DE10109022A1 - Neue für das chrS-Gen kodierende Nukleotidsequenzen - Google Patents
Neue für das chrS-Gen kodierende NukleotidsequenzenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein isoliertes Polynukleotid, enthaltend eine Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe DOLLAR A a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält, DOLLAR A b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, DOLLAR A c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und DOLLAR A d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c), DOLLAR A und ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen zumindest das chrS-Gen abgeschwächt vorliegt, und die Verwendung von Polynukleotiden, die die erfindungsgemäßen Sequenzen enthalten, als Hybridisierungssonden.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das chrS-Gen kodierende
Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien und ein
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
unter Verwendung von Bakterien, in denen das chrS-Gen
abgeschwächt wird.
L-Aminosäuren, insbesondere Lysin, finden in der
Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der
Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der
Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere
Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der
großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen
können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel
Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die
Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die
Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die
Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel
Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph
für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die
Aminosäuren produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-
Aminosäure produzierenden Stämmen von Corynebacterium
eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene
amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-
Produktion untersucht.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von
Aminosäuren bereitzustellen.
Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt,
sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich
ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-
Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-
Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-
Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan
und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt ist Lysin.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind
damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B.
Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Polynukleotid
aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das chrS-
Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der
Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c),
wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Sensor
Histidin Kinase ChrS aufweist.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls das oben genannte
Polynukleotid, wobei es sich bevorzugt um eine
replizierbare DNA handelt, enthaltend:
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Weitere Gegenstände sind:
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemäßen Polynukleotids, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz,
und coryneforme Bakterien, in denen das chrS-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.
ein replizierbares Polynukleotid, insbesondere DNA, enthaltend die Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID No. 1 dargestellt;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID No. 2 dargestellt, enthält;
ein Vektor, enthaltend Teile des erfindungsgemäßen Polynukleotids, mindestens aber 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der beanspruchten Sequenz,
und coryneforme Bakterien, in denen das chrS-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, abgeschwächt ist.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im
wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die
erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung
einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums,
die das vollständige Gen oder Teile davon enthält, mit
einer Sonde, die die Sequenz des erfindungsgemäßen
Polynukleotids gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Fragment davon
enthält und Isolierung der genannten Polynukleotidsequenz.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und
DNA geeignet, um Nukleinsäuren beziehungsweise
Polynukleotide oder Gene in voller Länge zu isolieren, die
für die Sensor Histidin Kinase ChrS kodieren, oder um
solche Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide oder
Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit mit der
Sequenz des chrS-Gens aufweisen. Sie sind ebenso zum Einbau
in sogenannte "arrays", "micro arrays" oder "DNA chips"
geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide zu
detektieren und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Erfindung
enthalten, sind weiterhin als Primer geeignet, mit deren
Hilfe mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) DNA von Genen
hergestellt werden kann, die für die Sensor Histidin Kinase
ChrS kodieren.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide
enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz
besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende
Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit
einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
"Isoliert" bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld
herausgetrennt.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf
Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es
sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte
RNA oder DNA handeln kann.
Die Polynukleotide gemäß Erfindung schließen ein
Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder ein daraus
hergestelltes Fragment und auch solche ein, die zu
wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% und besonders
zu wenigstens 90% bis 95% identisch sind mit dem
Polynukleotid gemäß SEQ ID No. 1 oder eines daraus
hergestellten Fragments.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine,
die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene
Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß Erfindung schließen ein Polypeptid
gemäß SEQ ID No. 2, insbesondere solche mit der
biologischen Aktivität der Sensor Histidin Kinase ChrS und
auch solche ein, die zu wenigstens 70%, bevorzugt zu
wenigstens 80% und besonders zu wenigstens 90% bis 95%
identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID No. 2 und
die genannte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von Aminosäuren, ausgewählt aus
der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-
Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-
Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin,
L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin, unter Verwendung von
coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits
Aminosäuren produzieren und in denen die für das chrS-Gen
kodierenden Nukleotidsequenzen abgeschwächt, insbesondere
ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert werden.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer
niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder
Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose,
Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder
aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um
Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung
Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium
ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu
nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist,
L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind
besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten beziehungsweise Stämme.
Das neue, für die Sensor Histidin Kinase ChrS kodierende
chrS-Gen von C. glutamicum wurde isoliert. Die Sensor
Histidin Kinase ChrS ist Teil eines Zwei-Komponenten-
Systems. Zwei-Komponenten-Regulationssysteme zeichnen sich
dadurch aus, dass verschiedene Response-Regulator-Proteine
durch Sensor-Kinasen aktiviert werden können.
Zur Isolierung des chrS-Gens oder auch anderer Gene von C.
glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses
Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das
Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten
Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel
seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim,
Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.:
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank
ist die des E, coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et
al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde.
Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265,
1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032,
die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos 1 (Wahl et al.,
1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84: 2160-2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326
(1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum
ATCC13032 unter Verwendung des Cosmides pHC79 (Hohn und
Collins, 1980, Gene 11, 291-298).
Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli
können auch Plasmide wie pBR322 (Bolivar, 1979, Life
Sciences, 25, 807-818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982,
Gene, 19: 259-268) verwendet werden. Als Wirte eignen sich
besonders solche E. coli-Stämme, die restriktions- und
rekombinationsdefekt sind wie beispielsweise der Stamm
DHSccmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National
Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben
wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen A-Vektoren
klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend
wiederum in gängige für die DNA-Sequenzierung geeignete
Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden,
so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of
America, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten
Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem von
Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), dem von
Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) oder
dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical
Analysis 39, 74-97 (1998)) untersucht werden.
Die neue für das chrS-Gen kodierende DNA-Sequenz von C.
glutamicum wurde gefunden, die als SEQ ID No. 1 Bestandteil
der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde aus der
vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen
Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins
abgeleitet. In SEQ ID No. 2 ist die sich ergebende
Aminosäuresequenz des chrS-Genproduktes dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID No. 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Kodes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1 oder Teilen von SEQ ID
No. 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt,
daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins
dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar
stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann
unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology
6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die
sich in entsprechender Weise aus SEQ ID No. 2 ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ ID No. 1
oder Teilen von SEQ ID No. 1 hybridisieren Bestandteil der
Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der
Erfindung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich
aus SEQ ID No. 1 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben
typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels
Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-
260 (1991)). Die Hybridisierung findet unter stringenten
Bedingungen statt, das heisst, es werden nur Hybride
gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit
der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70%
identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der
Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch
Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der
Salzkonzentration beeinflußt bzw. bestimmt wird. Die
Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ
niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten
durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5x
SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50-68°C
eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit
Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70%
Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride
sind weniger stabil und werden durch Waschen unter
stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise
durch Senken der Salzkonzentration auf 2x SSC und
gegebenenfalls nachfolgend 0,5x SSC (The DIG System Users
Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine
Temperatur von ca. 50-68°C eingestellt wird. Es ist
gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1x
SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1-2°C von
50 auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden,
die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder
mindestens 90% bis 95% Identität zur Sequenz der
eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur
Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt
erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No.
1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe
der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann
unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide
synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK,
1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer
Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des chrS-Gens in verbesserter Weise
Aminosäuren produzieren.
Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die
Expression des chrS-Gens oder die regulatorischen
beziehungsweise katalytischen Eigenschaften des
Enzymproteins herabgesetzt oder ausgeschaltet werden.
Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Pätek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)),
Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999))
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense
mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations")
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar (bp) in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in
deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die
Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu
mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung
("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene
replacement").
Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler
Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen
Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise
E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als
Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al.,
Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pKlBmob oder pK19mob
(Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pKlBmobsacB oder
pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174:
5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI,
USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological
Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt
(Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al.,
Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder
pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology
173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das
zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird
anschließend durch Konjugation oder Transformation in den
gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode
der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994))
beschrieben. Methoden zur Transformation sind
beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology
and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan
(Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS
Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben.
Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"-
Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens
durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei
unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'-
Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von
Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology
42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C.
glutamicum verwendet.
Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement")
wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder
Basenaustausch in dem interessierenden Gen in-vitro
hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen
für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und
dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation
in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach
homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration
bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten
zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses
im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau
der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde
beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology
144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C.
glutamicum durch eine Deletion auszuschalten.
In das chrS-Gen kann auf diese Weise eine Deletion,
Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren
vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des chrS-Gens
eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges,
der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus,
des Pentosephosphat-Zyklus, des Aminosäure-Exports und
gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken,
insbesondere überzuexprimieren.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man
beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene
erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder
Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein)
mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
So kann für die Herstellung von L-Aminosäuren neben der
Abschwächung des chrS-Gens gleichzeitig eines oder mehrere
der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),
- - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenäse kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),
- - das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A- 198 31 609),
- - das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998),
- - das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388)
- - das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222)
- - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171),
- - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065- 8072)) oder das für eine "feed back resistente" Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
- - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN (EP-B 0356739),
- - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
- - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 DE 199 59 328.0, DSM 13115)
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des chrS-Gens
gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus
der Gruppe
- - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
- - das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi(US 09/396,478, DSM 12969),
- - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE 199 51 975.7, DSM 13114),
- - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2
DE 199 59 327.2, DSM 13113)
abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.
Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des chrS-Gens
unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta,
Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind
ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert
werden. Eine Zusammenfassung über bekannte
Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die
Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA,
1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie
z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose,
Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie zum
Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett,
Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin und
Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure
verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als
Mischung verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen
enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder
Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind.
Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren
und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen
eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies
geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten
Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen
Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der
Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak
beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie
Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise
eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können
Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester
eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von
Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende
Stoffs, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um
aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff
oder Sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie zum Beispiel
Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur
liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei
25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis
sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat.
Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis
160 Stunden erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem
Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann zum Beispiel so
wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),
1190) beschrieben durch Anionenaustausch-Chromatographie
mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, oder
sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen
Herstellung von Aminosäuren.
Folgender Mikroorganismus wurde am 17. 01. 2001 als
Reinkultur bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen
und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß
Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli Stamm Top10/pCR2.1chrSint als DSM 13982.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie
alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische
Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al.
(Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA)
durchgeführt. Methoden zur Transformation von Escherichia
coli sind ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung gängiger Nährmedien wie LB- oder TY-
Medium kann ebenfalls dem Handbuch von Sambrook et al.
entnommen werden.
Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei
Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben,
isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham
Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung
Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-
Fragmente wurden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche
Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250)
dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCosl
(Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of
Sciences, USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma
Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl
Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wurde mit dem
Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02)
gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase
dephosphoryliert.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym
BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten.
Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der
behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-
DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)
behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit
Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La
Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing
Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.
Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al.
1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in
10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der
Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der
Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar
(Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) + 100 µg/ml Ampicillin
ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C
wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep
Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden,
Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem
Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27-
0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit
shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Molecular
Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung
SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach
gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung
der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp
mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021,
Qiagen, Hilden, Germany).
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1 bezogen von der Firma
Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung
Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01) wurde
mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product
No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente
in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et
al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-
Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses
Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm
DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy
of Sciences, U.S.A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et
al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123: 343-7) und auf LB-
Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) mit 50 mg/l Zeocin
ausplattiert.
Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit
dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden,
Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Dideoxy-
Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings
of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463-
5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990,
Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der "RR
dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied
Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland)
verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und
Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem
"Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product
No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism
377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems
(Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter
Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids
Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die
Einzelsequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem
zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte
Kodierbereichsanalyse wurden mit dem Programm XNIP (Staden,
1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.
Weitere Analysen wurden mit den "BLAST search programs"
(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research,
25 : 33893402) gegen die non-redundant Datenbank des
"National Center for Biotechnology Information" (NCBI,
Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1
dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein
offenes Leseraster von 1260 bp, welches als chrS-Gen
bezeichnet wurde. Das chrS-Gen kodiert für ein Polypeptid
von 419 Aminosäuren.
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde nach der Methode von
Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994))
chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für
C. glutamicum bekannten Sequenz des chrS-Gens wurden die
folgenden Oligonukleotide für die Polymerase Kettenreaktion
ausgewählt (siehe SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4):
chrS-int1:
5'CAT CGC TGA ATT CTC ATC C 3'
chrS-int2:
5'CTG ATT TCA CGG ACA TTG C 3'
chrS-int1:
5'CAT CGC TGA ATT CTC ATC C 3'
chrS-int2:
5'CTG ATT TCA CGG ACA TTG C 3'
Die dargestellten Primer wurden von der Firma MWG Biotech
(Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und nach der
Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A
guide to methods and applications, 1990, Academic Press)
mit der Taq-Polymerase der Firma Boehringer Mannheim
(Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA Polymerase,
Product No. 1 146 165) die PCR Reaktion durchgeführt. Mit
Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ermöglichen die Primer
die Amplifikation eines 468 bp großen internen Fragmentes
des chrS-Gens. Das so amplifizierte Produkt wurde in einem
0,8%igen Agarosegel elektrophoretisch geprüft.
Das amplifizierte DNA Fragment wurde mit dem TOPO TA
Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA,
USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO
(Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert.
Anschließend wurde der E. coli Stamm TOP10 mit dem
Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical
approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA,
1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden
Zellen erfolgte durch Ausplattieren des
Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989),
der mit 50 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des
QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und
durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und
anschließender Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) überprüft.
Das Plasmid wurde pCR2.1chrSint genannt und istin Fig. 1
dargestellt.
Der in Beispiel 3 genannte Vektor pCR2.1chrSint wurde nach
der Elektroporationsmethode von Tauch et.al. (FEMS
Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in
Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Bei dem
Stamm DSM 5715 handelt es sich um einen AEC resistenten
Lysin-Produzenten. Der Vektor pCR2.1chrSint kann in DSM5715
nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der
Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DSM 5715
integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom
integriertem pCR2.1chrSint erfolgte durch Ausplattieren des
Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit
15 mg/l Kanamycin supplementiert worden war.
Für den Nachweis der Integration wurde das chrSint-Fragment
nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH
(Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig-
Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert.
Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wurde nach
der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-
1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den
Restriktionsenzymen SacI, PstI und HindIII geschnitten. Die
entstehenden Fragmente wurden mittels der Agarosegel-
Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit
der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel
3 genannte Plasmid pCR2.1chrSint hatte innerhalb des
chromosomalen chrS-Gens ins Chromosom von DSM5715
inseriert. Der Stamm wurde als DSM5715::pCR2.1chrSint
bezeichnet.
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum Stamm
D5M5715::pCR2.1chrSint wurde in einem zur Produktion von
Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt
im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf Agarplatte mit dem
entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit Kanamycin
(25 mg/l) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von
dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10
ml Medium im 100 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die
Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet.
| NaCl | 2,5 g/l |
| Bacto-Pepton | 10 g/l |
| Bacto-Yeast-Extrakt | 10 g/l |
| Glucose (getrennt autoklaviert) | 2% (w/v) |
| AL=L<Der pH-Wert wurde auf pH 7.4 eingestellt |
Diesem wurde Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Vorkultur
wurde 16 Stunden bei 33°C bei 240 rpm auf dem Schüttler
inkubiert. Von dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur
angeimpft, so daß die Anfangs-OD (660 nm) der Hauptkultur
0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde das Medium mm
verwendet.
| CSL (Corn Steep Liquor) | 5 g/l |
| MOPS | 20 g/l |
| Glucose (getrennt autoklaviert) | 50 g/l |
| AL=L<Salze: | |
| (NH4)2SO4) | 25 g/l |
| KH2PO4 | 0,1 g/l |
| MgSO4 .7H2O | 1,0 g/l |
| CaCl2.2 H2O | 10 mg/l |
| FeSO4.7 H2O | 10 mg/l |
| MnSO4.H2O | 5,0 mg/l |
| Biotin (sterilfiltriert) | 0,3 mg/l |
| Thiamin.HCl (sterilfiltriert) | 0,2 mg/l |
| Leucin (sterilfiltriert) | 0,1 g/l |
| CaCO3 | 25 g/l |
CSL, MOPS und die Salzlösung werden mit Ammoniakwasser auf
pH 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend werden die
sterilen Substrat- und Vitaminlösungen zugesetzt, sowie das
trocken autoklavierte CaCO3 zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt in 10 ml Volumen in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Kanamycin
(25 mg/l) zugesetzt. Die Kultivierung erfolgte bei 33°C und
80% Luftfeuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Meßwellenlänge von
660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH,
München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit
einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik
(Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie
und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion
bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Folgende Figur ist beigefügt:
Fig. 1 Karte des Plasmids pCR2.1chrSint.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung.
KmR: Kanamycin Resistenz-Gen
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
chrSint: internes Fragment des chrS-Gens
ColE1: Replikationsursprung des Plasmides ColE1
KmR: Kanamycin Resistenz-Gen
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
chrSint: internes Fragment des chrS-Gens
ColE1: Replikationsursprung des Plasmides ColE1
Claims (22)
1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien,
enthaltend eine für das chrS-Gen kodierende
Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe
- a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,
- b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2,
- c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Polynukleotiden von a) oder b), und
- d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a), b) oder c), wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Sensor Histidin Kinase ChrS aufweist.
2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das
Polynukleotid eine in coryneformen Bakterien
replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA ist.
3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid
eine RNA ist.
4. Polynukleotid gemäß Anspruch 2, enthaltend die
Nukleinsäuresequenz wie in SEQ ID No. 1 dargestellt.
5. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 2, enthaltend
- a) die Nukleotidsequenz, gezeigt in SEQ ID No. 1, oder
- b) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Kodes entspricht, oder
- c) mindestens eine Sequenz, die mit der zur Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
- d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i).
6. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß die Hybridisierung
unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2x SSC
durchgeführt wird.
7. Polynukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, die für ein
Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID No. 2
dargestellte Aminosäuresequenz enthält.
8. Vektor pCR2.1chrSint, der
- 1. 8.1. ein 468 bp großes internes Fragment der chrS-Gens trägt,
- 2. 8.2 dessen Restriktionskarte in Fig. 1 wiedergegeben wird, und
- 3. 8.3 der in dem E. coli-Stamm Top10/pCR2.1chrSint unter der Nr. DSM 13982 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellenkulturen hinterlegt ist.
9. Internes Fragment des chrS-Gens mit einer Länge von
468 bp.
10. Coryneforme Bakterien, in denen das chrS-Gen
abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet wird.
11. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-
Aminosäuren, insbesondere Lysin, dadurch
gekennzeichnet, daß man folgende Schritte
durchführt:
- a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das chrS-Gen oder dafür kodierende Nukleotidsequenzen abschwächt, insbesondere ausschaltet;
- b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
- c) Isolieren der L-Aminosäure.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des
Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure
verstärkt.
13. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man Bakterien
einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest
teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
gewünschten L-Aminosäure verringern.
14. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Expression des
(der) Polynukleotides (e), das (die) für das chrS-Gen
kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere
ausschaltet.
15. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man die
regulatorischen beziehungsweise katalytischen
Eigenschaften des Polypetids (Enzymprotein) verringert,
für das das Polynukleotid chrS kodiert.
16. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 16.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
- 2. 16.2 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
- 3. 16.3 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi,
- 4. 16.4 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
- 5. 16.5 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
- 6. 16.6 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
- 7. 16.7 das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
- 8. 16.8 das für eine feed back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
- 9. 16.9 das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
- 10. 16.10 das für die Hornoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
- 11. 16.11 das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA oder das für eine feed back resistente Threonin-Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr),
- 12. 16.12 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierende Gen ilvBN,
- 13. 16.13 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
- 14. 16.14 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 verstärkt bzw. überexprimiert.
17. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß man zur Herstellung
von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen
fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder
mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- 1. 17.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck,
- 2. 17.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende Gen pgi,
- 3. 17.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB
17. 4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2
abschwächt.
18. Coryneforme Bakterien, die einen Vektor enthalten, der
Teile des Polynukleotids, mindestens aber 15
aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz gemäß
Anspruch 1, trägt.
19. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium
glutamicum einsetzt.
20. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um
Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene
zu isolieren, die für die Sensor Histidin Kinase ChrS
kodieren oder eine hohe Ähnlichkeit mit der Sequenz des
chrS-Gens aufweisen, dadurch
gekennzeichnet, daß man das Polynukleotid,
enthaltend die Polynukleotidsequenzen gemäß den
Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4 als Hybridisierungssonden
einsetzt.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch
gekennzeichnet, daß man arrays, micro
arrays oder DNA-chips einsetzt.
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|---|---|---|---|
| DE10109022A DE10109022A1 (de) | 2000-09-09 | 2001-02-24 | Neue für das chrS-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| AU2002213849A AU2002213849A1 (en) | 2000-09-09 | 2001-08-07 | Nucleotide sequences coding for the chrs gene |
| PCT/EP2001/009096 WO2002020572A2 (en) | 2000-09-09 | 2001-08-07 | Nucleotide sequences coding for the chrs gene |
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| US09/948,774 US6734002B2 (en) | 2000-09-09 | 2001-09-10 | Nucleotide sequences coding for the chrS protein |
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| DE10044753 | 2000-09-09 | ||
| DE10109022A DE10109022A1 (de) | 2000-09-09 | 2001-02-24 | Neue für das chrS-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
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| DE10109022A Withdrawn DE10109022A1 (de) | 2000-09-09 | 2001-02-24 | Neue für das chrS-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002042472A1 (en) * | 2000-11-22 | 2002-05-30 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the mtra and mtrb gene |
-
2001
- 2001-02-24 DE DE10109022A patent/DE10109022A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002042472A1 (en) * | 2000-11-22 | 2002-05-30 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the mtra and mtrb gene |
| US7229791B2 (en) | 2000-11-22 | 2007-06-12 | Degussa Ag | Nucleotide sequences coding for the MtrA and/or MtrB proteins |
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