DE10100246A1 - Mikroskop und Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops - Google Patents
Mikroskop und Verfahren zum Betreiben eines MikroskopsInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere ein konfokales oder doppelkonfokales Rastermikroskop, sowie ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops, wobei mindestens eine dem Objekt zugeordnete Objektträgereinheit vorgesehen ist, wobei mindestens ein in seiner Ausgestaltung bekanntes Referenzobjekt vorgesehen ist und wobei das Referenzobjekt zur Kalibrierung, Justierung und/oder Einstellung des Mikroskops lichtmikroskopisch detektierbar ist. Mit dem erfindungsgemäßen Mikroskop bzw. mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops können driftbedingte Veränderungen detektiert und ausgeglichen werden. Weiterhin sind Hilfsmittel vorgesehen, mit denen ein Objekt einfach und zuverlässig fokussiert werden kann.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop, insbesondere ein konfokales
oder doppelkonfokales Rastermikroskop, sowie ein Verfahren zum Betreiben
eines Mikroskops.
Mikroskope, insbesondere, konfokale Rastermikroskope sind seit geraumer
Zeit aus der Praxis bekannt. Hinsichtlich der konfokalen Rastermikroskope
wird auf "Handbook of Biological Confocal Microscopy", Plenum Press 1995,
2 nd Edition, Editor: J. B. Pawley, hinsichtlich doppelkonfokaler Raster
mikroskope wird auf die EP 0 491 289 A1 verwiesen.
Die Mikroskope der gattungsbildenden Art werden insbesondere für Aufnah
men biomedizinischer Objekte eingesetzt, wo Objektdetektionen durchaus
einen längeren Zeitraum in Anspruch nehmen können. Bei konfokalen und
insbesondere bei doppelkonfokalen Rastermikroskopen unterliegen jedoch die
einzelnen Komponenten des Mikroskop sowie das Objekt relativ zum Objektiv
thermisch bedingten Drifts, so dass länger andauernde Objektdetektionen
hierdurch fehlerbehaftet sein können.
Insbesondere bei konfokalen und doppelkonfokalen Rastermikroskopen ist
nach dem Einlegen einer neuen Probe die Fokussierung der neuen Probe
zeitaufwendig und fordert ein hohes Maß an Geschicklichkeit des Benutzers.
Dies ist insbesondere der Fall, wenn nicht bekannt ist, ob die Probe überhaupt
sichtbar sein wird - weil beispielsweise ein neues Fluoreszenz-Präparations
verfahren getestet wird. So kann das Auffinden des Objekts bzw. das Positio
nieren des Objekts in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs schwer, wenn
nicht sogar unmöglich sein. Insbesondere wenn ein neues Fluoreszenz-Prä
parationsverfahren getestet wird, kann ein Objekt mit einer schwachen Fluo
reszenzmarkierung schon ausgeblichen sein bevor sich das Objekt in der Fo
kalebene des Mikroskopobjektivs befindet, da während des Suchvorgangs der
Objektbereich andauernd mit zur Anregung der Fluoreszenzmarker geeigne
tem Licht beaufschlagt wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop,
insbesondere ein konfokales oder doppelkonfokales Rastermikroskop, sowie
ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops anzugeben und weiterzubil
den, bei dem driftbedingte Veränderungen detektiert und ausgeglichen
werden können sowie Hilfsmittel vorgesehen sind, mit denen ein Objekt
einfach und zuverlässig fokussiert werden kann.
Das erfindungsgemäße Mikroskop der gattungsbildenden Art löst die voran
stehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach han
delt es sich bei dem erfindungsgemäßen Mikroskop, insbesondere um ein
konfokales oder doppelkonfokales Rastermikroskop, wobei mindestens eine
dem Objekt zugeordnete Objektträgereinheit vorgesehen ist, wobei min
destens ein in seiner Ausgestaltung bekanntes Referenzobjekt vorgesehen ist
und wobei das Referenzobjekt zur Kalibrierung, Justierung und/oder Einstel
lung des Mikroskops lichtmikroskopisch detektierbar ist.
Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass die vor allem thermisch
bedingten Driftbewegungen verschiedener Komponenten des Mikroskops
bzw. des Objekts relativ zum Objektiv mit einem vertretbaren Aufwand nicht
verhindert werden können, beispielsweise durch eine entsprechende Tempe
raturregelung der relevanten Mikroskopkomponenten. Falls jedoch zumindest
ein in seiner Ausgestaltung bekanntes Referenzobjekt vorgesehen ist, anhand
dessen Rückschlüsse auf Driftbewegungen gezogen werden können, kann
hierdurch die Drift durch entsprechende Justiermaßnahmen kompensiert bzw.
ausgeglichen werden. Hierzu muss das Referenzobjekt in seiner Ausgestal
tung bekannt sein, d. h. die Größe, Form, Struktur und/oder optischen Eigen
schaften des Referenzobjekts sind bekannt. Weiterhin muss das Referenzob
jekt lichtmikroskopisch detektierbar sein, was notwendigerweise einen Detek
tionsvorgang des Referenzobjekts notwendig macht. In erfindungsgemäßer
Weise kann durch lichtmikroskopische Detektion des in seiner Ausgestaltung
bekannten Referenzobjekts das Mikroskop erneut justiert werden.
Insbesondere kann ein Objekt in einem konfokalen oder doppelkonfokalen
Rastermikroskop einfach aufgefunden und fokussiert werden, wenn als Refe
renzobjekt beispielsweise ein teilweise verspiegelt beschichtetes Deckglas
verwendet wird und das Objekt samt Objektträgereinheit und Deckglas entlang
der optischen Achse des Mikroskopobjektivs bewegt wird, wobei während
der Bewegung fortwährend kontinuierlich nach dem Referenzobjekt gesucht
wird. Dieser Detektionsvorgang könnte beispielsweise mit Licht einer
Wellenlänge erfolgen, die nicht zur Fluoreszenzanregung der
Fluoreszenzmarker geeignet ist, so dass ein Ausbleichen der
Fluoreszenzmarker während des Fokussierungsvorgangs vermieden werden
kann. Sobald das als teilweise verspiegelte Deckglas ausgestaltete
Referenzobjekt detektiert ist, kann eine entsprechende Fluoreszenzdetektion
der Fluoreszenzmarker des Objekts und somit die eigentliche Objektmessung
folgen. Somit können in besonders vorteilhafter Weise immer wiederkehrende
Schritte zur Einstellung des Mikroskops - beispielsweise das Fokussieren
unterschiedlicher Objekte - automatisiert werden, so dass insgesamt die
Bedienung des Mikroskops vereinfacht wird.
Weiterhin kann in erfindungsgemäßer Weise ein doppelkonfokales Raster
mikroskop durch die Verwendung eines Referenzobjekts kalibriert werden. So
könnte beispielsweise der Fokus des einen Mikroskopobjektivs genau auf den
Fokus des anderen Mikroskopobjektivs ausgerichtet werden, indem ein einfa
ches konfokales Mikroskopbild des Referenzobjekts mit lediglich einem Ob
jektiv des einen Teilstrahlengangs detektiert wird. Im Anschluss wird dasselbe
Referenzobjekt mit lediglich dem zweiten Mikroskopobjektiv des zweiten Teil
strahlengangs detektiert. Ein Vergleich der beiden Aufnahmen desselben Re
ferenzobjekts ermöglicht das laterale und/oder axiale Ausrichten der beiden
Mikroskopobjektive relativ zueinander, so dass einerseits die Fokalebenen der
beiden Mikroskopobjektive lateral und/oder axial übereinander fallen und an
dererseits deren optische Achsen übereinstimmen. Somit kann in erfin
dungsgemäßer Weise das Mikroskop, insbesondere ein doppelkonfokales
Rastermikroskop, kalibriert werden, und zwar auch - ggf. automatisch - un
mittelbar vor einem durchzuführenden Objektdetektionsvorgang, so dass in
vorteilhafter Weise ein Benutzer des Mikroskops keine Kalibrierung durchfüh
ren muss.
In einer konkreten Ausführungsform ist die Objektträgereinheit aus Glas an
gefertigt. In der einfachsten Ausführung könnte es sich bei der Objektträger
einheit um einen herkömmlichen Objektträger oder um ein herkömmliches
Deckglas handeln. Insbesondere bei der konfokalen oder doppelkonfokalen
Rastermikroskopie weist das Glas des Objektträgers bzw. das Deckglas einen
Brechungsindex auf, der für die Verwendung des jeweiligen Mikroskopsobjek
tivs geeignet bzw. angepasst ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist eine an die Objektträgereinheit
anbringbare Glasplatte mindestens eine als Referenzobjekt ausgestaltete Flä
che auf. Insbesondere handelt es sich bei der an die Objektirägereinheit an
bringbaren Glasplatte um ein Deckglas. Somit bildet eine entsprechend aus
gestaltete Fläche der Glasplatte bzw. des Deckglasses das eigentliche Refe
renzobjekt. Alternativ oder zusätzlich hierdurch könnte die Objektträgereinheit
mindestens eine als Referenzobjekt ausgestaltete Fläche aufweisen.
Die Fläche wiederum weist eine Textur und/oder eine Struktur auf. Diese
Textur/Struktur könnte ein regelmäßiges oder unregelmäßiges Gitter aufwei
sen, das beispielsweise aus einzelnen Strichen besteht. Auch regelmäßige
oder unregelmäßige Vielecke oder Kurven sind denkbar.
Alternativ oder zusätzlich hierzu könnte die Fläche eine Beschichtung
und/oder eine holographische Aufprägung aufweisen. Hinsichtlich einer kon
kreten Ausgestaltungsform könnte sich die Textur einer Fläche durch eine
entsprechende Beschichtung erzeugen lassen, beispielsweise mit Hilfe von
photolithografischen Belichtungsverfahren.
Es ist vorgesehen, dass die Beschichtung reflektierend und/oder lumineszie
rend ausgeführt ist, so dass eine lichtmikroskopische Detektion des Referenz
objekts möglich ist. Der Reflektionskoeffizient der Beschichtung ist üblicher
weise wesentlich kleiner als 1, so dass die Beschichtung lediglich teilweise
das auf sie auftreffende Licht reflektiert. Als lumineszierende Beschichtung
könnte eine Beschichtung vorgesehen sein, die aus Fluoreszenz- oder Phos
phoreszenzmolekülen besteht. Eine solche Beschichtung könnte beispiels
weise mit Verfahren aufgebracht werden, die denen der Tintenstrahldrucker
ähnlich sind. Insbesondere könnte die lumineszierende Beschichtung derart
ausgestaltet sein, dass sie lediglich mit Licht einer Wellenlänge anregbar ist,
die für die eigentliche Objektdetektion nicht geeignet bzw. vorgesehen ist.
Dementsprechend wird bei einer Referenzmessung das Objekt nicht mit Licht
beaufschlagt, dass beispielsweise spezifische Fluoreszenzmarker zum Aus
bleichen bringt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die
Textur bzw. Struktur der Fläche asymmetrisch ausgestaltet ist. So könnte die
Textur/Struktur beispielsweise aus unregelmäßigen geometrischen Gebilden
zusammengesetzt sein, die aus Linien, Kurven, Elipsen- oder Kreissegmenten
bestehen. Durch eine asymmetrische Textur/Struktur ist nach einer Detektion
des Referenzobjekts eine eindeutige Zuordnung des detektierten Bereichs des
Referenzobjekts zu einem entsprechenden, bereits vorher in Verbindung mit
dem Referenzobjekt detektierten Objektbereich möglich, so dass hierdurch
insbesondere Drifts des Objekts relativ zum Mikroskop detektiert und entspre
chend ausgeglichen werden können.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsform ist die als Referenz
objekt ausgestaltete Fläche in einer Ebene angeordnet. Hierbei könnte es sich
um eine Oberfläche der Objektträgereinheit oder um eine Oberfläche der an
die Objektträgereinheit anbringbaren Glasplatte handeln. Auf diese Oberfläche
könnte dementsprechend die reflektierende oder lumineszierende Beschich
tung aufgebracht sein. Idealerweise ist die Fläche der Objektträgereinheit bzw.
die an die Objektträgereinheit anbringbare Glasplatte derart orientiert, dass sie
parallel zur Fokalebene des Mikroskopsobjektivs orientiert ist. Hierdurch
könnte eine Verkippung der Objekträgerplatte relativ zur Fokalebene des
Mikroskopobjektivs insbesondere bei einem doppelkonfokalen Raste
rmikroskop detektiert werden und mit Hilfe von geeigneten Stellelementen
entsprechend korrigiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass als Referenzobjekt
mindestens ein an der Objektträgereinheit anbringbares mikroskopisches
Objekt dient. Als mikroskopische Objekte könnten beispielsweise Beads oder
Nanocrystals dienen, wobei Beads bzw. Nanocrystals mit gleichen oder unter
schiedlichen Größen/optischen Eigenschaften vorgesehen sein könnten. Ins
besondere ist vorgesehen, dass die als Referenzobjekte dienenden mikrosko
pischen Objekte stochastisch verteilt sind. Eine stochastische Verteilung die
ser Objekte könnte sich beispielsweise durch Auftropfen einer die mikroskopi
schen Objekte enthaltenden Lösung auf der Objektträgereinheit erzeugen
lassen, wobei die Lösung beispielsweise durch Verdunstung entfernt werden
könnte. Bei einer solchen Vorgehensweise ist zunächst lediglich das Refe
renzobjekt in seiner Ausgestaltung bekannt, d. h. es werden Beads mit einem
Durchmesser von beispielsweise 300 Nanometer verwendet. Die Anord
nung/Verteilung mehrerer Beads - beispielsweise auf der Objektträgereinheit
- sind jedoch stochastischer Natur und zunächst nicht bekannt. Dementspre
chend müsste ein Detektionsvorgang der Referenzobjekte durchgeführt wer
den, so dass auch deren Struktur bzw. Anordnung/Verteilung auf der Objekt
trägereinheit bekannt ist.
In verfahrensmäßiger Hinsicht wird die eingangs genannte Aufgabe durch die
Merkmale des Patentanspruchs 14 gelöst. Danach handelt es sich bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren um ein Verfahren zum Betreiben eines Mi
kroskops, insbesondere eines konfokalen oder doppelkonfokalen Raster
mikroskops, wobei dem Objekt mindestens eine Objektträgereinheit zugeord
net ist und wobei zur Kalibrierung, Justierung und/oder Einstellung des Mi
kroskops mindestens ein in seiner Ausgestaltung bekanntes Referenzobjekt
lichtmikroskopisch detektiert wird. Insbesondere handelt es sich bei dem Mi
kroskop um ein Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
In erfindungsgemäßer Weise ist daher erkannt worden, dass es einfacher und
vor allem kostengünstiger ist, das erfindungsgemäße Verfahren zum Kalibrie
ren, Justieren und/oder Einstellen des Mikroskops zu verwenden, als Verfah
ren einzusetzen, die das Mikroskop oder zumindest wesentliche Bauteile da
von auf eine bestimmte Temperatur regeln, so dass hierdurch weitgehend
Drifts der Einzelkomponenten unterbunden werden können. In letzterem Fall
wäre hinsichtlich einer Kalibrierung oder Einstellung des Mikroskops die der
Erfindung zugrunde liegende Aufgabe nicht vollständig gelöst.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist bevorzugt vorgesehen, dass das
Referenzobjekt mit einer Bildaufnahme detektiert wird. Hierbei könnte es sich
beispielsweise um ein konventionelles Mikroskop mit einer CCD-Kamera als
Detektor handeln. Falls es sich bei dem Mikroskop um ein konfokales oder
doppelkonfokales Rastermikroskop handelt, ist vorgesehen, dass es sich bei
dem Detektionsvorgang um einen Rastervorgang handelt. Dieser
Rastervorgang erfolgt in besonders vorteilhafter Weise in Form eines
zweidimensionalen optischen Schnitts. Hierdurch ist eine schnelle Detektion
des Referenzobjekts gewährleistet, da aufgrund der besonderen
Ausgestaltung des Referenzobjekts eine dreidimensionale Datenaufnahme
des Referenzobjekts nicht erforderlich ist. Es ist von wesentlicher Bedeutung,
dass eine nahezu eindeutige Identifikation des Referenzobjekts in schon nur
einem aufgenommenen Bild möglich ist, da das Referenzobjekt in seiner
Ausgestaltung bekannt ist. Hierdurch kann auf die Position und Orientierung
des Referenzobjekts geschlossen werden, und zwar im Idealfall schon mit
einer einzigen zweidimensionalen Bildaufnahme bzw. einem einzigen
zweidimensionalen Rastervorgang. Vorzugsweise ist der zweidimensionale
optische Schnitt derart orientiert, dass er zu der als Referenzobjekt
ausgestalteten Fläche senkrecht steht. Wenn die als Referenzobjekt dienende
Fläche beispielsweise parallel zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs
angeordnet ist, könnte ein zweidimensionaler optischer Schnitt zur Aufnahme
des Referenzobjekts derart orientiert sein, dass der optische Schnitt in einer
Ebene liegt, die die optisch Achse enthält.
In besonders vorteilhafter Weise werden die Bilddaten des Referenzobjekts
computergestützt ausgewertet. Diese Bilddatenauswertung könnte beispiels
weise mit Methoden der digitalen Bildverarbeitung erfolgen. So könnte bei
spielsweise anhand der detektierten Bilddaten des Referenzobjekts auf des
sen Lage und/oder Orientierung relativ zu dem detektierten Objektbereich
geschlossen werden. Hierdurch können Informationen über einen möglichen
Drift des Objekts relativ zur Objektträgereinheit bzw. relativ zum Referenzob
jekt gewonnen werden.
Weiterhin ist denkbar, dass durch Vergleich von detektierten Bilddaten des
Referenzobjekts mit zuvor detektierten Bilddaten - vorzugsweise des Refe
renzobjekts - auf die Drift des Objekts bzw. der Objektträgereinheit geschlos
sen werden kann. Durch diese Vorgehensweise kann eine Drift der gesamten
Objektträgereinheit - also der Objektträgereinheit samt Objekt und gegebe
nenfalls Deckglas - relativ zu dem Mikroskopobjektiv detektiert werden, wo
hingegen im vorigen Fall vor allem eine Drift des Objekts relativ zur Objektträ
gereinheit detekierbar ist.
In einem konkreten Verfahrensschritt ist vorgesehen, dass eine Drift des Ob
jekts und/oder der Objektträgereinheit durch eine entsprechende Bewegung
der Objektträgereinheit ausgeglichen wird. Somit wird das Objekt oder die
Objektträgereinheit, die sich aufgrund einer Drift beispielsweise um 2 µm in
eine Richtung bewegt hat, um den gleichen Betrag in die entgegengesetzte
Richtung zurückbewegt, so dass der ursprüngliche Zustand wiederhergestellt
ist. Alternativ oder zusätzlich hierzu ist vorgesehen, dass die Drift des Objekts
mit Methoden der digitalen Bildverarbeitung ausgeglichen werden. Hierbei
erfolgt der Ausgleich lediglich computergestützt, d. h. es werden gemäß dem
obigen Beispiel die Bilddaten des Objekts um einen dem Abbildungsmaßstab
der Mikroskopoptik entsprechenden Betrag verschoben. Diese Vorgehens
weise erfolgt also lediglich computergestützt und wird auf die detektierten
Bilddaten des Objekts angewandt.
In einem besonders bevorzugten Verfahrensabschnitt ist für ein doppelkonfo
kales Rastermikroskop vorgesehen, dass anhand der Detektion des Referenz
objekts die optischen Teilstrahlengänge, insbesondere deren Weglängenun
terschiede, und die Position der Objektive kalibriert und justiert werden. Die
Detektion des Referenzobjekts mit lediglich dem Mikroskopobjektiv des einen
Teilstrahlengangs des doppelkonfokalen Rastermikroskops ergibt einen Bild
datensatz, der mit dem zweiten Bilddatensatz verglichen werden kann, der mit
dem zweiten Mikroskopobjektiv des zweiten Teilstrahlengangs des
doppelkonfokalen Rastermikroskops aufgenommen wird. Hierzu wird ei
nerseits das Referenzobjekt mit einem zweidimensionalen optischen Schnitt
detektiert, der parallel zur Fokalebene der jeweiligen Mikroskopobjektive ori
entiert ist. Durch Vergleich dieser beiden Datensätze können die beiden Mi
kroskopobjektive in lateraler Richtung, d. h. quer zur optischen Achse, aufein
ander ausgerichtet werden. Durch die Detektion eines zweidimensionalen
optischen Schnitts, der senkrecht zu der als Referenzobjekt ausgestalteten
Fläche orientiert ist, können - entsprechende Aufnahmen der jeweiligen Mi
kroskopobjektive vorausgesetzt - die beiden Mikroskopobjektive in axialer
Richtung, d. h. entlang der Richtung der optischen Achse, aufeinander einge
stellt werden. Einer Verkippung der beiden Mikroskopobjektive relativ zuein
ander kann ebenfalls entgegengewirkt werden, so können beispielsweise un
scharf abgebildete Teilbereiche der Textur als Anzeichen einer Verkippung
gewertet werden. Somit kann mit Hilfe des Referenzobjekts einerseits der
doppelkonfokale Rastermikroskopstrahlengang vor der eigentlichen
Objektdetektion kalibriert und andererseits während der Objektdetektion zur
Justage wiederholt werden.
Zum automatischen Auffinden und/oder Fokussieren eines Objekts ist in
einem weiteren Verfahrensschritt vorgesehen, die Objektträgereinheit samt
Objekt entlang der optischen Achse des Mikroskopobjektivs bzw. der beiden
Mikroskopobjektive zu bewegen und hierbei das von der als Referenzobjekt
ausgestalteten Fläche kommende Licht zu detektieren. So könnte beispiels
weise eine als Objektträger ausgestaltetet Objektträgereinheit, die eine teil
weise reflektierende Oberflächenbeschichtung aufweist, samt Objekt auf den
Mikroskoptisch aufgebracht werden. Während einer automatischen Bewegung
des Mikroskoptischs (samt Objektträger und Objekt) wird der Objektbereich
des Mikroskopobjektivs zur Referenzmessung konfokal mit Laserlicht beauf
schlagt. Dieses Laserlicht wird jedoch nicht zur Detektion des Objekts einge
setzt und die Oberflächenbeschichtung des Objektträgers ist lediglich für das
Licht reflektierend, dass zur Referenzobjektdetektion eingesetzt wird. Dieses
Licht weist eine andere Wellenlänge auf als das, das zur Objektdetektion
verwendet wird. Sobald nun die Oberflächenbeschichtung des Objektträgers
in die Nähe der Fokalebene des Mikroskopobjektivs bewegt wird, ist ein kon
fokales Detektionssignal messbar. Wenn das Detektionssignal des Refe
renzobjekts maximal ist, befindet sich die Oberfläche des Objektträgers in der
Fokalebene des Mikroskopobjektivs. Hierdurch kann in ganz besonders vor
teilhafter Weise schnell und einfach zumindest ein erster Bezugspunkt gefun
den werden, so dass das Auffinden des Objekts hierdurch erheblich verein
facht und zeitlich verkürzt ist.
Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung
in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits
auf die den Patentansprüchen 1 und 14 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausfüh
rungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbin
dung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung
anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestal
tungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
Fig. 1a eine schematische Darstellung einer Elementarzelle einer er
sten Textur,
Fig. 1b eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
mit Elementarzelten aus Fig. 1a,
Fig. 2a eine schematische Darstellung einer Elementarzelle einer wei
teren Textur,
Fig. 2b eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
mit Elementarzellen aus Fig. 2a,
Fig. 3a eine schematische Darstellung einer Elementarzelle einer wei
teren Textur,
Fig. 3b eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
mit Elementarzellen aus Fig. 3a,
Fig. 4a eine schematische Darstellung einer Elementarzelle einer wei
teren Textur,
Fig. 4b eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
mit Elementarzellen aus Fig. 4a,
Fig. 5a eine schematische Darstellung einer Elementarzelle einer wei
teren Textur,
Fig. 5b eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
mit Elementarzellen aus Fig. 5a,
Fig. 6a eine schematische Darstellung einer Elementarzelle einer wei
teren Textur,
Fig. 6b eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
mit Elementarzellen aus Fig. 6a,
Fig. 7 eine schematische Darstellung der zusammengesetzten Textur
aus Fig. 1b, mit angedeutetem zweidimensionalen optischen
Schnitt,
Fig. 8 eine schematische Darstellung des zweidimensionalen opti
schen Schnitts, der in Fig. 7 angedeutet ist und
Fig. 9 eine schematische Darstellung der gemessenen Intensitäts
verteilung aus Fig. 8.
Die Fig. 1a, 2a, 3a, 4a, 5a und 6a zeigen allesamt Elementarzellen einer
Textur, die jeweils in den Fig. 1b, 2b, 3b, 4b, 5b und 6b zu einer zweidimen
sionalen ausgedehnten Textur zusammengesetzt sind. Diese Texturen sind in
ihren Ausgestaltungen bekannt, d. h. die jeweiligen Strichlinien sowie die je
weiligen Strichbreiten liegen in einem Bereich von etwa 200 bis 400 nm. Diese
Texturen dienen als Referenzobjekt, wobei diese Texturen auf Oberflächen
unterschiedlicher Deckgläser aufgebracht sind. Ein solches Deckglas dient als
Objektträgereinheit. Somit weist die als Deckglas ausgeführte Objekt
trägereinheit eine als Referenzobjekt ausgestaltete Oberfläche auf. Die Textur
ist hierbei in Form einer Beschichtung auf die Oberfläche aufgebracht. Bei den
Beschichtungen aus den Fig. 1b, 2b, und 3b handelt es sich jeweils um eine
reflektierende Beschichtung, die einen Reflexionskoeffizient von
beispielsweise 0,01 für Licht aus einem Wellenlängenbereich im nahen
Infrarot aufweist. Als Laserlichtquelle bietet sich dann z. B. ein cw-Diodenlaser
an.
Die Beschichtungen aus den Fig. 4b, 5b, und 6b sind fluoreszierend ausge
führt, es handelt sich jeweils um Fluoreszenzfarbstoffe, die im sichtbaren
Bereich zur Fluoreszenz anregbar sind. z. B. mit einem cw-Laser.
Sämtliche in den Fig. 1b, 2b, 3b, 4b, 5b und 6b gezeigten Beschichtungen
sind jeweils auf entsprechenden Deckgläsern aufgebracht und in einer Ebene
angeordnet.
Fig. 7 zeigt in einer schematischen Darstellung die Textur aus Fig. 1b, die mit
einem Rastervorgang eines doppelkonfokalen Rastermikroskops zumindest
teilweise detektiert wird. Es handelt sich hierbei um einen zweidimensionalen
optischen Schnitt, der senkrecht zur Oberfläche des mit der Beschichtung
versehenen Deckglases angeordnet ist. Dementsprechend ist die senkrechte
Projektion des optischen Schnitts auf die Oberfläche der Textur in Fig. 7 ge
strichelt gekennzeichnet.
Der zweidimensionale optische Schnitt der Textur aus Fig. 7 ist in Fig. 8
schematisch dargestellt. Mit dick eingezeichneten Kreisen sind jeweils die
Schnittpunkte des zweidimensionalen optischen Schnitts mit jeweils einer
dicken Linie der Textur aus Fig. 7 gezeigt. Die dünn eingezeichneten Kreise
entsprechen den Schnittpunkten mit den dünnen Linien aus Fig. 7. Die laterale
Richtung entspricht der Ortskoordinate entlang der Projektion aus Fig. 7. Die
axiale Richtung entspricht der Richtung senkrecht zur Textur aus Fig. 7. In der
Darstellung aus Fig. 8 wird deutlich, dass lediglich dann von der zweidimen
sionalen Textur aus Fig. 7 ein Detektionssignal nachweisbar ist, wenn sich die
Oberfläche - und somit die Beschichtung der Oberfläche - in der Fokalebene
der Mikroskopobjektive befindet.
In Fig. 9 ist das detektierte Signal als Funktion der lateralen Position der Pro
jektion aus den Fig. 7 bzw. Fig. 8 gezeigt. Das Reflexionssignal der dicken
Striche der Textur aus Fig. 7 resultiert in einem höheren Detektionsignal, was
an den beiden höheren Peaks in Fig. 9 zu erkennen ist. Die dünnen Striche
resultieren in Peaks, die allesamt die gleiche Intensität aufweisen.
Die Bilddaten des Referenzobjekts werden computergestützt ausgewertet. Die
als Referenzobjekt dienende Textur aus Fig. 7 ist in ihrer Ausgestaltung be
kannt, d. h. beispielsweise der Abstand zueinander paralleler Striche ist be
kannt. Weiterhin ist die Orientierung des vom doppelkonfokalen Raster
mikroskop ausgeführten zweidimensionalen optischen Schnitts bekannt. Somit
kann auf die tatsächliche laterale Orientierung der Textur aus Fig. 7 relativ zu
dem doppelkonfokalen Rastermikroskop geschlossen werden, da sich für je
den Schnittwinkel α eines Rastervorgangs des Rastermikroskops ein eindeuti
ges, definiertes Signalmuster, beispielsweise entsprechend Fig. 9, ergibt.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend
erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten
Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.
Claims (24)
1. Mikroskop, insbesondere konfokales oder doppelkonfokales Raster
mikroskop, wobei mindestens eine dem Objekt zugeordnete Objektträger
einheit vorgesehen ist, wobei mindestens ein in seiner Ausgestaltung be
kanntes Referenzobjekt vorgesehen ist und wobei das Referenzobjekt zur
Kalibrierung, Justierung und/oder Einstellung des Mikroskops licht
mikroskopisch detektierbar ist.
2. Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektträ
gereinheit aus Glas angefertigt ist.
3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektträ
gereinheit als Objektträger oder als Deckglas ausgeführt ist.
4. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
dass eine an die Objektträgereinheit anbringbare Glasplatte, vorzugsweise
ein Deckglas, mindestens eine als Referenzobjekt ausgestaltete Fläche
aufweist.
5. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
dass die Objektträgereinheit mindestens eine als Referenzobjekt ausge
staltete Fläche aufweist.
6. Mikroskop nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die
Fläche eine Textur und/oder Struktur aufweist.
7. Mikroskop nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
dass die Fläche eine Beschichtung und/oder eine holographischen Auf
prägung aufweist.
8. Mikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Be
schichtung reflektierend und/oder lumineszierend ausgeführt ist.
9. Mikroskop nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
dass die Textur/Struktur der Fläche asymmetrisch ausgestaltet ist.
10. Mikroskop nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
dass die Fläche in einer Ebene angeordnet ist.
11. Mikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
dass als Referenzobjekt mindestens ein an der Objektträgereinheit an
bringbares mikroskopisches Objekt vorgesehen ist.
12. Mikroskop nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass als mikro
skopische Objekte Beads oder Nanocrystals vorgesehen sind.
13. Mikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere
mikroskopische Objekte stochastisch verteilt sind.
14. Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops, insbesondere eines konfoka
len oder eines doppelkonfokalen Rastermikroskops, vorzugsweise eines
Mikroskops nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dem Objekt min
destens eine Objektträgereinheit zugeordnet ist und wobei zur Kalibrie
rung, Justierung und/oder Einstellung des Mikroskops mindestens ein in
seiner Ausgestaltung bekanntes Referenzobjekt lichtmikroskopisch detek
tiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Refe
renzobjekt mit einer Bildaufnahme bei einem Mikroskop oder mit einem
Rastervorgang bei einem konfokalen oder doppelkonfokalen
Rastermikroskop detektiert wird, wodurch eine eindeutige Zuordnung der
Position und der Orientierung des Referenzobjekts ermöglicht wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei dem Mikroskop um ein
konfokales oder doppelkonfokales Rastermikroskop handelt, dadurch ge
kennzeichnet, dass als Rastervorgang ein zweidimensionaler optischer
Schnitt erfolgt.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der optische
Schnitt senkrecht zur Fläche orientiert ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet,
dass die Bilddaten des Referenzobjekts computergestützt ausgewertet
werden.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet,
dass anhand der detektierten Bilddaten des Referenzobjekts auf dessen
Lage und/oder Orientierung relativ zu dem detektierten Objektbereich ge
schlossen wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet,
dass durch Vergleich von detektierten Bilddaten des Referenzobjekts mit
zuvor detektierten Bilddaten auf die Drift des Objekts/Objektträgereinheit
geschlossen wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass eine Drift des
Objekts durch eine entsprechende Bewegung der Objektträgereinheit aus
geglichen wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Drift des Objekts mit Methoden der digitalen Bildverarbeitung ausgeglichen
werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei es sich bei dem
Mikroskop um ein doppelkonfokales Rastermikroskop handelt, dadurch
gekennzeichnet, dass anhand der Detektion des Referenzobjekts die opti
schen Teilstrahlengänge, insbesondere deren Weglängenunterschiede,
und die Positionen der Objektive kalibriert und justiert werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 23, dadurch gekennzeichnet,
dass zum automatischen Auffinden und/oder Fokussieren des Objekts die
Objektträgereinheit samt Objekt entlang der optischen Achse des Objek
tivs oder der Objektive bewegt wird und dass hierbei das von der Fläche
kommende Licht detektiert wird.
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