DE60034224T2

DE60034224T2 - Nukleinsäuresequenzen für proteine die an der isoprenoid-synthese beteiligt sind

Info

Publication number: DE60034224T2
Application number: DE60034224T
Authority: DE
Inventors: Ganesh M. Creve Coeur KISHORE; Albert Boronat; Narciso Campos
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2020-04-15
Also published as: US6541259B1; US20030170833A1; CA2369844A1; AU2005200270B2; CN1408024A; CN100387721C; US7141718B2; US20020108148A1; EP1190068A2; JP2002541851A; DE60025713T2; US7335815B2; PT1190068E; BRPI0009763B1; AU2005200270A1; EP1190068B1; DE60034224D1; BRPI0009763B8; CA2370616A1; MXPA01010486A

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen und Konstrukte sowie die zugehörigen Verfahren.
HINTERGRUND
Isoprenoide sind ubiquitäre Verbindungen, die in allen lebenden Organismen gefunden werden. Pflanzen synthetisieren eine breite Vielfalt von mehr als 22 000 Isoprenoiden (Connolly und Hill (1992) Dictionary of Terpenoids, Chapman und Hall, New York, NY). In Pflanzen spielen Isoprenoide unverzichtbare Rollen bei bestimmten Zellfunktionen wie beispielsweise der Bildung von Sterolen, die zur Architektur eukaryotischer Membranen beitragen, von acyclischen Polyprenoiden, die in der Seitenkette von Ubichinonen und Plastochinonen gefunden werden, von Wachstumsregulatoren, wie Abscisinsäure, Gibberellinen, Brassinosteroiden, oder der Bildung von den photosynthetischen Pigmenten Chlorophyllen und Carotinoiden. Obwohl die physiologische Rolle von anderen Pflanzenisoprenoiden wie denen aus der großen Vielfalt von sekundären Metaboliten weniger offensichtlich ist, ist von einigen bekannt, dass sie Schlüsselrollen bei der Vermittlung der adaptiven Reaktionen auf verschiedene Umweltherausforderungen innehaben. Trotz der bemerkenswerten Diversität der Struktur und Funktion stammen alle Isoprenoide von einem einzelnen metabolischen Vorläufer ab, dem Isopentenyldiphosphat (IPP) (Wright, (1961), Annu. Rev. Biochem. 20:525–548, und Spurgeon und Porter, (1981) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds, Porter und Spurgeon (Hrsg.) (John Wiley, New York) Band 1, S. 1–46).
Eine Anzahl von einzigartigen und miteinander verbundenen biochemischen Synthesewegen, die aus dem Isoprenoidbiosynthe seweg abgeleitet sind, der zu sekundären Metaboliten einschließlich der Tocopherole führt, kommen in den Chloroplasten höherer Pflanzen vor. Tocopherole üben nicht nur lebenswichtige Funktionen in Pflanzen aus, sie sind ebenfalls aus dem Blickwinkel der Ernährung von Säugetieren wichtig. In Plastiden machen Tocopherole bis zu 40% des Gesamtchinonpools aus.
Tocopherole und Tocotrienole (ungesättigte Tocopherolderivate) sind gut bekannte Antioxidanzien und spielen beim Schutz der Zellen vor Schaden durch freie Radikale und bei der Verhinderung von vielen Krankheiten, einschließlich Herzkrankheiten, Krebs, Katarakten, Retinopathie, Alzheimer-Krankheit und Neurodegeneration, eine wichtige Rolle und es wurde gezeigt, dass sie auf Symptome der Arthritis haben und gegen das Altern vorteilhafte Wirkungen haben. Vitamin E wird im Hühnerfutter verwendet, um die Lagerzeit, das Aussehen, den Geschmack und die oxidative Stabilität des Fleisches zu verbessern, und um Tocole aus dem Futter in die Eier zu übertragen. Für Vitamin E wurde gezeigt, dass es für die normale Reproduktion wesentlich ist, es die Gesamtleistung verbessert, und es die Immunkompetenz in Herdentieren erhöht. Ein Zusatz von Vitamin E im Tierfutter verleiht Milchprodukten zudem oxidative Stabilität.
Die Nachfrage nach natürlichen Tocopherolen als Zusätzen hat während der letzten 3 Jahre fortwährend mit einer Rate von 10–20% zugenommen. Gegenwärtig überschreitet der Bedarf das Angebot an natürlichen Tocopherolen, von denen bekannt ist, dass sie biologisch wirksamer als racemische Mischungen von synthetisch hergestellten Tocopherolen sind. Natürlich vorkommende Tocopherole sind alles d-Stereomere, während synthetisches α-Tocopherol eine Mischung aus acht d,l-α-Tocopherolisomeren ist, von denen nur eines (12,5%) mit dem natürlichen d-α-Tocopherol identisch ist. Natürliches d-α-Tocopherol weist die höchste Vitamin E-Aktivität auf (1,49 IU/mg), wenn es mit anderen natürlichen Tocopherolen oder Tocotrienolen verglichen wird. Das synthetische α-Tocopherol weist eine Vitamin E-Aktivität von 1,1 IU/mg auf. 1995 betrug der weltweite Markt für rohe, raffinierte Tocopherole 1.020 Millionen Dollar, wobei synthetische Materialien 85–88% des Marktes ausmachten, wobei die verbleibenden 12–15% natürliche Materialien waren. Die besten Quellen für natürliche Tocopherole und Tocotrienole sind Pflanzenöle und Getreideprodukte. Gegenwärtig wird der größte Teil des natürlichen Vitamin E aus γ-Tocopherol hergestellt, das aus der Verarbeitung von Sojaöl stammt, das dann nachfolgend durch chemische Modifizierung in α-Tocopherol umgewandelt wird (α-Tocopherol weist die höchste biologische Aktivität auf).
Sato et al. (DNA. Research, Band 5, S. 41–54) offenbaren die Sequenz eines Klons auf Chromosom 5 von Arabidopsis. Lange et al. (EMBL, Online-Zugangscodenummer: AF116825, 1999) offenbaren die D-1-Deoxyxylulose-5-phosphat-Reductoisomerase aus Pfefferminz.
Verfahren zum Erhöhen der Gehalte von Tocopherolen und Tocotrienolen in Pflanzen, insbesondere der Gehalte der wünschenswerteren Verbindungen, die direkt ohne chemische Modifizierung verwendet werden können, wären für das Fachgebiet nützlich, da solche Moleküle eine bessere Funktionalität und Bioverfügbarkeit aufweisen.
Weiterhin sind Verfahren für die erhöhte Produktion von anderen Verbindungen, die aus Isoprenoiden abgeleitet sind, in einer Wirtspflanzenzelle wünschenswert. Außerdem werden Verfahren für die Produktion von bestimmten Isoprenoidverbindungen in einer Wirtspflanzenzelle benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf isolierte Polynukleotide gerichtet, die aus der Gruppe bestehend aus

a) einem isolierten Polynukleotid, das eine für das Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst;
b) einem isolierten Polynukleotid, das SEQ ID NO: 1 umfasst;
c) einem isolierten Polynukleotid, das zu der Polypeptidsequenz gemäß a) oder b) komplementär ist, ausgewählt sind.

Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf transgene Wirtszellen gerichtet, insbesondere Pflanzenzellen und Pflanzen, welche diese Polynukleotide umfassen.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf aufgereinigte Proteine gerichtet, die mit dem Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 identisch sind, mit der Ausnahme, dass 1 bis 10 Aminosäuren substituiert, deletiert oder hinzugefügt sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt einen Aminosäureabgleich zwischen der dxr-Sequenz aus Arabidopsis und der dxr-Sequenz aus E. coli.
2 zeigt ein schematisches Diagramm des Isoprenoidbiosytheseweges und dabei sowohl des Mevalonat- und des Nicht-Mevalonat-Biosyntheseweges.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem Zusammensetzungen und Verfahren zum Verändern (zum Beispiel Erhöhen oder Verringern) der Isoprenoidgehalte und/oder zum Modulieren ihrer Verhältnisse in Wirtszellen zur Verfügung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Polynukleotide, Polypeptide und Verfahren zu ihrer Verwendung für die Modulierung des Isoprenoidgehaltes in Pflanzenzellen, wie oben beschrieben, zur Verfügung.
Isoprenoide werden aus einer Baueinheit aus 5 Kohlenstoffen, dem Isopentenyldiphosphat (IPP), abgeleitet, das die universelle Isopreneinheit und ein verbreiteter Isoprenoidvorläufer ist. Isoprenoide umfassen eine strukturell vielfältige Gruppe von Verbindungen, die in zwei Klassen eingeteilt werden können: primäre und sekundäre Metaboliten (Chappell (1995) Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46:521–547). Primäre Metabolite umfassen solche Isoprenoide, die für die Membranintegrität, den Photoschutz, die Abstimmung von Entwicklungsprogrammen und das Verankern biochemischer Funktionen an spezifische Membransysteme benötigt werden. Derartige primäre Metabolite schließen Sterole, Carotinoide, Chlorophyll, Wachstumsregulatoren und die Polyprenolsubstituenten von Dolicholen, Chinonen und Proteinen ein, sind aber nicht auf sie beschränkt. Sekundäre Metaboliten vermitteln wichtige Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und der Umgebung, sind jedoch für das Überleben der Pflanze nicht notwendig. Sekundäre Metabolite schließen Tocopherole, Monoterpene, Sesquiterpene und Diterpene ein, sind aber nicht auf sie beschränkt.
Für viele Jahre wurde angenommen, daß IPP durch den gut bekannten Acetat/Mevalonat-Biosyntheseweg synthetisiert wird. Jedoch haben jüngere Studien das Vorkommen eines alternativen, Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweges für die IPP-Biosyn these gezeigt (Horbach et al. (1993) FEMS Microbiol. Lett. 111:135–140; Rohmer et al., (1993) Biochem. J. 295:517–524). Dieser Nicht-Mevalonat-Biosyntheseweg für die IPP-Biosynthese wurde anfänglich in Bakterien charakterisiert und später ferner in Grünen Algen und höheren Pflanzen (für jüngere Übersichtsartikel siehe Lichtenthaler et al. (1997) Physiol. Plant. 101:642–652, und Eisenreich et al. (1998) Chem. Biol. 5:R221–R233). Die erste Reaktion des neuen Mevalonatunabhängigen Biosyntheseweges ist die Kondensation von (Hydroxyethyl)thiamin, das vom Pyruvat stammt, mit der C₁-Aldehydgruppe von D-Glycerinaldehyd-3-phosphat, um D-1-Deoxyxylulose-5-phosphat hervorzubringen (Broers (1994) Doktorarbeit Eidgenossische Technische Hochschule, Zürich, Schweiz; Rohmer et al., (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:2564–2566). In Escherichia coli wird D-1-Deoxyxylulose (am wahrscheinlichsten in der Form von D-1-Deoxyxylulose-5-phosphat) effizient in die Prenyl-Seitenkette von Menachinon und Ubichinon eingebaut (Broers, (1994) loc. cit.; Rosa Putra et al., (1998) Tetrahedron Lett. 39:23–26). Vom Einbau von D-1-Deoxyxylulose in Isoprenoide in Pflanzen wurde ebenfalls berichtet (Zeidler et al., (1997) Z. Naturforsch. 52c:15–23; Arigoni et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10600–10605; Sagner et al., (1998) Chem. Commun. 2:221–222). Zusätzlich wurde D-1-Deoxyxylulose auch als Vorläufer für die Biosynthese von Thiamin und Pyridoxol beschrieben. D-1-Deoxyxylulose ist das Vorläufermolekül für die durchgehende 5-Kohlenstoffeinheit (C4'-C4-C5-C5'-C5'') des Thiazolrings von Thiamin in E. coli (Therisod et al., (1981) Biochem. Biophys. Res. Comm. 98:374–379; David et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:7341–7342) und in den Chloroplasten höherer Pflanzen (Julliard und Douce, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2042–2045). Die Rolle von D-1-Deoxyxylulose bei der Biosynthese von Pyridoxol in E. coli ist ebenfalls gut dokumentiert (Hill et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:1916–1917; Kennedy et al., (1995) J. Am. Chem. Soc. 117:1661–1662; Hill et al., (1996) J. Biol. Chem. 271:30426–30435). Kürzlich wurde die Klonierung von Genen, die für die 1-Deoxy-D-Xylulose5-phosphat-Synthase kodieren, in Bakterien (Sprenger et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12957–12962, Lois et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2105–2110) und in Pflanzen berichtet (Lange et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2100–2104; Bouvier et al., (1998) Plant Physiol. 117:1423–1431). Die 2 stellt eine schematische Darstellung der Isoprenoid-Biosynthesewege dar.
Obwohl die Zwischenprodukte zwischen dem 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat und dem IPP noch nicht charakterisiert worden sind, wurde 2-C-Methyl-D-erythriyol-4-phosphat durch Rohmer und Mitarbeiter als der erste verbindliche Vorläufer für die Isoprenoid-Biosynthese in Bakterien vorgeschlagen (Duvold et al., (1997) Tetrahedron Lett. 38:4769–4772; Duvold et al., (1997) Tetrahedron Lett. 38:6181–6184). Das Enzym 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase, das die Umwandlung von 1-D-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat in 2-C-Methyl-D-erythryol-4-phosphat katalysiert, wurde kürzlich in E. coli kloniert und charakterisiert (Takahashi et al, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:99879–9884). Die Biosynthese von 2-C-Methyl-D-erythitol in Pflanzen durch eine intramolekulare Umlagerung von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat wurde kürzlich von Sagner et al. (1998) Tetrahedron Lett. 39:23–26 und Sagner et al. (1998) Chem Commun. 2:221–222 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen zur Verfügung, die an der Bildung von 2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat aus 1-Deoxyxylulose-5-phosphat beteiligt sind, und die als 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase oder dxr bezeichnet werden. In der vorliegenden Erfindung werden Konstrukte und Verfahren für die Erzeugung einer veränderten Expression der dxr in Wirtszellen ebenso bereitgestellt, ebenso wie Verfahren für die Modifikation des Isoprenoid-Biosyntheseweges, einschließlich der Modi fikation des biosynthetischen Flusses durch den Isoprenoidbiosyntheseweg, und Verfahren für die Herstellung von spezifischen Klassen von Isoprenoiden in Wirtszellen.
Isolierte Polynukleotide, Proteine und Polypeptide
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte dxr-Polynukleotide, wie sie oben beschrieben sind. Die Polynukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung schließen isolierte Polynukleotide ein, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, die eine abgeleitete Aminosäuresequenz aufweisen, die aus der Gruppe von Sequenzen ausgewählt ist, die in dem Sequenzprotokoll dargelegt sind sowie andere Polynukleotidsequenzen, die mit solchen Sequenzen nahe verwandt sind, und deren Varianten, wie sie oben beschrieben sind.
Die Erfindung stellt eine Polynukleotidsequenz zur Verfügung, die über ihre gesamte Länge mit jeder kodierenden Sequenz identisch ist, die in dem Sequenzprotokoll dargestellt ist. Die Erfindung stellt ferner die kodierende Sequenz für das reife Polypeptid oder ein Fragment davon zur Verfügung, ebenso wie die kodierende Sequenz für das reife Polypeptid oder ein Fragment davon in einem Leserahmen mit anderen kodierenden Sequenzen, wie beispielsweise solchen, die für eine Leader- oder sekretorische Sequenz, eine Prä-, Pro- oder Präproprotein-Sequenz kodieren. Das Polynukleotid kann ferner nicht-kodierende Sequenzen einschließen, einschließlich zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf nicht-kodierende 5'- und 3'-Sequenzen, wie die transkribierten, untranslatierten Sequenzen, Terminationssignale, Ribosomenbindungsstellen, Sequenzen, die mRNA stabilisieren, Introns, Polyadenylierungssignale, und zusätzliche kodierende Sequenzen, die für zusätzliche Aminosäuren kodieren. Beispielsweise kann eine Markersequenz eingefügt werden, um die Aufreinigung des fusionierten Polypeptids zu vereinfachen. Erfindungsgemäße Polypeptide schließen ferner Polynukleotide ein, die ein strukturelles Gen und die natürlicherweise assoziierte Sequenzen umfassen, welche die Genexpression kontrollieren.
Die Erfindung betrifft ferner Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die für Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren. Varianten, die Fragmente der erfindungsgemäßen Polynukleotide sind, können verwendet werden, um erfindungsgemäße Volllängenpolynukleotide zu synthetisieren. Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die für Polypeptidvarianten kodieren, bei denen 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste einer Polypeptidsequenz der Erfindung in jeglicher Kombination substituiert, hinzugefügt oder deletiert wurden. Besonders bevorzugt sind Substitutionen, Additionen und Deletionen, die stumm ("silent") sind, so dass sie die Eigenschaften oder Aktivitäten des Polynukleotids oder des Polypeptids nicht verändern.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dxr-Polypeptide, wie sie oben beschrieben sind.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können ein reifes Protein sein oder können Teil eines Fusionsproteins sein.
Die erfindungsgemäßen Polynukleotide und Polypeptide können zum Beispiel in der Transformation von Wirtszellen, wie beispielsweise Pflanzenwirtszellen, verwendet werden, wie hier weiter diskutiert wird.
Die Erfindung stellt ferner Polynukleotide bereit, die für ein Polypeptid kodieren, das ein reifes Protein ist plus zusätzlicher Amino- oder Carboxy-terminaler Aminosäuren, oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids (zum Beispiel, wenn die reife Form des Proteins mehr als eine Polypeptidkette aufweist). Derartige Sequenzen können zum Beispiel eine Rolle bei dem Prozessieren eines Proteins aus einer Vorläufer- in eine reife Form spielen, den Proteintransport ermöglichen, die Halbwertszeit des Proteins verkürzen oder verlängern, oder die Handhabung des Proteins in Assays oder bei der Herstellung vereinfachen. Es wird in Betracht gezogen, daß zelluläre Enzyme verwendet werden können, um jedwede zusätzlichen Aminosäuren aus dem reifen Protein zu entfernen.
Ein Vorläuferprotein, das die reife Form des Polypeptids an eine oder mehrere Prosequenzen fusioniert aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Die inaktiven Vorläufer werden im Allgemeinen aktiviert, wenn die Prosequenzen entfernt werden. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Ein derartiges Vorläuferprotein wird im Allgemeinen Proprotein genannt.
Konstrukte und Verfahren der Verwendung
Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Nukleotidsequenzen in rekombinanten DNA-Konstrukten, um die Transkription oder die Transkription und Translation (Expression) der dxr-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in einer Wirtszelle zu steuern. Die Expressionskonstrukte umfassen im Allgemeinen einen Promotor, der in einer Wirtszelle funktional ist, in funktionsfähiger Verbindung an eine Nukleinsäuresequenz geknüpft, die für ein dxr der vorliegenden Erfindung kodiert, und eine transkriptionelle Terminierungsregion, die in einer Wirtszelle funktional ist. Wirtszellen von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung schließen Pilzzellen, Hefezellen, Bakterienzellen, Säugetierzellen und Pflanzenzellen ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Eine erste Nukleinsäuresequenz ist mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz "funktionsfähig verbunden" oder "funktionsfähig assoziiert", wenn die Sequenzen so angeordnet sind, daß die erste Nukleinsäuresequenz die Funktion der zweiten Nukleinsäuresequenz beeinflusst. Bevorzugt sind die zwei Sequenzen Teil eines einzelnen, durchgehenden Nukleinsäuremoleküls und sind noch bevorzugter benachbart. Zum Beispiel liegt ein Promotor in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Gen vor, wenn der Promotor die Transkription des Gens in einer Zelle reguliert oder vermittelt.
Die Fachleute werden erkennen, daß es eine Anzahl von Promotoren gibt, die in Pflanzenzellen funktional sind und die in der Literatur beschrieben worden sind. Chloroplasten- und Plastiden-spezifische Promotoren, Chloroplasten- oder Pastidenfunktionale Promotoren sowie Chloroplasten- oder Plastidenoperable Promotoren sind ebenfalls vorgesehen.
Eine Gruppe von Pflanzen-funktionalen Promotoren sind konstitutive Promotoren, wie die CaMV35S- oder FMV35S-Promotoren, die zu hohen Expressionsniveaus in den meisten Pflanzenorganen führen. Verstärkte oder verdoppelte Versionen der CaMV35S- und FMV35S-Promotoren sind bei der Durchführung dieser Erfindung nützlich (Odell, et al. (1985) Nature 313:810–812; Rogers, US-Patent Nr. 5,378, 619). Zusätzlich kann es bevorzugt sein, die Expression des dxr-Gens in bestimmten Geweben der Pflanzen, wie beispielsweise dem Blatt, dem Stamm, der Wurzel, der Knolle, dem Saatkorn, der Frucht, etc. zu bewirken, und der ausgewählte Promotor sollte die erwünschte Gewebe- und Entwicklungsspezifität aufweisen.
Von besonderem Interesse ist die Expression der Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung ausgehend von Transkriptionsinitiationsbereichen, die bevorzugt in einem Pflanzensaatgewebe exprimiert werden. Beispiele für solche Saat-bevorzugten Transkriptionsinitiationssequenzen schließen solche Sequenzen ein, die von Sequenzen abgeleitet sind, die für Gene für Pflanzenspeicherproteine oder für Gene kodieren, die an der Fettsäurebiosynthese in Ölsaaten beteiligt sind. Beispiele für solche Promotoren schließen die 5'-regulatorischen Bereiche von solchen Genen wie dem Napin (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991)), Phaseolin, Zein, dem Trypsininhibitor aus der Sojabohne, ACP, der Stearoyl-ACP-Desaturase, der α'-Untereinheit von β-Conglycinin aus der Sojabohne (Soja-7s, (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986))) und dem Oleosin ein.
Es kann vorteilhaft sein, die Lokalisierung der Proteine, die dxr gewähren, in ein bestimmtes zelluläres Kompartiment zu steuern, zum Beispiel in das Mitochondrium, das endoplasmatische Retikulum, die Vakuolen, den Chloroplasten oder ein anderes plastidäres Kompartiment. Wenn zum Beispiel die erfindungsgemäßen Gene von Interesse für die Expression hin zu Plastiden, wie beispielsweise Chloroplasten, gezielt ("targeted") sind, dann werden die Konstrukte die Verwendung von Sequenzen einsetzen, um das Gene zu dem Plastiden hin zu steuern. Solche Sequenzen werden hier als Chloroplastentransitpeptide (CTP) oder Plastidentransitpeptide (PTP) bezeichnet. Auf diese Weise werden, wenn das Gen von Interesse nicht direkt in das Plastid eingebracht wird, das Expressionskonstrukt zusätzlich ein Gen enthalten, das für ein Transitpeptid kodiert, um das Gen von Interesse zu dem Plastiden hin zu steuern. Die Chloroplastentransitpeptide können von dem Gen von Interesse abgeleitet sein, oder können von einer heterologen Sequenz abgeleitet sein, die ein CTP aufweist. Solche Transitpeptide sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544–17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 196:1414–1421; und Shah et al. (1986) Science 233:478–481.
Abhängig von der beabsichtigten Verwendung können die Konstrukte die Nukleinsäuresequenz enthalten, die für das gesamte dxr-Protein oder einen Teil davon kodiert. Wenn beispielsweise die Antisense-Inhibierung eines gegebenen dxr-Proteins gewünscht ist, wird nicht die gesamte dxr-Sequenz benötigt. Wo weiterhin die in den Konstrukten verwendeten dxr-Sequenzen für eine Verwendung als Sonden beabsichtigt sind, kann es vorteilhaft sein, Konstrukte zu erstellen, die nur einen bestimmten Teil einer für dxr kodierenden Sequenz enthalten, beispielsweise eine Sequenz, für die ermittelt wurde, daß sie für einen hochkonservierten dxr-Bereich kodiert.
Der Fachmann wird erkennen, daß es verschiedene Verfahren für die Inhibierung der Expression von endogenen Sequenzen in einer Wirtszelle gibt. Derartige Verfahren schließen Antisense-Suppression (Smith, et al. (1988) Nature 334:724–726), Co-Suppression (Napoli, et al. (1989) Plant Cell 2:279–289), Ribozyme (PCT-Veröffentlichung WO 97/10328), und Kombinationen von Sense und Antisense (Waterhouse, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959–13964) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Verfahren für die Suppression von endogenen Sequenzen in einer Wirtszelle verwenden üblicherweise die Transkription oder die Transkription und Translation von mindestens einem Teil der Sequenz, die supprimiert werden soll. Derartige Sequenzen können homolog zu kodierenden ebenso wie zu nicht-kodierenden Bereichen der endogenen Sequenz sein.
In den Pflanzenexpressionskonstrukten der vorliegenden Erfindung können auch regulatorische Transkriptionsterminierungsbereiche bereitgestellt werden. Transkriptionsterminierungsbereiche können durch die DNA-Sequenz bereitgestellt werden, die für das dxr kodiert, oder durch einen geeigneten Transkriptionsterminierungsbereich, der aus einer anderen Genquelle abgeleitet ist, zum Beispiel dem Transkriptionsterminierungsbereich, der natürlicherweise mit dem Transkriptionsinitiationsbereich assoziiert ist. Der Fachmann wird erkennen, dass jedweder geeigneter Transkriptionsterminierungsbereich, der in der Lage ist, die Transkription in einer Pflanzenzelle zu beenden, in den Konstrukten der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann.
Alternativ können Konstrukte hergestellt werden, um die Expression der dxr-Sequenzen direkt aus den Plastiden der Wirtspflanzenzelle zu steuern. Derartige Konstrukte und Verfahren sind im Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel in Svab, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526–8530 und in Svab und Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913–917 und im US-Patent Nr. 5,693,507 allgemein beschrieben.
Die Konstrukte der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Verfahren zur Veränderung des Flusses durch den Isoprenoidbiosyntheseweg mit zusätzlichen Konstrukten für die Expression von zusätzlichen Genen, die an der Bildung von Isoprenoiden beteiligt sind, verwendet werden. Solche Sequenzen schließen 1-Deoxyxylulose-5-phosphatsynthase ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Weiterhin können die Konstrukte der vorliegenden Erfindung in Transformationsverfahren mit zusätzlichen Konstrukten verwendet werden, die für die Expression von zusätzlichen Nukleinsäuresequenzen sorgen, die für Proteine der Bildung von spezifischen Isoprenoiden kodieren, wie beispielsweise Tocopherolen, Carotinoiden, Sterolen, Monoterpenen, Sesquiterpenen und Diterpenen. An der Bildung von Carotinoiden beteiligte Nukleinsäuresequenzen und Verfahren werden zum Beispiel in der PCT-Veröffentlichung WO 99/07867 beschrieben. Nukleinsäurese quenzen, die an der Bildung von Tocopherolen beteiligt sind, schließen gamma-Tocopherolmethyltransferase (Shintani, et al. (1998) Science 282(5396):2098–2100), Tocopherolcyclase, und Tocopherolmethyltransferase, Phytylprenyltransferase, Geranylgeranylpyrophosphathydrogenase, Geranylgeranylpyrophosphatsynthase ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Eine Pflanzenzelle, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan, oder eine Pflanze, in welches/welche die rekombinanten DNA-Konstrukte, welche die Expressionskonstrukte enthalten, eingebracht wurden, wird als transformiert, transfiziert oder transgen bezeichnet. Eine transgene oder transformierte Zelle oder Pflanze schließt ferner Nachkommen der Zelle oder der Pflanze sowie Nachkommen ein, die durch ein Zuchtprogramm erzeugt wurden, das eine derartige transgene Pflanze als einen Elter in einer Kreuzung verwenden und die einen veränderten Phänotyp zeigen, der von der Gegenwart einer dxr-Nukleinsäuresequenz herrührt.
Pflanzenexpressions- oder -transkriptionskonstrukte, die eine für dxr kodierende Sequenz als die DNA-Sequenz von Interesse für dessen erhöhte oder verringerte Expression aufweisen, können mit einer großen Vielfalt an pflanzlichem Leben verwendet werden. Für eine Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugte Pflanzen schließen Akazie, Alfalfa, Aneth, Apfel, Aprikose, Artischocke, Rauke, Spargel, Avocado, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Brombeere, Blaubeere, Brokkoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Cantaloup-Melone, Mohrrübe, Maniok, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicoree, Koriander, Zitrusgewächs, Clementinen, Kaffee, Mais, Baumwolle, Salatgurke, Douglastanne, Aubergine, Endivie, Winterendivie, Eukalyptus, Fenchel, Feigen, Knoblauch, Flaschenkürbis, Weintraube, Grapefruit, Honigtau ("honey dew"), Jicama, Kiwifrucht, Salat, Lauch, Limone, Limette, Loblolly-Kiefer, Mango, Melone, Pilz, Nektarine, Nuss, Hafer, Ölpalme, Raps, Okra, Zwiebel, Orange, eine Zierpflanze, Papaya, Petersilie, Erbse, Pfirsich, Erdnuss, Birne, Pfeffer, Persimone, Kiefer, Ananas, Kochbanane, Pflaume, Granatapfel, Pappel, Kartoffel, Kürbis, Quitte, Radiatakiefer, Radicchio, Rettich, Himbeere, Reis, Roggen, Sorghum, Südkiefer, Sojabohne, Spinat, Kürbis („squash"), Erdbeere, Zuckerrübe, Rohrzucker, Sonnenblume, Süßkartoffel, Amberbaum ("sweetgum"), Mandarine ("tangerine"), Tee, Tabak, Tomate, Triticale, Rasen, Weißrübe, ein wein, Wassermelone, Weizen, Yamswurzel und Zucchini ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Pflanzen sind besonders bevorzugt, die zu der Produktion von Pflanzenölen zur Verwendung als Nahrung und in der Industrie beitragen. Gemäßigte Ölsaatarten sind besonders bevorzugt. Gemäßigte Ölsaatarten von Interesse schließen Raps (Canola und Varietäten mit hohem Erucasäuregehalt), Sonnenblumen, Öldistel, Baumwolle, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss und Ölpalmen sowie Mais ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Abhängig von dem Verfahren zum Einbringen des rekombinanten Konstruktes in die Wirtszelle können andere DNA-Sequenzen benötigt werden. Es ist wichtig zu betonen, daß diese Erfindung auf dicotyledone und monocotyledone Arten gleichermaßen anwendbar ist und auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken leicht anwendbar sein wird.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung von dxr-Konstrukten in Pflanzen, um Pflanzen oder Pflanzenteile, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blätter, Stämme, Wurzeln, reproduktive Teile und die Saat, mit einem modifizierten Gehalt an Tocopherolen in Pflanzenteilen, die transformierte Pflanzenzellen aufweisen, herzustellen.
Für ein immunologisches Screening können Antikörper gegen das Protein durch Injizieren des auf gereinigten Proteins oder eines Teils davon in Kaninchen oder Mäusen hergestellt werden, wobei derartige Verfahren zum Herstellen von Antikörpern dem Fachmann gut bekannt sind. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt werden, obwohl üblicherweise polyklonale Antikörper zur Genisolierung nützlicher sind. Western-Analysen können ausgeführt werden, um zu bestimmen, daß ein verwandtes Protein in einem groben Extrakt der gewünschten Pflanzenart vorhanden ist, wie zum Beispiel durch Kreuzreaktion mit den Antikörpern der kodierten Proteine bestimmt werden kann. Wenn Kreuzreaktivität beobachtet wird, werden Gene, welche die verwandten Proteine kodieren, mittels Durchmustern von Expressionsbibliotheken, welche die gewünschten Pflanzenarten repräsentieren, isoliert. Expressionsbibliotheken können in einer Vielzahl von käuflich erhältlichen Vektoren, einschließlich Lambda gt11, wie in Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben konstruiert werden.
Um die Aktivität und die Spezifität der Proteine, die durch die identifizierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, als dxr-Enzyme zu bestätigen, werden in vitro-Assays in Insektenzellkulturen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionssystemen durchgeführt. Derartige Baculovirus-Expressionssysteme sind im Fachgebiet bekannt und werden von Lee, et al. US-Patent Nr. 5,348,886 beschrieben, dessen Gesamtgehalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Zusätzlich können andere Expressionskonstrukte hergestellt werden, um auf Proteinaktivität unter Verwendung unterschiedlicher Expressionssysteme zu testen. Derartige Expressionskonstrukte werden in einem Hefe- oder prokaryotischen Wirt transformiert und auf dxr-Aktivität getestet. Solche Expressionssysteme sind im Fachgebiet bekannt und sind über kommerzielle Quellen leicht erhältlich.
Zusätzlich zu den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sequenzen können DNA-kodierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, aus Algen, Pilzen, Bakterien, Säugetierquellen, Pflanzen, etc. erhalten werden. Homologiesuchen in bestehenden Datenbanken unter Verwendung von Signatursequenzen, die konservierten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen von dxr entsprechen, können verwendet werden, um entsprechende, verwandte Gene aus anderen Quellen, wie beispielsweise Pflanzen und Mikroorganismen, zu isolieren. Es können ebenfalls Suchen in EST-Datenbanken unternommen werden. Ferner wird die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Enzyme kodieren, die den hier beschriebenen funktionell enzymatisch entsprechen, von der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen, wobei solche DNA-Sequenzen degenerierte Äquivalente der hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen in Übereinstimmung mit der Degeneration des genetischen Kodes sind. Ein Nachweis der Funktionalität von kodierenden Sequenzen, die mittels eines dieser Verfahren identifiziert wurden, kann durch Komplementierung von Mutanten von geeigneten Organismen, wie beispielsweise Synechocystis, Shewanella, Hefe, Peusodomonas, Rhodobacteria, etc., denen spezifische biochemische Reaktionen fehlen oder die mutiert worden sind, durchgeführt werden. Die Sequenzen der DNA-kodierenden Bereiche können durch Gen-Resynthese auf Grundlage des Codon Usage für eine maximale Expression in bestimmten Wirten optimiert werden.
Das beim Erhalten solcher transgener Pflanzen verwendete Transformationsverfahren ist für die vorliegende Erfindung nicht wesentlich, wobei derzeit verschiedene Verfahren der Pflanzentransformation verfügbar sind. Wenn neuere Verfahren verfügbar werden, um Kulturpflanzen zu transformieren, können diese weiterhin hier direkt angewandt werden. Beispielsweise können viele Pflanzenarten, die natürlicherweise einer Agrobacterium-Infektion gegenüber empfänglich sind, über dreiteilige („tripartite") oder Binärvektor-Verfahren der Agrobac terium-vermittelten Transformation erfolgreich transformiert werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, daß das Konstrukt auf einer oder beiden Seiten von T-DNA flankiert wird, insbesondere wenn der linke und der rechte Rand vorliegt, noch wichtiger bei dem rechten Rand. Dies ist besonders nützlich, wenn das Konstrukt A. tumefaciens oder A. rhizogenes als das Mittel der Transformation verwendet, obwohl die T-DNA-Grenzen auch mit anderen Arten der Transformation Verwendung finden können. Zusätzlich wurden Techniken der Mikroinjektion, des DNA-Partikelbombardements und der Elektroporation entwikkelt, welche die Transformation von verschiedenen monocotyledonen und dicotyledonen Pflanzenarten ermöglichen.
Normalerweise wird in das DNA-Konstrukt ein strukturelles Gen aufgenommen, das die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression in einem Wirt aufweist und die Selektion von transformierten Zellen ermöglicht. Das Gen kann eine Resistenz gegenüber einem zytotoxischen Mittel, zum Beispiel einem Antibiotikum, Schwermetall, Toxin, etc., eine Komplementierung, die einem auxotrophen Wirt Phototrophie verleiht, virale Immunität oder dergleichen bereitstellen. Abhängig von der Anzahl der verschiedenen Wirtsarten, in die das Expressionskonstrukt oder Teile davon eingebracht werden, können ein oder mehrere Marker verwendet werden, wobei unterschiedliche Selektionsbedingungen für unterschiedliche Wirte verwendet werden.
Wenn Agrobacterium für die Pflanzenzelltransformation verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, der zur homologen Rekombination mit T-DNA oder dem in dem Agrobacterium-Wirt vorliegenden Ti- oder Ri-Plasmid in den Agrobacterium-Wirt eingebracht werden kann. Das die T-DNA für die Rekombination enthaltende Ti- oder Ri-Plasmid kann "bewaffnet" (zur Gallenbildung in der Lage) oder "unbewaffnet" (zur Gallenbildung nicht in der Lage) sein, wobei Letzteres zulässig ist, solange die vir-Gene in den transformierten Agrobacterium-Wirt vorhan den sind. Das "bewaffnete" Plasmid kann eine Mischung von normalen Pflanzenzellen und Gallen hervorrufen.
In einigen Fällen, bei denen Agrobacterium als das Vehikel für die Transformation von Wirtspflanzenzellen verwendet wird, wird das durch den/die T-DNA-Randbereich e) begrenzte Expressions- oder Transkriptionskonstrukt in einen Vektor mit breitem Wirtsspektrum eingebracht, der in der Lage ist, sich E. coli und Agrobacterium zu replizieren, wobei Vektoren mit breitem Wirtsspektrum in der Literatur beschrieben sind. Gewöhnlicherweise wird pRK2 oder Derivate davon verwendet. Siehe zum Beispiel Ditta, et al., (Proc. Nat. Acad. Set, U.S.A. (1980) 77:7347–7351) und EP-A-0 120 515, die hierin durch Bezugnahme vollständig aufgenommen werden. Alternativ kann man die in Pflanzenzellen zu exprimierenden Sequenzen in einen Vektor einbringen, der separate Replikationssequenzen enthält, von denen eine den Vektor in E. coli stabilisiert und die andere in Agrobacterium. Siehe zum Beispiel McBride, et al. (Plant Mol. Biol. (1990) 14:269–216), wobei der pRiHRI-Replikationsorigin (Jouanin, et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201:370–374) verwendet wird und zusätzliche Stabilität des Pflanzenexpressionsvektors in Wirts-Agrobacterium-Zellen bietet.
Ein oder mehrere Marker, welche die Selektion von transformiertem Agrobacterium und transformierten Pflanzenzellen ermöglichen, werden in das Expressionskonstrukt und die T-DNA eingeschlossen. Eine Anzahl von Markern ist für die Verwendung mit Pflanzenzellen entwickelt worden, wie beispielsweise die Resistenz gegenüber Chloramphenicol, Kanamycin, das Aminoglykosid G418, Hygromycin und dergleichen. Der verwendete bestimmte Marker ist für diese Erfindung nicht wesentlich, wobei der eine oder andere Marker in Abhängigkeit von dem bestimmten Wirt und der Art der Konstruktion bevorzugt sein kann.
Für die Transformation von Pflanzenzellen bei Verwendung von Agrobacterium können Explantate ("explant") vereint und zur Transformation mit dem transformierten Agrobacterium für eine ausreichende Zeit inkubiert, die Bakterien getötet und die Pflanzenzellen in einem geeigneten Selektionsmedium kultiviert werden. Sobald sich Kallus bildet, kann die Bildung von Trieben durch Verwendung der geeigneten Pflanzenhormone in Übereinstimmung mit bekannten Methoden gefördert werden und die Triebe zur Regeneration von Pflanzen auf Bewurzelungsmedium überführt werden. Die Pflanzen können dann bis zur Saatbildung angezogen werden und die Saat verwendet werden, um sich wiederholende Generationen zu bilden und um Pflanzenöle zu isolieren.
Es gibt verschiedene mögliche Wege, um die Pflanzenzellen dieser Erfindung zu erhalten, die multiple Expressionskonstrukte enthalten. Jegliches Mittel für die Herstellung einer Pflanze, die ein Konstrukt umfasst, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein Expressionskonstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, und mindestens ein weiteres Konstrukt, das eine weitere DNA-Sequenz aufweist, die für ein Enzym kodiert, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Beispielsweise kann das Expressionskonstrukt verwendet werden, um eine Pflanze zur gleichen Zeit wie das zweite Konstrukt zu transformieren, entweder durch Einschluss beider Expressionskonstrukte in einen einzelnen Transformationsvektor oder durch Verwenden getrennter Vektoren, von denen jedes gewünschte Gene exprimiert. Das zweite Konstrukt kann in eine Pflanze eingebracht werden, die bereits mit dem dxr-Expressionskonstrukt transformiert worden ist, oder alternativ können transformierte Pflanzen, von denen eine das dxr-Konstrukt exprimiert und eine das zweite Konstrukt exprimiert, gekreuzt werden, um die Konstrukte in der gleichen Pflanzen zusammen zu bringen.
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können in Konstrukten verwendet werden, um die Expression der Sequenzen in einer Vielzahl von Wirtszellen, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, bereitzustellen. Wirtszellen der vorliegenden Erfindung schließen bevorzugt monocotyledone und dicotyledone Pflanzenzellen ein.
Im Allgemeinen ist der Fachmann mit den Standardquellen und Materialien vertraut, welche die spezifische Bedingungen und Verfahren für die Konstruktion, Handhabung und Isolierung von Makromolekülen (zum Beispiel DNA-Moleküle, Plasmide, etc.), die Erzeugung von rekombinanten Organismen und das Screening und das Isolieren von Klonen beschreiben, (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995), die durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen werden; Birren et al, Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, New York, das zur Gänze hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Verfahren für die Expression von Sequenzen in Insektenwirtszellen sind im Fachgebiet bekannt. Baculovirus-Expressionsvektoren sind rekombinante Insektenviren, in denen die kodierende Sequenz für ein ausgewähltes fremdes Gen hinter einen Baculovirus-Promotor anstelle eines viralen Gens, zum Beispiel Polyhedrin (Smith und Summers, US-Pat. Nr., 4,745,051, das zur Gänze hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) eingefügt wurde. Baculovirus-Expressionsvektoren sind im Fachgebiet bekannt und werden zum Beispiel in Doerfler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131:51–68 (1968); Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47–55 (1988a); Miller, Annual Review of Microbiol. 42:177–199 (1988); Summers, Curr. Comm. Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Summers und Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Ag. Exper. Station Bulletin Nr. 1555 (1988) beschrieben, das zur Gänze hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Verfahren für die Expression einer Nukleinsäuresequenz von Interesse in einer Pilzwirtszelle sind im Fachgebiet bekannt. Die Pilzwirtszelle kann zum Beispiel eine Hefezelle oder eine filamentöse Pilzzelle sein. Verfahren für die Expression von DNA-Sequenzen von Interesse in Hefezellen sind in dem "Guide to yeast genetics and molecular biology", Guthrie und Fink, Hrsg., Methods in enzymology, Academic Press, Inc., Band 194 (1991) und in "Gene expression technology", Goeddel, Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Band 185 (1991) allgemein beschrieben.
Säugetierzellinien, die als Wirte für die Expression verfügbar sind, sind im Fachgebiet bekannt und schließen viele immortalisierte Zellinien ein, die von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) erhältlich sind, wie beispielsweise HeLa-Zellen, Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen), Babyhamsternieren (BHK)-Zellen und eine Anzahl von anderen Zellinien. Geeignete Promotoren für Säugetierzellen sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und schließen virale Promotoren, wie beispielsweise den vom Simian-Virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273:113 (1978), das zur Gänze hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird), vom Rous-Sarcoma-Virus (RSV), vom Adenovirus (ADV) und vom bovinen Papilloma-Virus (BPV) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Säugetierzellen können außerdem Terminatorsequenzen und Poly-A-Additionssequenzen benötigen. Verstärkersequenzen, welche die Expression verstärken, können ebenfalls eingeschlossen werden, und Sequenzen, welche die Amplifikation des Gens fördern, können ebenfalls wünschenswert sein (zum Beispiel Methotrexat-Resistenzgene).
Vektoren, die für die Replikation in Säugetierzellen geeignet sind, sind im Fachgebiet bekannt, und können virale Replikons einschließen, oder Sequenzen, welche den Einbau der geeigneten Sequenzen, die für Epitope kodieren, in das Wirtsgenom sicherstellen. Plasmidvektoren, welche die Konstruktion von rekombinanten Viren deutlich erleichtern, sind beschrieben worden (siehe zum Beispiel Mackett et al., J Virol. 49:857 (1984); Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403 (1985); Moss, In: Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller und Calos, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., S. 10, (1987), die alle durch Bezugnahme in Gänze hierin aufgenommen werden).
Die nun allgemein beschriebene Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele einfacher verstanden werden, wobei die Beispiele nur zum Zwecke der Veranschaulichung eingefügt wurden und nicht dazu gedacht sind, die vorliegende Erfindung zu beschränken.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Synthese von 2-C-Methyl-D-Erythritol
2-C-Methyl-D-Erythritol mit einem enantiomeren Überschuss („e.e.") von ca. 80% wurde gemäß einem (von) Duvold, et al. (1997) Tetrahedron Lett 38:4769–4772, und Duvold, et al. (1997) Tetrahedron Lett 38:6181–6184 (beschriebenen Verfahren) hergestellt, das an die Herstellung von größeren Mengen angepasst wurde. Eine Lösung von 3-Methyl-2(5H)-furanon (200 mg, 2 mmol) in trockenem Ether (20 ml) wurde bei 0°C über einen Zeitraum von 15 min zu einer gerührten Suspension von LiAlH₄ (46 mg, 1,2 mmol) in trockenem Ether (20 ml) unter Argon zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für weitere 2 h bei 0°C gerührt. Eine gesättigte Lösung von NH₄Cl (2 ml) wurde langsam zugegeben, bis der Überschuss an LiAlH₄ zerstört war. Nach Ansäuerung mit einer Lösung von 1 M HCl bis alle Aluminiumsalze gelöst waren, wurde die wässrige Phase mit Ethylacetat (6 × 20 ml) extrahiert. Die vereinten organischen Schichten wurden mit gesättigter Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels bei reduziertem Druck wurde das in Methylenchlorid (20 ml) gelöste grobe Diol (177 mg) für 15 min mit einer Mischung von Essigsäureanhydrid/Triethylamin (2:3, v/v, 1 ml) in Gegenwart von katalytischen Mengen von Dimethylaminopyridin (12 mg) direkt acetyliert. Das Lösungsmittel und der Überschuss an Reagenzien wurden bei reduziertem Druck verdampft. Eine schnelle Säulenchromatographie ("flash column chromatography"; Still et al., 1978) (Hexan/Ethylacetat, 4:1, v/v) lieferte pures Diacetat (330 mg, 86%). Enantioselektive Dihydroxylierung des Diacetats (300 mg, 1,6 mmol) wurde durch Rühren bei 0°C in tert.-Butanol/Wasser (1:1, v/v, 6 ml) in der Gegenwart des chiralen Osmylierungsreagenz AD-Mix-b (2,5 g) und CH₃SO₂NH₂ (152 mg, 1,6 mmol) durchgeführt. Nach 24 Stunden wurde die Reaktion mit festem Na₂SO₃ und zusätzlichem Rühren für 30 min gequencht. Eine wiederholte Extraktion mit Ethylacetat (6 × 20 ml) und eine schnelle Chromatographie (Ethylacetat) lieferte eine Mischung, die nur 2-C-Methyl-D-Erythritoldiacetate lieferte (die von partiellen intramolekularen Transesterifizierungen herrührten) (312 mg, 88% Ausbeute). Quantitative Deacetylierung wurde über Nacht bei Raumtemperatur in der Gegenwart von basischem Amberlyst A-26 (OH-Form) (150 mg für 1 mmol) in Methanol (30 ml) durchgeführt (Reed et al., 1981). Eine Filtration des Harzes und direktes Verdampfen des Lösungsmittels lieferte reines 2-C-methyl-D-Erythritol (190 mg, 75% Gesamtausbeute).
BEISPIEL 2: Ortsgerichtete Markerinsertionsmutagenese des dxr-Gens aus E. coli
Der Bereich, der sich von dem 5'-Bereich des dxr-Gens bis zu dem 3'-flankierenden Bereich des yaeS-Gens erstreckt, wurde durch PCR unter Verwendung von genomischer DNA, die aus dem Wildtyp-E. coli-Stamm W3110 (Kohara et al., 1987) isoliert wurde, und den Primern P1 (5'-CTCTGGATGTCATATGAAGCAACTC-3' (SEQ ID NO: 3); das unterstrichene ATG entspricht dem Translationsstartkodon des dxr-Gens) und P2 (5'-CCGCATAACACCGCCAACC-3' (SEQ ID NO: 4); befindet sich in dem 3'-flankierenden Bereich des yaeS-Gens) amplifiziert. Die Reaktionsmischung für die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl zubereitet, welche die DNA-Matrize (100 ng), 0,5 μM von jedem Primer, 200 μM von jedem Deoxynukleosidtriphosphat, 20 mM Tris-HCl eingestellt auf pH 8,8, 2 mM MgSO₄, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂50₄, 0,1 mg/ml BSA und 0,1% Triton X-100 enthielten. Die Probe wurde mit Mineralöl überschichtet, bei 94°C für 3 m min inkubiert und auf 80°C abgekühlt. Pfu-DNA-Polymerase (1,25 Einheiten, Stratagene) wurde zugegeben und die Reaktionsmischung wurde für 30 Zyklen bestehend aus 45 sek bei 94°C, 45 sek bei 59°C und 10 min bei 72°C gefolgt von einem Endschritt von 10 min bei 72°C inkubiert. Nach der Amplifikation wurden Adenine an die 3'-Enden des PCR-Produktes, wie in der Anleitung des Herstellers angegeben, angefügt und das adenylierte Produkt in den pGEM-T-Vektor (Promega) kloniert, um das Plasmid pMJl zu formen. Das CAT (Chloramphenicolacetyltransferase)-Gen, das im Plasmid pCAT19 (Fuqua, 1992) vorliegt, wurde durch Verdau mit PstI und XbaI ausgeschnitten, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und in die einmal vorkommende AsuII-Stelle, die in dem dxr-Gen vorliegt, durch Ligation über stumpfe Enden ("blunt end ligation") (nach Behandlung mit T4-DNA-Polymerase) kloniert, wodurch Plasmid pMJ2 entstand. Restriktionsenzymkartierung wurde verwendet, um die Klone zu identifizieren, in denen das CAT-Gen in der gleichen Orientierung wie das dxr-Gen vorliegt. Das Plasmid pMJ3 wurde durch Subklonieren des SpeI-SphI-Fragments, das aus dem Plasmid pMJ2 ausgeschnitten wurde, in die NheI-SphI-Stelle des Plasmids pBR322 gebildet. Das Plasmid pMJ3 wurde durch Verdau mit PstI linearisiert, mit alkaliner Phosphatase aus dem Kälberdarm ("calf intestinal alkaline phosphatase", Gibco BRL) inkubiert und durch Agarosegelelektrophorese auf gereinigt. 2 μg der aufgereinigten, linearisierten Plasmid-pMJ3-DNA wurden verwendet, um den E coli-Stamm JC7623 (Winans et al., 1985) zu transformieren. Transformierte Zellen wurden auf LB-Platten (Ausubel et al., 1987) plattiert, denen 2 mM 2-C-Methyl-D-Erythritol (ME) und Chloramphenicol (17 μg/ml) zugegeben worden sind. Kolonien, die sowohl Chloramphenicolresistenz als auch ME-Auxotrophie zeigen, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Das Vorkommen der CAT-Geninsertion in das dxr-Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer P3 (5'-GCACACTTCCACTGTGTGTG-3' (SEQ ID NO: 5), befindet sich in dem 5'-Bereich des frr-Gens) und P2 überprüft. Eine dieser Kolonien, die als Stamm JC7623dxr:CAT bezeichnet wurde, wurde für die Komplementierungsuntersuchungen verwendet.
EXAMPLE 3: Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden („rapid amplification of cDNA ends; RACE)
Um mutmaßliche Pflanzennukleinsäuresequenzen zu identifizieren, die für Homologe der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase (DXR) kodieren, wurde die nicht-redundante Datenbank des Nationalen Centers für Biotechnologieinformationen (NCBI) mit dem TBLASTN-Programm durchsucht, indem die vollständige Aminosäuresequenz des kürzlich klonierten DXR aus Escherichia coli (Takahashi et al., 1998) als Suchanfrage verwendet wurde. Ein signifikanter Identitätsgrad (40–64%) wurde zwischen dieser Suchanfrage und der Aminosäuresequenz gefunden, die durch sieben vorhergesagte Exons des genomischen Klons MQB2 aus A. thaliana (Zugangskodenr. ABOO9053) kodiert wurde.
Um das Vorkommen von mRNA-Sequenzen zu bestätigen, die dem mutmaßlichen A. thaliana-DXR-Gen entsprechen, wurde die EST-Datenbank des NCBI (dbEST) mit dem BLASTN-Programm unter Verwendung der Nukleotidsequenz des Klons MOB2, die sich von den Nukleotiden 29247 bis 31317 erstreckt, durchsucht. Zwei EST-Klone aus A. thaliana (12OE8T7 und 65FIIXP3', Zugangskodenummern T43949 bzw. AA586087) wurden gefunden, die Nukleotidsequenzen enthalten, die mit verschiedenen Bereichen der Suchanfrage identisch sind. Ein Sequenzieren der cDNA-Inserts zeigte, daß sich die zwei Klone überlappten. Die längste cDNA enthielt einen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid von 329 Resten kodierte, die eine Identität von 41,6% (Ähnlichkeit von 53,2%) mit dem C-terminalen Bereich des DXR aus E. coli zeigte, was darauf hinweist, daß die beiden cDNAs für verkürzte („truncated") Versionen des mutmaßlichen Enzyms aus A. thaliana kodieren.
Gesamt-RNA von für 12 Tage bei Licht angezogenen Arabidopsis thaliana- (var. Columbia) Keimlingen wurde wie beschrieben (Dean et al., 1985) aufgereinigt. Eine schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) wurde mit dem 5'-RACE-System (Version 2.0) von Life Technologies/Gibco BRL gemäß den Anweisungen des Lieferanten durchgeführt. Der erste cDNA-Strang wurde unter Verwendung von 1 μg der RNA-Probe als Matrize und dem Oligonukleotid DXR-GSP1 (5'-ATTCGAACCAGCAGCTAGAG-3' (SEQ ID NO: 6)) als spezifischem Downstream-Primer, der zu den Nukleotiden +767 bis +786 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz komplementär ist, synthetisiert. Nach Aufreinigung und homopolymeren Tailing der cDNA wurde zwei ineinander verschachtelte („nested") PCR-Reaktionen durchgeführt. Bei der ersten PCR war der spezifische Downstream-Primer das Oligonukleotid DXR-GSP2 (5'-CCAGTAGATCCAACGATAGAG-3' (SEQ ID NO: 7), der zu den Nukleotiden +530 bis +550 der SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz komplementär ist) und der Upstream-Primer war das Oligonukleotid 5'-RACE-AAP (in dem Kit bereitgestellt). Bei der zweiten PCR war der spezifische Downstream-Primer das Oligonukleotid DXR-GSP3 (5'-GGCCATGCTGGAGGAGGTTG-3' (SEQ ID NO: 8), der zu den Nukleotiden +456 bis +475 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz komplementär ist) und der Upstream-Primer war das Oligonukleotid AUAP (in dem Kit bereitgestellt). Bei beiden PCR-Reaktionen wurde der Amplifikationsprozess durch Denaturierung der Probe (3 min bei 94°C), Abkühlen auf 80°C und Zugabe der Taq-DNA-Polymerase gestartet. Die Reaktionsmischung der ersten PCR wurde über 15 Zyklen bestehend aus 30 sek bei 94°C, 30 sek bei 55°C und 1 min bei 72°C gefolgt von einem Endschritt von 5 min bei 72°C inkubiert. Die erhaltene Probe wurde 1 : 10 in der Reaktionsmischung der zweiten PCR verdünnt und über 30 Zyklen bestehend aus 30 sek bei 94°C, 30 sek bei 61°C und 1 min bei 72°C mit einem Endschritt von 5 min bei 72°C inkubiert. Die letztendlich erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt, in das Plasmid pBluescript SK+ kloniert und sequenziert (SEQ ID NO: 1).
BEISPIEL 4: Klonieren einer 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase-cDNA aus Arabidopsis thaliana
Um den 5'-Bereich des mutmaßlichen DXR-Gens zu definieren, wurde der entsprechende Transkriptionsstart durch Verwendung der RACE-Technik kartiert. Primer wurden auf der Grundlage des Abgleichs zwischen dem DXR aus E. coli und der Aminosäuresequenz, die aus dem genomischen Klon aus A. thaliana abgeleitet wurde, entworfen. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der dxr-Nukleinsäurensequenz aus Arabidopsis (SEQ ID NO: 1) wird als SEQ ID NO: 2 bereitgestellt. Der erste Strang der cDNA wurde unter Verwendung von RNA aus A. thaliana-Keimlingen als eine Matrize und dem Oligonukleotid DXR-GSP1 als Primer synthetisiert. Dieses Oligonukleotid war komplementär zu der Region zwischen den Positionen +767 und +786 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten genomischen Sequenz. Anschließend wurden zwei ineinan der verschachtelte PCR-Reaktionen ausgeführt, um das 5'-Ende der mRNA zu amplifizieren. Die spezifischen Downstream-Primer, die für die erste und die zweite ineinander verschachtelte PCR-Reaktion verwendet wurden, waren komplementär zu den Bereichen, die sich von den Positionen +530 bis +550 (Primer DXR-GSP2) bzw. +456 bis +475 (Primer DXR-GSP3) erstrecken. Vier Klone, die den Hauptamplifikationsprodukten entsprachen, wurden sequenziert, und es wurde gefunden, daß sie das gleiche 5'-Ende aufwiesen, welches dem Adenin an Position +1 in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten genomischen Sequenz entsprach.
Eine cDNA, welche die gesamte kodierende Sequenz des Arabidopsis-DXR enthielt, wurde durch zwei aufeinander folgende PCR-Reaktionen aus einer cDNA-Bibliothek amplifiziert, die aus der A. thaliana (var. Columbia)-Zellsuspensionslinie T87 abgeleitet war. Ein Aliquot der Bibliothek wurde mit Ethanol gefällt und in Wasser resuspendiert. Die Reaktionsmischung für die erste PCR wurde in einem Endvolumen von 25 μl zubereitet, welche die DNA-Matrize (das Äquivalent von 4 × 10⁵ pfu der cDNA-Bibliothek), 0,5 μM des Upstream-Primers DXR-34 (5'-CAAGAGTAGTAGTGCGGTTCTCTGG-3' (SEQ ID NO: 9), entspricht den Nukleotiden +34 bis +58 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz), 0,5 μM des Downstream-Primers DXR-E2 (5'-CAGTTTGGCTTGTTCGGATCACAG-3' (SEQ ID NO: 10), der zu den Nukleotiden +3146 bis +3169 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz komplementär ist), 200 μM von jedem Deoxynukleosidtriphosphat, 20 μM Tris-HCl eingestellt auf pH 8,8, 2 mM MgSO₄, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1 mg/ml BSA und 0,1% Triton X-100 enthielten. Die Probe wurde mit Mineralöl überschichtet, für 3 min bei 94°C inkubiert und auf 80°C abgekühlt. Pfu-DNA-Polymerase (1,25 Einheiten, Stratagene) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über 35 Zyklen bestehend aus 30 sek bei 94°C, 40 sek bei 55°C und 6, 5 min bei 72°C gefolgt von einem Endschritt von 15 min bei 72°C inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde 1 : 10 mit Wasser verdünnt und 5 μl wurden als eine Ma trize für die zweite PCR verwendet, die unter Verwendung der gleichen Bedingungen, die für die vorangehende Amplifikation beschrieben wurden, durchgeführt wurde, mit der Ausnahme, daß das Volumen der Reaktionsmischung auf 50 μl erhöht und die Anzahl der Zyklen auf 15 verringert wurde. Das Amplifikationsprodukt wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgereinigt und in das Plasmid pBluescript SK+ kloniert. Das entstehende Plasmid wurde pDXR-At benannt.
Auf diese Weise wurde ein cDNA-Klon, der für das gesamte A. thaliana-DXR kodiert, durch PCR aus einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung der Primer DXR-34 und DXR-E2, die den Bereichen entsprechen, die sich von den Positionen +34 bis +58 bzw. +3146 bis +3169 der genomischen Sequenz erstrecken, erhalten. Die Identität der amplifizierten cDNA wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Der Abgleich der cDNA- und der genomischen Sequenzen zeigte, daß das DXR-Gen aus A. thaliana 12 Exons und 11 Introns enthält, die sich über einen Bereich von 3,2 kBp erstrecken (SEQ ID NO: 1).
Die klonierte cDNA kodiert für ein Protein von 477 Aminosäureresten mit einer vorhergesagten Molekularmasse von 52 kDa. Der Abgleich von DXR aus A. thaliana und aus E. coli (1) zeigt, dass das Pflanzenenzym eine N-terminale Erweiterung von 79 Resten mit den typischen Eigenschaften von Plastidentransitpeptiden (von Heijne et al., 1989) aufweist. Die beiden Proteine zeigen eine Identität von 72,7% (Gleichheit von 54,3%).
BEISPIEL 5: Herstellung eines Expressionskonstruktes
Um das DXR aus A. thaliana in E. coli zu exprimieren, wurde der Bereich der DXR-cDNA, der für die Aminosäurereste 81 bis 477 kodiert, durch PCR aus dem Plasmid pDXR-At amplifiziert und in eine modifizierte Version des Plasmids pBAD-GFPuv (Clontech) kloniert. In diesem Plasmid wird die Expression durch den P_BAD-Promotor angetrieben, der durch Arabinose induziert und mit Glucose reprimiert werden kann. Zuerst wurde das Plasmid pBAD-GFPuv modifiziert, indem die NdeI-Stelle, die zwischen dem pBR322ori und dem für araC kodierenden Bereich (Position 4926–4931) liegt, durch ortsgerichtete Mutagenese dem Verfahren von Kunkel et al. (Kunkel et al., 1987) folgend entfernt wurde. Das Oligonukleotid pBAD-mutl (5'-CTGAGAGTGCACCATCTGCGGTGTGAAATACC-3' (SEQ ID NO: 11)) wurde als Mutageneseprimer verwendet. Das resultierende Plasmid wurde pBAD-Mi bezeichnet. Als nächstes wurden NdeI- und EcoRI-Restriktionsstellen an geeigneten Positionen in der DXR-cDNA von A. thaliana mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pDXR-At als Matrize und den Oligonukleotide 5'-MVKPI (5'-GGCATATGGTGAAACCCATCTCTATCGTTGGATC-3' (SEQ ID NO: 12), der zu den Nukleotiden +522 bis +544 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz komplementär ist; die unterstrichene Sequenz enthält die NdeI-Stelle) und DXR-END(5'-ACGAATTCATTATGCATGAACTGGCCTAGCACC-3' (SEQ ID NO: 13), der zu den Nukleotiden +2997 bis +3018 der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz komplementär ist; die unterstrichene Sequenz enthält die EcoRI-Stelle) als Mutageneseprimer eingeführt. Das PCR-Amplifikationsprodukt wurde mit NdeI und EcoRI verdaut und in das Plasmid pBAD-M1 kloniert, das mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut worden ist. Dies führte zu dem Ersetzen der für GFPuv kodierenden Sequenz im Plasmid pBAD-M1 durch die entsprechende kodierende Sequenz des DXR aus A. thaliana. Das resultierende Plasmid, das als pBAD-DXR bezeichnet wurde, wurde in den Stamm XL-1-Blue eingebracht. Das Plasmid pBAD-M1, das für GFPuv kodiert, wurde als eine Kontrolle in den Komplementierungsuntersuchungen verwendet.
BEISPIEL 6: Analyse des dxr aus Arabidopsis thaliana
Die Funktion des klonierten DXR aus A. thaliana wurde durch Komplementierungsanalysen eines E, coli-Stamms untersucht, der eine Unterbrechung ("disruption") in dem dxr-Gen trägt (Stamm JC7623dxr.:CAT) (siehe Beispiel 2). Dieser Stamm benötigt 2-C-Methyl-D-Erythritol (ME) für das Wachstum. Für die Komplementierungsuntersuchungen verwendeten wir den Bereich des DXR aus A. thaliana, der sich von den Aminosäuren 81 bis 477 der SEQ ID NO: 2 erstreckte, der das mutmaßliche Plastidentransitpeptid nicht einschloss. Das geeignete cDNA-Fragment wurde in ein Derivat des Plasmids pBAD-GFPuv unter der Kontrolle des PBAD-Promotor kloniert, und das entstehende Plasmid (pBAD-DXR) wurde in den JC7623dxr.-CAT-Stamm eingebracht. Die vom PBAD-Promotor ausgehende Expression ist durch Arabinose induzierbar und durch Glucose reprimierbar. Die Induktion mit Arabinose erlaubt das Wachstum des Stamms JC7623dxr.-CAT, der das Plasmid PBAD-DXR trägt, in Abwesenheit von ME, wohingegen kein Wachstum in Gegenwart von Glucose beobachtet wurde. Der Stamm JC7623dxr.:CAT, der das Kontrollplasmid pBAD-M1 trägt, wächst nicht in Gegenwart von Arabinose auf Medium, dem ME fehlt. Der Stamm JC7623dxr.-CAT, der entweder das Plasmid PBAD-DXR oder das Plasmid pBAD-GFPuv trägt, wächst auf Medium, das ME enthält. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die klonierte A. thaliana-cDNA für ein funktionelles DXR kodiert.
Alle in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind für den Grad der Fähigkeiten des Fachmanns bezeichnend, den diese Erfindung betrifft. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Bezugnahme in demselben Maße aufgenommen, als wenn für jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell angegeben worden wäre, daß sie hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden.
Obwohl die vorangehende Erfindung für Zwecke des klaren Verständnisses durch Erläuterungen und Beispiele beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, daß bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der angehängten Ansprüche ausgeübt werden können. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotid, das einen in einer Pflanzenzelle funktionsfähigen heterologen Promotor als eine funktionsfähig verknüpfte Komponente umfasst, wobei das isolierte Polynukleotid aus der Gruppe bestehend aus a) einem isolierten Polynukleotid, das eine für das Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst; b) einem isolierten Polynukleotid, das SEQ ID NO: 1 umfasst; c) einem isolierten Polynukleotid, das zu der Polynukleotidsequenz gemäß (a) oder (b) komplementär ist, ausgewählt ist.
DNA-Konstrukt, das als funktionsfähig verknüpfte Komponenten in 5'-3'-Richtung der Transkription einen in einer Pflanzenzelle funktionsfähigen Promotor, eine aus der Gruppe bestehend aus a) einem Polynukleotid, das eine für das Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst; b) einem Polynukleotid, das SEQ ID NO: 1 umfasst; c) einem Polynukleotid, das zu der Polynukleotidsequenz gemäß (a) oder (b) komplementär ist, ausgewählte Nukleinsäuresequenz und eine transkriptionelle Terminationssequenz umfasst.
Transgene Wirtszelle, die das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 2 umfasst.
Transgene Wirtszelle gemäß Anspruch 3, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Transgene Pflanze, die eine Pflanzenzelle umfasst, die das DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 2 umfasst.
Verfahren für die Veränderung des Isoprenoidgehalts in einer transgenen Pflanze, welches das Transformieren der Wirtspflanze mit einem Konstrukt umfasst, das als funktionsfähig verknüpfte Komponenten einen in einer Pflanze funktionsfähigen transkriptionellen Initiationsbereich, eine aus der Gruppe bestehend aus a) einem Polynukleotid, das eine für das Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst; b) einem Polynukleotid, das SEQ ID NO: 1 umfasst; c) einem Polynukleotid, das zu der Polynukleotidsequenz gemäß (a) oder (b) komplementär ist, ausgewählte Nukleinsäuresequenz und einen transkriptionellen Terminationsbereich umfasst.
Verfahren für die Veränderung des Isoprenoidgehaltes in einer Pflanze gemäß Anspruch 6, bei dem die Nukleinsäuresequenz in der Sense-Orientierung vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem der Isoprenoidgehalt erhöht wird.
Verfahren für die Veränderung des Isoprenoidgehaltes in einer Pflanze gemäß Anspruch 6, bei dem die Nukleinsäuresequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem der Isoprenoidgehalt verringert wird.
Verfahren zum Herstellen einer Isoprenoidverbindung von Interesse in einer Pflanzenzelle, wobei das Verfahren das Erhalten einer transformierten Pflanze umfasst, wobei die Pflanze in ihrem Genom ein primäres Konstrukt, das eine funktionsfähig an einen in einer Pflanzenzelle funktionsfähigen transkriptionellen Initiationsbereich geknüpfte DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Polynukleotid, das eine für das Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 kodierende Nukleotidsequenz umfasst; b) einem Polynukleotid, das SEQ ID NO: 1 umfasst; c) einem Polynukleotid, das zu der Polynukleotidsequenz gemäß (a) oder (b) komplementär ist, umfasst, und mindestens ein sekundäres Konstrukt aufweist und exprimiert, das eine an einen in einer Pflanzenzelle funktionsfähigen transkriptionellen Initiationsbereich gekoppelte DNA-Sequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, das an der Bildung eines bestimmten Isoprenoids beteiligt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, bei dem das Protein an der Bildung von Isoprenoiden beteiligt ist, die aus der Gruppe bestehend aus Tocopherolen, Carotinoiden, Monoterpenen, Diterpenen und Plastochinonen ausgewählt sind.
Verfahren zum Erhöhen des Mevalonat-unabhängigen Isopreonidbiosyntheseflusses in einer Zelle von einer Wirtspflanze, wobei das Verfahren das Transformieren der Wirtspflanze mit dem DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 2 umfasst.
Verfahren zum Modulieren der Krankheitsresistenz in einer Pflanze, wobei das Verfahren das Anziehen einer transgenen Pflanze umfasst, die in ihrem Genom ein Konstrukt gemäß Anspruch 1 oder 2 enthält.
Auf gereinigtes 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomeraseprotein, das mit dem Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 identisch ist mit der Ausnahme, dass 5 bis 10 Aminosäuren in jeglicher Kombination ausgetauscht, entfernt oder an das Polypeptid angehängt wurden.
Auf gereinigtes 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomeraseprotein, das mit dem Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 identisch ist mit der Ausnahme, dass 1 bis 5 Aminosäuren in jeglicher Kombination ausgetauscht, entfernt oder an das Polypeptid angehängt wurden.
Auf gereinigtes 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomeraseprotein, das mit dem Polypeptid aus SEQ ID NO: 2 identisch ist mit der Ausnahme, dass 1 bis 3 Aminosäuren in jeglicher Kombination ausgetauscht, entfernt oder an das Polypeptid angehängt wurden.