Hintergrund der Erfindung.
Nukleinsäurekonstrukte
und Mikroorganismen des eingangs genannten Aufbaus finden weitverbreitete
Anwendung im Bereich der Lebensmitteltechnologie, und zwar im Rahmen
solcher Herstellungsverfahren, die mit Gärverfahrenstufen arbeiten.
Hier sind insbesondere das Bäckereiwesen,
das Brauwesen sowie das Winzerwesen zu nennen. Folgend werden weitere
Hintergünde
exemplarisch anhand des Brauwesens näter erläutert.
Im
abgefüllten
Bier kann es nach einiger Zeit, in Abhängigkeit von den Lagerbedingungen,
zur Ausbildung eines Alterungsgeschmackes kommen. Für diesen
Alterungsgeschmack sind vor allem Carbonyle, die durch Oxidation
von Bierinhaltstoffen entstehen, verantwortlich.
Sulfit
spielt eine wichtige Rolle für
die Geschmacksstabilität.
Es wirkt als Antioxidans und bildet Komplexe mit Carbonylen. Diese
Sulfit-Carbonyl-Komplexe sind geschmacklich nicht mehr relevant.
Sulfit gelangt während
der Gärung
als Zwischenprodukt des Hefestoffwechsels ins Bier. Da ein Zusatz
von Schwefeldioxid zum Bier aufgrund des Reinheitsgebotes nicht
erlaubt ist, sind modifizierte Hefestämme wünschenswert, die eine erhöhte Sulfitproduktion
aufweisen.
Die
Oxidation von Bierinhaltstoffen erfolgt über einen radikalischen Mechanismus.
Dabei wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Bei dieser
Reaktion wirken Schwermetallspuren katalytisch. In Fenton-Reaktionen
reagieren Metallionen mit dem Wasserstoffperoxid, es entstehen Hydroxylionen
und Hydroxylradikale. Letztere sind außerordentlich reaktiv. Sie
können
aus höheren
Alkoholen Wasserstoff abstrahieren und so oxidative Reaktionen einleiten.
Sulfit wirkt als Radikalfänger
und ist dadurch in der Lage sauerstoffaktivierte Radikalreaktionen
zu verhindern. Außerdem
kann Sulfit mit flüchtigen
Carbonylverbindungen Komplexe bilden. Da diese Komplexe nicht stabil
sind, liegt ein Gleichgewicht zwischen freiem Sulfit, gebundenem
Sulfit und freien Carbonylen vor.
Sulfit
ist ein Zwischenprodukt bei der Biosynthese schwefelhaltiger Aminosäuren. Es
entsteht durch Reduktion von Sulfat, das aus der Würze aufgenommen
wird. Die Sulfitbildung beginnt mit der Aufnahme von Sulfat, das über einen
aktiven Transportmechanismus (Permeasen) aus der Würze in die
Zelle gelangt. Vor der Reduktion muß das Sulfat aktiviert werden.
Diese Aktivierung erfolgt enzymatisch (ATP-Sulfurylase und Adenosin-5'-phosphosulfat (APS)-Kinase)
in zwei Schritten unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP. Das aktivierte Sulfat
wird enzymatisch (Phosphoadenosin-5'-phosphosulfat(PAPS)-Reduktase) zu Sulfit
und weiter zu Sulfid reduziert (Sulfitreduktase), welches für die Biosynthese
der schwefelhaltigen Aminosäuren
Methionin und Cystein verwendet wird. Dieser Stoffwechselweg wird
auf zwei Ebenen reguliert. Zum einen liegt eine Kontrolle der Enzymaktivität vor, die
durch Substrat- oder Feedbackhemmung, d.h. Rückkopplungshemmung durch nachfolgende
Produkte, erfolgt. Zum anderen wird die Genexpression reguliert.
Die Regulation erfolgt entsprechend dem Bedarf an schwefelhaltigen
Aminosäuren.
Methionin hemmt als Endprodukt die Bildung vieler Enzyme dieses
Biosyntheseweges. Dementsprechend verläuft die Sulfitbildung und -ausscheidung
während
der Gärung
in vier Phasen. In der ersten Phase wird kein Sulfit ausgeschieden,
da die Expression der Enzyme der Sulfatreduktion durch Methionin
in der Würze
reprimiert ist. In der zweiten Phase wird Sulfat reduziert. Durch
das Zellwachstum ist ein verstärkter
Bedarf an Aminosäuren
bedingt. Daher wird das gebildete Sulfit zum größten Teil zu Sulfid reduziert
und für
die Biosynthese der schwefelhaltigen Aminosäuren verbraucht. Es wird kaum
Sulfit ausgeschieden. In der dritten Phase kommt es zu einer verstärkten Sulfitausscheidung,
da das Hefewachstum stoppt und damit der Aminosäurenbedarf sinkt. In der letzten
Phase ist der vergärbare
Extrakt annähernd
verbraucht. Der Stoffwechsel und damit die Sulfitbildung verlangsamt
sich und kommt zum Stillstand.
Schwefeldioxid
bzw. Sulfit spielt die folgende Rolle bei der Bieralterung. Im Bier
liegt ein Gleichgewicht zwischen freien Carbonylen, Carbonyl-Sulfit-Komplexen
und freiem Sulfit vor. Die Carbonyle stehen im Gleichgewicht mit
ihren korrespondierenden Alkoholen. Der Einfluß des Schwefeldioxids auf die
Geschmacksstabilität
muß unter
zwei Gesichtspunkten betrachtet werden: Die Wirkung während der
Gärung
bzw. während
der Lagerung. Während
der Gärung
werden viele Würzecarbonyle
zu den entsprechenden korrespondierenden Alkoholen reduziert. Das
gebildete Schwefeldioxid kann durch Komplexbildung mit diesen Carbonylen
ihre Reduktion behindern. So können
die Carbonyle in Form von Sulfit-Komplexen ins fertige Bier gelangen.
Nach Aufspaltung der Komplexe tragen sie zum Alterungsgeschmack
bei. Normalerweise beginnt die Sulfitausscheidung aber verzögert und
die Reduktion der Würzecarbonyle
findet sehr schnell statt. Deshalb kann man davon ausgehen, daß zu dem
Zeitpunkt an dem Sulfit ausgeschieden wird, bereits übenwiegend
die reduzierten Formen vorliegen und eine Sulfit-Würzecarbonyl-Komplexbildung
kaum noch erfolgt. Während
der Lagerung wirkt sich das im Bier enthaltene Sulfit positiv auf
die Geschmacksstabilität
aus. Durch die Komplexbildung des Sulfits mit geschmacksaktiven
Carbonylen wird das Auftreten eines Alterungsgeschmackes verzögert.
Eine
Erhöhung
der Sulfitausscheidung kann auf mehreren Wegen erreicht werden.
Zum einen kann im Hefestoffwechsel die Sulfitbildung verstärkt, zum
anderen die weitere Umsetzung des Sulfits verhindert oder eingeschränkt werden.
Aus
der Literaturstelle
DE 199 23
950 A1 ist es bekannt, eine Verstärkung der Sulfitbildung durch
Einbringen von zusätzlichen
Kopien derjenigen Gene zu bewerkstelligen, deren Genprodukte regulativ
an der Sulfitbildung beteiligt sind. Im Einzelnen ist beschrieben,
daß eine Überexpression
der Hefe Gene MET14 und MET 16 unter Kontrolle der HSP26- und HSP30-Promotoren
in Hefestämmen
zu einer erhöhten
Bildung von Sulfit im Rahmen einer Gärverfahrenstufe führt. Das
Genprodukt von MET16 ist die PAPS-Reduktase, die die Reduktion des
aktivierten Sulfats zum Sulfit bewirkt. Das Genprodukt von MET14
ist die APS Kinase. Es wurde insbesondere gezeigt, daß MET14
einen starken Einfluß hat.
Dessen Genprodukt scheint einen geschwindigkeitsbestimmmenden Schritt,
bei der biochemischen Sulfatreduktion zu Sulfit zu katalysieren.
Die insofern bekannten Maßnahmen
führen
nicht nur zu Erhöhung
der Sulfitkonzentration an sich, sondern zudem zu einer Erhöhung in
einer späten
Wachstumsphase der Mikroorganismen, wodurch eine störende (frühe) Komplexbildung
zwischen Sulfit und Würzecarbonylen
vermieden wird. Vielmehr kann Sulfit gleichsam konserviert und in das
Endprodukt übertragen
werden, wo es die gewünschte
Alterungsstabilität
durch Einfang von Radikalen und Carbonylen bewirkt. Nachteilig ist
allerdings, daß eine
Erhöhung
der Sulfitkonzentration in einer Zelle durch Wirkung von nachgeschalteten
Sulfitreduktasen gleichsam konterkariert werden können mit
den Ergebnis, daß die
Sulfitkonzentration im Endprodukt trotz der Erhöhung der Sulfitbildung nicht
befriedigend ist. Zudem stört
die auch sich erhöhende
Bildung von Sulfid in beachtlichem Maße.
Bezüglich weiterführender
Informationen zur Klonierung, zur Sequenz sowie der Regulierung
von MET14 wird beispielsweise auf die Literaturstelle Korch, Ch.
et al., Mol Gen Genet., 229:96-108 (1991) verwiesen.
Aus
der Literaturstelle Park, H. et al, Yeast, 16:881-888 (2000) ist
ein Gen bekannt, welches für
ein Plasma Membran Protein, SSU1, codiert, das Sulfit aus einer
Zelle ausschleust. Dies wird vor dem Hintergrund beschrieben, daß Sulfit
potentiell zelltoxisch ist und daher wünschenswerterweise aus einer
Zelle entfernt wird. Weiterhin ist beschrieben, daß Saccharomyces
cerevisiae, welche mit einer Mehrzahl von SSU1 Kopien oder mit einem
dominanten Allel (FZF1-4) eines Transkriptionsaktivators transformiert
ist, Sulfit in erhöhtem
Ausmaß in
den extrazellulären
Raum ausschüttet.
Technisches Problem der
Erfindung.
Der
Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Nukleinsäurekonstrukt
anzugeben, mittels welchem Mikroorganismen zum Einsatz in lebensmitteltechnischen
Gärverfahrenstufen
erzeugt werden können,
die zu einer erhöhten
Sulfitkonzentration in dem das Endprodukt bildenden Lebensmittel
führen.
Grundzüge der Erfindung.
Zur
Lösung
dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt
mit zumindest einer ersten Teilsequenz, welche ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus "für die Sulfitbildung
in einem Mikroorganismus erhöhende
Proteine oder Enzyme codierende Sequenzen" in Kombination mit einer zweiten Teilsequenz,
welche ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus "für
den Transport von Sulfit aus einer Zelle erhöhende Proteine oder Enzyme
codierende Sequenzen".
Mit
einem solchen Konstrukt lassen sich gentechnisch Mikroorganismen
erstellen, bei welchen einerseits (in einer späten Wachstumsphase) vermehrt
Sulfit gebildet wird, und andererseits das Sulfit praktisch unmittelbar
nach seiner Bildung aus der Zelle ausgeschleust und so einer störenden Einwirkung
von Sulfit-Reduktasen entzogen wird. Hierbei findet auch keine Verschiebung
zu einer früheren
Sulfitbildung statt, wie im Falle einer (zum Ausschleusen alternativen)
Inhibierung von Sulfit-Reduktase zu beobachten ist. Im Ergebnis lassen
sich Lebensmittel, insbesondere Bier, herstellen, die einen hohen
Gehalt an Sulfit aufweisen, ohne das Sulfit dem Lebensmittel zugesetzt
zu werden braucht. Man erhält
ein lange Zeit alterungsstabiles, insbesondere geschmackstabiles,
Lebensmittel.
Weiterhin
lehrt die Erfindung einen Mikroorganismus, in welchen ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurenkonstrukt
eingeschleust ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines solchen
Mikroorganismus, wobei das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt in einen natürlichen
oder modifizierten Basis-Mikroorganismus eingeschleust wird. Hinsichtlich
des Mikroorganismus ist anzumerken, daß dieser vorzugsweise ausschließlich mit
Genen des Basis-Mikroorganismus gebildet sein kann, wobei die an
sich natürlicherweise
in dem Basis-Mikroorganismus vorkommenden Gene bzw. deren Teilsequenzen
oder Promotorsequenzen lediglich anders zueinander positioniert
sind. Dies gilt insbesondere hinsichtlich der Anordnung von Promotorsequenzen,
welche fremde Promotoren in dem Sinne sein können, daß sie zwar in dem Mikroorganismus
in einem (anderen) Gen natürlicherweise
vorkommen, nunmehr jedoch Teil eines Gens bilden, in welchem sie
natürlicherweise
nicht vorkommen. In einer solchen Ausführungsform handelt es sich
bei dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus nicht
um einen gentechnisch veränderten
Mikroorganismus, da keinerlei artfremden Sequenzen oder Teilsequenzen
exprimiert werden.
Schließlich lehrt
die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus zur Herstellung
von Lebensmitteln oder Getränken,
welche mittels zumindest einer Gärverfahrenstufe
erhältlich
sind, wobei der Mikroorganismus in der Gärverfahrenstufe eingesetzt
wird.
Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung.
Zweckmäßigerweise
weist das Nukleinsäurekonstrukt
eine die erste Teilsequenz und/oder die zweite Teilsequenz kontrollierenden
Promotorsequenz, ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus "HSP-Gene, SSA-Gene,
HSP26, HSP30, YPG1, HXK1, MOL1 (TH14), HSP104, HSP78, HXT3, UBI4,
HSP12, HSP78, HSP104, ADH1, ADH2, PGK und GAP", auf. Es versteht sich, daß zum Zwecke
der Transkription beider Teilsequenzen auch mehrere Promotor eingerichtet
sein können.
Die zweite Teilsequenz wird vorzugsweise von der geneigenen Promotorsequenz
kontrolliert.
Bevorzugterweise
ist die erste Teilsequenz ausgewählt
aus der Gruppe der Hefegene bestehend aus "MET 14, MET 16, von vorstehenden Genen
verschiedene Gene, welche für
ein Polypeptid mit APS-Kinase und/oder PAPS-Reduktase Aktivität codieren
und Homologe oder Allele solcher Gene", vorzugsweise aus Saccharomyces cerevisiae.
Höchstvorzugsweise
handelt es sich um MET14, optional zusätzlich MET16, aus Saccharomyces
cerevisiae.
Die
zweite Teilsequenz ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Hefegene
bestehend aus "SSU1,
FZF1, FZF1-4, von vorstehenden Genen verschiedene Gene, welche für ein den
Sulfittransport aus einer Zelle codierendes Protein oder eines Transskriptionsaktivator
eines solchen Proteins codieren, und Homologe oder Allele solcher
Gene", vorzugsweise
aus Saccharomyces cerevisiae.
Die
zweite Teilsequenz und/oder die Promotorsequenz können jeweils
unabhängig
voneinander in einer Kopie oder einer Mehrzahl von Kopien eingerichtet
sein. Die erste Teilsequenz, die zweite Teilsequenz und/oder die
Promotorsequenz können
durch Substition, Insertion, Deletion, Inversion und/oder Addition
modifiziert sein.
Ein
erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt
kann in linearer oder zirkulärer
Form, vorliegen, in ersterem Falle vorzugsweise durch endständige Gruppen
gegen Abbau durch DNasen oder RNasen geschützt.
Ein
erfindungsgemäßer Mikroorganismus
ist bevorzugterweise eine Hefe oder ein Bakterium, vorzugsweise
ein Hefestamm der Gattung Saccharomyces, Brettanomyces oder Kluyveromyces,
höchstvorzugsweise eine
Art ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus "Saccharomyces
cerevisiae, ober- oder untergärige
Brauhefen, Weinhefen, Sekthefen, Sakehefen, Sherryhefen, Brennereihefen,
oder Bäckereihefen". Die Sequenzen des
Nukleinsäurekonstrukts
können
in episomaler Form oder in das Genom integriert vorliegen. Letzteres
ist aus Gründen
der stabilen Transformation bevorzugt.
Es
können
im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Herstellung eines Lebensmittels mehrere unterschiedliche erfindungsgemäße Mikroorganismen,
optional zusammen mit hiervon verschiedenen (natürlichen oder modifizierten)
Mikroorganismen, eingesetzt werden.
Zur
Kontrolle einer Transformation kann in einem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt
ein üblicher
Selektionsmarker eingerichtet sein. Ein Beispiel für einen Selektionsmarker
ist URA3 für
eine Selektion auf einem Minimalmedium ohne Uracil. Es ist möglich, nach
einer Selektion den Selektionsmarker aus dem Mikroorganismus wieder
zu entfernen. Nach der Selektion mit einem Selektionsmarker können selektierte
Klone einer Nachseleketion unterworfen werden, wobei die selektierten
Klone sowie untransformierte Mikroorganismen gleicher Art einer
Bestimmung der Sulfitbildung unterworfen werden, wobei die Bestimmung
gemäß den folgenden
Beispielen erfolgt, und wobei solche Klone nachselektiert werden,
deren Sulfitbildung um zumindest einen Faktor 2, vorzugsweise zumindest
einen Faktor 8, höchstvorzugsweise
zumindest einen Faktor 10, höher
als jene der untransformierten Mikroorganismen ist.
Vorzugsweise
werden Promotorsequenzen eingesetzt, die unabhängig von der Aminosäurenzusammensetzung
des Mediums, in welchen die Mikroorganismen kultiviert werden, sind.
Definitionen.
Die
Bezeichnungen Sulfit und SO2 werden in den
Zusammenhängen
der Erfindung als Synonyme verwendet.
Ein
Gen weist eine codierende Region, beispielsweise die erste oder
zweite Teilsequenz und eine Promotorsequenz auf. Es können auch
funktionslose Sequenzen enthalten bzw. zwischengeschaltet sein.
Ein
Nukleinsäurekonstrukt
bezeichnet eine Gesamtsequenz, welche keiner in einem natürlicherweise vorkommenden
Mikroorganismus identisch gleicht. Es kann sich insbesondere um
ein künstlich
erzeugtes Plasmid handeln.
Bezüglich der
Sequenzinformation zu im Rahmen der Erfindung eingesetzten ersten
Teilsequenzen und/oder Promotorsequenzen wird hiermit auf die Literaturstelle
DE 199 23 950 A1 verwiesen
und deren Offenbarungsgehalt insofern in den Offenbarungsgehalt
dieser Beschreibung inkorporiert. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Mikroorganismus
können
natürliche
und/oder künstliche
und/oder fremde Promotoren eingesetzt werden. Natürlich bezeichnet
in dem betreffenden Mikroorganismus natürlicherweise vorkommende Sequenzen.
Künstlich
bezeichnet in keinem natürlichen
Mikroorganismus vorkommende Sequenzen. Fremd bezeichnet natürlicherweise
in Mikroorganismen anderer Art vorkommende Sequenzen.
Bezüglich der
Sequenzinformation zu im Rahmen der Erfindung eingesetzten zweiten
Teilsequenzen und/oder Promotorsequenzen wird hiermit auf die Literaturstelle
Hoon Park et al., Yeast, 16:881-888 (2000) verwiesen und deren Offenbarungsgehalt
sowie die darin genannten Literaturstellen insofern in den Offenbarungsgehalt
dieser Beschreibung inkorporiert. Es werden vorzugsweise nur solche
zweite Teilsequenzen eingesetzt, die nicht zu einer verstärkten Apotose
führen.
Der
Ausdruck des Proteins umfaßt
im Rahmen der Erfindung auch Polypeptide.
Transport
von Sulfit aus einer Zelle bezeichnet den Durchtritt von SO3 2- oder HSO3 - Ionen durch eine äußere Zellmebran.
Eine Erhöhung
des Transportes bezeichnet eine Transportrate durch die Zellmembran
eines gentechnisch veränderten
Mikroorganismus bei definiertem Konzentrationsgefälle über die
Zellmembran, welche größer als
die Transportrate in einem gentechnisch nicht veränderten
Mikroorganismus gleicher Art ist. Die Erhöhung der Transportrate beträgt vorzugsweise
mehr als ein Faktor 1,10, höchstvorzugsweise
mehr als 2,00, Idealerweise mehr als 10,00.
Eine
Promotorsequenz kann bis zu 1000 Basenpaare und mehr vor dem Transkriptionsstart
umfassen. Eine Promotorsequenz kann zwischen regulierenden Elementen
auch nicht regulierende Bereiche umfassen. Bevorzugterweise werden
verzögert
angeschaltete Promotoren eingesetzt, wie beispielsweise HSP26 HSP30. Verzögert angeschaltete
Promotoren sind solche, die eine Transkription in der stationären Wachstumsphase, im
letzten Drittel der exponentiellen Wachstumsphase, und/oder bei
60% bis 90% der in einer Wachstumsphase erreichbaren maximalen Zellzahl,
initiieren, i.e. maximal 30%, vorzugsweise maximal 10%, der maximal
erreichbaren Sulfitkonzentration wird vor den genannten Zeitpunkten
eingestellt. Zur Bestimmung von Sulfit bzw. SO2 wird
beispielsweise auf die Literaturstelle Grant, Anal. Chem., 19:345-346
(1947) oder das per 30.03.2001 vertriebene enzymatische Testkit "TC-SULFIT" der Firma r-Biopharm
verwiesen.
Die
Erfindung umfaßt
auch den Einsatz von Teilsequenzen, die beispielsweise nicht für MET14
codieren, jedoch zur Expression eines (anderen) Proteins führen, welche
trotz der strukturellen Unterschiede mindestens die gleiche Aktivität von MET14
entwickeln. Entsprechendes gilt in aller Allgemeinheit für die erste
und die zweite Teilsequenz sowie die Promotorsequenz. Als zu einem
Gen homologe Gene sind solche Gene bezeichnet, die für Proteine
codieren, deren Aminosäurensequenz
zu zumindest 60%, vorzugsweise zu zumindest 80%, höchstvorzugsweise
zu zumindest 95%, der Sequenz des Genes, zu dem Homologie besteht,
gleichen.
Wenn
ein erfindungsgemäßes Konstrukt
einen Transkriptionsaktivator umfaßt, so genügt es mitunter, das hierdurch
aktivierbare Gen nicht einzuführen,
sofern es natürlicherweise
in dem erfindungsgemäßen Mikroorganismus
vorliegt. Wenn dagegen kein Transkriptionsaktivator eingesetzt wird,
so muß eine
Mehrzahl von Kopien des Gens eingesetzt werden, i.e. der erfindungsgemäße Mikroorganismus
enthält
letztendlich eine Mehrzahl von diesen (natürlichen und/oder künstlichen
und/oder fremden) Genen.
Eine
modifizierte Sequenz ist in zumindest einem Nukleotid verändert.
Das
Einschleusen eines Nukleinsäurekonstrukts
kann nach allen dem Fachmann vertrauten Methoden, beispielsweise
Transformation, Transfektion, Lipofektion, Konjugation oder Kreuzung
erfolgen. In letzterem Fall ist das Nukleinsäurekonstrukt bereits in das
Genom eines (anderen) Mikroorganismus integriert.
