DE10131789A1 - New nucleic acid containing plant promoter, useful for seed-specific gene expression - Google Patents

Abstract

Nucleic acid having a fully defined sequence (S1) of 780 nucleotides, given in the specification, containing a promoter that mediates gene expression in plants, is new. Independent claims are also included for the following: (1) expression cassette (EC) for expression or suppression of selected homologous or heterologous genes in plant seeds, especially in transfer cells, contains (S1), or its fragments or sequences that hydridize to (S1); (2) plasmids that contain EC; (3) genetic alteration of plant cells or plants that contain an EC to provide seed-specific expression; (4) plant cells produced by method (3), or containing EC, also tissues and plants regenerated from them.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1, der spezifisch die Genexpression von Genen in den Transferzellen pflanzlicher Embryonen erlaubt. Darüberhinaus betrifft die Erfindung Expressionskassetten und Vektoren enthaltend eine Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen in den Transferzellen pflanzlicher Embryonen. Die Erfindung betrifft auch mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte Pflanzen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die spezifisch unter Verwendung eines Promotors mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 Proteine in den Transferzellen von pflanzlichen Embryonen exprimieren. The present invention relates to a promoter with the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1, the specifically the Gene expression of genes in the transfer cells of plant embryos allowed. The invention also relates to Expression cassettes and vectors containing a nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 for the transgenic expression of nucleic acid sequences in the transfer cells of plant embryos. The invention also affects with these expression cassettes or vectors transformed plants. The invention also relates to Process for the production of transgenic plants that are specific using a promoter with the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 proteins in the transfer cells of vegetable Express embryos.

Die Transkription von DNA in mRNA wird durch eine Region 5' seitig von der DNA gesteuert, die gewöhnlich als Promotor bezeichnet wird. Diese Promotorregion enthält Abfolgen von Basenpaaren, die der RNA Polymerase signalisieren, sich mit der DNA zu assoziieren und die Transkription von mRNA zu starten. Dieser Vorgang ist beispielsweise bei samenspezifischen Genen aufgrund ihrer räumlichen Spezifität untersucht worden (Goldberg et al. Cell 56(2), 149-160 (1989); Thomas, T. L., The Plant Cell 5(1993), 1401-1410). The transcription of DNA into mRNA is determined by a region 5 ' mutually controlled by DNA, usually as a promoter referred to as. This promoter region contains sequences of Base pairs that signal the RNA polymerase align with the DNA to associate and start transcribing mRNA. This The process is due, for example, to seed-specific genes their spatial specificity was examined (Goldberg et al. Cell 56 (2), 149-160 (1989); Thomas, T.L., The Plant Cell 5 (1993), 1401 to 1410).

Die Steuerung der Transkription durch diese Promotorregionen erfolgt dabei für das Gewebe und die Entwicklung der Pflanzen hoch spezifisch. Diese Eigenschaft wird heute für die Überexpression oder Suppression von Zielgenen in transgenen Pflanzen ausgenutzt. Dabei ist es von Vorteil, regulatorische Sequenzen zu benutzen, die die Expression des Zielgens in gewünschter Weise erlauben. Durch die Wahl eines geeigneten Promotors, der das Gen spezifisch in einem bestimmten Gewebe, zu einem definierten Zeitpunkt und in der notwendigen Stärke steuert, ist es möglich Pflanzen zu produzieren, deren Eigenschaften wirtschaftliche Bedeutung besitzen. So können durch Expression von Genen des Stärke- oder Fettsäuremetabolismus unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors diese Biosynthesewege exklusiv im Samen manipuliert werden. Auch andere Ziele der Pflanzenzüchtung, wie Resistenz gegenüber Insekten und Krankheiten sowie Toleranz gegen ablotische Stressfaktoren lassen sich durch Expression entsprechender heterologer Gene unter Kontrolle gut definierter Promotoren erreichen. Control of transcription through these promoter regions is high for the tissue and the development of the plants specific. This property is used for overexpression today or suppression of target genes in transgenic plants. It is advantageous to use regulatory sequences which allow expression of the target gene in the desired manner. By choosing a suitable promoter that is specific to the gene in a certain tissue, at a defined time and controls in the necessary strength, it is possible to plant produce whose properties have economic importance have. So can by expression of genes of the starch or Fatty acid metabolism under the control of a seed-specific Promotors manipulated these biosynthetic pathways exclusively in the semen become. Other plant breeding goals, such as resistance towards insects and diseases as well as tolerance against ablotic stress factors can be determined by expression corresponding heterologous genes under control well defined Reach promoters.

Bekannt sind Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. So wurden beispielsweise die Promotoren von Genen identifiziert, die für Speicherproteine verschiedener Dicotyledonen kodieren. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseolins (US 5,504,200, Bustos M. M. et al., Plant Cell. 1989, 2(9): 839-53), des 2S Albumingens (Joseffson L. G. et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 12196-12201), des Legumins (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989, 215(2): 326-331), des USP (unknown seed protein; Bäumlein H, et al., Molecular & General Genetics 1991, 225(3): 459-67) des Napin Gens (Stalberg K., et al., L. Planta 1996, 199: 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H. et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128). Diese steuern eine samenspezifische Expression von Speicherproteinen. Eine Promotoraktivität mit einer Spezifität für bestimmte Zellen innerhalb des Samens ist lediglich für die Samenhülle beschrieben worden: Ein kryptischer Promotor mit Spezifität für die Samenhülle wurde durch "T-DNA tagging" in Tabak identifiziert (Fobert P. R. et al., Plant Journal 1994, 6(4): 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067). Promoters are known which have expression in semen and control herbal embryos. For example, the Promoters of genes identified for storage proteins encode different dicotyledons. Seed-specific promoters are, for example, the promoter of phaseoline (US 5,504,200, Bustos M. M. et al., Plant Cell. 1989, 2 (9): 839-53), of the 2S Albumingens (Joseffson L.G. et al., J. Biol. Chem. 1987, 262: 12196-12201), leguminum (Shirsat A et al., Mol Gen Genet. 1989, 215 (2): 326-331), of the USP (unknown seed protein; Bäumlein H, et al., Molecular & General Genetics 1991, 225 (3): 459-67) des Napin Gens (Stalberg K., et al., L. Planta 1996, 199: 515-519), of the sucrose binding protein (WO 00/26388) or the LeB4 promoter (Baumlein H. et al., Mol Gen Genet 1991, 225: 121-128). This control seed-specific expression of storage proteins. A promoter activity with specificity for certain cells within the seed is only described for the seed coat : A cryptic promoter with specificity for the The seed coat was identified by "T-DNA tagging" in tobacco (Fobert P.R. et al., Plant Journal 1994, 6 (4): 567-77; US 5,824,863; WO 99/53067).

Die Entwicklung der Embryonen im Samen ist abhängig von ihrer Ernährung. Über Transferzellen wird der junge Embryo mit den verschiedenen Nährstoffen wie z. B. Zuckern versorgt. Die Transferzellen sind durch fingerähnliche Einstülpungen in den Zellwänden an den Grenzen zu transportaktiven Zelloberflächen charakterisiert. Durch die derart vergrößerte Oberfläche können effizient Stoffe transportiert werden. Diese Transferzellen finden sich häufig in speziellen Geweben in sich entwickelnden Samen in unmittelbarer Nähe zu der maternalen Entladungszone (Bonnemain et al., In: Recent advances in phloem transport and assimilate compartmentation. Bonnemain, Delrot, Lucas and Dainty, Eds., Quest Editions, Nantes Cedex, 1991, 74-83). In Samen wurden sie in den basalen Endospermzellen bei Mais (Felker and Shannon, Plant Physiol. 65(1980), 864-870), im modifizierten Aleuron von Gerste, Weizen und in der embryonalen Epidermis von Vicia faba und Erbse (Bonnemain et al., 1991) gefunden. Bei Vicia faba startet die Entwicklung der Transferzellen in der Region, in der die Kotyledonen den ersten Kontakt mit der Samenschale finden und der Embryo über die Samenschale mit Nährstoffen wie Saccharose versorgt wird (Weber et al., Seed Science Res. 8(1998), 331-345). Die Transferzellschicht stellt somit einen für die Entwicklung des Samens wichtigen Zelltyp dar. The development of the embryos in the semen depends on theirs Nutrition. The young embryo with the various nutrients such as B. sugar. The Transfer cells are by finger-like indentations in the Cell walls on the borders to transport-active cell surfaces characterized. Due to the increased surface area materials are transported efficiently. These transfer cells are often found in special tissues in developing Seeds in close proximity to the maternal discharge zone (Bonnemain et al., In: Recent advances in phloem transport and assimilate compartmentation. Bonnemain, Delrot, Lucas and Dainty, Eds., Quest Editions, Nantes Cedex, 1991, 74-83). In seeds in basal endosperm cells in maize (Felker and Shannon, Plant Physiol. 65 (1980), 864-870), in the modified Aleuron von Barley, wheat and in the embryonic epidermis of Vicia faba and pea (Bonnemain et al., 1991). At Vicia faba starts the development of the transfer cells in the region in which the cotyledons find the first contact with the seed coat and the embryo over the seed coat with nutrients like sucrose is supplied (Weber et al., Seed Science Res. 8 (1998), 331-345). The transfer cell layer thus represents one for development important cell type of the seed.

Trotz der Vielzahl bekannter pflanzlicher Promotoren, wurde bislang kein Promotor mit einer Spezifität für die Transferzellen der Epidermis des pflanzlichen Embryos identifiziert. Despite the large number of known plant promoters, so far no promoter with a specificity for the Transfer cells of the epidermis of the plant embryo identified.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es einen Promotor zu identifizieren und zu isolieren, der die spezifische Genexpression von homologen bzw. heterologen Proteinen in Transferzellen pflanzlicher Embryonen erlaubt. The object of the present invention was a promoter to identify and isolate the specific Gene expression of homologous or heterologous proteins in Transfer cells from plant embryos allowed.

Die Aufgabe wurde gelöst durch Identifizierung und Charakterisierung eines als SutP27 bezeichneten Promotors mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1. Der Promotor ist in den Transferzellen von pflanzlichen Embryonen aktiv. Er kontrolliert die Expression des Gens VfSut1, welches für den Saccharosetransporter VfSut1 aus Vicia faba kodiert (Weber et al., The Plant Cell 9(1997), 895-908). Mit der Vergrößerung der Berührungsfläche zwischen Embryo und Samenschale und der Entwicklung der Transferzellen verstärkt sich die Expression des Saccharosetransporters. The task was solved by identification and Characterization of a promoter referred to as SutP27 with the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1. The promoter is in the transfer cells of plant embryos active. It controls expression of the gene VfSut1, which is used for the sucrose transporter VfSut1 encoded from Vicia faba (Weber et al., The Plant Cell 9 (1997), 895-908). With the enlargement of the interface between Embryo and seed coat and the development of transfer cells the expression of the sucrose transporter increases.

Der SutP27 Promotor und seine regulatorischen Elemente sind geeignet, in der Transferzellschicht Expression von homologen und heterologen Genen zu vermitteln und die Entwicklung des Embryos zu beeinflussen. Die in der vorliegende Erfindung als SutP27 Promotor bezeichnete Region umfasst den Promotor mit seinen regulatorischen Sequenzen und der 5' untranslatierten Region des VfSut1 Gens. Der SutP27 Promotor ist geeignet, jedes homologe oder heterologe Gen oder Teile davon in den Transferzellen pflanzlicher Embryonen zu exprimieren oder zu reprimieren. The SutP27 promoter and its regulatory elements are suitable in the transfer cell layer expression of homologous and to convey heterologous genes and the development of the embryo to influence. The one in the present invention as SutP27 Region designated promoter includes the promoter with its regulatory sequences and the 5 'untranslated region of the VfSut1 gene. The SutP27 promoter is suitable for any homologous or heterologous gene or parts thereof in the transfer cells express or repress plant embryos.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Nutzung von Teilen des SutP27 Promotors allein oder zusammen mit anderen regulatorischen Sequenzen zur Expression oder Suppression von Genen. The present invention also relates to the use of Share the SutP27 promoter alone or with others regulatory sequences for the expression or suppression of Genes.

Die vorliegende Erfindung schließt die Isolierung von Nukleinsäuren, die den SutP27 Promoter oder Teile davon beinhalten und transferzellspezifische Expression bewirken, mit ein. The present invention excludes the isolation of Nucleic acids that contain the SutP27 promoter or parts thereof and bring about transfer cell-specific expression with.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Expressionskassetten, die die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 des SutP27 Promotors oder Teile davon enthalten und die mit heterologen, homologen oder komplementären nativen Genen fusioniert sind. The present invention also relates to expression cassettes, which contain the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 of the SutP27 promoter or contain parts of it and those with heterologous, homologous or complementary native genes are fused.

Ein Gegenstand der Erfindung betrifft daher auch eine Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren in embryonalen Transferzellen enthaltend

• a) den Promotor des VfSut1-Gens aus Vicia faba gemäß SEQ-ID No. 1, oder
• b) ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a), das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt,

One object of the invention therefore also relates to an expression cassette for the transgenic expression of nucleic acids in embryonic transfer cells

• a) the promoter of the VfSut1 gene from Vicia faba according to SEQ-ID No. 1, or
• b) a functional equivalent or equivalent fragment of a) which has essentially the same promoter activity as a),

wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. where a) or b) is to be expressed functionally with a transgene Nucleic acid sequence are linked.

Unter Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren werden durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen verstanden, in denen sich

• a) der Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen oder ein von ihm abgeleitetes funktionelles Äquivalent oder äquivalente Fragment derselben, und
• b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz

Expression cassette for the transgenic expression of nucleic acids is understood to mean constructions which have been obtained by genetic engineering methods and which contain

• (a) the promoter specific for embryonic transfer cells or a functional equivalent or fragment thereof derived therefrom, and
• b) the nucleic acid sequence to be expressed

nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d. h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. not in their natural, genetic environment (i.e. their natural chromosomal locus) or through genetic engineering methods were modified, the modification examples of substitutions, additions, deletions, Inversion or insertions of one or more nucleotide residues can be.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Expressionskassette kann die Expression einer bestimmten Nukleinsäure durch einen Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen zur Bildung von sense- RNA oder anti-sense RNA führen. Die sense-RNA kann anschließend in bestimmte Polypeptide translatiert werden. Mit der anti-sense- RNA kann die Expression bestimmter Gene herunterreguliert werden. In the context of the expression cassette according to the invention, the Expression of a specific nucleic acid by a promoter Specificity for embryonic transfer cells to form sense Lead RNA or anti-sense RNA. The sense RNA can then be translated into certain polypeptides. With the anti-sense RNA can downregulate the expression of certain genes.

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung von dem Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen, der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer- Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare. A functional link is, for example the sequential arrangement of the promoter with specificity for embryonic transfer cells, the transgene to be expressed Nucleic acid sequence and possibly other regulatory elements such as for example a terminator such that each of the regulative Elements its function in the transgenic expression of the Nucleic acid sequence, depending on the arrangement of the nucleic acid sequences to sense or anti-sense RNA. This is not necessarily a direct link in the chemical sense required. Genetic control sequences, such as enhancer Sequences can also function from further away Positions or even from other DNA molecules on the Exercise target sequence. Arrangements are preferred in which the Nucleic acid sequence to be expressed transgenically behind that as a promoter acting sequence is positioned so that both sequences are covalently linked. The is preferred Distance between the promoter sequence and the transgene too expressing nucleic acid sequence less than 200 base pairs, particularly preferably less than 100 base pairs, very particularly preferably less than 50 base pairs.

Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt beispielsweise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen fungierenden Nukleinsäuresequenz mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen. Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation in ein pflanzliches Genom insertiert werden. Various ways are known to the person skilled in the art to achieve a expression cassette according to the invention. The An expression cassette according to the invention is produced for example preferably by direct fusion of one as a promoter with specificity for embryonic transfer cells Nucleic acid sequence with a nucleotide sequence to be expressed. Common recombination and Cloning techniques as described, for example, in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Mergers, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987). However, between the two sequences other sequences can also be positioned, for example the Function of a linker with certain Restriction enzyme interfaces or a signal peptide. The insertion can also of sequences lead to the expression of fusion proteins. The expression cassette, consisting of a Linking promoter and nucleic acid sequence to be expressed, integrated into a vector and by for example Transformation can be inserted into a plant genome.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides selektiv in embryonalen Transferzellen steuert. Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird selektiv die Expression des bestimmten Polypeptides in den embryonalen Transferzellen herunterreguliert oder ausgeschaltet. Alternativ kann der endogene Promotor zur Veränderung der Samenentwicklung beispielsweise durch Expression entsprechender Transkriptionsfaktoren reguliert werden. However, there are also those under an expression cassette Understand constructions in which the promoter without that he previously had a nucleic acid sequence to be expressed was functionally linked, for example via a targeted homologous recombination or a random insertion into one Host genome is introduced, there regulatory control via nucleic acid sequences then functionally linked to it takes over and controls the transgenic expression of the same. By inserting the promoter, for example by a homologous one Recombination - before a coding for a particular polypeptide An expression cassette is obtained which contains the nucleic acid Expression of the specific polypeptide selectively in embryonic Controls transfer cells. Furthermore, the insertion of the promoter also be done in such a way that antisense RNA is added to that for a expressed polypeptide-encoding nucleic acid becomes. This will selectively express the particular Downregulated polypeptides in embryonic transfer cells or switched off. Alternatively, the endogenous promoter can Change in semen development, for example through expression appropriate transcription factors are regulated.

Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den endogenen, natürlichen SutP27-Promotor inseriert werden, wodurch man eine Expressionskassette erhält, die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in embryonalen Transferzellen steuert. Analogously, a transgene can also be expressed Nucleic acid sequence for example by homologous recombination behind the endogenous, natural SutP27 promoter can be inserted one receives an expression cassette, the expression of the transgenic nucleic acid sequence to be expressed in embryonic Controls transfer cells.

Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeichnet, wenn die Transkription eines beliebigen zu exprimierenden Gens unter Kontrolle eines bestimmten von der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 abgeleiteten Promotors in den Transferzellen des Samens stattfindet. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50%, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10% von einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ-ID No. 1 beschriebenen Promotor unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50%, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% eines Vergleichswertes erhalten mit dem durch SEQ-ID No. 1 beschriebenen Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichswert die Expressionshöhe der natürlichen VfSut1 mRNA oder des natürlichen VfSut1 Proteins aus Vicia faba. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) oder ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., ENBO J. 1987, 6, 3901-3907). Promoter activity is considered essentially the same denotes when the transcription of any one to be expressed Gene under the control of a particular nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 derived promoter in the transfer cells of the Samens takes place. The level of expression can be both after down as well as up compared to a comparison value differ. Preference is given to those sequences whose Expression level, measured using the transcribed mRNA or as a result of the translated protein, among otherwise unchanged Conditions quantitatively by no more than 50%, preferably 25%, particularly preferably 10% of a comparison value obtained with by SEQ-ID No. 1 promoter differs. Sequences whose expression level, measured on the basis of the transcribed mRNA or the consequence translated protein, under otherwise unchanged conditions quantitatively by more than 50%, preferably 100%, particularly preferably 500%, very particularly preferably 1000% of one Comparative value obtained with that of SEQ-ID No. 1 described promoter exceeds. The expression level is preferred as a comparison value the natural VfSut1 mRNA or the natural VfSut1 protein from Vicia faba. Also preferred is the comparison value Get expression level with any but certain Nucleic acid sequence, preferably those nucleic acid sequences that encode for easily quantifiable proteins. Most notably reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13 (1): 29-44) like "green fluorescence protein "(GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5): 912-8, 1997), which Chloramphenicol transferase, a luciferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) or is particularly preferred β-glucuronidase (Jefferson et al., ENBO J. 1987, 6, 3901-3907).

Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird. Otherwise unchanged conditions means that the expression, through one of the expression cassettes to be compared is initiated, not by combination with additional ones genetic control sequences, for example enhancer sequences, is modified.

Die Erfindung beschreibt ferner Vektoren, die eine Expressionskassette enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 des SutP27 Promotors oder davon abgeleitete Sequenzen beinhalten. The invention also describes vectors that are Expression cassette containing the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 of Include SutP27 promoters or sequences derived therefrom.

Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können neben dem Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft sein. Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint sämtliche derartige Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz den Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz. The in the expression cassettes or vectors according to the invention contained nucleic acid sequences can in addition to the promoter Specificity for embryonic transfer cells with additional genetic Control sequences must be functionally linked. The term The genetic control sequences are widely understood and means all such sequences that have an impact on the formation or the function of the invention Expression cassette. Genetic control sequences modify, for example, transcription and translation in prokaryotic or eukaryotic organisms. Preferably include the expression cassettes according to the invention 5 'upstream of the respective transgene to be expressed Nucleic acid sequence the promoter with specificity for embryonic Transfer cells and 3 'downstream a terminator sequence as additional genetic control sequence, as well as any other usual ones regulatory elements each functionally linked to the Nucleic acid sequence to be expressed transgenically.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen, bevorzugt des VfSut1-Gens aus Vicia faba. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktion bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebespezifität fördern (Rouster J. et al., Plant J. 1998, 15: 435-440.). Umgekehrt unterdrückt die 5'-untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer S. et al., Plant Cell 1993, 5: 65-73). Die unter SEQ-ID No. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz enthält den Abschnitt des VfSut1-Gens, der den Promotor und die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des VfSut1-Gens repräsentiert. Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the 3' non-coding region of Genes, preferably the VfSut1 gene from Vicia faba. It is shown that this has a significant function in regulation of gene expression can play. So it was shown that 5'-untranslated sequences make the transient expression more heterologous Can amplify genes. You can also change the tissue specificity promote (Rouster J. et al., Plant J. 1998, 15: 435-440.). Conversely, the 5'-untranslated region of the opaque-2 gene suppresses the expression. A deletion of the corresponding region leads to an increase in gene activity (Lohmer S. et al., Plant Cell 1993, 5: 65-73). The under SEQ ID No. 1 specified Nucleic acid sequence contains the portion of the VfSut1 gene that is the promoter and the 5 'untranslated region up to the ATG start codon of the VfSut1 gene represented.

Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein. The expression cassette can advantageously one or more so-called "enhancer sequences" functionally linked to the Contain promoters that have an increased transgenic expression of the Enable nucleic acid sequence. Also at the 3 'end of the transgene expressing nucleic acid sequences can be additional advantageous sequences are inserted, such as further regulatory ones Elements or terminators. The transgene to be expressed Nucleic acid sequences can be copied in one or more copies Gene construct may be included.

Zusätzliche zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind Targeting-Sequenzen, wie ein Transitpeptid oder Signalpeptid kodierende Sequenzen, zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen. However, additional to the functional linkage was not preferred sequences limited to this are targeting sequences, such as a Transit peptide or signal peptide coding sequences for Ensuring subcellular localization in the apoplast, in the Vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic Reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or others Compartments as well as translation amplifiers like that 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) and the like.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen ausgetauscht werden. Control sequences are also to be understood as those which a homologous recombination or insertion into the genome of a Allow host organism or removal from the genome allow. In homologous recombination, for example, the natural promoter of a particular gene against a promoter with specificity for embryonic transfer cells.

Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen. Methods like cre / lox technology allow one tissue-specific, possibly inducible removal of the Expression cassette from the genome of the host organism (Sauer B. Methods. 1998; 14 (4): 381-92). Here are certain flanking Sequences added to the target gene (lox sequences), which later become a Allow removal using the cre recombinase.

Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen plaziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind und die dem Leseraster des Zielgens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem entsprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an den gewünschten Ort vor dem Zielgen platzieren, so dass die Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemäße Expressionskassette bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten reziproken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz verwendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist geeignet, um den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen den Promotor mit Spezifität für embryonale Transferzellen auszutauschen und so den Expressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren. Die funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemäße Expressionskassette dar. The promoter to be introduced can be homologous recombination are placed in front of the target gene to be expressed by: the promoter is linked to DNA sequences, for example are homologous to endogenous sequences and to the reading frame of the target gene are upstream. Such sequences are as understand genetic control sequences. After a cell was transformed with the corresponding DNA construct, can the two homologous sequences interact and so the Place the promoter sequence at the desired location in front of the target gene, see above that the promoter sequence is now functionally linked to is the target gene and an expression cassette according to the invention forms. The selection of the homologous sequences determines the Place of insertion of the promoter. Here, the expression cassette by homologous recombination using a simple or a double reciprocal recombination. In the case of simply reciprocal recombination, only one is used Recombination sequence used and there is insertion of the total imported DNA. With double-reciprocal recombination the DNA to be introduced is flanked by two homologous sequences and the flanked area is inserted. The latter The method is suitable to use the natural promoter specific gene against the promoter with specificity for embryonic Exchange transfer cells and so the expression site and -modify the time of this gene. The functional link represents an expression cassette according to the invention.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. The expression cassettes according to the invention and those of them derived vectors can contain further functional elements. The term functional element is to be understood broadly and means Elements that have an impact on production, propagation or Function of the expression cassettes, vectors according to the invention or have transgenic organisms.

Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

• a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol oder bevorzugt Herbizide, wie Phosphinotricin etc. verleihen.
• b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999, 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui W. L. et al., Curr. Biol. 1996, 6: 325-330; Leffel S. M. et al., Biotechniques. 23(5), 912-8, 1997), eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1992, 10: 324-414), und ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
• c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli oder Agrobakterium tumefaciens gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori, der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) oder der origin des pVS1 Plasmidsaus Pseudomonas {Itoh & Haas 1985 ID: 3781}.
• d) Elemente, die für eine Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Examples include, but are not limited to:

• a) Selection markers which are resistant to a metabolism inhibitor such as 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456), antibiotics or biocides, such as, for example, kanamycin, G 418, bleomycin, hygromycin, chloramphenicol or, preferably, herbicides, such as phosphinotricin etc. to lend.
• b) reporter genes which code for easily quantifiable proteins and which, by means of their own color or enzyme activity, ensure an assessment of the transformation efficiency or the place or time of expression. Reporter proteins (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999, 13 (1): 29-44) such as "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr. Biol. 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5), 912-8, 1997), a luciferase (Millar et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1992, 10: 324-414 ), and very particularly preferred is the β-glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907).
• c) origins of replication, which ensure an increase in the expression cassettes or vectors according to the invention in, for example, E. coli or Agrobacterium tumefaciens. Examples include ORI (origin of DNA replication), pBR322 ori, P15A ori (Sambrook et al .: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) or the origin of the pVS1 plasmid from Pseudomonas {Itoh & Haas 1985 ID: 3781}.
• d) Elements which are required for an agrobacterium-mediated plant transformation, such as, for example, the right or left border of the T-DNA or the vir region.

Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). For the selection of successfully homologously recombined or transformed cells, it is usually necessary to use one selectable marker to introduce the successfully recombined cells resistant to a biocide (for example a herbicide), a metabolism inhibitor such as 2-Deoxyglucose-6-phosphate or an antibiotic. The Selection marker allows the selection of the transformed cells from untransformed (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).

Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen. Das eine Paar dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird außerhalb der zu integrierenden DNA-Sequenz, d. h. außerhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom übertragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällg insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion inaktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1. das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E, coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34bp lox-Sequenz bzw. 47bp FRT-Sequenz) um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.) Homologous recombination is a relatively rare event in higher eukaryotes, especially in plants. Random Integrations in the host genome predominate. One way to remove randomly integrated sequences and thus using cell clones to enrich for correct homologous recombination in the use of a sequence specific Recombination system as described in US 6,110,736. This consists of three Elements: two pairs of specific recombination sequences and a sequence-specific recombinase. This recombinase catalyzes recombination only between the two Pairs of specific recombination sequences. The one pair these specific DNA sequences will be outside of the integrating DNA sequence, d. H. outside of the two homologues Localized DNA sequences. In the case of a correct homologue These sequences are not recombined into the genome transfer. In the case of accidental integration, insert them in usually along with the rest of the construct. Using containing a special recombinase and a construct a second pair of the specific sequences can be random inserted sequences cut out or by inversion be inactivated while correctly using homologous recombination inserted sequences remain in the genome. A variety of sequence-specific recombination systems can be used the Cre / lox system of bacteriophage P1 are exemplary. the FLP / FRT system of yeast, the Mu Phage gin recombinase, the Pin recombinase from E, coli and the R / RS system of the pSR1 plasmid called. Bacteriophage P1 Cre / lox and that are preferred Yeast FLP / FRT system. The recombinase (Cre or FLP) specifically with their respective recombination sequences (34bp lox sequence or 47bp FRT sequence) around the to delete or invert intermediate sequences. The FLP / FRT and cre / lox recombinase system has already been used in plant Systems applied (Odell et al., Mol. Gen. Genet., 223: 369-378, 1990.)

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche oder agrobakterielle Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator. Suitable polyadenylation signals as control sequences vegetable or agrobacterial polyadenylation signals, preferably those that are essentially T-DNA Polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, especially gene 3 correspond to the T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835ff) or functional Equivalents of it. Examples of particularly suitable ones Terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopaline synthase) terminator.

Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder von ihnen abgeleitete Vektoren können funktionelle Äquivalente zu der unter SEQ-ID No. 1 beschriebenen Sequenz des Promotors des Saccharosetransporter Gens aus Vicia faba enthalten. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang der durch SEQ-ID No. 1 definierten Sequenz abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen. The expression cassettes according to the invention or by them derived vectors can have functional equivalents to that below SEQ ID No. 1 described sequence of the promoter of Sucrose transporter gene from Vicia faba included. Functional equivalent sequences also include all of the sequences made by the complementary counter strand of SEQ-ID No. 1 defined Sequence are derived and essentially the same Have promoter activity.

Funktionelle Äquivalente meint zunächst DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der durch SEQ-ID No. 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz oder der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisieren und die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie durch SEQ-ID No. 1 beschriebene Nukleinsäuresequenz haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint sowohl stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben. Functional equivalents initially means DNA sequences that are under Standard conditions with those specified by SEQ-ID No. 1 described Nucleic acid sequence or the complementary to it Hybridize nucleic acid sequence and are essentially the same Promoter activities as defined by SEQ-ID No. 1 described Have nucleic acid sequence. Standard hybridization conditions is to understand broadly and means both stringent and less stringent hybridization conditions. Such Hybridization conditions are among others at Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., In Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 9.31-9.57) or in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. described.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2 X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2 X SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20 X SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind im folgenden beschrieben:

• 1. Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
  • a) 4 X SSC bei 65°C, oder
  • b) 6 X SSC bei 45°C, oder
  • c) 6 X SSC bei 68°C, 100 µg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder
  • d) 6 X SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
  • e) 6 X SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C.
  • f) 50% Formamid, 4 X SSC bei 42°C, oder
  • g) 50% (vol/vol) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrate bei 42°C, oder
  • h) 2 X oder 4 X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
  • i) 30 bis 40% Formamid, 2 X oder 4 X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung), oder
  • j) 0,05 M Na-Phosphatpuffer pH 7,0, 2 mM EDTA, 1% BSA und 7% SDS.
• 2. Waschschritte mit zum Beispiel
  • a) 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% SDS bei 50°C; oder
  • b) 0,1 X SSC bei 65°C, oder
  • c) 0,1 X SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
  • d) 0,1 X SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
  • e) 0,2 X SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
  • f) 2 X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung), oder
  • g) 40 mM Na-Phosphatpuffer pH 7,0, 1% SDS, 2 mM EDTA.

For example, the conditions during the washing step can be selected from the range of conditions limited to those with low stringency (with approximately 2 X SSC at 50 ° C.) and those with high stringency (with approximately 0.2 X SSC at 50 ° C., preferably at 65 ° C) (20 X SSC: 0.3 M sodium citrate, 3 M NaCl, pH 7.0). In addition, the temperature during the washing step can be raised from low stringent conditions at room temperature, about 22 ° C, to more stringent conditions at about 65 ° C. Both parameters, salt concentration and temperature, can be varied simultaneously, one of the two parameters can be kept constant and only the other can be varied. Denaturing agents such as formamide or SDS can also be used during hybridization. In the presence of 50% formamide, the hybridization is preferably carried out at 42 ° C. Some exemplary conditions for hybridization and washing step are described below:

• 1. Hybridization conditions with for example
  • a) 4 X SSC at 65 ° C, or
  • b) 6 X SSC at 45 ° C, or
  • c) 6 X SSC at 68 ° C, 100 µg / ml denatured fish sperm DNA, or
  • d) 6 X SSC, 0.5% SDS, 100 µg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA at 68 ° C, or
  • e) 6 X SSC, 0.5% SDS, 100 µg / ml denatured, fragmented salmon sperm DNA, 50% formamide at 42 ° C.
  • f) 50% formamide, 4 X SSC at 42 ° C, or
  • g) 50% (vol / vol) formamide, 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5, 750 mM NaCl, 75 mM sodium citrate at 42 ° C, or
  • h) 2 X or 4 X SSC at 50 ° C (weakly stringent condition), or
  • i) 30 to 40% formamide, 2 X or 4 X SSC at 42 ° C (weakly stringent condition), or
  • j) 0.05 M Na phosphate buffer pH 7.0, 2 mM EDTA, 1% BSA and 7% SDS.
• 2. Washing steps with for example
  • a) 0.015 M NaCl / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% SDS at 50 ° C; or
  • b) 0.1 X SSC at 65 ° C, or
  • c) 0.1 X SSC, 0.5% SDS at 68 ° C, or
  • d) 0.1 X SSC, 0.5% SDS, 50% formamide at 42 ° C, or
  • e) 0.2 X SSC, 0.1% SDS at 42 ° C, or
  • f) 2 X SSC at 65 ° C (weakly stringent condition), or
  • g) 40 mM Na phosphate buffer pH 7.0, 1% SDS, 2 mM EDTA.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Einsatz solcher Nukleinsäuren in den Expressionskassetten oder von ihnen abgeleiteten Vektoren, die mit der durch SEQ-ID No. 1 beschriebenen doppelsträngigen DNA-Sequenz oder Fragmenten derselben, unter den oben definierten Bedingungen hybridisieren und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der SutP27 Promotor aufweist. The use of such is preferred according to the invention Nucleic acids in the expression cassettes or derived from them Vectors identified by SEQ-ID No. 1 described double-stranded DNA sequence or fragments thereof, among those above hybridize defined conditions and essentially the has the same promoter activity as the SutP27 promoter.

Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen des unter SEQ-ID No.1 beschriebenen SutP27-Promotors sowie seine Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin eine Expression in pflanzlichen embryonalen Transferzellen initiieren können. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der SutP27-Promotor-Nukleotidsequenz erhält gemäß SEQ-ID No. 1. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz auf bestimmte regulatorische Elemente oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein. A functional equivalent is also to be understood especially natural or artificial mutations of the SutP27 promoter described under SEQ ID No.1 and its Homologues from other plant genera and species, which continued expression in herbal embryonic Can initiate transfer cells. Mutations include substitutions, Additions, deletions, inversions or insertions of one or several nucleotide residues. Thus, for example, such Nucleotide sequences encompassed by the present invention, which can be obtained by modifying the SutP27 promoter nucleotide sequence obtained according to SEQ ID No. 1. Aim of such Modification can e.g. B. the further narrowing of those contained therein Sequence to certain regulatory elements or e.g. Belly the insertion of further restriction enzyme interfaces which Removing unnecessary DNA or adding more sequences, for example further regulatory sequences.

Die Eingrenzung der Sequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden (K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300). Narrowing down the sequence to certain essential ones regulatory regions can also be done with the help of search routine to search for promoter elements. Often are in the regions relevant for promoter activity Promoter elements are abundant. This analysis can for example with computer programs such as the PLACE program ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") (K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300).

Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen. Where insertions, deletions or substitutions, such as. B. Transitions and transversions, in themselves, can be considered known techniques, such as in vitro mutagenesis, "primer repair", Restriction or ligation can be used. Through manipulations, such as B. restriction, "chewing-back" or replenishment of Overhangs for "blunt ends" can be complementary ends of the fragments be made available for the ligation. Too analog Results can also be obtained using the Polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide Primers are coming.

Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12; Length Weight: 4;
Average Match: 2,912; Average Mismatch: -2,003. Homology between two nucleic acids is understood to mean the identity of the nucleic acid sequence over the entire entire length of the sequence, which can be determined by comparison using the program algorithm GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) with the following parameters is calculated:
Gap Weight: 12; Length Weight: 4;
Average match: 2,912; Average mismatch: -2.003.

Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 20% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ-ID No. 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ-ID No. 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 20% aufweist. An example is a sequence that has a homology of at least 20% nucleic acid based on the sequence SEQ ID No. 1, understood a sequence that at a comparison with the sequence SEQ-ID No. 1 according to the above Program algorithm with the above parameter set a homology of at least 20%.

Funktionelle Äquivalente, abgeleitet von einer der in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenz SEQ-ID No. 1 zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 20%, bevorzugt 40%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90%, und zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Transkriptionsaktivität im Vergleich zu der SutP27-Promotorsequenz gemäß SEQ-ID No. 1 aus. Functional equivalents derived from one of the in the Expression cassettes or vectors according to the invention for Coming promoter sequence SEQ-ID No. 1 for example by substitution, insertion or deletion of nucleotides, have a homology of at least 20%, preferably 40%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 80%, very particularly preferably at least 90%, and are distinguished through an essentially identical transcription activity in the Comparison to the SutP27 promoter sequence according to SEQ-ID No. 1 off.

Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommende Promotorsequenz lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, durch Homologievergleiche aus Datenbanken auffinden. Further examples of those in the invention Expression cassettes or expression vectors used For example, promoter sequences can be derived from different organisms, whose genomic sequence is known, for example from Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, by comparing homology Find databases.

Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Promotorvarianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangspromotor, abgeschwächt oder verstärkt ist. Functional equivalents also include those promoter variants their function, compared to the output promoter, weakened or reinforced.

Als weitere geeignete funktionell äquivalente Expressionskassetten sind Sequenzen zu nennen, die unter Kontrolle der Promotorsequenz ein Fusionsprotein exprimieren, wobei ein Bestandteil des Fusionsproteins die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, der andere eine regulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das Genprodukt an den gewünschten Wirkort leitet, ist. As further suitable functionally equivalent Expression cassettes are sequences that are under the control of the Promoter sequence express a fusion protein, where a Part of the fusion protein to be expressed Nucleic acid sequence, the other a regulatory protein sequence, such as z. B. a signal or transit peptide that the gene product to the the desired place of action is.

Die Spezifität der erfindungsgemäßen Expressionskonstrukte und Vektoren für die pflanzliche, embryonale Epidermis ist besonders vorteilhaft. Die Transferzellen haben im Samenembryo eine essentielle Rolle bei der Aufnahme von Wasser, Gasen und Nährstoffen und stellen sowohl eine Barriere als auch die wesentliche Kontaktfläche des pflanzlichen Embryos zu seiner Umwelt dar. Sie haben eine bedeutende Funktion beim Schutz des Embryos gegen biotische und ablotische Stressfaktoren. Biotische Stressfaktoren können Pathogene, Verbiss durch Tiere etc. sein, ablotischer Stress kann Hitze, Kälte, Trockenheit, UV-Licht etc. sein. The specificity of the expression constructs according to the invention and vectors for the plant embryonic epidermis particularly advantageous. The transfer cells have in the semen embryo play an essential role in the absorption of water, gases and Nutrients and represent both a barrier and the essential contact surface of the plant embryo to its Environment. They have an important function in protecting the environment Embryos against biotic and ablotic stress factors. biotic Stress factors can be pathogens, animal bites etc., ablotic stress can include heat, cold, dryness, UV light etc. his.

Für eine hohe Effizienz solcher gentechnischer Ansätze ist eine konzentrierte Expression der entsprechenden transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in den embryonalen Transferzellen pflanzlicher Embryonen vorteilhaft. Eine konstitutive Expression in der gesamten Pflanze kann den Effekt zum Beispiel durch eine Verdünnung in Frage stellen oder das Wachstum der Pflanze bzw. die Qualität des Pflanzenproduktes beeinträchtigen. Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression verstärkt zum Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing"). For a high efficiency of such genetic engineering approaches is a concentrated expression of the corresponding transgene expressing nucleic acid sequence in the embryonic Transfer cells from plant embryos beneficial. A constitutive Expression throughout the plant can have the effect for example by diluting or questioning the growth of the Impair the plant or the quality of the plant product. It can also be enhanced by constitutive expression the transgene is switched off ("gene silencing").

Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Proteinen bekannt, deren rekombinante Expression in den embryonalen Transferzellen vorteilhaft sein könnte. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer entsprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend für vorteilhafte Effekte seien zu nennen: Das Erzielen einer Resistenz gegen ablotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV-Strahlung) und biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten), die Verbesserung von Nahrungs- oder Futtereigenschaften, die Verbesserung der Wachstumsrate, des Ertrages oder die Beeinflussung des Samenansatzes. Für die in diesen Anwendungen einsetzbaren Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide seien beispielhaft aber nicht einschränkend zu nennen:

• 1. Expression von Proteinen beispielsweise Transportproteinen, die die Aufnahme von Metaboliten, Nährstoffen oder Wasser in den Embryo verbessern und so das Embryonenwachstum, die Metabolitenzusammensetzung oder den Ertrag optimieren, zum Beispiel durch Expression eines Aminosäuretransporters, der die Aufnahme von Aminosäuren beschleunigt, oder eines Monosaccharid-Transporters, der die Aufnahme von Zuckern fördert. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den kationische Aminosäure-Transporter aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: X92657) oder für den Monosaccharid-Transporter aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: AJ002399) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• 2. Erzeugung von sterilen Pflanzen durch Verhinderung der Samenbildung mit Hilfe der Expression eines geeigneten Inhibitors zum Beispiel eines Toxins oder durch die Verhinderung der Zufuhr von Metaboliten und anderen Stoffen, die für die Entwicklung des Embryos benötigt werden, in den embryonalen Transferzellen des Samens um die Weiterverbreitung der Pflanzen zu unterbinden.
• 3. Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos gegen ablotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von den "antifreeze polypeptides" aus Myoxocephalus scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyltransferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 1998, 15: 1-32), DREB1A-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphatsynthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• 4. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metabolite oder Proteine in den embryonalen Transferzellen des Samens. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate, Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanzlichen Resistenz- und Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikrobiellen Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozym aus verschiedenen Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea Trypsininhibitor), Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Weizenkeimagglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No.: 578423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

A large number of proteins are known to the person skilled in the art, the recombinant expression of which in the embryonic transfer cells could be advantageous. Furthermore, a large number of genes are known to the person skilled in the art, by means of their repression or elimination by means of expression of a corresponding antisense RNA, advantageous effects can also be achieved. Examples include, but are not limited to, advantageous effects: achieving resistance to ablotic stress factors (heat, cold, dryness, increased humidity, environmental toxins, UV radiation) and biotic stress factors (pathogens, viruses, insects and diseases), improving Food or feed properties, improving the growth rate, the yield or influencing the seed set. For the nucleic acid sequences or polypeptides that can be used in these applications, the following may be mentioned as examples, but not by way of limitation:

• 1. Expression of proteins, for example transport proteins, which improve the uptake of metabolites, nutrients or water into the embryo and thus optimize embryo growth, the metabolite composition or the yield, for example by expression of an amino acid transporter which accelerates the uptake of amino acids, or a monosaccharide -Transporter that promotes the absorption of sugars. Preferred are nucleic acids which code for the cationic amino acid transporter from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: X92657) or for the monosaccharide transporter from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: AJ002399) or functional equivalents thereof.
• 2. Generation of sterile plants by preventing seed formation by means of the expression of a suitable inhibitor, for example a toxin, or by preventing the supply of metabolites and other substances required for the development of the embryo in the embryonic transfer cells of the seed around the Prevent the spread of plants.
• 3. Improved protection of the plant embryo against ablotic stress factors such as dryness, heat, or cold, for example by overexpression of the "antifreeze polypeptides" from Myoxocephalus scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, the Arabidopsis thaliana transcription activator CBF1, glasenamate (WOF1), glutenamate / 12983, WO 98/11240), a late embryogenesis gene (LEA), for example from barley (WO 97/13843), calcium-dependent protein kinase genes (WO 98/26045), calcineurins (WO 99/05902), farnesyltransferases (WO 99 / 06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), oxalate oxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 1998, 15: 1-32), DREB1A factor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), genes of mannitol or trehalose synthesis such as trehalose phosphate synthase or trehalose phosphate phosphatase (WO 9 7/42326), or by inhibiting genes such as trehalase (WO 97/50561). Nucleic acids which code for the transcriptional activator CBF1 from Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No .: U77378) or the "antifreeze protein" from Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No .: AF306348) or functional equivalents thereof are particularly preferred.
• 4. Achieving resistance, for example to fungi, insects, and diseases, through targeted secretion or accumulation of certain metabolites or proteins in the embryonic transfer cells of the seed. Examples include glucosinolates, chitinases or glucanases and other enzymes that destroy the cell wall of parasites, ribosome-inactivating proteins (RIPs) and other proteins of the plant resistance and stress reaction, such as those caused by injury or microbial attack on plants or chemically by, for example, salicylic acid , Jasmonic acid or ethylene are induced, lysozymes from non-plant sources such as, for example, T4 lysozyme or lysozyme from various mammals, insecticidal proteins such as Bacillus thuringiensis endotoxin, α-amylase inhibitor or protease inhibitors (cowpea trypsin inhibitor), glucanases, lectins, glutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinoglutinininglutinin , RNAsen or ribozymes. Particular preference is given to nucleic acids which are used for the chit42 endochitinase from Trichoderma harzianum (GenBank Acc.-No .: 578423) or for the N-hydroxylating, multifunctional cytochrome P-450 (CYP79) from Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No .: U32624 ) or encode functional equivalents thereof.

Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J. Exp. Bot. 2000, 51, 487-96. Further examples of advantageous genes are mentioned, for example at Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J. Exp. Bot. 2000, 51, 487-96.

Funktionelle Äquivalente meint hier - analog zu der Definition der funktionellen Äquivalente des Promotors mit Spezifität für embryonale Transferzellen des Samens - all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben, d. h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer Signaltransduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Äquivalent sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen. Functional equivalents mean here - analogous to the definition of the functional equivalents of the promoter with specificity for semen embryonic transfer cells - all the sequences that have essentially the same function, i. H. to the function (for example a substrate conversion or a Signal transduction) are capable as well as the example mentioned Protein. The functional equivalent can be different in others Distinguish characteristics. For example, one have higher or lower activity or even more Functionalities.

Funktionelle Äquivalente meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch für eine Signalpeptidsequenz kodieren. Functional equivalents also means sequences for Fusion proteins consisting of one of the preferred proteins and others Proteins for example another preferred protein or but also code for a signal peptide sequence.

Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch anti-sense reprimieren muss. Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli, R. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97(4): 1495-500). Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens. The person skilled in the art is also aware that he described the above Genes not directly using the coding for these genes Express nucleic acid sequences or for example by anti-sense must repress. He can also, for example artificial transcription factors of the zinc finger protein type use (Beerli, R.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97 (4): 1495-500). These factors are reflected in the regulatory areas of the to be expressed or repressing endogenous genes and depending on Shaping the factor, an expression or repression of the endogenous gene.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Pflanzen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz. Another object of the invention relates to transgenic plants, transformed with at least one of the invention Expression cassette or a vector according to the invention, as well as cells, Cell cultures, tissues, parts containing a promoter with the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 or one derived from it Sequence.

Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz. Included in the scope of the invention are all types and Species of higher and lower plants in the plant kingdom containing a promoter with the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 or a sequence derived from it.

Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium. The mature plants, seeds and sprouts are also included and seedlings, as well as parts derived therefrom, propagation material and cultures, for example cell cultures. Ripe plants means Plants at any stage of development beyond Seedling. Seedling means a young, immature plant in one early development stage.

Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugte Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz. Annual, perennial, monocotyledonous and dicotyledonous plants are preferred host organisms for the production of transgenic Plants containing a promoter with the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 or a sequence derived from it.

Die Expression von Genen in embryonalen Transferzellen ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae. The expression of genes in embryonic transfer cells is also advantageous for all ornamental plants, useful or ornamental trees, Flowers, cut flowers, shrubs or lawn. Exemplary, however non-restrictive angiosperms, bryophytes such as Hepaticae (liverwort) and Musci (moss); Pteridophytes such as ferns, horsetail and lycopods; Gymnosperms such as conifers, cycads, ginkgo and gnetals; Algae like Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatoms) and Euglenophyceae.

Pflanzen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielhaft und nicht einschränkend die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendron und Azalee, Euphorbiaceae wie Weihnachtsstern und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelke, Solanaceae wie Petunie, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranie, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr. Plants within the scope of the invention include examples and not restricting the families of the Rosaceae such as Rose, Ericaceae like rhododendron and azalea, Euphorbiaceae like poinsettia and croton, Caryophyllaceae such as carnation, Solanaceae such as petunia, Gesneriaceae like the African violet, Balsaminaceae like that Balsam, orchidaceae like orchids, iridaceae like gladiolus, Iris, freesia and crocus, compositae such as marigold, geraniaceae like geranium, Liliaceae like the dragon tree, Moraceae like ficus, Araceae like Philodendron and others more.

Beispielhaft aber nicht einschränkend für Blütenpflanzen seien zu nennen die Familien der Leguminosae wie Erbse, Alfalfa und Soja; Gramineae wie Reis, Mais, Weizen; Solanaceae wie Tabak und andere mehr; die Familie der Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Sellerie)) und andere mehr; die Familie der Solanacea, besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr; die Familie der Leguminosae, besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) und andere mehr; und die Familie der Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli); und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana und andere mehr; die Familie der Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr. Exemplary but not restrictive for flowering plants to name the families of the leguminosae such as pea, alfalfa and Soy; Gramineae such as rice, corn, wheat; Solanaceae such as tobacco and others more; the Umbelliferae family, especially the genus Daucus (especially the kind carota (carrot)) and Apium (whole especially the kind graveolens dulce (celery)) and others more; the family of the Solanacea, especially the genus Lycopersicon, especially the type esculentum (tomato) and the genus Solanum, especially the type tuberosum (potato) and melongena (eggplant) and others more; and the genus Capsicum, especially the type annum (pepper) and others; the Family of the Leguminosae, especially the genus Glycine, whole especially the type max (soybean) and others more; and the Family of the Cruciferae, especially the genus Brassica, whole especially the species campestris (turnip), oleracea cv Tastie (cabbage), oleracea cv Snowball Y (cauliflower) and oleracea cv Emperor (Broccoli); and the genus Arabidopsis, especially the species thaliana and others more; the Compositae family, especially the genus Lactuca, especially the species sativa (salad) and others more.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola, Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika, Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula, Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinspecies. The transgenic plants according to the invention are selected in particular from monocotyledonous crop plants, such as, for example, cereals such as wheat, barley, millet, rye, triticale, maize, rice or oats, and sugar cane. Furthermore, the transgenic plants according to the invention are particularly selected from dicotyledonous crop plants, such as, for example
Brassicacae such as rapeseed, cress, arabidopsis, cabbage or canola, leguminosae such as soy, alfalfa, pea, alfalfa, bean family or peanut
Solanaceae such as potato, tobacco, tomato, aubergine or bell pepper, Asteraceae such as sunflower, tagetes, lettuce or calendula, Cucurbitaceae such as melon, pumpkin or zucchini,
as well as flax, cotton, hemp, flax, red pepper, carrot, carrot, sugar beet and the various tree, nut and wine species.

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder Arten die sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie zum Beispiel Ölsaaten wie Raps, Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss. Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis and all genera and Species that are used as food or feed, such as the described cereals, or species that are used for Suitable for the production of oils, such as oilseeds such as rapeseed, Types of nuts, soy, sunflower, pumpkin and peanut.

Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA- beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. The production of a transformed organism or one transformed cell requires that the corresponding DNA be in the corresponding host cell is introduced. For this Process, which is called transformation, stands a A variety of methods are available (see also Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). So DNA can be exemplary directly by microinjection or by bombardment with DNA coated microparticles are introduced. It can also Cell chemical, for example with polyethylene glycol, be permeabilized so that the DNA diffuses into the cell can reach. The DNA can also be obtained by protoplast fusion other DNA-containing units such as minicells, cells, Lysosomes or liposomes are made. Electroporation is another appropriate method of introducing DNA in which the cells be reversibly permeabilized by an electrical pulse.

Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion. In plants, the methods described are used Transformation and regeneration of plants from plant tissues or Plant cells for transient or stable transformation used. Suitable methods are, above all Protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene cannon, the so-called particle bombardment method, electroporation, incubation dry embryos in DNA-containing solution and the Microinjection.

Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobacterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. In addition to these "direct" transformation techniques, a Transformation also by bacterial infection using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes can be performed. These strains contain a plasmid (Ti or Ri plasmid) which is based on the plant is transmitted after Agrobacterium infection. On Part of this plasmid, called T-DNA (transferred DNA), is described in integrates the plant cell genome.

Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen. The Agrobacterium -mediated transformation is best for dicotyledons, diploid plant cells suitable, whereas the direct transformation techniques are suitable for every cell type.

Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien sein. The introduction of an expression cassette according to the invention in Cells, preferably in plant cells, can be beneficial under Using vectors can be realized. Vectors can exemplary plasmids, cosmids, phages, viruses or Agrobacteria.

In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen. In an advantageous embodiment, the introduction of Expression cassette realized using plasmid vectors. Preferred vectors are those which ensure stable integration of the Enable expression cassette into the host genome.

Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC- Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist es erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet. In the case of injection or electroporation of DNA into plant cells are not particularly demanding plasmid used. Simple plasmids like that of the pUC Series can be used. Should be whole plants be regenerated from the transformed cells, so it is required that an additional on the plasmid selectable marker gene is located.

Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikationsursprung für eine Vermehrung in E. coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 u. a. Transformation techniques are different for different monocots and dicotyledonous plant organisms. Also stand different possible plasmid vectors for introduction Foreign genes are available in plants that usually have one Origin of replication for propagation in E. coli and a Contain marker marker for a selection of transformed bacteria. Examples are pBR322, pUC series, M13mp series, pACYC184 and others. a.

Die Expressionskassette enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E. coli eingeführt. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. The expression cassette containing a promoter with the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 or one derived from it Sequence can be inserted into the vector using an appropriate Restriction interface will be introduced. The resulting plasmid is first introduced in E. coli. Correctly transformed E. coli are selected, grown and the recombinant plasmid with methods familiar to the person skilled in the art. restriction analysis and sequencing can serve to complete the cloning step check.

Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakterien und ist zum Beispiel das NPTIII-Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobakterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobakterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Depending on the method of DNA introduction, additional genes can be found on the Vector plasmid may be required. If agrobacteria are used, so the expression cassette is in special plasmids integrate, either into an intermediate vector (English: shuttle or intermediate vector) or a binary vector. If for example a Ti or Ri plasmid is to be used for transformation, is at least the right boundary, but mostly the right one and the left boundary of the Ti or Ri plasmid T-DNA as flanking region with the expression cassette to be inserted connected. Binary vectors are preferably used. binary Vectors can be found in both E. coli and Agrobacterium replicate. They usually contain a selection marker gene and a left or polylinker flanked by the right and left T-DNA restriction sequence. You can jump in Agrobacteria are transformed (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163: 181-187 (1978). The selection marker gene allows one Selection of transformed agrobacteria and is for example that NPTIII gene that confers resistance to kanamycin. This in Agrobacterium acting as the host organism in this case already contain a plasmid with the vir region. This is for the transfer of T-DNA to the plant cell is required. An agrobacterium transformed in this way can be used for transformation plant cells can be used.

Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.). The use of T-DNA to transform plant cells has been intensively investigated and described (EP 0 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci. 4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Various Binary vectors are known and some are commercially available such as pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).

Transformierte pflanzliche Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiele sind das bar Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al.,Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21(5): 871-884), das nptII Gen, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht. Transformed plant cells d. H. those who inserted DNA integrated into the DNA of the host cell, can be selected from untransformed if a selectable marker is part of the introduced DNA. Any gene that acts as a marker can act as an example Can confer resistance to antibiotics or herbicides. Transformed cells that express such a marker gene are able to in the presence of concentrations of one corresponding antibiotic or herbicide to survive the one kill untransformed wild type. Examples are the bar gene, which confers resistance to the herbicide phosphinotricin (Rathore KS et al., Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21 (5): 871-884), the nptII gene that confers resistance to kanamycin, the hpt gene, which confers resistance to hygromycin, or the EPSP gene which Gives resistance to the herbicide glyphosate.

Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemäßen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid, einen Metabolismusinhibitor wie z. B. 2-Deoxyglucose) oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. verleiht. Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist. For the transfer of the DNA to the plant cell herbal explants with Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes co-cultivated. Starting from infected Plant material (e.g. leaf, root or stem parts, but also Protoplasts or suspensions of plant cells) can be whole Plant using a suitable medium that for Example antibiotics or biocides for the selection of transformed Cells can be regenerated. The received Plants can then be introduced to the presence of DNA, here the expression cassette according to the invention are screened. Once the DNA is integrated into the host genome, the corresponding genotype is generally stable and the corresponding Insertion is also found in the following generations. The integrated expression cassette usually contains one Selection marker that shows resistance to the transformed plant against a biocide (for example a herbicide, a Metabolism inhibitor such as B. 2-deoxyglucose) or an antibiotic such as Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin or Phosphinotricin etc. gives. The plants obtained can in a conventional manner be bred and crossed. Two or more generations should to be cultivated to ensure that the genomic Integration is stable and inheritable.

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden. Once a transformed plant cell has been made, a whole plant using the skilled person known methods can be obtained. Here you go as an example from callus cultures. From these still undifferentiated Cell masses can cause sprout and root formation in a known manner be induced. The sprouts obtained can be planted out and be bred.

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden. The effectiveness of expression of the transgenic expressed Nucleic acids can, for example, in vitro Shoot meristem propagation using one of those described above Selection methods are determined.

Von Menschen und Tieren verzehrbare genetisch veränderte Pflanzen können direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden. Genetically modified plants that can be consumed by humans and animals can be used directly or after processing known per se Food or feed are used.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Pflanzen wobei eine Pflanze mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die die Entwicklung der Samen in denen Biosynthesegene zur Herstellung gewünschter Feinchemikalien oder Pharmazeutika manipuliert wurden, positiv stimulieren. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Pflanzenzellen bzw. Pflanzen sowie die Isolierung der Wertstoffe erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. So ist beispielsweise die Produktion von Pharmazeutika, wi Antikörpern oder Vakkzinen beschrieben bei Hood E. E., Jilka J. M. Curr. Opin Biotechnol. 1999, 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol. Immunol. 1999, 236: 275-92. The present invention also relates to a method for recombinant manufacture of pharmaceuticals or fine chemicals in plants being a plant with one of those described above Expression cassettes containing a promoter with the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 or a sequence derived from it is transformed and this expression cassette one or more Contains structural genes that affect the development of the seeds in those Biosynthetic genes for the production of desired fine chemicals or Pharmaceuticals have been manipulated to stimulate positively. This Process is for fine chemicals like enzymes, vitamins, Amino acids, sugar, fatty acids, natural and synthetic Flavors, aromas and colors can be used widely. Especially the production of tocopherols and tocotrienols is preferred as well as carotenoids. The breeding of the transformed Plant cells or plants and the isolation of the valuable substances takes place with methods known to the person skilled in the art. For example, the Production of pharmaceuticals, such as antibodies or vaccines described by Hood E. E., Jilka J. M. Curr. Opin biotechnol. 1999, 10 (4): 382-6; Ma JK, Vine ND. Curr Top Microbiol. Immunol. 1999, 236: 275-92.

Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zur Kontrolle von Genfunktionen in embryonalen Transferzellen von Samen beliebiger mono- und dicotyler Pflanzen mit Hilfe des SutP27 Promotors enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz mit ein. Eine vom SutP27 Promotor abgeleitete Sequenz, welche auch Teile der für das Gen des Sucrosetransporters codierende Sequenz enthält und als Translationsfusion mit einem funktionellen Gen verbunden ist, kann ebenfalls Teil der Erfindung sein. The present invention includes a method of control of gene functions in embryonic transfer cells from semen any mono- and dicotyledon plants using the SutP27 Promoters containing a promoter with the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 or a sequence derived from it. A sequence derived from the SutP27 promoter, which also contains parts of the contains sequence coding for the gene of the sucrose transporter and linked to a functional gene as a translation fusion is also part of the invention.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren, in denen durch Kontrolle des SutP27 Promotors oder Teilen davon, homologe oder heterologe Gene exprimiert oder ausgeschaltet werden und diese Regulation zur Verhinderung der Samenentwicklung führt. The present invention also relates to processes in which Control of the SutP27 promoter or parts thereof, homologous or heterologous genes are expressed or switched off and these Regulation leads to the prevention of seed development.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren, in denen durch Kontrolle des SutP27 Promotors oder Teilen davon, homologe oder heterologe Gene exprimiert oder ausgeschaltet werden und diese Regulation zu einer verbesserten Samenernährung und damit beispielsweise zu einer Ertragssteigerung führt. The present invention also relates to methods in which by control of the SutP27 promoter or parts thereof, homologous or heterologous genes are expressed or switched off and this regulation to improved semen nutrition and thus for example leads to an increase in earnings.

Da der durch diese Erfindung beschriebene Promoter enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz neben der Kontrolle der Expression embryonalen Transferzellen auch die Eigenschaft hat, schwächer in anderen Zellen und Geweben aktiv zu sein, betrifft diese Erfindung auch die Expression oder Suppression von homologen oder heterologen Genen im gesamten Samen, in der Hülse, in Fruchtgeweben und in anderen sink Geweben. Since the promoter described by this invention contains the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 or one derived from it Sequence in addition to the control of embryonic expression Transfer cells also have the property of being weaker in other cells and To be active in tissues, this invention also relates to Expression or suppression of homologous or heterologous genes in the entire seeds, in the pod, in fruit tissues and in other sink Tissues.

Gegenstand der Erfindung ist zuerst das Plasmid pSutP27, bestehend aus einer ca. 3,6 kb großen DNA-Sequenz, welches das etwa 0,8 kb große Promotorfragment des regulatorischen Starterbereiches des VfSut1 Gens aus Vicia faba in dem Plasmid pUC18 (Pos. 1129-350) enthält, siehe Fig. 1. The invention firstly relates to the plasmid pSutP27, consisting of an approximately 3.6 kb DNA sequence, which contains the approximately 0.8 kb promoter fragment of the regulatory starter region of the VfSut1 gene from Vicia faba in the plasmid pUC18 (item 1129- 350), see Fig. 1.

Gegenstand der Erfindung ist auch das Plasmid pSutPGUS, bestehend aus einer ca. 6 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 0,8 kb großes Promotorfragment des regulatorischen Starterbereiches des VfSut1 Gens aus Vicia faba, die etwa 2 kb große kodierende Region der β-Glucuronidase und der Transcriptionsterminator des Octopinsynthase Gens enthalten sind, siehe Fig. 2. The invention also relates to the plasmid pSutPGUS, consisting of an approximately 6 kb DNA sequence in which an approximately 0.8 kb promoter fragment of the regulatory starter region of the VfSut1 gene from Vicia faba, the approximately 2 kb coding region of the β -Glucuronidase and the transcription terminator of the octopine synthase gene are contained, see FIG. 2.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Plasmid pBISutPGUS, bestehend aus einer ca. 14,7 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 1,5 kb großes Kanamycin-Resistenzgen, ein etwa 0,8 kb großes Promotorfragment des regulatorischen Starterbereiches des VfSut1 Gens aus Vicia faba, die etwa 2 kb große kodierende Region der β-Glucuronidase und der Transcriptionsterminator des Nopalinsynthasegens enthalten sind, siehe Fig. 3. Another object of the invention is the plasmid pBISutPGUS, consisting of an approximately 14.7 kb DNA sequence in which an approximately 1.5 kb kanamycin resistance gene, an approximately 0.8 kb promoter fragment of the regulatory starter region of the VfSut1 gene from Vicia faba, which contain the approximately 2 kb coding region of the β-glucuronidase and the transcription terminator of the nopaline synthase gene, see FIG. 3.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Plasmid PTSutPGUS, bestehend aus einer ca. 13,9 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 1 kb großes Phosphinothricin-Resistenzgen, ein etwa 0,8 kb großes Promotorfragment des regulatorischen Starterbereiches des VfSut1 Gens aus Vicia faba, die etwa 2 kb große kodierende Region der β-Glucuronidase und der Transcriptionsterminator des Octopinsynthasegens enthalten sind, siehe Fig. 4. Another object of the invention is the plasmid PTSutPGUS, consisting of an approximately 13.9 kb DNA sequence in which an approximately 1 kb phosphinothricin resistance gene, an approximately 0.8 kb promoter fragment of the regulatory starter region of the VfSut1 gene from Vicia faba, the approximately 2 kb coding region of the β-glucuronidase and the transcription terminator of the octopine synthase gene are contained, see FIG. 4.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur genetischen Veränderung einer Pflanzenzelle oder Pflanze, enthaltend eine Expressionskassette mit einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur samenspezifischen Genexpression, das folgende Schritte beinhaltet:

• a) Isolation des Klons pSutP27, dadurch gekennzeichnet, dass die darin enthaltenden Nukleinsäuresequenzen die regulatorische Starterregion des Saccharosetransporter 1-Gens SEQ-ID No. 1 aus Vicia faba enthalten
• b) Herstellung des Plasmids pSutPGUS unter Verwendung des 0,78 kb großen Fragments des Plasmids pSutP27
• c) Herstellung der Plasmide pBISutPGUS unter Verwendung des 0,78 kb großen Fragments aus den Plasmiden pSutP27
• d) Herstellung des Plasmids PTSutPGUS unter Verwendung des 3,4 kb großen SalI/SmaI Fragments des Plasmids pSutPGUS
• e) Integration von Fremdgenen in eine Expressionskassette, die den SutP27 Promotor enthält
• f) Klonierung dieser Expressionskassette in Binärvektoren
• g) Transfer der Plasmide pBISutPGUS und PTSutPGUS in eine Pflanzenzelle
• h) Transfer der Expressionskassette, die ein Fremdgen unter der Kontrolle des SutP27 Promotors enthält, in eine Pflanzenzelle.

The invention also relates to a method for the genetic modification of a plant cell or plant, comprising an expression cassette with a nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 on seed-specific gene expression, which includes the following steps:

• a) Isolation of the clone pSutP27, characterized in that the nucleic acid sequences contained therein the regulatory starter region of the sucrose transporter 1 gene SEQ-ID No. 1 from Vicia faba included
• b) Preparation of the plasmid pSutPGUS using the 0.78 kb fragment of the plasmid pSutP27
• c) Preparation of the plasmids pBISutPGUS using the 0.78 kb fragment from the plasmids pSutP27
• d) Preparation of the plasmid PTSutPGUS using the 3.4 kb SalI / SmaI fragment of the plasmid pSutPGUS
• e) Integration of foreign genes in an expression cassette that contains the SutP27 promoter
• f) Cloning of this expression cassette in binary vectors
• g) Transfer of the plasmids pBISutPGUS and PTSutPGUS into a plant cell
• h) Transfer of the expression cassette, which contains a foreign gene under the control of the SutP27 promoter, into a plant cell.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur genetischen Veränderung einer Pflanzenzelle oder Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass eine beliebige Expressionskassette enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 in eine pflanzliche Zelle eingebracht wird und diese Expressionskassette nach Regeneration der transformierten Zellen zur Ganzpflanze eine samenspezifische Genexpression bewirkt. Darüber hinaus ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur Expression homologer oder heterologer Gene in Samen transformierter Pflanzen, hier besonders in den Transferzellen von pflanzlichen Embryonen. The invention further relates to a method for genetic modification of a plant cell or plant, characterized in that any expression cassette containing the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 in one plant cell is introduced and this expression cassette after Regeneration of the transformed cells to a whole plant seed-specific gene expression. The invention also relates to its use a nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 for expression homologous or heterologous genes in seeds of transformed plants, here especially in the transfer cells of plant embryos.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur Expression von Genen, die die Qualität von Samen verändern, zur Regulation endogener Prozesse, zur Herstellung heterologer Produkte in Kulturpflanzen, zur Expression von Genen, die durch ihre Funktion in den Transferzellen des Embryo zu einer verbesserten Aufnahme von Metaboliten führen und so die erhöhte Speicherung von endogenen Produkten als auch von Produkten manipulierter Stoffwechselwege ermöglichen, zur Expression von Genen, die die Entwicklung der Pflanzensamen verändern, wobei die Entwicklung der Pflanzensamen auch verhindert werden kann, zur Expression von Genen in Sink- Geweben, in Früchten, wie beispielsweise in Tomatenfrüchten. The invention further relates to the use of a Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 for the expression of genes, that change the quality of seeds, to regulate endogenous Processes for the production of heterologous products in Cultivated plants, for the expression of genes by their function in the transfer cells of the embryo for an improved uptake of Metabolites lead and so the increased storage of endogenous Products as well as products of manipulated metabolic pathways enable expression of genes that are responsible for the development of the Plant seeds change, the development of plant seeds can also be prevented for expression of genes in sink Tissues, in fruits such as tomato fruits.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend einen Promotor mit der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 oder einer davon abgeleiteten Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Kassette in Bakterienstämme transferiert wird und die entstandenen rekombinanten Klone zur Transformation von mono- oder dicotylen Pflanzen verwendet, Pflanzen die im Samen veränderte oder neue Genprodukte exprimieren, selektiert, genetisch stabile Linien gezüchtet und ggf. die Genprodukte aus den Samen der transgenen Pflanzen extrahiert werden. The invention further relates to the use of a Expression cassette containing a promoter with the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 or a sequence derived from it, characterized in that the cassette in bacterial strains is transferred and the resulting recombinant clones Transformation of mono- or dicotyledonous plants used Plant the genetically modified or new gene products express, selected, genetically stable lines bred and possibly the gene products from the seeds of the transgenic plants be extracted.

Die vorliegende Erfindung betrifft jeden Vektor, jede Expressionskassette, jede Zelle, jede Pflanze, die Nachkommenschaften der Pflanzen und die Samen der Pflanzen, die eine Nukleinsäure mit einer Homologie von mehr als 60% oder eine identische Abfolge von 24 Basenpaaren im Vergleich zum SutP27 Promoter und seiner Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 enthält. The present invention relates to any vector, any Expression cassette, every cell, every plant, the offspring of plants and the seeds of plants that contain a nucleic acid with a homology of more than 60% or an identical one Sequence of 24 base pairs compared to the SutP27 promoter and its nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 contains.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher charakterisiert, die jedoch nicht limitierend für die Erfindung sind. The present invention is illustrated by the following examples characterized in more detail, but not limiting for the Are invention.

Allgemeine KlonierungsverfahrenGeneral cloning procedures

Rekombinante DNA Techniken wurden entsprechend Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982) durchgeführt. Die eingesetzten Enzyme wurden nach Vorschrift angewendet. Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18 (Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33(1985), 103-119), pBK-CMV (Stratagene) und pOCS1 (Plant Genetic Systems, Gent, Belgien) verwendet. Für die Pflanzentransformation wurden die Vektoren pBI101 und pGPTV-BAR (Becker, E, et al., Plant Mol. Biol. 20(1992), 1195-1197) eingesetzt. Recombinant DNA techniques were developed according to Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982). The Enzymes used were used according to the instructions. For cloning the vectors pUC18 (Yanisch-Perron, C. et al., Gene 33 (1985), 103-119), pBK-CMV (Stratagene) and pOCS1 (Plant Genetic Systems, Ghent, Belgium). For plant transformation the vectors pBI101 and pGPTV-BAR (Becker, E, et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1195-1197).

Für die Transformation in E. coli wurde der Stamm DH5α (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166(1983), 557-580) verwendet. Die Agrobakterienstämme EHA 105, GV3101 und LBA4404 wurden nach An, G., Mol. Gen. Genet. 207(1987), 210-216 mittels Frost-Tau- Methode direkt transformiert. The strain DH5α was used for the transformation into E. coli (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580). The Agrobacterial strains EHA 105, GV3101 and LBA4404 were identified An, G., Mol. Gen. Genet. 207 (1987), 210-216 using freeze-thaw Method transformed directly.

Die Transformation von Nicotiana tabacum erfolgte mit Hilfe der Blattscheibchenmethode, die Transformation von Arabidopsis thaliana durch in planta Infiltration und die Transformation von Raps (Brassica napus, Westar) durch Petiolentransformation über Agrobakterien vermittelten Gentransfer. The transformation of Nicotiana tabacum was done with the help the leaf disc method, the transformation of Arabidopsis thaliana through in planta infiltration and the transformation of Oilseed rape (Brassica napus, Westar) via petiol transformation Agrobacteria mediated gene transfer.

Die genomische DNA transgener Tabak, Arabidopsis und Raps Pflanzen wurde mit Hilfe des DNA-Isolierungskit der Firma Macherey & Nagel isoliert. In einem ersten Schritt wurden die transgenen Linien über PCR mit genspezifischen Primern identifiziert. Die Integration der Fremd-DNA wurde mittels "Southernblot" - Analysen von 20 µg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung untersucht. The genomic DNA of transgenic tobacco, arabidopsis and rapeseed Planting was done using the company's DNA isolation kit Macherey & Nagel isolated. In a first step the transgenic lines via PCR with gene-specific primers identified. The integration of the foreign DNA was carried out using "Southern blot" analyzes of 20 µg DNA for a suitable one Restriction cleavage examined.

Das Reportergen β-Glucuronidase ist ein bakterielles Enzym, das sowohl quantitativen als auch histochemischen Aktivitäts- bestimmungen zugänglich ist. Gewebeproben wurden in 1 mM X-Gluc, 50 mM Na-Phosphat (pH 7,0) und 0,1% Tween 20 über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Glucuronidaseaktivität in den transgenen Linien wurden wie bei Jefferson, R. A., Plant Molec. Biol. Rep 5(1987), 387-405) nach Extraktion der Gewebe durch den Umsatz von 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid quantitativ bestimmt. The reporter gene β-glucuronidase is a bacterial enzyme which is both quantitative and histochemical activity provisions is accessible. Tissue samples were made in 1 mM X-Gluc, 50 mM Na phosphate (pH 7.0) and 0.1% Tween 20 overnight at 37 ° C incubated. Glucuronidase activity in the transgenic lines were, as in Jefferson, R.A., Plant Molec. Biol. Rep 5 (1987), 387-405) after extraction of the tissues by the turnover of 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide quantified.

Beispiel 1example 1 Isolierung der regulatorischen Sequenzen des VfSUT1 GensIsolation of the regulatory sequences of the VfSUT1 gene

Der die regulatorischen Sequenzen und die 5' untranslatierte Region enthaltende SutP27 Promotor wurde mit Hilfe des "Universal GenomeWalker™Kit" der Firma CLONTECH (Palo Alto, USA) amplifiziert. Die genspezifischen Primern SucaP1, Position 209 (5'-GATGGATACCGAGGAGCTGGACGTAGGGAG-3'), SucaP2, Position 142 (5,- TTGTCGACCGGCTGCGATGGATGCAACCACC-3') und SucaP3, Position 108 (5'-CGGAGGGGACTTGGTTCAAGAG-3') wurden von der Sequenz des cDNA Klons VfSut1 (Weber et al., The Plant Cell 9(1997), 895-908), Acc. Nr. Z93774) abgeleitet. The regulatory sequences and the 5 'untranslated Region-containing SutP27 promoter was identified using the "Universal GenomeWalker ™ Kit "from CLONTECH (Palo Alto, USA) amplified. The gene-specific primers SucaP1, position 209 (5'-GATGGATACCGAGGAGCTGGACGTAGGGAG-3 '), SucaP2, position 142 (5, - TTGTCGACCGGCTGCGATGGATGCAACCACC-3 ') and SucaP3, position 108 (5'-CGGAGGGGACTTGGTTCAAGAG-3 ') were derived from the sequence of the cDNA Clones VfSut1 (Weber et al., The Plant Cell 9 (1997), 895-908), Acc. Z93774).

Nach vorheriger Spaltung der genomischen DNA von Vicia faba mit ScaI (a) bzw. Stul (b) und Ligation der Adaptoren wurde entsprechend der Beschreibung des Kits eine Zweischritt-PCR nach folgenden Parametern durchgeführt: 7 Zyklen à 94°C, 2 Sekunden, 72°C, 3 Minuten und 32 Zyklen à 94°C, 2 Sekunden 67°C, 3 Minuten und 4 Minuten 67°C. Die PCR-Ansätze wurden 1 : 50 verdünnt und jeweils 1 µl in einer zweiten PCR (5 Zyklen à 94°C, 2 Sekunden, 72°C, 3 Minuten und 20 Zyklen à 94°C, 2 Sekunden, 67°C und 4 Minuten bei 67°C amplifiziert. Nach einem dritten PCR Schritt (Primer SucaP3 und Adaptorprimer AP2) konnte mit Hilfe eines Southern Blots eine Bande von 0,78 kb verifiziert werden, die dann in pUC18 kloniert und anschließend sequenziert wurde. Der Klon pSutP27 konnte durch Sequenzvergleich als der zum Gen VfSut1 zugehörige Promotor identifiziert werden. Um zu zeigen, dass der SutP27 Promoter kein chimäres Produkt ist, wurden mit Hilfe zwei weiterer Primer P27/1 (5'-CTTGTAAATTAAATTTCCATCCt-3') und P27/2 (5'-CCCTTATCCTAAACCATTTCCTTGC-3') aus der genomischen Vicia faba DNA PCR-Fragmente amplifiziert und sequenziert, die die genomische Herkunft des Promotors belegen. Die Restriktionskarte des Klons pSutP27 ist in Fig. 1 und die Sequenz ist im Sequenzprotokoll SEQ-ID No. 1 wiedergegeben. Die Zahlen in Fig. 1 zeigen die Positionen der Restriktionsendonukleasen. After the Vicia faba genomic DNA had previously been cleaved with ScaI (a) or Stul (b) and the adapters had been ligated, a two-step PCR was carried out according to the description of the kit according to the following parameters: 7 cycles of 94 ° C., 2 seconds, 72 ° C, 3 minutes and 32 cycles of 94 ° C, 2 seconds 67 ° C, 3 minutes and 4 minutes 67 ° C. The PCR batches were diluted 1:50 and each 1 µl in a second PCR (5 cycles of 94 ° C, 2 seconds, 72 ° C, 3 minutes and 20 cycles of 94 ° C, 2 seconds, 67 ° C and 4 Minutes amplified at 67 ° C. After a third PCR step (primer SucaP3 and adapter primer AP2), a band of 0.78 kb was verified using a Southern blot, which was then cloned into pUC18 and subsequently sequenced Sequence comparison are identified as the promoter belonging to the gene VfSut1 In order to show that the SutP27 promoter is not a chimeric product, two further primers P27 / 1 (5'-CTTGTAAATTAAATTTCCATCCt-3 ') and P27 / 2 (5'- CCCTTATCCTAAACCATTTCCTTGC-3 ') amplified and sequenced from the Vicia faba genomic DNA PCR fragments which confirm the genomic origin of the promoter The restriction map of the clone pSutP27 is shown in Fig. 1 and the sequence is shown in the sequence listing SEQ-ID No. 1. The numbers in Fig. 1 show the positions of the restriction endonucleases.

Beispiel 2Example 2 Nachweis der samenspezifischen Expression in TabakEvidence of seed-specific expression in tobacco

Mit Hilfe des Reportergens der β-Glucuronidase wurde die samenspezifische Expression der isolierten regulatorischen Sequenz SutP27 überprüft. Dazu wurde das Binärplasmid pBI101 (Jefferson, Plant Molec. Biol. Rep. 5(1987), 387-405), welches das promotorlose β-Glucuronidase Gen hinter einem Polylinker enthält, mit SmaI geschnitten und dephosphoryliert. Aus dem Plasmid pSutP27 wurde mittels einer BamHI/NcoI Spaltung der Promotor isoliert und die Enden geglättet. Das Fragment wurden anschließend in den SmaI- Ort des Binärplasmides pBI101 vor das Reportergen kloniert, wobei das Plasmid pBISutPGUS entstanden ist. Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pBISutPGUS, Die Abkürzungen bedeuten: NPTIII: bakterielle Kanamycinresistenz; SutP: SutP27 Promotor; GUS: Reportergen, kodierend für die β-Glucuronidase aus E. coli; nosP und nosT: Promotor und Terminator des Nopalinsynthase Gens aus Agrobakterium tumefaciens, NPTII: Pflanzliche Kanamycinresistenz; LB: Linke Border, RB: rechte Border. The seed-specific expression of the isolated regulatory sequence SutP27 was checked with the help of the reporter gene of the β-glucuronidase. For this purpose, the binary plasmid pBI101 (Jefferson, Plant Molec. Biol. Rep. 5 (1987), 387-405), which contains the promoterless β-glucuronidase gene behind a polylinker, was cut with SmaI and dephosphorylated. The promoter was isolated from the plasmid pSutP27 by means of a BamHI / NcoI cleavage and the ends were smoothed. The fragment was then cloned into the SmaI site of the binary plasmid pBI101 in front of the reporter gene, the plasmid pBISutPGUS being formed. Fig. 3 shows the restriction map of the plasmid pBISutPGUS, The abbreviations: nptIII: bacterial kanamycin resistance; SutP: SutP27 promoter; GUS: reporter gene coding for the β-glucuronidase from E. coli; nosP and nosT: promoter and terminator of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens, NPTII: plant kanamycin resistance; LB: left border, RB: right border.

Dieses Plasmid wurde anschließend in den Agrobakterienstamm EHA105 transferiert und die das SutP27-Promotor/Glucuronidase Gen enthaltenen Agrobakterien für die Transformation von Tabak ein- gesetzt. Embryos einer mit pBISutPGUS transformierten transgenen Tabaklinie wurden 8 Tage bzw. 25 Tage nach Bestäubung mit X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide, cyclohexylammoniumsalz) gefärbt. Die Analyse der transgenen Tabaksamen zeigt eine Blaufärbung und damit eine Aktivität der Glucuronidase im Embryo des Tabaksamens im Transferzellbereich und entsprechend der Samenentwicklung. Überraschend war, dass im Gegensatz zu den Northern Daten des nativen Gens VfSut1 keinerlei Blaufärbung in den Wurzeln oder in den sink und source Blättern transgener Tabakpflanzen gefunden wurde. Diese Daten zeigen, dass die isolierten regulatorischen Sequenzen, die mit dem β-Glucuronidase Gen fusioniert wurden, eine spezifische Expression in den Transferzellschichten des Tabakembryos vermitteln. This plasmid was then in the agrobacterial strain EHA105 transferred and the SutP27 promoter / glucuronidase gene contained Agrobacteria for the transformation of tobacco set. Embryos of a transgenic transformed with pBISutPGUS Tobacco lines were 8 days and 25 days after pollination with X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide, cyclohexylammonium salt) colored. Analysis of the transgenic tobacco seeds shows one Blue staining and thus an activity of glucuronidase in the embryo the tobacco seed in the transfer cell area and corresponding to the Seed development. It was surprising that unlike the Northern data of the native gene VfSut1 no blue staining transgenic in the roots or in the sink and source leaves Tobacco plants was found. These data show that the isolated regulatory sequences associated with the β-glucuronidase A specific expression in the gene were fused Mediate transfer cell layers of the tobacco embryo.

Beispiel 3Example 3 Nachweis der transienten Expression in Embryonen von Vicia narbonensis, Raps, Lein und TomatenfrüchtenDetection of transient expression in Vicia embryos narbonensis, rapeseed, flax and tomato fruit

Zur transienten Analyse wurde der SutP27 Promotor als NcoI/SalI Fragment in den mit NcoI und SalI geschnittenen Vektor pGUS1 kloniert. Das resultierende Konstrukt - siehe Fig. 2 - wurde pSutPGUS genannt. Die Abkürzungen in Fig. 2 bedeuten: amp: Ampicillinresistenz; SutP: SutP27 Promotor; GUS: Reportergen, kodierend für die β-Glucuronidase aus E. coli; ocs: Terminator des Octopinsynthase Gens aus Agrobakterium tumefaciens. Präparierte Embryonen mittleren Stadiums von Vicia narbonensis, Raps (Brassica napus), Tomate und Lein (Linum usitatisium) wurden mit pSutPGUS und mit Hilfe der Partikelkanone "Biolistics" von der Firma "BioRad" beschossen. Folgende Bedingungen waren erfolg- reich: Coating Ansatz: 25 µl Gold (1,6 µm), 10 µl DNA (1 µg/µl), 25 µl CaCl₂ (2,5 M), 10 µl Spermidine (0,1 mM); 1800 Psi, 26 inch Hg. Die auf MS Agar beschossenen Embryonen wurden für 2 Tage in flüssigem MS Medium kultiviert und anschließend mit X-Gluc über Nacht bei 37°C inkubiert. Blaue Spots auf der Oberfläche der beschossenen Explantate zeigten die Aktivität des Promotors für alle untersuchten Embryonen von Vicia narbonensis, Brassica napus, und Lein (Linum usit). Im Fleisch von beschossenen Tomatenfrüchten (Lycopersicum esculentum) wurden ebenfalls blaue Spots gefunden, die zeigen, dass der Promoter auch in dem den Samen umgebenden Gewebe aktiv ist. For transient analysis, the SutP27 promoter was cloned as an NcoI / SalI fragment into the vector pGUS1 cut with NcoI and SalI. The resulting construct - see Figure 2 - was called pSutPGUS. The abbreviations in Fig. 2 mean: amp: ampicillin resistance; SutP: SutP27 promoter; GUS: reporter gene coding for the β-glucuronidase from E. coli; ocs: terminator of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens. Prepared middle-stage embryos from Vicia narbonensis, oilseed rape (Brassica napus), tomato and flax (Linum usitatisium) were bombarded with pSutPGUS and with the aid of the "Biolistics" particle cannon from "BioRad". The following conditions were successful: Coating approach: 25 µl gold (1.6 µm), 10 µl DNA (1 µg / µl), 25 µl CaCl ₂ (2.5 M), 10 µl spermidine (0.1 mM) ; 1800 psi, 26 inch Hg. The embryos bombarded on MS agar were cultivated for 2 days in liquid MS medium and then incubated with X-Gluc at 37 ° C. overnight. Blue spots on the surface of the bombarded explants showed the activity of the promoter for all embryos examined from Vicia narbonensis, Brassica napus, and flax (Linum usit). Blue spots were also found in the meat of bombarded tomato fruits (Lycopersicum esculentum), which show that the promoter is also active in the tissue surrounding the seeds.

Beispiel 4Example 4 Nachweis der samenspezifischen Expression in Arabidopsis und in RapsEvidence of seed-specific expression in Arabidopsis and in rapeseed

Zur Transformation von Arabidopsis thaliana (Coluxnbia) und Raps (Brassica napus, Westar) wurde das partiell EcoRI und HindIII gespaltene Fragment des pSutPGUS in den mit EcoRI und HindIII gespaltenen Vektor pGPTV-Bar kloniert. Das resultierende Konstrukt wurde PTSutPGUS genannt - siehe Fig. 4 - und in die Agrobakterien Stämme EHA 105, LBA4404 und GV3101 transformiert. Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids PTSutPGUS. Die Abkürzungen bedeuten: SutP: SutP27 Promotor; GUS: Reportergen, kodierend für die β-Glucuronidase aus E. coli; ocs: Terminator des Octopinsynthase Gens aus Agrobakterium tumefaciens; nosP: Promotor des Nopalinsynthase Gens aus Agrobakterium tumefaciens; bar: BASTA Resistenz, pAG7: Terminator des G7 Gens aus Agrobakterium tumefaciens. Nach den bei den allgemeinen Klonierungsverfahren beschriebenen Methoden sind Arabidopsis und Raps transformiert worden. GUS Staining zeigte die erwartete Blaufärbung der Embryonen. In anderen Geweben wurde keine GUS Färbung beobachtet. SEQUENCE LISTING

For the transformation of Arabidopsis thaliana (Coluxnbia) and oilseed rape (Brassica napus, Westar), the fragment of pSutPGUS which was partially cleaved by EcoRI and HindIII was cloned into the vector pGPTV-Bar cleaved by EcoRI and HindIII. The resulting construct was named PTSutPGUS - see FIG. 4 - and transformed into the agrobacterial strains EHA 105, LBA4404 and GV3101. Fig. 4 shows the restriction map of the plasmid PTSutPGUS. The abbreviations mean: SutP: SutP27 promoter; GUS: reporter gene coding for the β-glucuronidase from E. coli; ocs: terminator of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens; nosP: promoter of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens; bar: BASTA resistance, pAG7: terminator of the G7 gene from Agrobacterium tumefaciens. Arabidopsis and oilseed rape have been transformed using the methods described in the general cloning processes. GUS staining showed the expected blue color of the embryos. No GUS staining was observed in other tissues. SEQUENCE LISTING

Claims (25)

1. Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 enthaltend einen Promotor, der Genexpression in Pflanzen vermittelt. 1.Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 containing a promoter, of gene expression in plants. 2. Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 1, wobei die Genexpression spezifisch in Pflanzensamen erfolgt. 2.Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to claim 1, wherein gene expression occurs specifically in plant seeds. 3. Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpression in den Transferzellen pflanzlicher Embryonen erfolgt. 3.Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to claim 2, characterized characterized that gene expression in the transfer cells vegetable embryos. 4. Expressionskassette zur Expression von beliebigen homologen oder heterologen Genen in Pflanzensamen, insbesondere in Transferzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 1, Teile dieser Sequenz oder Nukleinsäuresequenzen, die mit SEQ-ID No. 1 hybridisieren, enthält. 4. Expression cassette for the expression of any homologous or heterologous genes in plant seeds, especially in Transfer cells, characterized in that they are the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to claim 1, parts thereof Sequence or nucleic acid sequences starting with SEQ-ID No. 1 hybridize contains. 5. Expressionskassette nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Fremdgene sowohl als Transkriptions- als auch als Translationsfusionen integriert werden können. 5. Expression cassette according to claim 4, characterized in that foreign genes both as transcription and as Translation fusions can be integrated. 6. Expressionskassette zur Suppression von beliebigen homologen oder heterologen Genen in Pflanzensamen, insbesondere in Transferzellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 1, Teile dieser Sequenz oder Nukleinsäuresequenzen, die mit SEQ-ID No. 1 hybridisieren, enthält. 6. Expression cassette for the suppression of any homologous or heterologous genes in plant seeds, especially in Transfer cells, characterized in that they are the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to claim 1, parts thereof Sequence or nucleic acid sequences starting with SEQ-ID No. 1 hybridize contains. 7. Plasmid enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4, 5 oder 6. 7. plasmid containing an expression cassette according to claim 4, 5 or 6. 8. Verfahren zur genetischen Veränderung einer Pflanzenzelle oder Pflanze, enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4, 5 oder 6 mit einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur samenspezifischen Genexpression, das folgende Schritte beinhaltet: a) Isolation des Klons pSucP27, dadurch gekennzeichnet, dass die darin enthaltenden Nukleinsäuresequenzen die regulatorische Starterregion des Saccharosetransporter 1-Gens aus Vicia faba enthalten b) Herstellung des Plasmids pSutPGUS unter Verwendung des 0,78 kb großen Fragments des Plasmids pSutP27 c) Herstellung des Plasmids pBISutPGUS unter Verwendung des 0,78 kb großen Fragments aus den Plasmiden pSutP27 d) Herstellung des Plasmids PTSutPGUS unter Verwendung des 3, 4 kb großen SalI/SmaI Fragments des Plasmids pSutPGUS e) Integration von Fremdgenen in eine Expressionskassette, die den SutP27 Promoter enthält f) Klonierung dieser Expressionskassette in Binärvektoren g) Transfer der Plasmide pBISutPGUS und PTSutPGUS in eine Pflanzenzelle h) Transfer der Expressionskassette, die ein Fremdgen unter der Kontrolle des SutP27 Promotors enthält, in eine Pflanzenzelle. 8. A method for the genetic modification of a plant cell or plant, comprising an expression cassette according to claim 4, 5 or 6 with a nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 on seed-specific gene expression, which includes the following steps: a) Isolation of the clone pSucP27, characterized in that the nucleic acid sequences contained therein contain the regulatory starter region of the sucrose transporter 1 gene from Vicia faba b) Preparation of the plasmid pSutPGUS using the 0.78 kb fragment of the plasmid pSutP27 c) Preparation of the plasmid pBISutPGUS using the 0.78 kb fragment from the plasmids pSutP27 d) Preparation of the plasmid PTSutPGUS using the 3.4 kb SalI / SmaI fragment of the plasmid pSutPGUS e) Integration of foreign genes in an expression cassette containing the SutP27 promoter f) Cloning of this expression cassette in binary vectors g) Transfer of the plasmids pBISutPGUS and PTSutPGUS into a plant cell h) Transfer of the expression cassette, which contains a foreign gene under the control of the SutP27 promoter, into a plant cell. 9. Verfahren zur genetischen Veränderung einer Pflanzenzelle oder Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass eine beliebige Expressionskassette enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 in eine pflanzliche Zelle eingebracht wird und diese Expressionskassette nach Regeneration der transformierten Zellen zur Ganzpflanze eine samenspezifische Genexpression bewirkt. 9. Procedure for the genetic modification of a plant cell or plant, characterized in that any Expression cassette containing the nucleic acid sequence SEQ ID No. 1 is introduced into a plant cell and this expression cassette after regeneration of the transformed cells into whole plants a seed-specific Gene expression causes. 10. Verfahren zur genetischen Veränderung einer Pflanzenzelle oder Pflanze gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpression in den Transferzellen des Samens erfolgt. 10. Procedure for the genetic modification of a plant cell or plant according to claim 8 or 9, characterized in that that gene expression in the transfer cells of the seed he follows. 11. Pflanzenzelle, hergestellt nach einem Verfahren des Anspruchs 8 oder 9. 11. Plant cell, produced by a process of Claim 8 or 9. 12. Pflanzliches Gewebe, regeneriert aus einer Pflanzenzelle gemäß Anspruch 11. 12. Vegetable tissue, regenerated from a plant cell according to claim 11. 13. Pflanze, regeneriert aus pflanzlichem Gewebe gemäß Anspruch 12. 13. Plant regenerated from plant tissue according to Claim 12. 14. Pflanzenzelle, enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4, 5 oder 6. 14. Plant cell containing an expression cassette according to Claim 4, 5 or 6. 15. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 1 zur Expression homologer oder heterologer Gene in Samen transformierter Pflanzen. 15. Use of a nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to Claim 1 for the expression of homologous or heterologous genes plants transformed into seeds. 16. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 1 zur Expression homologer oder heterologer Gene in Transferzellen von Samen transformierter Pflanzen. 16. Use of a nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to Claim 1 for the expression of homologous or heterologous genes in transfer cells from seeds of transformed plants. 17. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 gemäß Anspruch 1 zur Expression von Genen, die die Qualität von Samen verändern. 17. Use of a nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 according to Claim 1 for the expression of genes, the quality of Change seeds. 18. Verwendung der Plasmide pSutP27, pSutPGUS, pBISutPGUS, PTSutPGUS oder deren Derivate enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur Transformation von Kulturpflanzen. 18. Use of the plasmids pSutP27, pSutPGUS, pBISutPGUS, PTSutPGUS or its derivatives containing the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 for the transformation of crops. 19. Verwendung der Plasmide pSutP27, pSutPGUS, pBISutPGUS, PTSutPGUS oder deren Derivate enthaltend die Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 zur Regulation endogener Prozesse oder zur Herstellung heterogener Produkte in Kulturpflanzen. 19. Use of the plasmids pSutP27, pSutPGUS, pBISutPGUS, PTSutPGUS or its derivatives containing the Nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 for the regulation of endogenous processes or for the production of heterogeneous products in crops. 20. Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 nach Anspruch 1 zur Expression von Genen, die durch ihre Funktion in den Transferzellen des Embryo zu einer verbesserten Aufnahme von Metaboliten führen und so die erhöhte Speicherung von endogenen Produkten als auch von Produkten manipulierter Stoffwechselwege ermöglichen. 20. Use of the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 after Claim 1 for the expression of genes by their function in the embryo's transfer cells to an improved one Lead to metabolite uptake and thus increased storage of endogenous products as well as products manipulated Enable metabolic pathways. 21. Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 nach Anspruch 1 zur Expression von Genen, die die Entwicklung der Pflanzensamen verändern. 21. Use of the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 after Claim 1 for the expression of genes that development change the plant seeds. 22. Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 nach Anspruch 1 zur Expression von Genen, die die Entwicklung der Pflanzensamen verhindern. 22. Use of the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 after Claim 1 for the expression of genes that development prevent the plant seeds. 23. Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 nach Anspruch 1 zur Expression von Genen in sink-Geweben. 23. Use of the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 after Claim 1 for the expression of genes in sink tissues. 24. Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 nach Anspruch 1 zur Expression von Genen in Früchten. 24. Use of the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 after Claim 1 for the expression of genes in fruits. 25. Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ-ID No. 1 nach Anspruch 1 zur Expression von Genen in Tomatenfrüchten. 25. Use of the nucleic acid sequence SEQ-ID No. 1 after Claim 1 for the expression of genes in tomato fruits.