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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung von Mikroskopen, insbesondere
von konfokalen Mikroskopen, wobei das Mikroskop mindestens eine Lichtquelle,
einen das Licht zur Probe führenden
Beleuchtungsstrahlengang, einen Detektor und einen das Detektionslicht
von der Probe zum Detektor führenden
Detektionsstrahlengang aufweist.
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Des
Weiteren betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Prüfung von
Mikroskopen, insbesondere von konfokalen Mikroskopen, unter Nutzung
der Bauteile des Mikroskops, insbesondere unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Schließlich betrifft
die Erfindung eine Prüfprobe,
insbesondere zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und/oder der
erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Will
man ein Mikroskop auf die Funktionstüchtigkeit und Qualität der jeweiligen
Baugruppen prüfen,
ist es grundsätzlich
möglich,
als Prüfeinheit eine
kalibrierte Lichtquelle definierter Flächen- und/oder Volumenleuchtdichte
zu verwenden. Zum Einsatz kommen könnte hier eine kalibrierte
LED, die man in das Bildfeld des Mikroskops verbringt und anhand
derer man die Helligkeit des so entstehenden Bildes misst. Die Effizienz
von Mikroskopen wird derzeit jedoch nicht gemessen bzw. geprüft, nämlich in Ermangelung
einer Standardisierung und somit in Ermangelung eines objektiven
Vergleichs.
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Wollte
man ein Mikroskop anhand einer Lichtquelle prüfen, müsste die Lichtquelle auf jeden Fall
kalibriert sein. Sie müsste
auf genau die gleiche Weise wie bei ihrer Kalibrierung betrieben
werden und müsste
dabei in die gleiche Raumrichtung abstrahlen. Eine solche Lichtquelle
ist teuer. Im Vorfelde der Prüfung
wären aufwendige
Einrichtarbeiten erforderlich. Außerdem unterliegt eine konventionelle Lichtquelle
der Alterung, so dass deren Einsatz auch insoweit begrenzt ist.
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Aus
dem Stand der Technik ist für
sich gesehen bekannt, Fluoreszenzdetektionssysteme zu prüfen, indem
dort als Marker dienende Fluorophore als zu detektierende Objekte
verwendet werden (vgl.
DE 202
173 40 U1 ). Eine entsprechende Prüfung oder gar Kalibrierung
anhand der so erhaltenden Fluoreszenzsignale ist jedoch in der Praxis
problematisch, da die durch Bestrahlung erreichte Fluoreszenz von typischer
Weise 10 ns nicht ausreicht, um eine komplette Prüfung eines
Mik roskopsystems vorzunehmen. Folglich wird es unter Zugrundelegung
einer fluoreszierenden Probe erforderlich sein, diese ständig zu
beleuchten, wobei das Messergebnis vom Einfluss der Lichtquelle
des Systems abhängt.
Die dort stattfindende Alterung wird bei der Messung ebenfalls berücksichtigt,
wodurch eine zuverlässige
und reproduzierbare Kalibrierung jedenfalls nicht möglich ist.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zur Prüfung
von Mikroskopen anzugeben, wonach es mit einfachen Mitteln möglich ist,
Mikroskope zuverlässig
und dabei reproduzierbar zu prüfen
und unter Zugrundelegung der Prüfergebnisse
zu kalibrieren. Des Weiteren soll eine entsprechende Vorrichtung
sowie eine geeignete Prüfprobe
angegeben werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
löst die voranstehende
Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruches 1. In Bezug auf
eine erfindungsgemäße Vorrichtung
wird die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs
19 gelöst. Im
Hinblick auf eine erfindungsgemäße Prüfprobe wird
die Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 24 gelöst.
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Erfindungsgemäß ist in
verfahrensmäßiger Hinsicht
zunächst
einmal erkannt worden, dass man Mikroskope unter Nutzung der einzelnen
Funktionsgruppen des Mikroskops auf ihre Funktionstüchtigkeit
hin überprüfen kann,
wenn man nämlich
eine standardisierte oder standardisierbare Prüfprobe verwendet, durch deren
Detektion eine Charakterisierung des Mikroskops und somit eine Prüfung des
Mikroskops möglich
ist.
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Als
Prüfmittel
wird hier eine ganz besondere Prüfprobe
zur Verfügung
gestellt, nämlich
aus phosphoreszierendem Material. Phosphoreszierendes Material hat
nämlich
den großen
Vorteil, dass es nach seiner Anregung längere Zeit leuchtet, ohne dass
eine weitere Anregung erforderlich ist. Während man bis zu einer Nachleuchtdauer
von etwa 10 ns von Fluoreszenz spricht, handelt es sich über diesen Zeitraum
hinweg um Phosphoreszenz, die nach Anregung und in Abhängigkeit
von dem konkreten Material wesentlich länger andauert.
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Typisch
für die
Phosphoreszenz ist, dass bei der Anregung der angeregte Zustand
in Sättigung geht.
Folglich erhält
man nach der Anregung in die Sättigung
stets die gleiche Lichtausbeute, und zwar unabhängig davon, wie intensiv die
Anregung ist bzw. war. Folglich ist – quasi automatisch – die Reproduzierbarkeit
gegeben. Im Verlaufe der Zeit nimmt zwar die Lichtausbeute auch
bei der Phosphoreszenz allmählich
ab, jedoch ist die Lichtausbeute über eine lange Zeit hinweg
nahezu konstant. Die Abnahme der Lichtausbeute erfolgt auf relativ
langen Zeitskalen, die für
die Prüfung
des Mikroskops unerheblich sind. Je nach Zusammensetzung der Phosphore
liegen die Nachleuchtdauern der Stoffe zwischen Millisekunden und
mehreren Stunden. In erfindungsgemäßer Weise wird das Phänomen phosphoreszierender
Materialien genutzt.
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Entsprechend
den voranstehenden Ausführungen
wird in erfindungsgemäßer Weise
eine Prüfprobe
aus phosphoreszierendem Material zur Verfügung gestellt. Die Prüfprobe wird
bis in die Sättigung angeregt.
Anschließend
wird das von der Probe emittierte und über den Detektionsstrahlengang
des Mikroskops zum Detektor gelangende Licht detektiert, verarbeitet
bzw. ausgewertet sowie mit vorgegebenen oder vorgebbaren Daten verglichen.
Eine Prüfung
der Qualität
des Mikroskops, so beispielsweise der Optik, des Detektionsstrahlengangs,
aber auch des Detektors, ist somit möglich.
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Die
phosphoreszierendes Material enthaltende Prüfprobe lässt sich auf unterschiedliche
Arten anregen. So könnte
die Anregung beispielsweise über
radioaktiven Zerfall erfolgen. Eine thermische Anregung der Prüfprobe ist
für die
Praxis denkbar, wobei im Konkreten die thermische Anregung über eine
die Prüfprobe
tragende Heizeinrichtung, so beispielsweise über einen Heiztisch, erfolgen
kann.
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Am
einfachsten lässt
sich die Phosphoreszenz durch Licht anregen. So könnte die
Prüfprobe durch
das über
den Beleuchtungsstrahlengang von der Lichtquelle des Mikroskops
kommende Licht angeregt werden. Eine externe Lichtquelle ist nicht
erforderlich.
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Will
man das Prüfergebnis
unabhängig
von der eigenen Lichtquelle des Mikroskops machen, so könnte die
Prüfprobe über eine
externe Lichtquelle angeregt werden. Das Licht der externen Lichtquelle lässt sich
in den Beleuchtungsstrahlengang – über einen geeigneten Strahlvereiniger – einkoppeln.
Ebenso ist es denkbar, die externe Lichtquelle unterhalb der Prüfprobe anzuordnen,
so dass das Licht der ex ternen Lichtquelle von unterhalb der Prüfprobe auf diese
trifft und das phosphoreszierende Material anregt.
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Zur
punktuellen Anregung der Prüfprobe könnte ein
beliebiger Punkt über
einen vorgebbaren Zeitraum hinweg beleuchtet werden. Erfolgt die
Anregung über
den Beleuchtungsstrahlengang des Mikroskops, könnte der Scanner „geparkt" werden, so dass
der Lichtstrahl stets einen Punkt bestrahlt bzw. anregt, bis dieser
in die Sättigung
geht. Über
einen materialspezifischen Zeitraum hinweg lässt sich dieser Punkt in idealer
Weise durchgehend detektieren.
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Zuvor
ist bereits angemerkt worden, dass die Phosphoreszenz – ausgehend
von dem Zustand der Sättigung – über einen
Zeitraum hinweg konstant bleibt und danach in der Lichtausbeute
schwächer wird.
Wenngleich die Lichtausbeute im Laufe der Zeit – auf relativ langen Zeitskalen – abnimmt,
sind Nachleuchtdauern zwischen Millisekunden und mehreren Stunden
zu verzeichnen. Die Lichtausbeute lässt sich sogar noch in der
Phase der Degradation messen, wobei es dann von Vorteil ist, wenn
die Auswertung durch eine mathematische Kompensation der Degradation
erfolgt, so beispielsweise über
ein Anfitten einer e-Funktion.
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Durch
Detektion des von der Prüfprobe
emittierten Lichts und durch entsprechende Auswertung, die einen
Vergleich mit hinterlegten „Gutwerten" umfassen kann, lassen
sich mikroskopspezifische Eigenschaften wie Bildhelligkeit, Auflösung Bildausleuchtung,
Bildverzerrung, Effizienz, etc. überprüfen. Das
Rauschen eines oder mehrer Bildpunkte oder das Rauschen zu einem
Zeitpunkt innerhalb einer Fläche
oder zwischen mehreren Punkten lässt
sich über
die Zeit bestimmen und zum Erhalt des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses
des Detektionsstrahlengangs mit den detektierten Signalen ins Verhältnis setzen.
Die Güte
des Detektionsstrahlengangs ist somit prüfbar bzw. messbar.
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Im
Lichte der voranstehenden Ausführungen ist
es möglich,
das erfindungsgemäße Verfahren
zum Zwecke der Werksprüfung
oder werksseitigen Geräteabnahme
zu nutzen. Ebenso ist es denkbar, die Prüfung zum Zwecke der Kalibrierung
des Mikroskops zu verwenden. So könnte die Prüfung nach Aktivieren eines
Prüfprogramms
unter Verwendung auswählbarer
Prüfproben – beispielsweise
aus einem vorgegebenen Sortiment von Prüfproben – automatisch durchführbar sein,
nämlich
unter Zugrundelegung einer geeigneten Prozesssteuerung.
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Nach
der Prüfung
wird in weiter vorteilhafter Weise ein Prüfprotokoll erstellt, welches
Auskunft über
die Qualität
einzelner Baugruppen des Mikroskops liefert.
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Schließlich ist
es denkbar, dass das Ergebnis der Prüfung in den Vorgang einer Gerätekalibrierung – automatisch – einfließt, wobei
die Kalibrierung dann ebenfalls automatisch vorgenommen wird. Auf
diese Weise lässt
sich eine Art selbstkalibrierendes System realisieren.
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In
Bezug auf die erfindungsgemäße Vorrichtung,
die mit den Merkmalen des Patentanspruches 19 die eingangs genannte
Aufgabe löst,
ist von Bedeutung, dass das Mikroskop selbst die Vorrichtung zum
Prüfen
darstellt, da nämlich
sämtliche
zu prüfenden
Baugruppen des Mikroskops genutzt werden. Wesentlich ist die Verwendung
einer geeigneten Prüfprobe
aus phosphoreszierendem Material, die nach Anregung in der Sättigung über den
Detektionsstrahlengang vom Detektor detektierbar ist, und zwar unter
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Wie
bereits zuvor erwähnt,
lässt sich
die Prüfprobe
durch das über
den Beleuchtungsstrahlengang von der Lichtquelle kommende Licht
oder über eine
externe Lichtquelle anregen. Ebenso könnte die externe Lichtquelle
unterhalb der Prüfprobe
bzw. des Probenträgers
angeordnet sein. Ungeachtet der konkreten Anordnung der Lichtquelle
kann es ich dabei um einen Laser handeln.
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Die
erfindungsgemäße Prüfprobe dient
zum Einsatz in der erfindungsgemäßen Vorrichtung
und zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Prüfprobe
umfasst einen Probenträger
und auf dem Probenträger
aufgebrachtes phosphoreszierendes Material, welches in den Sättigungszustand verbringbar
ist.
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Bei
dem Prüfmaterial
kann es sich um Zinksulfid, Zinksilikat, Erdalkali-Phosphore, etc.
handeln. Wesentlich ist jedenfalls die phosphoreszierende Eigenschaft
des Materials und das Phänomen,
wonach das Prüfmaterial – in den
Sättigungszustand
verbracht – über eine
hinreichend lange Zeitspanne hinweg mit gleicher Lichtaus beute abstrahlt.
Eine Reproduzierbarkeit der gleich bleibenden Lichtausbeute ist
gewährleistet,
und zwar ungeachtet der Intensität der
Anregung.
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Zur
einfachen Handhabung ist es von Vorteil, wenn das Prüfmaterial
auf einem vorzugsweise transparenten Träger aufgebracht ist. Dabei
kann es sich beispielsweise um ein Glasplättchen handeln. Sofern die
Prüfprobe
wieder verwendet werden soll, ist es von weiterem Vorteil, wenn
das Prüfmaterial gekapselt
ist. Dazu könnte
sich das Prüfmaterial
zwischen dem Träger
und einer ebenfalls transparenten Abdeckplatte befinden, wobei die
Prüfprobe
insgesamt gekapselt bzw. versiegelt ist. Die Prüfprobe lässt sich somit einfach handhaben
und ist hinreichend geschützt.
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Im
Konkreten könnte
das Prüfmaterial
als vorzugsweise dünne
Schicht auf dem Träger
aufgebracht sein. Dabei könnte
die Schicht in weiter vorteilhafter Weise mikrostrukturiert sein.
Entsprechend kann das Material Punkte der Dimension 0, Linien der Dimension
1 und Flächen
der Dimension 2 aufweisen, nämlich
unter Berücksichtigung
einer extrem dünnen
Ausführung
einer Mikrostrukturierung. Mit Hilfe einer so gestalteten Prüfprobe lassen
sich alle gängigen
Eigenschaften wie Bildhelligkeit, Auflösung, Bildausleuchtung, Bildverzerrung
und dergleichen des Mikroskops überprüfen.
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Besonders
von Vorteil sind Punkte, d.h. im angeregten Zustand Leuchtpunkte,
der Dimension 0, da deren Helligkeit gerade in der konfokalen Mikroskopie
nicht von der Größe des Pinholes
abhängt
und so die Auflösung
des Mikroskops getestet werden kann.
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Für reine
Effizienzmessungen könnte
das Prüfmaterial
als Volumenmaterial, so beispielsweise als dicke Platte, ausgeführt sein.
Eine z-Auflösung
ist dabei nicht erforderlich.
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Es
gibt nun verschiedene Möglichkeiten,
die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten
und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch
1 nachgeordneten Patentansprüche
und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung verschiedener Ausführungsbeispiele
von Prüfproben
anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung
verschiedener Ausführungsbeispiele
der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allge meinen bevorzugte
Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In
der Zeichnung zeigt
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1 in einem schematischen
Blockdiagram den grundsätzlichen
Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
und die grundsätzliche
Funktionsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens,
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2a ein Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Prüfprobe mit
einem Punkt der Dimension 0 (ideal),
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2b ein Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Prüfprobe mit
einer Fläche
der Dimension 2,
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2c ein Ausführungsbeispiel
einer erfindungsgemäßen Prüfprobe mit
einer Punktmatrix,
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3 in einem schematischen
Diagramm den Verlauf der Lichtausbeute eines phosphoreszierenden
Materials in Abhängigkeit
von der Anregung und
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4 in einem schematischen
Diagramm den Verlauf der Lichtausbeute über den Zustand der Sättigung
hinweg im Zeitverlauf.
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1 zeigt im Rahmen eines
schematischen Diagramms eine erfindungsgemäße Vorrichtung sowie die Anwendung
eines erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Prüfung
von Mikroskopen, wobei hier – schematisch – ein konfokales
Mikroskop dargestellt ist.
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Das
Mikroskop umfasst eine Lichtquelle 1, einen das Licht über ein
Beleuchtungspinhole 2, einen Strahlteiler 3 und
einen Scanner 4 zur Probe 5 führenden Beleuchtungsstrahlengang 6.
Das Detektionslicht wird von der Probe 5 über den
Scanner 4 und den Strahlteiler 3 durch ein Detektionspinhole 8 zum
Detektor 7 geführt.
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Erfindungsgemäß wird eine
ganz besondere Probe verwendet, nämlich eine Prüfprobe 5.
Die Prüfprobe 5 umfasst
einen Träger 9,
der als Glasplatte ausgeführt
ist. Auf dem Träger 9 befindet
sich das Prüfmaterial 10,
bei dem es sich erfindungsgemäß um ein
phosphoreszierendes Material handelt.
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Bei
dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel
dient die Lichtquelle 1 des Mikroskops zum Anregen des
Prüfmaterials 10.
Ebenso ist es möglich, zu
diesem Zwecke eine gesonderte Lichtquelle zu verwenden, die in 1 nicht gezeigt ist.
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Die 2a, 2b und 2c zeigen
Prüfproben 5, auf
deren Träger 9 Prüfmaterial 10 unterschiedlich angeordnet
ist. Das Prüfmaterial 10 ist
als dünne Schicht
ausgeführt. 2a zeigt – schematisch – eine punktuelle
Anordnung des Prüfmaterials 10,
woraus sich bei hinreichend dünner
Ausgestaltung ein Leuchtpunkt der Dimension 0 ergibt.
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In 2b ist das Prüfmaterial 10 flächenförmig angelegt,
wobei auch hier in idealer Weise eine möglichst dünne Aufbringung des Prüfmaterials 10 vorliegt.
Folglich handelt es sich um eine Fläche der Dimension 2.
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Gemäß der Darstellung
in 2c ergeben einzelne
Punkte des Prüfmaterials 10 eine
Punktmatrix.
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Die
in den 2a, 2b und 2c gezeigten Prüfproben lassen sich als Standards
zur reproduzierbaren Prüfung
des Mikroskops verwenden.
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3 zeigt in einem Diagramm
den Verlauf der Lichtausbeute 11 des phosphoreszierenden
Materials durch die unterbrochene Linie (I phosphoresc.).
Sobald durch Anregung, beispielsweise mittels Beleuchtung, die Sättigung
erreicht ist, erhält
man eine nahezu gleich bleibende Lichtausbeute 11. Die erreichte
Sättigung
ist in 3 durch „I saturat" gekennzeichnet.
Auf der Ordinate ist die Lichtausbeute bzw. die Intensität der Lichtausbeute
abgetragen.
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4 zeigt die Lichtausbeute 11 im
Zeitverlauf. Sobald sich der angeregte Zustand des phosphoreszierenden
Materials in Sättigung 12 befindet
(I saturat), ist die Lichtausbeute 11 (I phosphoresc) zumindest über einen
gewissen Zeitraum hinweg (Δt measure)
konstant, wobei dieser Zeitraum zur Messung bzw. Prüfung gemäß der voranstehenden
Beschreibung genutzt wird. Danach klingt die Lichtausbeute nach
und nach ab, wobei auch in der Phase der Degradation eine Messung
der Lichtausbeute und somit Prüfung
des Mikroskops möglich
ist. Der Kompensation dienende Funktionen finden Anwendung.
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Schließlich sei
angemerkt, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele
zum Verständnis
der erfindungsgemäßen Lehre
beitragen, diese jedoch nicht auf das Ausführungsbeispiele einschränken.