regular, careful mixing. After cooling to room temperature, the mixture is extracted with 1 ml of chloroform / octanol (24: 1, shaken out with 1 M Tris / HCl, pH 8.0) by slow inverting and for phase separation for 5 min at 8,500 rpm (7,500 × g) and room temperature centrifuged. The aqueous phase is then extracted again with 1 ml of chloroform / octanol, centrifuged and mixed thoroughly by inverting with 1/10 volume of CTAB II buffer preheated to 65 ° C. Then the mixture is mixed carefully with 1 ml of chloroform / octanol mixture (see above) and centrifuged for 5 min at 8,500 rpm (7,500 × g) and room temperature to separate the phases again. The aqueous lower phase is transferred to a fresh Eppendorff tube and the upper organic phase is centrifuged again in a fresh Eppendorff tube for 15 min at 8,500 rpm (7,500 × g) and room temperature. The resulting aqueous phase is combined with the aqueous phase from the previous centrifugation step and the entire batch is mixed with exactly the same volume of preheated CTAB III buffer. This is followed by incubation at 65 ° C until the DNA precipitates in flakes. This can take up to 1 h or can be done by incubating at 37 ° C overnight. The sediment resulting from the subsequent centrifugation step (5 min. 2000 rpm (500 × g), 4 ° C.) is mixed with 250 μl of CTAB IV buffer preheated to 65 ° C. and for at least 30 min or until the sediment has completely dissolved incubated at 65 ° C. The solution for precipitating the DNA is then mixed with 2.5 volumes of ice-cold ethanol and incubated for 1 h at -20 ° C. Alternatively, the batch can be mixed with 0.6 volumes of isopropanol and centrifuged immediately for 15 min at 8,500 rpm (7,500 × g) and 4 ° C without further incubation. The sedimented DNA is washed twice with 1 ml of 80% ice-cold ethanol by inverting the Eppendorff tube, centrifuged again after each washing step (5 min. 8,500 rpm (7,500 × g), 4 ° C) and then for approx. 15 min air-dried. Finally, the DNA is resuspended in 100 µl TE with 100 µg / ml RNase and incubated for 30 min at room temperature. After a further incubation phase at 4 ° C overnight, the DNA solution is homogeneous and can be used for further experiments.
Solutions for CTAB:
Solution I (for 200 ml):
100 mM Tris / HCl pH 8.0 (2.42 g)
1.4 M NaCl (16.36 g)
20 mM EDTA (8.0 ml of 0.5 M stock solution)
2% (w / v) CTAB (4.0 g)
Before use, add fresh: 2% β-mercaptoethanol (20 µl for 1 ml solution I).
Solution II (for 200 ml):
0.7 M NaCl (8.18 g)
10% (w / v) CTAB (20 g)
Solution III (for 200 ml):
50 mM Tris / HCl pH 8.0 (1.21 g)
10 mM EDTA (4 ml 0.5 M of 0.5 M stock solution)
1% (w / v) CTAB (2.0 g)
Solution IV (high-salt TE) (for 200 ml):
10 mM Tris / HCl pH 8.0 (0.242 g)
0.1 mM EDTA (40 µl 0.5 M stock solution)
1 M NaCl (11.69 g)
Chloroform / octanol (24: 1) (for 200 ml)
192 ml chloroform
8 ml octanol
The mixture is shaken twice with 1 M TrisHCl pH 8.0 and stored away from light.
Die Transformation von Tabak erfolgte über Infektion mit Agrobacterium tumefaciens. gemäß der von Horsch entwickelten Methode (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Alle zur Transformation verwendeten Konstrukte wurden anhand der Gefrier/Tau-Methode (wiederholtes Auftauen und Einfrieren) in Agrobacterium tumefaciens transformiert. Die das gewünschte Konstrukt enthaltenden Agrobacterium-Kolonien wurden auf Mannitol/Glutamat-Medium mit 50 µg/ml Kanamycin, 50 µg/ml Ampicilin und 25 µg/ml Rifampicin selektioniert. The tobacco was transformed via infection with Agrobacterium tumefaciens. according to the method developed by Horsch (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). All for Constructs used were based on the Freeze / thaw method (repeated thawing and freezing) in Agrobacterium tumefaciens transformed. The desired construct Colonies containing Agrobacterium were grown on mannitol / glutamate medium with 50 µg / ml kanamycin, 50 µg / ml ampicilin and 25 µg / ml rifampicin selected.
Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tumefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol Plant 15: 473ff.) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto- Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphtylessigsäure (NAA), 1,5% Glukose und 0.8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt. For the transformation of tobacco plants (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) 10 ml of a grown under selection Centrifuged overnight culture from Agrobacterium tumefaciens, the The supernatant was discarded and the bacteria in the same volume Antibiotic-free medium resuspended. In a sterile Petri dishes became leaf disks of sterile plants (diameter approx. 1 cm) bathed in this bacterial solution. Then the Leaf disks in petri dishes on MS medium (Murashige and Skoog (1962) Physiol Plant 15: 473ff.) With 2% sucrose and 0.8% Bacto- Designed agar. After 2 days of incubation in the dark at 25 ° C they were on MS medium with 100 mg / l kanamycin, 500 mg / l claforan, 1 mg / l benzylaminopurine (BAP), 0.2 mg / l naphthylacetic acid (NAA), 1.5% glucose and 0.8% Bacto agar transferred and the cultivation (16 hours light / 8 hours dark) continued. growing Rungs were placed on hormone-free MS medium with 2% sucrose, 250 mg / l Claforan and 0.8% Bacto agar transferred.
Der putative Ferredoxin-Promotor wurde mittels PCR aus
genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern pWL35 und pWL36
amplifiziert. Der Primer pWL35 beginnt mit den in Fettdruck
hervorgehobenen SalI und EcoRI Restriktionsschnittstellen
unmittelbar vor der kodierenden Region des pFD-Gens. Der Primer pWL36
beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und Asp718
Restriktionsschnittstellen.
Reaktionsansatz:
1 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
5 µl Tth-Polymerase (2 U/µl)
3 µl Mg(OAc)2 (25 mM, final conc. 1,5 mM Mg2+)
15,2 µl 3,3 × Puffer
4 µl dNTPs (jeweils 2,5 mM, Takara, Endkonzentration:
jeweils 200 µM)
24, 3 µl H2O
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 3 min. bei 95°C
10 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 50°C für 20 sec und 72°C für
1 min.
20 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 65°C für 20 sec und 72°C für
1 min.
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.,
anschliessend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
The putative ferredoxin promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA with the primers pWL35 and pWL36. The primer pWL35 begins with the SalI and EcoRI restriction sites highlighted in bold immediately before the coding region of the pFD gene. The primer pWL36 begins with the SalI and Asp718 restriction sites highlighted in bold.
Reaction:
1 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 250 ng)
5 µl Tth polymerase (2 U / µl)
3 µl Mg (OAc) 2 (25 mM, final conc. 1.5 mM Mg 2+ )
15.2 µl 3.3 x buffer
4 µl dNTPs (2.5 mM each, Takara, final concentration: 200 µM each)
24.3 µl H 2 O
PCR conditions:
1 cycle with 3 min. at 95 ° C
10 cycles with 94 ° C for 10 sec, 50 ° C for 20 sec and 72 ° C for 1 min.
20 cycles with 94 ° C for 10 sec, 65 ° C for 20 sec and 72 ° C for 1 min.
1 cycle at 72 ° C for 5 min.,
then cooling to 4 ° C until further processing.
Das pFD-Promotor PCR-Produkt wurde in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert und anschließend mittels der durch das Primerpaar eingeführten SalI-Restriktionsschnittstellen isoliert und gelelektrophoretisch gereinigt. Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das ca. 850 bp umfassende pFD-Promotorfragment in den SalI-restringierten Binärvektor pBI101.2 (Clontech Inc.) kloniert und die Orientierung des Fragments wurde anschließend anhand von Restriktionsanalysen unter Verwendung der Endonukleasen BglII und BamHI verifiziert. Das resultierende Plasmid pFD::GUS wurde in Tabak transformiert. Die erzeugten Tabakpflanzen wurden pFD:GUS genannt. The pFD promoter PCR product was transformed into the vector pCRII (Invitrogen) cloned and then by means of the primer pair introduced SalI restriction sites isolated and cleaned by gel electrophoresis. For the fusion with the CIS gene was the approximately 850 bp pFD promoter fragment in the SalI-restricted binary vector pBI101.2 (Clontech Inc.) cloned and the orientation of the fragment was then determined using Restriction analyzes using the endonucleases BglII and BamHI verified. The resulting plasmid pFD :: GUS was described in Transformed tobacco. The tobacco plants produced were pFD: GUS called.
-
1. Der putative Ferredoxin-Promotor wurde mittels PCR aus
genomischer Arabidopsis thaliana DNA amplifiziert. Dabei wurden über
die Primer die Restriktionsstellen EcoRI und NcoI angefügt.
1. The putative ferredoxin promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA. The restriction sites EcoRI and NcoI were added via the primers.
Reaktionsansatz:
37,5 µl H2O
5,0 µl 10X Reaktionspuffer (Endkonzentration Mg2+ 1,5 mM)
4,0 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
1,0 µl Primer pFD1 (10 µM)
1,0 µl Primer pFD2 (10 µM)
0,5 µl Taq-Polymerase (Takara, 2 U/µl)
1,0 µl genomischer Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 3 min. bei 94°C
10 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 48°C für 20 sec und 72°C für
1 min
25 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 65°C für 20 sec und 72°C für
1 min
1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
Reaction:
37.5 µl H 2 O
5.0 µl 10X reaction buffer (final concentration Mg 2+ 1.5 mM)
4.0 µl dNTP mix (2.5 mM each)
1.0 µl primer pFD1 (10 µM)
1.0 µl primer pFD2 (10 µM)
0.5 µl Taq polymerase (Takara, 2 U / µl)
1.0 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 250 ng)
PCR conditions:
1 cycle with 3 min. at 94 ° C
10 cycles with 94 ° C for 10 sec, 48 ° C for 20 sec and 72 ° C for 1 min
25 cycles with 94 ° C for 10 sec, 65 ° C for 20 sec and 72 ° C for 1 min
1 cycle at 72 ° C for 5 min.
Das PCR Produkt wurde in das Plasmid pCRII (Invitrogen) subkloniert. Das Plasmid pCAMBIA 2300 (CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia; GenBank Acc.-No: AF234315; Binary vector pCAMBIA-2300, complete sequence; Hajdukiewicz P et al. (1994) Plant Mol Biol 25(6): 989-994) wurde mit EcoRI/NcoI geschnitten und das pFD Promotorfragment als EcoRI/NcoI Fragment aus dem pCRII Plasmid in diesen Vektor umkloniert. Dabei wurde der 35S Promotor aus dem Cambiavektor entfernt. Das resultierende Plasmid wurde als pFD-Promotor : NPTII bezeichnet und in Tabak transformiert. The PCR product was transformed into the plasmid pCRII (Invitrogen) subcloned. The plasmid pCAMBIA 2300 (CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia; GenBank Acc.-No: AF234315; Binary vector pCAMBIA-2300, complete sequence; Hajdukiewicz P et al. (1994) Plant Mol Biol 25 (6): 989-994) was cut with EcoRI / NcoI and the pFD promoter fragment as an EcoRI / NcoI fragment from the pCRII plasmid cloned into this vector. The 35S Promoter removed from the cambia vector. The resulting plasmid was designated as pFD promoter: NPTII and in tobacco transformed.
Im Rahmen histochemischer Untersuchungen zeigten transgene pFD:
:-GUS Tabakpflanzen eine starke GUS-Färbung in 'source'-Blättern
und eine schwache GUS-Färbung in den Geweben aller Blütenorgane.
Eine starke Färbung im Wurzelgewebe wurde nur bei in
vitro-Pflanzen beobachtet, deren Wurzeln der Belichtung ausgesetzt waren.
Anhand von Blattscheiben, die aus als pFD::GUS-positiv
identifizierten Pflanzen ausgestanzt worden waren, wurde Kalluswachstum
induziert. Das Kallusgewebe sowie die sich daraus entwickelnden
Pflanzensprosse zeigten eine GUS-Färbung, die in ihrer Intensität
der GUS-Färbung von CaMV35S::GUS (in pCambia 1304; CAMBIA, GPO
Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia; GenBank Acc.-No.:
AF234300, Binary vector pCAMBIA-1304, complete sequence,
Hajdukiewicz P et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(6):989-994) (1994))
transgenen Pflanzen vergleichbar war. In der unten aufgeführten
Tabelle (Tab. 3) wurden die Daten zur Quantifizierung der
GUS-Aktivität in den Antheren (Staubbeuteln) und 'source'-Blättern
ausgewählter transgener pFD::GUS Tabakpflanzen zusammengestellt.
Tabelle 3
Quantifizierung der GUS-Aktivität in den Antheren und
'source'-Blättern ausgewählter transgener pFD::GUS Tabakpflanzen
In the context of histochemical studies, transgenic pFD:: -GUS tobacco plants showed a strong GUS staining in 'source' leaves and a weak GUS staining in the tissues of all flower organs. A strong staining in the root tissue was only observed in in vitro plants whose roots were exposed to the light. Callus growth was induced using leaf disks punched out from plants identified as pFD :: GUS positive. The callus tissue and the plant shoots that developed from it showed a GUS staining, which in its intensity corresponds to the GUS staining of CaMV35S :: GUS (in pCambia 1304; CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia; GenBank Acc.-No. : AF234300, Binary vector pCAMBIA-1304, complete sequence, Hajdukiewicz P et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25 (6): 989-994) (1994)) was comparable to transgenic plants. In the table below (Tab. 3) the data for the quantification of the GUS activity in the anthers (anthers) and 'source' leaves of selected transgenic pFD :: GUS tobacco plants were compiled. Table 3 Quantification of GUS activity in the anthers and 'source' leaves of selected transgenic pFD :: GUS tobacco plants
Die Antheren der reifen Blüten zweigen keine Promotoraktivität. Bei geschlossenen Blüten ist sie schwach ausgeprägt. The anthers of the mature flowers do not branch any promoter activity. It is weakly pronounced when the flowers are closed.
Für die Untersuchung der pFD-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde das pFD-Promotor : NPTII Plasmid in Tabak transformiert. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte auf Kanamycin (100 mg/l). Die aus den sich entwickelnden Sproßknospen regenerierten Pflanzen enthielten das Kanamycin, was zeigte, daß der pFD Promotor das NPTII Gen exprimiert hat und somit die Selektion ermöglichte. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist ein nur geringe Aktivität im Pollen auf. Die Aktivität in den Antheren beträgt in der Regel weniger als 10% der Aktivität in den Source-Blättern. For the study of the pFD promoter-mediated mediation of Resistance to kanamycin was the pFD promoter: NPTII plasmid in Transformed tobacco. The selective regeneration of the Tobacco plants were made on kanamycin (100 mg / l). The one from itself developing bud buds regenerated plants contained that Kanamycin, which showed that the pFD promoter expresses the NPTII gene has and thus made the selection possible. The results demonstrate that the isolated nucleic acid sequence is the desired one has advantageous promoter properties, d. H. she shows one Promoter activity that is suitable for effective selection markers express and has little activity in the pollen. The activity in the anthers is usually less than 10% of the activity in the source sheets.
Eine weitere Variante des pFD Promotors stellt die Deletion
pFDshort (pFds) dar. Dazu wurde der Abschnitt von Basenpaar 137 bis
837 des pFD Promotors unter Verwendung nachfolgender Primer
amplifiziert:
Reaktionsansatz:
37,5 µl H2O
5,0 µl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
4,0 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 µl 25 mM Mg(OAc)2 (Endkonzentration 1,1 mM)
1,0 µl Primer pFD3 (10 µM)
1,0 µl Primer pFD5 (10 µM)
0,5 µl Pfu-turbo Polymerase Mix
1,0 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 5 min. bei 95°C
25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 50°C für 60 sec und 72°C für
1 min.
1 Zyklus mit 50°C für 60 sec, 72°C für 10 min.,
anschliessend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung
Another variant of the pFD promoter is the deletion pFDshort (pFds). For this purpose, the section from base pair 137 to 837 of the pFD promoter was amplified using the following primers:
Reaction:
37.5 µl H 2 O
5.0 µl 10X reaction buffer ("genomic PCR")
4.0 µl dNTP mix (2.5 mM each)
2.2 µl 25 mM Mg (OAc) 2 (final concentration 1.1 mM)
1.0 µl primer pFD3 (10 µM)
1.0 µl primer pFD5 (10 µM)
0.5 µl Pfu-turbo polymerase mix
1.0 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 250 ng)
PCR conditions:
1 cycle with 5 min. at 95 ° C
25 cycles with 94 ° C for 30 sec, 50 ° C for 60 sec and 72 ° C for 1 min.
1 cycle at 50 ° C for 60 sec, 72 ° C for 10 min.,
then cooling to 4 ° C until further processing
Die Primer enthielten Erkennungssequenzen für das Restriktionsenzym BamHI. Nach Spaltung des PCR Produktes mit BamHI wurde es in das Plasmid pGUSINT37 (s.o.), das ebenfalls BamHI geschnitten und dephosphoryliert wurde, ligiert. Mit dem resultierenden Konstrukt pFDsGUSINT wurden Tabakblätter mit der Biolistics (BioRad) beschossen. Dabei wurden Microcarrier (25 µg Gold, Heraeus 0,3-3 µm) mit 10 µg Plasmid DNA, 2,5 M CaCl2, und 0,1 M Spermidine behandelt, mit Alkohol gewaschen und bei einem Vakuum von 26 inch und einem Druck von 1100 psi auf die Blätter, die auf MS-Medium lagen, geschossen. Die Explantate wurden anschließend für 24 h in MS-Medium mit 2% Sucrose inkubiert und dann mit X-gluc histochemisch gefärbt. Blaue Spots zeigten die Aktivität des Promotors. The primers contained recognition sequences for the restriction enzyme BamHI. After cleavage of the PCR product with BamHI, it was ligated into the plasmid pGUSINT37 (see above), which was also cut by BamHI and dephosphorylated. The resulting construct pFDsGUSINT was used to bombard tobacco leaves with the Biolistics (BioRad). Microcarriers (25 µg gold, Heraeus 0.3-3 µm) were treated with 10 µg plasmid DNA, 2.5 M CaCl 2 , and 0.1 M spermidine, washed with alcohol and under a vacuum of 26 inches and a pressure shot at 1100 psi on the sheets lying on MS medium. The explants were then incubated for 24 h in MS medium with 2% sucrose and then histochemically stained with X-gluc. Blue spots showed the activity of the promoter.
Als BamHI Fragment wird der pFDs Promotor aus pFDsGUSINT herausgeschnitten und seine Enden mittels Klenow-"Fill-In" geglättet. Das erhaltene Fragment wird vor das NPTII Gens des Plasmids pSUNSNPTII (SEQ ID NO: 24), EcoRV geschnitten und dephosphoryliert, kloniert. Das Plasmid pSUNSNPTII ist ein Derivat des Plasmids pSUN3 (SEQ ID NO: 23), welches neben eine nosP/Pat Kassette noch ein promotorloses NPTII Gen enthält. Mit diesem Konstrukt ist es möglich Promotoren auf ihre Fähigkeit die Expression von NPTII zu testen. Parallel kann die Selektion auf Phosphinothricin enthaltenden Medium erfolgen. As a BamHI fragment, the pFDs promoter is made from pFDsGUSINT cut out and smoothed its ends with Klenow "Fill-In". The fragment obtained is placed in front of the NPTII gene of the plasmid pSUNSNPTII (SEQ ID NO: 24), EcoRV cut and dephosphorylated, cloned. The plasmid pSUNSNPTII is a derivative of the Plasmids pSUN3 (SEQ ID NO: 23), which is next to a nosP / Pat cassette still contains a promoterless NPTII gene. With this construct it is possible for promoters to express their ability Test NPTII. In parallel, the selection for phosphinothricin containing medium.
Das resultierende Plasmid pSun5FdsNPTII wird in Tabak transformiert. Regenerierte und selektierte Sprosse zeigten, daß der pFDs Promotor die Selektion auf NPTII erlaubt. The resulting plasmid pSun5FdsNPTII is in tobacco transformed. Regenerated and selected shoots showed that the pFDs Promoter allows selection for NPTII.
Die putative Promotorregion des FNR-Gens wurde unter Verwendung
der Oligonukleotid-primer L-FNRara und R-FNRara aus genomischer
DNA amplifiziert wobei das ATG-Startcodon des FNR-Gens ausgespart
und vier putative Stop-Codons des stromaufwärts gelegenen offenen
Leserahmens beibehalten wurden. Anhand der Primer L-FNRara und
R-FNRara wurde der FNR-Promotor als ein 635 bp großes Fragment
entsprechend dem Abschnitt des Klons K2A18.15 von Position 69493
bis Position 70127 (beide Nukleotide inklusive) mittels PCR aus
genomischer Arabidopsis thaliana DNA amplifiziert. Der Primer
L-FNRara beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und
BamHI Restriktionsschnittstellen und befindet sich stromaufwärts
vor den vier Stop-Codons des dem FNR-Promotor vorgeschalteten
Gens. Der Primer R-FNRara beginnt mit den in Fettdruck
hervorgehobenen SalI und XbaI Restriktionsschnittstellen unmittelbar vor
dem ATG-Startcodon des FNR-Gens.
The putative promoter region of the FNR gene was amplified from genomic DNA using the oligonucleotide primers L-FNRara and R-FNRara, leaving out the ATG start codon of the FNR gene and maintaining four putative stop codons of the upstream open reading frame. Using the primers L-FNRara and R-FNRara, the FNR promoter was amplified as a 635 bp fragment corresponding to the section of clone K2A18.15 from position 69493 to position 70127 (both nucleotides included) by means of PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA. The primer L-FNRara begins with the SalI and BamHI restriction sites highlighted in bold and is located upstream of the four stop codons of the gene upstream of the FNR promoter. The primer R-FNRara begins with the SalI and XbaI restriction sites highlighted in bold immediately before the ATG start codon of the FNR gene.
Zur Amplifizierung des FNR-Promotors wurde ein sogenanntes
'touchdown' PCR-Protokoll unter Verwendung des 'Advantage Genomic
Polymerase Mix' (Clontech Laboratories, Inc. Katalog-Nr. #8418-1)
benutzt. Der obengenannte Polymerase-Mix enthält eine
thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus (Tth DNA
Polymerase), gemischt mit einem kleineren Anteil der "Vent Proofreading
3'-5' Polymerase", und den Tth Start Antikörper, der "hot-start"
PCR ermöglicht.
Reaktionsansatz:
3 6,8 µl H2O
5 µl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
1 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 µl 25 mM Mg(OAc)2 (Endkonzentration 1,1 mM)
1 µl Primer L-FNR ara (10 µM)
1 µl Primer R-FNR ara (10 µM)
1 µl 50× Polymerase Mix
2 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 500 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 1 min. bei 94°C
10 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 70°C für 3 min.
32 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 65°C für 3 min.
1 Zyklus mit 65°C für 4 min.,
anschliessend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
A so-called 'touchdown' PCR protocol using the 'Advantage Genomic Polymerase Mix' (Clontech Laboratories, Inc. Catalog No. # 8418-1) was used to amplify the FNR promoter. The above-mentioned polymerase mix contains a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus (Tth DNA polymerase), mixed with a smaller portion of the "Vent Proofreading 3'-5 'polymerase", and the Tth Start antibody, the "hot-start" PCR allows.
Reaction:
3 6.8 µl H 2 O
5 µl 10X reaction buffer ("genomic PCR")
1 µl dNTP mix (2.5 mM each)
2.2 µl 25 mM Mg (OAc) 2 (final concentration 1.1 mM)
1 µl primer L-FNR ara (10 µM)
1 µl primer R-FNR ara (10 µM)
1 µl 50 × polymerase mix
2 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 500 ng)
PCR conditions:
1 cycle with 1 min. at 94 ° C
10 cycles with 94 ° C for 30 sec and 70 ° C for 3 min.
32 cycles with 94 ° C for 30 sec and 65 ° C for 3 min.
1 cycle at 65 ° C for 4 min.,
then cooling to 4 ° C until further processing.
Das FNR-Promotor PCR-Produkt wurde nach Gel-elektrophoretischer Auftrennung und Reinigung aus dem Gel mit dem Quiagen-PCR-Reinigungskit per TA-Klonierung in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert. Das Promotorfragment wurde anschließend aus dem resultierenden Plasmid pATFNR1 mittels der durch das Primerpaar eingeführten XbaI und BamHI-Restriktionsschnittstellen durch Verdau mit XbaI/BamHI isoliert und gelelektrophoretisch gereinigt. Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das ca. 600 bp umfassende FNR- Promotorfragment in den XbaI/BamHI-restringierten Binärvektor pBI101 kloniert. Die korrekte Insertion des richtigen Fragments im resultierenden Plasmid pATFNR-Bi wurde anschließend anhand einer Restrikrionsanalyse unter Verwendung der Endonukleasen EcoRV verifiziert. Das Plasmid pATFNR-Bi wurde zur Tabaktransformation verwendet. The FNR promoter PCR product became electrophoretic after gel Separation and purification from the gel with the Quiagen PCR purification kit via TA cloning into the vector pCRII (Invitrogen) cloned. The promoter fragment was then extracted from the resulting plasmid pATFNR1 by means of the primer pair introduced XbaI and BamHI restriction sites by digestion isolated with XbaI / BamHI and purified by gel electrophoresis. For the fusion with the GUS gene became the approximately 600 bp FNR- Promoter fragment in the XbaI / BamHI restricted binary vector pBI101 cloned. The correct insertion of the right fragment in the resulting plasmid pATFNR-Bi was then used a restriction analysis using the endonucleases EcoRV Verified. The plasmid pATFNR-Bi was used for tobacco transformation used.
Für die Untersuchung der FNR-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der FNR-Promotor als SalI Fragment aus dem Plasmid pATFNR1 vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das SalI geschnittene Plasmid pSUN3PatNos (SEQ ID NO: 25) kloniert. For the study of the FNR promoter-mediated mediation of Resistance to phosphinothricin was the FNR promoter as SalI Fragment from the plasmid pATFNR1 in front of the phosphinothricin Resistance gene in the SalI cut plasmid pSUN3PatNos (SEQ ID NO: 25) cloned.
Transgene FNR::GUS-Pflanzen zeigten starke GUS-Expression in allen grünen Geweben, vorallem in 'source'-Blättern Blattstielen und Internodien sowie allen Blütenorganen voll entwickelter Blüten (Ovarium, Stigma, Kelch- und Kronblätter) mit Ausnahme von Pollen, der keine GUS-Aktivität zeigte; eine geringe Färbungsintensität wurde in Antheren detektiert. Bei der ersten Analyse von Blattscheibchen von 80 in vitro-Pflanzen zeigten 70 Pflanzen eine starke GUS-Färbung mit geringer Variation in der Färbeintensität zwischen den individuellen Pflanzen. Das wurde als Hinweis darauf gewertet, daß der FNR-Promotor ein Element enthält, daß für limitierte Positionseffekte sorgt. In den Gewebekulturpflanzen war die GUS-Aktivität der FNR::GUS Pflanzen deutlich geringer als die der TPT::GUS Pflanzen. Transgenic FNR :: GUS plants showed strong GUS expression in all green fabrics, especially in 'source' leaves with petioles and internodes as well as all flower organs fully developed Flowers (ovary, stigma, sepals and petals) with the exception of Pollen that showed no GUS activity; a small one Staining intensity was detected in anthers. The first analysis of Leaf disks from 80 in vitro plants showed 70 plants one strong GUS staining with little variation in staining intensity between the individual plants. That was used as a hint evaluated that the FNR promoter contains an element that for limited position effects. In the tissue crops was the GUS activity of the FNR :: GUS plants is significantly lower than that the TPT :: GUS plants.
Samenmaterial (F1) der Linien FNR 13, FNR 45 und FNR 28 wurden bezüglich ihrer GUS-Aktivität analysiert. Dabei zeigte sich, daß weder in ruhenden Samen noch in ausgebrachten Keimlingen (3.5 Tage nach Aussaat) GUS-Aktivität detektiert werden konnte. In späteren Keimlingsstadien (6 und 10 Tage nach Aussaat) wurde starke GUS-Aktivität in Keimblättern und im oberen Bereich der Keimlingsachse detektiert, wogegen keine GUS-Färbung in den Wurzeln gefunden wurde. Bei Keimlingen, die im Dunkeln angezogen wurden, war die GUS-Aktivität auf die Kotyledonen beschränkt und war insgesamt geringer als bei lichtgekeimten Sämlingen. Seed material (F1) from lines FNR 13, FNR 45 and FNR 28 were analyzed for their GUS activity. It turned out that neither in resting seeds nor in seedlings (3.5 Days after sowing) GUS activity could be detected. In later seedling stages (6 and 10 days after sowing) strong GUS activity in cotyledons and in the upper part of the Seedling axis detected, whereas no GUS staining in the Roots was found. In seedlings that are grown in the dark GUS activity was restricted to the cotyledons and was overall less than that of light-sprouted seedlings.
Die quantitative Untersuchung der GUS-Aktivität in FNR::GUS
transgenen Tabakpflanzen (transformiert mit Plasmid pATFNR-Bi)
wurde an den ersten voll entwickelten Blättern von Tabakpflanzen
21 Tage nach dem Transfer von der Gewebekultur ins Gewächshaus
analysiert. Die Daten entsprechen dem Mittelwert von vier
unabhängigen Messungen.
Tabelle 4
Quantifizierung der GUS-Aktivität in Blättermaterial
ausgewählter transgener FNR::GUS Tabakpflanzen (transformiert mit
Plasmid pATFNR-Bi)
The quantitative investigation of GUS activity in FNR :: GUS transgenic tobacco plants (transformed with plasmid pATFNR-Bi) was analyzed on the first fully developed leaves of tobacco plants 21 days after the transfer from the tissue culture to the greenhouse. The data correspond to the mean of four independent measurements. Table 4 Quantification of GUS activity in leaf material from selected transgenic FNR :: GUS tobacco plants (transformed with plasmid pATFNR-Bi)
Das Plasmid pSUN3FNRPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation, wie unter 3. beschrieben, verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). 97% der Explantate, die unter Kanamycindruck und 40% der Explantate, die unter Phosphinothricindruck selektiert wurden, entwickleten Sproßknospen. Die daraus regenerierten Pflanzen enthielten sowohl das Kanamycin als auch das Phosphinothricingen was zeigte, dass der FNR Promotor das Phosphinothricinacetyltransferase Gen exprimiert hat und somit die Selektion ermöglichte. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist, Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist keine Aktivität im Pollen auf. The plasmid pSUN3FNRPat was constructed using the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 for tobacco transformation, as under 3. described, used. The selective regeneration of the Tobacco plants were made on the one hand on phosphinothricin (5 mg / l) and on the other hand, to check for kanamycin (100 mg / l). 97% of Explants that are under Kanamycin and 40% of the explants that selected under phosphinothric pressure, developed Shoot buds. The plants regenerated from it contained both the kanamycin as well as the phosphinothricin gene which showed that the FNR promoter the phosphinothricin acetyltransferase gene has expressed and thus made the selection possible. The results demonstrate that the nucleic acid sequence isolated the has desired advantageous promoter properties, d. H. she shows a promoter activity that is suitable, selection markers to express effectively and has no activity in the pollen.
Die putative Promotor-Region des TPT-Gens aus Arabidopsis
thaliana wurde durch Amplifizierung mit den Oligonukleotid-Primern
L-TPTara und R-TPTara isoliert, wobei das ATG-Startcodon des TPT-
Gens ausgespart wurde. Anhand der Primer L-TPTara und R-TPTara
wurde der TPT-Promotor als ein 2039 bp großes Fragment mittels
PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA amplifiziert. Der
Primer L-TPTara beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI
und BamHI Restriktionsschnittstellen. Der Primer R-TPTara beginnt
mit den in Fettdruck hervorgehobenen AatII, SalI und XbaI
Restriktionsschnittstellen unmittelbar vor dem ATG-Startcodon des
TPT-Gens.
The putative promoter region of the Arabidopsis thaliana TPT gene was isolated by amplification with the oligonucleotide primers L-TPTara and R-TPTara, thereby leaving out the ATG start codon of the TPT gene. Using the primers L-TPTara and R-TPTara, the TPT promoter was amplified as a 2039 bp fragment by means of PCR from Arabidopsis thaliana genomic DNA. The L-TPTara primer begins with the SalI and BamHI restriction sites highlighted in bold. The primer R-TPTara begins with the AatII, SalI and XbaI restriction sites highlighted in bold immediately before the ATG start codon of the TPT gene.
Zur Amplifizierung des TPT-Promotors wurde ein sogenanntes
'touchdown' PCR-Protokoll unter Verwendung des 'Advantage Genomic
Polymerase Mix' (Clontech Laboratories, Inc. Katalog-Nr. #8418-1)
benutzt. Der obengenannte Polymerase-Mix enthält eine
thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus (Tth DNA
polymerase), gemischt mit einem kleineren Anteil der 'Vent proofreading
3'-5' Polymerase', und den Tth Start Antikörper, der "hot-start"
PCR ermöglicht.
Reaktionsansatz:
36,8 µl H2O
5 µl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
1 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 µl 25 mM Mg(OAc)2 (Endkonzentration 1,1 mM)
1 µl Primer L-FNR ara (10 µM)
1 µl Primer R-FNR ara (10 µM)
1 µl 50× Polymerase Mix
2 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 500 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 1 min. bei 94°C
10 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 70°C für 3 min.
32 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 65°C für 3 min.
1 Zyklus mit 65°C für 4 min., anschliessend Kühlung auf
4°C bis zur Weiterverarbeitung.
A so-called 'touchdown' PCR protocol using the 'Advantage Genomic Polymerase Mix' (Clontech Laboratories, Inc. Catalog No. # 8418-1) was used to amplify the TPT promoter. The above-mentioned polymerase mix contains a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus (Tth DNA polymerase), mixed with a smaller proportion of the 'vent proofreading 3'-5' polymerase ', and the Tth Start antibody, the "hot-start" PCR allows.
Reaction:
36.8 µl H 2 O
5 µl 10X reaction buffer ("genomic PCR")
1 µl dNTP mix (2.5 mM each)
2.2 µl 25 mM Mg (OAc) 2 (final concentration 1.1 mM)
1 µl primer L-FNR ara (10 µM)
1 µl primer R-FNR ara (10 µM)
1 µl 50 × polymerase mix
2 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 500 ng)
PCR conditions:
1 cycle with 1 min. at 94 ° C
10 cycles with 94 ° C for 30 sec and 70 ° C for 3 min.
32 cycles with 94 ° C for 30 sec and 65 ° C for 3 min.
1 cycle at 65 ° C for 4 min., Then cooling to 4 ° C until further processing.
Das TPT-Promotor PCR-Produkt wurde nach Gel-elektrophoretischer Auftrennung und Reinigung aus dem Gel mit dem Quiagen-PCR-Reinigungskit per TA-Klonierung in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert. Das Promotorfragment wurde anschließend aus dem resultierenden Plasmid pATTPT mittels der durch das Primerpaar eingeführten SalI und XbaI -Restriktionsschnittstellen isoliert und gelelektrophoretisch gereinigt. Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das ca. 2.2 kb umfassende TPT-Promotorfragment in den SalI/XbaI -restringierten Binärvektor pBI101 kloniert. Die korrekte Insertion des richtigen Fragments im resultierenden Plasmid pATTPT-Bi wurde anschließend anhand einer Restrikrionsanalyse unter Verwendung der Endonukleasen HindIII verifiziert. Das Plasmid pATTPT-Bi wurde zur Tabaktransformation verwendet. The TPT promoter PCR product became electrophoretic after gel Separation and purification from the gel with the Quiagen PCR purification kit via TA cloning into the vector pCRII (Invitrogen) cloned. The promoter fragment was then extracted from the resulting plasmid pATTPT by means of the primer pair introduced SalI and XbaI restriction interfaces isolated and cleaned by gel electrophoresis. For the fusion with the CIS gene was the approximately 2.2 kb TPT promoter fragment in the SalI / XbaI -restricted binary vector pBI101 cloned. The correct one Insertion of the correct fragment in the resulting plasmid pATTPT-Bi was then based on a restriction analysis Use of the endonucleases HindIII verified. The plasmid pATTPT-Bi was used for tobacco transformation.
Für die Untersuchung der TPT-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der TPT-Promotor als SalI Fragment aus dem Plasmid pATTPT vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das SalI geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3TPTPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andrerseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). For the study of the TPT promoter-mediated mediation of Resistance to phosphinothricin was the TPT promoter as SalI Fragment from the plasmid pATTPT before the phosphinothricin Resistance gene cloned into the SalI-cut plasmid pSUN3PatNos. The resulting plasmid pSUN3TPTPat was cut using the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 for tobacco transformation used. The selective regeneration of the tobacco plants was done on the one hand on phosphinothricin (5 mg / l) and on the other hand to check for kanamycin (100 mg / l).
Transgene TPT::GUS-Pflanzen zeigten starke GUS-Expression in allen grünen Geweben, vor allem in 'source'-Blättern, hier insbesondere in den Trichomen und den Blütenorganen junger und voll entwickelter Blüten. Die GUS-Aktivität im Bereich der Blüten war am stärksten in den Ovarien und im Stigma; die Färbung der Kelch- und Kronblätter war etwas schwächer. In den Antheren war die GUS- Aktivität am geringsten und schwer zu detektieren. Transgenic TPT :: GUS plants showed strong GUS expression in all green tissues, especially in 'source' leaves, here especially in the trichomes and flower organs young and full developed flowers. The GUS activity was in the field of flowers strongest in the ovaries and stigma; the coloring of the chalice and petals were a little weaker. In the anthers was the CIS Least activity and difficult to detect.
Bei der ersten Analyse von Blattscheibchen von 80 in vitro-Pflanzen zeigten 22 Pflanzen überhaupt keine Färbung und 22 Pflanzen eine starke GUS-Färbung nach nur dreistündiger Färbung. Die übrigen Pflanzen zeigten eine große Bandbreite verschieden intensiver GUS-Färbungen bei den individuellen Pflanzen. In den Gewebekulturpflanzen war die GUS-Aktivität der TPT::GUS Pflanzen deutlich stärker als die der FNR::GUS Pflanzen. Samenmaterial (F1) der Linien TPT 55 und TPT 60 wurden bezüglich ihrer GUS-Aktivität analysiert. Dabei zeigte sich, daß sowohl in ruhenden Samen als auch in ausgebrachten Keimlingen (3.5 Tage nach Aussaat) eine starke GUS-Aktivität detektiert werden konnte. In späteren Keimlingsstadien (6 und 10 Tage nach Aussaat) wurde die stärkste GUS-Aktivität in Keimblättern und im oberen Bereich der Keimlingsachse detektiert und eine schwächere GUS-Färbung in den Wurzeln. Keimlinge, die im Dunkeln angezogen wurden, zeigten ein unverändertes GUS-Färbemuster. In the first analysis of leaf disks of 80 in In vitro plants, 22 plants showed no staining at all and 22 plants a strong GUS stain after only three hours of staining. The other plants showed a wide range of different intensities GUS stains on individual plants. In the In tissue culture plants, the GUS activity of the TPT :: GUS plants was clear stronger than that of the FNR :: GUS plants. Seed material (F1) the Lines TPT 55 and TPT 60 were checked for their GUS activity analyzed. It was found that both in resting seeds as well a strong one in seedlings (3.5 days after sowing) GUS activity could be detected. In later Seedling stages (6 and 10 days after sowing) became the strongest GUS activity in cotyledons and in the upper area of the seedling axis detected and a weaker GUS staining in the roots. Seedlings that were grown in the dark showed an unchanged GUS staining.
Die quantitative Untersuchung der GUS-Aktivität in TPT::GUS
transgenen Tabakpflanzen (transformiert mit Plasmid pAT-TPT-Bi)
wurde an den ersten voll entwickelten Blättern von Tabakpflanzen
19 Tage nach dem Transfer von der Gewebekultur ins Gewächshaus
analysiert. Die Daten entsprechen dem Mittelwert von vier
unabhängigen Messungen.
Tabelle 5
Quantifizierung der GUS-Aktivität in Blattgewebe
ausgewählter transgener TPT::GUS Tabakpflanzen (transformiert mit
Plasmid pAT-TPT-Bi). WT2: Kontrollwerte von untransformierten
Wildtyp-Pflanzen
The quantitative study of GUS activity in TPT :: GUS transgenic tobacco plants (transformed with plasmid pAT-TPT-Bi) was analyzed on the first fully developed leaves of tobacco plants 19 days after the transfer from the tissue culture to the greenhouse. The data correspond to the mean of four independent measurements. Table 5 Quantification of GUS activity in leaf tissue of selected transgenic TPT :: GUS tobacco plants (transformed with plasmid pAT-TPT-Bi). WT2: control values of untransformed wild-type plants
Das Plasmid pSUN3TPTPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation, wie unter 3. beschrieben, verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). 97% der Explantate, die unter Kanamycindruck und 70% der Explantate, die unter Phosphinothricindruck selektiert wurden, entwickelten Sproßknospen. Die daraus regenerierten Pflanzen enthielten sowohl das Kanamycin als auch das Phosphinothricingen was zeigte, daß der TPT Promotor das Phosphinothricinacetyltransferase Gen exprimiert hat und somit die Selektion ermöglichte. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist keine Aktivität im Pollen auf. The plasmid pSUN3TPTPat was constructed using the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 for tobacco transformation, as under 3. described, used. The selective regeneration of the Tobacco plants were made on the one hand on phosphinothricin (5 mg / l) and on the other hand, to check for kanamycin (100 mg / l). 97% of Explants that are under Kanamycin and 70% of the explants that selected under phosphinothric pressure Shoot buds. The plants regenerated from it contained both the kanamycin as well as the phosphinothricin gene which showed that the TPT promoter the phosphinothricin acetyltransferase gene has expressed and thus made the selection possible. The results demonstrate that the nucleic acid sequence isolated the has desired advantageous promoter properties, d. H. she shows a promoter activity that is suitable for selection markers to express effectively and has no activity in the pollen.
Der Ubiquitin Promotor wurde mittels PCR aus genomischer
Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern ubi5 und ubi3 amplifiziert.
Reaktionsansatz:
37,5 µl H2O
5 µl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
4 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 µl 25 mM Mg(OAc)2 (Endkonzentration 1,1 mM)
1 µl Primer ubi3 (10 µM)
1 µl Primer ubi5 (10 µM)
0.5 µl Pfu-turbo polymerase mix
1 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 5 min. bei 94°C
25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 52°C für 1 min. und 72°C für
1 min.
1 Zyklus mit 52°C für 1 min. und 72°C für 10 min.,
anschliessend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
The ubiquitin promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA with the primers ubi5 and ubi3.
Reaction:
37.5 µl H 2 O
5 µl 10X reaction buffer ("genomic PCR")
4 µl dNTP mix (2.5 mM each)
2.2 µl 25 mM Mg (OAc) 2 (final concentration 1.1 mM)
1 µl primer ubi3 (10 µM)
1 µl primer ubi5 (10 µM)
0.5 µl Pfu-turbo polymerase mix
1 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 250 ng)
PCR conditions:
1 cycle with 5 min. at 94 ° C
25 cycles at 94 ° C for 30 sec, 52 ° C for 1 min. and 72 ° C for 1 min.
1 cycle at 52 ° C for 1 min. and 72 ° C for 10 min.,
then cooling to 4 ° C until further processing.
Das entstandene PCR Fragment wurde als HindIII/BamHI Fragment in das mit HindIII/BamHI geschnittene Plasmid pGUSINT37 kloniert (pUBI42GUS) und mittels Sequenzanalyse verifiziert. The resulting PCR fragment was used as a HindIII / BamHI fragment in cloned the plasmid pGUSINT37 cut with HindIII / BamHI (pUBI42GUS) and verified by sequence analysis.
Für die Untersuchung der Ubiquitin-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der Ubiquitin- Promotor als BamHI/HindIII Fragment vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das BamHI/HindIII geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3UBIPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andrerseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). Supported for the study of the ubiquitin promoter The resistance to phosphinothricin was mediated by the ubiquitin Promoter as a BamHI / HindIII fragment in front of the phosphinothricin Resistance gene in the BamHI / HindIII cut plasmid pSUN3PatNos cloned. The resulting plasmid pSUN3UBIPat was created under Use of the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 for Tobacco transformation used. The selective regeneration of the Tobacco plants were made on the one hand on phosphinothricin (5 mg / l) and on the other hand, to check for kanamycin (100 mg / l).
Im Gegensatz zur Selektion auf Kanamycin, die normal verlief, konnten unter Selektion auf Phosphinothricin keine Kalli oder Sprosse erhalten werden. So ist der Ubiquitin Promotor nicht geeignet für die Expression eines selektiven Markers für den Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit anschließender Regeneration von Geweben. In contrast to the selection for kanamycin, which was normal, could not call or calli with selection for phosphinothricin Rung can be obtained. The ubiquitin promoter is not like this suitable for the expression of a selective marker for the Agrobacterium tumefaciens -mediated gene transfer with subsequent Regeneration of tissues.
Der Squalen Synthase Promotor wurde mittels PCR aus genomischer
Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern sqs5 und sqs3
amplifiziert.
Reaktionsansatz
37,5 µl H2O
5 µl 10X Reaktionspuffer ("genomic PCR")
4 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
2,2 µl 25 mM Mg(OAc)2 (Endkonzentration 1,1 mM)
1 µl Primer sqs3 (10 µM) (10 µM)
1 µl Primer sqs5 (10 µM)
0,5 µl Pfu-turbo polymerase mix
1 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
PCR-Bedingungen:
1 Zyklus mit 5 min. bei 94°C
25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 52°C für 1 min. und 72°C für
1 min.
1 Zyklus mit 52°C für 1 min. und 72°C für 10 min.,
anschliessend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
The squalene synthase promoter was amplified by PCR from genomic Arabidopsis thaliana DNA with the primers sqs5 and sqs3.
reaction
37.5 µl H 2 O
5 µl 10X reaction buffer ("genomic PCR")
4 µl dNTP mix (2.5 mM each)
2.2 µl 25 mM Mg (OAc) 2 (final concentration 1.1 mM)
1 µl primer sqs3 (10 µM) (10 µM)
1 µl primer sqs5 (10 µM)
0.5 µl Pfu-turbo polymerase mix
1 µl genomic Arabidopsis DNA (approx. 250 ng)
PCR conditions:
1 cycle with 5 min. at 94 ° C
25 cycles at 94 ° C for 30 sec, 52 ° C for 1 min. and 72 ° C for 1 min.
1 cycle at 52 ° C for 1 min. and 72 ° C for 10 min.,
then cooling to 4 ° C until further processing.
Das entstandene PCR Fragment wurde als XbaII/BamHI Fragment in das mit XbaII/BamHI geschnittene Plasmid pGUSINT37 kloniert (pSQSPGUS) und mittels Sequenzanalyse verifiziert. The resulting PCR fragment was used as an XbaII / BamHI fragment in cloned the plasmid pGUSINT37 cut with XbaII / BamHI (pSQSPGUS) and verified by sequence analysis.
Für die Untersuchung der Squalen Synthase-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der Squalen Synthase-Promotor als BamHI/SalI Fragment vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das BamHI/SalI geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3SQSPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andrerseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). Supported for the study of the squalene synthase promoter Mediation of resistance to phosphinothricin was the Squalene synthase promoter as a BamHI / SalI fragment in front of the Phosphinothricin resistance gene in the BamHI / SalI cut plasmid pSUN3PatNos cloned. The resulting plasmid was pSUN3SQSPat using the Agrobacterium tumefaciens strain EHA101 for Tobacco transformation used. The selective regeneration of the Tobacco plants were made on the one hand on phosphinothricin (5 mg / l) and on the other hand to control for kanamycin (100 mg / l).
Im Gegensatz zur Selektion auf Kanamycin, die normal verlief, konnten unter Selektion auf Phosphinothricin keine Kalli oder Sprosse erhalten werden. So ist der Ubiquitin Promotor nicht geeignet für die Expression eines selektiven Markers für den Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit anschließender Regneration von Geweben. In contrast to the selection for kanamycin, which was normal, could not call or calli with selection for phosphinothricin Rung can be obtained. The ubiquitin promoter is not like this suitable for the expression of a selective marker for the Agrobacterium tumefaciens -mediated gene transfer with subsequent Regeneration of tissues.
Um transient die Aktivität des Ubiquitin- und des Squalen Synthase-Promotors zu testen, wurden sterile Tabakblätter mit Plasmid- DNA der Plasmide pUBI42GUS, pSQSPGUS und pGUSINT37 mit der Partikelkanone "Biolistics" von BioRad beschossen. Dabei wurden Microcarrier (25 µg Gold, Hereus 0,3-3 µm) mit 10 µg Plasmid DNA, 2,5 M CaCl2, und 0,1 M Spermidine behandelt, mit Alkohol gewaschen und bei einem Vakuum von 26 inch und einem Druck von 1100 psi auf die Blätter, die auf MS-Agarmedium lagen, geschossen. Die Explantate wurden anschließend für 24 h in MS-Medium mit 2% Sucrose inkubiert und dann mit X-gluc histochemisch gefärbt. In order to test the activity of the ubiquitin and squalene synthase promoter transiently, sterile tobacco leaves were bombarded with plasmid DNA of the plasmids pUBI42GUS, pSQSPGUS and pGUSINT37 with the particle gun "Biolistics" from BioRad. Microcarriers (25 µg gold, Hereus 0.3-3 µm) were treated with 10 µg plasmid DNA, 2.5 M CaCl 2 , and 0.1 M spermidine, washed with alcohol and under a vacuum of 26 inches and a pressure shot at 1100 psi on the leaves lying on MS agar medium. The explants were then incubated for 24 h in MS medium with 2% sucrose and then histochemically stained with X-gluc.
Der Ubiquitin-Promotor und der Squalen Synthase-Promotor zeigten
hierbei im Gegensatz zum Vergleichskonstrukt pGUSINT37, wo das
GUS Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimiert wurde,
nur sehr wenige und sehr schwache Punkte mit GUS-Färbung. Dies
zeigt, daß die Aktivität des Ubiquitin- und des Squalen Synthase-
Promotors deutlich schwächer ist, als die des CaMV35S-Promotors.
SEQUENZPROTOKOLL
In contrast to the comparative construct pGUSINT37, where the GUS gene was expressed under the control of the 35S promoter, the ubiquitin promoter and the squalene synthase promoter showed only very few and very weak points with GUS staining. This shows that the activity of the ubiquitin and squalene synthase promoters is significantly weaker than that of the CaMV35S promoter. SEQUENCE LISTING
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