DE10119006A1 - Verfahren zur Verbesserung der Stabilität linearer DNA in zellfreien in vitro Transkriptions/Translations-Systemen - Google Patents

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verbesserung der Stabiltät linearer kurzer DNA gegenüber Exonukleasen in zellfreien DNA-abhängigen in vitro Transkriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in zellulären Exonuklease-haltigen Proteinexpressions-Systemen, wobei die Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch die Zugabe unspezifischer linearer DNA erreicht wird.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Verbesserung der Stabilität linearer kurzer DNA gegenüber Exonukleasen in zellfreien in vitro Transkriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in zellulären Systemen wobei die Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch die Zugabe unspezifischer linearer DNA erreicht wird.

Die zellfreie DNA-abhängige in vitro Transkription/Translation funktioniert in der Praxis recht gut in Verbindung mit der Expression zirkulärer Doppel-Helix DNA und in Verbindung mit der Expres­ sion langer linearer DNA. Versuche zur Expression von kürzeren linearen DNA-Stücken waren nur sehr begrenzt erfolgreich. Je kleiner die eingesetzte DNA desto schwieriger war es, nennenswerte Mengen Genprodukt zu erhalten. Es konnte nachgewiesen werden, daß diese Schwierigkeiten durch die Anwesenheit von Exonukleasen bedingt waren. So wurde gezeigt, daß bei der in vitro Transkrip­ tion und Translation mit S30 Lysaten von E. coli die Exonuklease V für den Abbau linearer DNA ver­ antwortlich ist. Die Exonuklease V besteht aus drei Untereinheiten (den Genprodukten recB, recC, recD). Diese Exonuklease spaltet dabei die lineare DNA von Ihrem 3'Ende her.

Es wurde versucht, diese Schwierigkeit zu beseitigen, indem die Untereinheiten dieser Exonuklease mutiert wurden, um die lytische Aktivität zu beseitigen. Yang et al., (1980) PNAS Vol. 77, No. 12, pp 7029-7033 beschreiben eine verbesserte Proteinsynthese ausgehend von linearen DNA-Templaten mit dem E. coli Stamm CF300 nach Deletion der Exonuklease V (Elimination der Gene recB recC; Stamm recB21).

Leavel Basset et al., 1983 haben den recB21 Stamm zusätzlich in RNase- und Polynukleotid-Phos­ phorylasegenen (rna-19 pnp-7) mutiert (Stamm CLB7) und mit linearen DNA-Templaten nach 1 h Inkubationszeit eine signifikant höhere Proteinexpression erzielt.

Lesley et al., 1991 arbeiten mit einem Exonuklease V defizienten recD BL21 Stamm, der als SL119 Stamm bezeichnet wird und beschreiben erstmals die Methode der in vitro Proteinsynthese ausgehend von PCR-generierten Templaten. Lysate des Stamms SL119 werden kommerziell zur in vitro Transkription/Translation mit linearen Templaten angeboten (Promega).

Der Nachteil der oben beschriebenen Maßnahmen ist jedoch, daß all diese Mutanten langsamer wachsen und auch die aus diesen Stämmen gewonnenen Lysate eine signifikant schlechtere Synthe­ seleistung aufweisen. Anscheinend spielt diese Exonuklease im Stoffwechsel der Bakterien eine wich­ tige Rolle. Daher scheint es wichtig, Lysate zu verwenden oder Zellkulturen, in denen Exonukleasen anwesend sind.

Eine weitere vorstellbare Maßnahme, um die Nukleinsäuren dennoch vor exonukleolytischen Abbau zu schützen, besteht in der Modifizierung der Nukleinsäuren durch Schutz der beiden Enden, oder über modifizierte Nukleotidbausteine, wie es in der Literatur für Nukleinsäuren auf dem Antisense- Gebiet beschrieben ist und in den folgenden Zitaten ausgeführt wird.

Einzelsträngige DNA/RNA-Moleküle können durch Endschutz mit Alkylgruppen und Modifizierung der Basen geschützt werden; Pandolfi et al., (1999) Nucleosides & Nudeotides. 18(9), 2051-2069. Verheijen et al. (2000)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 10, 801-804, zeigen eine erhöhte Stabilität von einzelsträngigen DNA-Molekülen durch Endschutz mit 4-hydroxy-N-acetylprolinol, L- serinol, oder durch 3'-3'-Phosphodieseter Bindungen. Pure oder gemischte Phosphorothioatbindun­ gen, sowie chemisch modifizierte Oligonukleotide z. B. Methylphosphonate und Phosphoramidate sind stabiler und werden langsamer durch Exonukleasen abgebaut Kandimalla et al., NAR (1997) Vol. 25. No. 2, pp370-378. Tohda et al. (1994) Journal of Biotechnology 34 (1994) 61-69 zeigen, daß Phosphorothioate-haltige RNA stabiler gegen Nukleasen ist und deshalb eine höhere Translationsef­ fizienz aufweist. Es konnten jedoch insgesamt nur geringe Mengen an Protein hergestellt werden. Tang et al. (1993) NAR, Vol. 21, No. 11, pp 2279-2735 zeigen, daß Hairpin-Loop-Strukturen das 3'- Ende von einzelsträngigen DNA's vor exonukleolytischem Abbau schützen. Hirao et al., (1993) FEBS, Vol. 321, No. 2, 3, 169-172 zeigen, daß der Hairpin, den das DNA-Fragment d(GCGAAGC) bildet, extrem gegenüber Nukleasen aus E. coli-Extrakten resistent ist. Yoshizawa et al., (1994) NAR, Vol. 22, No. 12, pp 2217-2221 beschreiben, daß eine Stabilisierung des 3'Endes von mRNA durch Hybridisie­ rung mit demselben Hairpin eine 200-fache Effizienzsteigerung der in-vitro Translation mit E. coli- Extrakten bewirkt. Good und Nielsen (1998) PNAS USA 95, 2073-6 zeigen, daß synthetische Mole­ küle mit Basen, die an ein Peptidrückgrat gekoppelt sind (peptide nucleic acid, PNA) gegenüber hy­ drolytischer Spaltung in E. coli-Extrakten resistent sind und als anti-sense Molekül eingesetzt werden können. Burdick und Emlen (1985) J. Immunology 135, 2593-7 beschreiben, daß in DNA anti-DNA- Immunkomplexen IgG Moleküle die von ihnen gebundene DNA vor nukleolytischen Abbau schützen. In EP 0 967 274 A2 sind Verfahren zur Herstellung von hantelförmigen linear doppelsträngigen DNA Molekülen beschrieben. Dabei wird ein Plasmid mit Restriktionsenzymen geschnitten wobei die entstehende doppelsträngigen, nicht kovalent-geschlossenen Moleküle dann durch Verdau der Enden mit einer Einzelstrang-Überhänge-bildenden Restriktionsendonuklease und anschließender Ligation von auf die entstandenen einzelsträngigen Überhänge passenden Haarnadel-Oligomeren zu hantelförmigen Konstrukten modifiziert werden. Dieses Konstrukt weist gegenüber der Exonukleasen der T7 DNA-Polymerase eine erhöhte Stabilität auf.

Nachteilig an diesen Maßnahmen ist, daß die Synthese dieser modifizierten Nukleotidbausteine oft sehr aufwendig ist. Zum einen ist die Herstellung von modifizierten Nukleotiden aufwendig und teuer. Zum anderen werden für den Einbau der Modifikation zusätzliche zeitaufwendige Arbeits­ schritte nötig. Darüber hinaus kann es Schwierigkeiten geben, die modifizierten Nukleinsäuren als Templat einzusetzen. Bei den Phosphotioaten liegt der Nachteil beispielsweise darin, daß die Synthese sehr aufwendig ist und ein Gemisch aus Diastereomeren entsteht, welches nach dem Einbau nicht optimal als Templat für die Transkription, bzw. Translation geeignet ist.

Im Stand Technik sind weiterhin zellfreie Expressionssysteme ohne Schutzstrategien beschrieben: In US 5571690 stellt Hecht eine Methode zur zellfreien Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer PCR Reaktion erzeugt wurde dar. Er amplifiziert dabei die gesamte Gense­ quenz inklusive der Phagen-Promotorregion aus einem Plasmid heraus. Nach einer in vitro Trans­ kription setzte er für die Translation ein Lysat aus Kaninchen Retikulozyten ein. Hierbei konnten mit mRNA, welche nach der Transkription mit einem 5'CAP modifiziert wurde, 57 µg/ml eines Proteins erzeugt werden. Martemyanov et al. (1997) FEBS Lett. 414, 268-270 zeigt mit einem S30 Extrakt aus E. coli eine zellfreie Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer 2-stufi­ gen PCR Reaktion erzeugt wurde. Dabei wird zunächst das Zielgen mit Hilfe von 2 genspezifischen Oligonukleotid-Primern in einer PCR Reaktion amplifiziert und anschließend einer 2. PCR Reaktion unterzogen, in der mit einem sogenannten Megaprimer der T7 Promotor und die Ribosomen Bin­ dungsstelle an das amplifizierte Gen anftisioniert wird. Es konnten dabei nur radioaktiv nachweisbare Mengen an Protein hergestellt werden. Yang et al. (2000) J. Bacteriol. 182, 295-302 zeigen mit einem S30 Extrakt aus E. coli eine zellfreie Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer PCR Reaktion erzeugt wurde. Es konnten dabei nur radioaktiv nachweisbare Mengen an Protein hergestellt werden. Nakano et al. (1999) Biotechnol. & Bioeng. 64, 194-199 zeigen mit einem S30 Extrakt aus E. coli in einem Hohlfaserreaktor die Herstellung von immerhin 80 µg/ml Reaktions­ ansatz eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer PCR Reaktion erzeugt wurde. In US 6027913 zeigt Sommer mit einem Extrakt aus Retikulozyten eine zellfreie Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer einstufigen PCR Reaktion erzeugt wurde. Dabei wird der T7 Promotor und die Ribosomen Bindungsstelle an das Zielgen anfusioniert wird. Auch mit dieser Methode wurden nur geringe Mengen an Protein hergestellt.

Doch auch die oben beschriebenen Methoden sind nicht zufriedenstellend. Eukaryontische Lysate aus Kaninchenretikulozyten sind zwar relativ Nuclease-arm, es ist jedoch nachteilig, daß sich diese Lysate nicht wirtschaftlich in großen Mengen herstellen lassen. Sie ermöglichen nur sehr geringe Proteinausbeuten. Das gleiche gilt für Lysate aus Weizenkeimen, die entweder sehr aufwendig prä­ pariert werden müssen, oder ansonsten von dem umgebenden Gewebe stark mit Translations-in­ hibierenden Faktoren kontaminiert sind JP 236 896.

E. coli Lysate hingegen liefern bisher die weitaus größten Proteinmengen. Die beschriebenen Methoden zur Herstellung von Lysaten aus E. coli erlauben mit linearen DNA-Templaten nur relativ kurze Reaktionszeiten bis zu etwa einer Stunde, da danach diese DNA Matrizen von den im Lysat enthaltenen Exonuklease völlig abgebaut wird. Die aus E. coli Exonuklease-Mutanten gewonnenen Lysate (d. h. Exonuklease-defiziente Stämme) haben eine signifikant schlechtere Syntheseleistung als die vergleichbaren Wildtypstämme wie beispielsweise der A19 Stamm.

Die Methoden zum Schutz der mRNA haben den Nachteil, daß zuerst eine in vitro Transkription durchgeführt werden muß, bevor die geschützte mRNA zum Lysat gegeben werden kann. Dies wiederum schließt eine gekoppelte Reaktion und eine kontinuierliche RNA-Synthese aus. Metho­ den zum Schutz der RNA werden beschrieben in Tohda et al. (1994) Journal of Biotechnology 34 (1994) 61-69, Yoshizawa et al., (1994) NAR, Vol. 22, No. 12, pp 2217-2221.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher eine Verfahren zur Verbesserung der Stabilität linearer kurzer DNA gegenüber Exonukleasen in zellfreien DNA-abhängigen in vitro Trans­ kriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in zellulären Systemen.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Verbesserung der Stabili­ tät linearer kurzer DNA gegenüber Exonukleasen in zellfreien DNA-abhängigen in vitro Trans­ kriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in zellulären Systemen wobei die Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch die Zugabe unspezifischer linearer DNA erreicht wird.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren für gekoppelte in vitro-Transkriptions/Trans­ lations-Systeme angewandt. Gekoppelt im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß die Transkription und Translation parallel in einer Reaktion ablaufen. Gekoppelt im Sinne der vor­ liegenden Erfindung kann auch bedeuten, daß die mRNA-Moleküle, welche gerade bei der Transkription entstehen bereits von den Ribosomen translatiert werden.

Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren angewendet, wenn es sich um zell­ freie in vitro-Transkriptions/Translations-Systeme mit Exonuklease-haltigen Lysaten handelt. Das Verfahren wird insbesondere angewandt für zellfreie in vitro-Transkriptions/Translations- Systeme mit Exonuklease-haltigen Lysaten aus Prokaryonten, z. B. Lysate von E. coli.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für zellfreie in vitro-Transkriptions/Translations-Systeme mit Exonuklease-haltigen eukaryontischen Lysaten. Diese Lysate können aus Oozyten bzw. Eiern z. B. aus Xenopus sein. Möglich sind auch Lysate aus Weizenkeimen oder aus Kaninchen-Retikulocyten. Das erfindungs­ gemäße Verfahren kann auch eingesetzt werden, wenn es sich bei den Exonuklease-haltigen Lysa­ ten um Lysate aus eukaryontischen Zellen handelt, die in Zellkultur angezüchtet worden sind.

Die Verwendung eines prokaryontischen Lysates ist erfindungsgemäß am meisten bevorzugt. Zwar enthält das gängige eukaryontische Lysat aus Kaninchen-Retikulozyten sehr viel weniger Exonukleasen als das des Prokaryonten E. coli beispielsweise und wäre dadurch hinsichtlich der Stabilität linearer Template zu bevorzugen. Die Verwendung eines prokaryontischen Lysates ist jedoch trotzdem besonders vorteilhaft, da die pro- anders als die eukaryontischen Ribosomen keine CAP-Struktur brauchen, um eine hohe Syntheserate zu ermöglichen. Diese CAP-Struktur kann wiederum nicht in einer gekoppelten Transkriptions-/Translationsreaktion gebildet wer­ den, d. h. in einer Reaktion in der Transkription und Translation gleichzeitig ablaufen.

Kurze DNA im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, wenn vor und nach einem Gen (d. h. Gen inklusive dessen regulatorischen Elemente wie beispielsweise Promotor, Terminator, Trans­ lations steigernde Elemente) nur bis zu 10 000 weitere Basenpaare vorhanden sind.

Die hinzu gegebene lineare DNA (Opfer- oder Kompetitor-DNA) darf jedoch nicht zu einer un­ erwünschten Hintergrundsynthese an Proteinen führen. Die hinzu gegebene DNA muß deshalb unspezifisch sein. Unspezifische DNA bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß die hinzu gegebene lineare DNA in dem vorhandenen in vitro-Transkriptions/Translations-System, nicht transkribiert wird.

Man kann durch verschiedene Maßnahmen erreichen, daß die hinzu gegebene lineare DNA nicht transkribiert wird. Bevorzugt werden in in vitro-Transkriptions/Translations-Systemen mit Exo­ nuklease-haltigen Lysaten solche RNA-Polymerasen eingesetzt, die nur die zu exprimierende DNA binden bzw. nur die zu exprimierende DNA als Templat für RNA-Synthese verwenden können jedoch nicht die hinzu gegebene unspezifische DNA. Folgender Fall soll zur näheren Er­ läuterung beispielhaft angenommen werden:

Prokaryontische DNA soll transkribiert werden. In diesem Fall kann als Polymerase die eine pro­ karyontische RNA-Polymerase oder eine RNA-Polymerase aus Bakteriophagen wie beispielsweise die des T7-, T3- oder SP6-Phagen eingesetzt werden, die zwar den zugehörigen prokaryonti­ schen, T7-, T3- oder SP6-Promotor erkennt, aber nicht die Promotoren eukaryontischer Syste­ me. Als unspezifische DNA kann somit in diesem Fall eukaryontische DNA hinzu gegeben wer­ den. Somit wird nur das Gen nach einem prokaryontischen, T7-, T3- oder SP6-Promotor trans­ kribiert, nicht jedoch die hinzu gegebene eukaryontische DNA, die deshalb für das verwendete System (Gen mit prokaryontischen, T7-, T3- oder SP6-Promotor plus prokaryontischer, T7-, T3- oder SP6-Polymerase) als unspezifisch bezeichnet wird.

Bevorzugt ist in Fällen wenn die Opfer-DNA eukaryontische DNA ist, wenn als unspezifische eukaryontische DNA gescherte DNA aus Heringssperma, Lachssperma, oder Kalbsthymus hinzu gegeben wird.

Somit ist eine Maßnahme, um zu erreichen, daß die Opfer-DNA nicht exprimiert wird, daß die zugegebene DNA speziesfremd ist oder keine regulatorischen Elemente enthält, die von der zur Expression verwendeten Polymerase erkannt werden können.

Als weitere Maßnahme zur Verhinderung unspezifischer Expression für das erfindungsgemäße Verfahren in in vitro-Transkriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten ist bevorzugt, wenn die eventuell in den verwendeten Lysaten oder zellulären Systemen enthaltenen Polymerasen inhibiert werden, um zu verhindern, daß eine unspezifische Expression von hinzu gegebener oder in den Lysaten/zellulären Systemen vorhandener DNA erfolgt.

Besonders bevorzugt ist, wenn die Transkription unspezifischer DNA verhindert wird, indem DNA abhängige RNA Polymerasen inhibiert werden, die auch unspezifische DNA transkribieren würden. Handelt es sich also beispielsweise bei dem in vitro Translations-System um zellfreie in vitro-Transkriptions/Translations-Systeme mit Exonuklease-haltigen Lysaten, die aus Prokaryon­ ten stammen wie z. B. E. coli Lysate, kann also - wie oben beschrieben - das zu exprimierende Gen mit einem Promoter versehen werden, der nur von einer Bakteriophagen RNA-Polymerase wie beispielsweise der T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase erkannt wird. Dann wird die T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase hinzugegeben. (erste Maßnahme zur Verhinderung unspezifischer Expression). Als weitere Maßnahme erfolgt die Zugabe einer Substanz wie Rifampicin, wodurch die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen des Prokaryonten-Lysates inhibiert werden. Somit ist nur die Bakteriophagen RNA-Polymerase wie beispielsweise der T7-, T3- oder SP6-RNA-Poly­ merase aktiv, welche nur den Promoter des zu exprimierenden Gens erkennt. Durch diese Maß­ nahmen wird die unspezifische Expression weitgehend unterdrückt.

Als zusätzliche oder alternative Maßnahme können auch anstelle von Rifampicin andere Sub­ stanzen wie beispielsweise Streptolydigin, Tirandamycin, Sorangicin oder Rifamycin Derivate hinzugegeben werden, welche die Kettenverlängerung von RNA inhibieren, indem sie an die DNA-abhängigen RNA-Polymerasen des Prokaryonten-Lysates binden.

Im Falle von in vitro-Transkriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten, die aus Eukaryonten stammen kann als Maßnahme zur Verhinderung unspezifischer Expression eine Substanz hinzugegeben werden, welche die RNA Polymerase II in den eukaryontischen Lysaten hemmt, z. B. alpha-Amanitin. Dann können spezielle Polyn-terasen hinzugegeben werden, wie beispielsweise T7-, T3-RNA Polymerase oder SP6-RNA Polymerase, die nur das zu expri­ mierende Gen als Templat akzeptieren, wenn das Gen hinter einen entsprechenden Promotor ge­ setzt ist.

Bevorzugt wird gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unspezifische DNA in einer Konzen­ tration von 1 bis 200 µg/ml pro Translationsansatz zugegeben. Besonders bevorzugt ist eine Kon­ zentration von 10 bis 100 µg/ml pro Translationsansatz.

Weiterhin wird bevorzugt, wenn die unspezifische DNA eine Länge von mindestens 10 bp Länge aufweist.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß Gene nicht umständlich in einen zirkulären Plasmidvektor kloniert werden müssen, um eine Proteinsynthese zu ermöglichen, son­ dern daß das gewünschte Gen direkt aus einer Genbank oder RNA Fraktion durch PCR bzw. RT- PCR für eine Proteinexpression amplifiziert werden kann. Bei dieser PCR können dann außer­ dem die für die Expression nötigen Promotor und Terminator-Regionen eingefügt werden.

Denkbar ist auch, daß solche unspezifische DNA bei der sogenannten DNA Immunisierung einem linearen DNA Expressionkonstrukt zugesetzt wird. Bei der DNA Immunisierung wird üb­ licherweise ein DNA Expressionskonstrukt in das Tier injiziert, welches dann von den Zellen des Tieres aufgenommen und exprimiert wird. Bis zur Aufnahme in die Zellen ist das DNA Stück exonukleolytischen Angriffen ausgesetzt, wobei die hinzugegebene unspezifische DNA schützen würde.

Die Vorteile der DNA Stabilisierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren liegen darin, daß das Templat kontinuierlich mRNA nachbilden kann und dadurch der Prozeß der Proteinsyn­ these beispielsweise in dem von Spirin et al. EP 0 312 617, EP 0 401 369 beschriebenen CFCF und CECF Prinzip länger ablaufen kann. Bei dem von Spirin zitierten CFCF bzw. CECF Prinzip wird die in vitro Translation/Transkription mit neuen Substraten versorgt und Reaktionsprodukte kontinuierlich entfernt. Die in vitro Translation/Transkriptions-Reaktion kann so über einen län­ geren Zeitraum, d. h. bis zu mehreren Tagen ablaufen. Daher muß das DNA Templat länger ge­ schützt werden, als dies in einer üblichen in vitro Translation/Transkription der Fall wäre, welche 30 Minuten bis maximal zwei Stunden andauert.

Es konnte gezeigt werden, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren, die Expression eines Proteins ausgehend von einem linearen Templat um ein mehrfaches gesteigert werden konnte.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Kit bestehend aus ein oder mehreren Gefäßen welche folgende Komponenten enthalten:

• - ein Ribosomen enthaltendes Lysat aus prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen her­ gestellt nach Verfahren, die dem Fachmann zur Erzeugung von Lysaten für die in vitro Trans­ lation bekannt sind.
• - ein oder mehrere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende, oder künstlich erzeugte t-RNA
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide, welche unphosphoryliert, oder als Mono-, Di- oder Triphosphat vorliegen können.
• - lineare unspezifische DNA.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Reagenzienlösung enthaltend

• - ein Ribosomen enthaltendes Lysat aus prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen herge­ stellt nach Verfahren, die dem Fachmann zur Erzeugung von Lysaten für die in vitro Trans­ lation bekannt sind.
• - ein oder mehrere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende, oder künstlich erzeugte t-RNA
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide, welche unphosphoryliert, als Mono- Di- oder Triphosphat vorliegen können
• - lineare unspezifische DNA.

Verfahren, die dem Fachmann zur Erzeugung von Lysaten für die in vitro Translation bekannt sind, sind beispielsweise beschrieben in Zubay, G (1973) Annu. Rev. Genet. 7, 267 (Prokaryon­ tische Extrakte); Clemens M. J. & Pruijn G. J. M. (1999) pp 129-168 in "Protein Expression-A Practical Approach" Higgins, S. J. & Hames, B. D. eds. Oxford University Press.

Figurenbeschreibung

Fig. 1
Fig. 1 zeigt die erhöhte Stabilität von linearer DNA (Plasmidfragmente mit einer Größe von 2830 und 1321 Basenpaaren), im gekoppelten Transkriptions-/Translationsansatz mit E. coli-S30 Lysat unter Anwesenheit von gescherter Heringssperma-DNA
Spur 1: M = Marker
Spur 2-7: In vitro Transkriptions/Translationsansätze ohne DNA-Zugabe nach 0, 2, 5, 30, 60 und 120 min Inkubationszeit.
Spur 8-13: In vitro Transkriptions/Translationsansätze mit Zugabe von je 520 µg/ml gescherter Heringssperma-DNA nach 0, 2, 5, 30, 60 und 120 min Inkubationszeit.
Spur 14: Plasmidfragmente mit einer Größe von 2830 und 1321 Basenpaaren vor der Inkubation

Fig. 2
Fig. 2 zeigt eine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung spezifisch für lineare Templat-DNA durch steigende Mengen an zugesetzter, gescherter DNA.
Blaue Säulen: Transkriptions-/Translationsansätze des Green Fluorescent Protein (GFP) Gens ausgehend von linearer DNA (EcoRV/Sphl-gespaltenes pIVEX2.1 GFP Plasmid) inkubiert mit einem Lysat aus mit E. coli. Den Ansätzen wurden 0, 1, 2 und 5 µg unspezifische, gescherte Heringssperma-DNA zugegeben.
Rote Säulen: Ansätze mit ungespaltenem zirkulärem pIVEX2.1 GFP Plasmid mit Zugabe von 0, 1, 2 und 5 µg unspezifischer, gescherter Heringssperma-DNA.

Fig. 3
Fig. 3 zeigt, daß der Zusatz von zirkulärer, unspezifischer DNA im Gegensatz zu linearer, un­ spezifischer DNA keine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung im gekoppelten Transkrip­ tions-/Translationsansatz mit E. coli-S30 Lysat ausgehend von linearem Template ergibt.
Rote Kurve: Zugabe von 0 bis 7 µg unspezifischer, gescherte Heringssperma-DNA zu Trans­ kriptions-/Translationsansätzen des Green Fluorescent Protein Gens ausgehend von linearer Templat DNA inkubiert mit einem Lysat aus mit E. coli. Den Ansätzen wurden 0, 1, 2 und 5 µg unspezifische, gescherte Heringssperma-DNA zugegeben.
Blaue Kurve: Zugabe von 0 bis 7 µg zirkulärem pBR322 Plasmid (anstatt gescherter Heringssperma-DNA) zu den Transkriptions-/Translationsansätzen

Fig. 4
Fig. 4 zeigt, zeigt eine verbesserte Proteinsynthese unter Zusatz von linearer, unspezifischer DNA im gekoppelten Transkriptions-/Translationsansatz mit E. coli-S30 Lysat ausgehend von ungereinigtem und gereinigtem PCR-Produkt.

Man sieht also, daß bereits mit einem ungereinigtem PCR-Produkt eine Proteinsynthese im ge­ koppelten Transkriptions-/Translationsansatz mit E. coli-S30 Lysat möglich ist, wenn man li­ neare, unspezifische DNA zusetzt.
Säule 1 und 2 ungereinigtes PCR Produkt mit codierender Sequenz für GFP, sowie der Kontroll­ elemente T7-Promotor, Ribosomenbindestelle und T7-Terminator. Säule 3 und 4 gereinigtes PCR Produkt. Säule 5 Positiv Kontrolle: EcoRV/Sphl-gespaltenes pIVEX2.1 GFP Plasmid mit codierender Sequenz für GFP, sowie der Kontrollelemente T7-Promotor, Ribosomenbindestelle und T7-Terminator. wurden in der in vitro-Expression gereinigt und ungereinigt getestet.
Säule 2 und 4: 0,5 µg PCR-Produkt plus 5 µg unspezifische, gescherte Heringssperma-DNA (HS DNA)
Säule 1 und 3: 1 µg PCR-Produkt.

Beispiel 1 Präparation von Template-DNA

Plasmid pIVEX2.1 GFP, das die Sequenz für das Green Fluorescent Protein aus Aequorea victoria in Form einer Mutante GFPcycle3 (Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319 enthielt, wurde in präparativem Maßstab mit je 1,5 U SphI und EcoRV (Roche Diagnostics GmbH) pro µg DNA für 2 h bei 37°C in 2830 bp-, 1321 bp- und 191 bp-Fragmente gespalten. Das 1321 bp-Fragment enthielt die codierende Sequenz für GFP mit den für die in vitro-Expression wichtigen Kontroll­ elementen T7-Promotor, Ribosomenbindestelle und T7-Terminator.

Zur in vitro-Expression ausgehend von PCR-Fragmenten wurde ein 1115 bp-Fragment mit dem Expand High Fidelity PCR Kit (Roche Diagnostics GmbH) amplifiziert. Das PCR-Produkt be­ gann 30 bp upstream vom T7-Promotor und enthielt die GFP-codierende Sequenz bis zum Ende vom T7-Terminator. Zur Amplifikation wurden folgende Primer eingesetzt: Sense-Primer 5' gcttagatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttc und Antisense-Primer 5' ggaagctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaagg. Als Template wurden 50 ng pIVEX2.1 GFP verwendet. Der PCR-Zyklus 1 Minute 94°C, 1 Minute 65°C, 1 Minute 72°C wurde 30 mal wie­ derholt. Die Konzentration des Produktes wurde über ein Agarosegel abgeschätzt. Zur Aufreini­ gung des PCR-Produktes wurde der High Pure PCR Purification Kit (Roche Diagnostics GmbH) benutzt.

Als unspezifische Kompetitor- oder Opfer DNA wurde gescherte Heringssperma-DNA und zirkuläres Plasmid pBR322 von Roche Diagnostics GmbH verwendet.

Beispiel 2 Gekoppelte in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion

Trankriptions-/Translationsreaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl 2 h bei 30°C durch­ geführt. Die Reaktionslösung enthielt 80,5 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 35 mM Ammoniumchlorid, 4 mM Magnesiumchlorid, 4% Polyethylenglycol 2000, 1 mM ATP, 0,5 mM CTP, 1 mM GTP, 0,5 mM UTP, 30 mM Phosphoenolpyruvat, 8 µg/ml Pyruvatkinase, 400 µM pro Aminosäure (alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren), 0,1 mM Folinsäure, 0,1 mM EDTA, 50 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 20 µg/ml Rifampicin, 0,03% Natriumazid, 2 µg/ml Aprotintin, 1 mg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin A, 10 mM Acetylphosphat, 100 µg/ml tRNA aus E. coli MRE600, 8 mM Dithiothreitol, 100 U/ml Rnase-Inhibitor, 15 µl E. coli Lysat, 0,5 U/µ1 T7-RNA Polymerase. Das E. coli Lysat wurde von dem Stamm A19 nach dem Verfahren von Zu­ bay (Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267) präpariert.

Beispiel 3 Fig. 1

Plasmid pIVEX2.1 GFP wurde in präparativem Maßstab mit je 1,5 U SphI und EcoRV pro µg DNA für 1 h bei 37°C in 2830 bp-, 1321 bp- und 191 bp-Fragmente gespalten. Je 2 µg des Spal­ tungsansatzes wurden für 0, 2, 5, 30, 60 und 120 Minuten mit 26 µg gescherter Heringssperma- DNA im 50 µl-Transkriptions-/Translationsansatz inkubiert. Die gleichen Ansätze wurden ohne Zusatz von gescherter, unspezifischer DNA durchgeführt. Nach Ethanolfällung der DNA erfolgte eine Auftrennung im 1% Agarosegel. (M, Molekulargewichtsmarker; Spur 14, gespaltenes Plas­ mid ohne Lysat-Zusatz).

Beispiel 4 Fig. 2

EcoRV/Sphl-gespaltenes pIVEX2.1 GFP Plasmid wurde für 2 h im gekoppelten Transkriptions- /Translationsansatz mit E. coli-S30 Lysat bei 30°C inkubiert. Den Ansätzen wurden 0, 1, 2 und 5 µg unspezifische, gescherte Heringssperma-DNA zugegeben. Die gleichen Ansätze wurden mit ungespaltenem pIVEX2.1 GFP Plasmid durchgeführt. GFP-Aktivität wurde mittels Fluoreszenz­ spektroskopie bestimmt. Zur Messung wurden die Proben mit 100 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 14 mM Magnesiumacetat, 60 mM Kaliumacetat, 0,5 mM Dithiothreitol, je nach Gehalt 1 : 50 bis 1 : 400 verdünnt.

Beispiel 5 Fig. 3

EcoRV/Sphl-gespaltenes pIVEX2.1 GFP Plasmid wurde für 2 h im gekoppelten Transkriptions- /Translationsansatz mit E. coli-S30 Lysat bei 30°C inkubiert. Den Ansätzen wurden 0 bis 7 µg unspezifische, gescherte Heringssperma-DNA bzw. 0 bis 7 µg zirkuläres pBR322 Plasmid zugegeben. GFP-Aktivität wurde mittels Fluoreszenzspektroskopie wie unter Fig. 2 beschrieben bestimmt.

Beispiel Fig. 4

PCR-Produkt, das die codierende Sequenz für GFP, sowie die Kontrollelemente T7-Promotor, Ribosomenbindestelle und T7-Terminator enthielt, wurde in der in vitro-Expression gereinigt und ungereinigt getestet. Ansätze mit 1 µg PCR-Produkt bzw. 0,5 µg PCR-Produkt plus 5 µg un­ spezifische, gescherte Heringssperma-DNA (HS DNA) wurden im gekoppelten Transkriptions- /Translationsansatz 2 h bei 30°C inkubiert. GFP-Aktivität wurde mittels Fluoreszenzspektrosko­ pie wie unter Fig. 2 beschrieben bestimmt.

Claims (16)

1. Verfahren zur Verbesserung der Stabilität linearer kurzer DNA gegenüber Exonukleasen in zellfreien in vitro Transkriptions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in Exonuklease-haltigen zellulären Proteinexpressions-Systemen wobei die Verbesse­ rung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch die Zugabe unspezifischer linearer DNA erreicht wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die unspezifische DNA gescherte DNA aus Herings­ sperma, Lachssperma oder Kalbsthymus ist.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die unspezifische DNA gescherte DNA aus Heringssperma ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei den zellfreien in vitro Transkriptions/Translations-Systemen um zellfreie gekoppelte in vitro-Transkriptions /Translations-Systeme handelt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den Exonuklease-haltigen Lysaten um prokaryontische Lysate handelt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei den Exonuklease-haltigen Lysaten um E. coli Lysate handelt.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei den Exonuklease-haltigen Lysaten um eukaryontische Lysate handelt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei den Exonuklease-haltigen Lysaten um Lysate aus eukaryontischen Zellen handelt, die in Zellkultur angezüchtet worden sind.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die unspezifische DNA in einer Kon­ zentration von 1 bis 200 µg/ml pro Translationsansatz zugegeben wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die unspezifische DNA in einer Kon­ zentration von 10 bis 100 µg/ml pro Translationsansatz zugegeben wird.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die unspezifische DNA eine Länge von mindestens 10 bp Länge aufweist.

12. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-11 zur Expression eines Proteins.

13. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-11 zur Expression eines Proteins, wobei das gewünschte Gen direkt aus einer Genbank oder RNA Fraktion durch PCR oder. RT-PCR amplifiziert wird.

14. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1-11 zur Expression eines Proteins in einem CFCF und CECF Reaktor.

15. Kit bestehend aus ein oder mehreren Gefäßen welche folgende Komponenten enthalten:

• - ein Ribosomen enthaltendes Lysat aus prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen hergestellt nach einem Verfahren zur Erzeugung von Lysaten für die in vitro Translation
• - ein oder mehrere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende, oder künstlich erzeugte t-RNA
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide, welche unphosphoryliert, als Mono- Di- oder Triphosphat vorliegen können.
• - lineare unspezifische DNA.

16. Reagenzienlösung enthaltend:

• - ein Ribosomen enthaltendes Lysat aus prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen hergestellt nach einem Verfahren zur Erzeugung von Lysaten für die in vitro Translation,
• - ein oder mehrere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende, oder künstlich erzeugte t-RNA
• - ein oder mehrere natürlich vorkommende Nukleotide, welche unphosphoryliert, als Mono- Di- oder Triphosphat vorliegen können,
• - lineare unspezifische DNA.