DE10107360A1

DE10107360A1 - Neue Metalloproteasen mit Thrombospondin-Domänen und Nucleinsäure- Zusammensetzungen , die diese codieren

Info

Publication number: DE10107360A1
Application number: DE10107360A
Authority: DE
Inventors: Renu Anand Heller; Paul Klonowski; Fengrong Zuo
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-02-18
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2001-09-06
Also published as: SE0100472D0; GB0103914D0; ITTO20010138A0; SE0100472L; ITTO20010138A1; GB2361702A; JP2001286289A; AU2303301A; FR2806738A1; FR2821085A1; US20020107361A1

Abstract

Neue Metalloproteasen mit Thrombospondin-Domäne(n) (MPTS-Proteine) und hiermit verwandte Polypeptide, außerdem Nucleinsäure-Zusammensetzungen, die diese codieren, werden bereitgestellt. Das vorliegende Polypeptid und die vorliegenden Nucleinsäure-Zusammensetzungen können in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, umfassend diagnostische Anwendungen, Anwendung zum Durchmustern von therapeutischen Mitteln und auch therapeutische Anwendungen für viele unterschiedliche Leiden. Außerdem werden Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen bereitgestellt, die mit der Aggrekanase-Aktivität in Zusammenhang stehen, z. B.: Zustände, die durch das Vorliegen von Aggrecan-Spaltprodukten gekennzeichnet sind, wie rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis.

Description

Die Erfindung betrifft das Fachgebiet der Proteasen, insbesondere der Metall- Proteasen mit Thrombospondin-Domänen.

Die Knorpelmatrixstruktur besteht als Trockengewicht des Gewebes aus 70% Collagen und 20 bis 30% Proteoglykanen. Die Proteoglykan-Komponente verleiht den Geweben, die eine Belastung aushalten müssen, eine mechanische Flexibilität und dem Knorpel viskoelastische Eigenschaften. Ihr Verlust führt zu einer raschen Strukturschädigung, wie sie meist bei arthritischen Gelenkerkrankungen und Gelenkverletzungen auftritt.

Aggrekan ist ein wichtiges Proteoglykan des Knorpels. Aggrekan ist ein großes Protein von 210 kDa und hat drei globuläre Domänen: G1, G2 und G3. Die Domänen G1 und G2 des Proteins liegen näher beim Aminoterminus des Proteins, und die zwischen ihnen liegende interglobuläre Domäne enthält proteolytisch empfindliche Stellen. Die Region zwischen G2 und G3 ist stark glykosyliert und wird an Oligosaccharide und Glykosaminoglykane (GAGs) gekoppelt, wodurch das reife Proteoglykan entsteht. Im arthritischen Knorpel lassen sich Kernprotein-Fragmente von 55 kDa nachweisen, von denen man annimmt, dass sie das Ergebnis einer Spaltung des Kernproteins in der G1- und G2-interglobulären Domäne zwischen Asparagin-341 und Phenylalanin-342 sind. Diese Spaltung kann durch viele Matrix- Metalloproteinasen durchgeführt werden, z. B. MMP-1, -2, -3, -7, -8, -9 und -13. Außerdem wurden noch 60-kDa-Aggrekan-Fragmente mit einem -COOH-Terminus von Glutaminsäure nachgewiesen, die auf eine Spaltstelle zwischen Glutaminsäure- 373 und Alanin-374 hinweisen. Matrix-Metalloproteinasen sind nicht in der Lage, an dieser Stelle zu spalten. Die einzigartige Endopeptidase-Aktivität, die für diese Spaltung verantwortlich ist, wurde als "Aggrekanase" bezeichnet.

Die G1-Domäne des Kernproteins bildet einen stabilen ternären Komplex, indem sie an Hyaluronsäure und Bindungsproteine in der Matrix bindet. Jede enzymatische Spaltung in dieser Region destabilisiert die Struktur der Knorpelmatrix, führt zu einem Verlust des wichtigen Proteoglykans Aggrekan und setzt Typ-II- Collagen den Collagenasen aus, wodurch ein Verlust an Knorpel und die anschließende Entstehung einer Gelenkerkrankung ausgelöst wird. Da von einer Vielzahl von anti-arthritischen Arzneistoffen keiner die Aggrekanase als Ziel hat und in der Lage ist, die Spaltung von Aggrekan zu blockieren, spielt die Aggrekanase- Stelle beim proteolytischen Abbau von Aggrekan eine Schlüsselrolle.

Deshalb kann man davon ausgehen, dass die Aggrekanase für Arzneistoffe gegen Arthritis ein wichtiges Angriffsziel darstellt. Aggrekan-Fragmente, die in die Synovialflüssigkeit abgegeben werden, sind die erste Veränderung, die bei der Entstehung einer rheumatoiden Arthritis oder einer Osteoarthritis nachgewiesen werden kann. Die Suche nach dieser Protease wurde intensiv betrieben. Jedoch wollte sich trotz dieses enormen wissenschaftlichen Einsatzes bisher kein Erfolg bei der Identifizierung der menschlichen Aggrekanase einstellen.

Deshalb besteht ein großes Interesse an der Identifizierung einer menschlichen Aggrekanase und außerdem an dem Gen, das diese Aktivität codiert.

Die folgenden Referenzen betreffen dieses Fachgebiet. Die US-Patente 5 872 209 und 5 427 954, sowie WO 99/09000, WO 98/55643, WO 98/51665 und WO 97/18207.

Andere Referenzen umfassen: Abbasdale, "Cloning and characterization of ADAMTS11, an Aggrekanase from the ADAMTS family", J. Biol. Chem. (Aug. 1999) 274: 23443-23450; Arner et al., "Generation and characterization of Aggrekanase. A soluble, cartilage-derived Aggrekan-degrading activity", J. Biol. Chem. (5. März 1999) 274 (10): 6594-6601; Arner et al., "Cytokine-induced cartilage proteoglycan degradation is mediated by Aggrekanase", Osteoarthritis Cartilage (Mai 1998) 6(3): 214-28; Billington et al., "An Aggrekan-degrading activity associated with chondrocyte membranes", Biochem. J. (15. Nov. 1998) 336 (Pt 1): 207-212; Buttner et al., "Membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP) cleaves the recombinant Aggrekan substrate rAgg1 mut at the "Aggrekanase" and the MMP sites. Characterization of MT1-MMP catabolic activities on the interglobular domaine of Aggrekan", Biochem. J. (1. Juli 1998) 333 (Pt 1): 159-165; Flannery et al., "Expression of ADAMTS homologues in articular cartilage", Biochem. Biophys. Res. Commun. (Juli 1999) 260: 318-322; Hurskainen et al., "ADAM-TS5, ADAM-TS6, and ADAM-TS7, novel members of a new family of zinc metalloproteases", J. Biol. Chem. (Sept. 1999) 274: 25555-25563; Hughes et al., "Differential expression of Aggrekanase and matrix metalloproteinase activity in chondrocytes isolated from bovine and porcine articular cartilage", J. Biol. Chem. (13. Nov. 1998) 273 (46): 30576-30582; Ilic et al., "Characterization of Aggrekan retained and lost from the extracellular matrix of articular cartilage. Involvement of carboxyl-terminal processing in the catabolism of Aggrekan", J. Biol. Chem. (10. Juli 1998) 273 (28): 17451-17456; Kuno et al., "ADAMTS-1 is an active metalloproteinase associated with the extracellular matrix", J. Biol. Chem. (Juni 1999) 274: 18821-18826; Kuno et al., "ADAMTS-1 protein anchors at the extracellular matrix through the thrombospondin type I motifs and its spacing region", J. Biol. Chem. (Mai 1998) 273: 13912-13927; Kuno et al., "The exon/intron organization and chromosomal mapping of the mouse ADAMTS-1 gene encoding an ADAM family protein with TSP motifs", Genomics (Dez. 1997) 46: 466-471; Kuno et al., "Molecular cloning of a gene encoding a new type of metalloproteinase-disintegrin family protein with thrombospondin motifs as an inflammation associated gene", J. Biol. Chem. (Jan. 1997) 272: 556-562; Sandy et al., "Chondrocyte-mediated catabolism of Aggrekan: Aggrecanase-dependent cleavage induced by interleukin-1 or retinoic acid can be inhibited by glucosamine", Biochem. J. (1. Okt. 1998) 335 (Pt 1): 59-66; Tang und Hong, "ADAMTS: A novel family of proteases with ADAM protease domain and thrombospondin I repeats", FEBS Lett. (Feb. 1999) 445: 223-225; Tortorella et al., "Purification and cloning of Aggrekanase-1: a member of the ADAMTS family of proteins", Science (Juni 1999) 284: 1664-1666; Vankemmelbeke et al., "Coincubation of bovine synovial of capsular tissue with cartilage generates a soluble "Aggrecanase" activity", Biochem. Biophys. Res. Commun. (24. Feb. 1999) 255 (3): 686-691; und Vasquez et al., "METH-1, a human ortholog of ADAMTS-1 and METH-2 are members of a new family of proteins with angio-inhibitory activity", J. Biol. Chem. (Aug. 1999) 274: 23349-23357.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Metalloproteasen mit Thrombospondin-Domäne(n) (MPTS-Proteine) und Polypeptide, die hiermit verwandt sind, außerdem werden Nucleinsäure-Zusammensetzungen bereitgestellt, die diese codieren. Das vorliegende Polypeptid und die vorliegenden Nucleinsäure- Zusammensetzungen können in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, umfassend diagnostische Anwendungen, Anwendungen zum Durchmustern von therapeutischen Mitteln und außerdem therapeutische Anwendungen für viele unterschiedliche Leiden. Ferner werden Verfahren für die Behandlung von Krankheitszuständen bereitgestellt, die mit einer Aggrekanase-Aktivität in Zusammenhang stehen, z. B. Zustände, die durch das Vorliegen von Aggrekan- Spaltprodukten gekennzeichnet sind, wie rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis.

Im Folgenden werden die Figuren kurz beschrieben:

Fig. 1A zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure, die MPTS-15, ein MPTS- Protein der vorliegenden Erfindung, codiert. Fig. 1B zeigt die Aminosäuresequenz von MPTS-15. In Fig. 1C ist die Aminosäuresequenz des vorliegenden MPTS-15 an der Aminosäuresequenz von ADAMTS-6, einer Sequenz, die in Hurskainen et al., J. Biol. Chem. (Sept. 1999) 274: 25555-25563, beschrieben ist, ausgerichtet.

Fig. 2A zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure, die MPTS-10, ein MPTS- Protein der vorliegenden Erfindung, codiert. Fig. 2B zeigt die Aminosäuresequenz von MPTS-10.

Fig. 3A zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure, die MPTS-19, ein MPTS- Protein der vorliegenden Erfindung, codiert. Fig. 3B zeigt die Aminosäuresequenz von MPTS-19.

Fig. 4A zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure, die MPTS-20, ein MPTS- Protein der vorliegenden Erfindung, codiert. Fig. 4B zeigt die Aminosäuresequenz von MPTS-20.

Neue MPTS-Proteine und hiermit verwandte Polypeptide sowie Nucleinsäure- Zusammensetzungen, die diese codieren, werden bereitgestellt. Insbesondere werden Nucleinsäuremoleküle, bereitgestellt, welche eine Metalloprotease mit Thrombospondin-Domäne(n) (MPTS-Proteine) codieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid codieren, das die unter SEQ ID NO.: 1, 3, 5 oder 7 angegebene Aminosäuresequenz umfasst;
b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO.: 2, 4, 6 oder 8 angegebene Nucleotidsequenz umfasst;
c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid codieren, das mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder am meisten bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität mit der unter SEQ ID NO.: 1, 3, 5 oder 7 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist;
d) Nucleinsäuremolekülen, die eine Sequenzhomologie von mindestens 75%, von mindestens 90%, meist bevorzugt von mindestens 95% mit der unter SEQ ID NO.: 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist;
e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem komplementären Strang, der unter (a), (b), (c) oder (d) genannten Nucleinsäuremolekülen unter stringenten Bedingungen hybridisieren;
f) Nucleinsäuremolekülen, die ein Fragment und/oder Fragmente, die funktionellen Domänen entsprechen, einer Nucleotidsequenz von (a), (b), (c), (d) oder (e) umfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform codieren die obengenannten Nucleinsäuremoleküle ein MPTS-15, MPTS-10, MPTS-19 oder MPTS-20 Protein. Bei den Nucleinsäuremolekülen, welche die Proteine und Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, handelt es sich bevorzugterweise um DNA- Moleküle, welche besonders bevorzugt als cDNA oder genomische DNA vorliegen. Außerdem werden in dieser Erfindung Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt, bei denen es sich um RNA-Moleküle handelt. Die hier vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle stammen bevorzugt aus einem Säuger, aus einer Hefe, aus einem Nematoden, aus Drosophila oder einem Zebrafisch (Danio rerio). Besonders bevorzugt stammt das Nucleinsäuremolekül von einem Primaten, von einem Menschen, von einem Nager, von einer Ratte, von einer Maus, von einem Hund, von einer Katze, von einem Rind, von einem Schaf oder von einem Pferd.

Außerdem werden Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die komplementär zu einem Nucleinsäuremolekül der obengenannten Nukleinsäuremoleküle sind. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesen Nukleinsäuremolekülen um ein Antisense Molekül.

Das vorliegende Polypeptid und/oder die vorliegenden Nucleinsäure- Zusammensetzungen können in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, umfassend Anwendungen in der Forschung, in der Diagnose sowie zum Durchmustern von therapeutischen Mitteln, zur Entdeckung und zur Herstellung. Ferner werden Verfahren für die Behandlung von Krankheitszuständen bereitgestellt, die mit der MPTS-Funktion, umfassend Aggrekanase-Funktion, in Zusammenhang stehen, z. B. Krankheiten, die durch das Vorliegen von Aggrekan- Spaltprodukten gekennzeichnet sind, wie rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis.

Neue Metalloproteasen mit Thrombospondin-Domäne(n) (auch bekannt als MPTS-Proteine, ADAMTS-Proteine oder Aggrekanase-Proteine) und außerdem hiermit verwandte Polypeptid-Zusammensetzungen werden bereitgestellt. Der hier verwendete Begriff Polypeptid-Zusammensetzung bezieht sich sowohl auf das Protein der vollen Länge als auch auf Teile oder Fragmente davon. Auch in diesem Begriff enthalten sind Variationen des in der Natur vorkommenden menschlichen Proteins, wobei solche Variationen zu dem in der Natur vorkommenden Protein homolog oder im Wesentlichen ähnlich sind, wie nachstehend ausführlicher beschrieben. In der folgenden Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "MPTS" nicht nur die hier beschriebenen spezifischen menschlichen MPTS- Proteine betreffen (d. h., MPTS-10; MPTS-15; MPTS-19 und MPTS-20), sondern auch Homologe davon, die in Nicht-Mensch-Arten, z. B. Mäuse-, Ratten- und anderen Säugerarten, exprimiert werden.

Spezifische (menschliche) MPTS-Proteine von Interesse sind MPTS-15, MPTS-10, MPTS-19 und MPTS-20. MPTS-15 weist eine Aminosäuresequenz auf, die in Fig. 1 B dargestellt ist und als SEQ ID NO.: 01 identifiziert wurde. MPTS-10 weist eine Aminosäuresequenz auf, die in Fig. 2B dargestellt ist und als SEQ ID NO.: 03 identifiziert wurde. MPTS-19 weist eine Aminosäuresequenz auf, die in Fig. 3B dargestellt ist und als SEQ ID NO.: 05 identifiziert wurde. MPTS-20 weist eine Aminosäuresequenz auf, die in Fig. 4B dargestellt ist und als SEQ ID NO.: 07 identifiziert wurde. Die vorliegenden MPTS-Proteine haben aufgrund ihrer Aminosäuresequenz ein Molekulargewicht von mindestens etwa 90 kDa, wobei das auf der Aminosäuresequenz beruhende Molekulargewicht in bestimmten Ausführungsformen wesentlich höher sein kann. Das tatsächliche Molekulargewicht der vorliegenden MPTS-Proteine kann aufgrund von Glykosylierung und/oder anderen posttranslationalen Modifikationen variieren.

Außerdem werden durch die vorliegende Erfindung MPTS-Polypeptid- Zusammensetzungen bereitgestellt. Der hier verwendete Begriff Polypeptid- Zusammensetzung bezieht sich sowohl auf die Proteine der vollen Länge als auch auf Teile oder Fragmente davon. Auch enthalten in diesem Begriff sind Variationen der in der Natur vorkommenden Proteine, wobei solche Variationen zu dem in der Natur vorkommenden Protein homolog oder im Wesentlichen ähnlich sind, wobei das in der Natur vorkommende Protein das menschliche Protein, das Maus-Protein oder das Protein von einer anderen Art sein kann, die in der Natur ein MPTS-Protein exprimiert, normalerweise einer Säugerart. Ein möglicher Kandidat für ein homologes Protein ist im Wesentlichen ähnlich zu einem MPTS-Protein der vorliegenden Erfindung und ist deshalb ein MPTS-Protein der vorliegenden Erfindung, wenn der Proteinkandidat eine Sequenz besitzt, die mindestens etwa 35% und meist mindestens etwa 45% und noch öfter mindestens etwa 60% Sequenz-Identität mit einem MPTS-Protein aufweist, wobei dies unter Verwendung des "Cluster-Algorithmus" MegAlign, DNAstar (1998), bestimmt wurde, wie in D. G. Higgins und P. M. Sharp, "Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer", (1989), CABIOS, 5: 151-153, beschrieben. (Die verwendeten Parameter sind ktuple 1, gpa penalty 3, window, 5 und diagonals saved 5). In der folgenden Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "MPTS-Protein" nicht nur die menschlichen MPTS-Proteine, sondern auch Homologe davon bezeichnen, die in Nicht-Mensch-Arten, z. B. in Mäuse-, Ratten- und anderen Säugerarten, exprimiert werden.

Außerdem werden MPTS-Proteine bereitgestellt, die im Wesentlichen mit den beschriebenen Proteinen identisch sind, wobei mit "im Wesentlichen identisch" gemeint ist, dass das Protein eine Aminosäuresequenz-Identität zu der Sequenz von einem der beschriebenen Proteine von mindestens etwa 60%, meist mindestens etwa 65% und noch öfter mindestens etwa 70% aufweist. In vielen bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Sequenz-Identität mindestens etwa 90%, meist mindestens etwa 95% und noch öfter mindestens etwa 99% über die gesamte Länge des Proteins.

In vielen Ausführungsformen sind die Proteine der vorliegenden Erfindung Enzyme, insbesondere Proteinasen und besonders Metalloproteinasen. Die vorliegenden Proteine dieser Ausführungsform sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aggrekanase-Aktivität aufweisen. Deshalb sind die vorliegenden Proteine in der Lage, Aggrekan in einer interglobulären Domäne, insbesondere zwischen den G1- und G2-Domänen und besonders an der Glu³⁷³-Ala³⁷⁴-Bindung des menschlichen Aggrekan, zu spalten, wodurch ein Spaltprodukt produziert wird, das eine N-terminale Sequenz von ARGSVIL aufweist.

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Proteinen werden auch Homologe oder Proteine (oder Fragmente davon) von anderen Arten, d. h., anderen Tier- oder Pflanzenarten, bereitgestellt, wobei solche Homologe oder Proteine von vielen unterschiedlichen Typen von Arten stammen können, normalerweise von Säugern, z. B. Nagern, wie Mäusen, Ratten; Haustieren, z. B. Pferden, Kühen, Hunden, Katzen; sowie vom Menschen. Mit Homolog ist ein Protein gemeint, das eine Aminosäuresequenz-Identität von mindestens etwa 35%, meist von mindestens etwa 40% und noch öfter von mindestens etwa 60% mit einem der spezifischen menschlichen MPTS-Proteine, wie vorstehend angegeben, aufweist (d. h., mit einem Protein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO.: 01, 03, 05 oder 07 aufweist), wobei die Sequenz-Identität wie vorstehend beschrieben bestimmt wird.

Die Proteine der vorliegenden Erfindung liegen in einer nicht in der Natur vorkommenden Umgebung vor, z. B. werden sie aus ihrer in der Natur vorkommenden Umgebung abgetrennt. In bestimmten Ausführungsformen liegen die vorliegenden Proteine in einer Zusammensetzung vor, in der das vorliegende Protein im Vergleich zu seiner in der Natur vorkommenden Umgebung angereichert ist. Beispielsweise wird ein gereinigtes Protein bereitgestellt, wobei mit "gereinigt" gemeint ist, dass das Protein in einer Zusammensetzung vorliegt, die "im Wesentlichen frei" ist von Nicht-MPTS-Proteinen, wobei mit im Wesentlichen frei gemeint ist, dass weniger als 90%, meist weniger als 60% und noch öfter weniger als 50% der Zusammensetzung aus Nicht-MPTS-Proteinen besteht. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können auch als ein Isolat vorliegen, was bedeutet, dass das Protein im Wesentlichen frei ist von anderen Proteinen und anderen in der Natur vorkommenden biologischen Molekülen, wie Oligosacchariden, Polynucleotiden und Fragmenten davon, sowie dergleichen, wobei der Begriff "im Wesentlichen frei" in diesem Fall bedeutet, dass weniger als 70%, meist weniger als 60% und noch öfter weniger als 50% der das isolierte Protein enthaltenden Zusammensetzung ein anderes, in der Natur vorkommendes biologisches Molekül ist. In bestimmten Ausführungsformen liegen die Proteine in im Wesentlichen reiner Form vor, wobei mit "im Wesentlichen reiner Form" gemeint ist, dass sie mindestens zu 95%, meist mindestens zu 97% und noch öfter mindestens zu 99% rein sind.

Zusätzlich zu den in der Natur vorkommenden Proteinen werden auch Polypeptide bereitgestellt, die sich von den in der Natur vorkommenden Proteinen unterscheiden, z. B. MPTS-Polypeptide. Mit MPTS-Polypeptid ist eine Aminosäuresequenz gemeint, die durch ein offenes Leseraster (ORF) des MPTS- codierenden Gens codiert wird, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, umfassend das Protein der vollen Länge und Fragmente davon, insbesondere biologisch aktive Fragmente und/oder Fragmente, die funktionellen Domänen entsprechen, z. B. Protease-Domäne, Thrombospondin-Domäne und dergleichen; und umfassend Fusionsprodukte der vorliegenden Polypeptide mit anderen Proteinen oder Teilen davon. Fragmente von Interesse zeigen typischerweise eine Länge von mindestens etwa 10 Aminosäuren, normalerweise eine Länge von mindestens etwa 50 Aminosäuren und können eine Länge von 300 Aminosäuren oder mehr aufweisen, wobei sie jedoch üblicherweise eine Länge von etwa 1000 Aminosäuren nicht überschreiten, wobei das Fragment eine Strecke von Aminosäuren aufweist, die mit dem vorliegenden Proteinen in mindestens etwa 10 Aminosäuren und meist mindestens etwa 15 Aminosäuren und in vielen Ausführungsformen in einer Länge von mindestens etwa 50 Aminosäuren identisch ist. Wenn das Fragment ein MPTS-15-Fragment ist, umfasst es vorzugsweise mindestens einen wesentlichen Teil der Protease-Domäne des Wildtyp-Proteins, wobei eine wesentliche Menge mindestens 50%, meist mindestens 60% und noch öfter mindestens 70% der Sequenz dieser Domäne des MPTS-15-Proteins ist. Beispielsweise umfasst das MPTS-15-Fragment im Allgemeinen eine Sequenz, die beim Ausrichten mit der Sequenz der Reste aus der Protease-Domäne der Wildtyp- Sequenz eine Identität mit der ausgerichteten Region der Wildtyp-Sequenz dieser Domäne von mindestens etwa 50%, meist von mindestens etwa 60% und noch öfter von mindestens etwa 70% aufweist, wobei in vielen Ausführungsformen die prozentuale Identität viel höher sein kann, z. B. 75, 80, 85, 90 oder 95% oder höher, z. B. 99%.

Die vorliegenden Proteine und Polypeptide können aus natürlich vorkommenden Quellen erhalten oder synthetisch produziert werden. So können die Proteine aus biologischen Quellen hergeleitet werden, die die Proteine exprimieren, z. B. Synoviocyten, Chondrocyten, Knorpel und dergleichen. Die vorliegenden Proteine können auch aus synthetischen Proben hergeleitet werden, z. B. durch Expression eines rekombinanten Gens, welches das Protein von Interesse codiert, in einem geeigneten Wirt, wie nachstehend ausführlicher beschrieben. Beliebige herkömmliche Verfahren zur Reinigung von Proteinen können eingesetzt werden, wobei geeignete Methoden zur Proteinreinigung im "Guide to Protein Purification" (Deuthser, Hrsg.,), (Academic Press, 1990), beschrieben werden. Beispielsweise kann ein Lysat aus der ursprünglichen Quelle, z. B. Chondrocyten oder dem Expressionswirt, hergestellt und sodann unter Verwendung von HPLC, Ausschluss- Chromatographie, Gel-Elektrophorese, Affinitäts-Chromatographie und dergleichen gereinigt werden.

Außerdem werden Nucleinsäure-Zusammensetzungen bereitgestellt, die MPTS-Proteine oder Fragmente davon sowie die MTPS-Homologe der vorliegenden Erfindung codieren. Die bereitgestellten Polypeptide sind vorzugsweise von den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen codiert oder werden mit einem der weiter unten beschriebenen Verfahren hergestellt. Mit Nucleinsäure- Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung gemeint, die eine DNA-Sequenz mit einem offenen Leseraster umfasst, die ein MPTS-Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, d. h. ein mpts-Gen, und sie ist unter geeigneten Bedingungen in der Lage, als MPTS exprimiert zu werden. Außerdem sind in diesem Begriff Nucleinsäuren enthalten, die homolog oder im Wesentlichen ähnlich zu den Nucleinsäuren sind, die MPTS-Proteine codieren, oder die damit identisch sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung Gene bereit, welche die menschlichen MPTS- Proteine der vorliegenden Erfindung und Homologe davon codieren. Das menschliche MPTS15-Gen ist in Fig. 1A dargestellt, wobei die in Fig. 1A gezeigte Sequenz als SEQ ID NO.: 02, nachstehend, identifiziert wurde. Das menschliche MPTS10-Gen ist in Fig. 2A dargestellt, wobei die in Fig. 2A gezeigte Sequenz als SEQ ID NO.: 04, nachstehend, identifiziert wurde. Das menschliche MPTS19-Gen ist in Fig. 3A dargestellt, wobei die in Fig. 3A gezeigte Sequenz als SEQ ID NO.: 06, nachstehend, identifiziert wurde. Das menschliche MPTS20-Gen ist in Fig. 4A dargestellt, wobei die in Fig. 4A gezeigte Sequenz als SEQ ID NO.: 08, nachstehend, identifiziert wurde.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, deren komplementärer Strang mit einem der obenbeschriebenen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle hybridisiert und die ein Protein mit den obengenannten Eigenschaften codieren.

Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben sind. Dabei bedeutet "stringente Bedingungen", daß eine Hybridisierung nur erfolgt, wenn eine Sequenzidentität von mindestens 90%, vorzugsweise von mindestens 95% und besonders bevorzugt von mindestens 97% über die gesamte Länge vorliegt.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jedem beliebigen tierischen Organismus stam men, der ein derartiges Protein exprimiert. Vorzugsweise sind es Moleküle, die entsprechende Proteine aus höheren tierischen Organismen codieren, bevorzugt aus Vertebraten, besonders bevorzugt aus Säugern und insbesondere aus Maus, Hund, Katze, Rind, Schaf, Pferd oder Mensch.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) oder durch Amplifikation mittels PCR.

Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter SEQ ID NO.: 2, 4, 6, oder 8 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, sollte eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erfolgen.

Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen insbesondere auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein mit den hierin beschriebenen Eigenschaften codieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen.

Die homologen Gene können von einer beliebigen Art stammen, z. B. einer Primaten-Art, insbesondere Mensch; von Nagern, z. B. Ratten und Mäusen, Hunden, Katzen, Rindern, Schafen, Pferden, Hefen, Nematoden usw. Zwischen Säugerarten, z. B. Mensch und Maus, weisen Homologe wesentliche Sequenz- Ähnlichkeiten auf, z. B. eine Sequenz-Identität zwischen Nucleotidsequenzen von mindestens 75%, meist von mindestens 90%, noch öfter von mindestens 95%. Die Sequenz-Ähnlichkeit wird mit Bezug auf eine Referenzsequenz berechnet, die eine Teilmenge einer größeren Sequenz sein kann, z. B. ein konserviertes Motiv, eine codierende Region, eine flankierende Region usw. Eine Referenzsequenz ist meist mindestens etwa 18 Nucleotide lang, noch öfter ist sie mindestens etwa 30 Nucleotide lang, und sie kann sich bis über die vollständigen Sequenz erstrecken, die verglichen wird. Algorithmen für die Sequenzanalyse sind dem Fachmann bekannt, z. B. BLAST, wie in Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-410, beschrieben (unter Verwendung von vorgegebenen Einstellungen, d. h. Parameter w = 4 und T = 17). Die hier bereitgestellten Sequenzen sind beim Suchen in Datenbanken essentiell für das Erkennen von zu MTPS, einschließlich Aggrekanase, verwandten und homologen Proteinen und der sie codierenden Nucleinsäuren. Von besonderem Interesse in bestimmten Ausführungsformen sind Nucleinsäuren mit im Wesentlichen der gleichen Länge wie die als SEQ ID NO.: 02, 04, 06 und 08 identifizierten Nucleinsäuren, und sie weisen eine Sequenz-Identität mit einer dieser Sequenzen von mindestens etwa 90%, meist von mindestens etwa 95% und noch öfter von mindestens etwa 99% über die gesamte Länge der Nucleinsäure auf.

Nucleinsäuren, welche die Proteine und Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, können cDNA oder genomische DNA oder ein Fragment davon sein. Der Begriff "MPTS-Gen" soll das offene Leseraster bedeuten, das spezifische MPTS-Proteine und Polypeptide codiert, und Introns sowie benachbarte 5'- und 3'- nichtcodierende Nucleotidsequenzen, die an der Regulation der Expression beteiligt sind, bis zu etwa 20 kb jenseits der codierenden Region, jedoch möglicherweise noch weiter in jeder Richtung. Das Gen kann in einen Vektor eingeführt werden, der für eine extrachromosomale Erhaltung oder für eine Integration in ein Wirtsgenom geeignet ist.

Der hier verwendete Begriff "cDNA" soll alle Nucleinsäuren umfassen, die die Anordnung von Sequenzelementen aufweisen, die in natürlichen reifen mRNA- Spezies zu finden sind, wobei Sequenzelemente Exons und 5'- und 3'-nicht- codierende Regionen sind. Normalerweise haben mRNA-Spezies angrenzende Exons, wobei die dazwischen liegenden Introns, sofern vorhanden, durch Kern- RNA-Spleißen entfernt werden, so dass ein kontinuierliches offenes Leseraster entsteht, das ein MPTS-Protein codiert.

Eine genomische Sequenz von Interesse umfasst die Nucleinsäure, die zwischen dem Start-Codon und dem Stopp-Codon vorliegt, wie in den aufgezählten Sequenzen definiert, umfassend alle Introns, die normalerweise in einem nativen Chromosom zu finden sind. Sie kann ferner 5'- und 3'-untranslatierte Regionen umfassen, die in der reifen mRNA vorliegen. Außerdem kann sie spezifische transkriptionale und translationale Regulationssequenzen, wie Promotoren, Enhancer usw., enthalten, einschließlich etwa 1 kb, möglicherweise mehr, einer flankierenden genomischen DNA am 5'- oder am 3'-Ende der transkribierten Region. Die genomische DNA kann als ein Fragment von 100 kbp oder kleiner isoliert werden, wobei im Wesentlichen keine flankierende chromosomale Sequenz vorliegt. Die genomische DNA, die die codierende Region entweder 3' oder 5' flankiert, oder innere regulatorische Sequenzen, wie sie manchmal in Introns zu finden sind, enthalten Sequenzen, die für die richtige gewebe- und stadiumspezifische Expression erforderlich sind.

Die Nucleinsäuren-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können das gesamte vorliegende MPTS-Protein oder einen Teil davon codieren. Doppel- oder einzelsträngige Fragmente können aus der DNA-Sequenz durch chemische Synthese von Oligonucleotiden gemäß herkömmlichen Verfahren durch Restriktionsenzym-Spaltung, durch PCR-Amplifikation usw. erhalten werden. Meistens weisen die DNA-Fragmente mindestens 15 Nucleotide auf, üblicherweise mindestens 18 oder 25 Nulceotide, und sie können aus mindestens etwa 50 Nucleotide bestehen.

Die vorliegenden Gene werden isoliert und im Wesentlichen in reiner Form, im Allgemeinen nicht als ein intaktes Chromosom, erhalten. Üblicherweise ist die erhaltene DNA im Wesentlichen frei von anderen Nucleinsäuresequenzen, die keine MPTS-Gensequenz oder kein Fragment davon umfassen, wobei sie im Allgemeinen zu mindestens etwa 50%, meist zu mindestens etwa 90% rein ist, und sie ist typischerweise "rekombinant", d. h., sie ist von einem oder mehreren Nucleotiden flankiert, mit dem/denen sie normalerweise auf einem in der Natur vorkommenden Chromosom nicht assoziiert ist.

Zusätzlich zu der Vielzahl von Anwendungen, die in den folgenden Abschnitten ausführlicher beschrieben werden, können die vorliegenden Nucleinsäure-Zusammensetzungen bei der Herstellung von allen oder einem Teil der MPTS-Polypeptide, wie vorstehend beschrieben, eingesetzt werden. Das bereitgestellte Polynucleotid (z. B. ein Polynucleotid mit einer Sequenz von SEQ ID NO.: 02, 04, 06 oder 08), die entsprechende cDNA oder das Gen der vollen Länge wird verwendet, um ein partielles oder vollständiges Genprodukt zu exprimieren. Konstrukte von Polynucleotiden mit einer Sequenz von SEQ ID NO.: 02, 04, 06 oder 08 können synthetisch erzeugt werden. Als Alternative wird ein einstufiger Zusammenbau eines Gens und ganzen Plasmids aus einer großen Anzahl von Oligodesoxyribonucleotiden wie z. B. von Stemmer et al., Gene (Amsterdam (1995) 164 (1): 49-53, beschrieben. Bei diesem Verfahren wird eine Assembly-PCR beschrieben (die Synthese von langen DNA-Sequenzen aus einer großen Anzahl von Oligodesoxyribonucleotiden (Oligos)). Das Verfahren wurde vom DNA- "Shuffling" (Stemmer, Nature (1994) 370: 389-391) hergeleitet und beruht nicht auf DNA-Ligase, sondern auf DNA-Polymerase, wodurch während des Assemblyprozesses immer längere DNA-Fragmente hergestellt werden. Geeignete Polynucleotid-Konstrukte werden durch herkömmliche DNA- Rekombinationstechniken, wie z. B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., (1989), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben, sowie unter Beachtung der herkömmlichen Bestimmungen, die in "United States Dep. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research" zusammengestellt sind, gereinigt.

Polynucleotid-Moleküle, die eine hier bereitgestellte Polynucleotid-Sequenz umfassen, werden vermehrt, indem das Molekül in einen Vektor eingebaut wird. Virale oder nicht-virale Vektoren, einschließlich Plasmide, werden verwendet. Die Auswahl des Plasmids hängt vom Zelltyp, in dem die Vermehrung stattfinden soll, und vom Zweck der Vermehrung ab. Bestimmte Vektoren können fürs Amplifizieren und Herstellen von großen Mengen der gewünschten DNA-Sequenz verwendet werden. Andere Vektoren sind für die Expression in Zellen in Kultur geeignet.

Wieder andere Vektoren können für die Übertragung und Expression in Zellen in einem ganzen Lebewesen oder einem Individuum eingesetzt werden. Der Fachmann kann nach dem Stand der Technik einen geeigneten Vektor auswählen. Eine Vielzahl solcher Vektoren sind im Handel erhältlich. Das partielle Polynucleotid oder das Polynucleotid der vollen Länge wird in einen Vektor eingefügt, indem typischerweise eine Verknüpfung durch DNA-Ligase an einer gespaltenen Restriktionsenzym-Stelle im Vektor erfolgt. Die gewünschte Nucleotidsequenz kann aber auch durch homologe Rekombination in vivo eingefügt werden. Typischerweise wird dies erreicht, indem Regionen, die zu dem Vektor homolog sind, an den Flanken der gewünschten Nucleotidsequenz angefügt werden. Homologe Regionen werden z. B. durch eine Ligierung von Oligonucleotiden oder durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Primern angehängt, die sowohl die homologe Region als auch einen Teil der gewünschten Nucleotidsequenz umfassen.

Für die Expression kann eine Expressionskassette oder ein Expressionssystem verwendet werden. Insbesondere wird hier eine erfindungsgemäße Expressionskassette bereitgestellt, welche eine transkriptionale Inititationsregion, eine Nucleotidsequenz unter der transkriptionalen Regulation der transkriptionalen Initiationsregion und eine, in einem Expressionswirt funktionelle, transkriptionale Terminationsregion umfasst. Das durch ein erfindungsgemäßes Polynucleotid codierte Genprodukt wird in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert, umfassend z. B. Bakterien-, Hefe-, Insekten-, Amphibien- und Säugersysteme. Außerdem werden Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen MPTS-Proteine bereitgestellt, umfassend das Züchten der bereitgestellten Wirtszellen und Isolierung des Proteins. Die hier bereitgestellten Vektoren enthalten ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül und/oder die weiter oben beschriebene erfindungsgemäße Expressionskassette. Vorzugsweise ist bei den bereitgestellten Vektoren das Nucleinsäuremolekül mit regulatorischen Elementen operativ verknüpft, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten. Geeignete Vektoren und Wirtszellen werden im US-Patent Nr. 5 654 173 beschrieben. Im Expressionsvektor wird ein MPTS-codierendes Polynucleotid, z. B. wie in SEQ ID NO.: 02, 04, 06 oder 08 angegeben, mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft, die für die gewünschten Expressionseigenschaften geeignet ist. Hierbei können Promotoren (angehängt entweder am 5'-Ende des Sense-Strangs oder am 3'-Ende des Antisense-Strangs), Enhancer, Terminatoren, Operatoren, Repressoren und Induktoren enthalten sein. Die Promotoren können reguliert oder konstitutiv sein. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, bedingt-aktive Promotoren, z. B. als gewebespezifische oder entwicklungsstadiumspezifische Promotoren, zu verwenden. Diese werden mit der gewünschten Nucleotidsequenz verknüpft, wobei die vorstehend für die Verknüpfung mit Vektoren beschriebenen Techniken verwendet werden. Jedes, dem Fachmann bekanntes Verfahren nach dem Stand der Technik kann verwendet werden. Mit anderen Worten, der Expressionsvektor stellt eine transkriptionale und translationale Initiationsregion, die induzierbar oder konstitutiv sein kann, wobei die codierende Region unter der transkriptionalen Kontrolle der transkriptionalen Initiationsregion funktionell verknüpft ist, sowie eine transkriptionale und translationale Terminationsregion bereit. Diese Kontrollregionen können zu dem entsprechenden MPTS-Gen nativ sein, oder sie können einen exogenen Ursprung haben.

Expressionsvektoren weisen im Allgemeinen geeignete Restriktionsstellen auf, die in der Nähe der Promotorsequenz liegen, so dass die Nucleinsäuresequenzen, die heterologe Proteine codieren, eingefügt werden können. Ein selektierbarer Marker, der in dem Expressionswirt eine bestimmte Funktion zeigt, kann vorliegen. Expressionsvektoren können für die Produktion von Fusionsproteinen eingesetzt werden, wobei das exogene Fusionspeptid noch eine zusätzliche Funktionalität, d. h. eine gesteigerte Proteinsynthese, Stabilität, Reaktivität mit definierten Antiseren, einen Enzymmarker, z. B. β-Galactosidase, usw., bereitstellt.

Expressionskassetten können hergestellt werden, die eine Transkriptions- Initiationsregion, das Gen oder ein Fragment davon und eine transkriptionale Terminationsregion umfassen. Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Sequenzen, die eine Expression von funktionellen Epitopen oder Domänen erlauben, üblicherweise mit einer Länge von mindestens etwa acht Aminosäuren, meist mit einer Länge von mindestens etwa 15 bis etwa 25 Aminosäuren und bis zum vollständigen offenen Leseraster des Gens. Nach Einführung der DNA können die Zellen, die das Konstrukt enthalten, mit Hilfe eines selektierbaren Markers selektiert werden, sodann können die Zellen expandiert und anschließend für die Expression verwendet werden.

Die MPTS-Proteine und Polypeptide können in Prokaryonten oder Eukaryonten in herkömmlicher Art und Weise, abhängig vom Zweck der Expression, exprimiert werden. Für die Massenproduktion des Proteins können als Expressions wirtszellen ein einzelliger Organismus, z. B. E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Insektenzellen in Kombination mit Baculovirus-Vektoren oder Zellen eines höheren Organismus, z. B. von Vertebraten, insbesondere von Säugern, z. B. COS 7-Zellen, HEK 293, CHO, Xenopus-Eizellen usw., verwendet werden. In einigen Fällen ist es wünschenswert, das Gen in eukaryontischen Zellen zu exprimieren, wo das exprimierte Protein von der nativen Faltung und posttranslationalen Modifikationen profitieren kann. Kleine Peptide können auch im Laboratorium synthetisiert werden. Polypeptide, die Teile der vollständigen Proteinsequenz sind, können zum Identifizieren und zum Untersuchen von Teilen des Proteins, die für die Funktion wichtig sind, eingesetzt werden.

Spezifische Expressionssysteme von Interesse umfassen von Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugerzellen stammenden Expressionssysteme.

Repräsentative Systeme aus jeder dieser Kategorien sind nachstehend angegeben:
Bakterien: Expressionssysteme in Bakterien umfassen die Systeme, die in Chang et al., Nature (1978) 275: 615; Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544; Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057; EP 0 036 776; US-Patent Nr. 4 551 433; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80: 21-25; und Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269, beschrieben werden.
Hefen: Expressionssysteme in Hefen umfassen die Systeme, die in Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75: 1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz et. al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202: 302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; US-Patente Nr. 4 837 148 und 4 929 555; Beach und Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284-289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205-221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81: 1470-1474; Kelly und Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479; EP 0 244 234; und WO 91/00357 beschrieben werden.
Insektenzellen: Die Expression von heterologen Genen in Insekten wird durchgeführt, wie in US-Patent Nr. 4 745 051; Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", in: The Molecular Biology of Baculoviruses (1986), (W. Doerfler, Hrsg.); EP 0 127 839; EP 0 155 476; und Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765-776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177; Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409; Maeda et al., Nature (1985) 315: 592-594; Lebacq erheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1985) 82: 8844; Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273; und Martin et al., DNA (1988) 7: 99, beschrieben. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten und entsprechende, hierfür empfängliche Insekten-Wirtszellen aus Wirten werden in Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47-55; Miller et al., Genetic Engineering (1986) 8: 277-279; und Maeda et al., Nature (1985) 315: 592-594, beschrieben.
Säugerzellen: Die Expression in Säugerzellen wird durchgeführt, wie in Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761; Gorman et al., Proc. Nah. Acad. Sci. (USA) (1982), 79: 6777; Boshart et al., Cell (1985) 41: 521; und US-Patent Nr. 4 399 216 beschrieben. Andere Merkmale der Säuger-Expression werden genutzt, wie in Ham und Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44; Barnes und Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255; in den US-Patenten Nr. 4 767 704, 4 765 866, 4 927 762, 4 560 655, WO 90/103430, WO 87/00195 und US RE 30 985 beschrieben.

Es werden Wirtszellen wie oben beschrieben bereitgestellt die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen, den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder den erfindungsgemäßen Vektoren transformiert sind oder von einer solchen Zelle abstammen.

Wenn die vorstehenden Wirtszellen oder andere geeignete Wirtszellen oder Organismen zum Replizieren und/oder Exprimieren der Polynucleotide oder Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, liegt die resultierende replizierte Nucleinsäure, RNA, das resultierende exprimierte Protein oder Polypeptid als ein Produkt der Wirtszelle oder des Wirtsorganismus im Rahmen der Erfindung. Das Produkt wird durch ein beliebiges bekanntes Verfahren nach dem Stand der Technik gewonnen.

Die Wirtszelle der Erfindung umfasst auch ES-Zellen, wie weiter unten beschrieben.

Sobald das einem ausgewählten Polynucleotid entsprechende Gen identifiziert wurde, kann seine Expression in der Zelle, in der das Gen nativ ist, reguliert werden. Beispielsweise kann ein endogenes Gen einer Zelle durch eine exogene regulatorische Sequenz gesteuert werden, wie in US-Patent Nr. 5 641 670 beschrieben.

Das vorliegende Polypeptid und die vorliegenden Nucleinsäure-Zusammen setzungen können in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen eingesetzt werden, umfassend allgemeine Anwendungen, diagnostische Anwendungen sowie Anwendungen zum Absuchen eines Arzneimittels, zur Entdeckung und zur Herstellung, sowie in therapeutischen Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Verwendung.

Die vorliegenden Nucleinsäure-Zusammensetzungen können in verschiedenen allgemeinen Anwendungen eingesetzt werden. Allgemeine Anwendungen von Interesse umfassen: die Identifizierung von MPTS-Homologen; als Ursprung neuer Promotorelemente; die Identifizierung von MPTS-Expression regulatorischen Faktoren; als Sonden und Primer bei Hybridisierungsanwendungen, z. B. PCR; die Identifizierung von Expressionsmustern in biologischen Proben; die Herstellung von Zell- oder Tiermodellen für die MPTS-Funktion; die Herstellung von in vitro-Modellen für die MPTS-Funktion usw..

Homologe der vorliegenden Gene können durch verschiedene Verfahren identifiziert werden. Ein Fragment der bereitgestellten cDNA kann als Hybridisierungssonde bei einer cDNA-Genbank von dem Zielorganismus von Interesse eingesetzt werden, wobei Bedingungen mit niedriger Stringenz verwendet werden. Die Sonde kann ein großes Fragment oder ein oder mehrere kurze degenerierte Primer sein. Nucleinsäuren, die eine Ähnlichkeit in der Sequenz aufweisen, werden durch Hybridisierung unter Bedingungen mit niedriger Stringenz, z. B. bei 50°C und 6 × SSC (0,9 M Natriumchlorid/0,09 M Natriumcitrat), nachgewiesen und bleiben gebunden, wenn sie einem Waschgang bei 55°C in 1 × SSC (0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat) unterzogen werden. Die Sequenz-Identität kann durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, z. B. bei 50°C oder höher und 0,1 × SSC (15 mM Natriumchlorid/01,5 mM Natriumcitrat), bestimmt werden. Nucleinsäuren, die eine Region aufweisen, die mit den bereitgestellten Sequenzen im Wesentlichen identisch ist, z. B. Allel-Varianten, genetisch veränderte Versionen des Gens usw., binden an die bereitgestellten Sequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Durch Verwendung von Sonden, insbesondere markierten Sonden von DNA-Sequenzen, kann man homologe oder verwandte Gene isolieren.

Die Sequenz der 5'-flankierenden Region kann für Promotor-Elemente, umfassend Enhancer-Bindungsstellen, genutzt werden, die eine entwicklungsabhängige Regulation in Geweben ermöglichen, in denen das vorliegende MPTS-Gen exprimiert wird. Die gewebespezifische Expression kann verwendet werden, um das Expressionsmuster zu bestimmen und Promotoren bereitzustellen, die das native Expressionsmuster nachahmen. In der Natur vorkommende Polymorphismen in der Promotorregion können genutzt werden, um natürliche Variationen in der Expression zu bestimmen, insbesondere solche, die möglicherweise mit einer Krankheit in Zusammenhang stehen könnten.

Als Alternative können Mutationen in die Promotorregion eingeführt werden, wodurch die Wirkung einer veränderten Expression in experimentell definierten Systemen bestimmt werden kann. Verfahren für die Identifizierung von spezifischen DNA-Motiven, die an der Bindung von transkriptionalen Faktoren beteiligt sind, sind dem Fachmann bekannt, z. B. die Sequenz-Ähnlichkeit zu bekannten Bindungsmotiven, Untersuchungen zur Verzögerung in Gelen usw. Beispiele hierfür finden sich in Blackwell et al., Mol. Med. (1995) 1: 194-205; Mortlock et al., Genome Res. (1996) 6: 327-333; und Joulin und Richard-Foy, Eur. J. Biochem. (1995) 232: 620-626.

Die regulatorischen Sequenzen können verwendet werden, um cis-wirkende Sequenzen zu identifizieren, die für die transkriptionale oder translationale Regulation der MPTS-Gen-Expression erforderlich sind, insbesondere in unterschiedlichen Geweben oder Entwicklungsstadien, und um cis-wirkende Sequenzen und trans-wirkende Faktoren zu identifizieren, die die MPTS-Gen- Expression regulieren oder vermitteln. Solche Transkriptions- oder Translations- Kontrollregionen können mit einem MPTS-Gen funktionell verknüpft werden, um die Expression von Wildtyp- oder veränderten MPTS-Proteinen oder anderen Proteinen von Interesse in gezüchteten Zellen oder in embryonalen, fetalen oder erwachsenen Geweben sowie für eine Gentherapie zu fördern.

Kleine DNA-Fragmente können als Primer für eine PCR, als Sonden zum Durchmustern durch Hybridisierung usw. eingesetzt werden. Größere DNA- Fragmente, d. h. größer als 100 Nucleotide, können zur Herstellung des codierten Polypeptids, wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben, verwendet werden. Für die Verwendung in geometrischen Amplifikationsreaktionen, z. B. einer geometrischen PCR, wird ein Primerpaar eingesetzt. Die genaue Zusammensetzung der Primersequenzen ist für die Erfindung nicht entscheidend, wobei jedoch bei den meisten Anwendungen die Primer mit der vorliegenden Sequenz unter stringenten Bedingungen, wie dem Fachmann bekannt, hybridisieren. Vorzugsweise wird ein Primerpaar ausgewählt, das ein Amplifikationsprodukt von mindestens etwa 50 Nucleotiden, bevorzugt von mindestens etwa 100 Nucleotiden, erzeugt. Algorithmen für die Selektion von Primersequenzen sind allgemein bekannt und in handelsüblichen Software-Paketen verfügbar. Amplifikationsprimer hybridisieren mit komplementären DNA-Strängen und "primen" aufeinander zu.

Die DNA kann auch verwendet werden, um die Expression des Gens in einer biologischen Probe nachzuweisen. Die Verfahren, mit denen man Zellen auf das Vorliegen bestimmter Nucleotidsequenzen, wie genomischer DNA oder RNA, testen kann, sind in der Literatur gut beschrieben. Kurz gesagt wird die DNA oder mRNA aus einer Zellprobe isoliert. Die mRNA kann durch RT-PCR amplifiziert werden, wobei unter Verwendung der reversen Transkriptase ein komplementärer DNA- Strang hergestellt wird und anschließend eine Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion folgt, bei der Primer eingesetzt werden, die für die vorliegenden DNA-Sequenzen spezifisch sind. Als Alternative wird die mRNA-Probe durch Gel-Elektrophorese aufgetrennt, auf einen geeigneten Träger, z. B. Nitrocellulose, Nylon usw., überführt und anschließend mit einem Fragment der vorliegenden DNA als Sonde getestet. Außerdem können andere Techniken verwendet werden, z. B. Oligonucleotid-Ligierungs-Tests, in situ-Hybridisierungen und Hybridisierung an DNA-Sonden, die auf einem festen Chip angeordnet sind. Der Nachweis von mRNA, die mit der vorliegenden Sequenz hybridisiert, ist ein Zeichen für die Expression des MPTS-Gens in der Probe.

Die Sequenz eines MPTS-Gens, umfassend flankierende Promotorregionen und codierende Regionen, kann auf unterschiedliche Art und Weise mutiert werden, wie dem Fachmann bekannt, um gezielte Änderungen in der Stärke des Promotors, in der Sequenz des codierten Proteins usw. zu erzeugen. Die DNA-Sequenz oder das Proteinprodukt einer solchen Mutation ist üblicherweise im Wesentlichen ähnlich zu den hier bereitgestellten Sequenzen, d. h. es unterscheidet sich mindestens in einem Nucleotid bzw. einer Aminosäure und es kann sich in mindestens zwei, jedoch nicht mehr als etwa zehn Nucleotiden oder Aminosäuren unterscheiden. Die Sequenzänderungen können Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder eine Kombination davon sein. Deletionen können ferner größere Veränderungen umfassen, z. B. Deletionen einer Domäne oder eines Exons. Andere Modifikationen von Interesse umfassen eine Epitop-Markierung, z. B. mit dem FLAG-System, HA, usw. Für Untersuchungen der subzellulären Lokalisierung können Fusionsproteine mit grün fluoreszierenden Proteinen (GFP) eingesetzt werden.

Techniken für die in vitro-Mutagenese von clonierten Genen sind bekannt. Beispiele von Protokollen für positionsspezifische ("site specific") Mutagenese finden sich in Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 537-539; und Prentki et al., Gene (1984) 29: 303-313. Verfahren für die positionsspezifische Mutagese finden sich in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, (1989), S. 15.3-15.108; Weiner et al., Gene (1993) 126: 35-41; Sayers et al., Biotechniques (1992) 13: 592-596; Jones und Winistorfer, Biotechniques (1992) 12: 528-530; Barton et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 7349-7355; Marotti und Tomich, Gene Anal. Tech. (1989) 6: 67-70; und Zhu, Anal. Biochem. (1989) 177: 120-124. Solche mutierten Gene können verwendet werden, um den Zusammenhang von Struktur und Funktion eines MPTS-Proteins zu untersuchen oder um Eigenschaften des Proteins so zu verändern, dass seine Funktion oder Regulation beeinflusst wird.

Die vorliegenden Nucleinsäuren können eingesetzt werden, um transgene, Nicht-Mensch-Tiere oder stellenspezifische Genmodifikationen in Zelllinien zu erzeugen. Insbesondere sollen transgene, nicht-menschliche Tiere bereitgestellt werden, die eine erfindungsgemäße Nucleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten. Die transgenen, nicht-menschlichen Tiere können auch Tiere umfassen, bei denen die Expression einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung reduziert und/oder ausgeschaltet ist. Transgene Tiere können, zum Beispiel, durch eine homologe Rekombination hergestellt werden, wobei der endogene Locus verändert wird. In einer anderen Ausführungsform wird ein Nucleinsäure-Konstrukt in das Genom nach Zufall integriert. Vektoren für einen stabilen Einbau umfassen Plasmide, Retroviren und andere Tier-Viren, YACs und dergleichen. Verfahren zum Herstellen eines transgenen, nicht-menschlichen Tieres, von Tierzellen und/oder Tiergeweben, umfassend die Einführung einer Nucleinsäure oder eines Vektors der vorliegenden Erfindung und wurden hierin beschrieben und sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere könne die Nucleinsäuren, und Expressionskassetten und/oder Vektoren dieser Erfindung verwendet werden, um die oben erwähnten transgenen, nicht-menschlichen Tiere bereitzustellen. Besonders bevorzugte nicht-menschliche transgene Tiere sind Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder, Ziegen, aber auch Fische, wie Zebrafisch, oder wirbellose Tiere wie Drosophila oder Nematoden (z. B. C. elegans). Wie unten ausgeführt können diese nicht-menschlichen Tiere (als auch Zellen, Gewebe die von diesen stammen) besonders in "Durchmusterungs"-Verfahren ("screening"-Verfahren) oder Absuchverfahren und/oder als Modellsysteme in pathologischen Veränderungen verwendet werden.

Die modifizierten Zellen oder Tiere können für die Untersuchung der Funktion und Regulation von MPTS eingesetzt werden. Von Interesse ist die Verwendung der vorliegenden Gene für die Konstruktion von transgenen Tiermodellen, die MPTS- verwandte Krankheitszustände darstellen, umfassend mit Aggrekanase zusammenhängende Krankheitszustände, z. B. Krankheitszustände, die mit der Aggrekanase-Aktivität in Zusammenhang stehen, wie Arthritis. Somit wird bei den transgenen Tiermodellen der vorliegenden Erfindung das endogene MPTS-Gen durch "Knockout" ausgeschaltet, so dass die Expression des endogenen MPTS zumindest reduziert, wenn nicht ganz eliminiert ist, und außerdem exprimieren solche Tiere typischerweise ein MPTS-Peptid der vorliegenden Erfindung, z. B. die spezifischen MPTS-Proteine der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon. Wenn eine Nucleinsäure, die eine im menschlichen MPTS-Gen vorliegende Sequenz aufweist, eingeführt wird, kann die eingeführte Nucleinsäure entweder vollständig sein oder sie kann eine partielle Sequenz des MPTS-Gens darstellen. Ein nachweisbarer Marker, wie IacZ, kann in den MPTS-Locus eingeführt werden, wobei eine Nach-Oben-Regulierung der Gen-Expression zu einer einfach nachweisbaren Veränderung des Phänotyps führt. Außerdem kann man die Expression des Gens oder von Varianten davon in Zellen oder Geweben durchführen, in denen es normalerweise nicht exprimiert wird, und zwar in Spiegeln, die normalerweise in solchen Zellen oder Geweben nicht vorliegen.

DNA-Konstrukte für eine homologe Rekombination umfassen mindestens einen Teil eines MPTS-Gens der vorliegenden Erfindung, wobei das Gen die gewünschte(n) genetische(n) Modifikation(en) aufweist und Regionen umfasst, die zu dem Ziellocus homolog sind. Dementsprechend werden transgene nicht- menschliche Tiere bereitgestellt, die ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül und/oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthalten, wobei die Nucleinsäure (eine) genetische Modifikation(en) aufweist. Solche Modifikationen können Additionen, Deletionen, Substitutionen, Duplikationen, Inversionen, etc. umfassen. DNA- Konstrukte für einen zufälligen Einbau müssen keine homologen Regionen umfassen, damit die Rekombination erfolgen kann. Am besten werden Marker für eine positive und negative Selektion eingefügt. Verfahren zur Erzeugung von Zellen mit gezielten Genmodifikationen durch homologe Rekombination sind dem Fachmann bekannt. Verschiedene Techniken zur Transfektion von Säugerzellen finden sich in Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185: 527-537.

Für embryonale Stammzellen (Es-Zellen) kann eine ES-Zelllinie eingesetzt werden, oder embryonale Zellen können frisch aus einem Wirt, z. B. Maus, Ratte, Meerschweinchen usw., erhalten werden. Solche Zellen werden auf einer geeigneten Fibroblasten-Feeder-Schicht gezüchtet, oder werden in Gegenwart des Leukämie-inhibierenden Faktors (LIF) kultiviert. Wenn die ES oder die embryonalen Zellen transformiert wurden, können sie zur Herstellung von transgenen Tieren verwendet werden. Nach der Transformation werden die Zellen auf eine Feeder- Schicht in einem geeigneten Medium plattiert. Die Zellen, die das Konstrukt enthalten, können durch Verwendung eines Selektivmediums nachgewiesen werden. Nachdem man die Kolonien eine ausreichend lange Zeit wachsen ließ, werden sie entnommen und auf das Vorliegen einer homologen Rekombination oder Integration des Konstrukts hin untersucht. Diejenigen Kolonien, die positiv sind, können sodann für eine Embryo-Manipulation oder Blastozysten-Injektion verwendet werden. Blastozysten werden aus vier bis sechs Wochen alten superovulierten Weibchen erhalten. Die ES-Zellen werden mit Trypsin behandelt und die modifizierten Zellen in die Blastozöle der Blastozyste injiziert. Nach der Injektion werden die Blastozysten wieder ins jeweilige Uterushorn von scheinträchtigen Weibchen eingebracht. Anschließend lässt man die Weibchen den Nachwuchs austragen, der sodann auf das Konstrukt abgesucht wird. Dadurch dass die Blastozyste und die genetisch modifizierten Zellen einen unterschiedlichen Phänotyp zeigen, kann der chimäre Nachwuchs einfach nachgewiesen werden.

Die chimären Tiere werden auf das Vorliegen des modifizierten Gens hin abgesucht, und Männchen und Weibchen, die Modifikationen aufweisen, werden gepaart, um homozygote Nachkommen zu erzeugen. Wenn die Genveränderung in irgendeinem Punkt der Entwicklung zur Letalität führt, können Gewebe oder Organe als allogene oder kongene Proben oder Transplantate oder in einer in vitro-Kultur weiterhin aufrecht erhalten werden. Die transgenen Tiere können ein beliebiges Nicht-Mensch-Säugetier sein, z. B. ein Versuchstier, ein Haustier usw. Die transgenen Tiere können in Funktionsuntersuchungen, beim Durchmustern von Arzneistoffen usw. eingesetzt werden, z. B. um die Wirkung eines möglichen Arzneistoff-Kandidaten auf Aggrekanase-Aktivität zu bestimmen.

Außerdem werden Verfahren für die Diagnose von Krankheitszuständen bereitgestellt, die auf den festgestellten Mengen eines MPTS-Proteins oder auf der Expressionsrate des Gens in einer biologischen Probe von Interesse beruhen. Proben, die hierfür verwendet werden können, umfassen biologische Flüssigkeiten wie Blut, zerebrospinale Flüssigkeit, Tränen, Speichel, Lymphe, Dialyseflüssigkeit und dergleichen; von Organen oder von einer Gewebekultur stammende Flüssigkeiten; und Flüssigkeiten, die aus physiologischen Geweben extrahiert wurden. Außerdem schließt der Begriff Derivate und Fraktionen solcher Flüssigkeiten ein. Im Fall von festen Geweben können die Zellen auch aufgetrennt werden, oder Gewebeschnitte können analysiert werden. Andererseits kann auch ein Lysat der Zellen hergestellt werden.

Zum Bestimmen der Expressionsrate eines Gens oder Proteins in einer bestimmten Probe sind verschiedene Verfahren verfügbar. Die Diagnose kann durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden, wobei die Abwesenheit oder das Vorliegen oder veränderte Mengen des normalen oder abnormen MPTS in einer Patientenprobe festgestellt wird/werden. Beispielsweise kann der Nachweis anhand der Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten mit markierten Antikörpern erfolgen, die gemäß herkömmlichen Methoden durchgeführt wird. Die Zellen werden permeabel gemacht, so dass cytoplasmatische Moleküle angefärbt werden können. Die Antikörper von Interesse werden der Zellprobe zugegeben und eine ausreichende Zeit inkubiert, so dass die Bindung an das Epitop erfolgen kann, normalerweise etwa zehn Minuten. Der Antikörper kann mit Radioisotopen, Enzymen, fluoreszierenden Stoffen, chemilumineszierenden Stoffen oder anderen Markierungen für einen direkten Nachweis markiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann als zweiter Schritt ein Antikörper oder ein Reagens verwendet werden, mit dem das Signal verstärkt werden kann. Solche Reagenzien sind dem Fachmann bekannt. So kann der primäre Antikörper an Biotin gekoppelt werden, und als Reagens für den zweiten Schritt wird ein mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Avidin zugegeben. Wahlweise kann der sekundäre Antikörper an eine fluoreszierende Verbindung gebunden sein, z. B. Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot usw. Zum endgültigen Nachweis wird ein Substrat verwendet, das in Gegenwart der Peroxidase eine Farbänderung durchmacht. Die Abwesenheit oder das Vorliegen einer Antikörperbindung kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden, umfassend Durchflusscytometrie von dissoziierten Zellen, Mikroskopie, Radiographie, Szintillationszählung usw.

Andererseits kann man sich auch auf die Expression des MPTS-Gens konzentrieren. Biochemische Untersuchungen, mit denen bestimmt wird, ob ein Sequenz-Polymorphismus in einer MPTS-codierenden Region oder Kontrollregionen mit einer Erkrankung in Zusammenhang steht, können durchgeführt werden.

Polymorphismen, die mit einer Erkrankung in Zusammenhang stehen, können eine Deletion oder Verkürzung des Gens, Mutationen, die Expressionsrate verändern, die die Aktivität des Proteins beeinflussen, usw. umfassen.

Veränderungen in der Promotor- oder Enhancer-Sequenz, die Expressionsraten von MPTS beeinflussen können, können mit den Expressionsraten des normalen Allels verglichen werden, wobei verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren eingesetzt werden können. Verfahren zur Bestimmung von Promotor- oder Enhancer-Stärke umfassen die Quantifizierung des exprimierten natürlichen Proteins; den Einbau des Varianten-Kontrollelements in einen Vektor mit einem Reportergen, z. B. β-Galactosidase, Luciferase, Chloramphenicol- Acetyltransferase usw., das eine einfache Quantifizierung ermöglicht; und dergleichen.

Verschiedene Verfahren sind verfügbar, um Nucleinsäuren auf das Vorliegen einer spezifischen Sequenz, z. B. eines mit einer Krankheit in Zusammenhang stehenden Polymorphismus, zu untersuchen. Wenn große Mengen der DNA verfügbar sind, wird die genomische DNA direkt verwendet. Ansonsten wird die Region von Interesse in einen geeigneten Vektor cloniert und in ausreichender Menge für die Analyse gezüchtet. Aus Zellen, die ein MPTS-Protein exprimieren, kann die mRNA erhalten werden, die direkt getestet oder für die Analyse in cDNA revers transkribiert werden kann. Die Nucleinsäure kann durch herkömmliche Techniken, z. B. durch Polymerasekettenreaktion ("polymerase chain reaction", PCR), amplifiziert werden, wodurch ausreichende Mengen für die Analyse bereitgestellt werden können. Die Verwendung der Polymerasekettenreaktion wird in Saiki et al., Science (1985) 239: 487, beschrieben, und eine Übersicht der Techniken findet sich in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, (1989), S. 14.2-14.33. Ansonsten sind dem Fachmann noch verschiedene Verfahren bekannt, bei denen zum Nachweis von Polymorphismen eine Oligonucleotid-Ligierung eingesetzt wird, vgl. z. B. Riley et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18: 2887-2890; und Delahunty et al., Am. J. Hum. Genet. (1996) 58: 1239-1246.

Bei einer Amplifikationsreaktion kann auch eine nachweisbare Markierung verwendet werden. Geeignete Markierungen umfassen Fluorochrome, z. B. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6- carboxyfluorescein (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7- hexachlorfluorescein (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) oder N,N,N',N'- Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), radioaktive Markierungen, z. B. ³²P, ³⁵S, ³H, usw. Die Markierung kann ein zweistufiges System darstellen, wobei die amplifizierte DNA an Biotin, Haptene usw. konjugiert wird, die einen Bindungspartner mit hoher Affinität haben, z. B. Avidin, spezifische Antikörper usw., wobei der Bindungspartner an eine nachweisbare Markierung gebunden wird. Die Markierung kann an einen oder an beide Primer gekoppelt sein. Als andere Möglichkeit wird der bei der Amplifikation verwendete Nucleotid-Pool markiert, wodurch die Markierung in das Amplifikationsprodukt eingebaut wird.

Die Nucleinsäureprobe, z. B. ein amplifiziertes oder cloniertes Fragment, kann durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren untersucht werden. Die Nucleinsäure kann durch das Didesoxy-Verfahren oder ein anderes Verfahren sequenziert werden, und die Basensequenz kann mit einer Wildtyp-Gensequenz verglichen werden. Auch kann eine Hybridisierung mit der Variantensequenz erfolgen, z. B. durch Southern-Blots, Dot-Blots usw., um ihr Vorliegen zu bestimmen. Außerdem kann das Hybridisierungsmuster einer Kontroll- und einer Variantensequenz mit einer Anordnung von Oligonucleotid-Sonden, die auf einem festen Träger immobilisiert sind, wie in US 5 445 934 oder in WO 95/35505 beschrieben, zum Nachweis des Vorliegens von Variantensequenzen eingesetzt werden. Analyse des Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP), denaturierende Gradientengel-Elektrophorese (DGGE) und Heteroduplex-Analyse in Gelmatrizes können eingesetzt werden, um Konformationsänderungen, die durch DNA-Sequenzvariationen verursacht wurden, als Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität nachzuweisen. Wenn andererseits ein Polymorphismus eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease erzeugt oder zerstört, wird die Probe mit dieser Endonuclease gespalten und die Produkte nach der Größe fraktioniert, wobei bestimmt werden kann, ob das Fragment gespalten wurde. Die Fraktionierung erfolgt durch Gel- oder Kapillarelektrophorese, insbesondere auf Acrylamid- oder Agarosegelen.

Entweder die funktionellen oder die antigenen Eigenschaften des Proteins können als Grundlage dienen, um MPTS-Proteine auf Mutationen abzusuchen. Tests auf Proteinverkürzung eignen sich für den Nachweis von Deletionen, die möglicherweise die biologische Aktivität des Proteins beeinträchtigen. Für das Absuchen können verschiedene Immuntests verwendet werden, die zum Nachweis von Polymorphismen bei MPTS-Proteinen erstellt wurden. Wenn viele unterschiedliche genetische Mutationen zu einem bestimmten Krankheitsphänotyp führen, haben sich Tests der Proteinfunktion als wirksame Screening-Tests erwiesen. Die Aktivität des codierten MPTS-Proteins kann durch Vergleich mit dem Wildtyp-Protein bestimmt werden.

Diagnostische Verfahren der vorliegenden Erfindung, bei denen die Expressionsrate des MPTS-Gens von Interesse ist, umfassen typischerweise einen Vergleich der Menge der MPTS-Nucleinsäure einer Probe von Interesse mit einem Kontrollwert, wodurch die relativen Unterschiede bestimmt werden, wobei der Unterschied qualitativ und/oder quantitativ gemessen werden kann, und wobei diese Unterschiede anschließend mit dem Vorliegen oder der Abwesenheit eines abnormen MPTS-Gen-Expressionsmusters in Zusammenhang gebracht werden können. Der Fachmann kennt eine Vielzahl von unterschiedlichen Verfahren, mit denen die Nucleinsäuremenge in einer Probe bestimmt werden kann, wobei die besonders interessanten Verfahren in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben werden: Pietu et al., Genome Res. (Juni 1996) 6: 492-503; Zhao et al., Gene (24. April 1995) 156: 207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (Oktober 1997) 8: 542-546; Raval, J. Pharmacol. Toxicol. Methods (Nov. 1994) 32: 125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem. (1. Feb. 1994) 216: 299-304; Stolz und Tuan, Mol. Biotechnol. (Dez. 1996) 6: 225-230; Hong et al., Bioscience Reports (19982) 2: 907; und McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143: 298. Außerdem sind die Verfahren interessant, die in WO 97/27317 beschrieben werden, deren Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.

Die vorliegenden Polypeptide können in verschiedenen Screening-Tests eingesetzt werden, die zum Identifizieren von Arzneimitteln erstellt wurden. Es werden dementsprechend Absuchungsverfahren zum Identifizieren von MPTS- modulatoren Mitteln bereitgestellt, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines erfindungsgemäßen Polypeptids mit einem Substrat in Gegenwart eines möglichen modulatorischen Mittels und die Bestimmung der Wirkung des modulatorischen Mittels auf die Aktivität des Polypeptids umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform des oben genannten Absuchungsverfahrens umfasst das Substrat eine Glu-Ala-Bindung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Substrat Aggrecan oder ein Fragment davon. MPTS-modulatorische Mittel, die durch die vorstehenden Verfahren erhalten werden können oder erhalten werden, werden zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Krankheitszustands, der mit der MPTS-Aktivität in Zusammenhang steht verwendet, wobei der Krankheitszustand inbesondere durch das Vorliegen von Aggrekan- Spaltprodukten gekennzeichnet ist.

Eine Ausführungsform der vorstehenden Verfahren ist die Verwendung eines MPTS-modulatorischen Mittels, das durch eines der vorstehenden Verfahren erhalten werden kann oder erhalten wird zur Herstellung eines Medikamentes zur Modulierung der MPTS-Aktivität. Bevorzugterweise umfaßt die vorstehende Modulierung eine Verstärkung oder Hemmung der MPTS-Aktivität.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das MPTS-modulatorische Mittel ein Antagonist oder Agonist, wie weiter unten beschrieben. Bevorzugterweise finden die erfindungsgemäßen modulatorischen Mittel eine Verwendung bei Krankheitszuständen, wobei der Krankheitszustand Arthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, infektiöse Arthritis, Gicht-Arthritis, Psoriasis-Arthritis, Spondolysis, Sportverletzung, Gelenktrauma oder Fibrose ist.

In vitro-Screening-Tests, bei denen die Aktivität eines MPTS-Polypeptids, z. B. die Aggrekanase-Aktivität eines MPTS-Polypeptids, in Gegenwart eines möglichen Arzneimittel-Kandidaten getestet und mit einer Kontrolle, d. h. der Aktivität in Abwesenheit des Arzneimittel-Kandidaten, verglichen wird, können verwendet werden. Die Aktivität kann in unterschiedlichen Verfahren ermittelt werden, wobei die Aktivität im Allgemeinen als die Fähigkeit bestimmt wird, Aggrekan oder mindestens ein Fragment davon sowie ein rekombinantes Polypeptid, das die Aggrekanase- Spaltstelle enthält, wie vorstehend beschrieben, zu spalten. Solche Tests werden in US-Patent Nr. 5 872 209 und WO 99/05921, außerdem in Arner et al., J. Biol. Chem. (März 1999) 274: 6594-6601, beschrieben.

Außerdem sind bei den Screening-Tests transgene Nicht-Mensch-Tiere von Interesse, die ein funktionelles MPTS exprimieren, wobei solche Tiere vorstehend beschrieben werden. In vielen Ausführungsformen fehlt den Tieren das entsprechende endogene MPTS. Wenn solche Tiere für Anwendungen zum Durchmustern eingesetzt werden, wird (werden) dem Tier eine Testverbindung (Testverbindungen) verabreicht und die resultierenden Veränderungen im Phänotyp, z. B. das Vorliegen von Aggrekan, erzeugt durch die Spaltung der Glu³⁷³-Ala³⁷⁴- Bindung, mit einer Kontrolle verglichen.

Als andere Möglichkeit kann die MPTS-bindende Aktivität in in vitro-Modellen gemessen werden, wobei die Bindungsereignisse zwischen MPTS und möglichen Kandidaten für MPTS-modulatorische Mittel registriert werden.

Bei den Screening-Tests können ferner verschiedene andere Reagenzien, abhängig von den jeweiligen verwendeten Absuchprotokollen, zugefügt werden. Diese umfassen Reagenzien, wie Salze, neutrale Proteine, z. B. Albumin, Detergentien usw., die eingesetzt werden, um die optimale Protein-Protein-Bindung zu fördern und/oder nicht-spezifische oder Hintergrund-Wechselwirkungen zu reduzieren. Außerdem können Reagenzien eingesetzt werden, die die Wirksamkeit des Tests verbessern, wie Protease-Inhibitoren, Nuclease-Inhibitoren, antimikrobielle Mittel usw.

Unterschiedliche Arzneimittel-Kandidaten, die entweder als MPTS-Agonisten oder als MPTS-Antagonisten wirken, können mit den vorstehenden Verfahren durchgemustert werden. Die möglichen Kandidaten für die Mittel umfassen zahlreichen chemische Klassen, wobei sie jedoch typischerweise organische Moleküle sind, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2500 Dalton. Die Kandidaten für die Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen erforderlich sind, insbesondere die Wasserstoffbindung, und sie enthalten typischerweise mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, vorzugsweise mindestens zwei funktionelle chemische Gruppen. Die Kandidaten für die Mittel umfassen häufig zyklische Kohlenstoffstrukturen oder heterocyclische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren vorstehenden funktionellen Gruppen substituiert sind. Mögliche Kandidaten für die Mittel sind außerdem unter Biomolekülen zu finden, umfassend Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, Strukturanaloga oder Kombinationen davon.

Mögliche Kandidaten für Mittel können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, einschließlich Genbanken von synthetischen oder natürlichen Verbindungen. Beispielsweise gibt es zahlreiche Verfahren für eine zufällige oder gezielte Synthese verschiedener organischer Verbindungen und Biomoleküle, umfassend die Expression von randomisierten Oligonucleotiden und Oligopeptiden. Oder wahlweise sind auch Genbanken von natürlichen Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, pflanzlichen und tierischen Extrakten verfügbar oder einfach herzustellen. Des Weiteren können natürliche oder synthetisch hergestellte Genbanken und Verbindungen durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Methoden einfach modifiziert werden und zur Herstellung kombinatorischer Genbanken verwendet werden. Von bekannten Pharmaka können durch direkte oder zufällige chemische Modifikationen, z. B. durch Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung usw., Strukturanaloga hergestellt werden.

Von besonderem Interesse sind in vielen Ausführungsformen Screening- Verfahren, mit denen Mittel identifiziert werden können, die selektiv das vorliegende MPTS-Enzym und keine anderen Proteasen modulieren, d. h. hemmen.

Die Nucleinsäure-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch als Arzneimitte) in Fällen eingesetzt werden, wenn die MPTS-Aktivität in einem Wirt verstärkt werden soll. Die MPTS-Gene, Genfragmente oder die codierten Proteine oder Proteinfragmente können in der Gentherapie eingesetzt werden, um Störungen zu behandeln, die mit MPTS-Defekten, einschließlich Aggrekanase- Defekten, in Zusammenhang stehen. Das Gen kann mit Hilfe von Expressionsvektoren in eine Zelle eingeführt werden. Solche Vektoren besitzen im Allgemeinen günstige Restriktionsstellen, die in der Nähe der Promotorsequenz liegen, so dass Nucleinsäuresequenzen eingefügt werden können. Transkriptionskassetten können hergestellt werden, die eine Transkriptions- Initiations-Region, das Zielgen oder ein Fragment davon und eine transkriptionale Terminations-Region aufweisen. Die Transkriptionskassetten können in verschiedene Vektoren eingeführt werden, z. B. Plasmid; Retrovirus, z. B. Lentivirus; Adenovirus; und dergleichen, wobei die Vektoren in Zellen vorübergehend oder stabil aufrecht erhalten werden können, üblicherweise für eine Zeitspanne von mindestens etwa einem Tag, meist für eine Zeitspanne von mindestens etwa mehreren Tagen bis mehreren Wochen.

Das Gen oder das Protein kann in Gewebe oder Wirtszellen über verschiedene Routen eingeführt werden, umfassend eine virale Infektion, Mikroinjektion oder Fusion von Vesikeln. Außerdem kann für die intramuskuläre Verabreichung eine Jet-Injektion verwendet werden, wie von Furth et al., Anal. Biochem. (1992) 205: 365-368, beschrieben. Die DNA kann auf Mikropartikel aus Gold beschichtet und intradermal durch eine Partikelbeschuss-Vorrichtung oder "gene gun" freigesetzt werden, wie in der Literatur beschrieben (vgl., z. B. Tang et al., Nature (1992) 356: 152-154), wobei Gold-Mikroprojektile mit der DNA beschichtet und anschließend in Hautzellen eingebracht werden.

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Modulieren der MPTS- Aktivität, und in vielen Ausführungsformen der Aggrekanase-Aktivität, in einer Zelle bereit, umfassend Verfahren zur Erhöhung der MPTS-Aktivität (z. B. Verfahren zur Verstärkung) und auch Verfahren zur Reduzierung oder Hemmung der MPTS- Aktivität, z. B. Verfahren zum Beenden oder Begrenzen der Aggrekan-Spaltung. In solchen Verfahren wird eine wirksame Menge eines modulatorischen Mittels mit der Zelle in Kontakt gebracht.

Außerdem werden Verfahren zum Modulieren bereitgestellt, die eine Verstärkung oder Hemmung der MPTS-Aktivität in einem Wirt umfassen. Bei solchen Verfahren wird eine wirksame Menge eines Wirkstoffs, der die Aktivität eines MPTS-Proteins in vivo moduliert, wobei z. B. das Mittel üblicherweise die gewünschte MPTS-Aktivität verstärkt oder hemmt, an den Wirt verabreicht. Bei dem Wirkstoff kann es sich um die unterschiedlichsten Verbindungen handeln, einschließlich eine in der Natur vorkommende oder synthetische niedermolekulare Verbindung, ein Antikörper, ein Fragment oder Derivat davon, eine Antisense- Zusammensetzung und dergleichen.

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Identifizieren von Agonisten oder Antagonisten eines erfindungsgemäßen Polypeptids bereit umfassend:

a) Herstellen von Zellen, die das erfindungsgemäße Polypeptid exprimieren;
b) Inkontaktbringen des Polypeptids, das in Schritt (a) hergestellt wird, mit einer Probe, welche möglicherweise einen Antagonisten oder Agonisten enthält; und
c) Identifizierung eines Antagonisten oder Agonisten durch Beobachtung von einer Bindung und Inhibierung oder Stimulierung der biologischen Aktivität des Polypeptids.

Außerdem stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Bindungspartners des erfindungsgemäßen Polypeptids bereit, umfassend:

a) Inkontaktbringen des erfindungsgemäßen Polypeptids mit einem Bindungspartner; und
b) Bestimmen, ob der Bindungspartner eine Aktivität des Polypeptids bewirkt.

Von besonderem Interesse sind in bestimmten Ausführungsformen Mittel, die die MPTS-Aktivität reduzieren, einschließlich Mittel, die die Aggrekanase-Aktivität, z. B. die Aggrekan-Spaltung, herabsetzen, und zwar mindestens etwa 10fach, meist mindestens etwa 20fach und noch öfter mindestens etwa 25fach, wobei dies durch den in Arner et al., (1999), oben, beschriebenen Test gemessen wird. In vielen Ausführungsformen von besonderem Interesse werden Verbindungen eingesetzt, die die Aggrekanase-Aktivität im Vergleich zu einer Kontrolle mindestens 100fach reduzieren.

Außerdem ist die Verwendung von Mitteln von Interesse, die zwar eine reduzierte MPTS-Aktivität, einschließlich Aggrekanase-Aktivität, bereitstellen, die aber die Aktivität von anderen Proteinase, wenn überhaupt, nicht wesentlich reduzieren. Somit sind die Mittel in dieser Ausführungsform selektive Inhibitoren von MPTS. Ein Mittel wird als selektiv angesehen, wenn es die vorstehende reduzierte Aggrekanase-Aktivität bereitstellt, jedoch im Wesentlichen keine reduzierte Aktivität von mindestens einer anderen Protease bewirkt, wobei "im Wesentlichen keine" eine Reduktion von weniger als 10fach, üblicherweise von weniger als 5fach und in vielen Fällen eine weniger als einfache Reduktion bedeutet, wobei die Aktivität wie in Arner et al., (1999), oben, beschrieben, gemessen wird.

In der Natur vorkommende oder synthetische niedermolekulare Verbindungen von Interesse umfassen zahlreiche chemische Klassen, wobei sie jedoch typischerweise organische Moleküle sind, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2500 Dalton. Mögliche Kandidaten für Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die für eine strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen erforderlich sind, insbesondere die Wasserstoffbindung, und sie enthalten typischerweise mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, vorzugsweise mindestens zwei funktionelle chemische Gruppen. Die möglichen Kandidaten für Mittel umfassen häufig zyklische Kohlenstoffstrukturen oder heterocyclische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren vorstehenden funktionellen Gruppen substituiert sind. Die möglichen Kandidaten für Mittel sind außerdem unter Biomolekülen zu finden, umfassend Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, Strukturanaloga oder Kombinationen davon.

Außerdem eignen sich als Wirkstoffe Antikörper, die die Ziel-MPTS-Aktivität, z. B. die Aggrekanase-Aktivität, im Wirt zumindest reduzieren, wenn nicht hemmen. Demgemäß werden Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörperderivate oder Aptamere bereitgestellt, die/das spezifisch die erfindungsgemäßen Polypeptide erkennen. Bevorzugterweise werden diese Antikörper, Antikörperfragmente oder Antikörperderivate ausgewählt aus der Gruppe aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, xenogenen Antikörpern, chimeren Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern, Fv-Fragmenten, F(ab')₂- Fragmenten oder Fab-Fragmenten. Geeignete Antikörper werden durch Immunisieren eines Wirtstieres mit Peptiden erhalten, die das gesamte Ziel-Protein oder einen Teil davon umfassen, z. B. MPTS-15, MPTS-19 oder MPTS-20. Geeignete Wirtstiere umfassen Maus, Ratte, Schaf, Ziege, Hamster, Kaninchen usw.

Das Protein-Immunogen kann von Maus, Mensch, Ratte, Affe usw. stammen. Als Wirtstier dient im Allgemeinen eine andere Art als fürs Immunogen, z. B. wird menschliches MPTS für die Immunisierung von Mäusen eingesetzt usw. Das Immunogen kann das vollständige Protein oder Fragmente und Derivate davon umfassen. Bevorzugte Immunogene umfassen das gesamte oder einen Teil von MPTS, wobei diese Reste die posttranslationalen Modifikationen, wie Glykosylierung, enthalten, die auf dem nativen Ziel-Protein zu finden sind. Immunogene, die die extrazelluläre Domäne aufweisen, können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. Expression von clonierten Genen unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter Verfahren, Isolierung von HEC usw.

Für die Herstellung von polyclonalen Antikörpern besteht der erste Schritt in einer Immunisierung des Wirtstieres mit dem Ziel-Protein, wobei das Ziel-Protein vorzugsweise im Wesentlichen in reiner Form vorliegt, d. h. es enthält weniger als etwa 1% Verunreinigung. Das Immunogen kann das vollständige Ziel-Protein, Fragmente oder Derivate davon enthalten. Um die Immunantwort des Wirtstieres zu steigern, kann das Ziel-Protein mit einem Adjuvans kombiniert werden, wobei geeignete Adjuvantien Alaun, Dextran, Sulfat, große polymere Anionen, Öl-und- Wasser-Emulsionen, z. B. Freundsches Adjuvans, komplettes Freundsches Adjuvans und dergleichen umfassen. Das Ziel-Protein kann auch an synthetische Trägerproteine oder synthetische Antigene gekoppelt werden. Verschiedene Wirte können immunisiert werden, so dass sie polyclonale Antikörper herstellen. Solche Wirte umfassen Kaninchen, Meerschweinchen, Nager, z. B. Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und dergleichen. Das Ziel-Protein wird an den Wirt meist intradermal verabreicht, wobei auf eine Anfangsdosis eine oder mehrere, meist zwei, weitere Booster-Dosierungen folgen. Nach der Immunisierung wird das Blut aus dem Wirt gewonnen, hierauf folgt die Abtrennung des Serums von den Blutzellen. Das im resultierenden Antiserum vorliegende Ig kann weiter fraktioniert werden, wobei bekannte Verfahren, wie Ammoniumsalz-Fraktionierung, DEAE-Chromatographie und dergleichen, eingesetzt werden.

Monoclonale Antikörper werden durch herkömmliche Techniken hergestellt. Im Allgemeinen können Plasmazellen aus der Milz und/oder den Lymphknoten eines immunisierten Wirtstieres gewonnen werden. Die Plasmazellen werden durch Fusion mit Myelomzellen immortalisiert, wodurch Hybridomzellen erzeugt werden. Damit werden Hybridomazellen bereitgestellt, die die vorstehenden erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper erzeugen. Der Kulturüberstand von einzelnen Hybridomen wird unter Verwendung von Standardtechniken abgesucht, um diejenigen zu identifizieren, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Tiere, die für die Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen das menschliche Protein geeignet sind, umfassen Maus, Ratte, Hamster usw. Um Antikörper gegen ein Maus-Protein herzustellen, wird das Tier im Allgemeinen ein Hamster, Meerschweinchen, Kaninchen usw. sein. Der Antikörper kann aus den Überständen von Hybridomzellen oder aus Aszitesflüssigkeiten durch herkömmliche Techniken, z. B. Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des an einen unlöslichen Träger gebundenen MPTS, Protein-A-Sepharose usw., gereinigt werden. Deshalb besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von monoclonalen Antikörpern, die spezifisch an die MPTS-Proteine der vorliegenden Erfindung binden, insbesondere von solchen Antikörpern, die die Aggrekanase-Aktivität hemmen, und von solchen Antikörpern, die menschliche oder vermenschlichte Antikörper sind.

Der Antikörper kann anstelle in der normalen multimeren Struktur als eine Einzelkette hergestellt werden. Einzelkettige Antikörper werden in Jost et al., J. B. C. (1994) 269: 26267-26273, und in anderen Veröffentlichungen beschrieben. DNA- Sequenzen, die die variable Region der schweren Kette und die variable Region der leichten Kette codieren, werden an einen Abstandshalter ligiert, der mindestens etwa vier Aminosäuren, d. h. kleine neutrale Aminosäuren, umfassend Glycin und/oder Serin, codiert. Das durch diese Fusion codierte Protein ermöglicht den Zusammenbau einer funktionellen variablen Region, die die Spezifität und Affinität des ursprünglichen Antikörpers besitzt.

Für die in vivo-Anwendung, insbesondere für die Injektion in Menschen, ist es wünschenswert, die Antigenität des Antikörpers zu verringern. Eine Immunantwort eines Empfängers gegen das Blockierungsmittel wird möglicherweise die Zeitspanne verkürzen, in der die Therapie wirksam ist. Verfahren zum Vermenschlichen von Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Der humanisierte Antikörper kann das Produkt eines Tieres sein, das Gene für eine transgene menschliche konstante Region des Immunglobulins aufweist (vgl. z. B. WO 90/10077 und WO 90/04036). Als andere Möglichkeit kann der Antikörper von Interesse durch DNA- Rekombinationstechniken gentechnisch so verändert werden, dass die CH1-, CH2-, CH3-, Scharnierdomänen und/oder die "framework"-Domäne durch die entsprechende menschliche Sequenz ersetzt werden (vgl. WO 92/02190).

Die Verwendung von Ig-cDNA für die Konstruktion von chimären Immunglobulin-Genen ist dem Fachmann bekannt (Liu et al., PNAS (1987) 84: 3439, und J. Immunol. (1987) 139: 3521). Die mRNA wird aus einer Hybridomzelle oder einer anderen Zelle, die den Antikörper produziert, isoliert und für die Herstellung von cDNA verwendet. Die cDNA von Interesse kann durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert werden (US-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202). Als Alternative wird eine Genbank hergestellt und auf die Sequenz von Interesse abgesucht, die sodann isoliert wird. Die DNA-Sequenz, die die variable Region des Antikörpers codiert, wird anschließend mit menschlichen Sequenzen der konstanten Region verknüpft. Die Sequenzen von menschlichen Genen von konstanten Regionen finden sich in Kabat et al., (1991), "Sequences of proteins of immunological interest", NIH- Veröffentlichung Nr. 91-3242. Gene der menschlichen C-Region sind aus bekannten Clonen einfach verfügbar. Der Isotyp wird entsprechend den gewünschten Effektor- Funktionen ausgewählt, z. B. Komplement-Fixierung oder Aktivität bei der Antikörper abhängigen zellulären Zytotoxizität. Bevorzugte Isotypen sind IgG1, IgG3 und IgG4. Von den menschlichen konstanten Regionen der leichten Kette kann sowohl der Kappa- als auch der Lambda-Typ verwendet werden. Anschließend wird der chimäre, humanisierte Antikörper durch herkömmliche Methoden exprimiert.

In anderen Ausführungsformen kön 47421 00070 552 001000280000000200012000285914731000040 0002010107360 00004 47302nen die Antikörper vollständige menschliche Antikörper sein. Beispielsweise können xenogene Antikörper verwendet werden, die mit menschlichen Antikörpern identisch sind. Mit xenogenen menschlichen Antikörpern sind Antikörper gemeint, die genauso wie menschliche Antikörper sind, d. h. sie sind vollständige menschliche Antikörper, mit der Ausnahme, dass sie unter Verwendung eines Nicht-Mensch-Wirtes hergestellt werden, der gentechnisch verändert wurde, so dass er menschliche und/oder humanisierte Antikörper exprimiert, vgl. z. B. WO 98/50433, WO 98/24893 und WO 99/53049.

Antikörper-Fragmente, wie Fv, F(ab')₂ und Fab, können durch Spaltung des intakten Proteins hergestellt werden, z. B. durch Protease oder durch chemische Spaltung. Es kann aber auch ein verkürztes Gen entworfen werden. Beispielsweise umfasst ein chimäres Gen, das einen Teil des F(ab')₂-Fragments codiert, DNA- Sequenzen, die die CH1-Domäne und Scharnier-Region der H-Kette codieren, gefolgt von einem translationalen Stopp-Codon, wodurch ein verkürztes Molekül erhalten wird.

Konsensus-Sequenzen von H- und LJ-Regionen können verwendet werden, um Oligonucleotide für die Verwendung als Primer zu entwerfen, durch die geeignete Restriktionsstellen in die J-Region eingeführt werden können, für die anschließende Kopplung von Segmenten der V-Region an Segmente der menschlichen C-Region. C-Region-cDNA kann durch positionsgerichtete Mutagenese modifiziert werden, so dass in der menschlichen Sequenz eine Restriktionsstelle an der entsprechenden Position eingefügt wird.

Expressionsvektoren umfassen Plasmide, Retroviren, YACs, von EBV stammende Episomen und dergleichen. Am besten geeignet ist ein Vektor, der eine funktionell vollständige menschliche CH- oder CL-Immunglobulin-Sequenz codiert, wobei geeignete Restriktionsstellen gentechnisch so eingefügt werden, dass eine beliebige VH- oder VL-Sequenz einfach eingefügt und exprimiert werden kann. In solchen Vektoren erfolgt das Spleißen normalerweise zwischen der Spleiß-Donor stelle in der eingefügten J-Region und der Spleiß-Akzeptorstelle, die der menschlichen C-Region voraus geht, und außerdem an den Spleiß-Regionen, die innerhalb der menschlichen CH-Exons vorliegen. Polyadenylierung und Transkriptions-Termination erfolgen an nativen chromosomalen Stellen stromabwärts der codierenden Regionen. Der resultierende chimäre Antikörper kann mit einem beliebigen starken Promotor gekoppelt werden, einschließlich Retrovirus- LTRs, z. B. SV-40-früher Promotor (Okayamqa et al., Mol. Cell. Bio. (1983) 3: 280), Rous-Sarkom-Virus-LTR (Gorman et al., PNAS (1982) 79: 6777) und Moloney- Muriner-Leukämievirus-LTR (Grosschedl et al., Cell (1985) 41: 885); native Ig- Promotoren usw.

In anderen Ausführungsformen der Erfindung ist der Wirkstoff ein Mittel, das die Expression des Gens, das das Ziel-Protein in dem Wirt codiert, moduliert und im Allgemeinen vermindert oder "nach unten"-reguliert. Beispielsweise können Antisense-Moleküle eingesetzt werden, um die Expression von MPTS in Zellen "nach unten" zu regulieren. Bei dem Antisense-Reagens kann es sich um Antisense- Oligonucleotide (ODN), insbesondere synthetische ODN, die chemische Modifikationen der nativen Nucleinsäuren aufweisen, oder um Nucleinsäurekonstrukte handeln, die solche Antisense-Moleküle als RNA exprimieren. Die Antisense-Sequenz ist zu der mRNA des Ziel-Gens komplementär und hemmt die Expression der Ziel-Gen-Produkte. Antisense-Moleküle hemmen die Genexpression durch verschiedene Mechanismen, z. B. indem die mRNA-Menge, die für die Translation verfügbar ist, reduziert wird, indem RNAse H aktiviert wird oder indem eine sterische Behinderung erfolgt. Ein Antisense-Molekül oder eine Kombination von Antisense-Molekülen kann verabreicht werden, wobei eine Kombination mehrere unterschiedliche Sequenzen umfassen kann.

Antisense-Moleküle können durch Expression der gesamten Ziel-Gensequenz oder eines Teils davon in einem geeigneten Vektor hergestellt werden, wobei die Orientierung der transkriptionalen Initiation bewirkt, dass ein Antisense-Strang in Form eines RNA-Moleküls produziert wird. In einer anderen Ausführungsform ist das Antisense-Molekül ein synthetisches Oligonucleotid. Antisense-Oligonucleotide weisen im Allgemeinen eine Länge von mindestens etwa sieben, meist mindestens etwa zwölf und noch öfter mindestens etwa 20 Nucleotiden und eine Länge von nicht mehr als etwa 500, meist nicht mehr als etwa 50 und noch öfter nicht mehr als etwa 35 Nucleotiden auf, wobei die Länge bestimmt wird durch die Hemmwirkung, die Spezifität, einschließlich Fehlen von Kreuzreaktivität und dergleichen. Es wurde gefunden, dass kurze Oligonucleotide, mit einer Länge von sieben bis acht Basen, starke und selektive Inhibitoren der Genexpression sein können (vgl. Wagner et al., Nature Biotechnol. (1996) 14: 840-844).

Eine spezifische Region oder Regionen der endogenen mRNA-Sequenz des Sense-Strangs wird ausgewählt, die durch die Antisense-Sequenz komplementiert wird. Die Auswahl einer spezifischen Sequenz für das Oligonucleotid kann anhand einer empirischen Methode erfolgen, wobei verschiedene Sequenz-Kandidaten in einem in vitro-Modell oder in einem Tiermodell getestet werden, ob sie die Expression des Ziel-Gens hemmen. Außerdem kann eine Kombination von Sequenzen verwendet werden, wobei mehrere Regionen der mRNA-Sequenz für die Antisense-Komplementierung ausgewählt werden.

Antisense-Oligonucleotide können durch Verfahren chemisch synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. Wagner et al., (1993), vorstehend, und Milligan et al., vorstehend). Bei bevorzugten Oligonucleotiden ist die native Phosphodiester-Struktur chemisch modifiziert, wodurch ihre intrazelluläre Stabilität und ihre Bindungsaffinität erhöht werden. Mehrere solche Modifikationen wurden in der Literatur beschrieben, wobei die Chemie des Rückgrats, der Zucker oder der heterocyclischen Basen verändert wird.

Zu geeigneten Änderungen der Chemie des Rückgrats zählen Phosphor thioate; Phosphordithioate, wobei die beiden nicht-brückenbildenden Sauerstoff atome durch Schwefelatome ersetzt sind; Phosphoramidite; Alkylphosphotriester und Borphosphate. Achirale Phosphatderivate umfassen 3'-O'-5'-S-Phosphorthioat, 3'-S-5'-O-Phosphorthioat, 3'-CH2-5'-O-Phosphonat und 3'-NH-5'-O-Phosphoramidat. Bei Peptid-Nucleinsäuren wird das gesamte Ribosephosphodiester-Rückgrat durch eine Peptidbindung ersetzt. Außerdem werden Zuckermodifikationen verwendet, um die Stabilität und Affinität zu steigern. Das α-Anomer von Desoxyribose kann verwendet werden, wobei die Base im Vergleich zum natürlichen β-Anomer invertiert ist. Die Gruppe 2'-OH des Zuckers Ribose kann so verändert werden, dass 2'-O- Methyl- oder 2'-O-Allyl-Zucker gebildet wird, wodurch das Produkt gegen eine Spaltung resistent wird, ohne eine Affinität aufzuweisen. Modifikationen der heterocyclischen Basen müssen so erfolgen, dass noch die richtige Basenpaarung beibehalten wird. Einige geeignete Substitutionen umfassen Desoxyuridin für Desoxythymidin; 5-Methyl-2'-desoxycytidin und 5-Brom-2'-desoxycytidin für Desoxycytidin. Für 5-Propynyl-2'-desoxyuridin und 5-Propynyl-2'-desoxycytidin wurde gezeigt, dass sie die Affinität und die biologische Aktivität steigern, wenn sie anstelle von Desoxythymidin bzw. Desoxycytidin eingesetzt werden.

Als Alternative zu Antisense-Inhibitoren können katalytische Nucleinsäure- Verbindungen, z. B. Ribozyme, Antisense-Konjugate usw., eingesetzt werden, um die Genexpression zu hemmen. Es werden Ribozyme bereitgestellt, welche die Expression der vorstehenden erfindungsgemäßen Nucleinsäuren inhibieren. Ribozyme können in vitro synthetisiert und sodann dem Patienten verabreicht werden, oder sie können auf einem Expressionsvektor codiert werden, von dem aus das Ribozym in der Ziel-Zelle synthetisiert wird (vgl. z. B. die Internationale Patentanmeldung WO 9523225 und Beigelman et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23: 4434-4442). Beispiele von Oligonucleotiden mit katalytischer Aktivität werden in WO 9506764 beschrieben. Konjugate von Antisense-ODN mit einem Metallkomplex, z. B. Terpyridyl-Cu(II), die in der Lage sind, die Hydrolyse von mRNA zu vermitteln, werden in Bashkin et al., Appl. Biochem. Biotechnol. (1995) 54: 43-56, beschrieben.

Deshalb ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zum Modulieren der MPTS-Aktivität in einem Wirt, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, in dem dem Wirt eine wirksame Menge eines MPTS- modulatorischen Mittels verabreicht wird, oder insbesondere eines Verfahrens, wobei das modulatorische Mittel ein kleines Molekül, ein Antikörper oder eine Nulceinsäure ist. Insbesondere wird eine, erfindungsgemäße Nucleinsäure, eine Expressionskassette, ein Vektor, ein Polypeptid, ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Antikörperderivat oder Aptamer, ein Ribozym oder ein MPTS-modulatorisches Mittel, welches durch eines der Absuchverfahren identifiziert wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der MPTS-Aktivität verwendet. Weiterhin werden Arzneimittel bereitgestellt, die eine Nucleinsäure(n), Expressionskassette(n), Vektor(en), Polypeptid(e), Antikörper, Antikörperfragment(e), Antikörperderivat(e) oder Aptamer(e), Ribozym(e) wie hierein beschrieben oder ein MPTS-modulatorisches Mittel, welches nach einem der erfindungsgemäßen Absuchungverfahren identifiziert wurde, umfassen.

Wie vorstehend erwähnt wird dem Wirt eine wirksame Menge des Wirkstoffs an den Wirt verabreicht, wobei "wirksame Menge" eine ausreichende Dosierung bedeutet, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Im Allgemeinen stellt das gewünschte Ergebnis im Vergleich zu einer Kontrolle mindestens eine Verstärkung oder Reduktion der MPTS-Aktivität, z. B. der Aggrekanase-Aktivität, die durch die Produktion des Aggrekan-Spaltprodukts gemessen wird, dar.

In den vorliegenden Verfahren kann (können) dem Wirt der (die) Wirkstoff(e) unter Verwendung beliebiger geeigneter Hilfsmittel verabreicht werden, so dass die gewünschte Modulation der MPTS-Aktivität, z. B. die gewünschte Verringerung der Produktion des Aggrekan-Spaltprodukts, bewirkt wird. Hierfür kann das Mittel in verschiedene Formulierungen für die therapeutische Verabreichung eingearbeitet werden. Insbesondere können die Mittel der vorliegenden Erfindung zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, indem sie mit geeigneten pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln kombiniert werden, und sie können zu Präparaten in fester, halbfester, flüssiger Form oder als Gas formuliert werden, wie Tabletten, Kapseln, Pulvern, Granula, Salben, Lösungen, Suppositorien, Injektionslösungen, Inhalationspräparaten und Aerosolen.

Die Verabreichung der Mittel kann über verschiedene Routen erfolgen, umfassend eine orale, bukkale, rektale, parenterale, intraperitoneale, intradermale, transdermale, intratracheale usw. Verabreichung.

In pharmazeutischen Dosierungsformen können die Mittel in Form ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze appliziert werden, oder sie können alleine oder in geeigneter Verbindung, und auch in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen eingesetzt werden.

Für orale Präparate können die Mittel alleine oder in Kombination mit geeigneten Zusatzstoffen verwendet werden, um Tabletten, Pulver, Granula oder Kapseln herzustellen, z. B. mit herkömmlichen Zusatzstoffen, wie Lactose, Mannit, Maisstärke oder Kartoffelstärke; mit Bindemitteln, wie kristalline Zellulose, Zellulosederivate, Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatinen; mit Zerfallhilfsmitteln, wie Maisstärke, Kartoffelstärke oder Natriumcarboxymethylcellulose; mit Gleitmitteln, wie Talcum oder Magnesiumstearat; und, sofern gewünscht, mit Verdünnungsmitteln, Puffern, Feuchthaltemitteln, Konservierungsmitteln und Geschmacksstoffen.

Die Mittel können zu Präparaten für die Injektion formuliert werden, indem sie in einem wässrigen oder nicht-wässrigen Lösungsmittel, wie in einem pflanzlichen Öl oder in ähnlichen Ölen, synthetischen aliphatischen Säureglyceriden, Estern von höheren aliphatischen Säuren oder Propylenglykol, gelöst, suspendiert oder emulgiert werden; außerdem können, sofern gewünscht, herkömmliche Zusatzstoffe, wie Lösungsvermittler, isotonische Mittel, Suspensionsmittel, Emulgatoren, Stabilisatoren und Konservierungsmittel, zugefügt werden.

Die Mittel können in Aerosolformulierungen eingesetzt werden, die über Inhalation appliziert werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in unter Druck gesetzten, verträglichen Treibmittel, wie Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen, formuliert werden.

Außerdem können die Mittel in Suppositorien eingearbeitet werden, indem sie mit verschiedenen Grundstoffen gemischt werden, z. B. emulgierenden oder wasserlöslichen Grundstoffen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mittels eines Suppositoriums rektal verabreicht werden. Das Suppositorium kann Träger, wie Kakaobutter, Carbowachse und Polyethylenglykole, umfassen, die bei Körpertemperatur schmelzen, die jedoch bei Raumtemperatur in fester Form vorliegen.

Einheitsdosierungsformen für die orale oder rektale Applikation, wie Sirups, Elixiere und Suspensionen, können bereitgestellt werden, wobei jede Dosierungseinheit, z. B. Teelöffel, Esslöffel, Tablette oder Suppositorium, eine vorher festgelegte Menge der Zusammensetzung enthält, die einen oder mehrere Inhibitoren umfasst. Genauso können Einheitsdosierungsformen für die Injektion oder für die intravenöse Verabreichung den (die) Inhibitor(en) in einer Zusammensetzung als Lösung in sterilem Wasser, in normaler Kochsalzlösung oder in einem anderen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.

Der hier verwendete Begriff "Einheitsdosierungsform" bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als Dosierungseinheiten für menschliche und tierische Individuen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorher festgelegte Menge von Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die als eine Menge berechnet wird, die ausreicht, um die gewünschte Wirkung zu erzeugen, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel enthält. Die genauen Angaben für die neuen Einheitsdosierungsformen der vorliegenden Erfindung hängen ab von der jeweils verwendeten Verbindung und der Wirkung, die erreicht werden soll, und außerdem von der Pharmakodynamik, die jede Verbindung in dem jeweiligen Wirt zeigt.

Die pharmazeutisch verträglichen Trägersubstanzen, wie Vehikel, Hilfsmittel, Träger oder Verdünnungsmittel, sind für die Allgemeinheit einfach verfügbar. Außerdem sind pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffer, tonuseinstellende Mittel, Stabilisatoren, Feuchthaltemittel und dergleichen, für die Allgemeinheit einfach verfügbar.

Wenn das Mittel ein Polypeptid, Polynucleotid, ein Analogon oder ein Nachahmer davon ist, z. B. eine Antisense-Zusammensetzung, kann es über verschiedene Routen in Gewebe oder Wirtszellen eingeführt werden, umfassend virale Infektion, Mikroinjektion oder Fusion von Vesikeln. Außerdem kann eine intramuskuläre Injektion mittels Jet-Injektion erfolgen, wie von Furth et al., Anal. Biochem. (1992) 205: 365-368, beschrieben. Die DNA kann auf Mikropartikel aus Gold beschichtet und intradermal durch eine Partikelbeschuss-Vorrichtung oder "gene gun" freigesetzt werden, wie in der Literatur beschrieben (vgl., z. B. Tang et al., Nature (1992) 356: 152-154), wobei Gold-Mikroprojektile mit der therapeutischen DNA beschichtet und anschließend in Hautzellen geschossen werden.

Der Fachmann weiß, dass die Dosismengen abhängig von der spezifischen Verbindung, der Schwere der Symptome und der Empfänglichkeit des Individuums für Nebenwirkungen variieren können. Bevorzugte Dosierungen können für eine bestimmte Verbindung vom Fachmann auf unterschiedliche Art und Weise einfach bestimmt werden.

Die vorliegenden Verfahren können zur Behandlung der unterschiedlichsten Krankheitszustände, bei denen die MPTS-Aktivität beteiligt ist, eingesetzt werden, einschließlich Krankheitszustände, bei denen die Aggrekanase-Aktivität eine Rolle spielt. Von besonderem Interesse ist die Verwendung der vorliegenden Verfahren zur Behandlung von Krankheitszuständen, die durch das Vorliegen von Aggrekan- Spaltprodukten gekennzeichnet sind, insbesondere 60-kDa-Aggrekan- Spaltprodukten mit einem ARGS-N-Terminus. Spezifische Krankheiten, die durch das Vorliegen solcher Verfahren gekennzeichnet sind, umfassen: rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, infektiöse Arthritis, Gicht-Arthritis, Psoriasis-Arthritis, Spondolysis, Sportverletzung, Gelenktrauma, Lungenerkrankung, Fibrose und dergleichen.

Mit Behandlung ist zumindest eine Besserung der Symptome gemeint, die mit dem pathologischen Zustand, an dem der Wirt leidet, in Zusammenhang stehen, wobei Besserung sehr weit gefasst ist und sich mindestens auf eine Verringerung des Ausmaßes eines Parameters bezieht, z. B. eines Symptoms, das mit dem behandelten pathologischen Zustand in Zusammenhang steht, z. B. Hyperphosphatämie. Somit beinhaltet Behandlung auch Situationen, bei denen der pathologische Zustand, oder zumindest damit in Zusammenhang stehende Symptome, vollständig gehemmt werden, z. B. ihr Auftreten verhindert oder gestoppt, z. B. beendet wird, so dass der Wirt nicht länger an dem pathologischen Zustand oder zumindest an den Symptomen, die den pathologischen Zustand kennzeichnen, leidet.

Die verschiedensten Wirte können gemäß den vorliegenden Verfahren behandelt werden. Im Allgemeinen sind solche Wirte "Säuger" oder "Säugetiere", wobei diese Begriffe allgemein verwendet werden, um Organismen zu beschreiben, die zur Klasse der Säugetiere zählen, einschließlich Fleischfresser (z. B. Hunde und Katzen), Nager (z. B. Mäuse, Meerschweinchen und Ratten) und Primaten (z. B. Menschen, Schimpansen und Affen). In vielen Ausführungsformen sind die Wirte Menschen.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin einen Kit bereit, umfassend die Nucleinsäure(n), die Expressionskassette(n), die Vektor(en), Polypeptid(e), Antikörper, Antikörperfragment(e), Antikörperderivat(e), Aptamer(e), Ribozym(e) dieser Erfindung oder ein MPTS-modulatorisches Mittel, welches nach einem der erfindungsgemäßen Absuchungverfahren identifiziert wurde.

Kits mit Einheitsdosierungen des Wirkstoffs, üblicherweise in oralen oder injizierbaren Dosierungen, werden bereitgestellt. Solche Kits enthalten zusätzlich zu den Behältern mit den Einheitsdosierungen noch einen informellen Beipackzettel, auf dem die Verwendung und der damit einhergehende Nutzen der Arzneistoffe bei der Behandlung des pathologischen Zustands von Interesse beschrieben werden. Bevorzugte Verbindungen und Einheitsdosierungen werden vorstehend beschrieben.

Schließlich stellt eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung folgendes dar:

a) Ein Screening-Verfahren zum Identifizieren von MPTS-modulatorische Mitteln, wobei das Verfahren folgendes umfasst: das Inkontaktbringen eines MPTS-Proteins wie hier definiert mit einem Substrat in Gegenwart eines möglicherweise modulierenden Mittels; und das Bestimmen der Wirkung des modulierenden Mittels auf die Aktivität des Proteins.
b) Das Verfahren ist wie in (i) definiert, wobei das Substrat eine Glu-Ala- Bindung enthält.
c) Das Verfahren ist wie in (ii) definiert, wobei das Substrat Aggrekan oder ein Fragment davon ist.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Wirts, der an einem Krankheitszustand leidet, der mit einer MPTS-Aktivität in Zusammenhang steht, wobei dieser Krankheitszustand insbesondere durch das Vorliegen von Aggrekan-Spaltprodukten gekennzeichnet ist, wobei das Verfahren den Schritt umfasst, in dem dem Wirt ein MPTS- modulatorischen Mittel, insbesondere ein Antagonist, verabreicht wird, sowie die Verwendung eines MPTS-modulatorischen Mittel, das durch das hier vorstehend beschriebene Verfahren erhalten werden kann oder erhalten wird, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Krankheitszustands, der mit einer MPTS-Aktivität in Zusammenhang steht, wobei der Krankheitszustand insbesondere durch das Vorliegen von Aggrekan-Spaltprodukten gekennzeichnet ist, wie Arthritis.

Beispiele Beispiel 1

Ein Nucleinsäure-Array wurde erstellt, das 699 bekannte Metall-Proteinase- Gene und neue ESTs enthielt, die aus öffentlichen und nicht-öffentlichen Datenbanken erhalten wurden. Diese im Array enthaltenen Sequenzen wurden anhand eines Subsets bekannter Metall-Protease-Proteinsequenzen abgesucht. Diese Proteinsequenzen wurden genutzt, um auf Protein(Codon)-Ebene übereinstimmende Sequenzen im menschlichen Nucleotid zu finden. Redundante Sequenzen wurden eliminiert, die verbleibenden Sequenzen zusammengestellt und abgetrennt und anschließend der einmalige Satz von 699 Sequenzen in einem Array abgelegt.

Mit Hilfe des erhaltenen Arrays wurden die in Primärkulturen von Chondrocyten exprimierten Gene abgesucht. Eine ganze Reihe von Metall- Proteinasen, die bekannterweise durch diese Zellen exprimiert werden, wurde identifiziert. Jedoch wurden dabei auch verschiedene ESTs für neue Proteine identifiziert. Unter Verwendung dieser ESTs für die anschließende Datenbank-Suche und bei PCR-Protokollen wurden vier unterschiedliche menschliche MPTS-Proteine identifiziert, d. h. MPTS-15, MPTS-10, MPTS-19 und MPTS-20.

Beispiel 2 Expression von MPTS-10

Ein Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-10 ist das COS-7- Säugerzellsystem. Die Nucleotidsequenz, die mpts-10 codiert, einschließlich der Sekretions-Signalsequenz, wurde in ein pcDNA3.1-Plasmid (In Vitrogen, Carbsbad, CA, USA) ligiert. 2 µg des resultierenden Plasmids wurden mit Lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA) kombiniert. Anschließend wurde das Gemisch zu COS-7-Zellen zugegeben, die in Platten mit sechs Vertiefungen bis zu einer Dichte von etwa 90% Konfluenz gezüchtet wurden. Nach sechs Stunden wurde den Zellen frisches Medium zugefügt, und nach 24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit frischem serumfreiem Medium versetzt, das Rinder-Aggrekan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Zellen wurden weitere 48 Stunden inkubiert. 500 µl Kulturflüssigkeit wurden aus jeder Vertiefung entnommen und zehnfach eingeengt. Sodann wurden 2 µl Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) zugegeben und die Proben über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben in SDS-PAGE-Probenauftragepuffer gekocht, einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel unterworfen und auf eine PVDF- Membran überführt. Sodann wurde ein Western-Blot durchgeführt, bei dem ein Antiserum gegen ein Neoepitop verwendet wurde, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-10 stellt das Baculovirus-Expressionssystem dar. Die DNA-Sequenz, die die codierende Sequenz für mpts-10 enthielt (einschließlich der Sequenzen, die die Sekretions-Signalse quenz codieren) und die in den pcDNA3.1-Vektor cloniert worden war, wurde durch PCR so modifiziert, dass die codierende Sequenz und das translationale Stopp- Codon durch Not1 (N-terminale Seite) und Sfi1 (C-terminale Seite) flankiert waren. Der für das N-terminaie Ende verwendete Primer war
GATCGCGGCCGCTATGGTGGACACGTGGCCTCTATGGCTCC,
und der Primer für das C-terminale Ende war
TGAGGCCTTCAGGGCCGATCACTGTGCAGAGCACTCACCCCAT. Nach Amplifikation unter Verwendung herkömmlicher PCR-Verfahren wurde das Fragment mit Not1 und Sfi1 gespalten. Das gespaltene Fragment wurde in einen Vektor pVL1392-U ligiert, der auch mit Not1 und Sfi1 gespalten worden war. PVL1392-U stammt von dem Baculovirus-Transferplasmid pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA, USA), bei dem die multiple Clonierungsstelle so verändert worden war, dass sie Not1 und Sfi1 enthielt. Die durch die Spaltung mit Not1 und Sfi1 erzeugten Überhänge waren zu den Überhängen komplementär, die in der mit Not1 und Sfi1 gespaltenen, PCR-amplifizierten DNA erzeugt wurden. Die ligierte DNA wurde in Bakterienzeilen transformiert und ein Clon ausgewählt, der das Plasmid und die korrekte mpts-10-Sequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde hergestellt und gereinigt. Die mpts-10-Sequenz wurde anhand von Standardtechniken in einen Baculovirus- Vektor übertragen (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, von David O'Reilly, Lois Miller, und Verne Luckow, W. H. Freeman und Co., New York, USA). Aus dem Viruspräparat wurden fünf Plaques-gereinigte Viruspräparate hergestellt. In Suspension wachsende Sf9-Insektenzellen wurden mit jedem der Plaques gereinigten Viruspräparate bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert. Die Kulturflüssigkeit wurde drei Tage nach der Infektion geerntet. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Verfahren für die Expression von mpts-10 stellt das Drosophila- Expressionssystem dar. Das DNA-Fragment, das die mpts-10-codierenden Sequenzen enthält, die durch Not1 und Sfi1 flankiert sind, das durch PCR erzeugt worden war (vgl. vorstehend), wurde in das Plasmid Cmk33 cloniert. Cmk33 ist ein Plasmid, das von pMK33/pMtHy (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996) 313: 57-64) hergeleitet wurde, so dass Not1 und Sfi1 in der Clonierungsstelle lagen. Die durch die Spaltung dieses Plasmids erzeugten Überhänge sind mit den Überhängen kompatibel, die in der gespaltenen, das mpts-10-Fragment enthaltenden DNA erzeugt wurden (vgl. vorstehend). Ein Plasmid, das die korrekte Sequenz von mpts- 10 enthielt, wurde amplifiziert und gereinigt. Drosophila (S2)-Zellen wurden mit dem Plasmid anhand von Standardtechniken transformiert (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996), 313, 57-64). Die Kulturflüssigkeit wurde zwei Tage nach der Transfektion abgenommen. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Beispiel 3 Expression von MPTS-15

Ein Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-15 ist das COS-7- Säugerzellsystem. Die Nucleotidsequenz, die mpts-15 codiert, einschließlich der Sekretions-Signalsequenz, wurde in ein pcDNA3.1-Plasmid (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA) ligiert. 2 µg des resultierenden Plasmids wurden mit Lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA) vereinigt. Anschließend wurde das Gemisch zu COS-7-Zellen zugegeben, die in Platten mit sechs Vertiefungen bis zu einer Dichte von etwa 90% Konfluenz gezüchtet wurden. Nach sechs Stunden wurde frisches Medium zu den Zellen zugefügt, und nach 24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit frischem serumfreiem Medium versetzt, das Rinder-Aggrekan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Zellen wurden weitere 48 Stunden inkubiert. 500 µl Kulturflüssigkeit wurden aus jeder Vertiefung entnommen und zehnfach eingeengt. Sodann wurden 2 µl Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) zugegeben und die Proben über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben in SDS-PAGE-Probenauftragepuffer gekocht, einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterworfen und auf eine PVDF-Membran überführt. Sodann wurde ein Western-Blot durchgeführt, bei dem ein Antiserum gegen ein Neoepitop verwendet wurde, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-15 stellt das Baculovirus-Expressionssystem dar. Die DNA-Sequenz, die die codierende Sequenz für mpts-15 enthielt (einschließlich der Sequenzen, die die Sekretions-Signalse quenz codieren) und die in den pcDNA3.1-Vektor cloniert worden war, wurde durch PCR so modifiziert, dass die codierende Sequenz und das translationale Stopp- Codon durch Not1 (N-terminale Seite) und Sfi1 (C-terminale Seite) flankiert waren. Der für das N-terminale Ende verwendete Primer war
GATCGCGGCCGCTATGGAAATTTTGTGGAAGACGTTG,
und der Primer für das C-terminale Ende war
TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTTAAAGCAAAGTTTCTTTTGGT. Nach Amplifikation unter Verwendung herkömmlicher PCR-Verfahren wurde das Fragment mit Not1 und Sfi1 gespalten. Das gespaltene Fragment wurde in einen Vektor pVL1392-U ligiert, der auch mit Not1 und Sfi1 gespalten worden war. PVL1392-U stammt von dem Baculovirus-Transferplasmid pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA, USA), bei dem die multiple Clonierungsstelle so verändert worden war, dass sie Not1 und Sfi1 enthielt. Die durch die Spaltung mit Not1 und Sfi1 erzeugten Überhänge waren zu den Überhängen komplementär, die in der mit Not1 und Sfi1 gespaltenen, PCR-amplifizierten DNA erzeugt wurden. Die ligierte DNA wurde in Bakterienzellen transformiert und ein Clon ausgewählt, der das Plasmid und die korrekte mpts-15-Sequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde hergestellt und gereinigt. Die mpts-15-Sequenz wurde anhand von Standardtechniken in einen Baculovirus- Vektor übertragen (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, von David O'Reilly, Lois Miller, und Verne Luckow, W. H. Freeman und Co., New York, USA). Aus dem Viruspräparat wurden fünf Plaques-gereinigte Viruspräparate hergestellt. In Suspension wachsende Sf9-Insektenzellen wurden mit jedem der Plaques gereinigten Viruspräparate bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert. Die Kulturflüssigkeit wurde drei Tage nach der Infektion geerntet. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Verfahren für die Expression von mpts-15 stellt das Drosophila- Expressionssystem dar. Das DNA-Fragment, das die mpts-15-codierenden Sequenzen enthält, die durch Not1 und Sfi1 flankiert sind, das durch PCR erzeugt worden war (vgl. vorstehend), wurde in das Plasmid Cmk33 cloniert. Cmk33 ist ein Plasmid, das von pMK33/pMtHy (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996) 313: 57-64) hergeleitet wurde, so dass Not1 und Sfi1 in der Clonierungsstelle lagen. Die durch die Spaltung dieses Plasmids erzeugten Überhänge sind mit den Überhängen kompatibel, die in der mit Not1 und Sfi1 gespaltenen, das mpts-15-Fragment enthaltenden DNA erzeugt wurden (vgl. vorstehend). Ein Plasmid, das die korrekte Sequenz von mpts-15 enthielt, wurde amplifiziert und gereinigt. Drosophila (52)- Zellen wurden mit dem Plasmid anhand von Standardtechniken transformiert (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996), 313, 57-64). Die Kulturflüssigkeit wurde zwei Tage nach der Transfektion abgenommen. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Beispiel 4 Expression von MPTS-19

Ein Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-19 ist das COS-7- Säugerzellsystem. Die Nucleotidsequenz, die mpts-19 codiert, einschließlich der Sekretions-Signalsequenz und des C-terminalen Stopp-Codons, wurde in ein pcDNA3.1-Plasmid (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA) ligiert. 2 µg des resultierenden Plasmids wurden mit Lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA) vereinigt. Anschließend wurde das Gemisch COS-7-Zellen zugegeben, die in Platten mit sechs Vertiefungen bis zu einer Dichte von etwa 90% Konfluenz gezüchtet wurden. Nach sechs Stunden wurde den Zellen frisches Medium zugefügt, und nach 24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit frischem serumfreiem Medium versetzt, das Rinder-Aggrekan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Zellen wurden weitere 48 Stunden inkubiert. 500 µl Kulturflüssigkeit wurden aus jeder Vertiefung entnommen und zehnfach eingeengt. Sodann wurden 2 µl Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) zugegeben und die Proben über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben in SDS-PAGE-Probenauftragepuffer gekocht, einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel unterworfen und auf eine PVDF-Membran überführt. Sodann wurde ein Western-Blot durchgeführt, bei dem ein Antiserum gegen ein Neoepitop verwendet wurde, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-19 stellt das Baculovirus-Expressionssystem dar. Die DNA-Sequenz, die die codierende Sequenz für mpts-19 enthielt (einschließlich der Sequenzen, die die Sekretions-Signalse quenz codieren) und die in den pcDNA3.1-Vektor cloniert worden war, wurde durch PCR so modifiziert, dass die codierende Sequenz und das translationale Stopp- Codon durch Not1 (N-terminale Seite) und Sfi1 (C-terminale Seite) flankiert waren. Der für das N-terminale Ende verwendete Primer war
GATCGCGGCCGCTATGCCCGGCGGCCCCAGTCCCCG,
und der Primer für das C-terminale Ende war
TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTCAGCGGCGGGCAACCCGCTG. Nach Amplifikation unter Verwendung herkömmlicher PCR-Verfahren wurde das Fragment mit Not1 und Sfi1 gespalten. Das gespaltene Fragment wurde in einen Vektor pVL1392-U ligiert, der auch mit Not1 und Sfi1 gespalten worden war. PVL1392-U stammt von dem Baculovirus-Transferplasmid pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA, USA), bei dem die multiple Clonierungsstelle so verändert worden war, dass sie Not1 und Sfi1 enthielt. Die durch die Spaltung mit Not1 und Sfi1 erzeugten Überhänge waren zu den Überhängen komplementär, die in der mit Not1 und Sfi1 gespaltenen, PCR-amplifizierten DNA erzeugt wurden. Die ligierte DNA wurde in Bakterienzellen transformiert und ein Clon ausgewählt, der das Plasmid und die korrekte mpts-19-Sequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde hergestellt und gereinigt. Die mpts-19-Sequenz wurde anhand von Standardtechniken in einen Baculovirus- Vektor übertragen (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, von David O'Reilly, Lois Miller, und Verne Luckow, W. H. Freeman und Co., New York, USA). Aus dem Viruspräparat wurden fünf Plaques-gereinigte Viruspräparate hergestellt. In Suspension wachsende Sf9-Insektenzellen wurden mit jedem der Plaques gereinigten Viruspräparate bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert. Die Kulturflüssigkeit wurde drei Tage nach der Infektion geerntet. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Verfahren für die Expression von mpts-19 stellt das Drosophila- Expressionssystem dar. Das DNA-Fragment, das die mpts-19-codierenden Sequenzen enthält, die durch Not1 und Sfi1 flankiert sind, das durch PCR erzeugt worden war (vgl. vorstehend), wurde in das Plasmid Cmk33 cloniert. Cmk33 ist ein Plasmid, das von pMK33/pMtHy (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996) 313: 57-64) hergeleitet wurde, so dass Not1 und Sfi1 in der Clonierungsstelle lagen. Die durch die Spaltung dieses Plasmids mit Not1 und Sfi1 erzeugten Überhänge sind mit den Überhängen kompatibel, die in der gespaltenen, das mpts-19-Fragment enthaltenden DNA erzeugt wurden (vgl. vorstehend). Ein Plasmid, das die korrekte Sequenz von mpts-19 enthielt, wurde amplifiziert und gereinigt. Drosophila (S2)- Zellen wurden mit dem Plasmid anhand von Standardtechniken transformiert (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996), 313, 57-64). Die Kulturflüssigkeit wurde zwei Tage nach der Transfektion abgenommen. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Beispiel 5 Expression von MPTS-20

Ein Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-20 ist das COS-7- Säugerzellsystem. Die Nucleotidsequenz, die mpts-10 codiert, einschließlich der Sekretions-Signalsequenz und des C-terminalen Stopp-Codons, wurde in ein pcDNA3.1-Plasmid (In Vitrogen, Carlsbad, CA, USA) ligiert. 2 µg des resultierenden Plasmids wurden mit Lipofectamine (Life Technologies, Rockville, MD, USA) vereinigt. Anschließend wurde das Gemisch COS-7-Zellen zugegeben, die in Platten mit sechs Vertiefungen bis zu einer Dichte von etwa 90% Konfluenz gezüchtet wurden. Nach sechs Stunden wurde den Zellen frisches Medium zugefügt, und nach 24 Stunden wurden die Zellen gewaschen und mit frischem serumfreiem Medium versetzt, das Rinder-Aggrekan (0,1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) enthielt. Die Zellen wurden weitere 48 Stunden inkubiert. 500 µl Kulturflüssigkeit wurden aus jeder Vertiefung entnommen und zehnfach eingeengt. Sodann wurden 2 µl Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) zugegeben und die Proben über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben in SDS-PAGE-Probenauftragepuffer gekocht, einer Elektrophorese auf einem Polyacrylamid-Gel unterworfen und auf eine PVDF-Membran überführt. Sodann wurde ein Western-Blot durchgeführt, bei dem ein Antiserum gegen ein Neoepitop verwendet wurde, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Beispiel eines Systems für die Expression von mpts-20 stellt das Baculovirus-Expressionssystem dar. Die DNA-Sequenz, die die codierende Sequenz für mpts-20 enthielt (einschließlich der Sequenzen, die die Sekretions-Signalse quenz codieren) und die in den pcDNA3.1-Vektor cloniert worden war, wurde durch PCR so modifiziert, dass die codierende Sequenz und das translationale Stopp- Codon durch Not1 (N-terminale Seite) und Sfi1 (C-terminale Seite) flankiert waren. Der für das N-terminale Ende verwendete Primer war
GATCGCGGCCGCTGCGCTGTGATGAGTGTGCCTG,
und der Primer für das C-terminaie Ende war
TGAGGCCTTCAGGGCCGATCTTATAAAGGCCTTGAGAAAACAG. Nach Amplifikation unter Verwendung herkömmlicher PCR-Verfahren wurde das Fragment mit Not1 und Sfi1 gespalten. Das gespaltene Fragment wurde in einen Vektor pVL1392-U ligiert, der auch mit Not1 und Sfi1 gespalten worden war. PVL1392-U stammt von dem Baculovirus-Transferplasmid pVL1392 (PharMingen, San Diego, CA, USA), bei dem die multiple Clonierungsstelle so verändert worden war, dass sie Not1 und Sfi1 enthielt. Die durch die Spaltung mit Not1 und Sfi1 erzeugten Überhänge waren zu den Überhängen komplementär, die in der mit Not1 und Sfi1 gespaltenen, PCR-amplifizierten DNA erzeugt wurden. Die ligierte DNA wurde in Bakterienzellen transformiert und ein Clon ausgewählt, der das Plasmid und die korrekte mpts-20-Sequenz enthielt. Dieses Plasmid wurde hergestellt und gereinigt. Die mpts-20-Sequenz wurde anhand von Standardtechniken in einen Baculovirus- Vektor übertragen (Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, von David O'Reilly, Lois Miller, und Verne Luckow, W. H. Freeman und Co., New York, USA). Aus dem Viruspräparat wurden fünf Plaques-gereinigte Viruspräparate hergestellt. In Suspension wachsende Sf9-Insektenzellen wurden mit jedem der Plaques- gereinigten Viruspräparate bei einer Multiplizität von 0,5 infiziert. Die Kulturflüssigkeit wurde drei Tage nach der Infektion geerntet. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Ein weiteres Verfahren für die Expression von mpts-20 stellt das Drosophila- Expressionssystem dar. Das DNA-Fragment, das die mpts-20-codierenden Sequenzen enthält, die durch Not1 und Sfi1 flankiert sind, das durch PCR erzeugt worden war (vgl. vorstehend), wurde in das Plasmid Cmk33 cloniert. Cmk33 ist ein Plasmid, das von pMK33/pMtHy (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996) 313: 57-64) hergeleitet wurde, so dass Not1 und Sfi1 in der Clonierungsstelle lagen. Die durch die Spaltung dieses Plasmids mit Not1 und Sfi1 erzeugten Überhänge sind mit den Überhängen kompatibel, die in der gespaltenen, das mpts-20-Fragment enthaltenden DNA erzeugt wurden (vgl. vorstehend). Ein Plasmid, das die korrekte Sequenz von mpts-20 enthielt, wurde amplifiziert und gereinigt. Drosophila (S2)- Zellen wurden mit dem Plasmid anhand von Standardtechniken transformiert (Li, Bin et al., Biochem. J. (1996), 313, 57-64). Die Kulturflüssigkeit wurde zwei Tage nach der Transfektion abgenommen. Diese Proben wurden auf Aggrekanase-Aktivität getestet, indem sie mit Rinder-Aggrekan (Sigma, St. Louis, MO, USA) bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml inkubiert wurden. Anschließend wurden die Proben mit Chondroitinase ABC und Keratinase (10 U/ml) bei 37°C über Nacht inkubiert. Sodann wurden die Proben durch Western-Blotting untersucht, wobei ein Antiserum verwendet wurde, das mit einem Neoepitop reagiert, welches bei der Spaltung von Aggrekan durch Aggrekanase erzeugt wird.

Beispiel 6 Reinigung von mpts-10, -15, 19 und 20

Mpts-10, 15, 19 und 20 wurden aus der Kulturflüssigkeit der vorstehend beschriebenen Expressionssysteme durch chromatographische Verfahren gereinigt. Beispielsweise wurde der pH-Wert der Kulturflüssigkeit eingestellt, sodann die Kulturflüssigkeit filtriert und anschließend auf eine mit Sulfopropyl-Sepharose FF (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) gepackte Säule aufgetragen. Nach Waschen mit einem Puffer, der aus 10 mM CaCl₂, 0,1 M NaCl und 0,05% Brij35 bestand und einen pH-Wert aufwies, der zur Retention der mpts-Proteine auf der Säule führt, wurden die mpts mit einem Gradienten von 0,1 bis 1,0 M NaCl eluiert. Die Fraktionen aus der Säule wurden auf das Vorliegen der Aggrekanase- Aktivität wie vorstehend beschrieben getestet und gewonnen. Für die Reinigung kann auch eine mit Phenyl-Sepharose oder Sephacryl S-200 gepackte Säule verwendet werden.

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, codierend eine Metalloprotease mit Thrombospondin- Domäne(n) (MPTS-Proteine), ausgewählt aus der Gruppe aus

a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid codieren, das die unter SEQ ID NO.: 1, 3, 5 oder 7 angegebene Aminosäuresequenz umfasst;
b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID NO.: 2, 4, 6 oder 8 angegebene Nucleotidsequenz umfasst;
c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Polypeptid codieren, das mindestens 35%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95% oder am meisten bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität mit der unter SEQ ID NO.: 1, 3, 5 oder 7 angegebenen Aminosäuresequenz aufweist;
d) Nucleinsäuremolekülen, die eine Sequenzhomologie von mindestens 75%, von mindestens 90%, meist bevorzugt von mindestens 95% mit der unter SEQ ID NO.: 2, 4, 6 oder 8 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist;
e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem komplementären Strang, der unter (a), (b), (c) oder (d) genannten Nucleinsäuremolekülen unter stringenten Bedingungen hybridisieren; und
f) Nucleinsäuremolekülen, die ein Fragment und/oder Fragmente, die funktionellen Domänen entsprechen, einer Nucleotidsequenz von (a), (b), (c), (d) oder (e) umfassen.

2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein MPTS-15, MPTS-10, MPTS-19 oder MPTS-20 Protein codiert.

3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, das ein DNA-Molekül ist.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, das ein cDNA-Molekül oder genomische DNA ist.

5. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, das ein RNA-Molekül ist.

6. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das von einem Säuger, aus einer Hefe von einem Nematoden, von Drosophila oder von einem Zebrafisch stammt.

7. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei das Nucleinsäuremolekül von einem Primaten, von einem Menschen, von einem Nager, von einer Ratte, von einer Maus, von einem Hund, von einer Katze, von einem Rind, von einem Schaf oder von einem Pferd stammt.

8. Nucleinsäuremolekül, das komplementär zu einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 ist.

9. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das ein Antisense-Molekül ist.

10. Expressionskassette, umfassend eine transkriptionale Inititationsregion, eine Nucleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 unter der transkriptionalen Regulation der transkriptionalen Initiationsregion und eine, in einem Expressionswirt funktionelle, transkriptionale Terminationsregion.

11. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und/oder enthaltend eine Expressionskassette nach Anspruch 10.

12. Vektor nach Anspruch 11, wobei das Nucleinsäuremolekül mit regulatorischen Elementen operativ verknüpft ist, die die Transkription und Synthese einer translatierbaren RNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

13. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, eine Expressionskassette nach Anspruch 10 oder einem Vektor nach einem der Ansprüche 11 oder 12 transformiert ist oder von einer solchen Zelle abstammt.

14. Verfahren zur Herstellung eines MPTS-Proteins, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 13 und Isolierung des Proteins.

15. Polypeptid codiert von einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 14.

16. Antikörper, Antikörperfragment, Antikörperderivat oder Aptamer, der/das spezifisch ein Polypeptid nach Anspruch 15 erkennt.

17. Antikörper, Antikörperfragment oder Antikörperderivat nach Anspruch 16 ausgewählt aus der Gruppe aus monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, xenogenen Antikörpern, chimeren Antikörpern, einzelkettigen Antikörpern, Fv-Fragmenten, F(ab')₂-Fragmenten, Fab-Fragmenten.

18. Hybridomazellen, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 17 erzeugen.

19. Ribozym, das die Expression einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 7 inhibiert.

20. Absuchungsverfahren zum Identifizieren von MPTS-modulatorischen Mitteln, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines Polypeptids nach Anspruch 15 mit einem Substrat in Gegenwart eines möglichen modulatorischen Mittels und die Bestimmung der Wirkung des modulatorischen Mittels auf die Aktivität des Polypeptids umfasst.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Substrat eine Glu-Ala-Bindung umfaßt.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Substrat Aggrekan oder ein Fragment davon ist.

23. Verfahren zum Identifizieren von Agonisten oder Antagonisten eines Polypeptids nach Anspruch 15 umfassend:

a) Herstellen von Zellen, die das Polypeptid nach Anspruch 15 exprimieren;
b) Inkontaktbringen des Polypeptids, das in Schritt (a) hergestellt wird, mit einer Probe, welche möglicherweise einen Antagonisten oder Agonisten enthält; und
c) Identifizierung eines Antagonisten oder Agonisten durch Beobachtung von einer Bindung und Inhibierung oder Stimulierung der biologischen Aktivität des Polypeptids.

24. Verfahren zum Identifizieren eines Bindungspartners des Polypeptids nach Anspruch 15, umfassend:

a) Inkontaktbringen des Polypeptids nach Anspruch 15 mit einem Bindungspartner; und
b) Bestimmen, ob der Bindungspartner eine Aktivität des Polypeptids bewirkt.

25. Verwendung eines MPTS-modulatorischen Mittels, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24 erhalten werden kann oder erhalten wird, zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Krankheitszustands, der mit der MPTS-Aktivität in Zusammenhang steht, wobei der Krankheitszustand insbesondere durch das Vorliegen von Aggrekan-Spaltprodukten gekennzeichnet ist.

26. Verwendung eines MPTS-modulatorischen Mittels, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 24 erhalten werden kann oder erhalten wird zur Herstellung eines Medikamentes zur Modulierung der MPTS-Aktivität.

27. Verwendung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Modulierung eine Verstärkung oder Hemmung der MPTS-Aktivität umfaßt.

28. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das MPTS- modulatorische Mittel ein Antagonist oder ein Agonist ist.

29. Verwendung nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei der Krankheitszustand Arthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, infektiöse Arthritis, Gicht-Arthritis, Psoriasis-Arthritis, Spondolysis, Sportverletzung, Gelenktrauma oder Fibrose ist.

30. Verwendung einer Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Expressionskassette nach Anspruch 10, eines Vektors nach Anspruch 11 oder 12, eines Polypeptids nach Anspruch 15, eines Antikörpers, Antikörperfragments, Antikörperderivats, oder Aptamers nach Anspruch 16 oder 17, eines Ribozyms nach Anspruch 19 oder eines MPTS- modulatorischen Mittels identifiziert nach einem der Ansprüche 20 bis 24 zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der MPTS-Aktivität.

31. Arzneimittel, umfassend eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Expressionskassette nach Anspruch 10, eines Vektors nach Anspruch 11 oder 12, eines Polypeptids nach Anspruch 15, eines Antikörpers, Antikörperfragments, Antikörperderivats, oder Aptamers nach Anspruch 16 oder 17, eines Ribozyms nach Anspruch 19 oder eines MPTS- modulatorischen Mittels identifiziert nach einem der Ansprüche 20 bis 24.

32. Kit umfassend ein eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9, einer Expressionskassette nach Anspruch 10, eines Vektors nach Anspruch 11 oder 12, eines Polypeptids nach Anspruch 15, eines Antikörpers, Antikörperfragments, Antikörperderivats, oder Aptamers nach Anspruch 16 oder 17, eines Ribozyms nach Anspruch 19 oder eines MPTS- modulatorischen Mittels identifiziert nach einem der Ansprüche 20 bis 24.